CN111812177A - 一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片及其制备方法及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物技术领域，提供了一种多孔阳极氧化铝‑Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片及其制备方法及应用方法，该复合传感膜片将Cas/dCas家族蛋白组装至多孔阳极氧化铝膜片，使该膜片能够结合具有特定核酸序列的双链DNA，并采用电化学设备对膜片两侧通过的钾离子进行测定，电信号改变能够反映对膜片表面对特定核酸序列的结合能力，可用于与核酸鉴定相关的诸多领域，具有广阔的市场前景。

Description

一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片及其 制备方法及应用方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片及其制备方法及应用方法。

背景技术

随着科技的迅速发展，纳米材料已经在各个领域中展现出其特有的价值。随着近两年微纳加工技术不断进步和成熟，纳米材料在科研和生活中扮演的角色越来越重要。纳米量级的材料具有很强的特殊性，能够在光学、生物学、电磁学以及多交叉学科中有很广泛的应用。

多孔阳极氧化铝(Porous Anodic Alumina，PAA)，由于具有高度的纵横比尺寸、有序可控、硬度大、耐高温等特点，因而可被用作纳米复合材料的填充模板或者其它纳米材料的生长基底，并且还可广泛应用于生物分子检测、生化传感器等领域中。

但是，现有的多孔阳极氧化铝由于其结构等方面的因素而不能与目的序列稳定地结合，因此其在生物分子检测，尤其是在特定核酸序列的检测应用的灵敏度差，检测结果不准确。

目前，针对特定核酸序列的分析和鉴定方法主要是用于生命科学、临床医学和刑事鉴定等多个方面，并在其中已经起到了不可替代的重要作用。当下针对特定核酸序列的分析和鉴定方法主要是核酸测序、PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)、等温扩增、CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)检测技术等几类，每种技术各有优缺点。需要指出的是，单独使用CRISPR检测技术通常达不到临床检验的灵敏度，因此需要结合扩增技术来提高灵敏度。CRISPR检测技术理论上可进一步提高单独使用扩增方法的灵敏度和特异性。CRISPR相关蛋白Cas/dCas蛋白家族(CRISPRassociated proteins family)可结合其他方法进行效率更高的检测。

发明内容

本发明实施例提供一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，旨在解决现有的CRISPR检测方法的灵敏度和特异性不高的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，多孔阳极氧化铝膜片的表面或孔道内壁连接有Cas/dCas家族蛋白。

本发明实施例还提供了一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法，包括：(1)对多孔阳极氧化铝膜片进行清洗预处理，得预处理后的多孔阳极氧化铝膜片；(2)对所述预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层依次进行羟基化表面修饰处理、氨基化表面修饰处理和戊二醛组装表面修饰处理，得到改性多孔阳极氧化铝膜片。

本发明实施例还提供了一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，所述多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片由上述的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法制备得到。

本发明实施例还提供了一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片在检测特定核酸序列中的应用方法，包括如下步骤：

(1)将表面组装有Cas家族蛋白或dCas家族蛋白的改性多孔阳极氧化铝膜片放入检测容器中，并加入电极缓冲液覆盖所述改性多孔阳极氧化铝膜片的两侧；

(2)向所述检测容器加入根据目的基因设计得到的单链引导核糖核酸RNA，使所述改性多孔阳极氧化铝膜片上的Cas蛋白或dCas家族蛋白与所述单链引导RNA进行结合；

(3)向所述检测容器加入待检测样品后进行膜片电位检测，并根据膜片电位检测结果判定所述待检测样品中是否含有目的基因。

本发明实施例提供的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，将Cas/dCas家族蛋白组装至多孔阳极氧化铝膜片，使该膜片能够结合具有特定核酸序列的双链DNA，并采用电化学设备对膜片两侧通过的钾离子进行测定，电信号改变能够反映对膜片表面对特定核酸序列的结合能力，可用于与核酸鉴定相关的诸多领域，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1是采用本发明实施例提供的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备工艺及核酸识别检测过程示意图；

图2是本发明实施例提供的改性多孔阳极氧化铝膜片的表面修饰作用过程示意图；

图3、4是经本发明实施例的氨基化表面修饰工艺处理后的改性多孔阳极氧化铝膜片的XPS检测结果；

图5是本发明实施例的dSpCas9原核表达SDS-PAGE凝胶电泳图；

图6是本发明实施例的SaCas9原核表达SDS-PAGE凝胶电泳图；

图7是本发明实施例的dSaCas9原核表达SDS-PAGE凝胶电泳图；

图8是本发明实施例的LbCas12a原核表达SDS-PAGE凝胶电泳图；

图9是本发明实施例的LwaCas13a原核表达SDS-PAGE凝胶电泳图；

图10是本发明实施例的dLwaCas13a原核表达SDS-PAGE凝胶电泳图；

图11是本发明实施例的dSpCas9、dLwaCas13a、dsaCas9这3个质粒纯化前后的产物SDS-PAGE凝胶电泳图；

图12是本发明实施例的SaCas9纯化产物SDS-PAGE凝胶电泳图；

图13是本发明实施例的LbCas12a纯化产物SDS-PAGE凝胶电泳图；

图14是本发明实施例的LwaCas13a纯化产物SDS-PAGE凝胶电泳图；

图15是采用BCA法测定BSA蛋白的标准曲线图；

图16是本发明实施例的dCas9蛋白与DNA结合反应的凝胶电泳图；

图17是本发明实验例1中的CK组的膜电位检测结果；

图18是本发明实验例1中的氨基化组的膜电位检测结果；

图19是本发明实验例1中的DNA组的膜电位检测结果；

图20是本发明实验例2中的CK组的膜电位检测结果；

图21是本发明实验例2中的氨基化组的膜电位检测结果；

图22是本发明实验例2中的Pr组的膜电位检测结果；

图23是本发明实验例2中的无gRNA组的膜电位检测结果；

图24是本发明实验例2中的DNA组的膜电位检测结果；

图25是本发明实验例3中根据非瘟VP72序列设计得到的多条sgRNA信息的详细信息；

图26是本发明实验例3中的CK组的膜电位检测结果；

图27是本发明实验例3中的氨基化组的膜电位检测结果；

图28是本发明实验例3中的DNA组的膜电位检测结果；

图29是本发明实验例4中的CK组的膜电位检测结果；

图30是本发明实验例4中的氨基化组的膜电位检测结果；

图31是本发明实验例4中的DNA组的膜电位检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

本发明实施例提供的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，将Cas/dCas家族蛋白组装至多孔阳极氧化铝膜片，使该膜片能够结合具有特定核酸序列的双链DNA，并采用电化学设备对膜片两侧通过的钾离子进行测定，电信号改变能够反映对膜片表面对特定核酸序列的结合能力，可用于与核酸鉴定相关的诸多领域，具有广阔的市场前景。

