CN102901763B - 基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的dna测序装置及制作方法 - Google Patents
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Abstract
基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的DNA测序装置及制作方法，在SOI硅片上部刻蚀有倒金字塔形微腔，在其下部刻蚀有柱状孔，倒金字塔形微腔塔顶为固态纳米孔，在上部有石墨烯，在石墨烯中央刻蚀有石墨烯纳米孔，铂电极和纵向微弱电流测量装置及电源构成纵向微弱电流测量回路，金电极和横向微弱电流测量装置及电源构成横向微弱电流测量回路；在SOI硅片正面刻蚀倒锥形腔，背面刻蚀垂直柱状孔，腐蚀掉其上氧化埋层，形成固态纳米孔，将已经制备的石墨烯转移到SOI硅片表面，在石墨烯中央刻蚀出与固定纳米孔同轴的石墨烯纳米孔；将芯片、电源和电流表组成电路，通过测定DNA穿过纳米孔时电路中电流强度的变化，实现对DNA的测序。
Description
技术领域
本发明涉及生物分子检测技术领域，具体涉及一种基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的DNA测序装置及制作方法。
背景技术
DNA测序技术是现代生命科学研究的核心技术之一。在所有以低成本、高通量、直接测序为目标的第三代测序技术中，基于纳米孔的单分子测序被认为是最有希望实现1000美元人类基因检测计划的技术。
固态纳米孔的孔径可以灵活的人为控制，且具有理想的生化孔径稳定性，优异的物、化性能。借助于显微镜电子束技术、聚焦离子束技术(FIB)等工艺，研究人员已经成功制作出了各种孔径可控的纳米、亚纳米固态孔。各种基于固态纳米孔的DNA测序的研究也取得了很好的进展。
然而，固态纳米孔的制作也面临一些问题。首先，采用FIB制作固态纳米孔成本高且只能逐个制作；其次，固态纳米孔通道长度通常为5nm以上,可以容纳十多个碱基,这一尺寸对于测序所需要的分辨单个碱基引起的电流变化过长；再次，当单个核苷酸占据纳米孔时只有大约100个离子穿过纳米孔，而4个碱基在结构上只有数个原子的差异，这种细微的结构化差异导致的电流变化太微弱，以至于研究人员很难区分出每个碱基。第四，所有基于纳米孔的测序方法目前尚无有效的控制DNA通过纳米孔的流速的方法，由于速度太快，造成了碱基检测识别率不高的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提出了一种基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的DNA测序装置及制作方法，能够改善传统纳米孔离子电流阻塞法信噪比低、易受外界环境干扰等问题，从而提高测序精度。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的DNA测序装置，包括SOI硅片1，置于SOI硅片1内的二氧化硅埋层2，在二氧化硅埋层2上部的SOI硅片1上刻蚀有倒金字塔形微腔21，在二氧化硅埋层2下部的SOI硅片1上刻蚀有直径大于倒金字塔形微腔21塔底直径的柱状孔，倒金字塔形微腔21的塔顶为固态纳米孔20，二氧化硅薄膜5包覆在SOI硅片1外部，在柱状孔底部的二氧化硅薄膜5外部包覆有金属铂薄膜6，在SOI硅片1上部有通过金电极12固定于二氧化硅薄膜5上的石墨烯8，在石墨烯8中央刻蚀有石墨烯纳米孔19，石墨烯纳米孔19和固态纳米孔20同轴，在金电极12两端的SOI硅片1外部上下采用聚二甲基硅氧烷10包围形成空腔，空腔中填充有电解液18，置于SOI硅片1上部的铂电极13接负电位，置于SOI硅片1下部的铂电极13接正电位，铂电极13和纵向微弱电流测量装置15以及电源14构成纵向微弱电流测量回路，金电极12和横向微弱电流测量装置16以及电源22构成横向微弱电流测量回路。
所述二氧化硅埋层2的厚度为400nm。
所述固态纳米孔20的直径为1.5～10nm。
所述石墨烯8为单原子层或多原子层。
所述石墨烯纳米孔19的直径为1.5～7nm。
所述二氧化硅薄膜5厚度为5～30nm。
所述纵向微弱电流测量装置15和横向微弱电流测量装置16均为皮安级电流表。
所述电解液18为KCl、NaCl或LiCl溶液，其浓度为0.8～1.5mol/L,pH值为8.0。
