CN106399463A - 一种单分子基因测序方法与装置 - Google Patents

Abstract

一种单分子基因测序方法，其包括步骤：在碳化硅衬底上生长散列的量子点颗粒；引导被测DNA分子进入间隙；由单电子电极阵列获取石墨烯的电子分布，通过快电子学输出给计算机；从单电子电极阵列输出的高速信号中重建DNA分子的时间和蜿蜒轨迹信息；获取系统响应矩阵；反演系统响应矩阵获得带有次序的核苷酸种类组成的向量。一种单分子基因测序装置，其中包括量子点薄膜间隙模块、DNA分子运动控制模块、单电子读出模块、系统响应矩阵计算模块、DNA序列估计模块。通过采用本发明的单分子基因测序方法与装置，能有效提高探测的测序精度，减少测序时间，避免基因扩增带来的偏向性误差，特别适合于手持终端和实时性要求高的应用场合。

Description

一种单分子基因测序方法与装置

技术领域

本发明涉及数字信号处理、生物信息和生物医学检测领域，尤其涉及一种单分子测序方法与装置。

背景技术

基因测序（Gene sequencing，或译基因定序）是指分析特定基因片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的基因测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。

在基础生物学研究中，和在众多的应用领域，如诊断，生物技术，法医生物学，生物系统学中，基因序列知识已成为不可缺少的知识。具有现代的基因测序技术的快速测序速度已经有助于达到测序完整的DNA（deoxyribonucleic acid，又称脫氧核糖核酸）序列，或多种类型的基因组测序和生命物种，包括人类基因组和其他许多动物，植物和微生物物种的完整DNA序列。

RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。目前应用最广泛的是由弗雷德里克·桑格发明的Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）。新的测序方法，例如454生物科学的方法和焦磷酸测序法。

马克萨姆-吉尔伯特测序（Maxam-Gilbert sequencing）是一项由阿伦·马克萨姆与沃尔特·吉尔伯特于1976～1977年间开发的DNA测序方法。此项方法基于：对核碱基特异性地进行局部化学改性，接下来在改性核苷酸毗邻的位点处DNA骨架发生断裂。

Sanger（桑格）双脱氧链终止法是弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶连锁反应（PCR，Polymerase chain reaction）。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸又少了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个。

霰弹枪定序法（Shotgun sequencing，又称鸟枪法）是一种广泛使用的为长DNA测序的方法，比传统的定序法快速，但精确度较差。曾经使用于塞雷拉基因组（Celera Genomics）公司所主持的人类基因组计划。

454测序法由454生物科学发明，是一个类似焦磷酸测序法的新方法。2003年向GenBank提交了一个腺病毒全序列，使得他们的技术成为Sanger测序法后第一个被用来测生物基因组全序列的新方法。454使用类似于焦磷酸测序的方法，有着相当高的读取速度，大约为5小时可以测两千万碱基对。

由于以上方法在测序时间、测序成本和测序无偏性上仍不能满足生物医学检测日益增长的需求，有必要提出一种测序时间短、测序流程简单、测序成本低廉、准确度高且没有PCR过程因而没有扩增偏向性的测序方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种单分子基因测序方法与装置，该方法与装置能有效地读出一个单分子基因单链的碱基序列。由于该测序过程不需要PCR和其他预备过程，该测序方法具有较高的测序效率和较低的测序成本。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种单分子基因测序方法，其包括步骤：

S1：在碳化硅衬底上生长散列的量子点颗粒，并用扫描电子显微镜对每个量子点进行定位，定位后，附上石墨烯薄膜，并在石墨烯薄膜上外延单电子电极阵列；

S2：采用电磁导引和微流控技术，引导被测DNA分子进入石墨烯薄膜和碳化硅衬底的间隙；

S3：DNA分子在带有量子点的薄膜间隙中游动时，不断地扭曲量子点附近的电子云结构，该电子云的涨落进一步影响石墨烯的电子分布情况，单电子电极阵列获取石墨烯的电子分布，通过快电子学输出给计算机；