本发明实施例提供了一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，多孔阳极氧化铝膜片的表面或孔道内壁连接有Cas/dCas家族蛋白。

本发明实施例还提供了一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法，包括：

步骤101，对多孔阳极氧化铝膜片进行清洗预处理，得预处理后的多孔阳极氧化铝膜片。

在本发明实施例中，对多孔阳极氧化铝膜片进行清洗预处理包括纯水超声清洗和氮吹。具体的，先将多孔阳极氧化铝膜片浸没到纯水中进行超声2分钟左右，以去除膜片表面上的杂质；然后再将膜片取出，用氮气吹干膜片上的水分。通过采用氮气吹干膜片，不仅可以降低液面溶剂蒸汽压，使溶剂加快蒸发；而且氮气是惰性气体，不活泼，能够隔绝氧气，保护膜片，避免膜片与水中溶解的其他物质产生化学反应。

步骤102，对所述预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层依次进行羟基化表面修饰处理、氨基化表面修饰处理和戊二醛组装表面修饰处理，得到膜片表面或孔道内壁可与Cas/dCas核酸酶蛋白家族稳定连接的改性多孔阳极氧化铝膜片。

发明人通过对多孔阳极氧化铝膜片(PAA膜片)的生长机理的研究发现，PAA生长过程实质就是铝基底界面处的氧化铝生成和外层阻挡层在氧化铝和电解液接触面场致溶解的共同相互作用。在外层场致溶解过程中，外加电场会使电解液中的阴离子向阳极电极移动，即铝表面小孔底部运动。氧化铝在界面生成的过程如下，开始时，H₂O分子在正电极表面附近发生反应生成H₃O⁺和O^2-，在外加电场环境中，O^2-与铝基底直接反应，形成阻挡层。而H₃O⁺则与底部分的C₂O₄ ^2-化学结合，又一次生成HC₂O₄ ^-对氧化铝进行场致溶解，从而使得纳米孔生长过程一直持续下去。阳极氧化过程在PAA表面持续进行，内层生成氧化铝的速率与外层阻挡层场致溶解的速率达到一种平衡，使得阻挡层厚度趋于稳定，纳米小孔稳定的沿着轴向方向继续生长。

在本发明实施例中，对所述预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层依次进行羟基化表面修饰处理、氨基化表面修饰处理和戊二醛组装表面修饰处理，具体是：首先在PAA膜体表面进行羟基化表面修饰处理，之后进行氨基化表面修饰处理、戊二醛组装表面修饰处理，作用过程如图2所示：

X射线光电子能谱(XPS)又称为化学分析用电子能谱法(ESCA)，是近年来发展最快的仪器分析技术之一。应用XPS研究配合物能直接了解中心离子内层电子状态及与之相结合的配体的电子状态和配位情况，可获得有关电荷转移的信息，对于中心离子的电子结构、配位键形成及其性质等的研究，其结果很具有说服力。本次氨基化后的膜片采用XPS检测方法，如峰图3、4所示检测出较高氮元素信号，说明氨基化修饰效果较好。

本发明实施例提供的改性多孔阳极氧化铝膜片的制备方法，通过对预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层依次进行行羟基化表面修饰处理、氨基化表面修饰处理和戊二醛组装表面修饰处理，使得膜片表面或孔道内壁可与Cas/dCas核酸酶蛋白家族稳定连接，从而提高了膜片与目的序列的结合稳定性，从而提高了膜片在特定核酸序列的检测应用中的灵敏度和准确度。

在本发明实施例中，上述步骤102包括：

步骤201，使用电晕枪外焰对所述预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡层或孔道内表面进行来回接触，以使所述预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡层表面或孔道内表面羟基化，得表面羟基化的多孔阳极氧化铝膜片。

步骤202，对所述表面羟基化的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层进行氨基化表面修饰处理，得表面氨基化的多孔阳极氧化铝膜片。

步骤203，对所述表面氨基化的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层进行戊二醛组装表面修饰处理，得所述改性多孔阳极氧化铝膜片。

在本发明实施例中，上述步骤201，具体为：使用电晕枪外焰对所述预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层(或孔道内表面)进行来回接触，以使所述预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层(或孔道内表面)羟基化，得表面羟基化的多孔阳极氧化铝膜片。

在本发明实施例中，上述步骤202，具体为：将所述表面羟基化的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层浸入浓度为1.5％～2％的APTES溶液中，静置过夜，再取出用乙醇进行多次冲洗，吹干，于120℃下加热处理至少1小时，得表面氨基化的多孔阳极氧化铝膜片。通过加热处理，可使分子发生脱水交联。

为了反应更加充分，优选的，APTES溶液的浓度为2％。

在本发明实施例中，上述步骤203，具体为：将所述表面氨基化的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层浸入浓度为2.5％～10％的戊二醛溶液中，于4℃下反应至少4小时，再取出用水冲洗，吹干，完成戊二醛组装表面修饰处理，得所述改性多孔阳极氧化铝膜片。为了反应充分，优选戊二醛溶液的浓度为10％，于4℃下反应至少4小时，以使PAA膜片的表面连接上醛基。戊二醛溶液使用PBS缓冲液进行配置。

在本发明实施例中，所述多孔阳极氧化铝膜片由如下方法制备得到：

步骤301，将经预处理后的铝箔置于500℃下真空煅烧至少5小时，取出并放入混合酸溶液中进行电化学抛光处理，得抛光处理后的铝箔。

在本发明实施例中，混合酸溶液采用酸性较强能够溶解氧化铝的多元酸，诸如草酸、硫酸或者磷酸中的任意两种或多种。

在本发明实施例中，优选采用纯度为99.999％的铝箔在500℃下真空煅烧5h，取出后放入浓的硫酸和磷酸的混合水溶液中进行电化学抛光处理。

在本发明的优选实施例中，在对铝箔进行电化学抛光处理之前，先对铝箔进行高温退火、机械抛光处理、超声或化学处理去除附着在铝箔表面上的脂类杂质以及自然氧化层。

步骤302，将所述抛光处理后的铝箔在室温下进行两步阳极氧化处理，得到所述多孔阳极氧化铝膜片，其中，两步阳极氧化处理的条件为：氧化电压为30～50V，电解液采用浓度为0.3moL/L的草酸水溶液。

