NL1006733C2 - Werkwijze voor het bepalen van genetische polymorfismen. - Google Patents

Description

Korte aanduiding: Werkwijze voor het bepalen van genetische polymorfismen.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van genetische polymorfismen binnen een of meer allelgedeelten, allelen of allelklassen van een biologische soort, met behulp van het op een drager vormen 5 en identificeren van volledige hybriden tussen a) enkelstrengs nucleinezuren, waarvan de sequentie overeenkomt met tenminste een gedeelte van de allelgedeelten, allelen respectievelijk allelklassen, dat een of meer te bepalen polymorfismen omvat, en 10 b) onderscheidenlijke sequentie-specifieke oligonucleotide proben, die elk de sequentie van een of meer te bepalen polymorf ismen omvatten, waarbij de nucleotidensequenties van de allelgedeelten/allelen, respectievelijk allelklassen ter plaatse van de te bepalen polymorf ismen tenminste bekend zijn 15 over de lengte van de te vormen hybride.

Onder genetische polymorfismen binnen een gen worden de verschillende voorkomende nucleotiden-sequenties in dat gen verstaan. Zo zijn er in bepaalde genen bepaalde plaatsen, "hot spots" genaamd, waarin veel genetische variatie wordt 20 aangetroffen. De variatie kan zich in een individu uiten, doordat een bepaald polymorfisme voor een bepaald aminozuur codeert, terwijl een ander polymorfisme binnen dat gen voor een ander aminozuur codeert, waardoor er in verschillende individuen op basis van dit polymorf ismeverschil verschillende 25 eiwitten kunnen worden gevormd. Op basis van zulk genpolymor-fisme kan een eiwit van het ene individu door een ander individu als lichaamsvreemd worden erkend.

Het vaststellen van de aanwezigheid van genetische polymorfismen is derhalve van groot belang in bijvoorbeeld 3 0 weefseltype-bepaling, hetgeen bijvoorbeeld een grote rol speelt bij het vinden van geschikte donororganen bij transplantatie in een ontvangende gastheer om de kans op afstoting van het donororgaan te minimaliseren, in het bepalen van verhoogde gevoeligheid voor een aandoening, met genetische predispositie, 1 ü o 6 7 3 3 2 zoals bijvoorbeeld het op latere leeftijd optreden van kanker of auto-immuun-ziekten, voor het optimaliseren van fokprogram-ma's bij bijvoorbeeld vee en huisdieren, bij criminologisch onderzoek, en voor bijvoorbeeld ouderschapsbepaling.

5 De huidige technieken voor het bepalen van het weefseltype ("tissue typing") vindt veelal plaats door toepassing van antilichamen die in staat zijn, een bepaald polymorfisme of groep polymorfismen te herkennen. Deze werkwijze is echter omslachtig, vergt veel tijd (die bij veel transplantaties 10 bijvoorbeeld niet beschikbaar is) en levert onnauwkeurige resultaten op, omdat de betrokken antilichamen diverse polymorfismen niet van elkaar kunnen onderscheiden. Voorts is het verschaffen van de antilichamen een tijdrovende en kostbare aangelegenheid, waarbij de voorraad van de toegepaste 15 antilichamen uitgeput kan raken, zodat er steeds behoefte is aan nieuwe antilichamen, die voor toepassing ervan telkens opnieuw dienen te worden gekarakteriseerd. Voorts dienen de antilichamen vanwege de voortdurende internationale uitwisseling van materiaal ook internationaal te worden 20 gestandaardiseerd. Bovendien is het uitvoeren van controlebepa-lingen, onder toepassing van cellen, waarvan het te onderzoeken polymorfisme bekend is, onontbeerlijk.

Het bepalen van genetische polymorf ismen met behulp van antilichamen is derhalve, gezien de onnauwkeurigheid en lange 25 tijdsduur die nodig is voor het verkrijgen van de resultaten, ontoereikend voor bijvoorbeeld het vaststellen van bepaalde genetische polymorfismen bij een donororgaan en bij ontvangerpatiënten, omdat in een dergelijk geval zo min mogelijk verschil in polymorfismen van relevante allelklassen, 3 0 met name de HLA klassen dient op te treden. Ook kan het bepalen van de genetische polymorfismen met behulp van antilichamen niet worden geautomatiseerd, waardoor voor het uitvoeren van de bepalingen goed opgeleid personeel noodzakelijk is.

Om de nadelen van de werkwijzen met antilichamen te 35 overwinnen, wordt er in het vakgebied intensief gezocht naar een werkwijze waarbij genetische polymorfismen kunnen worden bepaald op basis van genomisch DNA. Een dergelijke werkwijze 1 0 0 6 7 3 3 3 wordt beschreven in een wetenschappelijke publikatie van Williams et al. (F. Williams et al.., Tissue Antigens 1997: 49: 129-133). In deze publikatie wordt menselijk genomisch DNA van onderscheidenlijke bronnen onderworpen aan vermeerde-5 ring in een PCR reactie, onder toepassing van een voorwaartsge-richte en een achterwaarts gerichte oligonucleotide-primer, welke primers hybridiseren met het gebied rond de intronl-exon2-grens en met het gebied rond de exon3-intron3-grens van de HLA-A*02-allelsubklasse. In de HLA-A*02-allelsubklasse 10 zijn in deze gebieden geen polymorfismen bekend.

Het vermeerderd DNA, dat aldus de coderende sequentie van exons 2 en 3 bevat, werd vleksgewijs geïmmobiliseerd op een nylon membraan als drager. Deze drager werd vervolgens onderworpen aan hybridisatie met sequentie-specifieke 15 oligonucleotide proben met variabele lengte, waarvan de sequenties bekend waren en overeenkwamen met de vast te stellen polymorfismen. De proben waren gemerkt met een chemoilumi-nescerende merker. De polymorfismen werden bepaald door het vermeerderd DNA, op het nylon membraan gebonden, te onderwerpen 20 aan een hybridisatiebehandeling met een eerste sequentie-specif ieke oligonucleotide-probe, die een bepaald bekend polymorfisme omvatte.

Na hybridisatie werd de membraan onder dusdanig stringente omstandigheden gewassen, dat de probe slechts gepaard bleef 25 met het op de membraan gebonden DNA, wanneer dit DNA de met de probe overeenkomstige polymorf ismen bevatte. Na vaststelling of het onderzochte polymorfisme al dan niet aanwezig was, werd de probe van het aan de membraan gebonden DNA door denatureren verwijderd, en werd het aan de membraan gebonden 30 DNA onderworpen aan een tweede oligonucleotide-probe, waarvan de sequentie overeenkwam met een ander polymorf isme. Op deze wijze werden 19 proben via elkaar afwisselende denaturatie-en hybridisatiestappen na elkaar aan het aan het membraan-gebonden DNA gehybridiseerd, waarbij 13 varianten van 17 3 5 bekende HLA-A*02-allelvarianten konden worden bepaald. Deze werkwijze is derhalve onvolledig en bovendien tijdrovend, omdat voor elk toegepaste sequentiespecif ieke oligonucleotide- 1 0 0 6 7 3 3 4 probe de optimale hybridisatie-omstandigheden kunnen variëren en dienen afzonderlijk proefondervindelijk te worden vastgesteld. Voorts dient het genetisch materiaal van de bron, waarvan de genetische polymorfismen dienen te worden 5 vastgesteld ten behoeve van deze bepaling te worden geïmmobiliseerd op een drager. Bovendien is voor elk polymorfisme dat met een aparte probe dient te worden vastgesteld een aanvullende denaturatie-hybridisatiestap noodzakelijk. Voorts is het met de werkwijze volgens Williams 10 slechts mogelijk om een beperkt aantal polymorf ismen uit een beperkt aantal HLA-allelen te onderzoeken. De polymorf ismen, die buiten het door PCR vermeerdere gebied liggen, waaronder ook de allelgebieden, die bij de vermeerderingsreactie met de oligonucleotide-primers binden, kunnen niet worden 15 vastgesteld.