所述电源14的偏置电压为0.05～0.2V，硅片上方的铂电极13接电源14负极，硅片下方铂电极13接电源14正极。
上述所述的DNA测序装置的制作方法，包括如下步骤：
步骤1：在SOI硅片1的正面覆盖一层300nm厚的保护材料铬3，在SOI硅片1的背面覆盖一层700nm厚的保护材料铝4，所述SOI硅片1为P型SOI硅片；
步骤2：采用光刻技术将需要在SOI硅片1上刻蚀出的图形加工到正面保护材料铬3上和背面保护材料铝4上，图形的深度到达SOI硅片1的表面；
步骤3：以保护材料铝4作为掩模，在SOI硅片1的背面运用感应耦合等离子体刻蚀的方法刻蚀出垂直的正方形柱状孔，正方形刻蚀窗口的边长为0.8～1.5mm，感应耦合等离子体刻蚀过程直到遇到SOI硅片1的二氧化硅埋层2时自停止；
步骤4：以保护材料铬3作为掩模，在SOI硅片1的正面采用KOH溶液各向异性湿法刻蚀的方法刻蚀出倒锥形的腔，根据SOI硅片1顶层硅的厚度H来设计KOH溶液各向异性湿法刻蚀窗口正方形的边长W，其关系式为：W＝2H/tanα，其中α是单晶硅（100）晶面与（111）晶面之间的夹角，为54.74°，KOH溶液配比为KOH：H2O：IPA=50g:100mL:10mL，其中IPA为异丙醇，刻蚀温度为60℃，精度控制在±1℃；
步骤5：使用氢氟酸溶液除去SOI硅片1的氧化埋层2，释放纳米孔，得到直径为10～30nm的固态纳米孔20；
步骤6：使用硝酸铈铵溶液除去SOI硅片1正面的保护材料铬3，使用磷酸溶液除去SOI硅片1背面的保护材料铝4；
步骤7：将制作有固态纳米孔20的SOI硅片1表面热氧化生长一层厚度为5～30nm的致密的二氧化硅薄膜5，此步骤既能够使固态纳米孔20直径收缩至1.5～10nm，又能够保证SOI硅片1与下一步中的石墨烯8保持良好的绝缘；
步骤8：在硅衬底背面感应耦合等离子体刻蚀区域溅射一层厚度为200～400nm的金属铂薄膜6，以此作为离子刻蚀石墨烯8形成石墨烯纳米孔19的掩模；
步骤9：采用CVD方法在铜基9上面制备的石墨烯8转移到SOI硅片1表面：首先以铜基9为基底通过CVD生长制备石墨烯8，并在石墨烯8表面旋涂聚甲基丙烯酸甲酯7；然后使用聚二甲基硅氧烷10自然粘合在聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯/铜基表面；接下来先把聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯/铜基置于FeCl3溶液11中腐蚀掉铜基9，并多次在去离子水中清洗，去除石墨烯8表面残存的金属离子；然后利用聚二甲基硅氧烷10把聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯转移到准备好的SOI硅片1上；再去除聚甲基丙烯酸甲酯7和聚二甲基硅氧烷10。
步骤10：在石墨烯8两端淀积金电极12，以此可将石墨烯固定在SOI硅片1上。
步骤11：以金属铂薄膜6为掩模，运用离子自对准刻蚀在微尺寸石墨烯8上制备直径为1.5～7nm的石墨烯纳米孔19。
步骤12：在两个金电极12之间接入横向微弱电流测量装置16和电源22，在两个铂电极13之间接入纵向微弱电流测量装置15和提供驱动单链DNA17穿过石墨烯纳米孔19和固态纳米孔20电场的电源14，最后制得基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的DNA测序装置。
本发明和现有技术相比，具有如下优点：
1）、一种基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔（GPCP）结构的新型DNA测序装置，即利用传统的硅材料及新材料石墨烯设计一种新型石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔（GPCP）的结构。固态纳米孔克服了生物分子纳米孔的不稳定性和孔径不易控制性；石墨烯纳米孔的采用解决了常规固态纳米孔通道太长导致测序分辨率难以达到单个碱基的问题。此外，这种结构还在一定程度上实现了对核酸分子穿越纳米孔的速度控制，为检测赢得了时间；这些为实现单碱基分辨率、直接纳米孔测序奠定了基础。同时利用纳米孔纵向离子电流和石墨烯横向电导率变化的双数据解析测序新思想。采用这种双向数据解析测序可以提供核酸分子穿越石墨烯纳米孔-腔-孔结构时更多的信息，有望改善传统纳米孔离子电流阻塞法信噪比低、易受外界环境干扰等问题，从而提高测序精度，有望从根本上解决目前新一代DNA测序所面临的问题。