在本发明实施例中，将经上述电化学抛光后的铝箔于在室温下，进行两步阳极氧化处理。

在本发明实施例中，多孔阳极氧化铝膜片采用两步阳极氧化处理法制备得到。第一步阳极氧化处理的条件为：氧化电压为30～50V，电解液采用浓度为0.3moL/L的草酸水溶液。铝箔经过第一步阳极氧化处理后，会在其表面形成阳极氧化层。为了获得更加有序的孔洞结构，本发明采用磷酸和铬酸的混合溶液将经第一步阳极氧化处理后在铝箔表面上形成的阳极氧化层溶去，然后再将溶去阳极氧化层后的铝箔进行第二步阳极氧化处理，最终铝基体表面发生氧化后会形成更加有序的孔洞结构的六方元胞结构的多孔PAA膜。第二步阳极氧化处理的条件与第一阳极氧化处理的条件相同。

在实际应用中，可以根据所采用的电解液的不同，选择使用恒流或恒压方式进行阳极氧化处理。在进行阳极氧化处理过程中，将铝箔一侧进行封闭，另一侧作为阳极进行氧化，氧化池内通入空气进行强烈搅拌，氧化过程中的空气搅拌可以防止氧化膜周围局部温度过热和局部浓度过高，避免由于溶解不均而产生的凹的缝隙等缺陷。

为了获得更加有序的孔洞结构的六方元胞结构的多孔PAA膜，可对经过上述两步阳极氧化处理后在PAA膜的孔的底部形成一薄层的阻挡层的PAA膜片采用化学腐蚀去除剩余铝基、通孔及扩孔。具体的是将经两步阳极氧化处理后的PAA膜片置于5％的H₃PO₄，溶液中30℃中处理，则可在扩孔的同时除去阻碍层而得到两端贯通的膜，通过改变处理的时间还可调节孔径大小。

在本发明的优选实施例中，上述多孔阳极氧化铝膜片的膜厚度为0.05～0.3mm，膜直径为1～10mm。厚度不高于0.3mm通常在0.1mm左右利于膜片通过离子达到对电位变化的精准测量；直径低于10mm利于控制待测样品以及Cas蛋白和RNA的上样量，液面全覆盖使膜片不干，达到微量精准检测的目的。

本发明实施例还提供了一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，所述多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片由上述多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法制备得到。

本发明实施例提供的上述多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片可应用于检测特定核酸序列。在实际应用中，可将本发明实施例制得的改性多孔阳极氧化铝膜片应用于制备多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，该复合传感膜片可用于检测特定核酸序列。

近年来，全基因组测序已允许对指示各种病理的生物标志物进行广泛的分析和鉴定。这种扩展的知识使得开发各种靶标特异性核酸检测工具成为可能。此类工具可以为医生提供可用于诊疗的信息，以改善患者的治疗效果并引入精准医学治疗方法。在过去的30年中，基于核酸的分子诊断测试(例如PCR)的最成熟方法已得到优化，以扩增和检测目标基因组序列。尽管核酸检测技术取得了显着进步，但是这些核酸检测工具中的大多数仍耗时且使用昂贵，因为它们需要多步反应，许多试剂，训练有素的人员和复杂的仪器。另外，对这些核酸扩增技术的定量分析通常需要复杂的探针/引物设计和优化方法以用于有效靶向。此外，他们仍然经常依靠大型昂贵的光学组件进行检测。因此，需要新的方法来克服与常规核酸检测策略相关的局限性，以提供低成本和完全集成的紧凑型基于核酸的诊断工具来扩展其临床实用性。

基于簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸酶(Cas)方法已被用于改进光学检测的常规核酸靶序列检测。CRISPR-Cas蛋白在单链RNA的引导下，是可用于序列特异性靶向检测的强大工具。在2017年，有相关研究报告了该技术背景的SHERLOCK方法，通过重组酶聚合酶扩增(RPA)进行扩增，扩增后的靶序列在sgRNA的引导下特异性识别激活Casl3a，预先添加的RNA靶向效应序列被激活后的Cas13a切断，出现荧光信号再利用光学系统或试纸条系统进行判读。不久之后，另外有研究者报道了DETECTR方法，其利用靶向DNA的Cas12a消除了SHERLOCK对DNA序列检测所需的DNA至RNA转化的步骤。考虑到信号放大传感的问题，必须有足够量的可被Cas13a或者Cas12a识别的序列，因此，以上两种系统都必须经过核酸的扩增过程，扩增产物容易引起检测实验室的气溶胶污染，对实验室环境和设备要求较高，开展检测的通量和便捷性都不够。

目前，针对特定核酸序列的分析和鉴定方法主要是用于生命科学、临床医学和刑事鉴定等多个方面，并在其中已经起到了不可替代的重要作用。当下针对特定核酸序列的分析和鉴定方法无非是以下两大类，下面对这些方法做个简要介绍和对比。

1、核酸测序

测序技术可直接解读出核酸碱基的排列顺序，DNA是ATGC、RNA则为AUGC的顺序，新冠病毒接近3万个碱基，比人类少多了，人基因组差不多是30亿。对于一个完全未知的新病毒来说，测序技术是必须的。但通常来说，对病毒的全部序列测序需要相对昂贵的仪器、较长的时间，且需要专业生物信息学人对其解读。

测序技术虽然早在1977年就已发明，但在“人类基因组计划”的末期(20世纪末)，该技术瓶颈得到重要突破，并开始迅猛发展。据了解，2003年SARS的鉴定耗时5个多月、2013年H7N9为1个多月，而对新冠病毒的全基因组测序仅仅5天。

2、PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)

PCR技术发明于1983年，这一体外扩增核酸序列的技术在当今几乎任何一个分子生物学实验都会用到。PCR拓展了各种应用，包括目的核酸的扩增、DNA片段的连接、突变等，以及这里重点介绍的检测。PCR技术应用之前，首先得要知道病原体的基因序列，找到它的特征序列，设计引物。然后，用变温的方式将双链打开、引物结合、延伸，经30个左右的温度循环，可使目的片段得到指数级的扩增。那么，反推可知，能检测到大量DNA目的片段的即是阳性样品。(当然，RNA样品需要逆转录酶转换成DNA)。DNA扩增产物验证可通过琼脂糖凝胶电泳验证，但这种操作一是麻烦、二是开盖容易造成产物的气溶胶污染。目前，也可以荧光物质、或荧光探针杂交法检测扩增产物。

