JP6810559B2 - 環状型一本鎖核酸、およびその調製方法と使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、環状型一本鎖核酸、およびその調製方法と使用方法に関する。
生物では、ゲノムＤＮＡ上の配列情報がｍＲＮＡに転写され、その情報を基にタンパク質が合成される。この合成されたタンパク質が生体内で機能することにより、生命活動が維持されている。一方で、近年の次世代シーケンサ技術の発展により、個々の細胞のそれぞれのゲノムＤＮＡ配列を決定することが可能となっている。これにより得られたゲノムＤＮＡの情報を発生のメカニズムの解明といった基礎研究から、医療への応用の一助としようとする動きが活発化している。個々の細胞のゲノムＤＮＡを解析することで、一様に同じ細胞からなるように見える組織も、多様な細胞が混在する不均一な状態からなることがわかってきている。特にがんにおいては、がん細胞集団の不均一性が予後を悪くしているとも言われている。即ち、選択した治療法で排除できなかった少数の細胞群が、後に増殖し再発の原因となると考えられている 。このがん組織の不均一性は、細胞間での異なるゲノム変異が原因のひとつとして考えられている。ゲノム変異の形態には、一塩基のみに起こる点突然変異や、大きなゲノム領域もしくは染色体全体に関わる異常がある。がんにおいては、がんの進行に伴ってこれらの異常が蓄積することが知られている。がん組織に不均一性をもたらす原因のひとつであるゲノム変異を解明するためには、個々の細胞を解析する単一細胞レベルでのゲノムＤＮＡ解析が必須であり、これによりがんの変異メカニズム解明や、その知見に基づいた的確な治療の実施が可能になることが期待される。
単一細胞もしくは数個〜１００個程度の極微量の細胞由来のゲノムの変異を解析するためには、細胞当たり２コピーしかないゲノムＤＮＡを、まずは増幅する必要がある。単一細胞由来の全ゲノムＤＮＡ増幅方法としては、その工程により、（１）ＰＣＲを基本とした方法、（２）鎖置換反応を基本とした方法、および（３）鎖置換反応とＰＣＲを組み合わせた方法が知られている。
（１）のＰＣＲを基本とした手法では、ランダムプライマー（６〜１５塩基長程度のランダムな配列からなるプライマー）をゲノムＤＮＡ上に結合させ伸長反応を行うことで産物を得る。合成されたＤＮＡと鋳型ＤＮＡとの変性工程（９４〜９６℃）、プライマーと鋳型ＤＮＡとのアニーリング工程（５０〜６０℃程度）およびＤＮＡ伸長工程（６５〜７５℃程度）の３工程を数十回繰り返すことで産物を得ることができる。相補鎖結合時の温度（アニーリング温度）を下げることで、相補鎖結合効率をあげ、後にアニーリング温度を上昇させ、ＤＮＡ合成精度を上げる工夫をしているプロトコールが多い。PicoPLEX WGA
kit (New England Biolabs社)や、GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit（SIGMA社）が該当する。この方法の長所は、複雑な反応工程を経ないことである。一方で、配列によって増幅されやすい部分と増幅されにくい部分の差が顕著であり、ゲノムＤＮＡ全体をバイアスなく増幅するためには適切な方法ではない。
kit (New England Biolabs社)や、GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit（SIGMA社）が該当する。この方法の長所は、複雑な反応工程を経ないことである。一方で、配列によって増幅されやすい部分と増幅されにくい部分の差が顕著であり、ゲノムＤＮＡ全体をバイアスなく増幅するためには適切な方法ではない。
（２）のＭＤＡ法は、ランダムプライマー（通常６塩基長）をゲノムＤＮＡと相補鎖結合させ合成鎖を作るところまでは（１）と同じである。しかし、続いて反応に使用する酵素Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼが鋳型となっているＤＮＡからこの合成鎖を剥がし、次のランダムプライマーが再度相補鎖合成する部位となる点がＰＣＲと異なる。鎖置換反応および合成反応は高温と低温を繰り返しサイクルさせるＰＣＲとは異なり、恒温（３０℃）反応であることも特徴的である。恒温反応であるため、合成される鎖長が非常に長い。また、通常のＰＣＲと比較してＤＮＡ合成は１、０００倍近く精度（塩基合成の正確性）が高く、偽陽性や陰性の結果を排除できることが大きな特徴である。REPLI-g Single C
ell Kit （QIAGEN社）やTrue Prime Single Cell WGA Kit （SYGNIS社）がこれに該当す
る。
ell Kit （QIAGEN社）やTrue Prime Single Cell WGA Kit （SYGNIS社）がこれに該当す
る。
（３）のＭＡＬＢＡＣ法は（１）および（２）の方法と比べると、少し複雑な工程からなる。ランダムプライマーの末端に、特異的な配列（アダプター配列）を結合させることで、pre-amplificationの工程で両側にアダプター配列が挿入されたものは、ループ構造
を形成するようになる。ループ構造をとった産物は、pre-amplificationの工程において
再度鋳型となることがない。（１）のＰＣＲも（２）のＭＤＡ法も、高温化もしくは鎖置換活性で、合成された産物が鋳型から剥がれ、１本鎖となることで再度鋳型として使用され、この工程が配列特異的な増幅の偏りを増大させているとされている。この問題を、ＭＡＬＢＡＣ法では、ループ構造をとり産物が鋳型にはならないことで、解消している。pre-amplificationの工程では線形増幅であり、２コピーしかないゲノムＤＮＡを一定量増
幅させ、その後ＰＣＲにより所望の量まで増幅させる。MALBAC Single Cell WGA Kit （Yikon Genomics社）がこれに該当する。
を形成するようになる。ループ構造をとった産物は、pre-amplificationの工程において
再度鋳型となることがない。（１）のＰＣＲも（２）のＭＤＡ法も、高温化もしくは鎖置換活性で、合成された産物が鋳型から剥がれ、１本鎖となることで再度鋳型として使用され、この工程が配列特異的な増幅の偏りを増大させているとされている。この問題を、ＭＡＬＢＡＣ法では、ループ構造をとり産物が鋳型にはならないことで、解消している。pre-amplificationの工程では線形増幅であり、２コピーしかないゲノムＤＮＡを一定量増
