CN105806912A - 基于纳米孔道和电化学传感定量检测端粒酶活性的方法 - Google Patents

基于纳米孔道和电化学传感定量检测端粒酶活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于纳米孔道和电化学传感的端粒酶活性检测方法，本方法步骤如下：首先，在多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜的纳米孔道内壁连接端粒酶识别序列作为引物；然后，端粒酶对引物进行扩增，形成的富G序列；在钾离子存在下形成G‑四链体；利用电化学工作站对通过纳米孔道的指示分子产生的电流进行电化学检测。本发明无需制备复杂材料以及标记DNA探针，可避免材料制备及标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明具有成本低、快速、简便、灵敏度高、准确性好的优点。

Description

基于纳米孔道和电化学传感定量检测端粒酶活性的方法
技术领域
本发明属于一种定量检测尿液中端粒酶活性的生物传感技术，具体涉及基于纳米孔道的电化学传感定量检测端粒酶活性的方法。
背景技术
端粒酶是合成染色体末端的端粒的酶。端粒(telomere)是真核细胞染色体的天然末端，由上千个6碱基重复序列(TTAGGG)组成，是细胞必需的遗传组分。它的作用是维持端粒有足够的长度，保证基因信息在复制过程中的准确性，以防止染色体末端遗传信息的丢失。在正常情况下，每个细胞分裂周期都会使端粒变的越来越短，当端粒短到一定程度时就会发出信号，细胞停止分裂。端粒酶由RNA和蛋白质亚基组成，是基本的核蛋白逆转录酶，在细胞染色体复制过程中，能够以自身RNA为模板，在染色体3’末端合成重复序列，维持端粒的长度。端粒酶在正常体细胞中的活性被抑制，但是大量的资料表明在一些恶性肿瘤中的表达高达85％。由于端粒酶特异地表达于各种肿瘤细胞，并且是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的。因此，端粒酶活性是诊断多数恶性肿瘤、判断愈后的良好指标。
传统的端粒酶活性检测方法主要有端粒重复序列延伸法、端粒重复序列扩增法(TRAP)。此方法系最早建立的方法，稳定性好，特异性高；缺点是需要样品量较大，灵敏性差，检测时间长，不适合临床标本的大量检测，另外在实验中同位素的用量较大，对试验人员的身体有危害。TRAP分析法能够实现高通量高灵敏度的检测，但仍有PCR放大技术带来的缺点。此外，TRAP法需要使用昂贵的设备和试剂。此外，TRAP在筛选有效的端粒酶抑制剂如G-四联体配体时易受PCR派生产物的影响，因此，该方法存在很多局限性。
近年来，为替代传统的TRAP分析法，研究者们已经开发了许多PCR-free分析方法并将之应用到端粒酶活性的检测中，例如光学传感器、表面等离子共振、电致化学发光、电化学检测和指数等温扩增分析等，然而，上述大多数策略因为端粒酶引物的固定化成本高、操作烦琐、灵敏度低等问题在应用时受到了限制。此外，当前的大多数新建端粒酶检测方法都局限于细胞提取物中端粒酶活性分析，用于实际样品的检测很少。因此，发展对端粒酶活性分析的简单、灵敏、低成本的监测方法、并可直接用于尿液中端粒酶活性的检测对医学临床诊断技术的发展有重要意义。
发明内容
发明目的：针对现有技术的问题，提供了一种基于纳米孔道和电化学传感进行定量测定端粒酶活性的方法。本发明中针对端粒酶作用于端粒产生G-四链体而产生的构型的变化，从而使孔道内空腔减少，流体位阻增加,通过信号分子的阳极电流的变化测定端粒酶活性，它具有灵敏度高、准确性好、无标记等优点。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于纳米孔道和电化学传感检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)细胞的培养以及端粒酶的提取；
(2)在多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜的纳米孔道内壁连接5’端修饰了-CHO的端粒酶引物；
(3)用细胞中提取的端粒酶对连接到纳米孔道内壁的端粒酶引物进行扩增，得到重复的富G序列；
(4)在加入钾离子的条件下富G序列的空间构型发生变化，形成G-四链体；
(5)利用电化学方法对通过纳米孔道的铁氰化钾或邻苯二酚指示分子产生的电流进行检测。
步骤(1)中所述的细胞为HeLa、A549、MCF-7或MDA-MB-231等肿瘤细胞，其中HeLa细胞的数量为10～10000个细胞，其余肿瘤细胞为3000个。
步骤(2)中所述的多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜的孔径优选为55nm～180nm。
