JPH07500734A

JPH07500734A - オリゴヌクレオチドプローブのポリマーを用いる核酸配列の検出方法

Info

Publication number: JPH07500734A
Application number: JP5508504A
Authority: JP
Inventors: ルダート　ウィリアム　エイ; トラッコ　マッシモ
Original assignee: ユニヴァーシティ　オブ　ピッツバーグ
Priority date: 1991-10-31
Filing date: 1992-10-22
Publication date: 1995-01-26
Also published as: WO1993009245A1; EP0656065A1; US5683872A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチドプローブのポリマーを用いる核酸配列の検出方法承認本発明は、米国予防衛生研究所によって査定された認可番号第Ａ１２３９６３号として政府助成により開発された。政府は、本発明においである一定の権利を有する。

発明の分野本発明は、一般的には、特定のヌクレオチド配列の検出を容易にする方法及び物質に関する。更に詳細には、本発明は、疾患に関連した遺伝子の存在を検出するために、特にＨＬＡ分子判定に用いられる逆ドツトプロット法に有用なオリゴヌクレオチドプローブのポリマーを作成する酵素増幅法の使用に関する。

発明の背景ヒト組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ）は、臓器移植の免疫拒絶のようなヒト免疫応答のほとんどすべての態様を調節する３クラスの分子を包含する。ＨＬＡ遺伝子は染色体６のショートアームに見られ、抗原ペプチド断片を結合する高度冬型内在性膜タンパク質セットをコードする。発現クラス１１分子、ＤＰ、ＤＱ及びＤＲは各々サブ領域を形成し、これらも冬型性である。一般に、Ｈｌ、Ａ判定は、移植のための組織判定及びある種の自己免疫疾患に対する遺伝的感受性の分析に有効である。Ｄｕｑｕｅｓｎｏｙ、　Ｊ、Ｒ，等、　ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　８：１０３（１９８８）参照、この開示を参考として本明細書に引用する。

組織移植が指数関数的展開で行われている結果としてＨＬＡ判定によるドナーーレシピエントＨＬＡマツチングの要求が増加してきた。同書。更に、ＨＬＡ判定はある種Ｈ１，Ａ関連の自己免疫疾患を発生する危険を確認するために行われて本明細書に引用する。自己免疫疾患評価の場合には、ＨＬＡクラス１１判定がＨＬｉｎ　ｌｎｎｕｎｏｌｏｇｙ　９：２０１　（１９８９）、この開示を参考として本明細書に引用する。しかしながら、これらの目的に対して、ＨＬＡクラス＋１分子の対立遺伝子の血清学的判定による確認にはかなりの制限があることは明らかである：最も使用される抗クラス１１抗血清の量が限られている；２人のドナーからの血清が同一ドナーでさえも時間が違うと正確に同じ特異性を有しないことから再現性のある結果を得ることが困難であり、ＤＰのような多数の対立遺伝子がアロ抗血清によって確認されない；及び満足なりラスＩＩＨＬＡ判定は比較的多量の血液からのみ得られる８９２８球の十分に精製された集団が必要である。分子レベルでの判定とは反対に血清学的判定の主な利点は、不完全ではあるが極めて良好な結果が２４時間以内に可能なことである。現在、分子の方法は比較的複雑な技術的手順を伴うので、この予定時間に合わせることができない。

分子レベルでのＨＬＡ判定は、血清学的判定より極めて正確かつ完全であるが、制限断片長条型（ＲＦＬＰ）分析を行うかあるいはプローブとしてオリゴヌクレオチドを用いる複雑さによりその適用が制限される。ＲＦＬＰ分析は、当該技術において周知であるように、判定されるべきドナーのゲノムＤＮＡを消化するために特定の制限酵素セットを各ＤＮＡプローブに対して用い、すべての実験室において簡便に実施されるものではない。例えば、ある実験室では、放射能の使用が問題とされ、一方ではサザンプロット法が、特に多くの試験が短時間で行われなければならない場合には、正しく行われにくい。また、多くの実験室は、プローブとして用いられるＤＮＡを適正に伸長させかつ適切に標識する専門的技術や設備がない。

最近ではもう１つの方法、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）が冬型制限部位及び核酸配列を検出するために用いられており、上記サザンプロット法の制限が多くの点て除去された。ＰＣＲ法は、米国特許第４．６８３．１９５号、同第４．６８３．２０２号及び同第４．８８９．８１８号（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）並びに５ａｉｋｉ、　Ｒ，に、等。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：　１３５０　（１９８５）に記載されており、これらの開示を参考として本明細書に引用する。簡単に言えば、ＰＣＲは核酸中に含まれる任意の標的核酸配列を増幅する方法である。一定の核酸配列を増幅するために、核酸配列の別々の相補（変性）鎖は、標的配列に隣接する２本の逆向きに集まっているオリゴヌクレオチドブライマーのモル過剰量で処理される。プライマーは別々の鎖に対してアニールし、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの１つ又は両方で伸長される場合、プライマーの反復伸長が２本のプライマー間で生じる標的核酸配列のコピーを得る。

各伸長サイクルの終わりに、相捕的プライマー伸長産物は変性され、プライマーアニーリング及びプライマー伸長の次のサイクルの鋳型として働き、そのことにより前に合成されたものよりＤＮＡ配列量が実質的に倍になる。その結果は、標的配列の指数関数的増幅、約２′（ｎはサイクル数である）である。ＰＣＲ増幅により、上記標準的な核酸ハイブリッド形成法で検出できない少量の試料中のＤＮＡを検出することが可能である。

ＤＮＡの特定のヌクレオチド配列の有無を検出するためにしばしば用いられ、性（１本鎖）標的ＤＮＡを膜に一つなぎとめ、引き続き結合された標的ＤＮＡのセグメントと特定のプローブがハイブリッド形成するような条件下でその膜を標識化及び変性した特定の短ＤＮＡプローブを含む溶液で処理する。次いで、ハイブリッド形成されないプローブを洗い流し、特定プローブの保持を当該技術において周知の各種方法によってめるが、そのすべての方法がプローブに対してリポータ一部分又は標識を予め結合することを必要とする。プローブを追跡する最も一般に用いられる方法は、プローブに組込まれた３２Ｐのオートラジオグラフィーを含んでいる。その最初の説明から、ドツトプロット法は、プローブされるべき特定配列を増幅するＰＣＲを用いることにより変更されている。この改良により、ドツトプロット法は、厳重な条件を各プローブに適合させることができるので、特定のヌクレオチド配列の存在をめるのに、ある種間列の単一のヌクレオチド変異の存在でさえ有効である。

ヌクレオチド配列を検出するために用いられるもう１つの手法は、いわゆる逆ドツトプロット法である。逆ドツトプロット法は、膜につなぎとめられたりガントがその存在が試験される試料又は標的ＤＮＡではなくオリゴヌクレオチドプローブである点で従来のドツトプロット法と異なっている。この方法においては、従来のドツトプロット法の場合の特定のプローブの代わりにリポータ一部分が試験される試料ＤＮＡに結合される。逆ドツトプロット法は、従来のドツトプロット法よりいくつかの利点がある。まず、多数の特定プローブを単一膜の種々の場所につなぎとめることができ、従って、ハイブリッド形成を特定の各プローブの別々の容器の代わりに単一容器で同時に行うことができる。即ち、単一ハイブリッド形成反応においては、全配列系を同時に分析することができる。更にこの方法の利点は、リポータ一部分を含むＤＮＡの単一標品を多数の特定の結合プローブに用いることができるが、従来のドツトプロット法は別々に標識化されるべき個々の各プローブを必要とした点である。この利点は、数種のプローブからの結果を比較しなければならない場合に特に重要である。個々の標識プローブの場合、各プローブの標識化の違いを補うように訂正を加えなければならないが、逆ドツトプロット法の標識ＤＮＡは各プローブとの相互作用が同じであり、各々の特定ハイブリッド形成結果を直接比較することができる。