幅させ、その後ＰＣＲにより所望の量まで増幅させる。MALBAC Single Cell WGA Kit （Yikon Genomics社）がこれに該当する。
いずれの手法も、単一細胞由来の全ゲノムＤＮＡを増幅できるとしており、極微量細胞由来のゲノムＤＮＡ増幅にも同様に適用可能な技術である。
本発明は、環状型一本鎖核酸、およびその調製方法と使用方法を提供することを目的とする。
本発明の一実施態様は、ゲノムＤＮＡ上の標的塩基を決定するための環状型一本鎖核酸であって、前記標的塩基またはその相補塩基を有する、ゲノムＤＮＡの一方の鎖の一部である第１の一本鎖核酸と、ゲノムＤＮＡが由来する細胞のインデックスとなるインデックス配列またはその相補配列を有する第２の一本鎖核酸と、を含む、環状型一本鎖核酸である。この環状型一本鎖核酸は、第２の一本鎖核酸に隣接した、アダプター配列またはその相補配列を有する第３の一本鎖核酸を含んでもよい。
本発明の他の実施態様は、ゲノムＤＮＡ上の標的塩基を決定するための環状型一本鎖核酸の調製方法であって、前記ゲノムＤＮＡが由来する細胞のインデックスとなるインデックス配列を有する第２の一本鎖核酸と、ランダムな配列を有する第４の一本鎖核酸とを、この順で５’側から含む第１のオリゴヌクレオチドと、前記標的塩基から、１〜１０００塩基離れた部位にある塩基配列またはその相補配列を有する第５の一本鎖核酸を含む第２のオリゴヌクレオチドと、をプライマーとして用い、前記ゲノムＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程と、前記増幅産物のうち、一方の一本鎖核酸の両端を結合させて環状にする工程と、を含む、環状型一本鎖核酸の調整方法である。本法において、第１のオリゴヌクレオチドが、第２の一本鎖核酸の５’側に、アダプター配列を有する第３の一本鎖核酸を含んでもよい。また、第４の一本鎖核酸は、各々ランダムな配列を有する一本鎖核酸の集合であってもよい。第１のオリゴヌクレオチドは、固相基材に結合していてもよい。
本発明のさらなる実施態様は、ゲノムＤＮＡ上の標的塩基を決定するための核酸の調製方法であって、前記ゲノムＤＮＡが由来する細胞のインデックスとなるインデックス配列を有する第２の一本鎖核酸と、ランダムな配列を有する第４の一本鎖核酸とが、この順で５’側から結合している第１のオリゴヌクレオチドと、前記標的塩基またはその相補塩基から、１〜１０００塩基離れた部位にある第１の隣接塩基配列を有する第５の一本鎖核酸を含む第２のオリゴヌクレオチドと、をプライマーとして用い、前記ゲノムＤＮＡを鋳型
として用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程と、前記増幅産物のうち、一方の一本鎖核酸の両端を結合させて環状にして環状型一本鎖核酸を得る工程と、前記環状型一本鎖核酸を鋳型とし、第１の隣接塩基配列の相補相補配列を有するオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドとをこの順で５’側から含む第６の１本鎖核酸、または第１のオリゴヌクレオチドの相補配列を有するオリゴヌクレオチドと第１の隣接塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをこの順で５’側から含む第７の１本鎖核酸、の一部または全部の塩基配列の相補配列を有する第３のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、Rolling Circle Amplification（ＲＣＡ）反応を行い、増幅産物を得る工程を含む方法である。本法において、第６の一本鎖核酸の一部または全部の塩基配列の相補配列、または第７の一本鎖核酸の一部または全部の塩基配列を有する第４のオリゴヌクレオチドと、前記増幅産物を鋳型とし、前記増幅産物上で第４のオリゴヌクレオチドの結合配列と、前記標的塩基を挟んで逆側に１〜１０００塩基離れた部位にある第２の隣接塩基配列を有する第６の一本鎖核酸を含む第５のオリゴヌクレオチドと、をプライマーとして、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程をさらに含んでもよい。
として用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程と、前記増幅産物のうち、一方の一本鎖核酸の両端を結合させて環状にして環状型一本鎖核酸を得る工程と、前記環状型一本鎖核酸を鋳型とし、第１の隣接塩基配列の相補相補配列を有するオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドとをこの順で５’側から含む第６の１本鎖核酸、または第１のオリゴヌクレオチドの相補配列を有するオリゴヌクレオチドと第１の隣接塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをこの順で５’側から含む第７の１本鎖核酸、の一部または全部の塩基配列の相補配列を有する第３のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、Rolling Circle Amplification（ＲＣＡ）反応を行い、増幅産物を得る工程を含む方法である。本法において、第６の一本鎖核酸の一部または全部の塩基配列の相補配列、または第７の一本鎖核酸の一部または全部の塩基配列を有する第４のオリゴヌクレオチドと、前記増幅産物を鋳型とし、前記増幅産物上で第４のオリゴヌクレオチドの結合配列と、前記標的塩基を挟んで逆側に１〜１０００塩基離れた部位にある第２の隣接塩基配列を有する第６の一本鎖核酸を含む第５のオリゴヌクレオチドと、をプライマーとして、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程をさらに含んでもよい。
本発明によって、環状型一本鎖核酸、およびその調製方法と使用方法を提供することができるようになった。
本発明の一実施態様は、ゲノムＤＮＡ上の標的塩基を決定するための環状型一本鎖核酸であって、標的塩基またはその相補塩基を有する、ゲノムＤＮＡの一方の鎖の一部である第１の一本鎖核酸と、ゲノムＤＮＡが由来する細胞のインデックスとなるインデックス配列を有する第２の一本鎖核酸と、を含む、環状型一本鎖核酸である。以下に、この環状型一本鎖核酸の調製方法及び使用方法を含む、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.),
Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、
当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をこれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をこれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
１. インデックスプライマー
本実施態様では、細胞のインデックスとなるインデックス配列またはその相補配列を有する一本鎖核酸は、細胞固有のインデックスプライマーを構成する。インデックスプライマーは、ＤＮＡで構成されるのが好ましいが、それに限定されるものでなく、例えばＲＮＡや人工核酸を含んでいてもよい。インデックスプライマーの塩基数は特に限定されないが、４〜３０塩基とすることが好ましい。例えば、細胞の母集団を識別するために用いる場合、インデックス配列がＡ、Ｃ、ＧもしくはＴの１塩基だけで構成されると、異なる４種類の母集団の識別が可能になる。インデックス配列がＡ、Ｃ、ＧもしくはＴから選ばれる２塩基で構成されれば、４２＝１６種類の識別が可能になり、Ｎ塩基で構成されれば、４Ｎ種類の異なる母集団の識別が可能となる。
本実施態様では、細胞のインデックスとなるインデックス配列またはその相補配列を有する一本鎖核酸は、細胞固有のインデックスプライマーを構成する。インデックスプライマーは、ＤＮＡで構成されるのが好ましいが、それに限定されるものでなく、例えばＲＮＡや人工核酸を含んでいてもよい。インデックスプライマーの塩基数は特に限定されないが、４〜３０塩基とすることが好ましい。例えば、細胞の母集団を識別するために用いる場合、インデックス配列がＡ、Ｃ、ＧもしくはＴの１塩基だけで構成されると、異なる４種類の母集団の識別が可能になる。インデックス配列がＡ、Ｃ、ＧもしくはＴから選ばれる２塩基で構成されれば、４２＝１６種類の識別が可能になり、Ｎ塩基で構成されれば、４Ｎ種類の異なる母集団の識別が可能となる。
インデックスプライマーは、インデックス配列またはその相補配列を有する一本鎖核酸の３’末端側に、ランダムな塩基配列を有する一本鎖核酸を有していることが好ましい。この一本鎖核酸は、その配列自体がランダムなだけではなく、その一本鎖核酸の集合に含まれる各核酸の配列もランダムに異なっている。ランダムな塩基配列の塩基数は特に限定されないが、核酸と安定して相補鎖を形成できる塩基数が好ましく、例えば２〜２０塩基が好ましく、４〜１０塩基がより好ましい。
インデックスプライマーは、インデックス配列またはその相補配列を有する一本鎖核酸の３’末端側または５’末端側に、後の増幅工程やシーケンス工程で使用することが可能なアダプター配列を有する一本鎖核酸を有してもよいが、その位置は５’末端側であることが好ましい。アダプター配列は複数設けてもよい。
２．ゲノムＤＮＡ上の標的塩基
ゲノムＤＮＡ上の標的塩基は、塩基の種類を決定する対象の塩基であって、一塩基に限らず、複数の塩基であっても、塩基配列であってもよい。その塩基数も特に限定されず、数十塩基〜数百塩基であってもよい。
ゲノムＤＮＡ上の標的塩基は、塩基の種類を決定する対象の塩基であって、一塩基に限らず、複数の塩基であっても、塩基配列であってもよい。その塩基数も特に限定されず、数十塩基〜数百塩基であってもよい。
標的塩基としては、例えば、変異を有する可能性のある塩基が挙げられる。変異の種類は特に限定されず、ＳＮＰ（Single nucleotide polymorphism）などの点突然変異、挿入突然変異、欠失突然変異、置換突然変異などが挙げられる。また、標的塩基として、遺伝子またはその一部であってもよい。
３．標的部位特異的第１の隣接プライマー
標的塩基から、１〜１０００塩基離れた部位にある第１の隣接塩基配列を有する一本鎖核酸は、標的部位特異的第１の隣接プライマーを構成する。この隣接プライマーはＤＮＡで構成されてもよいが、それに限定されず、例えばＲＮＡや人口核酸を含んでもよい。第１の隣接塩基配列の標的塩基からの距離は、１〜１０００塩基離れているが、１０塩基〜６００塩基離れていることが好ましく、３０塩基〜２００塩基離れていることが好ましい。この間隔は、一度に増幅でき、一度に塩基配列が決定できる塩基長に依存する。第１の隣接塩基配列の塩基数は特に限定されないが、１０〜４０塩基数が好ましく、１５〜３０塩基数がより好ましい。
標的塩基から、１〜１０００塩基離れた部位にある第１の隣接塩基配列を有する一本鎖核酸は、標的部位特異的第１の隣接プライマーを構成する。この隣接プライマーはＤＮＡで構成されてもよいが、それに限定されず、例えばＲＮＡや人口核酸を含んでもよい。第１の隣接塩基配列の標的塩基からの距離は、１〜１０００塩基離れているが、１０塩基〜６００塩基離れていることが好ましく、３０塩基〜２００塩基離れていることが好ましい。この間隔は、一度に増幅でき、一度に塩基配列が決定できる塩基長に依存する。第１の隣接塩基配列の塩基数は特に限定されないが、１０〜４０塩基数が好ましく、１５〜３０塩基数がより好ましい。
４．環状型一本鎖核酸の調製方法
本発明の一実施態様である、環状型一本鎖核酸の調製方法は、インデックスプライマーと、標的部位特異的第１の隣接プライマーとをプライマーとして用い、ゲノムＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程と、得られた増幅産物のうち、一方の一本鎖核酸の両端を結合させて環状にする工程と、を含む。インデックスプライマーの伸長反応と第１の隣接プライマーの伸長反応は、１回ずつでもよく、ＰＣＲのように複数回行ってもよい。１回ずつしか行わない場合、一方のプライマーだけで行ったあとで、もう一方のプライマーを加えて行ってもよく、プライマーを同時に加えて行ってもよい。以下、詳細に説明する。
本発明の一実施態様である、環状型一本鎖核酸の調製方法は、インデックスプライマーと、標的部位特異的第１の隣接プライマーとをプライマーとして用い、ゲノムＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程と、得られた増幅産物のうち、一方の一本鎖核酸の両端を結合させて環状にする工程と、を含む。インデックスプライマーの伸長反応と第１の隣接プライマーの伸長反応は、１回ずつでもよく、ＰＣＲのように複数回行ってもよい。１回ずつしか行わない場合、一方のプライマーだけで行ったあとで、もう一方のプライマーを加えて行ってもよく、プライマーを同時に加えて行ってもよい。以下、詳細に説明する。
