CN111289586B - 一种调控和动态监测g-四联体构象变化的纳米孔体系和方法 - Google Patents

一种调控和动态监测g-四联体构象变化的纳米孔体系和方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种动态监测G‑四联体构象变化的纳米孔体系和调控和动态监测G‑四联体构象变化的方法及应用。所述体系包括氮化硅纳米孔、端粒序列DNA、电导液和光控纳米器件，所述动态监测在基于光控纳米器件的光学调控下进行，所述氮化硅纳米孔置于电导液中，所述端粒序列DNA在过所述氮化硅纳米孔时会产生离子电流变化。本发明所述调控和动态监测G‑四联体构象变化的方法可研究金属离子和偶氮苯对G‑四联体构象的共同作用，利用氮化硅固态纳米孔在单分子水平对该过程进行动态监测。

Description

一种调控和动态监测G-四联体构象变化的纳米孔体系和方法
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种动态监测G-四联体构象变化的纳米孔体系和调控和动态监测G-四联体构象变化的方法。
背景技术
存在于真核细胞染色体端粒中的富G残基之间通过Hoogsteen氢键结合成G-四面体进而通过pi-pi堆积形成的一种特殊的DNA二级结构，人体端粒由6个碱基重复序列d(TTAGGG)n和结合蛋白组成，参与调节许多重要的生物学功能，G-四联体的形成可稳定染色体，调节正常细胞生长。因而研究人体内端粒序列G-四联体的稳定性以及成因与数量对生命科学研究具有一定指导意义。生物学领域中常用来研究核酸、蛋白和多糖立体结构有圆二色谱、紫外光谱、凝胶电泳法和核磁共振谱等，这些方法可以表征体系的整体性质，但是具有分辨率低、灵敏度差、耗时长、操作过程繁琐等不足。纳米孔分析作为第三代单分子基因测序技术，在监测核酸和蛋白质序列时表现出的优异性能使其在制备与生理机能调控相关的器件的应用中具有很大的潜力。
利用α-溶血素生物纳米孔对G-四联体的监测已有报道，但是由于支撑生物纳米孔的磷脂双分子层不够稳定，生物孔的使用寿命受到了极大的限制，并且其固有的内径尺寸也限制了它的检测范围。G-四联体存在于人体许多重要的生物学功能区，与细胞寿命及癌症病理相关。人体端粒序列在不同阳离子诱导下能自发形成不同构象的G-四联体结构，但对其构象及稳定性解析仍存在挑战。因此，为克服以上缺陷，本发明选用了氮化硅纳米孔，其结构更加稳定，环境耐受性强，孔径孔型可控，且成本低廉。通过检测在端粒序列不同位置修饰有偶氮苯分子的DNA通过纳米孔的信号，以及光照后DNA序列受偶氮苯构象反转而发生的结构变化来监测G-四联体通过氮化硅纳米孔的折叠与解链的动态过程。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种动态监测G-四联体构象变化的纳米孔体系，所述纳米孔体系结构稳定，环境耐受性强且孔径孔型可控。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
所述体系包括氮化硅纳米孔、端粒序列DNA、水溶性偶氮苯、电导液和光控纳米器件，所述动态监测在基于光控纳米器件的光学调控下进行，所述氮化硅纳米孔置于电导液中，所述端粒序列DNA在过所述氮化硅纳米孔时会产生离子电流变化。
本发明的目的之二在于提供利用目的一提供的纳米孔体系调控和动态监测G-四联体构象变化的方法，所述方法可调控G-四联体构象的变化，实现G-四联体构象的可逆转变，并为监测过程提供了超高的时间分辨率和空间分辨率，可以实现单分子水平的监测，且该方法比传统大多数检测方法灵敏度高、准确性好，且操作快捷成本低廉。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