步骤(2)所述的5’端修饰了-CHO的端粒酶引物序列为：5’-CHO-TTT TTT TTT AATCCG TCG AGC AGA GTT-3′。其中，5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’为端粒酶进行扩增的特异性识别序列。
步骤(2)所述在纳米孔道内壁连接5’端修饰了-CHO的端粒酶引物具体如下：将多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜浸入0.8-1.5mL含有1％-10％APTES的乙醇溶液中并震荡10-15小时后，再用乙醇洗去纳米孔道内残余的硅烷，干燥后，将3-20μL浓度为30-100μM的5’端修饰了-CHO的端粒酶引物的水溶液滴在多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜表面，反应20-30小时后，此时，5’端修饰了-CHO的端粒酶引物因其修饰的醛基与孔道内修饰的氨基发生席夫碱反应而被连接到孔道内部。将连接有端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜浸入到含有0.02％-0.2％的苯甲醛的水溶液中并震荡8-14小时，在0-10℃下将多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜保存于缓冲溶液中；其中，所述缓冲溶液为pH＝8.0的10mMTris-HCl溶液。其中，所述5’端修饰了-CHO的端粒酶引物在pH＝8.0的10mM Tris-HCl缓冲溶液中的终浓度为10～100μM。
其中，步骤(3)和步骤(4)具体步骤如下：将步骤(2)得到的内壁连接上5’端修饰了-CHO的端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜，置于密封的装置内，并保持内部环境湿润。用端粒酶缓冲溶液将肿瘤细胞配置成不同的浓度的肿瘤细胞液，在孔道内壁连接上端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜上滴加10μL不同浓度的肿瘤细胞液对其引物进行扩增延伸，28-32℃下反应4-6小时后，浸入0.5-1.5M KCl并轻轻震荡0.5-1.5小时，得到孔道内部形成G-四链体的多孔阳极氧化铝模板。其中，所述端粒酶缓冲溶液为含有MgCl2、KCl、Tween 20、EGTA或dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HCl缓冲溶液，所述MgCl2初始浓度为1.5mM，KCl初始浓度为63mM，Tween 20初始浓度为0.005％(v/v)，EGTA初始浓度为1mM，dNTPs初始浓度为1mM。
其中，步骤(5)所述的利用电化学方法进行检测的具体步骤如下：自制一个电解池作为检测元件。将铂片作为工作电极固定在电解池底部，多孔阳极氧化铝模板置于铂片上，之后加入O型硅树脂密封圈以防漏液，接着固定电解池的上半部分。用一个铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，形成三电极体系。在电解池中加入指示分子并放置3-10分钟后用电化学工作站进行检测得到电流-时间曲线。设置参数：电位为0V，采样间隔为0.05s，采样时间为600s。其中，指示分子为浓度为5mM的铁氰化钾溶液。其中含有5mM铁氰化钾，100mM氯化钾。所述的指示分子还可以采用邻苯二酚。
本发明提供的一种基于纳米孔道和电化学传感定量检测端粒酶活性方法的原理为：本发明通过在多孔阳极氧化铝模板内部连接5’端修饰了-CHO的端粒酶引物，利用端粒酶与端粒酶引物之间的作用对端粒酶引物进行扩增，产生引物的重复序列，在钾离子的存在下该重复序列形成G-四链体，发生了构型上的变化，导致了纳米孔道内的位阻增大有效面积减小，从而阳极电流的减小。上述方法中，5’端修饰了-CHO的端粒酶引物是通过席夫碱反应连接到纳米孔道内部：在纳米孔道内部修饰上-NH2，加入5’端修饰了-CHO的端粒酶引物后，在温和的条件下进行反应，将端粒酶引物连接到纳米孔道内壁。上述方法中，端粒酶可以与端粒酶引物相结合，并在端粒酶引物的3’端扩增延伸形成重复的富G序列(TTAGGG)，之后四个鸟嘌呤会以分子内氢键的形式形成G-四分体，每个相邻G-四分体之间通过π-π堆积作用形成G-四链体；这种四链体的DNA本身是负电性的，在四个鸟嘌呤中心形成一个空的离子通道，如果有K+或者Na+，它们就会占据到这些位置，起到稳定G-四链体的作用。
本发明相对于现有技术具有以下优点：