第二代PCR技术是目前新冠病毒检测方法的主流方法。它在反应体系中加入了荧光物质，通过专门的仪器，可实现实时荧光检测，方便了结果读取过程，也防止开盖后造成可能的污染，该技术也可对模板进行定量计算。另外，为了增加灵敏度和特异性，该技术还有不少改进版本，比如Taqman探针法、双重或多重荧光PCR等。这一方法，是目前官方的测定方法。

第三代PCR是数字PCR技术，它将一小管(50微升左右)分割成了近10万个液滴，单一液滴为独立的反应单元，反应完成后读取每一单元的扩增情况(荧光)，从而最终可实现模板DNA的绝对定量。现在这样技术试剂和机器相当昂贵(一台仪器近百万元)，对新型冠状病毒快速检测的优势不大。

3、等温扩增

PCR技术需要快速精准的升降温过程仪器，这类仪器相对昂贵，而等温扩增技术仅使用一个温度，对仪器的要求很低。等温扩增的方法有多种，但总的来说，这些技术主要分为2大类，一类是利用特殊的酶取代了PCR中高温解链的步骤，比如LAMP技术中的链置换DNA聚合酶和RPA中的重组酶、单链结合蛋白和链置换酶；另一类涉及到DNA和RNA之间的相互转换来扩增，比如NASBA和TMA用到的逆转录酶和RNA聚合酶。

等温技术灵敏度和反应时间上，并不输给PCR。但等温扩增也有问题，首先是对引物的设计要求比较高，比如日本荣研公司开发了专门设计LAMP引物的软件以应对复杂的设计，即使是这样，扩增的序列也不是任何区域都能设计得出来，而且实际效果要反复测试。另外，像RPA这种方法，较低温下的扩增反应，引物的非特异性结合的可能性会增加，容易造成假阳性。

此前，日本荣研公司将其技术应用于结核分枝杆菌(TB)的检测，得到了WHO的认可和推荐，最近该公司也在全力研发对新冠病毒检测的试剂盒。在国内，杭州优思达在等温扩增的技术上也是领先的，其技术为交叉引物恒温扩增技术。其原理关键同样是链置换酶，只是引物设计策略与LAMP不同。从取样到出结果的一体化快速检测耗材与仪器是它的优势。最近，也被国家列为新冠病毒快速检测的紧急审批9个产品之一。

4、CRISPR检测技术

基于CRISPR-Cas13的检测RNA的技术，称为SHERLOCK，该方法原理是Cas13蛋白在人工设计的gRNA引导下，结合特异性RNA序列后，产生反式切割RNA探针的活性。目前基于CRISPR-Cas12的技术专用于检测特异性DNA。当然，DNA和RNA之间很容易实现相互转换，因此这两个技术对于DNA和RNA都可检测。

但是，单独使用CRISPR检测技术通常达不到临床检验的灵敏度，因此需要结合扩增技术来提高灵敏度。CRISPR检测技术理论上可进一步提高单独使用扩增方法的灵敏度和特异性。

结合图1，本发明实施例基于CRISPR(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)技术，通过先将具有基因识别功能的Cas蛋白组装到本发明制得的改性多孔阳极氧化铝膜片上，膜片两端分别加入适量的电极缓冲液；再利用Cas蛋白结合根据目的基因设计的单链引导RNA(Single guide RNA，sgRNA)，通过sgRNA上的靶点序列，在目标基因组上进行识别捕获，进而引起PAA膜片局部电势的变化，通过监测电流-电压(IV)曲线的变化，从而可以敏感地测量分析物，进而确定PAA膜片上的Cas蛋白是否结合目的基因，由此可判断待测样品中是否含有目的基因。

具体的，本发明实施例提供了上述多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片在检测特定核酸序列中的应用方法，包括如下步骤：

步骤401，将表面组装有Cas家族蛋白或dCas家族蛋白的改性多孔阳极氧化铝膜片放入检测容器中，并加入电极缓冲液覆盖所述改性多孔阳极氧化铝膜片的两侧。

在本发明实施例中，Cas/dCas家族蛋白可为dCas9、SpCas9、SaCas9、dSaCas9、LbCas12a、LwaCas13a或者dLwaCas13a中的任意一种。

在本发明实施例中，在改性多孔阳极氧化铝膜片的表面组装Cas/dCas家族蛋白的操作如下：在改性多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层上滴加经重组表达以及纯化处理后Cas/dCas家族蛋白溶液，于4℃下反应过夜，使得蛋白溶液中的氨基与PAA膜片表面上的醛基连接，以为下一步结合sgRNA(根据目的基因设计得到的单链引导RNA)和特定序列(目的基因)提供基础。在反应期间需要保持PAA膜片表面的蛋白溶液不能干掉，因为若PAA膜片表面的蛋白液体干掉后会影响蛋白活性和结合稳定性。蛋白溶液可以覆盖PAA膜表面，反应完成之后用PBS缓冲液轻柔清洗表面，清洗后的PAA膜片置于缓冲液中低温保存备用。

步骤402，向所述检测容器加入根据目的基因设计得到的单链引导核糖核酸RNA，使所述改性多孔阳极氧化铝膜片上的Cas蛋白或dCas家族蛋白与所述单链引导RNA进行结合。Cas/dCas家族蛋白与sgRNA结合后具有对特定核酸序列(目的基因)识别并结合的能力。

步骤403，向所述检测容器加入待检测样品后进行膜片电位检测，并根据膜片电位检测结果判定所述待检测样品中是否含有目的基因。

加入待测样品后，含有特定核酸序列双链DNA片段与Cas蛋白在PAA膜片表面形成复合物，利用电化学工作站检测引起PAA膜两侧电流-电压(I-V)曲线的变化，判定待测样品中是否含有特定核酸序列(目的基因)。

在本发明实施例中，上述待测样品为病原微生物基因组DNA或RNA样本或外显子发生突变后肿瘤病人的基因组DNA样本。

其中，病原微生物基因组DNA或RNA样本包括DNA病毒、RNA病毒、蛋白质病毒(如，朊病毒)、亚病毒(Subvirus，包括类病毒、拟病毒、朊病毒等)、噬菌体(如，细菌病毒)、植物病毒(如，烟草花叶病毒等)、动物病毒(如，禽流感病毒、天花病毒、HIV等)、狂犬病毒、新型冠状病毒和非洲猪瘟病毒等。还包括结核杆菌、大肠杆菌、肉毒杆菌、沙门氏菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌以及链球菌等致病菌。

