CN113782095A - 一种高通量实时检测细胞状态的方法 - Google Patents

一种高通量实时检测细胞状态的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113782095A
CN113782095A CN202010525177.9A CN202010525177A CN113782095A CN 113782095 A CN113782095 A CN 113782095A CN 202010525177 A CN202010525177 A CN 202010525177A CN 113782095 A CN113782095 A CN 113782095A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mirna
rna
cell
cells
analysis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010525177.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113782095B (zh
Inventor
史鹏
王子迅
张文军
杨扬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
City University of Hong Kong CityU
Original Assignee
City University of Hong Kong CityU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by City University of Hong Kong CityU filed Critical City University of Hong Kong CityU
Priority to CN202010525177.9A priority Critical patent/CN113782095B/zh
Publication of CN113782095A publication Critical patent/CN113782095A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113782095B publication Critical patent/CN113782095B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F18/00—Pattern recognition
    • G06F18/20—Analysing
    • G06F18/23—Clustering techniques

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本公开涉及一种高通量实时检测细胞状态的方法，该方法包括如下步骤：S1、将RNA探针导入细胞中，并与靶miRNA结合，得到双链RNA；所述RNA探针包含与靶miRNA互补的第一片段和用于结合显色试剂的第二片段；S2、将带有纳米针的芯片与所述细胞接触，以使得所述纳米针刺入所述细胞中，所述纳米针上结合有RNA结合蛋白，并使所述RNA结合蛋白与所述双链RNA结合。

Description

一种高通量实时检测细胞状态的方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种高通量实时检测细胞状态的方法。
背景技术
在用于miRNA分析的工具中，定量逆转录PCR(qRT-PCR)是“黄金标准”，但它是一种验证方法，而不是发现工具。RNA测序以极高的通量解析miRNA转录组，但是由于成本高，处理时间长和数据分析复杂而受到不利影响。如上所述，两种方法都从所需的PCR过程中继承了类似的问题。或者，微阵列可基于探针-靶标杂交提供多重miRNA分析，但特异性和敏感性较低。所有这些常用技术都需要从细胞裂解物中分离RNA样品，仅对所有细胞提供miRNA的平均测量值。因此，关于细胞群体异质性的重要信息将丢失，并且只能通过使用基于单细胞的分析技术才能获得。最近，一些高分辨率的显微技术与纳米技术相结合，报道了一些原位miRNA检测工具，但其中定量工具数量少，有时受到毒性问题的限制。
发明内容
本公开的目的是提供一种高通量实时检测细胞状态的方法。
本发明的发明人提供了一种用于活细胞中miRNA的多重原位分析的细胞内活检技术(inCell-Biopsy)。一种金刚石纳米针阵列被RNA结合蛋白(p19) 功能化，并被用作“钓鱼竿”，可在几分钟内直接将多个靶向的miRNA从细胞质中拉出，使细胞存活。在进行inCell活检后，每个纳米针都作为独立的反应工厂，用于miRNA的平行原位扩增，可视化和定量。检测限可低至 10-15M，这比即使细胞中只有一个miRNA分子所等价的丰度低了近三个数量级。使用inCell活检，展示了活细胞中miRNA的多重分析，分析了胚胎干细胞向运动神经元分化过程中的时空miRNA转录组，揭示了基于miRNA 表达的分化细胞群体的细胞异质性和相关的进化动力学。
本公开提供了一种高通量实时检测细胞状态的方法，该方法包括如下步骤：S1、将RNA探针导入细胞中，并与靶miRNA结合，得到双链RNA；所述RNA探针包含与靶miRNA互补的第一片段和用于结合显色试剂的第二片段；S2、将带有纳米针的芯片与所述细胞接触，以使得所述纳米针刺入所述细胞中，所述纳米针上结合有RNA结合蛋白，并使所述RNA结合蛋白与所述双链RNA结合；S3、拔出所述纳米针，并将所述芯片洗涤和平行原位扩增，然后与显色试剂接触并再次洗涤，接着置于带有定位指示件的玻片上进行图像采集；S4、重复进行步骤S1至S3一次或多次，并且将采集得到的图像进行去噪、分区和光电信号转换；S5、将转换得到的信号根据强度和定位进行聚类分析，得到多个亚类；S6、将所述多个亚类进行时序分析，得到细胞实时状态。
可选地，其中，所述显色试剂为带有荧光基团且与所述第二片段互补的寡核酸。
可选地，其中，所述RNA探针为多种RNA探针，其中每一种探针针对的靶miRNA彼此不同。
可选地，其中，所述RNA结合蛋白为p19蛋白。
可选地，其中，通过离心使得所述纳米针刺入所述细胞中。
通过上述技术方案，本公开实现了对细胞状态的高通量实时检测。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是用于miRNA分析的inCell活检技术的设计。(a)对来自活细胞的miRNA进行细胞内活检的示意图。(b)通过杂交链反应(HCR)在针头上扩增miRNA信号。(c)DNase辅助了多轮信号可视化。(d)用于miRNA转录组分析的图像处理和信息学方法。
图2是细胞内活检的技术表征。(a)金刚石纳米针的SEM图像，比例尺为50μm。(b)荧光图像(俯视图)，显示纳米针(绿色)上的miRNA 信号(红色)，比例尺，50μm。对于a和b，框形区域在下面放大，比例尺为10μm。(c)用小提琴图分析检测限，显示所有纳米针的miRNA信号分布。通过Kruskal-Wallis检验*p<0.005。(d)miRNA浓度与所有纳米针平均荧光强度之间的关系。红线表示对数拟合(R2＝0.99，通过F检验p <0.001)。(e)miRNA浓度与信号+纳米针比例之间的关系。蓝线表示 Langmuir等温线模型的非线性拟合(R2＝0.98，在F检验中p<0.001)。(f) 分析检测特异性。NC，不包含目标。通过ANOVA测试，*p＜0.001。(g) 处理后的A549细胞图像，比例尺，50μm。(h)纳米针(绿色)上的miRNA (红色，let-7a或miR-34a)的荧光可视化，比例尺，3D和俯视图为10μm，放大图为1μm。(i)来自不同对照的miRNA(let-7a或miR-34a)信号的比较。(j)有或没有HCR扩增的实验中信号+纳米针的比率。对于d，e， i，j，n＝3，误差线表示s.e.m.，通过ANOVA测试，*p<0.001。