利用所述动态监测G-四联体构象变化的纳米孔体系调控和动态监测G-四联体构象变化的方法在于将修饰有偶氮苯的端粒序列DNA在电导液中过氮化硅纳米孔，或将未修饰偶氮苯的端粒DNA序列与水溶性偶氮苯混合物过孔，并通过调控光控纳米器件交替照射可见光和紫外光来进行单分子水平的动态监测。
进一步，所述方法包括以下步骤：
1)氮化硅纳米孔的制备和活化：在硅基氮化硅薄膜上采用电流脉冲击穿的方式获得纳米孔；
2)调控和动态监测G-四联体构象变化：将氮化硅纳米孔置于电导液中，调控光控纳米器件交替照射可见光和紫外光，采集产生的离子电流波动信号，动态监测G-四联体构象的变化。
进一步，1)氮化硅纳米孔的制备和活化：在硅基氮化硅薄膜上采用电流脉冲击穿的方式获得纳米孔，再将纳米孔用溶剂A和B进行活化；
4)调控和动态监测G-四联体构象变化：将氮化硅纳米孔置于电导液中，调控光控纳米器件交替照射可见光和紫外光，采集产生的离子电流波动信号，动态监测G-四联体构象的变化。
本发明采用的是新型单分子纳米孔检测技术，纳米孔的限域空间内能精确检测分子的尺寸、荷电状态和分子构象。该技术具有高灵敏度，高特异性，实时快速等优点，广泛应用于单分子DNA、RNA、蛋白质及纳米粒子的尺寸及表面功能化的检测中，是目前检测生物单分子使用最广泛的技术之一。图1(A)所示为本发明中采用的电流脉冲击穿法制备氮化硅固态纳米孔示意图，在两个充满电解液(1M KCl、10mM Tris、1mM EDTA(pH 8))的腔体中插入Ag/AgCl电极，施加一脉冲电压直至得到一个纳米孔，两个腔体之间由唯一的纳米孔连接。当在两侧施加一个恒定电压时，电解液中的离子电泳通过纳米孔将产生单一恒定的离子电流(图1(B))，在负极一侧的腔体中加入含有DNA待测物的电解液时，待测物在电场驱动下穿过纳米孔，产生物理占位(图1(C))，使孔道中的离子数量减少，从而产生阻塞信号，引起离子电流的起伏波动，I0为开孔电流值，Ib为阻塞电流值，Dwell Time为阻塞时间，即待测物通过纳米孔所需要的时间(图1(D))。
偶氮苯及其衍生物是一种具有光致异构性质的分子，在紫外光(～360nm)/可见光(～450nm)的交替照射下，会发生顺/反式构象的转变。而顺式偶氮苯和反式偶氮苯对DNA双链及二级结构的稳定性具有不同的影响。G-四联体是人体端粒序列中富含鸟嘌呤G的DNA单链之间或单链内对应的G残基之间通过Hoogsteen氢键结合成G-四面体进而通过pi-pi堆积形成的，可见光照后的反式偶氮苯(trans-Azo)为平面共轭结构，会通过pi-pi堆叠作用插入鸟嘌呤四面体层间从而稳定D-四联体构象，经紫外光照射，反式偶氮苯翻转为顺式偶氮苯(cis-Azo)，顺式偶氮苯为非平面结构，会破环G-四面体的堆叠，从而破环G-四联体构象使其解链(图2)。
进一步，步骤1)所述溶剂A为体积比为1：1：1的去离子水、乙醇、异丙醇，所述溶剂B为食人鱼洗液。
具体的，所述食人鱼洗液由体积比为3:1的硫酸和双氧水制备而成。
进一步，所述电导液为K离子电导液、Cs离子电导液和Li离子电导液，所述K离子电导液由物质的量浓度比为1000:10:1的KCl、Tris和EDTA组成；所述Cs离子电导液由物质的量浓度比为1000:10:1的CsCl、Tris和EDTA组成；所述Li离子电导液由物质的量浓度比为1000:10:1的LiCl、Tris和EDTA组成。
进一步，所述K离子电导液的pH为8，所述Cs离子电导液的pH为7.4，所述Li离子电导液的pH为8。