図１に示すように、核酸増幅反応において、まずインデックスプライマーが有するランダムな配列はゲノム上の様々な場所に偏りなくハイブリダイズする。その後、インデックスプライマーの伸長反応を行う。用いる酵素は、ＤＮＡの伸長反応中に、伸長した先にある既に相補鎖結合している別のＤＮＡ鎖を剥がしながら、自分自身の伸長鎖を合成する鎖置換活性を持つものが好ましい。このような酵素として、例えば、Phi29 DNAポリメラー
ゼやBst DNAポリメラーゼ、Large Fragment、Deep vent DNAポリメラーゼ、Klenow DNAポリメラーゼが挙げられる。伸長して得られたＤＮＡ鎖は５’末端側にインデックス配列を有する。
ゼやBst DNAポリメラーゼ、Large Fragment、Deep vent DNAポリメラーゼ、Klenow DNAポリメラーゼが挙げられる。伸長して得られたＤＮＡ鎖は５’末端側にインデックス配列を有する。
次に、図２に示すように、得られた伸長鎖に対し、第１の隣接プライマーをハイブリダイズさせる。第１の隣接プライマーは、伸長鎖に第１の隣接塩基配列が含まれる場合、その伸長鎖にハイブリダイズする。この後、第１の隣接プライマーの伸長反応を行う。ここで用いる酵素は、一般的にDNA鎖を合成するものであれば限定されず、T4 DNAポリメラー
ゼや、Klenow DNAポリメラーゼのように熱耐性の無いものでも、Taq DNAポリメラーゼの
ように熱耐性のものでもよいが、熱耐性の酵素が好ましい。
ゼや、Klenow DNAポリメラーゼのように熱耐性の無いものでも、Taq DNAポリメラーゼの
ように熱耐性のものでもよいが、熱耐性の酵素が好ましい。
以上により、一端にインデックス配列を有し、他の一端に第一の隣接塩基配列を持つ二本鎖ＤＮＡが得られる。
次に、二本鎖ＤＮＡから、いずれか一方の一本鎖ＤＮＡを単離する。その方法は特に限定されないが、例えば、図３に示すように、インデックスプライマーまたは第１の隣接プライマーの５’末端に、あらかじめ単離用基質を付加しておき、伸長反応後、その単離用基質に結合する結合物質を利用して単離してもよい。この単離用基質と結合物質の例として、マグネティック粒子と磁石、ビオチン類とアビジン類、抗原と抗体、Hisタグと金属
、GSTとグルタチオンなどが挙げられる。
、GSTとグルタチオンなどが挙げられる。
単離用基質と結合物質は、伸長工程の前に結合させておいてもよい。それにより、反応溶液の交換が容易になる。また、微量試料の場合、チップやチューブなどへの吸着による損失を減らすことができる。
また、結合物質を固相基材に結合させてもよい。固相基材は、DNA及びRNAの核酸解析システムの分野で一般的に使用されている材料で作製されたものであれば特に限定されるものではない。例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケルなどやステンレスなどの合金からなる金属；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ及び感光性ガラスなどのガラス材料；ポリエステル樹脂、ポリスチレン、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂（AcryLinitrile Butadiene Styrene樹脂）、ナイロン、アクリル樹脂及び塩化ビニル樹脂などのプラスチック；アガロース、アクリドアミド、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、ニトロセルロース、キチン、キトサンなどが挙げられる。
固相基材の形状も限定されず、平面状の板などでもよく、球状のビーズなどでもよいが、結合表面積が大きく、操作性も高いことからマグネティック粒子などのビーズが好ましい。
サンプルに複数種類の細胞由来のゲノムＤＮＡが混在し、標的塩基が複数ある場合、細胞集団ごとに異なるインデックス配列を有するインデックスプライマーを使用する必要がある。このため、あらかじめ固相基材に各インデックスプライマーが結合している場合には、公知の方法によって、インデックスプライマー毎に独立させればよい。
なお、二本鎖ＤＮＡを一本鎖にする方法として、酵素反応を用いることも可能である。例えば、インデックスプライマーの５’末端をあらかじめリン酸基で修飾しておき、５’末端にリン酸基が修飾された鎖だけを特異的に分解する酵素を用いて一方の鎖を分解することにより、二本鎖ＤＮＡを一本鎖にすることができる。分解酵素としては、ラムダエクソヌクレアーゼが挙げられるが、同様の活性を示すものであれば限定されない。
こうして得られたいずれかの一本鎖ＤＮＡの両末端を結合し環状化する。環状化に用いる酵素は、Ampligase、T4 DNA ligase、Circligaseなどを用いることができる。AmpligaseやT4 DNA ligaseの場合、環状化にヘルパープローブを用いるのが好ましい。ヘルパープローブは、一本鎖ＤＮＡの両末端に相補的な配列を有し、同時にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドであれば、特に配列は限定されない。インデックスプライマーが伸長した一本鎖ＤＮＡに対しては、インデックスプライマーの５’末端と第１の隣接プライマーの３’末端とを結合させるため、ヘルパープローブには、インデックスプライマーの相補的な塩基配列の３’末端側の一部または全部と、第１の隣接プライマーの有する塩基配列の５’末端側の一部または全部を、５’末端側からこの順で結合させた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。具体的には、アダプター配列を用いない場合、インデックス配列と相補的な配列の３’末端側の一部または全部と、第１の隣接プライマーの有する塩基配列の５’末端側の一部または全部をこの順で５’側から結合させた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。