逆ドツトプロット法を行うために用いられる特定のオリゴヌクレオチドプローブは、約１４〜約２０個のヌクレオチドの長さが好ましい。しかしながら、このサイズのプローブを膜に直接付着することに伴う欠点がある。まず、全体の付着過程の効率がよくない。第２に、プローブは特定配列の一部に化学結合する形で膜に結合され、そのことにより特異性又はプローブの単−ＤＮＡ塩基対誤対合レベルの判別能が低下する。当該技術は、これらの課題を克服するためにプローブを酵素改変することにより進展し、プローブの３′端に比較的多数のチミジンヌクレオチドを付加してデオキシリボチミジンホモポリマー尾部を形成した。ポリｄＴテーリングとしても知られるこの方法は、５ａｉｋｉ、　Ｒ，に、等、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　（ＵＳＡ）８６：８２３０　（１９８９）に記載されており、この開示を参考として本明細書に引用する。

ポリｄＴ尾部を付加するためにプローブのサイズが大きくなると、膜に対するプローブの結合効率が増大する効果があり、多くの場合、膜との化学結合が特定の結合配列よりポリｄＴ尾部内で生じ、そのことによりプローブの特異性が維持される。

ＰＣＲプロトコールは、ＨＬＡ領域の遺伝子変異を検出するのに特に有効であった。ＰＣＲ法及び従来のドツトプロット方法を用いると、例えば、ＨＬＡ−ＤＱＢＩ遺伝子の第２エクソンのコドン５７に中心がある短セグメントの変異がイシスワン依存性糖尿病感受性の信頼できるマーカーであるかをめる場合、何百という試料を分子的に判別することが起こりえた。この開示は、Ｍｏｒｅｌ、　Ｐ、等。

Ｐ、Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　（ＵＳＡ）　８５：８１１１　（１９８８）；　Ｂａｏ、　ＩｔＺ、等、　Ｌａｎｃｅｔ　２：２９７　（１９８９j；　Ｃａｒｃａｓｓｉ、　Ｃ，等、　Ｈｕｗｍｎ　Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ　３１：１５９　（１９９１）；及びＤｏｒｍｎ、　Ｊ、等、　Ｐ、Ｎ、　Ａ、　ＳB （ＵＳＡ）　８７：７３７０　（１９９０）に記載されており、参考として本明細書に引用する。この方法を用いて非常に優れた結果が得られたが、完全クラス ■！分子判別が単一遺伝子の１つのセグメントだけの多型性を試験するより要求が多いことは明らかである。例えば、ＸＩ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　）ｌｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　（１９９０）の基準プロトコールには、完全クラス１１判定に必要な１４０個のオリゴヌクレオチドが挙げられており、この開示を参考として本明細書に引用する。オリゴヌクレオチドの各々は、独立して標識化されたハイブリッド形成プローブとして用いなければならず、特定温度で厳重に洗浄されなければならない。これらのオリゴヌクレオチド１４０個すべての標識化と操作及びろ過は、通常の試験の場合にはほとんど実際的でない。更に、必要な放射性試薬、ＰＣＲ試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）、ニトロセルロースフィルター及び専門の職員にかかるコストが非常に高い。

ＨＬＡ判定に特異的なＰＣＲ増幅ＤＮＡに関するＲＦＬＰ分析の使用は、Ｔｒｕｃｃｏ、　Ｇ、等、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３８：１６１７　（１９８９）及びＲｕｄｅｒｔ、　Ｗ、Ａ、等、　Ｐｈａｒｍａｃｙ　Ｔ奄高■刀B ０ｃｔｏｂｅｒ　１９８９　ｐ、　３８に記載されており、これらの開示を参考として本明細書に引用する。この方法は上記方法より迅速であり、放射性物質あるいはド・ソトブロ・ソト手順なしで行うことができるので有利であるが、まだ複雑過ぎるので多くの実験室で行うことができない。

Ｅｒ１ｉｃｈ、１１．Ａ、等、　ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　Ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｎｄ　ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｎ１ｓ、　１０．等、　（Ｅｄｓ、）　ｐ、　２６１　（１９９０）には、標識オリゴヌクレオチドプローブによるドツトプロットハイブリッド形成及びオリゴヌクレオチドプローブを膜に固定しかつ標識ＰＣＲ標識ＤＮＡ産物に対してノーイブリッド形成することによる逆ドツトプロット法によってＰＣＲ増幅試料における特定のＨＬＡ対立遺伝子を検出することが詳述されており、この開示を参考として本明細書に引用する。５ａｉｋｉ、　Ｒ，に、等、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３２４：１６３　（１９８６）に報告されているように、ＰＣＲがβ−グロビン及びＨＬＡ−ＤＱαＤＮＡを酵素増幅するために用いられ、得られた増幅産物を対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドでプローブして従来のドツトプロット法を用いて対立遺伝子変異が検出されており、この開示を参考として本明細書に引用する。５ａｉｋｉ、　Ｒ，に、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：６２３０　（１９８９）（ポリｄＴテーリングによる逆ドツトプロット）も参照、この開示を参考として本明細書に引用する。

本発明は、酵素増幅法の種々の態様の利点を用いることにより逆ドツトプロット法を進展させるものである。

発明の要約従って、本発明の第１の目的は、固定した配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて特定のヌクレオチド配列を検出する効率の良い方法を提供するものである。

本発明のもう１つの目的は、プローブが従来の逆ドツトプロット法よりプローブの特異的ハイブリッド形成特性を保持することができる固定化した配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて特定のヌクレオチド配列を検出する方法を提供するものである。

また本発明のもう１つの目的は、逆ドツトプロット法において結合リガンドとして有用なオリゴヌクレオチドプローブのポリマーを合成することである。

更に本発明のもう１つの目的は、逆ドツトプロット法において結合リガンドとして有用な酵素増幅法を用いたオリゴヌクレオチドモノマーの長いポリマーを合成することである。

更に本発明のもう１つの目的は、ポリマーを適切な宿主でクローン化しかつ必要なときにポリマーを切り出すことによりオリゴヌクレオチドモノマーの長いポリマーの永久起原を提供するものである。

本発明のもう１つの目的は、検体ＤＮＡの両鏡が結合オリゴヌクレオチドプローブに対してハイブリッド形成することができる逆ド・ソトブロ・ソト法を提供するものである。

更にもう１つの目的は、放射性標識を用いない逆ド・ソトブロ、ソト法を提供するものである。

またもう１つの目的は、非常に限られた量の血液又は他の種類の組織を用いる正確かつ高速の完全ＨＬＡ判定方法を提供するものである。

本発明のこれらの及び他の目的は、１種以上の下記実施態様により達成される。

ｌ態様においては、本発明は、核酸配列の有無を検出する方法を特徴とするものであって：検出されるべき核酸配列の領域に相補的な選択オリゴヌクレオチドプローブのポリマーを基質に結合し；プローブポリマーが結合される該基質をリポータ一部分が組込まれている未知のオリゴヌクレオチド配列を含む増幅された検体ＤＮＡ試料と接触させて、相補的ヌクレオチド配列をアニールし；その基質を洗浄してアニールされない増幅された検体ＤＮＡを基質から除去し；その基質上にオリゴヌクレオチドプローブによって保持されたリポータ一部分の有無を検出する。

ことを含む方法である。

本発明の好ましい実施態様においては、選択オリゴヌクレオチドプローブのポリマーは下記段階によって合成される：■、逆向きでありカリそれらの３′端で相補性を共有し、双方が直接あるいは相補的ヌクレオチドとしてオリゴヌクレオチドプローブ配列及び隣接子ツマ一単位の十分な数のヌクレオチドを組込む完全モノマー単位の配列を形成する２本のオリゴヌクレオチドブライマーをアニールすると、プライマーがそれらの３′端でアニールし、プライマーの５′端がアニールされずかつ第１伸長産物の合成の鋳型として機能し：＋１．そのプライマーをデオキシリボヌクレオチドの存在下にＤＮＡポリメラーゼで処理して各鋳型に相補的な各プライマーの第１伸長産物を合成し：ＩＩ１．その相補的第１伸長産物を変性により分離して１本鎖分子を作製し；ＩＶ、第１伸長産物の相補鎖を互い違い配列の３′端でアニールすると、５′端がアニールされずかつ前の伸長産物を更に伸長するための鋳型として機能し；Ｖ、アニール鎖をＤＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチドを用いて処理して２本鎖伸長産物を合成し；Ｖｌ、その相補的伸長産物を変性により分離し；ＶＩｌ、段階（ｆ）の伸長産物を用いて段階（ｄ）〜（ｆ）を繰り返して各々反復した連続的に長い伸長産物を作製する。