外显子发生突变后肿瘤病人的基因组DNA样本包括肺癌，胃癌，肝癌，结肠癌，乳腺癌，淋巴癌，肌母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、白血病及其他肿瘤组织或血液性疾病等肿瘤样本。

以Cas蛋白家族中的Cas9蛋白为例，首先，制备重组inactive spCas9(dCas9)蛋白。dCas9蛋白是Cas9蛋白的突变体，即Cas9内切酶的RuvC1和HNH两个核酸酶活性区发生突变。因此，dCas9蛋白的内切酶活性全部消失，只保留由gRNA引导进入基因组的能力。本发明实施例所使用的dCas9-NLS蛋白是大肠杆菌重组表达的来自Streptococcus pyogenes的DNA切割活性缺失突变体Cas9蛋白(D10A，H840A)。dCas9蛋白C端添加了NLS信号肽。Cas9-NLS可以与设计好的gRNA稳定结合，并结合到DNA靶点位置。

设计并制备sgRNA。SpCas9在基因组上PAM序列识别位点：NGG；

与SpCas9锚定结合的sgRNA scaffold序列为：

以非洲猪瘟病毒(ASFV)为例：

靶序列选择：选取ASFV基因组复制的关键蛋白DNA聚合酶和外壳蛋白组装多聚蛋白P220两个基因的保守区作为检测靶标，确保检测准确性和针对各个ASFV基因型的广谱性。

设计方法：首先通过对比30种不同基因型ASFV的DNA聚合酶和pp220基因的序列，确定DNA聚合酶和多聚蛋白pp220的保守区，将保守区序列片段拼接起来，再利用CCTOP在线设计gRNA软件筛选针对DNA聚合酶和多聚蛋白pp220基因再保守区可以靶向的位点，先去除掉横跨两个拼接片段的靶向位点，因保守区片段太短，不能作为靶向位点；再根据网站预测的在待检测物种的基因组序列上可能产生脱靶的位点，去除脱靶位点位于外显子，尽量使其脱靶位点位于基因间隔区或内含子区域，降低脱靶。筛选后选取评分较高的3个位点，供后续研究确定最优位点。

合成sgRNA需要先合成CrRNA的DNA序列前加T7启动子序列，和其互补序列，退火形成DNA双链作为体外转录的模板，加入T7RNA聚合酶(T7转录试剂盒(NEB))37℃孵育4-8h，DNase I消化DNA模板，切10％Urea-PAGE胶回收得到crRNA。

在本发明实施例中，Cas系列蛋白的重组表达以及纯化处理如下：

1、蛋白信息如下表1所示。

表1

2、试剂和耗材

Kan(上海生工)，IPTG(上海生工)；Ni-NTA Resin(TransGen)，咪唑(BBI)；SDS-PAGE快速凝胶配制试剂盒(碧云天)；SDS-PAGE上样缓冲液(YESEN)；PROTEINMARKER(YESEN)；Bradford试剂盒(碧云天)；LB培养基，磷酸二氢钠、氯化钠、试剂瓶、三角瓶等常规试剂和耗材若干。

3、实验仪器

超净工作台(HDL)、恒温震荡培养箱(上海知楚)、核酸蛋白检测仪(Eppendorf)、大型台式高速冷冻离心机(Eppendorf)、小型台式高速冷冻离心机(Eppendorf)、超声破碎仪(Sonics)、MultiTemp III恒温水浴锅(精宏)、垂直电泳仪(Bio-Rad)、酶标仪(Bio-Rad)。

4、实验操作步骤

4.1质粒转化及重组细菌扩大培养：

(1)取1μL质粒转化，次日挑单克隆至20mL含Amp的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，作为种子；

(2)取5mL种子，转至500mL含kan的LB培养基中，37℃，250rpm震荡培养，直到OD≈0.6；

(3)加入终浓度0.1mM的IPTG，15℃，200rpm震荡培养过夜；

(4)3400rpm，4℃，20min，1L离心瓶离心收集菌体；

(5)菌液重悬，转至50mL离心管中，5000rpm，4℃，10min，离心收集菌体，用于超声破碎。

4.2菌体的破碎：

(1)破碎条件：300W功率，破碎4s，间隔6s，冰上，2小时；

(2)破菌缓冲液：300mM NaCl，50mM NaH₂PO₄，20mM咪唑pH8.0。

4.3纯化：

(1)将Ni-NTA Resin加入层析柱，静置，直到颗粒全部下沉；

(2)用10倍柱体积平衡缓冲液(300mM NaCl，50mM NaH₂PO₄，20mM咪唑pH8.0)平衡层析柱；

(3)将细胞破碎液12000rpm离心20min，取上清，加入层析柱；

(4)用10倍柱体积平衡液洗涤层析柱，直到洗出液达到OD280基线值；

(5)根据预实验结果，采用1倍柱体积不同浓度的咪唑，从50mM开始至洗脱峰+100mM的咪唑浓度进行梯度洗脱；

(6)从洗脱峰前0.5倍柱体积开始收集洗脱液，利用Bradford检测洗脱液中的蛋白浓度；

(7)取洗脱峰洗脱液，采用0.1MPB(PH＝7.8)缓冲液透析过夜；

(8)采用BCA法测定纯化后蛋白浓度；

(9)取透析后蛋白1μg进行SDS-PAGE电泳，根据条带灰度扫描值计算目标蛋白的纯度。

5、实验结果

5.1dSpCas9系列蛋白重组表达汇总结果

dSpCas9原核表达SDS-PAGE凝胶电泳结果见图5。目标蛋白在BL21(DE3)菌株37℃诱导沉淀中明显表达，Arctic Expression(DE3)菌株16℃诱导沉淀中少量表达。

SaCas9原核表达SDS-PAGE凝胶电泳结果见图6。目标蛋白在BL21(DE3)菌株37℃诱导沉淀中明显表达，Arctic Expression(DE3)菌株16℃诱导沉淀中少量表达。

dSaCas9原核表达SDS-PAGE凝胶电泳结果见图7。目标蛋白在BL21(DE3)菌株37℃和Arctic Expression(DE3)菌株16℃诱导沉淀中明显表达，上清中可能少量表达。