アダプター配列を用いる場合、アダプター配列と相補的な配列の３’末端側の一部または全部と、第１の隣接プライマーの有する塩基配列の５’末端側の一部または全部をこの順で５’側から結合させた塩基配列、あるいはインデックス配列と相補的な配列の３’末端側の一部または全部、アダプター配列と相補的な配列の全部、第１の隣接プライマーの有する塩基配列の５’末端側の一部または全部をこの順で５’側から結合させた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、第１の隣接プライマーが伸長した一本鎖ＤＮＡに対しては、インデックスプライマーの３’末端と第１の隣接プライマーの５’末端とを結合させるため、ヘルパープローブには、第１の隣接プライマーの相補的な塩基配列の３’末端側の一部または全部と、インデックスプライマーの有する塩基配列の５’末端側の一部または全部とをこの順で５’側から結合させた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。具体的には、アダプター配列を用いない場合、第１の隣接プライマーの有する塩基配列と相補的な配列の３’末端側の一部または全部と、インデックス配列の５’末端側の一部または全部とをこの順で５’側から結合させた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。アダプター配列を用いる場合、第１の隣接プライマーの有する塩基配列と相補的な配列の３’末端側の一部または全部と、アダプター配列の５’末端側の一部または全部をこの順で５’側から結合させた塩基配列、あるいは第１の隣接プライマーの有する塩基配列と相補的な配列の３’末端側の一部または全部、アダプター配列の全部、インデックス配列の５’末端側の一部または全部をこの順で５’側から結合させた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。なお、図４には、第１の隣接プライマーが伸長した一本鎖ＤＮＡ４を用いた場合の工程を示している。
ここで、ヘルパープローブの塩基数は特に限定されないが、全体として、１０〜１００
塩基数であることが好ましく、１０〜３０塩基数であることがより好ましい。そして、第１の隣接プライマー側とインデックスプライマー側で、それぞれ５〜５０塩基数であることが好ましく、５〜１５塩基数であることが好ましく、同じ塩基数であれば特に好ましい。
塩基数であることが好ましく、１０〜３０塩基数であることがより好ましい。そして、第１の隣接プライマー側とインデックスプライマー側で、それぞれ５〜５０塩基数であることが好ましく、５〜１５塩基数であることが好ましく、同じ塩基数であれば特に好ましい。
５．環状型一本鎖核酸の使用方法
上述のようにして得られた環状型一本鎖核酸を鋳型として、環状化産物の一部と相補的な配列を有するプライマーを用いて、Rolling Cilecle Amplification （ＲＣＡ法）を行う。ＲＣＡ法で使用する酵素は、鎖置換活性を有するものであれば限定されず、Phi29 DNA polymeraseや、Bst DNA polymerase、Vent DNA ploymerase、Deep Vent DNA polymeraseなどが挙げられる。この時に用いるプライマーは、環状型一本鎖核酸を増幅できるもの
であれば特に限定されないが、操作の簡便さのため、環状化に用いたヘルパープローブを用いることが好ましい。こうして、図４（３）で示すように、ヘルパープローブの塩基配列とゲノムＤＮＡの塩基配列が繰り返された一本鎖核酸が得られる。
上述のようにして得られた環状型一本鎖核酸を鋳型として、環状化産物の一部と相補的な配列を有するプライマーを用いて、Rolling Cilecle Amplification （ＲＣＡ法）を行う。ＲＣＡ法で使用する酵素は、鎖置換活性を有するものであれば限定されず、Phi29 DNA polymeraseや、Bst DNA polymerase、Vent DNA ploymerase、Deep Vent DNA polymeraseなどが挙げられる。この時に用いるプライマーは、環状型一本鎖核酸を増幅できるもの
であれば特に限定されないが、操作の簡便さのため、環状化に用いたヘルパープローブを用いることが好ましい。こうして、図４（３）で示すように、ヘルパープローブの塩基配列とゲノムＤＮＡの塩基配列が繰り返された一本鎖核酸が得られる。
その後、この一本鎖核酸のうち、標的塩基周辺の核酸について、核酸増幅反応を行う。具体的な核酸増幅反応は、公知の方法を用いることができ、例えば、Polymerase Chain Reaction （ＰＣＲ法）やLoop-Mediated Isothermal Amplification（ＬＡＭＰ法）やNucleic Acid Sequence-Based Amplification （ＮＡＳＢＡ法）などを用いることができる。ここで用いるプライマーは、標的塩基を増幅できるプライマーペアであれば特に限定されないが、インデックスプライマーが伸長した一本鎖ＤＮＡから作成された環状型一本鎖核酸に由来する一本鎖ＤＮＡの場合、第１の隣接プライマーの有する塩基配列と相補的な配列の３’末端側の一部または全部を含むプライマーと、このプライマーに対し標的塩基を挟んで逆側に１〜１０００塩基離れた部位にある第２の隣接塩基配列の相補配列を有する第２の隣接プライマーとを用いることができる。同様に、第１の隣接プライマーが伸長した一本鎖ＤＮＡから作成された環状型一本鎖核酸に由来する一本鎖ＤＮＡの場合、第１の隣接プライマーの有する塩基配列の３’末端側の一部または全部を含むプライマーと、このプライマーに対し標的塩基を挟んで逆側に１〜１０００塩基離れた部位にある第２の隣接塩基配列の相補配列を有する第２の隣接プライマーとを用いることができる。
ここで、第２の隣接塩基配列の標的塩基からの距離は、１〜１０００塩基離れているが、１０塩基〜６００塩基離れていることが好ましく、３０塩基〜２００塩基離れていることが好ましい。この間隔は、一度に増幅でき、一度に塩基配列が決定できる塩基長に依存する。第２の隣接塩基配列の塩基数は特に限定されないが、１０〜４０塩基数が好ましく、１５〜３０塩基数がより好ましい。
インデックスプライマーから標的塩基までの塩基数は様々であるが、第１の隣接塩基配列から標的塩基までの塩基数は人為的に決めることができる。同様に、第２の隣接塩基配列から標的塩基までの塩基数は人為的に決めることができる。したがって、上記プライマーを用いることによって、この工程の後で行うシーケンス反応に適当な塩基数を決めることが可能になる。