进一步，步骤3)所述偶氮苯为2-3个。
具体的，偶氮苯分子具有光致异构性质，可见光条件下偶氮苯呈现较为稳定的平面反式构象，与端粒序列上的碱基发生堆叠作用，从而起到稳定G-四联体的作用；紫外光条件下反式构象转变为非平面的顺式构象，起到解链的作用。
进一步，所述氮化硅纳米孔的孔径为3-4nm。
进一步，步骤3)所述缓冲液的pH为7.4，进一步，步骤4)可见光和紫外光的波长分别为450nm和360nm。
本发明的目的之三在于提供一种动态监测G-四联体构象变化的纳米孔体系在检测G-四联体构象及形成的稳定性和癌症诱发与增殖研究中的应用。
本发明的目的之四在于提供所述的调控和动态监测G-四联体构象变化的方法在检测G-四联体构象及形成的稳定性和癌症诱发与增殖研究中的应用。
本发明的有益效果在于：
1)本发明所述调控和动态监测G-四联体构象变化的方法可研究金属离子和偶氮苯对G-四联体构象的共同作用，利用氮化硅固态纳米孔在单分子水平对该过程进行动态监测；
2)所述方法操作便捷，灵敏度高、准确性好，对人体端粒DNA中肿瘤启动区G-四联体的折叠特别是针对临床诊断中癌症诱发与增殖机理的研究及后续癌症的靶向治疗方面有重要指导意义；
3)利用所述纳米孔体系和方法可以实现对体端粒序列DNA中G-四联体结构检测与解链调控，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1中(A)为纳米孔制备示意图；(B)为典型纳米孔开孔电流示意图；(C)为氮化硅固态纳米孔检测示意图；(D)为典型纳米孔阻塞电流示意图。
图2为不同光照条件引起的偶氮苯结构反转从而导致的DNA构象的变化。
图3为调控和动态监测G-四联体构象变化的方法原理图。
图4为修饰有偶氮苯的端粒序列DNA过孔和未修饰偶氮苯的端粒序列与水溶性偶氮苯混合物过孔实验图。
图5为实施例4裸孔检测的实验结果图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1一种动态监测G-四联体构象变化的纳米孔体系
所述体系包括氮化硅纳米孔、端粒序列DNA、水溶性偶氮苯、电导液和光控纳米器件，所述动态监测在基于光控纳米器件的光学调控下进行，所述氮化硅纳米孔置于电导液中，所述端粒序列DNA在过所述氮化硅纳米孔时会产生离子电流变化。
实施例2调控和动态监测G-四联体构象变化的方法
利用实施例1的纳米孔体系调控和动态监测G-四联体构象变化，具体实施方案如下：
1.氮化硅纳米孔的制备
在硅基氮化硅薄膜(尺寸：3×3mm；硅片厚度：200μm；窗口：10μm2；氮化硅膜厚：20nm)上采用电流脉冲击穿的方式获得孔径合适的纳米孔(3nm)，电导液1M KCl、10mMTris、1mM EDTA(pH 8)，利用膜片钳记录纳米孔的IV曲线得到纳米孔的电导G，由公式计算孔径。
2调控与测试
对修饰有偶氮苯的DNA单链在氮化硅固态纳米孔中进行测试，测试过程应通过光控纳米器件的调控伴随着一定的光照条件，对比在可见光和紫外光照条件下离子电流的变化，采集不同金属离子和偶氮苯对G-四联体构象的共同作用引起的离子电流波动信号。所用电导液为1M CsCl、10mM Tris、1mM EDTA(pH 7.4)离子电导液；1M LiCl、10mM Tris、1mMEDTA(pH 8)离子电导液。