(1)本发明将端粒酶引物连接到纳米孔道壁上，采用了多孔阳极氧化铝模板，具有孔径可调，良好的纳米通道阵列，稳固的整体结构，便于表面官能化等优点，是一种有很大潜力的检测材料。
(2)本发明无需标记，可避免现有技术中对PCR体系中加入荧光基团进行标记而导致检测成本高的缺点。
(3)本发明利用端粒酶对其引物的特异性识别进行扩增延伸来提高其特异性。
(4)本发明在实验过程中，5’端修饰了-CHO的端粒酶引物通过席夫碱反应连接到纳米孔道内壁以及端粒酶与其引物进行扩增延伸的反应中，反应条件温和，实验操作简单。
(5)电化学生物传感器具有高灵敏度、高兼容性和成本低廉等优点，降低了实验的检测限。
(6)该方法可用于尿液中端粒酶的检测，检测结果与临床诊断结果一致，对临床诊断技术的发展具有重要意义。
附图说明
图1显示了基于纳米孔道的电化学传感检测端粒酶活性的流程图。
图2为电化学检测过程中所用到的自制电解池的结构示意图。其中标记A为电解池的上半部分。
图3显示了端粒酶活性检测实验验证图。
其中，附图3中的a-d标记说明如下：
a：铁氰化钾流经多孔阳极氧化铝模板产生的电流-时间曲线；
b：在多孔阳极氧化铝模板内壁连接5’端修饰了-CHO的端粒酶引物后，铁氰化钾流经多孔阳极氧化铝模板产生的电流-时间曲线；
c：在多孔阳极氧化铝模板上加入端粒酶与钾离子后，铁氰化钾流经多孔阳极氧化铝模板产生的电流-时间曲线；
d：在多孔阳极氧化铝模板内壁连接5’端修饰了-CHO的端粒酶引物并加入端粒酶与钾离子后，铁氰化钾流经多孔阳极氧化铝模板产生的电流-时间曲线。
图4显示了定量检测端粒酶活性的时间-电流曲线。
其中，图4A：在不同量的甲基化转移酶作用下，得到的时间-电流曲线(HeLa细胞的个数：(a)10、(b)50、(c)100、(d)200、(e)500、(f)1000、(g)2500、(h)5000、(i)7500、(j)10000cells)；
图4B：电流降低百分比与细胞个数的标准曲线图；
图4B的插图：电流降低百分比与细胞个数的线性关系。
图5为不同细胞中的端粒酶活性及端粒酶的特异性检测结果。
其中，图5A显示了从不同细胞中(加热后的HeLa细胞，MCF-7细胞，A549细胞，MDA-MB-231细胞，HeLa细胞)提取出的端粒酶的活性；
图5B显示了3000个HeLa细胞，100ug牛血清蛋白，葡萄糖氧化酶，辣根过氧化物酶)与端粒酶引物作用后引起的电流降低百分比。
具体实施方式
下面结合附图1-附图5对本发明作更进一步的说明。
本实验中用到的试剂和仪器：
5’端修饰了-CHO的端粒酶引物，多孔阳极氧化铝模板(PAA)，端粒酶(telomerase),3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，苯甲醛，铁氰化钾，HeLa细胞，牛血清蛋白(BSA)，葡萄糖氧化酶(GOD)，辣根过氧化物酶(HRP)，电化学工作站(CHI660)。
5’端修饰了-CHO的端粒酶引物序列：5’-CHO-TTT TTT TTT AAT CCG TCG AGCAGA GTT-3′
实施例1：
参见图1，基于纳米孔道和电化学传感检测HeLa细胞中端粒酶活性的分析方法，检测步骤是：
步骤(1)细胞培养和端粒酶提取：HeLa细胞接种在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将100万个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 7.5,1mM MgCl2,1mM EGTA,0.5％(w/v)CHAPS,10％(v/v)glycerol,0.1mMPMSF)中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中；
步骤(2)在纳米孔道内壁连接5’端修饰了-CHO的端粒酶引物：用乙醇和超纯水将多孔阳极氧化铝模板洗去杂质，在室温下用氮气干燥；多孔阳极氧化铝模板浸入1mL含有5％APTES的乙醇溶液中，轻轻震荡12h后在纳米孔道内壁产生-NH2群；之后，再用乙醇清洗除去纳米孔道内的残余硅烷，并在室温下用氮气进行干燥；之后，10μL的60μM 5’端修饰了-CHO的端粒酶引物水溶液滴在模板表面上并反应24h；在此过程中，多孔阳极氧化铝模板被放置在一个固定在密封的玻璃瓶中的架子上，玻璃瓶底部有一些水使瓶子内部保持湿润的环境。将连接有端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板浸入到1mL含有0.1％的苯甲醛的水溶液中，并轻轻震荡12h，用来封闭剩余的氨基。未连接上的端粒酶引物和剩余的苯甲醛用超纯水清洗；得到孔道内壁固定了端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板，将其在4℃保存于pH＝8的10mM的Tris-HCl缓冲溶液中；