LbCas12a原核表达SDS-PAGE凝胶电泳结果见图8。目标蛋白在BL21(DE3)菌株37℃诱导和Arctic Expression(DE3)菌株16℃诱导沉淀中明显表达，在上清中可能少量表达。

LwaCas13a原核表达SDS-PAGE凝胶电泳结果见图9。目标蛋白在BL21(DE3)菌株37℃诱导沉淀，Arctic Expression(DE3)菌株16℃诱导上清和沉淀中明显表达。

dLwaCas13a原核表达SDS-PAGE凝胶电泳结果见图10。目标蛋白在BL21(DE3)菌株37℃和Arctic Expression(DE3)菌株16℃诱导沉淀中明显表达。

SpCas9系列蛋白重组表达汇总结果见下表2。SpCas9系列蛋白表达情况。“√”表示表达，“○”表示可能表达。

表2

图7～图10中的泳道说明：lane 1＝16℃诱导破碎上清(Arctic Expression(DE3))，Lane 2＝16℃诱导破碎沉淀(Arctic Expression(DE3))，lane 3＝37℃诱导破碎上清(BL21(DE3))，lane 4＝37℃诱导破碎沉淀(BL21(DE3))，lane5＝阴性对照上清，lane6＝阴性对照沉淀。

5.2纯化蛋白SDS-PAGE分析结果

图11为dSpCas9等3个质粒纯化产物SDS-PAGE凝胶电泳结果。1＝dsaCas9纯化后②，2＝dsaCas9纯化后①，3＝dsaCas9纯化前；4＝SpCas9纯化后，5＝SpCas9纯化前；6＝dLwaCas13a纯化后，7＝dLwaCas13a纯化前。纯化前样品上样量2.5μL，纯化透析后上样量1μg。

图12为SaCas9纯化产物SDS-PAGE凝胶电泳结果。1＝纯化后，2＝纯化前。纯化前样品上样量2.5μL，纯化透析后上样量1μg。

图13为LbCas12a纯化产物SDS-PAGE凝胶电泳结果。1＝纯化前，2＝纯化后①，3＝纯化后②。纯化前样品上样量2.5μL，纯化透析后上样量2μL。

图14为LwaCas13a纯化产物SDS-PAGE凝胶电泳结果。1＝纯化前，2＝纯化后。纯化前样品上样量2.5μL，纯化透析后上样量1μL。

5.3纯化蛋白的纯度检测结果

采用ImageJ图像软件，扫描SDS-PAGE电泳条带，结果见上述各蛋白所对应的纯化产物凝胶电泳图。根据灰度值计算dSpCas9纯化蛋白的纯度为98.9％；dSaCas9纯化蛋白①的纯度为77.4％；SaCas9纯化蛋白的纯度为91.5％。LbCas12a纯化蛋白①的纯度为96.1％；LbCas12a纯化蛋白②的纯度为96.3％；LwaCas13a纯化蛋白的纯度为90.4％。

5.4纯化蛋白的浓度检测结果

BCA测定dSpCas9纯化蛋白的浓度为0.95mg/mL；dSaCas9纯化蛋白①浓度为0.63mg/mL；dSaCas9纯化蛋白②的浓度为0.78mg/mL；dLwaCas13a纯化蛋白的浓度为0.56mg/mL；SaCas9纯化蛋白的浓度为0.37mg/mL；LbCas12a纯化蛋白①浓度为0.49mg/mL；LbCas12a纯化蛋白②的浓度为0.43mg/mL；LwaCas13a纯化蛋白的浓度为0.8mg/mL。图15为BCA法测定BSA蛋白标准曲线。

经过上述对Cas系列蛋白的重组表达以及纯化处理后，获得了纯度和浓度均较高的Cas系列蛋白，可进一步提高对特定核酸序列的检测的灵敏度和准确度。

下面通过具体的实验例对本发明的技术效果进行进一步阐述。

实验例1、针对来自克隆质粒PUC57的一段DNA序列的检测试验

该段序列如SEQ ID NO：1所示。

用于扩增该段序列的PCR引物：正向引物：5‘-tgaccaaaatcccttaacgt-3’；反向引物：5‘-ttatgcttccggctcgtatg-3’。

1、sgRNA的设计方法和信息：根据CCTop-CRISPR/Cas9 target online predictor在线设计得到sgRNA靶点：ctgctaatcctgttaccagtgg即sgRNA全长序列：

2、dCas蛋白识别结合活性检测

DNA结合反应：将经上述重组表达和纯化处理后的dCas9蛋白、sgRNA、模板DNA按照表3的体系混合。

表3

	1	2	3
				dCas9蛋白	0μg	0.5μg	1μg
sgRNA	0.5μg	0.5μg	0.5μg
				底物DNA	1μg	1μg	1μg
10×PBS Buffer	2μL	2μL	2μL
				RNase free H<sub>2</sub>O	加至20μL	加至20μL	加至20μL

37℃孵育30min。各组取5uL进行电泳检测，检测结果如图16所示。从图16可以看出，3DNA条带滞后，显示dCas9蛋白与DNA结合。

3、模板DNA检测结果

首先配置浓度在1mM-100mM之间、pH值(pH＝7.6)的电极缓冲液(氯化钾电极缓冲液)，加入模具中覆盖PAA膜片两侧。之后模具夹紧PAA膜片，组装电极调节检测仪器参数进行分组检测，保存数据进行对比分析。设置随机选取PAA膜片上的50个点进行电位检测：包括CK组、氨基化组和DNA组。CK组(即空白组)，采用现在的未经表面修饰处理的PAA膜片直接检测；氨基化组，采用经本发明氨基化表面修饰处理后，戊二醛组装表面修饰处理之前的PAA膜片进行检测；DNA组，采用本发明的改性多孔阳极氧化铝膜片，加入dCas9蛋白、sgRNA、来自克隆质粒PUC57的一段DNA序列样品进行检测。DNA组膜片滴加sgRNA后于37℃反应20min，氮气吹干。滴加待测目的基因，液面尽量覆盖膜表面37℃孵育(设置时间梯度30min/60min/90min)。

检测结果如下图17～19所示：理论上膜电位变化应为空白膜片即CK组在pH值稳定条件下检测值在4uA-8uA之间，氨基化后膜片即氨基化组一般检测值在0-4uA之间，而最终检测的连上目的基因的膜片即DNA组一定会大于10uA。从图17～19可看出，测试组的数值大小区间可变，但几组整体趋势不变，由此可知，该模板DNA检测值符合要求，采用本发明制得的改性多孔阳极氧化铝膜片可用于特定核酸序列的检测，且该检测方法真实有效。