图3是通过细胞内活检对miRNA进行时间分析。(a)在胚胎干细胞 (ESC)分化过程中监测miRNA动态的实验设计。(b)相衬和荧光(绿色荧光表示，GFP)图像显示了细胞的形态变化以及分化。比例尺，50μm。 (c)捕捞和HCR扩增后钻石纳米针的共聚焦荧光图像(顶视图)。比例尺， 20μm。框形区域在下面放大，以显示来自3轮扩增和可视化的9种miRNA 的表达。比例尺，2μm。(d)在所有三个阶段的细胞内活检结果显示，合并的多维miRNA载体的T-SNE聚类，显示了miRNA表达的整体演变以及ESC的分化。
图4是细胞内活检显示mESCs异质性的动态演变。基于自扩散的光谱聚类和相关的相似性网络，用于在分化的第7天(a)或第14天(b)从数千个纳米针进行多维miRNA测量。(c)在第7天或第14天通过t-SNE分析指示的细胞亚群的分离。热图显示了在第7天(d)或第14天(e)从无监督分类获得的不同簇之间不同的miRNA表达模式。(f)扇区图显示了第7天或第14天每个簇中纳米针在纳米针总数中所占的比例。雷达图(左) 和相关的小提琴图(右)显示了每组中9个miRNA在第7天(g)或第14 天(h)识别出的集群中的平均表达水平。
图5是将miRNA转录组映射到细胞组成。(a)用于从两个微分阶段确定最接近的聚类对的超几何检验。显着的关联用红色正方形标记，并与 -log10(p值)成比例地着色(所有P<0.001)。(b)系统发育树显示了随着分化的进行，簇(细胞亚群)之间的进化关系。分支的宽度与从超几何检验得出的变换后的p值(-log10(p-values))成比例。(c)簇miRNA模式(源自inCell活组织检查)与通过miRNA测序(miR-seq)获得的分类运动神经元/祖细胞结果之间的相关性。*表示P<0.001。(d)在第7天和第 14天对运动神经元样簇的9种miRNA的平均表达进行定量分析。误差线表示s.e.m.来自六个独立的实验(e)密度直方图和相关的小提琴图，显示了第 7天和第14天运动神经元样簇的9种miRNA表达的变化和分布。
图6是inCell活检技术细节。(A)首先将纳米针贴剂在90℃的食人鱼(3：1，v/v，98％H2SO4：27.5％H2O2)溶液中浸泡1.5小时，然后用蒸馏水，甲醇，甲醇/二氯甲烷(DCM)混合物(3：1，v/v)，然后依次使用DCM。将纳米针贴片用氮气干燥，然后在氮气保护的环境中浸入 APTES溶液(在DCM中为20％)中过夜。依次使用乙醇，2-丙醇和蒸馏水冲洗纳米针贴剂，然后通过吹氮气将其干燥。然后将纳米针贴片在NHS-生物素溶液(PBS中1μg/mL)中浸泡1小时，链霉亲和素(链霉亲和素的 1/5被荧光染料Alexa Fluor 488标记)溶液(PBS中10μg/mL)持续2小时，然后用生物素化的p19 siRNA结合蛋白(New England Biolabs)溶液(在PBS中1μg/mL)持续1小时。在相邻的浴步骤之间，用蒸馏水冲洗贴剂。(B) 显示纳米针穿刺后的细胞的相衬图像。比例尺，50μm。(C)细胞内活检操作后，Cy5标记的let-7a PROBE序列的细胞内递送。(D)显示细胞与递送的let-7a探针序列的共定位的组合图像。(E)SEM图像显示金刚石纳米针渗透进入细胞膜。进行细胞内活检后，立即将一块膜碎片从细胞上剥离下来。
图7是细胞内活检特异性和HCR扩增分析。(A)对照组包括“无探针”，“末端钝”(因此无HCR扩增)，“Cel-39的悬垂探针”递送的细胞。 Cel-39在哺乳动物细胞中不表达。误差线表示s.e.m.，n＝3。*P<0.001，通过ANOVA分析。(B)使用cy3标记的诱饵(红色)在细胞内捕捞miR34a 或let-7a后立即获得的金刚石纳米针(FAM标记的绿色)的荧光共聚焦图像，未使用HCR扩增。比例尺在3D和顶视图中为10μm，在放大视图中为1 μm(顶视图中的方框区域)。
图8是紫外线诱导的DNA损伤后miRNA表达的变化。(A)共聚焦荧光图像显示在miR-16，miR-26和let-7a细胞内捕捞后(顶部)或之后(底部)UV处理(50J/m2)后的miRNA信号。比例尺，20μm。(B)，直方图显示了在UV处理后miR-16，miR-26和let-7a的表达变化。(C，D) 紫外线处理后miR-16，miR-26和let-7a表达变化的定量分析，以纳米针荧光(C)或信号+纳米针的比率(D)表示，n＝3，*P<0.001，通过ANOVA 分析。
图9是多维miRNA分析显示了细胞周期的演进。(A)小提琴图定量显示了整个细胞周期中miRNA(miR-21，let-7a，miR-34a和miR-24)表达的分布。在重叠的箱图中，“晶须”范围为1～99％，每个框显示数据的25％， 50％和75％百分位数，n＝3，*P<0.005(通过Kruskal-Wallis检验)。(B) 热图是在不同细胞周期阶段(G1，S和G2)由四个miRNA(let-7a，miR-21， miR-34a，miR-24)的所有检查过的纳米针产生的独特特征。(C)直方图的散点图，显示了在不同细胞周期阶段细胞内miRNA表达的异质性。(D) PI染色的流式细胞术分析，用于验证inCell-Biopsy miRNA分析显示的细胞周期。(E)三个miRNA(miR-21，let-7a，miR-34a)表达的散点图，显示了沿细胞周期阶段(G1，红色簇；S，绿色簇；G2，蓝色簇)的细胞转变。(F)let-7a，miR-21，miR24和miR-34a的QRT-PCR测量分别在循环阶段G1，S和G2进行。误差线表示s.e.m.来自3个独立实验。(G)通过细胞内活检技术显示的miRNA谱图。平均荧光值是来自单个实验的至少250 个纳米针的平均信号。
图10是图像和数据处理工作流程。(A)图像处理工作流程。(B) 图像配准和感兴趣的信号区域(ROI)提取。经过三轮放大和成像后获得的十二个图像被对齐以获得12通道图像堆栈。然后对该图像堆栈进行求和投影并设定阈值，以获取纳米针ROI和背景ROI，以进行进一步的定量分析。 (C)数据过滤和定量分析工作流程。(D)灰度荧光图像显示目标miRNA通道(Data.miR)和参考miRNA通道(Ref.miR)中的纳米针ROI和背景 ROI。比例尺，3μm。(D)中的白色矩形区域的定量分析结果显示在(E) 中。最上面的两个面板显示了Data.miR和Ref.miR的平均荧光强度，下面的面板显示了Data.miR的标准化平均荧光强度。
图11是聚类优化。(A)Eigengaps显示光谱聚类中的最佳聚类数。最高eigengap表示最佳群集数(第7天为4个群集，第14天为5个群集)。(B) 主成分分析(PCA)，显示第7天和第14天的miRNA转录组数据的分布，显示第7天和第14天分化阶段亚群的分离。
图12是每个重复的第7天和第14天的热图。热图显示在第7天(A) 和第14天(B)的六个重复中，不同簇之间的不同miRNA转录组模式。