De onderhavige uitvinding lost de bovengenoemde problemen op en wordt daartoe gekenmerkt, doordat men de enkelstrengs nucleinezuren merkt, de onderscheidenlijke sequentie-specifieke oligonucleotide-proben gescheiden van elkaar op één of meer 20 dragers immobiliseert en men volledige hybriden vormt tussen de gemerkte enkelstrengs nucleinezuren en de geïmmobiliseerde oligonucleotide proben.

Door de onderscheidenlijke sequentiespecifieke oligonucleotide-proben op een drager te immobiliseren, kunnen alle 25 te bepalen polymorfismen uit een bepaalde bron genomisch materiaal met één hybridisatiestap worden vastgesteld. Immobiliseren van een oligonucleotideprobe op een drager is bijvoorbeeld mogelijk door de proben covalent met de drager te binden. Het is echter eveneens mogelijk de betreffende 30 proben op een drager te synthetiseren, hetgeen in deze aanvrage eveneens als immobiliseren op de drager wordt beschouwd. Voorts is de drager opnieuw te gebruiken, door het gehybridiseerde materiaal door middel van een denaturatie van de geïmmobiliseerde proben te verwijderen. Men kan aldus in genetisch 35 materiaal van verschillende oorsprong, bijvoorbeeld van verschillende individuen, dezelfde genetische polymorf ismen snel, betrouwbaar en volledig vaststellen.

1 o 0 6 7 3 3 5

Voor het bepalen van polymorfismen kan elk genetisch materiaal-bevattend monster van elke willekeurige biologische soort worden gebruikt, zolang de te onderzoeken allelgedeel-ten/allelen/allelklassen waarin de polymorfismen dienen te 5 worden bepaald, aanwezig zijn. De nucleotiden-sequenties van de allelgedeelten, allelen, respectievelijk de allelklassen ter plaatse van de te bepalen polymorf ismen dienen tenminste bekend te zijn over de lengte van de met de betreffende oligonucleotide probe te vormen volledige hybride. Het 10 genetisch materiaal kan bijvoorbeeld zowel genomisch DNA als RNA zijn.

De enkelstrengs nucleinezuren kunnen van de te onderzoeken allelgedeelten/allelen/allelklassen worden afgeleid door een amplificatiereactie, zoals die in het vakgebied bekend zijn, 15 zoals bijvoorbeeld de PCR-werkwijze bij een DNA-bron of de RT-PCR-werkwij ze bij een RNA-bron, selectief uit het genetisch materiaal-bevattend monster worden vermeerderd door gebruik te maken van sequentie-specifieke primerparen, die ieder specifiek met bepaalde sequenties op het genetisch materiaal 20 hybridiseren ("primen"), welke sequenties de te onderzoeken allelgedeelten/allelen/allelklassen flankeren. Bij voorkeur bevatten deze flankerende sequenties zelf geen of nagenoeg geen polymorfismen, omdat hierdoor de specificiteit van de betreffende primer wordt verlaagd, en/of geen optimale 25 primingshybridisatie plaatsvindt, hetgeen een verlaagde opbrengst in de vermeerderingsreactie tot gevolg kan hebben.

Van het dubbelstrengs vermeerderingsproduct, ook wel amplicon genoemd, worden in een uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding enkelstrengs 30 gemerkte nucleinezuren afgeleid, waarvan de sequentie overeenkomt met een van de strengen van het amplicon. Dit kan bijvoorbeeld plaatsvinden door de strengen van het amplicon te scheiden, waarna een van de afzonderlijke strengen vervolgens wordt gemerkt met behulp van een algemeen in het 35 vakgebied bekende markeringswijze, zoals het kinaseren van de 5' uiteinden van de betreffende streng. Bij voorkeur wordt het amplicon echter als matrijs gebruikt voor de synthese 1006733 6 van een gemerkt enkelstrengs nucleinezuur onder toepassing van bijvoorbeeld gemerkte nucleotiden tijdens de synthese. Zo kan men een gemerkt enkelstrengs DNA bereiden door het amplicon nogmaals aan een PCR-reactie bloot te stellen, waarbij 5 een van de voorheen gebruikte PCR-primers als enkele primer worden gebruikt. Uiteraard kan men ook een andere primer gebruiken, al naar gelang het beoogde gemerkt enkelstrengs nucleinezuur. Ook kan men hiertoe een gemerkt enkelstrengs RNA bereiden, hetgeen de voorkeur kan verdienen omdat een 10 RNA-DNA-duplexinteractie sterker is dan die van een DNA-DNA-duplex, hetgeen bij de hybridisatie met proben (zie hierna) van belang kan zijn. Hiertoe kan een van de in de amplificatie-reactie toegepaste primers een sequentie omvatten, die overeenkomt met bijvoorbeeld een promotorsequentie, die 15 geschikt is voor bijvoorbeeld in vitro-transcriptie, zoals de T3-, T7- of de SP6-promotorsequentie. Het verkregen amplicon kan op een in het vakgebied bekende wij ze worden onderworpen aan een in vitro-transcriptiereactie, waardoor gemerkt enkelstrengs RNA kan worden verkregen, dat sequenties van 2 0 de te bepalen polymorf ismen omvat. Het verkregen enkelstrengs RNA kan op eenvoudige wijze willekeurig worden gekliefd in kleinere fragmenten van een in hoofdzaak nagenoeg homogene lengte, hetgeen eveneens van voordeel is bij genoemde hybridisatie (zie hierna).

25 In de aanvrage wordt overigens met "overeenkomstige sequentie" een sequentie bedoeld, die ofwel een gelijke sequentie omvat als de sequentie waarnaar in het geval wordt verwezen, ofwel een daaraan conplementaire sequentie; de vakman zal in alle gevallen echter direct begrijpen of het een 30 gelijke, dan wel de complementaire sequentie betreft.

Het gemerkt enkelstrengs nucleinezuur bevat de sequent ie-informatie die de te bepalen polymorf ismen omvat. Ter bepaling van de polymorf ismen worden sequentie-specifieke oligonucleoti-denproben met een bepaalde lengte op een in het vakgebied 35 bekende wijze bereid, welke proben elk ten minste een base omvatten die met een te bepalen polymorfisme overeenkomt. Verschillende proben, waarvan de sequentie overeenkomt met 1 u 0 6-7 3 3 7 de verschillende te onderzoeken polymorfismen worden aan een of meer dragers, zoals een membraan of glas, gekoppeld. Hiervoor zijn in het vakgebied eveneens vele mogelijkheden bekend. Op de drager bevinden zich aldus sequentie-specifieke 5 proben, die overeenkomen met de te bepalen polymorf ismen die aanwezig zijn in het gemerkte enkelstrengs nucleinezuur.