S4：从单电子电极阵列输出的高速信号中重建DNA分子的时间和蜿蜒轨迹信息；

S5：采用已知的DNA片段测试电极阵列的系统响应矩阵，系统响应矩阵的精度足以分清四种核苷酸对电极不同的影响；

S6：以轨迹附近的单电子电极的电流大小组成的向量为输出，通过反演这个系统响应矩阵，计算带有次序的核苷酸种类组成的向量。

优选地，在上述的单分子基因测序方法中，所述碳化硅衬底是指有碳化硅材料制成的光滑衬底结构，以此结构为基础，可以方便地外延其他微结构，用以实现特殊的电子或者机械功能。

优选地，在上述的单分子基因测序方法中，所述的电磁导引是指通过设定和改变空间内的电磁场，对带电的微粒或者DNA分子进行输运操控的工艺制程。

优选地，在上述的单分子基因测序方法中，所述的微流控技术，一种精确控制和操控微尺度流体，尤其特指亚微米结构的技术。

优选地，在上述的单分子基因测序方法中，所述带有量子点的薄膜间隙是指由碳化硅衬底、散列量子点和石墨烯薄膜构成的三维结构，由于碳化硅衬底和石墨烯薄膜之间存在散列量子点，在其间会产生一种二维的微纳结构。

优选地，在上述的单分子基因测序方法中，所述测试电极阵列的系统响应矩阵是指测试电极阵列接收到DNA分子在不同位置的电磁感应的响应关系，这里用矩阵严格地表示这种数量关系。

一种单分子基因测序装置，其中包括量子点薄膜间隙模块、DNA分子运动控制模块、单电子读出模块、系统响应矩阵计算模块、DNA序列估计模块，其中，

量子点薄膜间隙模块，用于形成测序的电子学、动力学的薄膜间隙结构，是DNA测序的主要工作场所；

DNA分子运动控制模块，用于控制DNA分子在薄膜间隙当中游动，在一些特殊的场合要求能精确控制DNA分子的速度和加速度；

单电子读出模块，以单电子器件对石墨烯薄膜上的电位电荷变化进行实时测量，并以数字形式尽心存储；

系统响应矩阵计算模块，用于计算薄膜间隙内的每一个像素对单电子电极阵列的系统响应矩阵；

DNA序列估计模块，用于对DNA序列进行估计，主要是反演一个大规模的线性方程组。

从上述技术方案可以看出，通过采用本发明的单分子基因测序方法与装置，能有效提高基因测序的信噪比，免去了基因扩增带来的有偏影响，特别适合于实时基因诊断和超微量样本的基因测序。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）DNA序列的无扩增设计，保证了DNA序列不受扩增中的条件影响；

（2）测序流程简单，因而具有更加快速的测序时间、灵活性，较一般的测序方式应用更为广泛；

（3）高灵敏的系统设计，由于本测序方法为单DNA分子直接测序，因而具有更加高的灵敏度，而不受环境和样本的限制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的有关本发明的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明单分子基因测序方法的流程图；

图2为本发明切单分子基因测序装置的装置结构图；

图3为本发明的系统原型模块间示意图；

图4为本发明的读出电路的示意图；

图5为本发明典型的单电子电极阵列的示意图；

图6为本发明典型的散列量子点示意图；

图7为本发明典型的单个电极的电路版示意图；

图8为本发明典型的观测矩阵一；

图9为本发明典型的观测矩阵二；

图10为本发明典型的观测矩阵三；

图11为本发明典型的观测矩阵四。

具体实施方式

本发明公开了一种单分子基因测序方法与装置，该方法与装置能有效地实现单个分子的直接测序，提升测序的速度和精度。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明公开的一种单分子基因测序方法与装置通过以散列量子点的形式读出DNA分子的核苷酸序列在薄膜电极中施加的电磁力，再利用相应的物理电子学技术获取DNA碱基序列，具体的方法步骤为：

S1：在碳化硅衬底上生长散列的量子点颗粒，并用扫描电子显微镜对每个量子点进行定位，定位后，附上石墨烯薄膜，并在石墨烯薄膜上外延单电子电极阵列；

S2：采用电磁导引和微流控技术，引导被测DNA分子进入石墨烯薄膜和碳化硅衬底的间隙；

S3：DNA分子在带有量子点的薄膜间隙中游动时，不断地扭曲量子点附近的电子云结构，该电子云的涨落进一步影响石墨烯的电子分布情况，单电子电极阵列获取石墨烯的电子分布，通过快电子学输出给计算机；