图13是无化学诱导的随机mESC分化的细胞内活检分析。(A)Eigengap 用于确定光谱聚类期间的最佳聚类数。从第7天和第14天从miRNA转录组数据中识别出的最佳簇数分别为4和6。(B)T-SNE图显示第7天和第14 天的亚群分离非常差。(C)热图显示分别在第7天和第14天的不同亚群的 miRNA转录组的详细模式。(D)热图显示了在第7天和第14天基于亚种群之间的超几何检验的关联的统计显着性。统计关联的颜色与-log10(P值) 成比例。(E)系统发育树图显示了亚群之间沿分化的进化关系。分支的宽度与从超几何检验得出的变换后的P值[-log10(P值)]成比例。(F)箱线图分别显示了第7天和第14天源自细胞内活检的亚群miRNA转录组与分类的运动神经元的miRNA测序之间的Pearson相关系数。
图14是用于固定纳米针芯片的装置示意图，以保证多次测量能够在同一位置。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
miRNA的细胞内活检
细胞内活检技术是基于“分子捕捞”系统(19)的不断发展而来的，该系统利用一系列金刚石纳米针作为“钓鱼竿”，以最小程度地侵入和可逆地进入哺乳动物细胞的胞质区域(图1a)。具体而言，对于“捕捞”miRNA，通过将具有尺寸选择性的RNA结合蛋白p19交联在纳米针上以使纳米针功能化，充当“捕捞钩”以捕获双链RNA(dsRNA)(图1a，更多细节图6)。P19可以选择性地结合20-22个碱基对的所有dsRNA(20、21)，该范围涵盖了哺乳动物细胞中几乎所有的miRNA。由于成熟的细胞内miRNA大多是单链的(22)，因此在本研究中，针对每种靶向的miRNA，“诱饵”RNA序列已被递送至细胞质，与靶标杂交以捕获p19。当使用离心促进程序将功能化的金刚烷酮与活细胞连接时，“钓鱼竿”可以通过暂时的膜破坏穿透细胞膜进入细胞质区域，同时促进诱饵RNA的细胞内传递(19、23)(图6)。取回纳米针后，分离出了靶向的miRNA，使细胞存活(生存力96.2±1.5％，平均值±标准差，n＝3)。
细胞内活检后，对纳米针进行杂交链反应(HCR)以扩增miRNA。HCR 的特征是具有茎环结构的两个单链DNA(发夹1和2)，如果一个序列的茎部分是开放的，则它们可以彼此循环杂交(图1b)(24)。对于每个miRNA 靶标，相应的诱饵RNA在其3'端均包含互补序列以及一个小的编码突出端部分，该部分与一个小的DNA序列(引发剂)结合以触发HCR(图1b)。为了增强检测灵敏度，对发夹之一(发夹1)进行了荧光标记，并淬灭，直到其在HCR中打开。为了进行多重分析，诱饵序列的突出部分针对不同的 miRNA靶标进行了唯一编码，因此可以通过不同的荧光团观察多个miRNA 靶标(表S1)。尽管光学可分离的荧光团的数量可能受到限制(例如4个通道)，但通过使用DNase-I酶在每轮结束后收集信号后去除了DNA发夹，从而实施了多轮HCR，因此有了一套新的miRNA可以检查以提高细胞内活检技术的分析通量(图1c)。三轮HCR使能够在每次活检后检查12个miRNA。为了提高测定的可靠性，四个通道之一专用于参考miRNA(图1d)cel-miR-39，它在人或啮齿动物细胞中不存在，而是人为引入细胞质中，从而消除了潜在的由实验环境差异引起的系统性错误。通过共聚焦显微镜获得的归一化荧光亮度值(相对于参照物)表明了靶向miRNA的表达水平。尽管无法通过一一对应的方式将纳米针与每个细胞相关联，但基于它们的miRNA表达谱，来自成千上万个纳米针的分散信号仍保留着有关细胞群体的丰富信息(图 1d)。
miRNA检测限和特异性的表征
为了表征本文的细胞内活检技术的检测极限，首先进行了模拟实验，方法是从包含预混合的dsRNA(miR-34a和相应诱饵序列)的培养基中分析 miRNA(浓度从10-16到10-10不等)M.将纳米针芯片在溶液中孵育，然后冲洗，然后再进行进一步分析。对于每个芯片，都收集并量化了来自一千多个纳米针的信号(图2a，b)。本文的结果表明，低至10-15M浓度的dsRNA 都能可靠地分化(图2c)。观察到荧光强度的总体分布与miRNA浓度呈正相关(图2d)，并且正好遵循Langmuir等温线模型(25)，阳性纳米针的比例也与miRNA浓度呈正相关(图2e，另请参阅注释S1)。为了测试检测特异性，进行了一项分析，以检测合成的let-7a miRNA在具有1nt错配(let-7c) 或2-nt错配(let-7b)的序列上，并证明inCell活检技术是通过成功地区分紧密相关的miRNA序列，对单核苷酸变异具有特异性(图2f)。然后实施细胞内活检，以检测培养的A549细胞中的miRNA(let-7a或miR-34a)(图2g)。据报道这两种miRNA在细胞中表达的丰度不同：Let-7a高表达，而miR-34a 的细胞内水平相对较低(26)。使用离心控制的方法将纳米针芯片与A549 细胞连接，以启动细胞内活检(19、23)，并将两个诱饵序列递送至细胞内结构域。钓鱼反应15分钟后，从细胞中取出芯片进行分析。对于成功的 miRNA活检，已鉴定出纳米针与来自HCR扩增的荧光信号共定位(图2h)，该信号明显高于其他对照(图2i，j，也见图7A)。HCR扩增在检测细胞内丰度低的miRNA(例如miR-34a)时特别有用，否则，如果没有在针头进行 HCR扩增，这是无法观察到的(图7B)。
miRNA转录组
捕获miRNA表达动力学的能力对于一种分析技术极为重要，因为细胞内miRNA在基因表达网络中起着关键的调节作用，并在细胞切换状态时发生改变(27)。然后，在细胞活检中应用了表征DNA损伤或细胞周期不同阶段的细胞中相关miRNA的方法，以显示其作为探测细胞动力学技术的潜力。在紫外线诱导的DNA损伤后，let-7a显着下调，而miR-16和miR-26在短短几分钟内显着上调(图8)。在一个延长的时间窗口中，随着细胞进展到不同的分裂周期，观察到let-7a，miR-21和miR-34a从G1，S到G2阶段逐渐增加，而miR-24在这些阶段保持稳定(图9)。这些结果与文献(28、29) 相呼应，并证明了Cell-Biopsy能够监测与细胞活性相关的miRNA表达波动的能力。此外，该技术不仅可以全面评估细胞中miRNA的表达，而且还可以捕获细胞群体的动态异质性，如流式细胞仪(图9D)和qRT-PCR分析(图 9F，G)所证实的那样。
mESC分化的异质性进化
经过上述技术验证后，接下来在细胞活检中应用了临时的miRNA转录组，并研究了mESCs(HB9：GFP)向运动神经元的分化过程中其与细胞异质性的关系。从分化诱导开始，选择在第0天，第7天和第14天在这些细胞中分析9种不同的miRNA(图3a，b)。通过使用定制开发的处理流程和程序(图10)，获得了9个miRNA在不同分化阶段的表达(图3c)。当将所有数据盲目汇总在一起时，t分布随机邻居嵌入(t-SNE)(30)定量显示了通过三个自组织簇的出现以及ESC的分化，细胞的整体进化变化，表明使用这种方法的有效性组合miRNA表达模式可作为此过程中细胞身份的指标 (图3d)。
由ESC分化产生的细胞通常是异质性的(31)，inCell活检技术为提供了利用时间miRNA动力学来破译这种异质性和生物进化的可能性(16)。对于9个miRNA靶标中的每一个，量化了其在后期分化阶段相对于初始干细胞水平的倍数变化，针对数以千计的多维miRNA测量进行了基于自扩散的光谱聚类(实验部分中的详细信息)从6个独立的重复样品中收集纳米针，并通过eigengap(32)确定最佳簇数(图11A)。发现在分化后的第7天和第 14天都清楚地观察到稳定的亚群，并且在后期细胞似乎更加分散(图4a，b)。聚类结果也通过t-SNE分析(图4c)和主成分分析(PCA)(图11B)得到了证实。9个miRNA的热图和小提琴图显示了每个簇在特定分化阶段的独特表达模式(图4d，e，g，h和图12)，还表明了不同簇中特定簇的一些相似性(例如，第7天的聚类3与第14天的聚类5)，暗示它们之间可能存在进化相关性。从统计学上讲，能够识别簇特异性miRNA表达特征(表S2)。第7天和第14天的群集之间的共享签名支持推测它们的进化关系。例如，第7天的簇3和第14天的簇5共享了miR99a，miR218和miR9的相似签名 miRNA。MiR24，miR218和miR219是第7天第4组和第14天第3组的共享签名miRNA。这些簇的发现是通过对来自数千个与大量细胞连接的纳米针的信号进行统计分析而得出的。还假设特定簇的比例(在所有纳米针中) 作为细胞亚群百分比的指标，假设纳米针在细胞的均匀培养物中分布均匀 (图4f)。如果用细胞裂解物进行平均miRNA测量，而这些散射信息将丢失，因为大多数方法是通过现有方法完成的。