Het gemerkte enkelstrengs nucleinezuur laat men met de proben hybridiseren, waarna men de gevormde hybriden aan dusdanig stringente omstandigheden blootstelt, dat slechts 10 volledige hybriden gepaard blijven. Deze omstandigheden zijn door de vakman eenvoudig vast te stellen; veelal ondergaan de hybriden een of meer wasstappen, waarin temperatuur en ionenconcentratie van het wasmedium al naar gelang de stringentheid worden gevarieerd. Aldus blijven alleen de 15 hybriden bestaan, die over de gehele lengte van de betreffende probe zijn gebasenpaard, hier "volledige hybriden" genoemd. Wordt een volledig hybride op de drager vastgesteld, betekent dit, dat het polymorfisme, dat door het betreffende oligo wordt vertegenwoordigd, in het genetisch materiaal van het 20 onderzochte monster aanwezig moet zijn geweest.

Alle op de drager aanwezige volledige hybriden kunnen aldus eenvoudig worden geïdentificeerd; wordt bijvoorbeeld een radioactief gemerkt enkelstrengs nucleinezuur toegepast, dan kan identificatie plaatsvinden door het uitvoeren van 25 autoradiografie of fosfor-beeldverwerking ("fosfo-imaging"). Er zijn echter veel markeringswijzen, die in het vakgebied bekend zijn, geschikt, zolang de identificatie van volledige hybriden mogelijk is. Identificatie houdt in, dat een waargenomen volledige hybride kan worden toegeschreven aan 3 0 een bepaalde probe.

Door het identificeren van alle volledige hybriden kunnen alle polymorfismen, aanwezig in het gemerkte enkelstrengs nucleinezuur en die door de proben worden vertegenwoordigd, worden geïdentificeerd.

35 Met behulp van een computer kunnen de geïdentificeerde polymorf ismen nader worden onderzocht en worden toegeschreven aan een bepaald allel(gebied), zodat het bij voldoende 1006733 8 polymorfismegegevens mogelijk is, de identiteit van de in het onderzochte monster aanwezige allelen vast te stellen, bijvoorbeeld door het opnemen van alle mogelijke bestaande polymorfismen en polymorfismecombinaties in een computerbestand 5 en het met de computer vergelijken van de geïdentificeerde oligonucleotiden met de in de computer ingevoerde en opgeslagen combinaties.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt het aantal oligonucleotide-proben zodanig gekozen, dat in 10 hoofdzaak alle in de allelgedeelten/allelen bekende te bepalen polymorfismen in de oligonucleotiden zijn opgenomen. Op deze wijze kunnen alle voor het betreffende allel\allelgedeelte bekende polymorfismen met één hybridisatiestap worden bepaald. Indien men slechts een selectief aantal polymorfismen van 15 de te onderzoeken allelgedeelten\allelen\allelklassen wenst te bepalen, kan men een overeenkomstig kleiner aantal oligonucleotiden-proben toepassen, zolang alle polymorfismen die men wenst te bepalen in de toegepaste oligonucleotiden-proben zijn vertegenwoordigd.

20 Een bepaald polymorfisme is fysiologisch bijvoorbeeld van minder belang, wanneer deze bijvoorbeeld gelegen is binnen een intron, of binnen een signaal sequent ie (waarin eveneens veelal een groot aantal polymorfismen worden aangetroffen) en dus niet tot expressie wordt gebracht, of wanneer een 25 polymorfisme zich op een zodanige plaats in de coderende sequentie bevindt, dat nucleotidevariatie op deze plaats vanwege de degeneratie van de genetische code geen uitwerking heeft op het gevormde eiwit en het polymorfisme derhalve geen fysiologisch belang heeft. Een dergelijke overweging kan een 30 rol spelen bij het vaststellen van polymorfismen bij orgaantransplantaties. Voor bijvoorbeeld criminologisch onderzoek kan echter elk polymorfisme, onafhankelijk van de expressie van het betreffende allelgedeelte, allel of allelklasse en fysiologisch belang daarvan, beslissend zijn; 3 5 dan kan het van voordeel zijn een of meer polymorfismen in bijvoorbeeld een of meer introns en/of de signaalsequentie van een bepaald allel of allelklasse te bepalen.

1 0:0 6 7 3 3 9

Bij voorkeur zijn de smelttemperaturen van de volledige hybriden nagenoeg gelijk. Dit kan bijvoorbeeld worden bereikt, door de proben qua lengte en GC/AT-gehalte op elkaar af te stemmen, hetgeen de vakman bekend is. Hierdoor zullen de 5 smelttemperaturen van volledige hybriden van deze proben binnen een klein temperatuursgebied variëren, hetgeen bevorderlijk is voor het verkrijgen van in hoge mate betrouwbare resultaten bij het uitvoeren van een enkele wasstap na hybridisatie, waarbij alle onvolledige hybriden onder dezelfde omstandigheden 10 worden opgeheven terwijl volledige hybriden in stand blijven.

Om de smelttemperaturen van de verschillende proben nog dichter bij elkaar te brengen, waardoor men nog beter in staat is de stringentheid van de wasomstandigheden zeer nauwkeurig te specificeren, worden de oligonucleotide-proben bij voorkeur 15 zodanig ontworpen, dat de sequentie voor het te onderzoeken polymorfisme zich nabij het midden van het betreffende oligo bevindt. Indien er twee polymorf ismen binnen dezelfde probe zijn gelegen, liggen deze beide bij voorkeur eveneens zo veel mogelijk rond het midden van de betreffende probe.

2 0 Gebleken is, dat volledige hybriden op betrouwbare wijze kunnen worden verkregen onder toepassing van een of meer wasstappen, waarvan de omstandigheden in principe voor alle hybriden gelijk zijn, wanneer de sequent ie-specifieke proben een lengte hebben tussen 8 en 15 nucleotiden, met nog meer 25 voorkeur van 9-10 nucleotiden.

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding worden de gemerkte enkelstrengs nucleinezuren alvorens met de sequentiespecifieke proben te worden gehybridiseerd, gekliefd in fragmenten tussen 8 en 100 nucleotiden. Fragmenten 30 met een dergelijke grootte zijn het meest bruikbaar voor hybridisatie. Geschikte klievingwerkwijzen zijn in het vakgebied bekend. Indien de gemerkte enkelstrengs nucleinezuren bijvoorbeeld RNA-moleculen zijn, kunnen deze in fragmenten met genoemde grootte worden gekliefd door incubatie in 35 bijvoorbeeld 30 mM MgCl gedurende 30 min bij 94 °C.