结果：如图3所示，本发明利用孔结构稳定，环境耐受性强，孔径孔型可控的氮化硅固态纳米孔对端粒序列DNA的构象变化进行动态监测。根据不同光照条件引起的偶氮苯结构反转从而导致的DNA构象的变化，对经过不同处理的样品进行纳米孔检测，孔径为3nm。图3(A)为经95℃保持5min后自然冷却至室温的样品，在外加恒定电压下DNA分子过孔产生的阻塞电流幅值为100pA；图3(B)为经95℃保持5min后自然冷却至室温放置2h以上，经过可见光照射待DNA序列形成G-四联体，在外加恒定电压下DNA分子过孔产生的阻塞电流幅值为500pA，且无小信号；将上述样品进行紫外光照射20分钟，再次利用纳米孔进行检测，在外加恒定电压下DNA分子过孔产生的阻塞电流幅值减小，小信号增多，说明紫外光照后产生的顺式偶氮苯使得G-四联体解链。纳米孔为监测过程提供了超高的时间分辨率和空间分辨率，可以实现单分子水平的监测。
实施例3监测不同金属离子对DNA序列的影响
1.氮化硅纳米孔的制备(同实施例2)
2.纳米孔监测
利用3nm氮化硅固态纳米孔进行测试，测试DNA样品分别为没有修饰偶氮苯的DNA序列和在不同位置修饰2-3个偶氮苯的DNA序列，测试过程应伴随着一定的光照条件，对比在可见光和紫外光照条件下G-四联体构象的变化。
所用缓冲体系分别是：
1M CsCl、10mM Tris、1mM EDTA(pH 7.4)离子电导液；
1M LiCl、10mM Tris、1mM EDTA(pH 8)离子电导液。
结果：测试样品在不同光波长照射下离子阻塞电流信号的幅值有差异且分布不同。
实施例4裸孔监测
1.氮化硅纳米孔的制备
将购买的硅基氮化硅薄膜在去离子水和乙醇中分别浸泡10min(尺寸：3×3mm；硅片厚度：200μm；窗口：10μm2；氮化硅膜厚：20nm)，然后组装至flowcell中，在两侧腔体中注入200μl电导液(1M KCl、10mM Tris、1mM EDTA(pH 8))，采用电流脉冲击穿的方式获得孔径合适的纳米孔(3nm/14nm)，利用膜片钳记录纳米孔的IV曲线得到纳米孔的电导G，由换算公式计算纳米孔孔径。
2.裸孔监测
利用3nm氮化硅固态纳米孔进行测试，制得的纳米孔用去离子水小心清洗至少五次，备用。实验所需的DNA样品溶解于高纯水在-20℃冰箱中冷冻保存，测试之前需要对样品进行前期处理。将样品稀释至1M CsCl、10mM Tris、1mM EDTA(pH 7.4)离子电导液和1MLiCl、10mM Tris、1mM EDTA(pH 8)离子电导液中，加热至95℃保持5分钟，缓慢冷却至室温16℃，静置至少2h备用。
测试过程应伴随着一定的光照条件，分别采集有偶氮苯修饰和没有偶氮苯修饰的DNA样品在不同离子缓冲溶液中的过孔信号，以及它们在可见光和紫外光照后所引起的离子电流的变化，从而研究不同金属离子(Cs+,Li+)和偶氮苯对G-四联体构象的反转的影响。
所用缓冲体系分别是：
1M CsCl、10mM Tris、1mM EDTA(pH 7.4)离子电导液；
1M LiCl、10mM Tris、1mM EDTA(pH 8)离子电导液。
结果：如图5所示，在含有Cs离子的电解液中进行实验，图中的1-3行分别为修饰有偶氮苯的样品经可见光照射，紫外光照射和没有修饰偶氮苯的样品过孔信号采集以及数据处理分析，所用孔径为3nm，将含有20nM DNA样品的电导液加入cis端(cis端接地)，在两侧腔体施加+100mV的恒定电压，DNA序列将在电压驱动力下过孔，产生阻塞信号(a1-a3)。由于G-四联体的尺寸(2.8nm)与孔径接近，电流阻塞信号幅值较大(a1)，如果没有形成G-四联体，DNA单链序列以折叠状态过孔，此时DNA无法完全将纳米孔阻塞，电流阻塞信号幅值较小(a2,a3)。图中的b1-b4为分子过孔所需的阻塞时间(Dwell Time)和I/I0散点图，c1-c4,d1-d4分别为阻塞时间Dwell Time和归一化的阻塞电流I/I0的统计图。