2）、由于本发明采用KOH溶液各向异性湿法刻蚀与感应耦合等离子体干法刻蚀相结合的方法，在SOI硅片上制作固态纳米孔，并结合石墨烯纳米孔构成石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的GPCP结构，通过施加电场使得带负电荷的核酸分子穿过GPCP结构，该结构不但可以控制DNA通过孔的速度，同时由于采用了石墨烯材料，可以进行纵向离子电流和横向电流检测，实现双数据解析精确测算核酸序列，有望从根本上解决目前新一代DNA测序所面临的问题。
附图说明
图1为本发明基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的DNA测序装置的示意图。
图2为本发明中制作固态纳米孔的流程图。
图3为本发明制备石墨烯的流程图。
图4为本发明将制备的石墨烯转移到SOI硅片上的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
如图1所示，本发明一种基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的DNA测序装置，包括SOI硅片1，置于SOI硅片1内的二氧化硅埋层2，在二氧化硅埋层2上部的SOI硅片1上刻蚀有倒金字塔形微腔21，在二氧化硅埋层2下部的SOI硅片1上刻蚀有直径大于倒金字塔形微腔21塔底直径的柱状孔，倒金字塔形微腔21的塔顶为固态纳米孔20，二氧化硅薄膜5包覆在SOI硅片1外部，在柱状孔底部的二氧化硅薄膜5外部包覆有金属铂薄膜6，在SOI硅片1上部有通过金电极12固定于二氧化硅薄膜5上的石墨烯8，在石墨烯8中央刻蚀有石墨烯纳米孔19，石墨烯纳米孔19和固态纳米孔20同轴，在金电极12两端的SOI硅片1外部上下采用聚二甲基硅氧烷10包围形成空腔，空腔中填充有电解液18，置于SOI硅片1上部的铂电极13接负电位，置于SOI硅片1下部的铂电极13接正电位，铂电极13和纵向微弱电流测量装置15以及电源14构成纵向微弱电流测量回路，金电极12和横向微弱电流测量装置16以及电源22构成横向微弱电流测量回路。
优选二氧化硅埋层2的厚度为400nm。
优选固态纳米孔20的直径为1.5～10nm。
优选石墨烯8为单原子层或多原子层。
优选石墨烯纳米孔19的直径为1.5～7nm。
优选二氧化硅薄膜5厚度为5～30nm。
优选纵向微弱电流测量装置15和横向微弱电流测量装置16均为皮安级电流表。
优选电解液18为KCl、NaCl或LiCl溶液，其浓度为0.8～1.5mol/L,pH值为8.0。
优选电源14的偏置电压为0.05～0.2V，硅片上方的铂电极13接电源14负极，硅片下方铂电极13接电源14正极。
本发明还提供了一种基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的DNA测序装置的制作方法，如图2、图3和图4所示，包括以下步骤：
步骤1：在SOI硅片1的正面覆盖一层300nm厚的保护材料铬3，在SOI硅片1的背面覆盖一层700nm厚的保护材料铝4，保护材料铬3和保护材料铝4均采用磁控溅射的方法生成，所述SOI硅片1为P型SOI硅片；
步骤2：采用光刻技术将需要在SOI硅片1上刻蚀出的图形加工到正面保护材料铬3上和背面保护材料铝4上，图形的深度到达SOI硅片1的表面；
步骤3：以保护材料铝4作为掩模，在SOI硅片1的背面运用感应耦合等离子体刻蚀的方法刻蚀出垂直的正方形柱状孔，正方形刻蚀窗口的边长为0.8～1.5mm，感应耦合等离子体刻蚀过程直到遇到SOI硅片1的二氧化硅埋层2时自停止；
步骤4：以保护材料铬3作为掩模，在SOI硅片1的正面采用KOH溶液各向异性湿法刻蚀的方法刻蚀出倒锥形的腔，根据SOI硅片1顶层硅的厚度H来设计KOH溶液各向异性湿法刻蚀窗口正方形的边长W，其关系式为：W=2H/tanα，其中α是单晶硅（100）晶面与（111）晶面之间的夹角，约为54.74°，KOH溶液配比为KOH：H2O：IPA=50g:100mL:10mL，其中IPA为异丙醇，刻蚀温度为60℃，精度控制在±1℃；
步骤5：使用氢氟酸溶液除去SOI硅片1的氧化埋层2，释放纳米孔，得到直径为10～30nm的固态纳米孔20；