Bij voorkeur worden de enkelstrengs nucleinezuren gekliefd in fragmenten, waarvan de lengte in hoofdzaak gelijk is aan 1 0 Ο,β 7 3 3 10 de lengte van de geïmmobiliseerde oligonucleotide-proben. Optimale hybridisatie vindt plaats, wanneer de hybridiserende partners, in dit geval de sequentiespecifieke oligonucleotide-probe en een overeenkomstig enkelstrengs nucleïnezuurfrag-5 ment,een gelijk aantal basen bezitten: een korter enkelstrengs nucleïnezuur zal onder de toegepaste stringente omstandigheden niet aan de betreffende probe gehybridiseerd blijven, omdat hierbij alleen volledige paren gehandhaafd blijven. Indien de gemerkte enkelstrengs nucleinezuren groter zijn dan de 10 proben, bestaat de kans, dat het betreffende gemerkte enkelstrengs nucleïnezuur complementaire gebieden heeft, waardoor het aan twee verschillende oligonucleotide-proben kan hybridiseren. Wanneer er bijvoorbeeld een hardnekkige aanwezige secundaire structuur aanwezig is in de sequentie 15 die complementair is aan één van beide proben, zal er minder hybridisatie aan de desbetreffende probe plaatsvinden en zal het gemerkte enkelstrengse nucleïnezuur met voorkeur aan de probe hybridiseren, waarin de vorming van secundaire structuren een mindere rol speelt. Er kan hierdoor een ongewenste 20 signaalonderdrukking respectievelijk signaalversterking plaatsvinden, waardoor in het eerste geval een polymorfisme ongedetecteerd kan blijven.

Bij voorkeur worden de gemerkte enkelstrengs nucleinezuren verkregen door de een of meer allelgedeelten/allelen aan een 2 5 amplif icatiereactie te onderwerpen met behulp van hybridisatie van tenminste een sequentie-specifieke voorwaarts gerichte en tenminste één sequentie-specifieke achterwaarts gerichte oligonucleotide primer voor het verkrijgen van tenminste een dubbelstrengs amplicon, waarin de te bepalen polymorfismen 30 aanwezig zijn en men enkelstrengs nucleinezuren van het amplicon afleidt, waarvan de sequentie overeenkomt met tenminste een gedeelte van een van beide strengen van het amplicon, in welke nucleinezuren de te bepalen polymorf ismen aanwezig zijn. De enkelstrengs nucleinezuren kunnen dan op 35 een bovenbeschreven wijze worden gemerkt.

Bij voorkeur bevatten de gebieden van de een of meer allelgedeelten/allelen die met genoemde voorwaarts en 1 o 0 6 7 3 3 11 achterwaarts gerichte primers hybridiseren in hoofdzaak geen polymorfismen. Door deze in hoofdzaak polymorfisme-vrije gebieden voor aanhechting van de primers toe te passen, kan met eenzelfde primerpaar amplicons uit een groot aantal, zo 5 niet alle gewenste allelgedeelten/allelen/allelklassen worden bereid. Bovendien waarborgen deze in hoofdzaak polymorf isme-vrije gebieden een goede aanhechting van de primers. Voorts hoeven geen polymorfismen onopgemerkt te blijven, aangezien de primers dergelijke polymorfismen door hybridisatie niet 10 zullen afdekken.

In een volgende uitvoeringsvorm van de werkwij ze volgens de uitvinding stelt men gelijktijdig de aanwezigheid van polymorfismen in twee of meer allelgedeelten van gelijke of onderscheidenlijke allelen vast door in dezelfde amplificatie-15 reactie meer dan twee seguentie-specifieke oligonucleotide primers toe te passen, waardoor onderscheidenlijke allelgedeelten worden vermeerderd en overeenkomstig onderscheidenlijke gemerkte enkelstrengs nucleïnezuren worden bereid en dat men de onderscheidenlijke gemerkte enkelstrengs nucleïnezuren 20 gezamenlijk met de geïmmobiliseerde proben laat hybridiseren.

Op deze wijze kan men gelijktijdig meerdere verschillende amplicons verkrijgen op basis waarvan meerderde gemerkte enkelstrengs nucleïnezuren kunnen worden bereid. Aldus is het mogelijk, in één vermeerderingsreactie alle polymorfisme 25 bevattende gebieden van de allelgedeelten/allelen/allelklassen met eenzelfde set primers te vermeerderen.

Mocht er in de in hoofdzaak polymorfisme vrije gebieden waaraan een voorwaarts gericht of achterwaarts gerichte oligonucleotide-primer dient aan te hechten eveneens een of 30 meer polymorfismen aanwezig zijn, verdient het de voorkeur, om in aanvullende gemerkte enkelstrengs nucleïnezuren te voorzien, welke de door voornoemde primers afgedekte polymorfismen bevatten. In een dergelijk geval kan men de primerparen voor de amplificatiereactie zodanig kiezen, dat 35 twee aldus door een amplicatiereactie vermeerderde gemerkte enkelstrengs nucleïnezuursequenties elkaar overlappen. Op deze wijze kunnen ook die allelgebieden worden onderzocht 1006733 12 op de aanwezigheid van polymorfismen, welke zijn gebruikt voor het aanhechten van de eerstgenoemde vermeerderingsprimers.

Volgens een tweede aspect van de uitvinding, wordt voorzien in een werkwijze voor het vaststellen van verschillen 5 en overeenkomsten in polymorfismen van twee of meer allelen/allelgedeelten van verschillende individuen/weef-sels/organen, waarbij men voor de individuen/weefsels/organen afzonderlijk de aanwezigheid van de betreffende polymorfismen volgens 10 de werkwijze van één of meer van de voorgaande conclusies vaststelt onder toepassing van dezelfde sequentie-specifieke oligonucleotide-proben voor elk te onderzoeken individu/weefsel/orgaan, en men per toegepaste probe het verschil respectievelijk 15 overeenkomst wat betreft een bepaald polymorfisme vaststelt door vergelijking van de aan- respectievelijk afwezigheid van een volledige hybride tussen de betreffende probe en een gemerkt nucleinezuur afkomstig van het ene individu/weef sel/orgaan, met de aan-20 respectievelijk afwezigheid van een soortgelijke hybride tussen eenzelfde probe en een gemerkt nucleinezuur afkomstig van het andere individu/weefsel/orgaan.

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is uitstekend geschikt voor het op zeer snelle, doeltreffende 25 en betrouwbare wijze bepalen van alle polymorfismen, waarvan de sequentie bekend is, van een allelgedeelte, allel of allelklasse. Bovendien kunnen de bepaalde polymorfismen worden afgelezen en geïdentificeerd aan de hand van een hybridisatie-patroon op een drager. Aldus kan men door het herhalen van 30 de werkwijze met genetisch materiaal van een ander individu/weef sel/orgaan de overeenkomsten en verschillen in polymorfismen op eenvoudige wijze vaststellen, door het verkregen hybridisatiepatroon van de tweede bepaling te vergelijken met die van de eerste bepaling. Wordt er in beide 35 bepalingen bij eenzelfde probe hybridisatie waargenomen, is dit een indicatie dat het overeenkomstige polymorfisme in beide onderzochte bronnen aanwezig is. Indien in de eerste 1 0 0-6 7 33 13 bepaling een hybridisatie met een bepaalde probe wordt geregistreerd, terwijl met dezelfde probe geen hybridisatie wordt geregistreerd in de tweede bepaling, kan men ervan uit gaan, dat er sprake is van niet overeenstemmende polymorfismen 5 in het betreffende onderzochte allel ter plaatse van de desbetreffende probe in de onderzochte verschillende bronnen. Bij het vergelijken en interpreteren van hybridisatiepatronen kan uiteraard gebruik worden gemaakt van een computer, zoals dit hierboven reeds is uiteengezet. Het spreekt voor zich, 10 dat deze uitvoeringsvorm kan worden uitgevoerd met drie of meer individuen/weefsel/organen.