步骤(3)端粒酶对端粒酶引物进行扩增：将步骤(2)得到的连接上端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板在室温下用氮气干燥后，置于密封的装置内，并保持内部环境湿润，在多孔阳极氧化铝模板上分别滴加10μL含有10个和1000个HeLa细胞的端粒酶缓冲溶液，并将其置于30℃的水浴锅中反应5个小时，使端粒酶对端粒酶引物进行扩增延伸；
步骤(4)形成G四链体：反应结束后，将多孔阳极氧化铝模板浸入1M KCl并轻轻震荡1小时，得到了孔道内部形成了G-四链体的多孔阳极氧化铝模板；
步骤(5)端粒酶活性检测步骤：自制一个电解池作为检测元件(参见图2)。将铂片作为工作电极固定在电解池底部，多孔阳极氧化铝模板置于铂片上。之后，将电解池的上半部分(参见图2中A)固定在多孔阳极氧化铝模板上，在他们中间加入O型硅树脂密封圈防止漏液。用一个铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，与电解池底部的铂片形成三电极体系。装置建好之后，在电解池中加入3mL铁氰化钾溶液并静置5min，用电化学工作站进行检测，设置初始电位为0V，采样间隔为0.05s，试验时间为600s，测定其时间-电流曲线。检测结束后，得到了图4A中的a和f曲线。根据其电流值计算得检测到的细胞个数为11个和914个，证明了该方法检测限低、灵敏度和准确度高(10％以内)。
图4B级插图中显示了电流降低百分比与细胞个数的线性关系。将电流降低百分比定义为D，得到了电流降低百分比与细胞个数的对数之间的线性关系，即D＝-3.8784+10.6004log(No./N)。线性范围为10～5000个细胞，相关系数为0.9945。说明检测信号电流和端粒酶的个数之间在一定的范围内(10-5000)成线性相关，该方法可以被用于分析端粒酶活性。计算得到最低检测限为7个细胞，说明该方法检测限低、灵敏度高。
实施例2
参见图1，基于纳米孔道和电化学传感检测A549细胞、MCF-7细胞和MDA-MB-231中端粒酶活性的分析方法，检测步骤是：
步骤(1)细胞培养和端粒酶提取：A549细胞、MCF-7细胞，和MDA-MB-231细胞接种在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将100万个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 7.5,1mM MgCl2,1mM EGTA,0.5％(w/v)CHAPS,10％(v/v)glycerol,0.1mM PMSF)中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中；
步骤(2)在纳米孔道内壁连接5’端修饰了-CHO的端粒酶引物：用乙醇和超纯水将多孔阳极氧化铝模板洗去杂质，在室温下用氮气干燥；多孔阳极氧化铝模板浸入1mL含有5％APTES的乙醇溶液中，轻轻震荡12h后在纳米孔道内壁产生-NH2群；之后，再用乙醇清洗除去纳米孔道内的残余硅烷，并在室温下用氮气进行干燥；之后，10μL的60μM 5’端修饰了-CHO的端粒酶引物水溶液滴在模板表面上并反应24h；在此过程中，多孔阳极氧化铝模板被放置在一个固定在密封的玻璃瓶中的架子上，玻璃瓶底部有一些水，瓶子中的饱和蒸汽压使水溶液在24h后仍能保持10μL。将多孔阳极氧化铝模板浸入到1mL含有0.1％的苯甲醛的水溶液中，并轻轻震荡12h，用来封闭剩余的氨基。未连接上的端粒酶引物和剩余的苯甲醛用超纯水清洗；得到孔道内壁固定了端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板，将其在4℃保存于pH＝8的10mM的Tris-HCl缓冲溶液中；
步骤(3)端粒酶对端粒酶引物进行扩增：将步骤(2)得到的连接上端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板在室温下用氮气干燥后，置于密封的装置内，并保持内部环境湿润，在多孔阳极氧化铝模板上分别滴加10μL含有3000个A549细胞、MCF-7细胞、和MDA-MB-231细胞的端粒酶缓冲溶液，并将其置于30℃的水浴锅中反应5个小时，使端粒酶对端粒酶引物进行扩增延伸；
步骤(4)形成G-四链体：反应结束后，将多孔阳极氧化铝模板浸入1M KCl并轻轻震荡1小时，得到了孔道内部形成了G-四链体的多孔阳极氧化铝模板；