miRNA转录组对细胞组成的定位
为了研究分化过程中不同细胞亚群(以簇表示)之间的进化相关性，使用了来自inCell活检的多维miRNA数据来研究第7天和第14天的簇之间的统计关联，以确定最接近的配对。可以唯一地追溯第14天的每个群集，以与第7天的群集链接(图5a，P<0.001，超几何检验)。例如，第14天的簇 3/4/5分别与第7天的簇4/2/3相关性最高，这些配对的簇也显示了相似的 miRNA表达模式，如小提琴图所示(图4g，h)。有趣的是，第14天的聚类1和2都可以追溯到第7天的聚类1，表明第14天的聚类2是衍生自第7 天的聚类1的新分化亚群(图5b)。
为了弄清基于miRNA表达的已鉴定簇与细胞类型同一性之间的关系，集中研究了分化的运动神经元/祖细胞(GFP+)，并将每个簇在细胞内活检获得的miRNA图谱与miRNA采集的数据进行了比较在不同分化阶段对运动神经元/祖细胞进行测序(miR-seq)。有趣的是，发现第7天的第3组或第14天的第5组中的大多数9维miRNA载体与miR-seq测量的miRNA表达模式具有显着更高的相关性(图5c，P<0.001，Wilcoxon符号秩检验)，但在同一分化阶段的其他簇中未观察到，这表明在miRNA活检操作中，第7 天第3组或第14天第5组中的纳米针大部分采样了运动神经元/祖细胞。仔细观察两个簇，进一步观察到了不同miRNA的动态变化(图5d，e)。例如，从第7天到第14天，干细胞特异性miRNA(33)的miR-294明显减少；而富含运动神经元的miR-9和miR-218(34)在同一时期显着增加(图5d)。同样，对于两个运动神经元样簇，miRNA表达通常在第14天更加分散(与第7天，图5e相比)，这表明细胞状态随着分化的进行而增加。
在这里，开发了一种高度通用且功能强大的技术，即inCell活检技术，用于在活细胞中对miRNA进行原位多重分析。该技术能够从细胞质中挑选出靶向的miRNA，同时保留完整的样品。为了定量分析细胞RNA，大多数现有技术(例如qRT-PCR，微阵列，RNA测序等)始于从细胞群中提取的 RNA样品，并且仅提供细胞群的平均测量值(13、14)。另一方面，InCell活检通过使用金刚石纳米针促进的分子捕捞系统，在短短几分钟内即可从大量单个细胞中分离靶向的miRNA(19)，并并行进行miRNA的原位扩增，可视化和定量分析使用每个纳米针作为单独的反应室。这样，本文的方法不仅可以检测平均的miRNA表达水平，还可以基于miRNA分析来捕获细胞群体的细胞异质性，而在其他方法中通常会遗漏这种异质性，并且只能使用单细胞RNA测序分析(scRNA-seq)(16)。在这项研究中，金刚石纳米针的密度大致控制在每10×10μm2区域约5个纳米针。尽管无法在纳米针与每个单个细胞之间建立精确的一对一(或多对一)接触图，但inCell活检技术可实现准单细胞分析，从而提供丰富的信息来表征细胞混合物通过使用多维miRNA配置文件。作为概念的证明，使用了细胞内活检技术来剖析ESC 分化过程中的细胞异质性，并通过动态时空miRNA转录组分析研究了细胞的进化。
虽然先前已经报道了细胞内活检策略(19，35-37)，但在这项研究中，通过针对多个miRNA的特定生化设计以及用于多路原位信号放大，可视化和定量分析，共计拟为准单细胞miRNA分析平台。值得注意的是，金刚石纳米针具有足够的刚性以刺穿细胞膜，并在纳米级保持超弹性以维持变形并在细胞内活检过程中不会破裂(38)。尽管最近开发出了不同的纳米结构作为从活细胞中分离细胞内物质的工具(35-37)，并且与测序技术结合使用可能具有检测miRNA的潜力，但本文的inCell活检技术在以下方面的平衡组合中脱颖而出：现场能力，高通量，易用性以及昂贵设备的独立性。
作为一项核心优点，inCell活检不涉及任何细胞裂解和RNA制备程序，因此，可以保存所检查的细胞以进行进一步的纵向分析。此功能还极大地简化了实验操作，减少了处理时间，并为定量分析接受外部刺激或经历细胞程序内部转换的同一批细胞的miRNA表达的时间动态提供了机会。当将 miRNA分析用作基于细胞的治疗方法的表征或质量控制时，这将非常有用 (39)。同时，直接从单个细胞的细胞质中捕获miRNA的能力有效地绕过了低丰度miRNA的稀释，并防止了细胞裂解和RNA提取过程中的样品流失。即使细胞中仅存在一份单拷贝的miRNA，纳米针辅助细胞活检的实际浓度也将在10-13～10-12M左右，该技术的检测极限可以很好地耐受(10-15M)。
本文的inCell活检基于细胞内分子捕鱼系统，其中金刚石纳米针用作“钓鱼杆”，而RNA结合蛋白(p19)用作“钓鱼钩”，其特异性结合dsRNA(而不是ssRNA)(dsDNA)或dsDNA)(大小相关)(20)。对于细胞内活检操作，dsRNA复合物是通过靶向单链miRNA与互补的Bait序列之间的杂交形成的，该序列被认为是通过纳米穿刺诱导的可逆膜破坏扩散到细胞溶质中的(23)。胞质物质也可能扩散到细胞外，但这在本研究中对于处理过的细胞来说应该不是问题，因为纳米针与脂质双分子膜紧密相连(图6)，因此可能性较小使细胞内成分(例如miRNA)泄漏并被捕获。值得注意的是，在传统的基于PCR的检测中导致假阳性的细胞内pri-miRNA或pre-miRNA(13) 不会干扰本文的测定，因为它们的结构会阻止诱饵杂交以及随后与p19蛋白的结合。
每个miRNA靶标的编码诱饵序列的引入进一步增强了细胞内活检技术的特异性。实际上，p19可以结合所有可用的正确长度的dsRNA，因此可以通过轻松地在细胞内递送多个Bait序列轻松实现多重检测(例如，本研究中的9个miRNA)(20)。与scRNA-seq相比，inCell活检技术的通量在当前阶段可能较低，但是无疑具有显着降低成本和更有效的实验方案的优势。为了改进，还可以对荧光标记系统进行微调以包括更多通道，以提高测定通量。例如，如果发夹序列标记有量子点，则很容易实现8通道成像系统；并且三轮成像可以将通量提高到21个miRNA靶标。而且，某些条形码策略(例如，纳米串系统(40))的结合可以进一步提高分析通量，以允许在单个可视化周期内分析数百个miRNA靶标。
正如已经证明的，inCell-Biopsy产生的9维miRNA载体空间已经携带了丰富的信息，可用于鉴定异种簇，这些异种簇代表了与ESC分化的细胞亚群。聚类是从对miRNA表达模式的准单细胞分析中自动得出的，最近已报道这是细胞异质性的良好指标(11、12)。虽然无法在空间上确定每个纳米针与单个细胞的接触关系，但从统计学上讲，inCell活组织检查中的 miRNA分析仍然可以反映所检查细胞的组成性质，假设钻石纳米针在均匀培养的情况下随机但均匀分布细胞。源自每个纳米针的多维miRNA载体被视为巨大miRNA载体空间的输入，这有效地创建了用于miRNA转录组分析的准单细胞分析框架。特别是，在这项研究中，验证了纳米针簇与特定细胞亚群身份之间的对应关系，以进一步证实inCell活检所获得的分析结果的有效性。例如，采用了一种指导运动神经元分化的方案，并盲目鉴定了主要的纳米针簇(在所有纳米针中)，在分化后的第7天和第二天都与运动神经元身份高度相关。但是，当相同的mESC(HB9：GFP)在没有诱导化合物(视黄酸和平滑激动剂)的情况下进行自发分化时，则找不到运动神经元样簇(图13)。