实验例2、针对新型冠状病毒S基因检测试验

新型冠状病毒，世界卫生组织(WHO)最近将其命名为SARS-CoV-2，旧称2019-nCoV，其导致的疾病称为COVID-19，属于β属冠状病毒，有包膜。新型冠状病毒的RNA核心外，由蛋白质外壳包裹，表面突出的是刺突蛋白(S Protein)，它是侵染宿主细胞关键。本实验检测选取S Protein表达的S基因。

1、S Protein表达的S基因的基因序列如SEQ ID NO：2所示。(＞NC_045512.2：21563-25384严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离物武汉-胡-1，全基因组)

PCR引物：正向引物：ttgccactagtctctagtca；反向引物：accttcacgaggaaagtgtg。

阳性对照序列(可使用合成的DNA寡聚体的T7转录产生＞S基因片段)：

2、S基因对应的sgRNA序列为：

3、新型冠状病毒S基因检测结果

首先配置浓度在1mM-100mM之间、pH值(pH＝7.6)的电极缓冲液(氯化钾电极缓冲液)，加入模具中覆盖膜片两侧。之后模具夹紧膜片，组装电极调节检测仪器参数进行分组检测，保存数据进行对比分析设置随机选取50个点进行电位检测：包括CK组、氨基化组、蛋白组、无sgRNA只加DNA组和完整添加的DNA组。CK组(即空白组)，采用现在的未经表面修饰处理的PAA膜片直接检测；氨基化组，采用经本发明氨基化表面修饰处理后，戊二醛组装表面修饰处理之前的PAA膜片进行检测；蛋白组，采用本发明的改性PAA膜上组装有Cas系列蛋白的PAA膜片；无sgRNA只加DNA组，采用本发明的改性多孔阳极氧化铝膜片，加入dCas9蛋白、新型冠状病毒S基因样品进行检测；完整添加的DNA组，采用本发明的改性多孔阳极氧化铝膜片，加入dCas9蛋白、sgRNA、新型冠状病毒S基因样品进行检测。

检测结果如图20～24所示。理论上膜电位变化应为空白膜片即CK组在PH值稳定条件下检测值在4uA-8uA之间，氨基化后膜片一般检测值在0-4uA之间，而最终检测的连上目的基因的膜片即DNA组一定会大于10uA。

从图20～24可看出，测试组的数值大小区间可变，但几组整体趋势不变，由此可知，该新型冠状病毒S基因的检测值符合要求，采用本发明制得的改性多孔阳极氧化铝膜片可用于特定核酸序列的检测，且该检测方法真实有效。

实验例3、针对非洲猪瘟病毒VP72序列检测试验

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种烈性、高度接触性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)属非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，是一种有囊膜的双链DNA病毒，也是唯一的虫媒DNA病毒。

传统的分子检测技术以基因扩增为主，包括核酸杂交技术、常规PCR、巢式PCR、多重PCR等技术。PCR技术敏感、特异、高效、快速，但假阳性高。核酸杂交技术具有灵敏度高，特异性强，实用性好的特点，是多种动物疫病诊断的常规方法，但操作复杂、成本高，普通实验室没有相应设备，易出现假阳性。基因芯片和高通量测序技术快速简便、特异性强、灵敏度高和高通量化，但成本高和对操作人员水平要求高。这就使得开发ASF的简便、快速、精准的现场诊断方法变得尤为重要。因此，亟需提供一种简单快速，且灵敏度、特异性高的特异性片段检测方法。

本实验例系采用本发明实施例制得的改性多孔阳极氧化铝膜片对非洲猪瘟病毒VP72序列进行检测，具体的检测方法如下：

1、非瘟VP72序列如SEQ ID NO：3所示。

图25为是根据非瘟VP72序列设计得到的多条sgRNA信息的详细信息。

根据评分及设计原则从图25给出的多条中sgRNA信息中选取下述sgRNA序列用于本次实验：

先合成CrRNA的DNA序列前加T7启动子序列，和其互补序列，退火形成DNA双链作为体外转录的模板，加入T7RNA聚合酶(T7转录试剂盒(NEB))37℃孵育4-8h，DNase I消化DNA模板，切10％Urea-PAGE胶回收得到crRNA。

2、非洲猪瘟病毒VP72序列检测结果

首先配置浓度在1mM-100mM之间、pH值(pH＝7.6)的电极缓冲液(氯化钾电极缓冲液)，加入模具中覆盖PAA膜片两侧。之后模具夹紧PAA膜片，组装电极调节检测仪器参数进行分组检测，保存数据进行对比分析。设置随机选取50个点进行电位检测：包括CK组、氨基化组和DNA组。CK组(即空白组)，采用现在的未经表面修饰处理的PAA膜片直接检测；氨基化组，采用经本发明氨基化表面修饰处理后，戊二醛组装表面修饰处理之前的PAA膜片进行检测；DNA组，采用本发明的改性多孔阳极氧化铝膜片，加入dCas9蛋白、sgRNA、非洲猪瘟病毒VP72序列样品进行检测。

检测结果如下图26～28所示：理论上膜电位变化应为空白膜片即CK组在PH值稳定条件下检测值在4uA-8uA之间，氨基化后膜片一般检测值在0-4uA之间，而最终检测的连上目的基因的膜片即DNA组一定会大于10uA。从图26～28可以看出，测试组的数值大小区间可变，但几组整体趋势不变，由此可知，该非洲猪瘟病毒VP72序列的检测值符合要求，采用本发明制得的改性多孔阳极氧化铝膜片可用于特定核酸序列的检测，且该检测方法真实有效。

实验例4、非小细胞肺癌(NSCLC)EGFR19外显子缺失突变检测

1、EGFR19外显子

19号外显子主要是第746-752位密码子(GGAGACGCGGGCCTGCTC)的缺失突变，导致19号外显子编码的EGFR蛋白的氨基酸序列中4个高保守的氨基酸(LREA)丢失，这一缺失改变了受体格氨酸激酶ATP结ATP binding cleft)的角度，从而显著增强癌细胞对TKIs(靶向药)的敏感性。

2、设计sgRNA

根据CCTop-CRISPR/Cas9 target online predictor在线设计得到sgRNA靶点：cgggagacgcgggcctgctccgg即sgRNA全长序列：