步骤(5)端粒酶活性检测步骤：自制一个电解池作为检测元件(参见图2)。将铂片作为工作电极固定在电解池底部，多孔阳极氧化铝模板置于铂片上。之后，将电解池的上半部分(参见图2中A)固定在多孔阳极氧化铝模板上，在他们中间加入O型硅树脂密封圈防止漏液。用一个铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，与电解池底部的铂片形成三电极体系。装置建好之后，在电解池中加入3mL铁氰化钾溶液并放置5min后，用电化学工作站进行检测，设置初始电位为0V，采样间隔为0.05s，试验时间为600s，测定其时间-电流曲线。检测结束后，得到了图5A中的各细胞的电流降低值，经计算，检测到该溶液含A549细胞、MCF-7细胞，和MDA-MB-231细胞各为2805、3135、和3242个，误差在8％以内，说明该方法可用于检测不同肿瘤细胞中的端粒酶，准确度高。
实施例3
参见图1，基于纳米孔道和电化学传感检测A549细胞中端粒酶活性的分析方法，检测步骤是：
步骤(1)细胞培养和端粒酶提取：A549细胞、MCF-7细胞，和MDA-MB-231细胞接种在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将100万个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 7.5,1mM MgCl2,1mM EGTA,0.5％(w/v)CHAPS,10％(v/v)glycerol,0.1mM PMSF)中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。并准备三种蛋白如下：牛血清蛋白(BSA)，葡萄糖氧化酶(GOD)，辣根过氧化物酶(HRP)
步骤(2)在纳米孔道内壁连接5’端修饰了-CHO的端粒酶引物：用乙醇和超纯水将多孔阳极氧化铝模板洗去杂质，在室温下用氮气干燥；多孔阳极氧化铝模板浸入1mL含有5％APTES的乙醇溶液中，轻轻震荡12h后在纳米孔道内壁产生-NH2群；之后，再用乙醇清洗除去纳米孔道内的残余硅烷，并在室温下用氮气进行干燥；之后，10μL的60μM 5’端修饰了-CHO的端粒酶引物水溶液滴在模板表面上并反应24h；在此过程中，多孔阳极氧化铝模板被放置在一个固定在密封的玻璃瓶中的架子上，玻璃瓶底部有一些水，瓶子中的饱和蒸汽压使水溶液在24h后仍能保持10μL。将多孔阳极氧化铝模板浸入到1mL含有0.1％的苯甲醛的水溶液中，并轻轻震荡12h，用来封闭剩余的氨基。未连接上的端粒酶引物和剩余的苯甲醛用超纯水清洗；得到孔道内壁固定了端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板，将其在4℃保存于pH＝8的10mM的Tris-HCl缓冲溶液中；
步骤(3)端粒酶对端粒酶引物进行扩增：将步骤(2)得到的连接上端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板在室温下用氮气干燥后，置于密封的装置内，并保持内部环境湿润，在多孔阳极氧化铝模板上分别滴加10μL 3000个HeLa细胞，100μg的牛血清蛋白、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶的缓冲溶液，并将其置于30℃的水浴锅中反应5个小时；
步骤(4)反应结束后，将多孔阳极氧化铝模板浸入1M KCl并轻轻震荡1小时；
步骤(5)端粒酶活性检测步骤：自制一个电解池作为检测元件(参见图2)。将铂片作为工作电极固定在电解池底部，多孔阳极氧化铝模板置于铂片上。之后，将电解池的上半部分(参见图2中A)固定在多孔阳极氧化铝模板上，在他们中间加入O型硅树脂密封圈防止漏液，即在本发明中，电解池的上半部分指的是O型硅树脂密封圈以上部分，如图2中虚线框A部分所示。用一个铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，与电解池底部的铂片形成三电极体系。装置建好之后，在电解池中加入3mL铁氰化钾溶液并放置5min后，用电化学工作站进行检测，设置初始电位为0V，采样间隔为0.05s，试验时间为600s，测定其时间-电流曲线。检测结束后，得到了图5B中的四种物质的电流降低值，其中100μg的牛血清蛋白、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶引起的电流降低值与空白溶液无显著性差异，说明该方法对不同癌细胞中的端粒酶活性都可以检测，而对尿液中的其它生物杂质如牛血清蛋白，葡萄糖氧化酶，辣根过氧化物酶没有响应，说明该方法对端粒酶检测有良好的选择性。
实施例4
参见图1，基于纳米孔道和电化学传感检测膀胱癌患者尿液中端粒酶活性的分析方法，检测步骤是：