本発明のもう１つの態様においては、本発明は、ｐｕｃｌ８、ｐＵＣｌ　９又は２本鎖プライマー伸長産物をクローン化するバクテリオファージＭｌ　３ｍｐ由来のベクターを特徴とするものである。

他の好ましい実施態様においては、本発明は、ｐｕｃｌ　８、ｐｕｃｌ９又は２本鎖プライマー伸長産物をクローン化するバクテリオファージＭ１３ｍｐ由来のベクターで移入した細菌培養物及び大量のプライマー伸長産物ポリマーの生産方法であって：かかる細菌を培養し：ポリマーを含むベクターを回収し：挿入ポリマーを制限エンドヌクレアーゼを切り出す；ことを含む方法を特徴とするものである。

またもう１つの態様においては、本発明は、検出されるべき核酸配列の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブの長い選択ポリマーを結合する基質を特徴とするものである。

他の実施態様においては、本発明は、試料とそれに適用できる診断キットにあることが疑われる特定の核酸配列の存在を診断する方法に関するものである。長いポリマーの永久起原は、ＨＬ　Ａ分子判定のような診断試験結果の再現性が確実である適切な宿主内でポリマーをクローン化することにより提供される。

図面の説明図１は、従来のドツトプロット法、ポリｄＴテーリングを用いた逆ド、ソトブロソト法及び本発明のオリゴヌクレオチドプローブのポリマーを用いた逆ドツトプロット法の概略図である。

図２は、合成オリゴヌクレオチド配列体を用いて酵素増幅することによるオリゴヌクレオチドプローブのポリマーの合成を示すものである。

図３Ａ及び３Ｂは、各々短いプライマー鋳型配列及びクローン化二員体の制限エンドヌクレアーゼ消化から誘導されたプライマー−鋳型配列を用いたオリゴヌクレオチドプローブのポリマーの合成を示すものである。

図４は、プライマー及び鋳型としての両方を２本のオリゴヌクレオチド（太文字）を用いて標的ＨＬＡＤＱＢ遺伝子プロモーター配列を酵素増幅してその配列の多数の縦列反復コピーを最終的に含むポリマーを作製する段階と産物を示すものである。

図５Ａ及び５Ｂは、各々ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩて消化することによりプラスミドＸＬＩ−Ｂｌｕｅから切断したポリマークローン化挿入断片及びプラスミドＸＬＩ−Ｂｌｕｅから切断したポリマークローン化挿入断片のＥｃｏＲＶ消化により形成された産物のオートラジオグラムの写真を示すものである。

図６は、放射性標識プローブとハイブリッド形成した本発明の方法によって作製したＤＮＡポリマーの増加量でスポットしたＮｙｔｒａｎフィルターの写真である。

図７Ａ及び７Ｂは、各々コドン５７及びコドン２６を包含するＤＱβ対立遺伝子特異的ポリマーを調製するために用いたオリゴヌクレオチドを示すものである。

図８は、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌｌで消化することにより対応するプラスミドから切断したＨＬＡ−ＤＱβ対立遺伝子のコドン５７の前後を合成した後、精製した８個のオリゴヌクレオチドプローブのポリマークローン化挿入断片を含む臭化エチジウム染色アガロースゲルの写真である。

図９Ａ及び９Ｂは、各々ＤＱβ遺伝子座のコドン５７で変異する多数の対立遺伝子をもつファミリーに対して従来のドツトプロット法及び本方法を用いて得られた分子判定結果の写真を示すものである。

図１Ｏは、図９Ｂの対応する逆ドツトプロット法のイメージ分析を示すものである。

図１１は、ＤＱβ配列すべてを試験するために必要とされるプライマ一対及びプローブ配列を示すものである。

発明の詳細な説明本明細書で用いられる“ポリマー”とは、少なくとも１回同一分子が別の所で繰り返されるヌクレオチド配列を含む１本鎖又は２本鎖核酸、詳細にはＲＮＡ又はＤＮＡを意味する。反復セグメントは、縦列に配列されるか又は１つの場所から別の場所までの長さ及び／又は配列が異なってもよい他のセグメントによって分けられるものである。理論上反復配列は正確なコピーであるが、実際には反復配列のいくつかはポリマー構築方法の完全な忠実度の不足のため又は細菌のベクター内でのポリマーの増殖で生じる突然変異又は欠失のようなエラーのために配列が外れてしまうことは理解される。

本明細書で用いられる“基質”とは、核酸をこれに限定されないが通常では共有結合によって化学的に結合することができる剛性又は可撓性の支持体を意味するものである。基質は、更に種々の条件下で検体ＤＮＡ及びリポータ一部分検出系の試薬に対して基質自体の親和性を最少限に維持することができる特性をもっている。許容しうる種類の基質の例としては、基質と付着されたＤＮＡが当該技術において周知でありかつ頻繁に実施されている熱又は紫外線に反応する結果として共有結合を形成するナイロン及びニトロセルロース膜が挙げられるが、これらに限定されない。

これらの特定の要求は、更に残りの活性部位を後で失活させることにより、検体ＤＮＡと検出系分子に対する基質親和性が最小になるような方法でＤＮＡプローブに対する共有結合の形成を促進するように化学的に活性化することができる特性を有する基質によっても満たすことができる。このような基質の例としては、５ｅｅｄ、　Ｂ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＩＯ：１７９９　（＋９８２）に記載されているジアゾ化しうるアリールアミドセルロース紙であり、この開示を参考として本明細書に引用する。

本明細書で用いられる“オリゴヌクレオチド”とは、プライマー、プローブ及び検出されるべきオリゴマー断片を意味し、２個以上、好ましくは３個より多いデオキシリボヌクレオチドからなる分子として定義される。本発明によって作製されるオリゴヌクレオチドプローブは、２キロベ一ス程度である。

本発明は、逆ドツトプロット法において結合リガンド／プローブの結合効率及びハイブリッド形成効率を高める方法を提供するものである。１分子当たり特定のヌクレオチド配列（“モノマー”）約２５反復を有することが好ましく、ポリマーの長さが約２００〜２０００塩基対の範囲にあることが好ましい長いポリマーは、高い効率で基質、例えば慣用のナイロン又はニトロセルロース膜に結合するりガント／プローブとして作用するように調製される。基質に対するオリゴヌクレオチドプローブの結合で形成される化学結合はプローブ配列のいくらかを必ず変えるが、ｌプローブ配列に１つの単結合がポリマープローブを基質に十分つなぎとめるのに必要とされるだけである。従って、各結合プローブポリマーが特定ヌクレオチド配列のそのように多くのコピーを含むという事実によってポリｄＴテーリング法よりも基質に対する各々の結合又は連鎖により多くのプローブ配列が基質に付着される。本発明の実施により得られる高いプローブ配列濃度は、短時間のハイブリッド形成をもたらしかつ従来の逆ドツトプロットに用いられるポリｄＴテーリング法よりも感受性の低い検出法又は条件を使用することができる。プローブを含む基質と接触させる検体ＤＮＡ試料は、適切な任意の増幅法により増幅させることが好ましい。

本発明で請求された方法は、更に、プローブ配列の相補鎖の両方が膜に結合する点でポリｄＴテーリング法と異なるものである。プローブ配列の相補鎖の両方をつなぎとめると、既知の方法のポリｄＴ尾部オリゴヌクレオチド１本鎖プローブに相補的な１つの鎖だけではなく検体ＤＮＡの両路がハイブリッド形成することが可能である。しかしながら、本発明は、２本鎖ポリマープローブの使用に限定するものではない。必要な場合には、１本鎖ポリマーを当該技術において周知の方法を用いて適切な１本鎖バクテリオファージ粒子で調製することができる。