在inCell活组织检查操作后保留细胞样品的能力使得可以在不同时间点进行多轮miRNA分析，从而提供了时间性miRNA转录组分析。本文的结果表明，inCell活组织检查不仅可以基于其miRNA概况创建所检查活细胞异质性的快速快照，而且还可以捕获miRNA表达的时空动态，并随后给出细胞进化路径，异源之间的生源关系细胞群，对于临床应用尤其有用(7)。
总而言之，展示了一种新颖而强大的技术，即inCell活检，可用于分析活细胞中的miRNA。通过这种技术捕获的时空miRNA动态可用于揭示在延长的培养期内混合细胞群体中细胞异质性的演变，可能为涉及细胞成分的新兴治疗策略的质量控制提供快速便捷的评估平台。
细胞培养
HB9：GFP mESCs从哥伦比亚大学的干细胞核心实验室获得。将ESC 接种在涂有0.1％明胶的皮氏培养皿中，并在37℃，5％CO2的培养箱中进一步培养以进行增殖。三天后，将ESCs胰蛋白酶消化以接种细胞。通常， 250mL ESC培养基由200mL EmbryoMax DMEM(Millipore)，37.5mL胎牛血清(FBS，HyClone)，2.5mL EmbryoMax MEM非必需氨基酸(Millipore)， 2.5mL Nucleosides(Millipore)，2.5mL的200mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)， 2.5mL的Pen/Strep(10,000单位/mL青霉素；10,000μg/mL的链霉素，Invitrogen)，180μL的2-巯基乙醇稀释(1/100in稀释)含Mg和Ca，Invitrogen 的PBS)和25μLLIF/ESGRO(Millipore)。之后，将ES培养基替换为分化培养基。通常，450mL分化培养基包括200mL Advanced DMEM/F12 (Invitrogen)，200mL神经基础培养基(Invitrogen)，46mLKnockout-SR (Invitrogen)，4.6mL Pen/Strep，4.6mL L-谷氨酰胺，320μL的2-巯基乙醇稀释液。两天后，将视黄酸(RA，在分化培养基中，稀释度为1/1000， Sigma-Aldrich)和平滑激动剂(SAG，在分化培养基中，稀释度为1/1000， Sigma-Aldrich)添加到培养基中，以强烈诱导运动神经元分化。体外分化3 天后，使用分化培养基补充4.5μL胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF， Invitrogen)，9mL B27(Invitrogen)和4.5mL N2补充剂(Invitrogen)，以促进运动神经元的生长。
A549癌细胞保存在补充有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Life Technology)中。在进行分子捕捞实验之前，将细胞接种到4孔多孔培养皿(Nunclon)中，并使其生长直至汇合至～80％。
金刚石纳米针的制备与表征
金刚石纳米针的制造遵循先前描述的规程(19)，包括纳米金刚石膜的沉积以及随后通过电子回旋共振微波等离子体化学气相沉积(ECR-MPCVD) 进行的偏压辅助反应离子刻蚀(RIE)。直径为3英寸的N型(001)硅片用作衬底。在纳米金刚石沉积之前，将基板在超声浴中浸泡在乙醇中60分钟，该乙醇包含粒径为5nm的纳米金刚石粉末的悬浮液。然后使用装有1.5kW 微波发生器的商业ASTeX MPCVD沉积7微米厚的纳米金刚石薄膜。纳米金刚石沉积在10％CH4/H2混合物中诱导的等离子体中进行，总压力为30Torr，总气体流速为200sccm。微波功率和沉积温度分别保持在1200W和800℃。在纳米金刚石膜沉积之后，使用电子回旋共振MPCVD进行RIE。ASTeX 微波源采用了由外部电磁线圈产生的875G磁场。RIE使用45％Ar和55％ H2的混合物作为反应气体，以20sccm的总流速提供气体。基板偏压为-200V，反应物压力为7×10-3Torr。蚀刻时间为3小时，输入微波功率为800W。通过扫描电子显微镜(SEM，Philips FEG SEM XL30)表征所得金刚石纳米针的形貌，并将样品倾斜45°进行SEM。
金刚石纳米针的功能化
为了使用p19蛋白功能化金刚石纳米针，首先将贴剂在食人鱼溶液(3： 1，v/v，98％H2SO4：27.5％H2O2)中浸泡1.5小时，然后用蒸馏水，甲醇，甲醇/二氯甲烷(DCM)混合物(3：1，v/v)和DCM依次进行。将纳米针贴剂用氮气干燥，然后在氮气保护的环境中浸入(3-氨丙基)三乙氧基硅烷 (APTES)溶液(在DCM中为20％，v/v)中过夜。依次使用乙醇，异丙醇和蒸馏水冲洗纳米针贴剂，然后通过吹氮气将其进一步干燥。然后将纳米针贴片在NHS-生物素溶液(PBS中1μg/mL，Sigma-Aldrich)中浸泡1小时，链霉亲和素(20％的链霉亲和素被荧光染料Alexa Fluor 488标记)溶液 (10μg/mL)在PBS中(Invitrogen)孵育2小时，并用生物素化的p19 siRNA 结合蛋白溶液(在PBS中1μg/mL，New England Biolabs)孵育1小时。在相邻的浴步骤之间，用蒸馏水冲洗纳米针贴剂。每次实验后，将纳米针贴片浸入热(约90℃)食人鱼溶液(3：1，v/v，98％H2SO4：27.5％H2O2)中，以除去纳米针上的所有交联物质(蛋白质，核苷酸等)。纳米针表面，并通过SEM图像确保纳米针结构的完整性。这样，一个补丁可以使用至少20次。除非另有说明，否则所有材料均购自Sigma-Aldrich。
离心控制分子捕捞
RNA诱饵序列的细胞内递送和miRNA捕捞是通过离心控制的过程进行的(19)。对于贴壁培养的细胞，首先去除培养基，然后将100μLRNA诱饵序列溶液(无血清培养基中的每个诱饵序列为10nM)施加到细胞上。然后将纳米针贴片面向4孔培养皿中的细胞放置。然后将整个复合物置于带有平板转子的离心机中，以400r.p.m旋转。(22.8g)4分钟。第一次离心后，将装置置于培养箱中10分钟，以使诱饵序列扩散到细胞质中并与细胞内靶标形成dsRNA。之后，进行第二次离心以增强miRNA捕捞结果。在离心过程中，控制升温速度以保持平稳的加速度，以避免纳米针贴剂在细胞上的任何运动。分别选择3rpm/s和6rpm/s进行加速和减速。
原位HCR扩增
细胞内活检中使用的每个RNA诱饵序列都有一个独特的10bp突出端序列，可用于扩增与杂交链反应(HCR)耦合的信号(41)。为了在针头上进行miRNA的HCR扩增，将引发剂序列在含有5X柠檬酸钠(SSC，Invitrogen) 和0.05％吐温(pH 7.4，Invitrogen)的杂交缓冲液中稀释至最终浓度10nM；将发夹在反应缓冲液中稀释至最终工作浓度为20nM。用0.05％SDS冲洗15 分钟后，将纳米针贴片浸入引发剂溶液中，以在dsRNA和引发剂序列之间进行杂交。用洗涤缓冲液(1X SSC，0.05％Tween)快速漂洗后，将贴片在 37℃的杂交缓冲液中进一步孵育3小时，该杂交缓冲液包含不同的发夹 DNA(20nM)，FAM，JOE，CY3或CY5荧光标记和黑色孔淬火器(BHQ)。在启动HCR之后，分离异二聚体，并恢复荧光团的吸收/发射。为确保分离并降低发夹1与发夹2结合后的重新淬灭效果，发夹序列中包含一个短的不匹配序列，可作为间隔子。所有发夹和引发剂寡核苷酸均购自BGI(中国深圳)，并汇总在表S1中。
DNase I辅助多轮信号放大