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding voor het vaststellen van verschillen en overeenkomst in polymor fismen, zoals hierboven is beschreven, vindt bij voorkeur plaats 15 doordat men voor elk te onderzoeken individu/weefsel/orgaan, als drager één of meer replicaplaten toepast, waarop de sequentiespecifieke oligonucleotide-proben zijn geïmmobiliseerd. Hier worden met replicaplaten identieke dragerplaten bedoeld, waarop op eenzelfde plaats telkens eenzelfde 20 oligonucleotide is geïmmobiliseerd. Door toepassing van replicadragers volgens de onderhavige uitvinding wordt de locatie van elke probe op de dragers op eenvoudige wijze gestandaardiseerd. Replicaplaten volgens de uitvinding bevatten dus gelijke oligonucleotiden op overeenkomstige plaatsen. 25 Op deze wijze wordt het mogelijk, meerdere genetische bronnen gelijktijdig te onderwerpen aan de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding. Door het gebruik van replicaplaten behoeft niet op het resultaat van de hybridisatie van de eerste genetische bron te worden gewacht, alvorens men na denaturatie 3 0 van de gehybridiseerde paren de werkwijze dient te herhalen. Toepassing van replicaplaten maakt het ook mogelijk, een vergelijkend onderzoek naar de vast te stellen genetische polymorfismen op afstand van elkaar plaats te laten vinden. Dit is bijvoorbeeld van groot voordeel, wanneer genetische 35 polymorfismen dienen te worden vastgesteld wanneer er een donororgaan ter beschikking komt, ter bepaling van de meest geschikte ontvanger-patiênt, op basis van de mate van 1006733 14 overeenkomst in de daartoe te bepalen polymorfismen. Hiertoe wordt een polymorfismebepaling uitgevoerd op het genetisch materiaal van het donororgaan, alsmede op dat van de potentiële ontvanger-individuen, waarbij bij elke bepaling gebruik kan 5 worden gemaakt van een replicaplaat. Toepassing van replicaplaten heeft voorts als voordeel, dat gelijke polymorfismen tot gelijke volledige hybriden leiden, die op overeenkomstige plaatsen op de replicaplaten worden gevormd, zodat een visuele vergelijking van overeenkomstige polymorfis-10 men kan worden uitgevoerd door vergelijking van de op de replicaplaten gevormde patronen van volledige hybriden. Het vervaardigingsprincipe van grote aantallen dergelijke replicaplaten is in het vakgebied bekend, en behoeft hier geen nadere uitleg. De beschikbaarheid van een groot aantal 15 replicaplaten is van voordeel, omdat hiermee een bepaalde polymorfismebepaling veelvuldig op verschillende individuen/weef sels/organen al dan niet op meerdere locaties kan worden uitgevoerd.

Indien verschillen en overeenkomsten in polymorfismen 20 in een vergelijkend onderzoek op één locatie worden vastgesteld, kan de werkwijze worden uitgevoerd, doordat men van één van de te onderzoeken individuen/weef sels/organen de polymorf ismen identificeert, de hybriden door denatureren opheft en dezelfde geïmmobiliseerde proben toepast voor het 25 vaststellen van de polymorf ismen bij een volgende te onderzoeken individu/weefsel/orgaan.

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is uitermate geschikt voor het vaststellen van genetische polymorf ismen in de HLA-klasse I allelen. Dit was tot nu toe 30 slechts voor een klein aantal polymorfismen uit deze klasse mogelijk {Williams et al., ibid.) . Een voordelige uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding voorziet er derhalve in, dat men polymorfismen bepaalt van HLA-A-, HLA-B- en HLA-C-klasse I-allelen van een monster dat DNA van humane oorsprong 35 bevat. Toepassing van deze uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding maakt een zeer snelle en volledige weefseltypebepaling mogelijk, waardoor betrouwbare 1 0 0 j6 7 3 3 15 resultaten worden bereikt die gebruikt kunnen worden voor het toewijzen van donororganen aan ontvangende patiënten.

Om nagenoeg alle bekende voor transplantatie-doeleinden relevante polymorfismen van de HLA-klasse I allelen van een 5 monster van menselijke oorsprong te bepalen, voert men de amplificatiereactie van menselijk genetisch materiaal bij voorkeur uit met de volgende primerparen, (weergegeven in de richting 5'-3'):

Elf: GCCGAGGATG

10 Elb: GGTCAGGGCC

E2f: CACTCCATGA

E2b: CCTCGCTCTG

15 E3f1: TCTCACACC

E3bl: CTTCCCGTTC

E4f: TCTCTGACCA

E4b: CTCAGGGTG

20

Toepassing van deze primerparen levert vier amplicons op, die in hoofdzaak met de volledige sequenties van exons 1, 2, 3 en 4 van de HLA-A, HLA-B en HLA-C klasse I allelen overeenkomen.

25 Primer E3fl hybridiseert echter met een gebied, waarin in het HLA-B-allel polymorfismen aanwezig zijn. Primer E3bl hybridiseert met een gebied, waarin in het HLA-C-allel polymorfismen aanwezig zijn. Om genoemde polymorfismen in dezelfde bepaling volgens de onderhavige uitvinding te kunnen 30 identificeren, voert men de voornoemde vermeerderingsreactie aanvullend uit met de volgende primers:

E3f2: GGTCTCACA

E3b2: GCGCGCTGCAG

In het geval dat men in een bepaling zowel HLA-A, alsmede 35 de HLA-B-alleien wenst de identificeren, kan men bijvoorbeeld voorzien in primer E3f2. Primer E3b2 kan worden gebruikt om polymorfismen in het HLA-C-gen te identificeren, die zich 1006733 ' 16 bevinden in het gebied waarmee primer E3bl hybridiseert. Deze primers maken bepaling van de genoemde, respectievelijk door E3f1 en E3bl bedekte, polymorfismen van respectievelijk de HLA-B en HLA-C subklassen mogelijk, doordat E3f2 en E3b2 elders 5 aan de betreffende allelen hybridiseren (zie tevens figuur 1) ·

In een volgende voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding worden de volledige sequenties van de HLA-A klasse I-allelen, die de te bepalen en op zich bekende 10 polymorf ismen bevatten, door sequentiespecifieke oligonucleoti- de-proben vertegenwoordigd, waarbij de oligonucleotide-proben telkens aan elkaar grenzende gebieden van de allelen vertegenwoordigen, en men op basis van de sequenties van de oligonucleotiden van de volledige hybriden de in het monster 15 aanwezige HLA-A klasse-I-allelen identificeert. Hierdoor worden alle polymorfismen slechts eenmaal op de drager door een oligonucleotide-probe vertegenwoordigd, waardoor een minimale hoeveelheid proben kan worden toegepast voor het verkrijgen van betrouwbare hybridisatiesignalen. Indien men bijvoorbeeld 20 kiest voor oligonucleotide-proben met een lengte van 10 nucleotiden kan men bij het aantal thans bekende polymorfismen in de HLA-klasse I volstaan met minder dan 1000 onderscheidenlijke oligonucleotide-proben. Indien de proben zodanig worden gekozen, dat deze overlappende allelsequenties vertegenwoordi-25 gen, zal men overeenkomstig meer proben dienen toe te passen.