図１は、従来のドツトプロット、ポリｄＴテーリングを用いた逆ドツトプロット及び本発明の主題であるオリゴヌクレオチドプローブのポリマーを用いた逆ドツトプロットの概略図である。

オリゴヌクレオチドプローブポリマーの合成一般的には、逆向きでありかつ３′ 端で相補的な２本のオリゴヌクレオチドブライマーが３′端でアニールされる。

アニールされたプライマーは、直接あるいは伸長最終産物を含む相補的ヌクレオチドによって、特定のオリゴヌクレオチドプローブ配列を組込む完全モノマー単位の配列を形成する。更に、隣接のモノマー単位の十分な数のヌクレオチドがプライマーに組込まれる。アニールされないアニールされたプライマーの５′端は、プライマーがＤＮＡポリメラーゼと４個のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（“ｄＮＴＰｓ”又は“デオキシリボヌクレオチド”）で処理される際に形成される伸長産物の合成の鋳型として機能する。次いで、第１伸長産物は熱又は他の手段で変性されるかさもなければ分離されて１本鎖ＤＮＡ分子を作製する。１本鎖産物の３′端は、５′端がアニールせず、かつそのことにより前の伸長産物を更に伸長するための鋳型として機能するように互い違い配列でアニールすることができる。変性、伸長及びアニーリング段階の反復により、ポリマーを漸進的に成長させる。

本発明によるオリゴヌクレオチドプローブポリマーの基本的な合成は、図２に示されている。図２．３Ａ及び３Ｂにおいて、上段の文字は任意のヌクレオチド配列を示し、長さは通常１２個より多く５０個より少ないヌクレオチドである。

′の次の文字は、印のない文字に相補的な配列を示し、また２つの相補的配列のアニーリングに対して適正な５’−３’方向を示すものである。ＤＮＡポリメラーゼ又は他の酵素による伸長に用いうる部位は、′。′で示される。下段の文字は、これらのヌクレオチドが前のアニーリングのプライマーの伸長によってＤＮＡポリメラーゼ又は他の酵素が予め添加されている以外は、上段の文字と同一のヌクレオチドを表すものである。

図２に一般的に示されているように、オリゴヌクレオチド配列の１対の相補的二量体が選ばれ、６対の５′端が突き出ておりかつ３′配列がアニールされるような互い違い方法でアニールすることができる。相補的二量体がそのような方法でアニールされると、ＤＮＡポリメラーゼもしくは他の酵素又は伸長産物の合成を達成するために機能する化合物により、更に４個のデオキシリボヌクレオチドがモル過剰量で添加される場合の２本領三員体を合成するためにプライマ一部位として引っ込んだ（３′）端及び鋳型として突き出ている（５′）端が用いられる。この目的に適切な酵素としては、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、熱安定酵素及び適切な条件下で伸長産物を形成させることができる他の酵素が挙げられる。二量体対は他の２つの配置、即ち、一方は平滑末端であり、もう一方は３′端が突き出ており５′端がアニールされる配置でアニールすることもできるが、これらの他の配置ではＤＮＡポリメラーゼが伸長ＤＮＡを合成させることができない。同様に、三量体と二量体の相補的３′モノマー配列はアニールして四量体を合成させることができる。

十分な量の三量体が存在する場合、ＤＮＡポリメラーゼ又は他の酵素で伸長させることができる２方法においてアニールすると四量体あるいは三量体を得ることができる。四量体の合成の場合、三量体は３′端の二量体配列上でアニールし、モノマ−５′配列が突き出てＤＮＡ合成の鋳型として作用する。三量体は、３′ モノマー配列がアニールし、５′二量体配列が鋳型として突き出る場合に形成される。その際、ＤＮＡポリメラーゼ又は他の酵素を用いて２本領日量体及び三量体を各々合成させることができる。

上記のことでわかるように、２量体配列をその５′端が突き出るようにアニーリングすると、相補的アニーリング配列の長さが１つのモノマーで増加する。同様に、多量体の長さｎの場合には、産物の長さはｎ−１多量体単位で増加させることができる。当該技術において周知のように、このような方法は熱安定酵素及び温度循環法を用いて自動操作することができる。適切な熱安定酵素の例として及び適切な条件下で伸長産物を形成させる他の熱安定酵素が挙げられる。すべての場合において、オリゴヌクレオチドブライマーはその各３′端のアニーリングでプライマーと鋳型の両方として働き、その５′端はプライマーの伸長に鋳型として働くものである。

本発明によれば、この基本的合成に関して数種の変更も可能である。図３八に示されている変更の１つによれば、両方が全二量体配列を含むオリゴヌクレオチドブライマーで開始する必要がない。２本領二型体分子を酵素増幅法の第１ラウンドで合成することができる場合には、本発明の方法に十分である。実際にこの変更は、熱安定ポリメラーゼ及び熱循環法を用いて達成することができる。二量体第１伸長産物が合成されると、上記方法が開始し、連続サイクルで自動的に進行する。しかしながら、この変更の場合、１つのモノマーと次の連続モノマーとの間の結合を含むヌクレオチドセグメントを確立するために十分な二量体配列を保持しなければならない。即ち、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドブライマーは、モノマー配列の３′端（尾部）、続いて次の連続モノマーの開始に対応する５′配列（頭部）のヌクレオチド配列を含まねばならない。図３Ａの説明では、この条件はプライマー３’　Ｃ’　Ａ’　５’で適合しており、５’　ＡＢＣ３ ’で表されるモノマー配列のセンスでは尾部から頭部までの相補的結合を構成している。

最終産物がモノマー配列の多重反復であるので、種々のモノマー配列を選ぶことができ、任意の位置で開始し、配列が反復するまで続ける。即ち、尾部から頭部までの結合は任意に配置することができ、特定オリゴヌクレオチドプローブ配列の末端の位置によって決められることを必要としない。また、図３Ａにおいて、Ｂで表されるヌクレオチドセグメントの長さがＯから５０個より多いヌクレオチドであってよいことも言及されるべきである。Ｂの長さが数個のヌクレオチドだけの場合には、共通の同じ３’　Ｃ’　Ａ’　５’プライマーを用いてわずかに異なる特定の配列が合成される。Ｂが極めて大きい場合には、モノマー５’　ＡＢＣ３’はクローン化断片から誘導され、合成３’　Ｃ’　Ａ’　５’はクローン化断片の末端から誘導され、モノマー間の結合が作られる。

モノマーの頭部及び尾部の位置を選択する可変性は、増幅法でプライマーの３′ 端の特定の配列にしばしば伴う特異的でないアニーリングによる課題をできるだけ少なくするのに重要である。更に、早い増幅サイクルで適切にアニールすることができるように、１本のプライマーの３′端の配列が十分な長さのもう１本のプライマーの３′端の配列に相補的であることが要求される。そのようなアニーリングに必要な長さは、少なくとも１２個前後から２０個以上のヌクレオチドであることが好ましい。プライマーサイズに明確な上限はないが、モノマーサイズにもよる。ポリマーの企図される使用が単一ヌクレオチド変異を検出するためである場合、プライマーの全長は約２０〜４５個のヌクレオチドであることが好ましい。

上記のこの態様は、実際には、熱循環プロトコールを用いて行われる。早いサイクルで十分な量の二量体第１伸長産物が合成されると、その第１伸長産物を用いて上記の最初の方法が中間産物を精製せずに自動的に進行する。