3、EGFR19外显子检测结果

首先配置浓度在1mM-100mM之间、pH值的电极缓冲液，加入模具中覆盖PAA膜片两侧。之后模具夹紧PAA膜片，组装电极调节检测仪器参数进行分组检测，保存数据进行对比分析，设置随机选取50个点进行电位检测：包括CK组、氨基化组和DNA组。CK组(即空白组)，采用现在的未经表面修饰处理的PAA膜片直接检测；氨基化组，采用经本发明氨基化表面修饰处理后，戊二醛组装表面修饰处理之前的PAA膜片进行检测；DNA组，采用本发明的改性多孔阳极氧化铝膜片，加入dCas9蛋白、sgRNA、EGFR19外显子样品进行检测。

检测结果如下图29～31所示：理论上膜电位变化应为空白膜片即CK组在pH值稳定条件下检测值在4uA-8uA之间，氨基化后膜片一般检测值在0-4uA之间，而最终检测的连上目的基因的膜片即DNA组一定会大于10uA。

从图29～31可以看出，测试组的数值大小区间可变，但几组整体趋势不变，由此可知，该EGFR19外显子的检测值符合要求，采用本发明制得的改性多孔阳极氧化铝膜片可用于特定核酸序列检测，且该检测方法真实有效。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片及其制备方法及应用方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 760

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tattgttcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 60

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 120

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 180

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 240

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 300

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 360

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 420

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 480

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 540

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 600

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 660

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 720

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 760

<210> 2

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720

tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822

<210> 3

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcagccca ctcaccacgc agagataagc tttcaggata gagatacagc tcttccagac 60

gcatgttcat ctatatctga tattagcccc gttacgtatc cgatcacatt acctattatt 120

aaaaacattt ccgtaactgc tcatggtatc aatcttatcg ataaatttcc atcaaagttc 180

tgcagctctt acataccctt ccactacgga ggcaatgcga ttaaaacccc cgatgatccg 240

ggtgcgatga tgattacctt tgctttgaag ccacgggagg aataccaacc cagtggtcat 300

attaacgtat ccagagcaag agaattttat attagttggg acacggatta cgtggggtct 360

atcactacgg ctgatcttgt ggtatcggca tctgctatta actttcttct tcttcag 417

Claims (12)

1.一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，其特征在于，多孔阳极氧化铝膜片的表面或孔道内壁连接有Cas/dCas家族蛋白。

2.如权利要求1所述多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法，包括：

（1）对多孔阳极氧化铝膜片进行清洗预处理，得预处理后的多孔阳极氧化铝膜片；

（2）对所述预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层依次进行羟基化表面修饰处理、氨基化表面修饰处理和戊二醛组装表面修饰处理，得到改性多孔阳极氧化铝膜片。

3.如权利要求2所述的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法，其特征在于，所述对所述预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层或孔道内表面依次进行羟基化表面修饰处理、氨基化表面修饰处理和戊二醛组装表面修饰处理，得到改性多孔阳极氧化铝膜片的步骤，包括：

（1）使用电晕枪外焰对所述预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡层或孔道内表面进行来回接触，以使所述预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡层表面或孔道内表面羟基化，得表面羟基化的多孔阳极氧化铝膜片；

（2）对所述表面羟基化的多孔阳极氧化铝膜片进行氨基化表面修饰处理，得表面氨基化的多孔阳极氧化铝膜片；

（3）对所述表面氨基化的多孔阳极氧化铝膜片进行戊二醛组装表面修饰处理，得所述改性多孔阳极氧化铝膜片。

4.如权利要求3所述的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法，其特征在于，所述对所述表面羟基化的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡层进行氨基化表面修饰处理，得表面氨基化的多孔阳极氧化铝膜片的步骤，具体包括：

（1）将所述表面羟基化的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡层浸入浓度为1.5%~2%的APTES溶液中，静置过夜；

（2）取出该膜片后用乙醇进行多次冲洗，吹干；

（3）于120℃下加热处理该膜片至少1小时，得表面氨基化的多孔阳极氧化铝膜片。

5.如权利要求3所述的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法，其特征在于，所述对所述表面氨基化的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡层进行戊二醛组装表面修饰处理，得所述改性多孔阳极氧化铝膜片的步骤，具体包括：

（1）将所述表面氨基化的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡层浸入浓度为2.5%~10%的戊二醛溶液中，于4℃下反应至少4小时；

（2）取出该膜片后，用水冲洗，吹干，完成戊二醛组装表面修饰处理，得所述改性多孔阳极氧化铝膜片。

6.如权利要求2所述的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法，其特征在于，所述多孔阳极氧化铝膜片由如下方法制备得到：

（1）将经预处理后的铝箔置于500℃下真空煅烧至少5小时，取出并放入混合酸溶液中进行电化学抛光处理，得抛光处理后的铝箔；

（2）将所述抛光处理后的铝箔在室温下进行两步阳极氧化处理，得到所述多孔阳极氧化铝膜片，其中，两步阳极氧化处理的条件为：氧化电压为30~50V，电解液采用浓度为0.3moL/L的草酸水溶液。

7.如权利要求2所述的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法，其特征在于，所述多孔阳极氧化铝膜片的膜厚度为0.05~0.3mm，膜直径为1~10mm。

8.一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，其特征在于，所述多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片由如权利要求2~7任意一项所述的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法制备得到。

9.如权利要求8所述的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，可用于检测特定核酸序列。

10.如权利要求8所述的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片在检测特定核酸序列中的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将表面组装有Cas家族蛋白或dCas家族蛋白的改性多孔阳极氧化铝膜片放入检测容器中，并加入电极缓冲液覆盖所述改性多孔阳极氧化铝膜片的两侧；

（2）向所述检测容器加入根据目的基因设计得到的单链引导核糖核酸RNA，使所述改性多孔阳极氧化铝膜片上的Cas蛋白或dCas家族蛋白与所述单链引导RNA进行结合；

（3）向所述检测容器加入待检测样品后进行膜片电位检测，并根据膜片电位检测结果判定所述待检测样品中是否含有目的基因。

11.如权利要求10所述的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片在检测特定核酸序列中的应用方法，其特征在于，所述待检测样品为病原微生物基因组DNA或RNA样本。

12.如权利要求10所述的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片在检测特定核酸序列中的应用方法，其特征在于，所述待检测样品为外显子发生突变后肿瘤病人的基因组DNA样本。

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