CN109554452A - 基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明属于DNA测序技术领域，公开了一种基于固态纳米孔技术检测超低浓度分子标志物的方法。该方法主要利用纳米孔两侧的盐浓度梯度来实现低浓度DNA、RNA分子的检测，具有高通量、周期短、信噪比较高、精度较高的优点，对疾病的早期检测和治疗具有重大的意义。同时，本发明还公开了一种SiNx薄膜固态纳米孔反应装置，该装置能够克服生物分子纳米孔的不稳定性和孔径不易控制性，还能改善了传统纳米孔检测装置信噪比低、易受外界环境干扰等问题。

Description

基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法及装置
技术领域
本发明属于DNA测序技术，具体涉及一种SiNx薄膜固态纳米孔技术检测飞摩尔量级浓度分子标志物的方法及装置。
背景技术
DNA测序技术作为人类探索生命秘密的重要手段之一，其技术水平不断发展，成为生命科学研究的核心领域，对生物、化学、电学、生命科学、医学等领域的技术发展起到巨大的推动作用。DNA测序技术自诞生以来经历了几代变革。
第一代技术使用的是1977年Sanger等人发明的经典双脱氧核苷酸末端终止测序法，以及Gilbert等人提出的类似的化学降解法。第二代技术作为目前市场上主流的DNA测序技术,较第一代测序技术而言,测量通量明显提高。如Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLID技术。第三代技术以Pacific Biosciences公司的RS系统为代表,以单分子实时测序为主要特点,对单个荧光分子进行高灵敏度检测,从而快速获得DNA序列信息。纳米孔测序技术是第四代测序技术,用于DNA测序的纳米孔有两类：生物纳米孔(α-溶血素)和固态纳米孔(包括各种硅基材料、SiNx、碳纳米管、石墨烯、玻璃纳米管等)。相比于生物纳米孔,固态纳米孔在稳定性、电流噪声、工艺集成方面有着显著的优势。
然而，基于纳米孔的DNA测序方法从1996年被提出至今，越来越多的研究小组投入到这项研究，但该技术发展至今仍没有达到预期的检测目标。这主要是由于纳米通道的尺寸限制效应和边界层问题的复杂性，使得建立描述以DNA聚合物链为对象的聚合物纳流体动力学的数学模型非常困难，生物分子在纳通道内运动规律很难建立，因此要利用纳米孔技术对DNA进行测序，真正实现商业化应用还面临着严峻的挑战，需要科学家进一步探索，如提高通道的选择性和灵敏度、控制DNA穿越速度及提高信噪比等。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于固态纳米孔并利用其两侧的盐浓度梯度，实现检测超低浓度DNA、RNA分子的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法，该方法使用了一种SiNx薄膜固态纳米孔反应装置，该装置主要由7个部分组成，分别是样品池(1)，SiNx薄膜基片(4)，SiNx薄膜将样品池分隔为顺式腔(2)和反式腔(3)，SiNx薄膜上有电击击穿的纳米孔(5)，连接顺式腔和反式腔的电极(6)和外接电源(7)。检测目标分子标志物时前，先用多级电流脉冲击穿法在SiNx薄膜上制备出纳米孔(5)，随后在纳米孔两侧的顺式腔(2)和反式腔(3)中形成盐浓度梯度，最后在样品池(1)两端施加电压驱使待测分子过孔从而产生离子阻塞电流脉冲信号，最后将采集到的信号进行分析以检索出目标分子。
进一步，SiNx薄膜在使用时先置于无水乙醇中浸泡10-15min对其窗口表面进行亲疏水性的处理，然后取出并将其放入去离子水中浸泡1-2分钟洗去表面无水乙醇，最后将其组装入样品池中备用。
进一步，样品池的两腔内先分别注入无水乙醇以达到去除腔室气泡的目的，然后用去离子水清洗三次，再注入由LiCl、Tris和EDTA混合液组成电解液。
进一步，LiCl、Tris和EDTA的比例为1M：10mM：1mM。
进一步，样品池的顺式腔接地，两个储液腔室与计算机控制的源表keithley2450通过两根银电极形成一个闭合回路，于反式腔端施加电流脉冲，设置起始电流、步长、目标孔径来制备纳米孔。纳米孔的孔径大小是通过调节脉冲电流的大小和时间间隔来控制。对纳米电极间距的精确控制是电极加工的主要难题，如果两电极间距过大，很难测到DNA分子过孔时产生的隧道电流；如果间距过小，则DNA过孔时容易粘附在电极上，很难保持线性自然的姿态，导致检测的电流信号不能真实的体现DNA结构。
进一步，检测的分子标志物浓度范围为10nM-0.01fM。
进一步，反式腔中盐溶液的浓度范围为0.5M-5M。