図３Ｂに示されている本発明の増幅法のもう１つの態様は、所望のプローブ配列が予めクローン化され、その中に少なくとも２種類のエンドヌクレアーゼ部位を有する場合に用いられる。まず、所望配列の二量体をＥｉｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、等。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８２５２１　（１９９０）に記載されている方向性クローニング法により構築され、この開示を参考として本明細書に引用する。場合によっては、必要とされる制限部位の２つのうち１つがこの構築で導入される。適切な二量体が図３Ｂに図式的に示されており、式中″ｍ″及びｎ ″はフランキングベクター配列であり、制限エンドヌクレアーゼ部位■及び１１は各々５’　Ａ−８３’及び５′ｌ３−Ｃ３’結合で生じる。更に、制限部位間のヌクレオチド配列が前に記載された態様の頭部及び尾部と同様の方法でアニールするのに十分な長さと特性をもたねばならないことが要求される。

２種類の部分的に相補的なりローン化二量体の断片は制限エンドヌクレアーゼの各々の消化により調製され、次いて酵素増幅でプライマー及び鋳型として用いられる。図３Ｂに示されているこの合成態様によれば、二量体又はそれ以」二の長さの産物が合成されると、図２に示されている基本的合成でのように反応が進行する。この具体的な態様においては、出発物質は２本鎖であるので、ＤＮＡの各鎖は共に開始から存在する。

上記のことは、本発明の実施で用いられる長いポリマーを作成するために、ＤＮＡポリメラーゼの使用に基づく方法のみが用いられるものであると解釈されるべきてはない。長いポリマーを作成する方法は、例えば方向性クローニングでも用いられる。一般的スキームがＥｉｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、等、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ−１８２：５２１（＋９９０）に記載されており、モノマーが、一方ともう一方とをアニール及び連結するために適合できる末端を作るＢｇｌｌ！及びＢａｍＨＩのような２つの制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接するベクターに挿入されるものであり、この開示を参考として本明細書に引用する。ＢａｍＨＩの挿入断片を含むベクター断片がＢｇｉ１１部位の断片にアニール及び連結されると、二量体が作られ、Ｂｇ１１１部位とＢａｍＨＩ部位が隣接し、ＢａｍＨＩ／Ｂｇｌｌｌ結合を含み、いずれの酵素によっても認識又は切断されない。この方法は、二量体から四量体等を作るために連続して繰り返すことができる。

本発明の実施に有効なもう１つの方法は、Ｋａｄｏｎａｇａ、　Ｊ、Ｔ、等、Ｐ、Ｎ、Ａ、糺」塾８３・５８８９　（＋９８６）に記載されている２木の相補的オリゴヌクレオチドをアニールして２本鎖モノマーを形成することを含み、この開示を参考として本明細書に引用する。この方法の頭部対頭部又は尾部対尾部結合を作製する傾向は、しばしばベクターとして安定な長いポリマーを作製しない。しかしながら、１態様は一方向を有する方法が可能である。１本のオリゴヌクレオチドの位置がもう１本に相対してずれるようなオリゴヌクレオチドが選ばれるので、互い違いのアニーリングがあり、各オリゴヌクレオチドは相補的オリゴヌクレオチドの２つの分子の反対の末端にアニールする。多数の隣接したアニール端が酵素的に連結されると、各ＤＮＡ鎖のポリマーが形成される。必須ではないが、この方法の連結は熱安定リガーゼて行われ、温度循環プロトコールを用いることにより、方法の効率が改善される。連結段階が停止すると、分子の極端は互い違いのままであるが、ヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼで組込むか又は５ ′あるいは３′端が突き出ているかによっていくつかのＤＮＡポリメラーゼに関連した３′エキソヌクレアーゼ活性を用いて切断することにより平滑端に変換される。この時点でこれらのポリマーは、上記の他の方法のようにクローン化される。

長いポリマーを構築する最後の方法は、２本の相補的オリゴヌクレオチドのポリマーを化学的に合成し、次いでアニールされ、適切なベクターでクローン化されるものである。しかしながら、これらのオリゴヌクレオチドは互い違いの方法でもしばしばアニールするので、上記方法のようにクローン化する前に、末端を切断又は充填する必要がある。

長いポリマーが酵素又は他の方法により合成されると、反応又は合成産物は、バクテリオファージＭ１３ｍｐ系のもの又はｐＵ１８又はｐＵ１９由来のファージミド、例えば、ｐＴ７／Ｔ３α１８、ｐ　Ｔ７　／　Ｔ　３　ａ　１．９　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ＢＲＬ”　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）；　ｐ　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ｌｌ５Ｋ　＋／−P ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＫｓ　＋／−１ｐＢＣＳＫ　＋／−１ｐＢＣＫＳ＋／−及びｐＢＳ＋／−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　ＬａＪｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆ、）のような適切なベクターに連結される。次イテ、ベクターをＸＬＩ−Ｂｌｕｅ又はＳ　Ｕ　ＲＥ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような組換え欠損大腸で本明細書に引用する。上記合成の産物がかなりのサイズ範囲で変動するので、所望の数のモノマー反復のポリマーを含む細菌クローンを選ぶことが好ましい。

長いポリマーを所望する場合であっても、クローン化配列は上記方向性クローニングによりベクター内で反復複製される。次いで、均一なサイズ及び膜結合特性を有するポリマーの永久起源になるように、使用したクローンから細菌保存液が調製される。特定のオリゴヌクレオチドプローブのポリマーカ鐘ドツトプロットに使用することが望まれる場合には、細菌の多量のプラスミド標品の制限ヌクレアーゼ消化により調製される。少量の場合には、クローニング部位に隣接したプラスミドベクターに対してアニールするＴ３及びＴ　７　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プライマーを用いた酵素増幅法により、プラスミドからポリマーが増幅される。

所望のポリマーを含む全ベクターがこれに結合されることによって基質が調製され、従って、ベクターが修飾されて必要でないセグメントが除去され、結合ＤＮＡプローブ配列の割合を更に増大させることができることは言及されるべきである。

下記実施例においては、ＨＬＡ　ＤＱＢＩ遺伝子プロモーターのタンパク質結合領域のＤＮＡポリマーが合成される。

Ａ−ＤＱＢ１遺伝子プロモーターのＸ保存ボックスのメチル化保護領域の縦列反復を作るために、プライマー−鋳型として用いられるヌクレオチド配列を示すものである。プライマーは、第１プライマーの中心にタンパク質結合配列又は認識配列の尾部をおき、次の隣接配列の頭部を含めるように選んだ。また、ポリマーの多重認識配列の間に制限部位を作るために、約４〜８個以上のヌクレオチドがオリゴマー接続部に加えられる。図４に見られるように、ＴＡＴＣをタンパク質結合配列の３′及び５′端の両方に加えてＥｃｏＲＶ制限部位（ＧＡＴＡＴＣ）を作った。

また、プライマーの３′端は好ましくないプライマー人為産物を避けるために注意して選ばなければならない。本実施例においては、ＡとＴの伸長分子は、数塩基、例えば、ＣＴＡＧＡてプライマーの長さを伸ばすことにより３′端ではなくプライマーの中心近くに位置した。そのことにより合成オリゴヌクレオチドのサイズは、各々３１及び２８塩基に増え、これらを用いて２２個のヌクレオチドの長さの反復したポリマーを作成した。

図４に見られるように、増幅の第１ラウンドにより、４４塩基対を有する第１伸長産物を作成し、種々の互い違いのアニーリングが後の段階でポリマーサイズを漸進的に増大させる。

図４に図式的に示されている増幅を２段階で行った。第１段階では、９０℃で１分間変性、４４℃で１．５分間アニーリング及び７２℃で１．５分間伸長の４０サイクルを、５０＋ｎＭのＫＣｌ１０ｍＭのトリス−ＣＩ、ｐＨ８，３，１，５＋ｎＭのＭｇＣｌ２．０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、２００　μＭの各ｄＮＴＰ、３μＭの各プライマー及び２．０−２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ、　ＥＩＩＩｅｒｙｖｉｌｌｅ、　Ｃａ１ｉｆ、）を用いて最終容量１００μｍで行った。３本の試験管の物質（３Ｘ１００μｌ）をプールし、次いで、低融点アガロース（ＴＡＢバッファー中１．７％）で分離した。