步骤6：使用硝酸铈铵溶液除去SOI硅片1正面的保护材料铬3，使用磷酸溶液除去SOI硅片1背面的保护材料铝4；
步骤7：将制作有固态纳米孔20的SOI硅片1表面热氧化生长一层厚度为5～30nm的致密的二氧化硅薄膜5，此步骤既能够使固态纳米孔20直径收缩至1.5～10nm，又能够保证SOI硅片1与下一步中的石墨烯8保持良好的绝缘；
步骤8：在硅衬底背面感应耦合等离子体刻蚀区域溅射一层厚度为200～400nm的金属铂薄膜6，以此作为离子刻蚀石墨烯8形成石墨烯纳米孔19的掩模；
步骤9：把以铜基9CVD方法制备的石墨烯8转移到SOI硅片1表面：首先以铜基9为基底通过CVD生长制备石墨烯8，并在石墨烯8表面旋涂聚甲基丙烯酸甲酯7；然后使用聚二甲基硅氧烷10自然粘合在聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯/铜基表面；接下来先把聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯/铜基置于FeCl3溶液11中腐蚀掉铜基9，并多次在去离子水中清洗，去除石墨烯8表面残存的金属离子；然后利用聚二甲基硅氧烷10把聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯转移到准备好的SOI硅片1上；再去除聚甲基丙烯酸甲酯7和聚二甲基硅氧烷10；
步骤10：在石墨烯8两端淀积金电极12，以此可将石墨烯固定在SOI硅片1上。
步骤11：以金属铂薄膜6为掩模，运用离子自对准刻蚀在微尺寸石墨烯8上制备直径为1.5～7nm的石墨烯纳米孔19。
步骤12：在两个金电极12之间接入横向微弱电流测量装置16和电源22，在两个铂电极13之间接入纵向微弱电流测量装置15和提供驱动单链DNA17穿过石墨烯纳米孔19和固态纳米孔20电场的电源14，最后制得基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的DNA测序装置。
Claims (10)
1.基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的DNA测序装置，其特征在于：包括SOI硅片(1)，置于SOI硅片(1)内的二氧化硅埋层(2)，在二氧化硅埋层(2)上部的SOI硅片(1)上刻蚀有倒金字塔形微腔(21)，在二氧化硅埋层(2)下部的SOI硅片(1)上刻蚀有直径大于倒金字塔形微腔(21)塔底直径的柱状孔，倒金字塔形微腔(21)的塔顶为固态纳米孔(20)，二氧化硅薄膜(5)包覆在SOI硅片(1)外部，在柱状孔底部的二氧化硅薄膜(5)外部包覆有金属铂薄膜(6)，在SOI硅片(1)上部有通过金电极(12)固定于二氧化硅薄膜(5)上的石墨烯(8)，在石墨烯(8)中央刻蚀有石墨烯纳米孔(19)，石墨烯纳米孔(19)和固态纳米孔(20)同轴，在金电极(12)两端的SOI硅片(1)外部上下采用聚二甲基硅氧烷(10)包围形成空腔，空腔中填充有电解液(18)，置于SOI硅片(1)上部的铂电极(13)接负电位，置于SOI硅片(1)下部的铂电极(13)接正电位，铂电极(13)和纵向微弱电流测量装置(15)以及电源(14)构成纵向微弱电流测量回路，金电极(12)和横向微弱电流测量装置(16)以及电源(22)构成横向微弱电流测量回路。
2.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述二氧化硅埋层(2)的厚度为400nm。
3.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述固态纳米孔(20)的直径为1.5～10nm。
4.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述石墨烯(8)为单原子层或多原子层。
5.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述石墨烯纳米孔(19)的直径为1.5～7nm。
6.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述二氧化硅薄膜(5)厚度为5～30nm。