步骤(1)尿液中端粒酶的提取。取膀胱癌患者新鲜尿液200mL，在4℃、1 000rpm的转速下离心10分钟，用1×PBS缓冲液(pH 7.2～7.4,136.89mM NaCl,2.67mM KCl,8.24mM Na2HPO4,1.76mM NaH2PO4)洗涤。该样品继续在4℃、1 800rpm的转速下离心5分钟。取沉淀物重新分散在2mL的细胞裂解缓冲液中冰浴30mins。然后，该混合物在4℃，12 000rpm转速下离心20mins。取上清液分装，并贮藏在-80℃的冰箱中备用。
步骤(2)在纳米孔道内壁连接5’端修饰了-CHO的端粒酶引物：用乙醇和超纯水将多孔阳极氧化铝模板洗去杂质，在室温下用氮气干燥；多孔阳极氧化铝模板浸入1mL含有5％APTES的乙醇溶液中，轻轻震荡12h后在纳米孔道内壁产生-NH2群；之后，再用乙醇清洗除去纳米孔道内的残余硅烷，并在室温下用氮气进行干燥；之后，10μL的60μM 5’端修饰了-CHO的端粒酶引物水溶液滴在模板表面上并反应24h；在此过程中，多孔阳极氧化铝模板被放置在一个固定在密封的玻璃瓶中的架子上，玻璃瓶底部有水，瓶子中的饱和蒸汽压使水溶液在24h后仍能保持10μL。将多孔阳极氧化铝模板浸入到1mL含有0.1％的苯甲醛的水溶液中，并轻轻震荡12h，用来封闭剩余的氨基。未连接上的端粒酶引物和剩余的苯甲醛用超纯水清洗；得到孔道内壁固定了端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板，将其在4℃保存于pH＝8的10mM的Tris-HCl缓冲溶液中；
步骤(3)端粒酶对端粒酶引物进行扩增：将步骤(2)得到的连接上端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板在室温下用氮气干燥后，置于密封的装置内，并保持内部环境湿润，在多孔阳极氧化铝模板上分别滴加10μL步骤(1)中处理过的尿液，并将其置于30℃的水浴锅中反应5个小时；
步骤(4)反应结束后，将多孔阳极氧化铝模板浸入1M KCl并轻轻震荡1小时；
步骤(5)端粒酶活性检测步骤：自制一个电解池作为检测元件(参见图2)。将铂片作为工作电极固定在电解池底部，多孔阳极氧化铝模板置于铂片上。之后，将电解池的上半部分固定在多孔阳极氧化铝模板上，在他们中间加入O型硅树脂密封圈防止漏液。用一个铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，与电解池底部的铂片形成三电极体系。在电解池中加入3mL铁氰化钾溶液并放置5min后，用电化学工作站进行检测，设置初始电位为0V，采样间隔为0.05s，试验时间为600s，测定其时间-电流曲线。测定结果与标准曲线比较，得到不同样品的检测结果(表1)。
表1显示了该方法对7个正常人尿液、炎症患者尿液及膀胱癌患者尿液的检测结果。从表中可以看出，正常人尿液和炎症患者尿液的检测结果均为阴性，而膀胱癌患者的检测结果均为阳性，并且该检测信号与其临床诊断的癌症发展阶段相一致。
表1
本发明的具体实施方式中采用的多孔阳极氧化铝模板和铁氰化钾指示分子均为本发明的优选方案，本发明中还可以在聚对苯二甲酸乙二醇酯膜的纳米孔道内壁连接5’端修饰了-CHO的端粒酶引物，本发明的指示分子还可以采用邻苯二酚，均可以解决本发明的技术问题，并达到本发明的技术效果。
本发明经反复试验验证，取得了满意的效果。本发明的实施方式不限于上述实施例，在不脱离本发明宗旨的前提下做出的各种变化均属于本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南工业大学
<120> 基于纳米孔道和电化学传感定量检测端粒酶活性的方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttttttttta atccgtcgag cagagtt 27

Claims (10)

1.基于纳米孔道和电化学传感检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)细胞的培养以及端粒酶的提取；
(2)在多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜的纳米孔道内壁连接5’端修饰了-CHO的端粒酶引物；
(3)用细胞中提取的端粒酶对连接到纳米孔道内壁的端粒酶引物进行扩增，得到重复的富G序列；
(4)在加入钾离子的条件下富G序列的空间构型发生变化，形成G-四链体；
(5)利用电化学方法对通过纳米孔道的铁氰化钾或邻苯二酚指示分子产生的电流进行检测。
2.根据权利要求1所述的基于纳米孔道和电化学传感检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述细胞为HeLa细胞、A549细胞、MCF-7细胞或MDA-MB-231细胞。
