CN114778651A - 一种不同癌基因的单分子拓扑结构鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种不同癌基因的单分子拓扑结构鉴别方法。本发明提供的不同癌基因的单分子拓扑结构鉴别方法，采用固态纳米孔平台技术，在施加偏压下获得待测样本通过所述固态纳米孔产生的电学信息，通过分析相对离子阻塞电流值对待测样本进行鉴别。该方法简单灵敏，操作便捷，可靠性好，实现了对不同序列富G癌基因形成的G4拓扑结构的鉴别，对于癌基因的结构分型及在特定生理功能区与特异蛋白的单分子作用机制研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种不同癌基因的单分子拓扑结构鉴别方法。
背景技术
B淋巴细胞瘤-2基因简称BCL-2，是凋亡分子机制研究的主要靶分子。它具有明显抑制细胞凋亡的作用，并且近年来的一些研究已开始揭示这一作用的机制。人体端粒序列(hTel)存在于人类染色体末端端粒区域，与癌症疾病及衰老有关。它能够保护DNA不被降解，在每个复制周期后会缩短，经过一系列循环后，由于变得太短而无法保护DNA，细胞将会死亡。AS1411是可以与核仁素特异性结合的DNA单链，而核仁素在多种肿瘤细胞中均有表达，并且核仁素也参与了很多重要的细胞生理活动，所以AS1411对于核仁素的靶向性对于抗肿瘤药物具有很大的研究价值。
传统的鉴别基因结构的方法包括：核磁共振(NMR)、圆二色谱(CD)、原子力显微镜(AFM)、凝胶电泳及光镊和磁镊等技术，尽管这些研究方法都已经被证实可以进行癌基因结构的鉴别，但是它们都存在一定局限。这些技术大多需要大型设备，测试样品需求量也比较多，并且操作复杂，对操作人员的技术要求较高，且大多只能获取体相分子的平均信息。
纳米孔具有检测迅速、成本低、可进行单分子检测等优势，为不同癌基因的结构鉴别指出了新的方向。常用的实验技术是在纳米孔两端加一个电压，通过电场驱动，使DNA分子从孔一端电泳通过纳米孔，在外电路收集的离子电流会出现一个突然下降，电流的突然下降值和阻滞时间，可以对应DNA的生物学信息。但是单纯使用电场调节，DNA的穿孔速度太快。只有延长DNA分子的穿孔时间，减慢DNA的穿孔速度，才有可能实现对不同碱基的分辨。
申请号为202010521146.6的发明专利公开了一种硅基固态纳米孔的制备方法，用所述硅基固态纳米孔来进行DNA和/或RNA的测序，可以提高纳米孔测序的成功率。
发明内容
鉴于上述问题，本发明在基于固态纳米孔检测的平台技术上，提供了一种不同癌基因的单分子拓扑结构鉴别方法。
本发明的目的之一，在于提供一种基于固态纳米孔对富G癌基因鉴别的方法，该方法为不同癌基因的单分子拓扑结构的鉴别提供了新思路。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
所述的方法为用固态纳米孔对检测样品的相对离子阻塞电流值进行测定和分析；所述固态纳米孔的孔径为3～5nm；所述检测样品为含有一种或多种富G癌基因的溶液。
进一步，所述的检测样品浓度为纳摩尔。
进一步，所述的方法为鉴别富G癌基因的G4结构。
进一步，所述的方法具体包括以下步骤：
S1：富G癌基因G4结构的制备；
S2：固态纳米孔的制备；
S3：在施加偏压的情况下检测S1所得富G癌基因G4结构穿过S2所得固态纳米孔产生的相对离子阻塞电流值；
其中S1与S2顺序不限。
进一步，S2中所述的固态纳米孔载体为硅基氮化硅薄膜。
进一步，S3中所述的施加偏压范围为100mv～200mv。
进一步，S3中所述的施加偏压为100mv、150mv、200mv。
进一步，S3之后还包括S4对产生的相对离子阻塞电流值进行分析。
进一步，所述相对离子阻塞电流值与所述富G癌基因G4结构的物理尺寸呈正相关。
用上述的方法对BCL-2基因、ParalleIBCL-2基因、hTel基因和AS1411基因中的一种或多种进行鉴别。
本发明的有益之处在于：
1)本发明通过具有结构稳定且尺度匹配孔径的硅基氮化硅纳米孔检测平台技术能实现了不同序列富G癌基因形成的G4拓扑结构的鉴别。
2)本发明提供的鉴别方法，通过采集不同物理尺寸和荷电极性的生物大分子穿过纳米孔引起的皮安级别离子电流波动，解析电流幅值升降、阻滞时间以及过孔事件频率以实现鉴别不同序列折叠成的高级结构差异。
3)本发明提供的鉴别方法简单灵敏，操作便捷，可靠性好，对于癌基因的结构分型及在特定生理功能区与特异蛋白的单分子作用机制研究具有重要意义。
附图说明
图1为不同序列所折叠的G4纳米孔检测示意图。
图2为纳米孔离子电流信号示意图。
图3为不同富G癌基因序列G4结构的凝胶电泳条带图。