S4：从单电子电极阵列输出的高速信号中重建DNA分子的时间和蜿蜒轨迹信息；

S5：采用已知的DNA片段测试电极阵列的系统响应矩阵，系统响应矩阵的精度足以分清四种核苷酸对电极不同的影响；

S6：以轨迹附近的单电子电极的电流大小组成的向量为输出，通过反演这个系统响应矩阵，计算带有次序的核苷酸种类组成的向量。

以上单分子基因测序方法与装置中，所述碳化硅衬底是指有碳化硅材料制成的光滑衬底结构，以此结构为基础，可以方便地外延其他微结构，用以实现特殊的电子或者机械功能。

以上单分子基因测序方法与装置中，所述的电磁导引是指通过设定和改变空间内的电磁场，对带电的微粒或者DNA分子进行输运操控的工艺制程。

以上单分子基因测序方法与装置中，所述的微流控技术，一种精确控制和操控微尺度流体，尤其特指亚微米结构的技术。

以上单分子基因测序方法与装置中，所述带有量子点的薄膜间隙是指由碳化硅衬底、散列量子点和石墨烯薄膜构成的三维结构，由于碳化硅衬底和石墨烯薄膜之间存在散列量子点，在其间会产生一种二维的微纳结构。

以上单分子基因测序方法与装置中，所述测试电极阵列的系统响应矩阵是指测试电极阵列接收到DNA分子在不同位置的电磁感应的响应关系，这里用矩阵严格地表示这种数量关系。

如图2所示，本发明公开的一种单分子基因测序装置，其中包括量子点薄膜间隙模块、DNA分子运动控制模块、单电子读出模块、系统响应矩阵计算模块、DNA序列估计模块，其中，

量子点薄膜间隙模块，用于形成测序的电子学、动力学的薄膜间隙结构，是DNA测序的主要工作场所；

DNA分子运动控制模块，用于控制DNA分子在薄膜间隙当中游动，在一些特殊的场合要求能精确控制DNA分子的速度和加速度；

单电子读出模块，以单电子器件对石墨烯薄膜上的电位电荷变化进行实时测量，并以数字形式尽心存储；

系统响应矩阵计算模块，用于计算薄膜间隙内的每一个像素对单电子电极阵列的系统响应矩阵；

DNA序列估计模块，用于对DNA序列进行估计，主要是反演一个大规模的线性方程组。

图3为本发明的系统原型模块间示意图；图4为本发明的读出电路的示意图；图5为本发明典型的单电子电极阵列的示意图；图6为本发明典型的散列量子点示意图；图7为本发明典型的单个电极的电路版示意图；图8为本发明典型的观测矩阵一；图9为本发明典型的观测矩阵二；图10为本发明典型的观测矩阵三；图11为本发明典型的观测矩阵四。结合图3、图4及图7，通过几个具体的实施例，对本发明单分子基因测序方法与装置做进一步描述。本发明提出的单电子时间分辨的单分子基因测序方法与装置，其涉及到的参数、滤波器设计、大规模矩阵反演需要根据与获取数据的特点进行调节以达到良好的核苷酸分辨性能和较短的电脉冲持续时间。此处列出所涉及的应用实施例处理数据的参数。

