JP2006246881A - ウシ白血病発症に対する抵抗性の判定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖の75番目のアミノ酸がバリンであるか否かを判定することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
【選択図】 なし
Description
(1)被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖の75番目のアミノ酸がバリンであるか否かを判定することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
(a)被験ウシからゲノムDNA又はmRNAを調製するステップ、
(b)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子のDQA1*0101アリルを検出するステップ、
を含み、DQA1*0101アリルの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。
上記方法において、ステップ(b)は、例えばポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法(PCR−SBT)により行うことができる。具体的には、ステップ(b)は、(b1)配列番号3に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号4に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、又は(b2)配列番号5に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号6に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、あるいは(b1)及び(b2)の両方のステップを含むものである。また、ステップ(b)が、(b3)得られた増幅産物の塩基配列を決定するステップ、をさらに含んでもよい。
(a)被験ウシからゲノムDNA又はmRNAを調製するステップ、
(b)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子のDQA1*0101アリルを検出するステップ、
(c)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DR分子β鎖をコードするDRB3遺伝子のDRB3*0701アリルを検出するステップ、
を含み、DQA1*0101アリル及びDRB3*0701アリルの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。
上記方法において、ステップ(b)及び(c)は、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法(PCR−SBT)により行うことができる。
(a)被験ウシからゲノムDNA又はmRNAを調製するステップ、
(b)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DR分子β鎖をコードするDRB3遺伝子のDRB3*0701アリルを検出するステップ、
(c)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子のDQA1*0101アリルを検出するステップ、
(d)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA2遺伝子のDQA2*22031アリルを検出するステップ、
(e)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA3遺伝子の存在を検出するステップ、
を含み、DRB3*0701アリル、DQA1*0101アリル及びDQA2*22031アリルが存在し、DQA3遺伝子が存在しないハプロタイプの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。
(a)被験ウシからゲノムDNA又はmRNAを調製するステップ、
(b)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DR分子β鎖をコードするDRB3遺伝子のDRB3*14012アリルを検出するステップ、
(c)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子のDQA1*10012アリルを検出するステップ、
(d)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA2遺伝子のDQA2*22021アリルを検出するステップ、
(e)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA3遺伝子の存在を検出するステップ、
を含み、DRB3*14012アリル、DQA1*10012アリル及びDQA2*22021アリルが存在し、DQA3遺伝子が存在しないハプロタイプの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。
(13)ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子のDQA1*0101アリルを検出する手段を含むことを特徴とする、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定するためのキット。
(14)ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子のDQA1*0101アリルを検出する手段、及びウシ主要組織適合抗原DR分子β鎖をコードするDRB3遺伝子のDRB3*0701アリルを検出する手段を含むことを特徴とする、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定するためのキット。
1.ウシ白血病発症に対する抵抗性の判定
本発明は、ウシ白血病ウイルス(BLV)感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法である。本発明の方法は、ウシ主要組織適合抗原(BoLA)のDQ分子のDQA1*0101アリルをホモ又はヘテロに有するウシ個体がBLV感染によるウシ白血病発症に対して抵抗性を示すという知見に基づくものである。
本発明の方法では、ウシ白血病発症に対する抵抗性を判定しようとするウシ(被験ウシ)からゲノムDNA又はmRNAを調製する。ゲノムDNAの調製は、公知の方法、例えばフェノール/クロロホルム法、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)法などにより調製することができる。また、mRNAの調製は、公知の方法、例えばグアニジンイソチオシアネート法などにより調製することができる。ゲノムDNA又はmRNAを調製するためのキットも市販されており、ゲノムDNAの調製用には例えばWizard Genomic DNA Purification Kit(Promega)など、mRNAの調製用には例えばNucleoTrap(登録商標)mRNA Kit(Clontech)などを使用することができる。
ゲノムDNA又はmRNAにおけるDQA1*0101アリルの検出は、例えば、当技術分野で公知の遺伝子多型検出手段により行うことができ、限定するものではないが、直接配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用した方法、制限酵素断片長多型(RFLP)を利用した方法、ハイブリダイゼーション法を利用した方法、プライマー伸長反応を利用する方法、質量分光法などが挙げられる。これらの方法はいずれも当業者に周知である。以下にその概要を説明する。
DQA1*0101アリルは、ゲノムDNA又はmRNA由来のcDNAを用いて直接配列決定法により検出することができる。直接配列決定法においては、最初に、被験ウシからゲノムDNA又はmRNA由来のcDNAを調製し、検出対象となるDQA1*0101アリルを含む領域をベクターにクローニングし、宿主細胞(例えば細菌)において増幅させる。あるいは、検出対象のDQA1*0101アリルを含む領域内のDNAをPCRにより増幅することも可能である。増幅後、検出対象領域内のDNAを配列決定する。配列決定法としては、限定されるものではないが、手動式配列決定法又は自動配列決定法が挙げられる。手動配列決定法としては、例えば放射性マーカーヌクレオチドを使用する方法などが挙げられ、自動配列決定法としては、ダイターミネーターを使用する方法などが挙げられる。配列決定の結果に基づいて、被験ウシがDQA1*0101アリルを有するか否かを判定する。
(a)配列番号3に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号4に示す塩基配列からなるプライマー