经指数衰减拟合得到DNA序列过孔产生的阻塞时间，可见光下DNA-3azo样品的阻塞时间为0.3825±0.0138ms(c1),而紫外光照射20分钟后，阻塞时间变为0.2134±0.0033ms(c2),阻塞时间变小说明G四联体构象存在解链现象，未修饰由偶氮苯的样品在可见光下阻塞时间为0.0707±0.0021ms(c3)，阻塞时间最短；由d列通过高斯拟合可以明显的看出，可见光照时DNA-3azo分子呈G-四联体构象,I/I0＝0.7279±0.0037(d1)，经过20min紫外光照射，G-四联体存在解链现象，分子尺寸变小，电流阻塞信号幅值变小I/I0＝0.4302±0.0093(d2)，且分布较宽，而DNA分子以自由链段形式过孔时I/I0＝0.3251±0.0094(d3)，电流阻塞信号幅值最小(d3)。将修饰有偶氮苯的样品在含有Li离子的电解液中进行实验，所用孔径为3nm，将含有50nM DNA样品的电导液加入cis端(cis端接地)，在两侧腔体施加+50mV的恒定电压，DNA序列将在电压驱动力下过孔，产生阻塞信号(a4)，可见光照下阻塞时间为0.1002±0.0022ms(c4)，电流阻塞信号幅值I/I0＝0.2177±0.0016(d4)，说明DNA没有形成G-四联体构象。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.利用纳米孔体系调控和动态监测G-四联体构象变化的方法，其特征在于，所述纳米孔体系包括氮化硅纳米孔、端粒序列DNA、水溶性偶氮苯、电导液和光控纳米器件，所述动态监测在基于光控纳米器件的光学调控下进行，所述氮化硅纳米孔置于电导液中，所述端粒序列DNA在过所述氮化硅纳米孔时会产生离子电流变化；
所述方法为：将修饰有偶氮苯的端粒序列DNA在电导液中过氮化硅纳米孔，或将未修饰偶氮苯的端粒DNA序列与水溶性偶氮苯混合物过孔，并通过调控光控纳米器件交替照射可见光和紫外光来进行单分子水平的动态监测；所述氮化硅纳米孔的孔径为3-4nm；所述电导液为Cs离子电导液，所述电导液的pH为7.4；所述水溶性偶氮苯为2-3个。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）氮化硅纳米孔的制备和活化：在硅基氮化硅薄膜上采用电流脉冲击穿的方式获得纳米孔并进行亲水活化；
2）调控和动态监测G-四联体构象变化：将氮化硅纳米孔置于电导液中，调控光控纳米器件交替照射可见光和紫外光，采集产生的离子电流波动信号，动态监测G-四联体构象的变化。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）氮化硅纳米孔的制备和活化：在硅基氮化硅薄膜上采用电流脉冲击穿的方式获得纳米孔，再将纳米孔用溶剂A和溶剂B进行活化；所述溶剂A为体积比为1：1：1的去离子水、乙醇、异丙醇，所述溶剂B为食人鱼洗液；
2）调控和动态监测G-四联体构象变化：将氮化硅纳米孔置于电导液中，调控光控纳米器件交替照射可见光和紫外光，采集产生的离子电流波动信号，动态监测G-四联体构象的变化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Cs离子电导液由物质的量浓度比为1000:10:1的CsCl、Tris和EDTA组成。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2）可见光和紫外光的波长分别为450nm和360nm。
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