第一次成像后，将HCR扩增的纳米针贴片在37℃下浸入DNase I溶液中1小时，以完全洗脱在针表面杂交的DNA，然后用洗涤缓冲液洗涤3次。之后，启用纳米针贴片以执行HCR扩增以检测另外四个miRNA靶标。
共聚焦显微镜和图像处理
在每个HCR扩增过程之后，进行共聚焦显微镜检查(Leica SP8，40倍物镜，1.3N.A.，水浸)，以可视化和量化捕获在金刚石纳米针表面的miRNA。用z分辨率为0.3μm的纳米针贴片进行扫描，得到一叠45-55片，并获得了三维重建和该叠层的最大投影。HCR扩增的结果是，对纳米针表面的荧光斑点(来自DNA发夹序列)进行了定量分析，并用于分析细胞内miRNA 靶标的捕获。经过三轮放大后，将图像投影并对齐以获得包含荧光强度和相对位置信息的12通道图像堆栈。为了区分正信号与背景噪声或碎屑，首先选择了直径为0.4至1.5μm的荧光斑点作为纳米针区域。然后应用荧光阈值来分选带有捕获的miRNA的阳性纳米针。对于每个纳米针贴片，最终获得代表miRNA表达水平的强度矩阵，其中列是miRNA靶标，行是不同的纳米针。
数据预处理和聚类
获得miRNA表达矩阵后，将第7天和第14天的表达数据除以胚胎干细胞阶段相匹配的平均值，然后进行log2转化，得出miRNA表达倍数变化数据。为了确保不同重复之间的miRNA表达数据可比，随后分别在第7天和第14天进行了分位数归一化。
进行了预处理后，来自所有重复样本的miRNA表达倍数变化数据将分别合并为第7天和第14天的无监督分类输入。进行了自扩散分析(42)，该分析是通过传播亲和矩阵以改善样本相似性学习而实现的，然后进行光谱聚类(32)，以实现相对较好的数据分布适应性和较低的时间消耗。基于局部缩放亲和力计算了eigengap(32)，从而推断出逐样本距离的自校正亲和力，并选择了最佳聚类数(k)进行聚类(图11A)。第7天和第14天的逐样本相似性矩阵和相似性网络分别显示在图4a，4b中。
进化关系和细胞成分的确定
对于第7天(或第14天)的每个miRNA分析，在第14天(或第7天) 计算其miRNA表达与不同簇中纳米针的平均表达水平之间的Pearson相关系数。随后在第14天将第7天的纳米针分配给最相关的簇，反之亦然。构建混淆矩阵以汇总在第7天和第14天同时分类到每对簇的纳米针的总数，然后进行超几何测试以评估其关联的统计意义。首先，计算了第7天每个簇中探针的平均表达谱。其次，对于第14天的每个纳米针，用第7天每个簇的平均谱和纳米针(第14天)计算了皮尔逊相关系数(PCC))与PCC 最高的集群配对(第7天)。第三，对所有成对的Day14-Day7纳米针关系进行计数，汇总，然后进行超几何测试，以验证第14天与第7天的簇配对的纳米针的超量表达。最后，对来自超几何测试的p值进行调整，以进行多个假设检验。使用Benjamini-Hochberg过程，并作为热图进行了说明。同样，使用第14天的簇作为参考，对第7天的纳米针进行了关联测试，结论是高度一致的。
为了说明聚类在不同阶段之间的潜在进化关系，根据第7天和第14天聚类之间的统计关联生成了系统进化树，其中分支宽度代表从中得出的变换后的p值(-log10(P))超几何检验。为了进行验证，用Sony SH800S细胞分选仪分离了运动神经元细胞(GFP+)，使用TRIzol试剂盒(Life Technology) 提取了分选细胞的总RNA，用于miR-seq分析(BGI)。为了研究纳米针簇的潜在细胞类型同一性，计算了inCell活检获得的miRNA图谱与通过 miR-seq测量的9种miRNA的表达水平之间的皮尔逊相关系数。
miRNA的qRT-PCR
为了使用qRT-PCR测量miRNA(Let-7a，miR-21，miR-24，miR-34a， RNU43)，使用TRIzol试剂盒(生命技术)从A549细胞中提取总RNA。对于15μL反应，将10ng总RNA反转录并通过TaqMan miRNA Assays试剂盒(产品号4366596，Life Technology)进行分析。按照制造商的规程，使用Applied Biosystems实时PCR仪器分析特定miRNA的表达。
统计分析
至少三个独立的生物学复制品用于所有实验(n≥3)，对于每个复制品，收集至少250个纳米针的信号进行分析。对于图2c，对于小提琴图，沿y 轴的bin大小为60(荧光，a.u。)；覆盖框图的晶须范围为1～99％，每个框显示数据的25％，50％和75％。进行Kruskal-Wallis分析以确定不同dsRNA 浓度之间的统计学显着性，p<0.005表示显着差异。对于图2h，i进行了 ANOVA分析以确定统计学显着性，P<0.05表示有显着差异。误差棒表示来自3个独立实验的平均值(s.e.m.)的标准误差。对于图4g，h，小提琴图沿 y轴的大小为0.1(表达水平的倍数变化)。为了鉴定簇特异性的miRNA表达特征，进行了两尾Student's t检验，以评估每种miRNA在第7天(或第14天)的特定簇与其他簇之间是否差异表达。对于第7天(或第14天)的每个群集，基于绝对log2表达水平(|log2EL|>＝0.75)和Benjamini-Hochberg 调整后的p值(BH调整后的P<0.001)对miRNA表达特征进行优先排序。对于图5c，进行了Wilcoxon符号秩检验以确定统计显着性，P<0.001表示显着差异。对于图5d，误差线表示来自6个独立实验的平均值(s.e.m.)的标准误差。图5e，对于小提琴图，沿y轴的bin大小为0.1(表达水平的倍数变化)。
注释S1：p19和dsRNA吸附建模的详细信息
本文的系统利用p19蛋白捕获双链RNA(dsRNA)(21)，可以使用 Langmuir等温模型(25)进行大致描述。用p19蛋白修饰针表面；将指定浓度的dsRNA溶解在本体溶液中，并可以被p19蛋白捕获，该过程类似于通过以下方法描述的表面吸附：
Figure RE-GDA0002878578700000211
其中，R(液体)表示本体溶液中自由流动的dsRNA，R(吸收)表示被p19捕获(吸收在反应性表面上)的dsRNA。
有两个主要假设：
1)在此模型中，假设p19蛋白捕获是一个相互独立的过程，这意味着无论被吸附物(dsRNA)的覆盖率如何，吸附速率都是恒定的。
2)假定每个贴片中的所有纳米针都是均匀的，因此所有针表面均被理想化为一个完整的反应表面以捕获dsRNA。
因此，可以表示出吸附到表面的dsRNA的通量，如下所示：
Ra＝kacacs(1-θ)
其中Ra是dsRNA在表面上的通量(mol m-2s-1)；ka是吸附速率常数 (m3 mol-1s-1)；ca是溶液表面的浓度(mol m-3)；cs(mol m-2)是表面饱和的被吸附物的最大表面浓度；θ是被吸附物的部分覆盖率。
同样，dsRNA离开表面的流量为：
Rd＝kdcsθ
其中kd是解吸速率常数(s-1)。
在平衡状态下，dsRNA被吸附物的表面覆盖率是恒定的，因此dsRNA 流入和流出表面的通量是相等的。等同于上述表达式并取消通用术语，可以找到：
Figure RE-GDA0002878578700000221
ka/kd比是吸附的平衡常数，可以用Ka来描述它。通过重新排列表达式，可以将表面覆盖率表示为：
Figure RE-GDA0002878578700000222
在室温和一定的pH值(7.4)下，Ka为常数。考虑到系统中涉及的荧光背景，将常量N添加到表达式中，其中N表示初始状态下由荧光背景引起的覆盖率。因此，将表面覆盖率表示为
Figure RE-GDA0002878578700000223
在本文的系统中，通过拟合实验数据，N值为0.118，Ka值为6.83×109 (m3·mol-1)。
表S1寡核苷酸序列
Figure RE-GDA0002878578700000224