进一步，盐溶液可以为LiCl、KCl、NaCl中的一种。但本发明在实验中发现，LiCl溶液相较于KCl和NaCl在获得较高信噪比信号和更多的信号量方面具有明显的优势，且随着浓度梯度的增加其优势更加的明显，因此本发明优选的盐溶液为LiCl。
进一步，将检测物与盐溶液注入顺式腔，反式腔注入盐溶液，使样品池两端形成十倍的盐浓度梯度，反式腔的浓度大于顺式腔的浓度。盐浓度梯度能增加单位时间内的信号量目前已被多方研究所证实。
本发明的另一目的还在于提供一种SiNx薄膜固态纳米孔反应装置。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种SiNx薄膜固态纳米孔反应装置，该装置主要由7个部分组成，分别是样品池(1)，SiNx薄膜基片(4)，SiNx薄膜将样品池分隔为顺式腔(2)和反式腔(3)，SiNx薄膜上有电击击穿的纳米孔(5)，连接顺式腔和反式腔的电极(6)和外接电源(7)；该装置的纳米孔大小为2-6nm。
本发明的有益效果：本发明提供了一种基于固态纳米孔技术检测飞摩尔量级浓度分子标志物的方法。1)该技术具有高通量、周期短、信噪比较高、检测费用低、实现百万分之一的分子检测精度等优点。2)该方法将固态纳米孔技术应用于早期疾病分子(DNA、RNA)的检测，通过对分子标志物经过纳米孔时产生的特征电流信号的分析，从而获得标志物分子是否存在以及其形态，序列，长度等信息，对疾病的早期检测和治疗具有重大的意义。本发明还提供了一种SiNx薄膜固态纳米孔反应装置，该装置能够克服生物分子纳米孔的不稳定性和孔径不易控制性，还能改善传统纳米孔检测装置信噪比低、易受外界环境干扰等问题。
附图说明
图1：原理示意图
图2：1-10倍盐浓度梯度下10pM43T-MER-AssDNA的检测结果
图3：10nM-0.01fM浓度下43T-MER-AssDNA的信号量
图4：10倍盐浓度梯度的LiCl盐溶液下0.01fM的43T-MER-AssDNA过孔的散点图、幅值分析柱状图、时间分析柱状图
图5：3种不同分析物比例下ssDNA：dsDNA信号图
图6：SiNx薄膜固态纳米孔反应装置
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
一.检测步骤：
1.将SiNx薄膜基片置于无水乙醇中浸泡10-15min对其窗口表面进行亲疏水性的处理；然后取出并将其放入去离子水中浸泡1-2分钟洗去表面无水乙醇；最后将其组装入检测夹具中。
2.将SiNx薄膜基片封装于样品池中，顺式腔加入0.5M LiCl，10mM Tris，1mM EDTA与10pM 43T-MER-AssDNA的混合物；反式腔加入0.5M-5M LiCl盐溶液。
3.通电，电压250mV，检测。对每组的信号进行统计从而得出相同时间段内每组的信号量。
二.检测结果：
检测结果如图2所示。
图2展示了：(a)1，6，10倍盐浓度梯度下的信号。可以看出10倍盐浓度梯度下信号量十分密集且具有较高的信噪比。(b)1min内1，2，4，6，8，10倍浓度梯度下的信号量。从中可以看出随着盐浓度梯度的增加，单位时间内的信号采集量增加的同时其信噪比也在提高。这就说明盐浓度梯度在一定范围内增加后不仅对信号有富集的作用，而且一定程度上增加了所测分子信号的幅值(信噪比增加)。这些特性为接下来采用高浓度梯度测试超低浓度下目标DNA分子提供了依据。
实施例2
一.检测步骤：
1.将SiNx薄膜基片置于无水乙醇中浸泡10-15min对其窗口表面进行亲疏水性的处理；然后取出并将其放入去离子水中浸泡1-2分钟洗去表面无水乙醇；最后将其组装入检测夹具中。
2.将SiNx薄膜基片封装于样品池中，cis端加入浓度分别为10nM-0.01fM的43T-MER-AssDNA，随后用10倍盐浓度梯度(ccis:ctrans＝0.5:5M)的LiCl溶液进行检测。
二.检测结果：
检测结果如图3、图4所示。
图3展示了浓度从10nM变化到0.01fM的43T-MER-A ssDNA在3min内的信号数量。我们以100pM为基准，将其他浓度均换算成相对于100pM的比值，图中横坐标为相对比值浓度，横坐标为信号量。由图可知随着浓度的增加相同时间内的信号量呈增加的趋势。其次，待测物分子不同浓度的测试也从另一方面验证了低浓度下测试到的信号的精确性。最后，将检测物分子浓度进一步降低后在测试中没有观察到信号的出现，这验证了10倍LiCl盐浓度梯度在我们实验中的检测极限。
图4为10倍盐浓度梯度的LiCl盐溶液下0.01fM的43T-MER-AssDNA过孔的散点图、幅值分析柱状图、时间分析柱状图。此实验的设计是延续图3的测试之后，图3中验证了10倍LiCl盐浓度梯度下可以检测到0.01fM的待测物分子，随后开始测试该浓度下的DNA分子。图中的幅值分布符合高斯分布时间分布符合指数衰减分布，这些说明检测信号的可靠性。且此浓度下分子的捕获意味着捕获精度达到了1μl液体中六七个生物分子亦能被检测的精度。
实施例3
一.检测步骤：
1.将SiNx薄膜基片置于无水乙醇中浸泡10-15min对其窗口表面进行亲疏水性的处理；然后取出并将其放入去离子水中浸泡1-2分钟洗去表面无水乙醇；最后将其组装入检测夹具中。
2.将SiNx薄膜基片封装于样品池中，cis端加入浓度10nM的43T-MER-AssDNA和浓度分别为1.5fM-1.5nM的500bp的dsDNA的混合物以及0.5M的LiCl盐溶液；trans端加入5M的LiCl盐溶液。
3.通电，检测，最后将采集到的信号进行分析以检索出500bp的dsDNA。二.检测结果：
检测结果如图5。
图5为3种不同分析物比例下(ssDNA：dsDNA)的信号图。从时间和幅值可以看出两种不同类型的信号即500bp DNA信号(长过孔时间和大幅值)和43T-MER-Ass DNA信号(短过孔时间和小幅值)。并且随着ssDNA：dsDNA比例变大500bp dsDNA的信号量逐渐的减少。从三幅图中也可以看出随着两者浓度差异越来越大其区分精度也越来越大，当两者比列为10nM：1.5fM(图5最左侧)即dsDNA：ssDNA达到六七百万分之一的比例时隐藏在ssDNA中的dsDNA依然能被检索出来(如图中唯一一个大幅值的信号)，这个比列尺度下的检测对早期疾病的诊断有重大的意义。

Claims (10)

1.一种基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法，其特征在于，所述方法使用了一种SiNx薄膜固态纳米孔反应装置，所述装置包括样品池(1)，SiNx薄膜基片(4)，SiNx薄膜将样品池分隔为顺式腔(2)和反式腔(3)，SiNx薄膜上有电击击穿的纳米孔(5)，连接顺式腔和反式腔的电极(6)和外接电源(7)；所述方法在检测样品前先用多级电流脉冲击穿法在SiNx薄膜上制备出纳米孔(5)，随后在纳米孔两侧的顺式腔(2)和反式腔(3)中形成盐浓度梯度，最后在样品池(1)两端施加电压驱使待测分子过孔从而产生离子阻塞电流脉冲信号，最后将采集到的信号进行分析以检索出目标分子。
2.根据权利要求1所述的一种基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法，其特征在于，SiNx薄膜在使用时先置于无水乙醇中浸泡10-15min对其窗口表面进行亲疏水性的处理。
3.根据权利要求1所述的一种基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法，其特征在于，样品池内要注入由LiCl、Tris和EDTA混合液组成电解液。
4.根据权利要求3所述的一种基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法，其特征在于，所述电解液的比例为LiCl：Tris：EDTA＝1M：10mM：1mM。
5.根据权利要求1所述的一种基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法，其特征在于，顺式腔接地，两个储液腔室与计算机控制的源表keithley2450通过两根银电极形成一个闭合回路，于反式腔端施加电流脉冲，设置起始电流、步长、目标孔径来制备纳米孔。
6.根据权利要求1所述的一种基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法，其特征在于，检测的分子标志物浓度范围为10nM-0.01fM。
7.根据权利要求1所述的一种基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法，其特征在于，反式腔中盐溶液的浓度0.5M-5M。
8.根据权利要求1所述的一种基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法，其特征在于，盐溶液为LiCl溶液。
9.根据权利要求1所述的一种基于固态纳米孔检测超低浓度分子标志物的方法，样品池两端的液体形成十倍的盐浓度梯度，反式腔的浓度大于顺势腔的浓度。
10.一种SiNx薄膜固态纳米孔反应装置，其特征在于，所述装置包括样品池(1)，SiNx薄膜基片(4)，SiNx薄膜将样品池分隔为顺式腔(2)和反式腔(3)，SiNx薄膜上有电击击穿的纳米孔(5)，连接顺式腔和反式腔的电极(6)和外接电源(7)；所述纳米孔大小为2-6nm。
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