４及び５反復ポリマー（ｍｅｒｓ）に対応する主要バンドを単離し、溶離し、濃縮した。

次いで、これらのポリマーを更に２５サイクル同じ条件を用いて第２増幅のプライマーと鋳型として用いた。得られた産物を濃縮し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ装置（Ａｓ＋１ｃｏｎ）で洗浄し、Ｔ４ポリ核酸キナーゼを用いて当該技術において周知の方法によりリン酸化した。次いで、リン酸化産物をＢ　Ｉｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｉ　Ｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｅｏＲＶ部位に連結し、Ｘ　Ｌ　１−Ｂ　Ｉ　ｕ　ｅ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で標準法を用いてクローン化した。

ポリマー挿入断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌｌで消化してベクターから切断し、１．６％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色で検出した。図５Ａは、Ｉｔ−７０反復ポリマーに相当するクローン化挿入断片のサイズ範囲を示すものである。ポリマー挿入断片をＥｃｏＲＶでも消化し、得られた産物を１２％アクリルアミドゲルで分離した。図５Ａのレーンｌは、ｌｋｂの基準ＤＮＡラダーを含んでいる。図５Ｂは、各挿入断片をＥｃｏＲＶて消化した結果を示すものである。本実施例においては、消化の条件は、大きな挿入断片が完全に消化されるようなものである。２２塩基対を含むモノマー単位及びその多量体か容易に見られる。

ポリマーが、変性後、ＮＹけａｎ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅ１１．　Ｋｅｅｎｅ、　Ｎ１（）に結合しかつ標識相補的ＤＮＡ試料と適切にハイブリッド形成する能力についても試験した。図６は、ＩＩＹＢＲＩ・ＤＯＴろ過マニホルド（ＢＲＬ）を用いて各列の左から右に量を増加させてＮｙｔｒａｎ膜に塗布したＤＮＡポリマーの増加量を示すものである。各カラムはＤＮＡ質量により同量を含有させたが、各列で用いたポリマーの反復数は上から下に増加している。上の列は、全試験ＤＮＡ配列に相同な対照として用いた。上の列は、全プローブ配列の相同な対照として用いた。ＤＮＡを膜に固定してＵＶ線を５分間露光した（ｕｖｐ　ＵＶ　トランスイルミネーター、　３０２ｎｍフィルター付、　Ｓａｎ　Ｇａｂｒｉｅｌ、　ＣＡ）。フィルターを図４のタンパク質結合領域を含むＨＬ　Ａ　ＤＱβプロモーターの２７５塩基対放射性標識検体ＤＮＡとハイブリッド形成した。

Ｔｕｒｃｏ、　［！、等、ＩＩＩＷｌｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　３２：１１７　（１９９０）参照。見られるように、最も長いプローブを用いて効率のよいハイブリッド形成が生じた。

本実施例で用いたモノマー、ポリマー及びアニールされた検体ＤＮＡのサイズは、本発明の逆ドツトプロットを行うのに典型的に用いられるものと同じものである。

」二記方法に従って作成したポリマー配列は、また、ＤＮＡ結合結合タンパクツアフィニティーカラム製するために用いられ、また、これらのＤＮＡ配列に結合するタンパク質をコードする遺伝子の探索用発現ライブラリーのスクリーニングに用いることができるプローブとしても用いられる。

下記実施例においては、本発明の方法に従って調製されたオリゴヌクレオチドのポリマーを逆ドソトブロッ（・法において結合リガンドとして用いた。

実施例２゜図７八に示されているＩ（ＬＡ−ＤＱＢｌ遺伝子の第２エキソンのコドン５７に中心のある８個のｉ（Ｌ　Ａ　−Ｄ　Ｑβ対立遺伝子に特異的なポリマーを作成するオリゴヌクレオチド（Ｍｏｒｅｌ、　Ｐ、等、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　（ＵＳＡ）　８５：８１１１　（＋９８８）参照、この開示を参考として本明細書に引用する）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｙｃｌｏｎｅ　Ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｍｉｌｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓ、）て合成した。図７Ａについて、■、ｗ、　ｘＳｙ及びＺは、左に示される種々のＤＱ β対立遺伝子で異なるヌクレオチドを表すものである。“ｔａｇａ”配列は、対立遺伝子特異的配列の反復の間にＢｇｌ１１部位を導入するために付加された。

Ｙ′、Ｗ′、Ｘ′、Ｙ′及びＺ′は、各々■、Ｗ、　Ｘ、Ｙ及びＺの相補的ヌクレオチドを表すものである。

ポリマーを実施例１のように構築し、クローン化した。ポリマー挿入断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌｌて消化することによりベクターから切断し、１．６％アガロースゲルで分離し、精製した。上記ＤＱβ対立遺伝子に対応する精製ポリマーが図８のアガロースゲルに見られる。最初と最後のレーンは、主要バンドが５８７塩基対である分子量マーカーを含んでいる。

コドン５７に中心のある同一オリゴヌクレオチドを特徴とする対立遺伝子対を区別するために、別の５個のポリマーをフィルターに加えることが必要である。

これらの付加オリゴヌクレオチドは別の可変セグメントを表すために選ばれる。

例えば、コドン２６に中心のあるセグメントを図７Ｂに示されている配列で用いた。他の位置の数ポリマーは、共通でない変異を区別するために必要である。ＸＩＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＨＬＡ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　（１９９０）；　Ｍａｒｓｈ、　ＳA　Ｇ、等。

ＨｕｎＩａｎ　Ｉａｗｎｕｎｏｌ、　３１＋２０７　（１９９１）参照、この開示を参考として本明細書に引用する。

図９Ａ及びＢは、従来のドツトプロット法（Ａ）及び本発明の方法（Ｂ）を用いて得られた結果を示すものである。例えばＤＱＢ　１　’　０３０１及びＤＱＢ　１　”　０３０２を区別するに当たり本発明の方法の感受性を証明するために、ピッツバーグの小児病院のインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）登録者のファミリー５５１４のメンバーを選んだ。Ｍｏｒｅｌ、　Ｐ、等、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　ＵＳＡ　８５：８１１１　（１９８Ｂ）及びＴｒｕｃｃｏ、　Ｇ、等。

Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３８：１６１７　（１９８９）参照、これらの開示を参考として本明細書に引用する。

コドン５７に１つの塩基の変化によってのみ相違があるこれらの対立遺伝子は、ＩＤＤＭに対する感受性の重要なマーカーとみなされる。同書。ファミリー５５１４は前もって血清学的に判定されており、この判定は家系で示されている。図９Ａに示されている結果は、図７Ａの１．４．６及び７列の配列に対応する放射性標識対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド用いた従来のドツトプロット得られた。同書。図９Ｂにおいては、代わりに増幅にビオチニル化プライマー及び非放射性ＦＬＡＳＨ検出系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて得られた結果である。

図９Ｂの結果は、前記図８に示されている種々のポリマーの滴定量（左から右に４０．１６。

６０ｇ）をスポ・川・したナイロンフィルター（ＦＬＡＳｔＬ　ＳｔｒａＬａｇｅｎｅ）を用いて得られた。

１〜８列は、図７Ａに示されている順序でコドン５７を包含するオリゴヌクレオチドのポリマーを含んでいる。９列は、負の対照として直線化プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ−、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の等価量を含んでいる。正の対照は、１０列である。このポリマーは、すべてのＤＱβｌ対立遺伝子が共有するアミノ酸４２にな独立した反応数を減少させる同時増幅を行うことにより実質的に減少させることができる。

一般的には、適切な対立遺伝子特異的ポリマーの非常に選択的な結合を保証しつつ、種々の同時増幅されたゲノムＤＮＡ伸長分子すべてを同時にハイブリッド形成するための最も適切な条件をめることが重要である。標準の逆ドツトプロット法においては、ヌクレオチド組成に基づいて同一融点を共有するように種々のオリゴヌクレオチドを選ぶことに注意を向けなければならない。このようにして、各プローブの所望の特異性をなお維持しつつ、厳重な同一条件をプローブすべてに対して用いることができる。これは、上記実験条件から不可能ではないが、本発明のポリマー標品に適切なオリゴヌクレオチドを選ぶに当たり、Ｗｏｏｄ、　Ｖｌ、　Ｉ。