Figure RE-GDA0002878578700000231
表S2识别特定簇的miRNA签名
Figure RE-GDA0002878578700000241
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (4)

1.一种高通量实时检测细胞状态的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、将RNA探针导入细胞中，并与靶miRNA结合，得到双链RNA；所述RNA探针包含与靶miRNA互补的第一片段和用于结合显色试剂的第二片段；
S2、将带有纳米针的芯片与所述细胞接触，以使得所述纳米针刺入所述细胞中，所述纳米针上结合有RNA结合蛋白，并使所述RNA结合蛋白与所述双链RNA结合；
S3、拔出所述纳米针，并将所述芯片洗涤和平行原位扩增，然后与显色试剂接触并再次洗涤，接着置于带有定位指示件的玻片上进行图像采集；
S4、重复进行步骤S1至S3一次或多次，并且将采集得到的图像进行去噪、分区、筛选和光电信号转换；
S5、将转换得到的信号根据强度和定位进行聚类分析，得到多个亚类；
S6、将所述多个亚类进行时序分析，得到细胞实时状态和/或不同细胞间状态关系。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述显色试剂为带有荧光基团且与所述第二片段互补的寡核酸，或一系列可以互相打开的带有荧光基团的茎环结构寡核酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA探针为多种RNA探针，其中每一种探针针对的靶miRNA彼此不同。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA结合蛋白为p19蛋白；
通过离心使得所述纳米针刺入所述细胞中。
CN202010525177.9A 2020-06-10 2020-06-10 一种高通量实时检测细胞状态的方法 Active CN113782095B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010525177.9A CN113782095B (zh) 2020-06-10 2020-06-10 一种高通量实时检测细胞状态的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010525177.9A CN113782095B (zh) 2020-06-10 2020-06-10 一种高通量实时检测细胞状态的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113782095A true CN113782095A (zh) 2021-12-10
CN113782095B CN113782095B (zh) 2023-11-28

Family

ID=78834832

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010525177.9A Active CN113782095B (zh) 2020-06-10 2020-06-10 一种高通量实时检测细胞状态的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113782095B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114632564A (zh) * 2022-04-20 2022-06-17 香港城市大学深圳研究院 一种集成微流控芯片及原代循环肿瘤细胞体外处理方法
WO2024006308A1 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 Viqi, Inc. Auto high content screening using artificial intelligence for drug compound development
CN117821597A (zh) * 2024-03-06 2024-04-05 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种实时检测活细胞内lncRNA表达水平的方法及其应用
CN117821597B (zh) * 2024-03-06 2024-05-24 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种实时检测活细胞内lncRNA表达水平的方法及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030104426A1 (en) * 2001-06-18 2003-06-05 Linsley Peter S. Signature genes in chronic myelogenous leukemia
US20030175720A1 (en) * 2002-03-18 2003-09-18 Daniel Bozinov Cluster analysis of genetic microarray images
CN102220431A (zh) * 2011-05-18 2011-10-19 中国药科大学 一种检测活细胞内核酸的探针及其应用方法
CN104250662A (zh) * 2013-06-26 2014-12-31 南京大学 一种原位检测细胞内端粒酶活性的纳米探针及其制备方法
US20160069903A1 (en) * 2014-09-10 2016-03-10 Fundació Institute De Ciències Foròniques Method for detecting cells
CN107748256A (zh) * 2017-10-11 2018-03-02 上海医盈网络科技有限公司 一种循环肿瘤细胞的液体活检检测方法
CN110577983A (zh) * 2019-09-29 2019-12-17 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 高通量单细胞转录组与基因突变整合分析方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030104426A1 (en) * 2001-06-18 2003-06-05 Linsley Peter S. Signature genes in chronic myelogenous leukemia
US20030175720A1 (en) * 2002-03-18 2003-09-18 Daniel Bozinov Cluster analysis of genetic microarray images
CN102220431A (zh) * 2011-05-18 2011-10-19 中国药科大学 一种检测活细胞内核酸的探针及其应用方法
CN104250662A (zh) * 2013-06-26 2014-12-31 南京大学 一种原位检测细胞内端粒酶活性的纳米探针及其制备方法
US20160069903A1 (en) * 2014-09-10 2016-03-10 Fundació Institute De Ciències Foròniques Method for detecting cells
CN107748256A (zh) * 2017-10-11 2018-03-02 上海医盈网络科技有限公司 一种循环肿瘤细胞的液体活检检测方法