Zoals hierboven reeds beschreven, voorziet een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding erin, dat men de polymorfismen van de betreffende allelen vaststelt van een donororgaan en van 30 één of meer mogelijke ontvanger-patiënten, om de compatibiliteit wat betreft weefseltype op basis van overeenkomst in de betreffende polymorfismen tussen donororgaan en ontvanger-patiënt vast te stellen. Hierbij spelen vooral polymorfismen van de HLA-klasse I-allelen een grote rol. Hierbij kan tevens 35 worden gedacht aan bloedtransfusies, daar bloed als een vloeibaar orgaan kan worden beschouwd. Het bepalen van de polymorfismen in bloed ten behoeve van bloedtransfusies volgens 1 u o fc 7 3 5 17 de werkwijze van de onderhavige uitvinding levert zeer snel en meer relevante informatie op dan de tot nu toe gebruikelijke bloedgroepentests.

Uiteraard kan de werkwijze volgens de onderhavige 5 uitvinding ook worden gebruikt om de genetische polymorf ismen binnen bijvoorbeeld de HLA-klasse II allelen vast te stellen. Hiertoe dient men geschikte primers toe te passen voor het verkrijgen van één of meer vermeerderde matrijzen ter bereiding van overeenkomstige enkelstrengs nucleinezuren en dient men 10 de overeenkomstige oligonucleotide-proben, die geschikt zijn voor het bepalen van de genetische polymorfismen binnen de HLA-klasse II-allelen toe te passen. De werkwijze kan tevens worden toegepast bij het bepalen van bijvoorbeeld polymorfismen van het HLA-equivalent bij runderen, BoLA, met proben die 15 BoLA-polymorfismen kunnen identificeren, welke polymorfismen een rol spelen bij de productie van antilichamen. Men kan van koeien, die bijvoorbeeld gewenste melk met verschillende hoeveelheden antilichamen produceren, het hybridisatiepatroon bepalen en daaruit de polymorfismen afleiden, en het patroon 2 0 van verschillende koeien met elkaar vergelijken om op basis hiervan verband te kunnen leggen tussen dat patroon en antilichaamproductie, dan wel te kunnen voorspellen of een bepaald kalf later melk met veel, dan wel weining antilichamen zal vervaardigen. Voor polymorf ismebepalingen, waarbij slechts 25 polymorfismen behoeven te worden bepaald, die tussen bepaalde species zijn geconserveerd, kunnen proben van de andere betreffende species worden toegepast; zo is het bijvoorbeeld mogelijk, dat men proben die overeenkomen met de sequentie van polymorfismen van menselijke oorsprong toepast voor het 30 bepalen van polymorfismen in runderen, of voor het vergelijken van de overeenkomsten respectievelijk verschillen in polymorfismen tussen de twee species.

Toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding bij slachtvee maakt het bijvoorbeeld mogelijk om de herkomst ervan 35 te bepalen, waardoor het fraudegevoelige oormerk-systeem overbodig wordt. De werkwijze kan ook worden toegepast voor het vaststellen van de soortsoorsprong van een monster 1 0:0 6 7 3 3 18 (bijvoorbeeld van gehakt) door het op een drager immobiliseren van daartoe geschikte proben.

Opgemerkt wordt, dat wanneer het uiterst zeldzame geval zich voordoet, dat een bepaald hybridisatiepatroon wordt 5 geregistreerd, waarbij aan het betreffende onderzochte allel/allelgedeelte niet een bepaald polymorfisme eenduidig kan worden toegekend, men het betreffende gemerkt enkelstrengs nucleinezuur respectievelijk fragmenten aan een hybridisatie met een tweede reeks geïmmobiliseerde oligonucleotide-proben 10 onderwerpt, welke proben zijn ontworpen om de betreffende toekenning eenduidig mogelijk te maken. Hiertoe kan men de werkwijze herhalen, met speciaal voor het voorkomende geval ontworpen alternatieve oligonucleotide-proben. Een dergelijk hypothetisch geval treedt slechts op, wanneer het aantal 15 oligonucleotiden laag is in verhouding tot de hoeveelheid mogelijke allelen waarin zich de betrokken polymorfismen kunnen bevinden.

Door het kiezen van een groot aantal te onderzoeken polymorfismen en het voorzien in een dusdanig aantal 20 oligonucleotide-proben, dat in hoofdzaak nagenoeg de volledige sequentie van het onderzochte allel/allelgedeelte/allelklasse door de geïmmobiliseerde oligonucleotide-proben wordt vertegenwoordigd, treedt de situatie, waarin een bepaald hybridisatieresultaat niet eenduidig kan worden toegekend 25 aan een bepaald allelgedeelte/allel, niet op.

De uitvinding heeft voorts betrekking op een drager, bestemd voor toepassing in de werkwij ze volgens de onderhavige uitvinding, waarop verschillende oligonucleotide-proben gescheiden van elkaar zijn geïmmobiliseerd, of op de drager 30 zijn gesynthetiseerd, die elk sequentie-specifiek zijn voor een allelgedeelte, allel of allelklasse van een biologische soort en ten minste een polymorfisme van het betreffende allelgedeelte/allel omvatten.

Met een dergelijke drager is het, zoals hierboven reeds 35 is uiteengezet, mogelijk om met één hybridisatiestap de te bepalen polymorf ismen van de te onderzoeken allelgedeelten/al-lelen/allelklassen te bepalen.

1 0 0 6 7 33 19

Indien de bepaling zich uitstrekt tot polymorfismen van een compleet allel of allelenklasse, kunnen op de drager alle daarin aanwezige polymorfismen door tenminste een oligo zijn vertegenwoordigd. Het is echter ook mogelijk, een aantal minder 5 relevante polymorfismen, zoals hierboven reeds is uiteengezet, niet te bepalen, door het niet op de drager opnemen van oligonucleotide-proben, die een voor de desbetreffende polymorfismen specifieke sequentie bezitten.

Om alle te bepalen polymorfismen in één hybridisatiestap 10 te bepalen, zijn alle op zich bekende polymorfismen in de één of meer allelgedeelten/allelen/allelklassen die men wenst te bepalen, in de oligonucleotiden opgenomen.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding omvat de drager oligonucleotide-proben, die 15 sequentie-specifiek zijn voor alle humane HLA-klasse I-allelen. Deze allelenklasse is, zoals hierboven reeds is beschreven, van bijzonder belang bij het bepalen van de compatibiliteit tussen een donororgaan en een mogelijke ontvanger/patiënt. Dergelijke dragers kunnen onafhankelijk van elkaar op 2 0 verschillende locaties worden toegepast in de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, zodat voor het bepalen van de compatibiliteit het betreffende orgaan en de betreffende ontvanger/patiënt zich niet op dezelfde locatie hoeven te bevinden. Een en ander is hierboven reeds toegelicht. Door 25 toepassing van dezelfde oligonucleotideproben in de verschillende polymorfismebepalingen is de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding op eenvoudige wijze te standaardiseren.

Bij voorkeur bezitten de oligonucleotide-proben op de 30 drager volgens de onderhavige uitvinding alle een lengte van ofwel 9 ofwel 10 nucleotiden. Zoals hierboven reeds is beschreven, is gebleken dat met oligonucleotide-proben met een dergelijke lengte optimaal betrouwbare hybridisatieresulta-ten worden verkregen. Het is mogelijk, dat de oligonucleotide-35 proben meer dan 10 nucleotiden bezitten, bijvoorbeeld 12 of 20; het productieproces voor de dragers wordt hierdoor echter duurder. Naburige polymorfismen worden eveneens door meerdere 1 0 06 733 20 oligonucleotide-proben gedekt, hetgeen de bepaling onnodig compliceert.