また、同一のゲノムＤＮＡ上の複数の標的塩基を解析する場合、インデックスプライマーは同一の物と用いることができるが、第１の隣接プライマーおよび第２の隣接プライマーの配列は、標的塩基ごとに異なるものにする必要がある。しかしながら、これら２種の隣接プライマーの位置を各標的塩基から同一、もしくはほぼ同じ距離にそろえることによって、シーケンスの反応効率を一定にすることが可能になる。
６. 標的塩基にインデックスを付加することの用途
ゲノムＤＮＡや遺伝子発現を解析する際、多数の細胞を個別に調べることにより情報の
統計学的意義を深めることが可能になる。また、例えば、微量試料が複数種類ある場合にも、種類の数が多いほど、得られる情報の確からしさは増す。一方で、多数の細胞や試料を同時に解析した場合、それぞれにどの細胞由来か、どの試料由来かといったことを明示する、細胞の種類と関連付けられたインデックスが有用である。このインデックスによって、複数種類の細胞由来のゲノムが混合されていても、どの細胞由来かを識別することが可能になる。
ゲノムＤＮＡや遺伝子発現を解析する際、多数の細胞を個別に調べることにより情報の
統計学的意義を深めることが可能になる。また、例えば、微量試料が複数種類ある場合にも、種類の数が多いほど、得られる情報の確からしさは増す。一方で、多数の細胞や試料を同時に解析した場合、それぞれにどの細胞由来か、どの試料由来かといったことを明示する、細胞の種類と関連付けられたインデックスが有用である。このインデックスによって、複数種類の細胞由来のゲノムが混合されていても、どの細胞由来かを識別することが可能になる。
このように、複数の細胞に各細胞固有のインデックス配列を付与し、標的塩基と関連付けを行いながら、その標的塩基の解析を行うことができる。以下に詳細を説明する。
（１）まず、同じ標的塩基で、細胞によって塩基が異なる場合を考える。
複数の細胞を準備し、細胞ごとに異なる配列を有するインデックス配列を有する固有のインデックスプライマーを用いる。上述したようにして、最終的に、細胞ごとに異なるインデックス配列を有し、標的塩基を挟んで、第１の隣接配列と第２の隣接配列が存在する、二重鎖ＤＮＡを得ることができる。
その後、全ての細胞から得られた生成物を混合し、一括でシーケンス反応を実施すると、インデックス配列の情報と標的塩基の情報をセットで得ることができる。すなわち、細胞ごとに標的塩基の情報があきらかになる。
（２）次に、細胞によって標的塩基が異なる位置にある場合を考える。
複数の細胞を準備し、細胞ごとに、異なる配列を有するインデックス配列を有する固有のインデックスプライマーと、各標的塩基に特異的な異なる隣接プライマーを用いる。上述したようにして、最終的に、細胞ごとに異なるインデックス配列を有し、標的塩基を挟んで、細胞ごとに異なる第１の隣接配列と第２の隣接配列が存在する、二重鎖ＤＮＡを得ることができる。
その後、全ての細胞から得られた生成物を混合し、一括でシーケンス反応を実施すると、インデックス配列の情報と標的塩基の情報をセットで得ることができる。すなわち、細胞ごとに標的塩基の情報があきらかになる。
７．得られた配列データの解析
以上の方法で構築された、多細胞由来の変異の配列データは、図５に示すようにそれぞれの変異のタイプと、細胞の番号で整理されたマトリックスデータ１０１として表示することが可能である。変異のパターンの組合せを解析用コンピュータ１０２で解析することで、例えば、変異由来の疾患であるがんの抗がん剤投与の指標や、予後治療の指標として活用できる。変異の種類は膨大であり、また、細胞の数も多いほどデータの信頼性が高まることから、これらの整理されたデータをサーバ１０３に蓄積し、新たな知見を加えることも可能になる。
以上の方法で構築された、多細胞由来の変異の配列データは、図５に示すようにそれぞれの変異のタイプと、細胞の番号で整理されたマトリックスデータ１０１として表示することが可能である。変異のパターンの組合せを解析用コンピュータ１０２で解析することで、例えば、変異由来の疾患であるがんの抗がん剤投与の指標や、予後治療の指標として活用できる。変異の種類は膨大であり、また、細胞の数も多いほどデータの信頼性が高まることから、これらの整理されたデータをサーバ１０３に蓄積し、新たな知見を加えることも可能になる。
以下、本発明の実施形態の具体例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。
本実施例では、Ｈ１９７５（ヒト肺腺癌培養細胞）を用い、単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡの解析標的部位の点突然変異の解析を行った。
（１）まず、図４に示すように、インデックス配列および標的部位特異的な第１の隣接プ
ライマーを有する一本鎖ＤＮＡ断片を得る工程（図４（１））、解析標的部位とインデックス配列を隣接させる工程（図４（２））、および隣接したインデックスおよび解析標的部位を増幅する工程（図４（３〜５））を以下に説明する。
ライマーを有する一本鎖ＤＮＡ断片を得る工程（図４（１））、解析標的部位とインデックス配列を隣接させる工程（図４（２））、および隣接したインデックスおよび解析標的部位を増幅する工程（図４（３〜５））を以下に説明する。
図１に示すように、本実施例では、インデックスプライマー３１は、５’末端がビオチン標識３４で修飾されているものを用いた。インデックスプライマー３１として、５’末端側から、既知配列からなる第１のアダプター配列３３（配列番号１）、固有のインデックス配列３１（配列番号２〜１１）および６塩基のランダム配列３２から構成されるオリゴヌクレオチドを用いた。以下に各配列を示す。
5’-CGATGACGTAATACGACTCACTATAGGG-3’ （配列番号１）
5’-ATACGCG-3’ （配列番号２）
5’-GTACGCT-3’ （配列番号３）
5’-CGCTAGC-3’ （配列番号４）
5’-CTAGCGC-3’ （配列番号５）
5’-GTATCGC-3’ （配列番号６）
5’-CACGCTA-3’ （配列番号７）
5’-GATAGCG-3’ （配列番号８）
5’-CGAGCTA-3’ （配列番号９）
5’-CGCGACG-3’ （配列番号１０）
5’-CGTCGCG-3’ （配列番号１１）
本実施例において、複数のインデックス配列３１について増幅を試みた。アダプター配列３３は全て共通である。ランダム配列３２に示されるＮはＡ、Ｃ、Ｇ、もしくはＴの４種類のいずれかの核酸から構成されるものを使用した。インデックス配列３１は７塩基で構成したことにより、最大１６，３８４個の細胞の識別が可能であった。