7.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述纵向微弱电流测量装置(15)和横向微弱电流测量装置(16)均为皮安级电流表。
8.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述电解液(18)为KCl、NaCl或LiCl溶液，其浓度为0.8～1.5mol/L，pH值为8.0。
9.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于，所述电源(14)的偏置电压为0.05～0.2V，硅片上方的铂电极(13)接电源(14)负极，硅片下方铂电极(13)接电源(14)正极。
10.权利要求1至9任一项所述的DNA测序装置的制作方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：在SOI硅片(1)的正面覆盖一层300nm厚的保护材料铬(3)，在SOI硅片(1)的背面覆盖一层700nm厚的保护材料铝(4)，所述SOI硅片(1)为P型SOI硅片；
步骤2：采用光刻技术将需要在SOI硅片(1)上刻蚀出的图形加工到正面保护材料铬(3)上和背面保护材料铝(4)上，图形的深度到达SOI硅片(1)的表面；
步骤3：以保护材料铝(4)作为掩模，在SOI硅片(1)的背面运用感应耦合等离子体刻蚀的方法刻蚀出垂直的正方形柱状孔，正方形刻蚀窗口的边长为0.8～1.5mm，感应耦合等离子体刻蚀过程直到遇到SOI硅片(1)的二氧化硅埋层(2)时自停止；
步骤4：以保护材料铬(3)作为掩模，在SOI硅片(1)的正面采用KOH溶液各向异性湿法刻蚀的方法刻蚀出倒锥形的腔，根据SOI硅片(1)顶层硅的厚度H来设计KOH溶液各向异性湿法刻蚀窗口正方形的边长W，其关系式为：W＝2H/tanα，其中α是单晶硅100晶面与111晶面之间的夹角，为54.74°，KOH溶液配比为KOH∶H2O∶IPA＝50g∶100mL∶10mL，其中IPA为异丙醇，刻蚀温度为60℃，精度控制在±1℃；
步骤5：使用氢氟酸溶液除去SOI硅片(1)的氧化埋层(2)，释放纳米孔，得到直径为10～30nm的固态纳米孔(20)；
步骤6：使用硝酸铈铵溶液除去SOI硅片(1)正面的保护材料铬(3)，使用磷酸溶液除去SOI硅片(1)背面的保护材料铝(4)：
步骤7：将制作有固态纳米孔(20)的SOI硅片(1)表面热氧化生长一层厚度为5～30nm的致密的二氧化硅薄膜(5)，此步骤既能够使固态纳米孔(20)直径收缩至1.5～10nm，又能够保证SOI硅片(1)与下一步中的石墨烯(8)保持良好的绝缘；
步骤8：在硅衬底背面感应耦合等离子体刻蚀区域溅射一层厚度为200～400nm的金属铂薄膜(6)，以此作为离子刻蚀石墨烯(8)形成石墨烯纳米孔(19)的掩模；
步骤9：把以铜基(9)CVD方法制备的石墨烯(8)转移到SOI硅片(1)表面：首先以铜基(9)为基底通过CVD生长制备石墨烯(8)，并在石墨烯(8)表面旋涂聚甲基丙烯酸甲酯(7)；然后使用聚二甲基硅氧烷(10)自然粘合在聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯/铜基表面；接下来先把聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯/铜基置于FeCl3溶液(11)中腐蚀掉铜基(9)，并多次在去离子水中清洗，去除石墨烯(8)表面残存的金属离子；然后利用聚二甲基硅氧烷(10)把聚甲基丙烯酸甲酯/石墨烯转移到准备好的SOI硅片(1)上；再去除聚甲基丙烯酸甲酯(7)和聚二甲基硅氧烷(10)；
步骤10：在石墨烯(8)两端淀积金电极(12)，以此可将石墨烯固定在SO1硅片(1)上；
步骤11：以金属铂薄膜(6)为掩模，运用离子自对准刻蚀在微尺寸石墨烯(8)上制备直径为1.5～7nm的石墨烯纳米孔(19)；
步骤12：在两个金电极(12)之间接入横向微弱电流测量装置(16)和电源(22)，在两个铂电极(13)之间接入纵向微弱电流测量装置(15)和提供驱动单链DNA(17)穿过石墨烯纳米孔(19)和固态纳米孔(20)电场的电源(14)，最后制得基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔的DNA测序装置。
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