Bij voorkeur vertegenwoordigen de oligo' s op een drager volgens de onderhavige uitvinding wat betreft sequentie elkaar 5 niet overlappende gedeelten van het te onderzoeken allelgedeel-te/allel of allelenklasse. Het toepassen van overlappende sequenties zal tot een toename in het aantal volledige hybrideparen op de drager leiden, hetgeen er echter niet toe hoeft te leiden, dat een dergelijke toename een betere 10 identificatie van de polymorfismen met zich meebrengt. Bij voorkeur wordt volstaan met een zo min mogelijk aantal oligonucleotide-proben op een drager om met zekerheid de te onderzoeken polymorfismen te kunnen identificeren, om bijvoorbeeld de dimensies van de drager of het aantal dragers 15 zoveel mogelijk te beperken. Hiertoe kunnen de op de drager geïmmobiliseerde oligonucleotide-proben wat betreft sequentie aangrenzende gedeelten van het te onderzoeken allelgedeelte/al-lel of allelenklasse vertegenwoordigen, hetgeen doorgaans voldoende is om aldus de polymorf ismen van een ononderbroken 20 gebied daarvan te kunnen identificeren.

Voorts wordt nog gewezen op WO-A-89/10977, waarin meerdere op een drager geïmmobiliseerde oligonucleotiden worden beschreven voor het onderzoeken en vaststellen en vergelijken van nucleotidensequenties. Ook kan men door geschikte keuze 25 van de proben telkens 2 polymorf ismen van verschillende allelen van elkaar onderscheiden. Het vaststellen van een groot aantal polymorf ismen binnen een of meer allelgedeelten, allelen of allelenklassen wordt echter niet geopenbaard.

In het navolgende zal de uitvinding aan de hand van de 30 tekening en een voorbeeld nader worden toegelicht.

In de tekening toont:

Figuur 1 de sequenties van bekende humane allelen behorende tot de HLA klasse I. De consensus-sequenties zijn 35 met hoofdletters aangegeven. De polymorf ismen zijn in de allelen met kleine letters aangegeven. Streepjes verwijzen naar de consensussequentie. De plaats van hybridisatie van 1006733 21 de primers is telkens met een pijl aangegeven, waarvan de richting de polymerisatierichting in de amplificatiereactie weergeeft. De onderzochte polymorfismen zijn weergegeven door een omcirceling van het betreffende nucleotide; het nummer 5 verwijst naar de probe met de overeenkomstige sequentie.

Figuur 2 toont een hybridisatiepatroon van een aantal aan een polymorfismebepaling onderworpen humane allelen behorende tot de HLA-A-subklasse, onder toepassing van 125 sequentiespecifieke geïmmobiliseerde proben, zoals genummerd 10 in figuur 1.

VOORBEELD

Met behulp van vier oligonucleotide-primerparen (Elf-Elb, E2f-E2b, E3f-E3b, E4f-E4b) werden relevante gedeelten van 15 de vier exons van de HLA-A allelen vermeerderd van een menselijk DNA-bevattend monster door middel van PCR. Uit fig. 1 is te zien, dat de HLA-A sequentie, waarmee genoemde primers hybridiseren, geen polymorf ismen bevatten. Het uit voeren van een aanvullende amplificatie van een overlappende HLA-A 20 sequentie was in dit geval derhalve niet noodzakelijk.

De amplicons werden gebruikt om gemerkt enkelstrengs RNA te bereiden.

Om een aantal polymorfismen binnen de HLA-A klasse I allelen van de mens te identificeren, werden 125 DNA-25 oligonucleotiden gesynthetiseerd. Elk oligonucleotide was 10 nucleotiden lang en omvatte een of meer op zich bekende polymorfismen van de HLA-A klasse I-allelen. De sequentie van de onderzochte allelen wordt in figuur 1 getoond. De sequentie van de oligonucleotide-proben kwamen overeen met 30 de aangegeven consensus-sequentie, waarbij elke genummerde probe ten minste een polymorfisme omvatte, hetgeen door omcirkelen in figuur 1 is weergegeven. Zo vertegenwoordigt oligonucleotide-7 een polymorfisme in het A*0101-gen en komt oligo-9 overeen met polymorfismen van onder andere de genen 35 A*2901 en *2902. Oligonucleotide-12 omvat twee polymorf ismen van het A*2901 allel. Alle 125 proben werden gescheiden van elkaar op een drager gerangschikt.

1Oi6 753 22

De proben werden aan hybridisatie onderworpen met het bovengenoemd RNA, waarna onder stringente omstandigheden gewassen, zodat slechts volledige hybriden in stand bleven.

In fig. 2 zijn de verkregen hybridisatie-patronen van 5 een aantal allelen, te weten A*0101, 0102, 1101, 1102, 3301, 3302 en 8001 weergegeven.

Identificatie van de hybriden :

Indien het te onderzoeken monster het allel A*0101 omvat, zullen op de drager volledige hybriden worden gevormd ter 10 plaatse van proben 1, 7, 10, 13, 19, 21, 24, 33, 38,44, 49, 52, 55, 57, 63, 65, 74, 75, 78, 81, 87, 91, 92, 96, 102, 103, 104, 105, 106, 110, 114, 118, 120 en 121. In het geval dat het monster eveneens bijvoorbeeld het HLA*3301 bevat, zullen er aanvullend eveneens volledige hybriden worden gevormd met 15 proben 9, 12, 36, 42, 43, 47, 50, 53, 58, 61, 67, 69, 72, 76, 88, 97, 101, 107, 108, 111, 115 en 123 . Alle allelcombina-ties zullen een unieke combinatie van volledige hybriden tot gevolg hebben. Zoals hierboven reeds is beschreven, zal het vaststellen van de aanwezigheid van bepaalde allelen in 2 0 het onderzochte monster kunnen worden vereenvoudigd en versneld door gebruik te maken van automatische gegevensverwerking en -vergelijking.

1006733

Claims (24)

1. Werkwijze voor het bepalen van genetische polyraorfismen binnen een of meer allelgedeelten, allelen of allelklassen van een biologische soort, met behulp van het op een drager vormen en identificeren van volledige hybriden tussen 5 a) enkelstrengs nucleinezuren, waarvan de sequentie overeenkomt met tenminste een gedeelte van de allelgedeelten, allelen respectievelijk allelklassen, dat een of meer te bepalen polymorfismen omvat, en b) onderscheidenlijke sequentie-specifieke oligonucleotide 10 proben, die elk de sequentie van een of meer te bepalen polymorf ismen omvatten, waarbij de nucleotidensequenties van de allelgedeelten/allelen, respectievelijk allelklassen ter plaatse van de te bepalen polymorf ismen tenminste bekend zijn over de lengte van de te vormen hybride, met het kenmerk, 15 dat men de enkelstrengs nucleïnezuren merkt, de onderscheidenlijke sequentie-specifieke oligonucleotide-proben gescheiden van elkaar op één of meer dragers immobiliseert en men volledige hybriden vormt tussen de gemerkte enkelstrengs nucleïnezuren en de geïmmobiliseerde oligonucleotide proben. 20

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat elke oligonucleotide-probe tenminste één polymorfisme van de één of meer allelgedeelten/allelen/allelklassen in zich draagt, waarbij het aantal oligonucleotide-proben zodanig wordt 25 gekozen, dat in hoofdzaak alle in de allelgedeelten/allelen bekende te bepalen polymorf ismen in de oligonucleotiden zijn opgenomen.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, 30 dat de smelttemperaturen van de volledige hybriden nagenoeg gelijk zijn.