等、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　（ＵＳＡ）　８２：１５８５　（１９８５）の方法を用いてより自由に得ることができ、この開示を参考として本明細書に引用する。

イオン条件を変更することにより、厳重なハイブリッド形成はＧ／Ｃ含量に依存しなくなり、温度とアニーリングセグメントの長さに関するだけである。このため、プローブポリマーは、アニーリングセグメントは一貫して同一サイズを有するように設計される。この方法は、ハイブリッド形成フィルターを室温において６ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで１回洗浄して過剰のプローブを除去し、次に室温において３，０Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、５０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄してナトリウムイオンをテトラメチルアンモニウムイオンに交換することを必要とする。次いで、フィルターを５７℃において同一溶液で厳重に洗浄する。調製してから、ポリマーの各々は洗液が予想したようにふるまうことを確かめるためにこれらの条件下で評価し、必要ならば、プローブの長さ又はその正確な位置を調整してポリマープローブすべてに最も一様な特徴を得る。

本発明のもう１つの態様は、ＤＮＡ標識化に対して放射性同位元素を危険のないトレーサーに置き換えることができることである。放射能の使用に関するすべての課題を取り除く有効な方法は、酵素増幅のプライマーを標識化するためにビオチン（ビタミンＨ）を用いるものである。修飾プライマーは、ＧｅｎｏｓｙｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、（Ｔｈｅ　ＷｏＯｄｌａｎｄｓ、　Ｔｅｘａｓ）のような多くの所で市販されている。また、ビオチニル化ヌクレオチドは、問題の種々のＤＮＡセグメントの酵素増幅で用いることができる。

Ｌａｎｇｅｒ、　Ｐ、等、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　（ＵＳＡ）　７Ｂ：６６３３　（１９８１）に記載されているように、アリルアミン１ルカーアームを介してピリミジン環のＣ−５位に共有結合したビオチン分子を含むチミジンオリゴヌクレオチドチミジン三リン酸の類縁体は既知であり、この開示を参考として本明細書に引用する。ｌｋｂ当たり５０分子のビオチンを含むポリヌクレオチドを作成することができる。これらのプローブは、ビオチン置換のない対照と同様の変性、再会合及びハイブリッド形成特性を有する。

ビオチンの多くの特徴のために、これらのプローブは放射性プローブより本発明の目的に適している。実際に、ビオチンとアビジン、卵白由来の６８，０００ダルトンの糖タンパク質との間の相互作用は、既知の最も高い結合定数の１つである（Ｋａ＋、　＝　ｔ　ｏ−ｌ５）。従って、ビオチニル化ＤＮＡ伸長分子は、ハイブリッド形成したＤＮＡにアビジンと結合した適切な指標分子を加えることにより簡単に認識することができる。このような指示薬は、蛍光色素、高電子密度タンパク質、酵素又は抗体とすることができる。アビジン分子の顕著な特徴は、ビオチン残基に結合することができる指標分子の数を増やすことができることであり、これにより検出が高められる。

別法として、マトリックスに固定したＤＮＡの特定の配列を検出あるいは位置を決めるために、抗ビオチン抗体をアビジンなしで用いることができる。例えば、ウサギ抗ビオチン抗体とフルオレセイン標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧあるいはアルカリ性ホスファターゼと結合した抗体を用いて無色の基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート又はニトロブルーテトラゾリウム塩［ＮＴＢ］）を紫青色沈澱に変えるプロトコールが開発され、これによりハイブリッド形成ビオチニル化ＤＮＡの位置が同定される。

非放射性ＤＮＡ標識化及び検出用キットも市販されている。それらの中の１つ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製のものは、同様の技術的方法を用いている：ｄＵＴＰをスペーサーアームを介してステロイドハプテンジゴキシゲニン（Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ）に結合する。アルカリ性ホスファターゼと結合した抗ジゴキシゲニン特異抗体及び適切な酵素触媒着色反応を用いた酵素結合イムノアッセイにより、ハイブリッド形成りＮＡを検出する。

最近になって化学発光検出系がビオチンとジゴキシゲニン修飾ヌクレオチドの双方を検出するのに利用されている。もう１つの非放射性検出キットは、化学発光法を用いてビオチニル化ＤＮＡを検出するＦ１ａ５ｈ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。化学発光基質は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒぬ曲ｈｅｉｍキットにも有効である。ビオチン又はジゴキシゲニンは、また、光反応性ビオチン又はホトジゴキシゲニン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉＩｌｌ）を用いて合成した後、検体ＤＮＡに結合させることもてきる。

更に別の検出法は、検出系の酵素を結合させることを含んでいる。このような酵素は、オリゴヌクレオチドプライマーあるいは合成後の検体ＤＮＡに結合することができる。この方法は、酵素アルカリ性ホスファターゼをアミノ修飾オリゴヌクレオチドプライマー又は組込まれているデオキシリボヌクレオチドに結合した後、化学発光基質で処理するＬｉｇｈｔｓｍｉ　ｔｂＩ標識系（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓ、）を用いて行われる。

上記検出方法は、放射能を使用するものより多くの利点を有する。例えば、結果を短時間で利用でき、プライマーが安定であるので各回毎に新たに調製する必要がない。更に、危険でない物質のみを使用するので、いかなる実験室でもこれらの方法を行うことができる。

この方法は、放射性標識の使用により示される多くの課題を解決し、プローブのポリマーをハイブリッド形成することにより非常に高いシグナルを生じることから、本発明の方法において用いることができる。本明細書で記載される試薬及び方法はすべて自動システムに組込むことができるので、増幅された産物のすべてを単一フィルターに対してハイブリッド形成しかつ結果が自動的に説明されることにより、完全クラス１１又は他の判定を得ることができる。このような自動化により、完全な判定に関与するマニュアル操作が著しく減り、各判定で生じる大量のデータの正確な解釈が容易になる。必要なプローブのポリマーをすべて含むフィルターを予め作っておくことにより、仕事を減らすことができる。適切なポリマーとそれらの組合わせが決定されると、ロホットのワークステーションでドツトプロット法が容易に行われ、多くのフィルターが自動的に調製される。従って、一定の判定用キットは、必要とされるプローブ及び標準化鋳型をすべて結合する基質を含み、結果を説明することができる。

結果の解釈は、コンピュータに直接生のデータを入力する走査装置を用いて自動化することができる。これを行うために、フィルターに関する正負のシグナル強度をできるだけ標準化することが重要である。正負の反応を区別するために、コンピュータは、ＤＲαポリマー及び大腸菌ＤＮＡのような増幅されたヒトセグメントに類似性のないＤＮＡに対して共に常に正の反応によって生じるシグナル強度を表す。プローブの個々のポリマーの場合には、標識ＤＮＡが正しくハイブリッド形成際に正のシグナルが一様な強度を有するように、フィルターに付着される正確な量を調整する必要がある。そのシステムにより、正負の反応を適切に同定することができると、フィルター上の正のスポットの位置を用いて対応する特異性がめられる。単一オリゴヌクレオチドポリマーによって特に認識することができない対立遺伝子に特異的なパターンだけを作成することがしばしば必要であるので、コンピュータは２又は３種類の位置で正のスポットの存在を関係付けることもてきるようにプログラムされなければならない。これらの状況の典型がＤＲβである。十分な内部制御に基づいて、正のスポットの位置を慣用の完全なＨＬＡクラス［Ｉ判定に自動的に変換する簡単な演算法を設計することができる。

上記の方法及び実施例は、決してＨＬＡクラス１■判定に限定されるものではない。本発明の方法は、例えば、膵嚢胞性繊維症、マルファン症候群、筋ジストロフィー、ヘマグロビノパシーズ、２１−ヒドロキシラーゼ欠損症又は具体的な配列変化が知られるようになる他のケースに見られる遺伝子異常配列の検出に同様に適用できる。