实例1：

此处列出本实施例1处理数据的参数：

步骤（1）量子点数目为每平方微米2000-10000个，量子点间距大于0.5nm小于15nm；

步骤（2）采用强电场驱动弱磁场聚焦，控制DNA链沿着小孔方向以每秒钟5微米到5毫米的速度流动；

步骤（3）采用普通的台式计算机，数据的吞吐量在1M/s到8M/s之间；

步骤（4）通过控制流速，DNA分子的总曲率40度以内；

步骤（5）通过采用实验加仿真的方式获取系统响应矩阵，5次独立的测试后，要求错误率在百万分之一以下；

步骤（6）采用解析的大规模线性方程组求解方法，直接绘出核苷酸在不同位置的种类。

实例2：

此处列出本应用实例2处理数据的参数：

步骤（1）量子点数目为每平方微米200-50000个，量子点间距大于0.1nm小于15nm；

步骤（2）采用强电场驱动弱磁场聚焦，控制DNA链沿着小孔方向以每秒钟50微米到10毫米的速度流动；

步骤（3）采用普通的智能手机作为数据接入载体，可上网发布，数据的吞吐量在100k/s到800k/s之间；

步骤（4）通过控制流速，DNA分子的总曲率30度以内；

步骤（5）通过采用实验加仿真的方式获取系统响应矩阵，500次独立的测试后，要求错误率在十万分之一以下；

步骤（6）采用迭代的大规模线性方程组求解方法，逼近地绘出核苷酸在不同位置的种类，迭代次数在100次以内。

本发明的单分子基因测序方法和装置可以用于生物信息技术，包括动物样本、植物样本分析、临床样本仪器。

通过对比可以看出，通过采用本发明的单分子基因测序方法和装置，能有效提高装置的测序信噪比，抵御外界噪声信号影响，特别适合于小动物或者临床等快速测序的应用场景。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）DNA序列的无扩增设计，保证了DNA序列不受扩增中的条件影响；

（2）测序流程简单，因而具有更加快速的测序时间、灵活性，较一般的测序方式应用更为广泛；

（3）高灵敏的系统设计，由于本测序方法为单DNA分子直接测序，因而具有更加高的灵敏度，而不受环境和样本的限制。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种单分子基因测序方法，其特征在于包括步骤：

S1：在碳化硅衬底上生长散列的量子点颗粒，并用扫描电子显微镜对每个量子点进行定位，定位后，附上石墨烯薄膜，并在石墨烯薄膜上外延单电子电极阵列；

S2：采用电磁导引和微流控技术，引导被测DNA分子进入石墨烯薄膜和碳化硅衬底的间隙；

S3：DNA分子在带有量子点的薄膜间隙中游动时，不断地扭曲量子点附近的电子云结构，该电子云的涨落进一步影响石墨烯的电子分布情况，单电子电极阵列获取石墨烯的电子分布，通过快电子学输出给计算机；

S4：从单电子电极阵列输出的高速信号中重建DNA分子的时间和蜿蜒轨迹信息；

S5：采用已知的DNA片段测试电极阵列的系统响应矩阵，系统响应矩阵的精度足以分清四种核苷酸对电极不同的影响；

S6：以轨迹附近的单电子电极的电流大小组成的向量为输出，通过反演这个系统响应矩阵，计算带有次序的核苷酸种类组成的向量。

2.根据权利要求1所述的单分子基因测序方法，其特征在于：在碳化硅衬底上生长散列的量子点颗粒，并用扫描电子显微镜对每个量子点进行定位，定位后，附上石墨烯薄膜，并在石墨烯薄膜上外延单电子电极阵列。

3.根据权利要求1所述的单分子基因测序方法，其特征在于：采用电磁导引和微流控技术，引导被测DNA分子进入石墨烯薄膜和碳化硅衬底的间隙。

4.根据权利要求1所述的单分子基因测序方法，其特征在于：DNA分子在带有量子点的薄膜间隙中游动时，不断地扭曲量子点附近的电子云结构，该电子云的涨落进一步影响石墨烯的电子分布情况，单电子电极阵列获取石墨烯的电子分布，通过快电子学输出给计算机。

5.根据权利要求1所述的单分子基因测序方法，其特征在于：从单电子电极阵列输出的高速信号中重建DNA分子的时间和蜿蜒轨迹信息。

6.根据权利要求1所述的单分子基因测序方法，其特征在于：采用已知的DNA片段测试电极阵列的系统响应矩阵，系统响应矩阵的精度足以分清四种核苷酸对电极不同的影响。

7.根据权利要求1所述的单分子基因测序方法，其特征在于：以轨迹附近的单电子电极的电流大小组成的向量为输出，通过反演这个系统响应矩阵，计算带有次序的核苷酸种类组成的向量。

8.一种单分子基因测序装置，其特征在于包括：量子点薄膜间隙模块、DNA分子运动控制模块、单电子读出模块、系统响应矩阵计算模块、DNA序列估计模块，其中，

量子点薄膜间隙模块，用于形成测序的电子学、动力学的薄膜间隙结构，是DNA测序的主要工作场所；

DNA分子运动控制模块，用于控制DNA分子在薄膜间隙当中游动，在一些特殊的场合要求能精确控制DNA分子的速度和加速度；

单电子读出模块，以单电子器件对石墨烯薄膜上的电位电荷变化进行实时测量，并以数字形式尽心存储；

系统响应矩阵计算模块，用于计算薄膜间隙内的每一个像素对单电子电极阵列的系统响应矩阵；

DNA序列估计模块，用于对DNA序列进行估计，主要是反演一个大规模的线性方程组。