4. Werkwi j ze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de sequentie-specifieke proben 35 een lengte hebben tussen 8 en 15 nucleotiden. 1006733

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de sequentie-specifieke proben een lengte hebben van 9-10 nucleotiden.

6. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de gemerkte enkelstrengs nucleïnezuren alvorens met de sequentie-specifieke proben te worden gehybridiseerd, gekliefd worden in fragmenten tussen 8 en 100 nucleotiden. 10

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de gemerkte enkelstrengse nucleïnezuren worden gekliefd in fragmenten, waarvan de lengte in hoofdzaak gelijk is aan de lengte van de geïmmobiliseerde oligonucleotide-proben. 15

8. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de gemerkte enkelstrengs nucleïnezuren zijn verkregen door de een of meer allelgedeelten/allelen aan een amplif icatiereactie te onderwerpen met behulp van hybridisatie 20 van tenminste een sequentie-specifieke voorwaarts gerichte en tenminste één sequentie-specif ieke achterwaarts gerichte oligonucleotide primer voor het verkrijgen van tenminste een dubbelstrengs amplicon, waarin de te bepalen polymorfismen aanwezig zijn en men enkelstrengs nucleïnezuren van het 25 amplicon afleidt, waarvan de sequentie overeenkomt met tenminste een gedeelte van een van beide strengen van het amplicon, in welke nucleïnezuren de te bepalen polymorf ismen aanwezig zijn.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de gebieden van de een of meer allelgedeelten/allelen die met genoemde voorwaarts en achterwaarts gerichte primers hybridiseren in hoofdzaak geen polymorfismen bevatten.

10. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men gelijktijdig de aanwezigheid van polymorf ismen in twee of meer allelgedeelten van gelijke of 1 o 0 6 7 33 onderscheidenlijke allelen vaststelt, door in dezelfde amplificatiereactie meer dan twee sequentie-specifieke oligonucleotide primers toe te passen, waardoor onderscheidenlijke allelgedeelten worden vermeerderd en overeenkomstig 5 onderscheidenlijke gemerkte enkelstrengs nucleinezuren worden bereid en dat men de onderscheidenlijke gemerkte enkelstrengs nucleinezuren gezamenlijk met de geïmmobiliseerde proben laat hybridiseren.

11. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de primerparen zodanig worden gekozen, dat twee aldus door een amplificatiereactie vermeerderde allelgedeelten elkaar overlappen.

12. Werkwijze voor het vaststellen van verschillen en overeenkomsten in polymorfismen van twee of meer allelen/allel-gedeelten van verschillende individuen/weefsels/organen, met het kenmerk, dat men voor de individuen/weefsels/organen afzonderlijk de 20 aanwezigheid van de betreffende polymorfismen volgens de werkwijze van één of meer van de voorgaande conclusies vaststelt onder toepassing van dezelfde sequentie-specifieke oligonucleotide-proben voor elk te onderzoeken individu/weefsel/orgaan, en 25. men per toegepaste probe het verschil respectievelijk overeenkomst wat betreft een bepaald polymorfisme vaststelt door vergelijking van de aan- respectievelijk afwezigheid van een volledige hybride tussen de betreffende probe en een gemerkt nucleïnezuur afkomstig 30 van het ene individu/weefsel/orgaan, met de aan- respectievelijk afwezigheid van een soortgelijke hybride tussen eenzelfde probe en een gemerkt nucleïnezuur afkomstig van het andere individu/weefsel/orgaan.

13. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat men voor elk te onderzoeken individu/weefsel/orgaan als drager een of meer replicaplaten toepast, waarop de sequentiespecifie- 1006733 ke oligonucleotide-proben zijn geïmmobiliseerd.

14. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat men van één van de te onderzoeken individuen/weefsels/organen 5 de polymorfismen identificeert, de hybriden door denatureren opheft en dezelfde geïmmobiliseerde proben toepast voor het vaststellen van de polymorf ismen bij een volgende te onderzoeken individu/weefsel/orgaan.

15. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men polymorfismen bepaalt van HLA-A, HLA-B, HLA-C, klasse I-allelen van een monster dat DNA van humane oorsprong bevat.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat men de vermeerderingsreactie uitvoert met de volgende primerparen, (weergegeven in de richtlijn 5'-3') : Elf: GCCGAGGATG Elb: GGTCAGGGCC 20 E2f: CACTCCATGA E2b: CCTCGCTCTG E3f1: TCTCACACC

25 E3bl: CTTCCCGTTC E4f: TCTCTGACCA E4b: CTCAGGGTG

17. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat men de vermeerderingsreactie uitvoert met aanvullend de volgende primers: E3f2: GGTCTCACA E3b2: GCGCGCTGCAG 35

18. Werkwijze volgens een van de conclusies 15-17, met het kenmerk, dat de volledige sequenties van de HLA-A klasse I- 10 0673 3 allelen, die de te bepalen en op zich bekende polymorfismen bevatten, door sequentiespecifieke oligonucleotide-proben worden vertegenwoordigd, waarbij de oligonucleotide-proben telkens aan elkaar grenzende gebieden van de allelen 5 vertegenwoordigen, en men op basis van de sequenties van de oligonucleotiden van de volledige hybriden de in het monster aanwezige HLA-A klasse-I-allelen identificeert.

19. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men de polymorfismen van de betreffende allelen vaststelt van een donororgaan en van één of meer mogelijke ontvanger-patiënten, om de compatibiliteit wat betreft weefseltype op basis van overeenkomst in 15 de betreffende polymorf ismen tussen donororgaan en ontvanger-patiënt vast te stellen.

20. Drager, bestemd voor toepassing in de werkwijze volgens een of meer van de voorgaande conclusies, waarop verschillende 20 oligonucleotide-proben gescheiden van elkaar zijn geïmmobiliseerd, die elk sequent ie-specifiek zijn voor een allelgedeelte, allel of allelklasse van een biologische soort en ten minste een polymorfisme van het betreffende allelgedeelte/allel omvatten. 25

21. Drager volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat alle op zich bekende polymorf ismen in de één of meer allelgedeel-ten/allelen/allelklassen die men wenst te bepalen, in de oligonucleotiden zijn opgenomen. 30

22. Drager volgens conclusie 20 en/of 21, met het kenmerk, dat de allelenklasse de humane HLA-klasse I omvat.

23. Drager volgens een of meer van de conclusies 20-22, met 35 het kenmerk, dat de oligonucleotide-proben alle een lengte van ofwel 9 ofwel 10 nucleotiden bezitten. 1006733

24. Drager volgens één of meer van de conclusies 20-23, met het kenmerk, dat de oligonucleotiden-proben wat betreft sequentie elkaar niet overlappende gedeelten van een allelgedeelte/allel of allelenklasse vertegenwoordigen. 5 1006733