图4为不同富G癌基因序列G4结构穿过纳米孔的相对阻塞电流幅值柱状叠加图。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1.固态纳米孔的制备
将20nm厚度的硅基氮化硅芯片在去离子水里浸泡，去除薄膜表面的无机杂质；然后用等体积比丙酮：异丙醇：酒精混合溶剂浸泡10min，去除薄膜表面的有机杂质；再将清洗烘干后的氮化硅薄膜用食人鱼洗液加热活化1h，使薄膜表面充分羟基化。
在活化过的硅基氮化硅薄膜上，采用介电击穿的方式制备直径约为4nm左右的孔道，电导液为1M KCl、TE(pH 8)，通过膜片钳测定纳米孔的IV曲线，得到电导G，并由模型公式计算出纳米孔的直径。
实施例2.富G癌基因序列G4结构的制备
将单链癌基因序列BCL-2、Parallel BCL-2、AS1411、hTel溶解在电解质溶液(1MKCl、TE，pH 7.4)中，充分摇匀后，在95℃条件下加热5min，并慢慢冷至室温退火1h，得到癌基因的高级结构G-四链体结构。
实施例3.G4穿过纳米孔通道的检测
如图1所示，将实施例1制备的纳米孔装配在测试池Flowcell中，把配置好的实施例2制备的G4结构的样品溶液加在Flowcell的一侧腔室内，另外一侧加入测试缓冲液(1MKCl、TE，pH 7.4)。
通过调节外力及测试参数，记录不同序列结构的样品通过尺度匹配纳米孔的电信号波动情况，如图2所示，通过数据解析鉴别电信号特征与不同G4结构的对应关系，从而达到区分不同序列G4结构的目的。
图3为实施例2制备的G4结构的样品溶液所形成的凝胶电泳条带图，从中可以观察到，体积比较小的G4结构形成序列为BCL-2、Parallel BCL-2，而AS1411、hTel则为体积较大的两个G4结构形成的序列。
如图4所示，不同富G癌基因G4结构穿过纳米孔的相对阻塞电流幅值柱状叠加图可以看出，参数I/Io能反应分子的物理尺寸，它在不同测试电压下的分布基本遵循凝胶电泳表征的尺寸规律，即BCL-2、para BCL-2两个序列所形成的G4结构过孔的I/Io要比物理尺寸大的G4形成序列AS1411、hTel要小，而G4物理尺寸相近的序列结构过孔的I/Io则差异较小。
两种表征检测结果表明，不同物理尺度的G4结构能得到有效鉴别，且单分子尺度的纳米孔技术能实现纳摩尔及以下浓度的检测，方法更灵敏快捷。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.基于固态纳米孔对富G癌基因鉴别的方法，其特征在于，所述的方法为用固态纳米孔对检测样品的相对离子阻塞电流值进行测定和分析；所述固态纳米孔的孔径为3～5nm；所述检测样品为含有一种或多种富G癌基因的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测样品浓度为纳摩尔。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法为鉴别富G癌基因的G4结构。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法具体包括以下步骤：
S1：富G癌基因G4结构的制备；
S2：固态纳米孔的制备；
S3：在施加偏压的情况下检测S1所得富G癌基因G4结构穿过S2所得固态纳米孔产生的相对离子阻塞电流值；
其中S1与S2顺序不限。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中所述的固态纳米孔载体为硅基氮化硅薄膜。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S3中所述的施加偏压范围为100mv～200mv。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S3中所述的施加偏压为100mv、150mv、200mv。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S3之后还包括S4对产生的相对离子阻塞电流值进行分析。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述相对离子阻塞电流值与所述富G癌基因G4结构的物理尺寸呈正相关。
10.用权利要求1所述的方法对BCL-2基因、ParalleIBCL-2基因、hTel基因和AS1411基因中的一种或多种进行鉴别。
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