具体的に説明するために本発明を詳細に記載してきたが、その詳細は単にそのためのものであり、請求の範囲で限定されるほかは本発明の真意及び範囲を逸脱することなく、その中で当業者によって変更がなされることは理解されるべきである。

５’ＡＡ３’　＋　３１Ａ’ＡＴ５’ 二量体　二量体５’ＡＡ會３’５’ＡＡ３’５’ＡＡ３’３　＋　ｉ＝　ＡＩ　ＡＩ　５＋　３１　ＡｌＡｌ　５１　３１ＡＩ　ＡＬ　５１３Ｉ★ａ’ＡメＡ’５’３’＊★ａ ’Ａ’Ａ’５’３’電會Ａ’Ａメ５Ｉ四量体　二量体　四量体ＦＩＧｔＪＲＥ　２Ａ５’ＡＢＣ３’＋３’Ｃ’Ａ’５’ ↓ ＦＩＧＵＲＥ　５Ａ　ＦＩＧＵＲＥ　５Ｂ’ｏｓ　・　・　拳　書ＦＩＧｔＪＲＥ　６ＦＩＧＵＲＥ　７ＡＦＩＧＵＲＥ　７ＢＦＩＧＵＲＥ　８ファミリー　５５１４ＦＩＧＵＲＥ　９八ファミリー５５１４ＦＩＧ［ＪＲＥ　９ＢプライマーＦＩＧＵＲＥ　１１

Claims

【特許請求の範囲】

１．核酸配列の有無を検出する方法であって：検出されるべき核酸配列の領域に相補的な選択オリゴヌクレオチドプローブのポリマーを基質に結合し；該プローブポリマーが結合される該基質をリポーター部分組込まれている未知のオリゴヌクレオチド配列を含む増幅された検体ＤＮＡ試料と接触させて、相補的ヌクレオチド配列をアニールし；該基質を洗浄してアニールされない増幅された検体ＤＮＡを該基質から除去し；該基質上にオリゴヌクレオチドプローブによって保持されたリポーター部分の有無を検出する；ことを含む方法。
２．該基質がナイロン膜である請求項１記載の方法。
３．該基質がニトロセルロース膜である請求項１記載の方法。
４．該選択オリゴヌクレオチドプローブポリマーが下記段階によって合成される請求項１記載の方法：（ａ）逆向きでありかつ３′端で相補性を共有し、双方が直接あるいは相補的ヌクレオチドとして選択オリゴヌクレオチドプローブ配列及び隣接のモノマー単位の十分な数のヌクレオチドを組込む完全なモノマー単位の配列を形成する２本のオリゴヌクレオチドプライマーをアニールすると、該プライマーが３′端でアニールし、該プライマーの５′端がアニールされずかつ第１伸長産物の合成の鋳型として機能し；（ｂ）該プライマーをデオキシリボヌクレオチドの存在下にＤＮＡポリメラーゼで処理して各鋳型に相補的な各プライマーの第１伸長産物を合成し；（ｃ）該相補的第１伸長産物を変性により分離して１本鎖分子を作製し；（ｄ）該第１伸長産物の相補鎖を互い違い配列の３′端でアニールすると、５′端がアニールせずかつ前の伸長産物を更に伸長するための鋳型として機能し；（ｅ）該アニール鎖をＤＮＡポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチドを用いて処理して２本鎖伸長産物を合成し；（ｆ）該相補的伸長産物を変性により分離し；（ｇ）段階（ｄ）〜（ｆ）を段階（ｆ）の伸長産物を用いて繰り返して各々が反復した連続的に長い伸長産物を作製する。
５．段階（ｃ）後、更に下記段階を含む請求項４記載の方法：（ｃ′）第１伸長産物の付加分子が鋳型として第１伸長産物の１本鎖を用いて合成されるような条件下、段階（ｃ）で作成された１本鎖第１伸長産物を段階（ａ）のプライマーで処理し；（ｃ′′）段階（ｃ）と（ｃ′）を任意に繰り返して第１伸長産物の量を増加させる。
６．該変性が加熱によるものである請求項４記載の方法。
７．該第１伸長産物に実質的に等価な長い出発オリゴヌクレオチドプライマーを用いて段階（ａ）−（ｃ）を削除する請求項４記載の方法。
８．段階（ｄ）のアニーリングが生じる十分な濃度の第１伸長産物がある場合、各段階の産物を精製しないで段階（ｇ）の反復が段階（ｃ）と（ｃ′）の反復と同時に生じる請求項５記載の方法。
９．該ＤＮＡポリメラーゼが大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれる請求項４記載の方法。
１０．該ＤＮＡポリメラーゼがサーマスアガチクスＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカスリトラリスＤＮＡポリメラーゼ及びビロコッカスフリオサスＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれた熱安定ＤＮＡポリメラーゼであり、段階（ｇ）の反復サイクルがアニーリング、伸長及び変性に適切な温度から逐次反応温度を循環することにより達成される請求項４記載の方法。
１１．下記段階：適切なベクター内で２本鎖プライマー伸長最終産物をクローン化する、を更に含む請求項４記載の方法。
１２．該クローン化プライマー伸長産物を該ベクター内で方向性クローニングにより反復複製してベクター内に挿入したプローブ配列の量を更に増加させる請求項１１記載の方法。
１３．該ベクターがｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９又はバクテリオファージＭ１３ｍｐ系由来のものである請求項１１記載の方法。
１４．２本鎖プライマー伸長産物をクローン化するｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９又はバクテリオファージＭ１３ｍｐ系由来のベクター。
１５．該クローン化プライマー伸長産物を該ベクター内で方向性クローニングにより反復複製する請求項１４記載のベクター。
１６．請求項１４記載のベクターを移入した細菌培養物。
１７．請求項１５記載のベクターを移入した細菌培養物。
１８．大量のプライマー伸長産物ポリマーの生産方法であって：請求項１６記載の細菌を培養し；ポリマーを含むベクターを回収し；挿入ポリマーを制限エンドヌクレアーゼで切り出す；ことを含む方法。
１９．大量のプライマー伸長産物ポリマーの生産方法であってれ：請求項１７記載の細菌を培養し；ポリマーを含むベクターを回収し；挿入ポリマーを制限エンドヌクレアーゼで切り出す；ことを含む方法。
２０．選択オリゴヌクレオチドプローブのポリマーを含む全ベクターを該基質に結合する請求項１記載の方法。
２１．該ベクターを非必須セグメントを除去することにより修飾して結合ＤＮＡプローブ配列の割合を更に増加させる請求項２０記載の方法。
２２．該ポリマーが１本鎖ＤＮＡである請求項１記載の方法。
２３．該リポーター部分が３２Ｐ、ビオチン及びジゴキシゲニンの中から選ばれ、該増幅産物を合成する前に該リポーター部分を該プライマーの１又は２本に結合する請求項１記載の方法。
２４．該増幅産物が、該産物を合成した後にリポーター部分を結合することにより修飾される請求項１記載の方法。
２５．該リポーター部分が検体ＤＮＡに共有結合する酵素であり、該酵素が検出系の一部として機能する請求項１記載の方法。
２６．検出されるべき核酸配列の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブの長い選択ポリマーが結合される基質。
２７．該ポリマーの各々のモノマー単位が約１２−２０個のヌクレオチドを含み、各ポリマーが約２００−２０００塩基対を含む請求項２６記載の基質。
２８．該長い選択ポリマーがＨＬＡＤＱ、ＤＲ及びＤＰクラスＩＩα及びβ対立遺伝子の特定オリゴヌクレオチドからなる請求項２７記載の基質。
２９．核酸配列の有無を検出する方法であって：請求項２８記載の基質をリポーター部分が組込まれている未知のオリゴヌクレオチド配列を含む増幅された検体ＤＮＡ試料と接触させて、相補的ヌクレオチド配列をアニールし；該基質を洗浄してアニールされない増幅された検体ＤＮＡを該基質から除去し；該基質上にオリゴヌクレオチドプローブによって保持されたリポーター部分の有無を検出する；ことを含む方法。