5’-CGATGACGTAATACGACTCACTATAGGG-3’ （配列番号１）
5’-ATACGCG-3’ （配列番号２）
5’-GTACGCT-3’ （配列番号３）
5’-CGCTAGC-3’ （配列番号４）
5’-CTAGCGC-3’ （配列番号５）
5’-GTATCGC-3’ （配列番号６）
5’-CACGCTA-3’ （配列番号７）
5’-GATAGCG-3’ （配列番号８）
5’-CGAGCTA-3’ （配列番号９）
5’-CGCGACG-3’ （配列番号１０）
5’-CGTCGCG-3’ （配列番号１１）
本実施例において、複数のインデックス配列３１について増幅を試みた。アダプター配列３３は全て共通である。ランダム配列３２に示されるＮはＡ、Ｃ、Ｇ、もしくはＴの４種類のいずれかの核酸から構成されるものを使用した。インデックス配列３１は７塩基で構成したことにより、最大１６，３８４個の細胞の識別が可能であった。
インデックスプライマー３１は、固相基材としてストレプトアビジン標識磁気ビーズMyOne C1 (Thermo Scientific)（φ＝1μm）３８にあらかじめ結合させた。磁気ビーズ１
個にプライマー１コピーとなるように結合させた。
個にプライマー１コピーとなるように結合させた。
９６ウエルプレートの各ウエルの反応溶液に、単一細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ、固有のインデックスを有するインデックスプライマー、インデックスプライマーが結合したビーズを１０７個添加した。詳細な反応溶液の構成を表１に示す。最終溶液量が１０μＬ になるよう滅菌水で調製した後、３０℃で３時間伸長反応を行った。その後６０℃で１０分処理して酵素を失活させた。
（２）伸長反応終了後、ネオジウム磁石を用い、10mM Tris-Cl (pH8.0) 、 0.1% Tweenのバッファーで磁気ビーズを洗浄した。上清を完全に除去した後、同じバッファー２μＬで
磁気ビーズを懸濁した。ランダム配列３２は、ゲノムＤＮＡに対して偏りなく、二重鎖３５を形成することができ、そこから伸長鎖３６を合成できる。したがって、この伸長反応によって、伸長していった先に、標的塩基３９が含まれる伸長鎖３６と含まれない伸長鎖３７が生じる。
磁気ビーズを懸濁した。ランダム配列３２は、ゲノムＤＮＡに対して偏りなく、二重鎖３５を形成することができ、そこから伸長鎖３６を合成できる。したがって、この伸長反応によって、伸長していった先に、標的塩基３９が含まれる伸長鎖３６と含まれない伸長鎖３７が生じる。
次に、図２に示すように、インデックスプライマー３１の伸長鎖３６に標的部位特異的な第1の隣接プライマー２をアニールさせ、伸長反応を行った。第1の隣接プライマー２の塩基配列として、標的塩基が存在するゲノムＤＮＡの相補鎖３９上で、標的塩基３９に対してインデックスプライマー３１と反対側に位置し、標的塩基３９から、１７０塩基離れた配列5’-CCTGGCATGAACATGACCC-3’（配列番号１２）を用いた。したがって、隣接プラ
イマー２は、標的塩基３９が含まれる伸長鎖３６にのみアニールして二重鎖４０が形成され（図２（２））、標的塩基３９を含む伸長鎖３６を鋳型として伸長鎖４１が合成された（図２（３））。続いて、得られた二重鎖を変性させて一本鎖にし（図２（５））、磁気ビーズの付着した方のＤＮＡ鎖を除去することによって、５’末端に第1の隣接プライマ
ー２を有し、３’末端に固有のインデックス配列の相補配列４３と第1のアダプター配列
の相補配列４２を有する一本鎖を得た。
イマー２は、標的塩基３９が含まれる伸長鎖３６にのみアニールして二重鎖４０が形成され（図２（２））、標的塩基３９を含む伸長鎖３６を鋳型として伸長鎖４１が合成された（図２（３））。続いて、得られた二重鎖を変性させて一本鎖にし（図２（５））、磁気ビーズの付着した方のＤＮＡ鎖を除去することによって、５’末端に第1の隣接プライマ
ー２を有し、３’末端に固有のインデックス配列の相補配列４３と第1のアダプター配列
の相補配列４２を有する一本鎖を得た。
以下に具体的な伸長反応の反応条件を示す。インデックスプライマー３１の伸長鎖３６が結合した磁気ビーズ懸濁液に、表２に示す伸長反応試薬を加え、最終溶液量が２０μＬになるよう滅菌水で調製した。続いて、サーマルサイクラーを用いて、表３に示す熱サイクル反応を行った。
熱サイクル反応終了後、反応溶液（２０μＬ）に０．５Ｎ ＮａＯＨを５μＬ加え、３７℃で１０分間保持し、伸長鎖の変性反応を行った。続いて、磁気ビーズをネオジウム磁石で保持しながら上清を回収した。この上清に、一本鎖化した第１の隣接プライマーの伸長鎖が含まれる。続いて、０．５Ｎ ＨＣｌを５μＬ加え溶液の中和反応を行った。
（３）続いて、得られた一本鎖ＤＮＡの５’末端のリン酸化反応を行った。表４に示すリン酸化反応試薬を調製し、最終溶液量が２０μＬ になるよう滅菌水を加えた。３７℃で３０分間反応させ、７０℃５分で酵素を失活させた。
（４）その後、標的塩基３を含む一本鎖ＤＮＡのリン酸化された５’末端と３’末端を結合し、環状化産物を合成した。表５に示す環状化反応試薬を調製し、最終溶液量が１０μＬになるよう滅菌水を加え、５０℃で１〜５時間反応を行った。なお、環状化に際して使用したヘルパープローブは、図４（２）に示すように、ＤＮＡ断片の両末端部と相補的な配列（配列番号１３）からなるオリゴヌクレオチドを用いた。以下に用いた配列を示す。5’-GGGTCATGTTCATGCCAGGCGATGACGTAATACGACTCACTATAGGG-3’（配列番号１３）
（５）次に、得られた環状化産物を鋳型とし、ヘルパープローブを用いたRolling Circle
Amplification（ＲＣＡ）による増幅反応を行った。ＲＣＡ産物８は、図４（３）に示すように、環状化産物の相補鎖配列が、ヘルパープローブを起点として並列に繰り返される構造になる。
Amplification（ＲＣＡ）による増幅反応を行った。ＲＣＡ産物８は、図４（３）に示すように、環状化産物の相補鎖配列が、ヘルパープローブを起点として並列に繰り返される構造になる。
具体的には、表６に示すＲＣＡ反応試薬を調製し、最終溶液量が１０μＬになるよう滅菌水を加え、３７℃で２〜１６時間反応を行った。
（６）続いて、図４（４）および（５）に示すように、インデックスプライマーの相補鎖配列を有するプライマー、および標的部位特異的な第２の隣接配列の相補鎖配列（配列番号１４）からなる第２の隣接プライマー９を用いて、ＲＣＡ産物を鋳型としてＰＣＲ反応による増幅反応を行い、標的塩基３が含まれたＤＮＡ断片１０を増幅させた。以下に、用いた配列を示す。