3.根据权利要求1所述的基于纳米孔道和电化学传感检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜的孔径为55nm～180nm。
4.根据权利要求1所述的基于纳米孔道和电化学传感检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述5’端修饰了-CHO的端粒酶引物序列为5’-CHO-TTT TTT TTT AAT CCG TCGAGC AGA GTT-3′。
5.根据权利要求1所述的基于纳米孔道和电化学传感检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体步骤如下：将多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜浸入0.8-1.5mL含有1％-10％APTES的乙醇溶液中并震荡10-15小时后，再用乙醇洗去纳米孔道内的残余硅烷，干燥后，将3～20μL浓度为30～100μM的5’端修饰了-CHO的端粒酶引物的水溶液滴在多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜表面，反应20-30小时后，将连接有端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜浸入到含有0.02％～0.2％苯甲醛的水溶液中并震荡8-14小时，在0-10℃下将多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜保存于缓冲溶液中。
6.根据权利要求1所述的基于纳米孔道和电化学传感检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(4)的具体步骤如下：将步骤(2)得到的孔道内壁连接上端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜，置于密封的装置内，并保持内部环境湿润；用端粒酶缓冲溶液将肿瘤细胞配置成不同的浓度的肿瘤细胞液，在孔道内壁连接上端粒酶引物的多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜上滴加不同浓度的肿瘤细胞液对其引物进行扩增延伸，在28-32℃下反应4-6小时后，浸入0.5-1.5M的KCl溶液并震荡0.5-1.5小时，得到孔道内部形成G-四链体的多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜。
7.根据权利要求1所述的基于纳米孔道和电化学传感检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤(5)的具体步骤如下：将铂片作为工作电极固定在电解池底部，将孔道内部形成G-四链体的多孔阳极氧化铝模板或聚对苯二甲酸乙二醇酯膜置于铂片上，之后加入O型硅树脂密封圈以防漏液，接着固定电解池的上半部分。用一个铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，形成三电极体系。在电解池中加入铁氰化钾或邻苯二酚指示分子并放置3-10分钟后用电化学工作站进行检测得到电流-时间曲线。
8.根据权利要求5所述的基于纳米孔道和电化学传感检测端粒酶活性的方法，，其特征在于，所述缓冲溶液为pH＝8.0的10mM Tris-HCl溶液；所述5’端修饰了-CHO的端粒酶引物在pH＝8.0的10mM Tris-HCl溶液中的终浓度为10～100μM。
9.根据权利要求6所述的基于纳米孔道和电化学传感检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述端粒酶缓冲溶液为含有MgCl2、KCl、Tween 20、EGTA或dNTPs的pH＝8.3的20mM Tris-HCl溶液，所述MgCl2初始浓度为1.5mM，KCl初始浓度为63mM，Tween20初始浓度为0.005％(v/v)，EGTA初始浓度为1mM，dNTPs初始浓度为1mM；所述肿瘤细胞在端粒酶缓冲液中的数量为10～10000个细胞。
10.根据权利要求1所述的基于纳米孔道和电化学传感检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述铁氰化钾指示分子为5mM的铁氰化钾溶液，其中含有5mM铁氰化钾，100mM氯化钾。
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