CN110577983A (zh) * 2019-09-29 2019-12-17 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 高通量单细胞转录组与基因突变整合分析方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GERILE OUDENG等: "One-Step in Situ Detection of miRNA-21 Expression in Single Cancer Cells Based on Biofunctionalized MoS2 Nanosheets", 《ACS APPLIED MATERIALS & INTERFACES》, vol. 10, no. 1, pages 350 - 360 *
ZIXUN WANG等: "High-throughput intracellular biopsy of microRNAs for dissecting the temporal dynamics of cellular heterogeneity", 《SCIENCE ADVANCES》, vol. 6, pages 1 - 11 *
ZIXUN WANG等: "Interrogation of Cellular Innate Immunity by Diamond-Nanoneedle-Assisted Intracellular Molecular Fishing", 《NANO LETTERS》, vol. 15, pages 7058 *
王绘珍 等: "基于Y型探针用于外泌体内多种MicroRNA原位检测研究", 《中国化学会第十三届全国分析化学年会论文集（二）》, pages 1664 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114632564A (zh) * 2022-04-20 2022-06-17 香港城市大学深圳研究院 一种集成微流控芯片及原代循环肿瘤细胞体外处理方法
CN114632564B (zh) * 2022-04-20 2024-03-08 香港城市大学深圳研究院 一种集成微流控芯片及原代循环肿瘤细胞体外处理方法
WO2024006308A1 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 Viqi, Inc. Auto high content screening using artificial intelligence for drug compound development
CN117821597A (zh) * 2024-03-06 2024-04-05 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种实时检测活细胞内lncRNA表达水平的方法及其应用
CN117821597B (zh) * 2024-03-06 2024-05-24 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种实时检测活细胞内lncRNA表达水平的方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113782095B (zh) 2023-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Crosetto et al. Spatially resolved transcriptomics and beyond
JP7327826B2 (ja) 核酸の検知
CN108350484B (zh) Rna分析的组合物和方法
Luo et al. Cerebral organoids recapitulate epigenomic signatures of the human fetal brain
US10724078B2 (en) Spatial mapping of molecular profiles of biological tissue samples
US20220026433A1 (en) Cleavable fluorescent tyramide for sensitive and multiplexed analysis of biological samples
AU2017200433B2 (en) Multivariate diagnostic assays and methods for using same
US11492610B2 (en) Sample multiplexing for single-cell RNA sequencing
CN105164279A (zh) 靶核酸的多重分析
Wang et al. High-throughput intracellular biopsy of microRNAs for dissecting the temporal dynamics of cellular heterogeneity
Liu et al. Integrating single-cell RNA-seq and imaging with SCOPE-seq2
CN113782095B (zh) 一种高通量实时检测细胞状态的方法
CN106536735A (zh) 分析dna样品的探针集合和使用所述探针集合的方法
WO2017196527A1 (en) Consecutive hybridization for multiplexed analysis of biological samples
EP2670867B1 (en) A method for detecting chromosome structure and gene expression simultaneously in single cells
Lee et al. Single-cell toolkits opening a new era for cell engineering
CN106497916A (zh) 一种用于高通量测序检测的nk细胞多基因变异文库的构建方法及其应用
Vertes Single-cell biology: The power of one
CN106834493B (zh) 一种低成本的aml1-eto融合基因快速检测探针及其制备方法和应用
Zhao et al. Discrete single-cell microRNA analysis for phenotyping the heterogeneity of acute myeloid leukemia
US20110275074A1 (en) Method and apparatus for chromosome profiling
CN117821597B (zh) 一种实时检测活细胞内lncRNA表达水平的方法及其应用
Cheng et al. Autonomous combinatorial color barcoding for multiplexing single molecule RNA visualization
US11634769B2 (en) Method of determining target nucleic acid
CN117821597A (zh) 一种实时检测活细胞内lncRNA表达水平的方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant