CN111154848A - 一种用于dna测序的通道结构及其制备和测序的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于DNA测序技术领域，具体涉及一种用于DNA测序的通道结构及其制备方法和应用。所述通道结构为DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构。所述通道结构能减小通道的有效厚度，从而大大提高通道在单分子检测中的空间分辨率，同时也能解决固态纳米孔不规整的内表面形貌和不均匀的电荷分布带来的测试低频噪音干扰，为DNA测序设备提供稳定高灵敏的核心检测部件，且所述复合通道结构具有很好的稳定性，用于DNA测序，具有较高的准确度。
Description
技术领域
本发明属于DNA测序技术领域，具体涉及一种用于DNA测序的通道结构及其制备方法和用于测序的方法。
背景技术
纳米孔电学检测作为单分子检测新手段能给一些生物大分子结构分析带来传统检测手段达不到的精度与灵敏度，尤其是面向未来DNA测序的稳定可靠国产测序装置的研发与应用。但现在纳米孔主打的两种载体材料无论是生物蛋白还是无机有机薄膜，都存在各自的优势与不足。后续发展的将两者结合的新型复合纳米孔，也依然存在信噪比不高，漏电流大，复合孔寿命不长等缺陷。DNA折纸作为新型的DNA多级组装结构能通过组装媒介和DNA浓度等参数调控，得到形貌、强度和性能多样的组装体与不同体系进行集成，从而实现多功能化的应用拓展。
近来也有报道采用DNA折纸结构嵌入磷脂双层，构筑仿生离子通道或生物大分子检测平台，这个复合器件面临与生物纳米孔同样的问题，就是脂质层受外界环境影响而不稳定。后续也有将DNA折纸通过一个单链牵引在电场驱动下嵌入固态纳米孔中，形成复合纳米通道，但通道的空间分辨率仍受折纸结构的限制。为了克服以上缺陷，本发明重新设计了DNA折纸，构筑了新型的DNA折纸与固态纳米孔复合结构。
发明内容
本发明的目的之一在于提供所述用于DNA测序的通道结构的制备方法，所述制备方法可有效制备所述通道结构，且时间较短，稳定性强。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
所述用于DNA测序的通道结构的制备方法，包括以下步骤：
1)固态纳米孔的制备：在硅基氮化硅薄膜上利用电流脉冲击穿的方式制备；
具体的，在带有10μm2窗口的硅基氮化硅薄膜上，采用电导液(1M KCl、10mM Tris、1mM EDTA)利用电流脉冲击穿的方式制备直径为10-15nm的孔道，并在上述电导液中通过膜片钳测定IV曲线，由经验公式计算纳米孔的直径。
2)固态纳米孔的活化：将步骤1)的固态纳米孔清洗后浸泡于食人鱼洗液再清洗烘干；
具体的，将负载有纳米孔的氮化硅基片用有机溶剂及水清洗后烘干，然后用功率20-30w的等离子体清洗氮化硅薄膜数分钟，再在食人鱼洗液(硫酸和双氧水体积比3：1)中室温浸泡30分钟，水洗数次去除酸液后，将纳米孔基片在100℃下烘干数分钟，以此增加纳米孔的亲水性，有利于后续与DNA孔复合。
3)DNA折纸的制备与表征：通过staple序列与核心序列的设计，在含有镁离子的缓冲体系中通过调节温度和DNA浓度多步逐级组装，构筑底端与固态纳米孔尺寸嵌合，且上面交错部分留有2nm有效厚度的纳米孔，并在正立方体DNA折纸通道设计ssDNA牵引序列，然后将DNA折纸通道溶液滴在碳膜铜网上，通过电镜做形貌尺寸的表征，确定结构符合设计需求；
4)DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构的制备：将DNA折纸加入电解液池的cis端，在外加偏压驱使下，通过ssDNA牵引序列将DNA折纸定向插入固态纳米孔内。
具体的，Staple序列是将折纸结构稳定住，在一定的组装条件下能固定组装形态，人类基因组DNA中存在着许多重复单位在数个至数十个碱基对之间的串联重复DNA,即小卫星DNA。不同小卫星DNA的重复单位虽不相同，但是均含有一个比较相似的、差异比较小的、富含G的序列，称为核心序列或基序。核心序列就相当于乐高里面的不同模块，它主要决定会组装成什么特定形貌。
进一步，所述DNA折纸的结构为两个水平互相堆叠的带长方条的沟槽且沟槽互相垂直的DNA折纸，然后盖在下端正立方体DNA折纸通道的上方，正立方体DNA折纸通道连有ssDNA牵引序列。
进一步，所述DNA折纸通过ssDNA牵引序列将DNA折纸定向插入固态纳米孔内形成DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构。
进一步，所述长方条的沟槽的宽度为2nm。
进一步，所述复合通道结构的宽度和有效厚度小于2nm，所述复合通道结构的口径小于固态纳米孔的口径。
进一步，下端正立方体DNA折纸通道的厚度小于或等于固态纳米孔。
具体的，所述DNA折纸以及复合通道结构如图1所示，所述DNA折纸的结构为带2nm沟槽的上、下折纸互相垂直，然后盖在下端正立方体DNA折纸通道的上方，正立方体DNA折纸通道连有ssDNA牵引序列。通过ssDNA牵引序列将DNA折纸定向插入固态纳米孔内形成DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构。
具体的，ssDNA牵引序列是一个大概碱基长度100左右的DNA单链，在电场中电泳力作用下能拉伸通过纳米孔，从而牵引整个DNA折纸结构定向嵌插在纳米孔上实现DNA折纸-固态纳米孔的复合。
进一步，步骤4)通过离子电流的骤降判断复合通道结构的形成。
进一步，步骤4)可通过施加反向电压将复合通道结构孔剥离。
本发明的目的之二在于提供一种目的一所述制备方法制备得到的用于DNA测序的通道结构，所述通道结构能减小通道的有效厚度，从而大大提高通道在单分子检测中的空间分辨率，同时也能解决固态纳米孔不规整的内表面形貌和不均匀的电荷分布带来的测试低频噪音干扰，为DNA测序设备提供稳定高灵敏的核心检测部件。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
所述用于DNA测序的通道结构为DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构。
DNA以其独特的纳米尺度、分子线性结构、物理化学稳定性、力学刚性、自我识别能力以及自组装等优势，正逐步被应用于分子生物学和电子学领域。以DNA为模板，构筑纳米材料及分子器件，正成为一个新的研究热点。将DNA折纸技术与纳米孔技术的结合为集成用于DNA测序的关键部件提供新的设计思路。
本发明的目的之三在于提供一种用所述的用于DNA测序的通道结构进行DNA测序的方法，本发明是通过近零厚度复合纳米孔的构建，面向DNA测序应用，实现尽可能短的序列的明显区分，在测试10个以下寡链DNA的区分情况，逐步逼近单碱基识别的目标。
具体的，在膜片钳上外加偏压驱使下，使DNA过所述通道结构，根据过通道的特征测定DNA序列。通过对所述复合通道结构进行噪声和漏电流情况测试，证实所述复合通道结构具有很好的稳定性。并通过具体的DNA测序实验，证明所述复合通道结构可以很好的应用于DNA测序，具有较高的准确度。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种DNA折纸与固态纳米孔结合制备而成的复合通道结构，所述通道结构能减小通道的有效厚度，从而大大提高通道在单分子检测中的空间分辨率，同时也能解决固态纳米孔不规整的内表面形貌和不均匀的电荷分布带来的测试低频噪音干扰，为DNA测序设备提供稳定高灵敏的核心检测部件，且所述复合通道结构具有很好的稳定性，用于DNA测序，具有较高的准确度。
附图说明
图1DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构示意图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构
如图1所示，所述DNA折纸的结构为带2nm沟槽的上、下折纸互相垂直，然后盖在下端正立方体DNA折纸通道的上方，正立方体DNA折纸通道连有ssDNA牵引序列。通过ssDNA牵引序列将DNA折纸定向插入固态纳米孔内形成DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构。
实施例2DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构的制备
1.固态纳米孔的制备
在带有10μm2窗口的硅基氮化硅薄膜上，采用电导液(1M KCl、10mMTris、1mMEDTA)利用电流脉冲击穿的方式制备直径为10-15nm的孔道，并在上述电导液中通过膜片钳测定IV曲线，由经验公式计算纳米孔的直径。
2.固态纳米孔的活化
将负载有纳米孔的氮化硅基片用有机溶剂及水清洗后烘干，然后用功率20-30w的等离子体清洗氮化硅薄膜数分钟，再在食人鱼洗液(硫酸和双氧水体积比3：1)中室温浸泡30分钟，水洗数次去除酸液后，将纳米孔基片在100℃下烘干数分钟，以此增加纳米孔的亲水性，有利于后续与DNA孔复合。
3.DNA折纸的制备与表征
通过staple序列与核心序列的设计，在含有镁离子的缓冲体系中通过调节温度和DNA浓度多步逐级组装过程，构筑底端与固态纳米孔尺寸嵌合，且上面交错部分留有2nm有效厚度的纳米孔，并在折纸通道的底端设计ssDNA牵引序列。将DNA折纸通道溶液滴在碳膜铜网上，通过电镜做形貌尺寸的表征，确定结构符合设计需求。
4.DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构的制备
将DNA折纸加入电解液池的cis端，在外加偏压驱使下，通过ssDNA牵引序列将DNA折纸定向插入固态纳米孔内。
实施例3DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构的测试
将制备好的DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构通过离子电流的骤降判断复合孔的形成，并可通过施加反向电压将DNA孔剥离固态孔，在膜片钳上外加偏压下同时检测固态纳米孔与复合通道的噪声及漏电流情，况测试两个通道复合的可逆性以及复合所需时间及复合孔的稳定性。
实施例4DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构用于DNA测序的测试
测试10个碱基以下的寡核苷酸单链过孔行为，比较事件的频率、信噪比等，通过10个以下碱基不同单链长度过孔特征的区分程度，以验证复合通道结构用于测定DNA测序的准确性。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种用于DNA测序的通道结构的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)固态纳米孔的制备：在硅基氮化硅薄膜上利用电流脉冲击穿的方式制备；
2)固态纳米孔的活化：将步骤1)的固态纳米孔清洗后浸泡于食人鱼洗液再清洗烘干；
3)DNA折纸的制备与表征：通过staple序列与核心序列的设计，在含有镁离子的缓冲体系中通过调节温度和DNA浓度多步逐级组装，构筑底端与固态纳米孔尺寸嵌合，且上面交错部分留有2nm有效厚度的纳米孔，并在正立方体DNA折纸通道设计ssDNA牵引序列，然后将DNA折纸通道溶液滴在碳膜铜网上，通过电镜做形貌尺寸的表征，确定结构符合设计需求；
4)DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构的制备：将DNA折纸加入电解液池的cis端，在外加偏压驱使下，通过ssDNA牵引序列将DNA折纸定向插入固态纳米孔内。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述DNA折纸的结构为两个水平互相堆叠的带长方条的沟槽且沟槽互相垂直的DNA折纸，然后盖在下端正立方体DNA折纸通道的上方，正立方体DNA折纸通道连有ssDNA牵引序列。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述DNA折纸通过ssDNA牵引序列将DNA折纸定向插入固态纳米孔内形成DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述长方条的沟槽的宽度为2nm。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述复合通道结构的宽度和有效厚度小于2nm，所述复合通道结构的口径小于固态纳米孔的口径。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，下端正立方体DNA折纸通道的厚度小于或等于固态纳米孔。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)通过离子电流的骤降判断复合通道结构的形成。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)可通过施加反向电压将复合通道结构孔剥离。
9.权利要求1-6任一项所述制备方法制备的用于DNA测序的通道结构，其特征在于，所述通道结构为DNA折纸与固态纳米孔的复合通道结构。
10.采用权利要求9所述的通道结构进行DNA测序的方法，其特征在于，在膜片钳上外加偏压驱使下，使DNA过所述通道结构，根据过通道的特征测定DNA序列。
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