5’-CATCCTCCCCTGCATGTGT-3’（配列番号１４）
5’-CATCCTCCCCTGCATGTGT-3’（配列番号１４）
以下に反応の詳細を示す。ＲＣＡ産物に、表７に示すＰＣＲ反応試薬を加え、最終溶液量が２５μＬになるよう滅菌水で調製した。続いて、サーマルサイクラーを用いて、表８に示す熱サイクル反応を行った。
このようにして、標的塩基３と固有インデックス配列１が隣接したＤＮＡ断片の増幅産物を得た。増幅産物を定量した結果を図６に示す。
Ｈ１９７５細胞株は標的塩基において、一方のアレルのみが変異しているヘテロ接合体であるため、増幅産物は野生型と変異型両方について得られた。なお、１０種類のいずれのインデックスプライマーを用いた場合も同様の結果を得た。
Ｈ１９７５細胞株は標的塩基において、一方のアレルのみが変異しているヘテロ接合体であるため、増幅産物は野生型と変異型両方について得られた。なお、１０種類のいずれのインデックスプライマーを用いた場合も同様の結果を得た。
１． インデックスプライマー
２・ 第１の隣接プライマー
３． 標的塩基
４． 第１の隣接プライマーが伸長した一本鎖ＤＮＡ
５． 第１の隣接プライマーの相補鎖配列
６． インデックスプライマーの相補鎖配列
７． 標的塩基の相補塩基
８． ＲＣＡ産物
９． 第２の隣接プライマー
１０． インデックスプライマーの伸長反応
１１． ＰＣＲ産物
３０． ゲノムＤＮＡ
３１． インデックス配列を有する一本鎖核酸
３２． ランダム配列を有する一本鎖核酸
３３． 第１のアダプター配列を有する一本鎖核酸
３４． ビオチン標識
３５． 二重鎖
３６． 標的塩基を含む伸長鎖
３７． 標的塩基を含まない伸長鎖
３８． 磁気ビーズ
３９． 標的塩基の相補塩基
４０． 二重鎖
４１． 第１の隣接プライマーの伸長鎖
４２． 第１のアダプター配列の相補配列を有する一本鎖
４３． インデックス配列を有する一本鎖
１０１． マトリックスデータ
１０２． 解析用ＰＣ
１０３． データサーバ
２・ 第１の隣接プライマー
３． 標的塩基
４． 第１の隣接プライマーが伸長した一本鎖ＤＮＡ
５． 第１の隣接プライマーの相補鎖配列
６． インデックスプライマーの相補鎖配列
７． 標的塩基の相補塩基
８． ＲＣＡ産物
９． 第２の隣接プライマー
１０． インデックスプライマーの伸長反応
１１． ＰＣＲ産物
３０． ゲノムＤＮＡ
３１． インデックス配列を有する一本鎖核酸
３２． ランダム配列を有する一本鎖核酸
３３． 第１のアダプター配列を有する一本鎖核酸
３４． ビオチン標識
３５． 二重鎖
３６． 標的塩基を含む伸長鎖
３７． 標的塩基を含まない伸長鎖
３８． 磁気ビーズ
３９． 標的塩基の相補塩基
４０． 二重鎖
４１． 第１の隣接プライマーの伸長鎖
４２． 第１のアダプター配列の相補配列を有する一本鎖
４３． インデックス配列を有する一本鎖
１０１． マトリックスデータ
１０２． 解析用ＰＣ
１０３． データサーバ
Claims (5)
- ゲノムＤＮＡ上の標的塩基を決定するための環状型一本鎖核酸の調製方法であって、
前記ゲノムＤＮＡが由来する細胞のインデックスとなるインデックス配列を有する第２の一本鎖核酸と、各々ランダムな配列を有する一本鎖核酸の集合である第４の一本鎖核酸とを、この順で５’側から含む第１のオリゴヌクレオチドと、前記標的塩基から、１〜１０００塩基離れた部位にある塩基配列またはその相補配列を有する第５の一本鎖核酸を含む第２のオリゴヌクレオチドと、をプライマーとして用い、前記ゲノムＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物のうち、一方の一本鎖核酸の両端を結合させて環状にする工程と、
を含む、環状型一本鎖核酸の調整方法。 - 第１のオリゴヌクレオチドが、第２の一本鎖核酸の５’側に、アダプター配列を有する第３の一本鎖核酸を含む、請求項１に記載の環状型一本鎖核酸の調整方法。
- 第１のオリゴヌクレオチドは、固相基材に結合している、請求項１または２に記載の環状型一本鎖核酸の調整方法。
- ゲノムＤＮＡ上の標的塩基を決定するための核酸の調製方法であって、
前記ゲノムＤＮＡが由来する細胞のインデックスとなるインデックス配列を有する第２の一本鎖核酸と、各々ランダムな配列を有する一本鎖核酸の集合である第４の一本鎖核酸とが、この順で５’側から結合している第１のオリゴヌクレオチドと、前記標的塩基またはその相補塩基から、１〜１０００塩基離れた部位にある第１の隣接塩基配列を有する第５の一本鎖核酸を含む第２のオリゴヌクレオチドと、をプライマーとして用い、前記ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物のうち、一方の一本鎖核酸の両端を結合させて環状にして環状型一本鎖核酸を得る工程と、
前記環状型一本鎖核酸を鋳型とし、第１の隣接塩基配列の相補配列を有するオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドとをこの順で５’側から含む第６の１本鎖核酸、または第１のオリゴヌクレオチドの相補配列を有するオリゴヌクレオチドと第１の隣接塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをこの順で５’側から含む第７の１本鎖核酸、の一部または全部の塩基配列の相補配列を有する第３のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、Rolling Circle Amplification（ＲＣＡ）反応を行い、増幅産物を得る工程を含む方法。 - 第６の一本鎖核酸の一部または全部の塩基配列の相補配列、または第７の一本鎖核酸の一部または全部の塩基配列を有する第４のオリゴヌクレオチドと、
前記増幅産物を鋳型とし、前記増幅産物上で第４のオリゴヌクレオチドの結合配列と、前記標的塩基を挟んで逆側に１〜１０００塩基離れた部位にある第２の隣接塩基配列を有する第６の一本鎖核酸を含む第５のオリゴヌクレオチドと、をプライマーとして、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
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