5’-CAC AAA TGA AGC CCA CAA TG-3’(配列番号3)
5’-CCC TAG GGA AAA GGG AGT GA-3’(配列番号4)
(b)配列番号5に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号6に示す塩基配列からなるプライマー
5’-GCC CAC AAT GTT TGA TAG TC-3’(配列番号5)
5’-GGG RAC ACA TAC TGT TGG T-3’(配列番号6)
(配列中、RはA又はGを表す)
また、増幅の特異性を高めるために、2組以上のプライマーを用いて2回以上増幅反応を行うことが好ましい。具体的には、最初に、被験ウシに由来するゲノムDNAを鋳型として、BoLA−DQA1の第2エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅する。次いで、増幅された核酸断片を鋳型として、さらにBoLA−DQA1の第2エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅する。このように2回以上増幅反応を行う場合には、各増幅反応で使用するプライマーを、同じ位置に設計してもよいし、あるいは、最初の増幅におけるプライマーの位置よりも内側に設計することができる。
(a)配列番号3に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号4に示す塩基配列からなるプライマー
(b)配列番号5に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号6に示す塩基配列からなるプライマー
上述のようにして、被験ウシに由来するゲノムDNAを鋳型として、BoLA−DQA1の第2エクソンの塩基配列を含む核酸断片を特異的に増幅することができる。
(c)配列番号7に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号8に示す塩基配列からなるプライマー
5’-ACA ATG TTT GAT AGT CAA TTT C-3’(配列番号7)
5’-GGG RAC ACA TAC TGT TGG TAG-3’(配列番号8)
(配列中、RはA又はGを表す)
核酸断片の塩基配列(すなわち第2エクソンの塩基配列)を決定した後、その塩基配列と、DQA1*0101アリルの塩基配列(配列番号1)を比較する。
DQA1*0101アリルは、PCR法を利用して検出することもできる。PCRは、DQA1*0101アリルを有する配列又は他のアリルを有する配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを利用して行う。そのDQA1*0101アリル用及びその他のアリル用の両方のプライマーセットを使用して被験ウシ由来のゲノムDNA又はmRNA由来のcDNAを増幅する。DQA1*0101アリル用プライマーのみがPCR産物を生成した場合には、被験ウシはDQA1*0101アリルをホモで有し、DQA1*0101アリル用プライマーと他のアリル用プライマーからのPCR産物が生成された場合には、被験ウシはDQA1*0101アリルをヘテロで有することになる。他のアリル用プライマーのみがPCR産物を生成した場合には、被験ウシはDQA1*0101アリルを有しない。
DQA1*0101アリルは、制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism;RFLP)を利用して検出することもできる。まず、検出対象のDQA1*0101アリルを含む領域をPCRで増幅する。続いてこのPCR産物を、DQA1*0101アリルに独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたPCR産物は、一般的にはゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化する。断片の長さを、分子量マーカー、並びに他のアリル及びDQA1*0101アリルの対照により生じた断片の長さと比較することによって、被験ウシにおけるDQA1*0101アリルを検出することができる。
DQA1*0101アリルは、ハイブリダイゼーションを利用して検出することもできる。ハイブリダイゼーション法は、被験ウシ由来のゲノムDNA又はmRNAが、それに対し相補的なDNA分子(例えばオリゴヌクレオチドプローブ)とハイブリダイズする能力に基づいて、DQA1*0101アリルの有無を決定する方法である。ハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。
本発明の方法においては、タンパク質レベルでDQA1*0101アリルを検出することも可能である。具体的には、DQA1*0101アリルを有するDQ分子のα鎖を特異的に認識することができる抗体を用いることにより、DQA1*0101アリルを検出することができる。
DQA1*0101アリルの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有する可能性を示すものである。このDQA1*0101アリルの存在は、ホモ又はヘテロのいずれでもよい。
さらに本発明のウシ白血病ウイルス(BLV)感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法は、ウシ主要組織適合抗原(BoLA)のDQ分子のDQA1*0101アリル及びBoLAのDR分子のDRB3*0701アリルを有するウシ個体がBLV感染によるウシ白血病発症に対して高い抵抗性を示すという知見に基づくものである。
さらに本発明のウシ白血病ウイルス(BLV)感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法は、ウシ主要組織適合抗原(BoLA)のDRB3*0701アリル、DQA1*0101アリル及びDQA2*22031アリルが存在し、DQA3遺伝子が存在しないハプロタイプ、又はDRB3*14012アリル、DQA1*10012アリル及びDQA2*22021アリルが存在し、DQA3遺伝子が存在しないハプロタイプを有するウシ個体が、BLV感染によるウシ白血病発症に対して高い抵抗性を示すという知見に基づくものである。
(d)配列番号9に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号10に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT TCC ACC TTY CTG CTC CT-3’(配列番号9)
5’-CAC TTA CCA TTG ATA ACA GG-3’(配列番号10)
(配列中、YはC又はTを表す)
(e)配列番号9に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号11に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT TCC ACC TTY CTG CTC CT-3’(配列番号9)
5’-TTG ATA ACA GGG GTA AAG TTG GA-3’(配列番号11)
(配列中、YはC又はTを表す)
(f)配列番号30に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号10に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT GCT TAG AGA CAT TGT GC-3’(配列番号30)
5’-CAC TTA CCA TTG ATA ACA GG-3’(配列番号10)
(g)配列番号31に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号10に示す塩基配列からなるプライマー
5’-TTT TCC ACC TTY YTG CTC CT-3’(配列番号31)
5’-CAC TTA CCA TTG ATA ACA GG-3’(配列番号10)
(配列中、YはC又はTを表す)。
本発明のキットは、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定するために用いることができ、ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖におけるDQA1*0101アリルを検出する手段を含むものである。
(a)配列番号3に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号4に示す塩基配列からなるプライマー
(b)配列番号5に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号6に示す塩基配列からなるプライマー
さらに本発明のキットは、BoLA−DQA1の第2エクソンを配列決定するためのプライマーセットとして、以下の(c)のプライマーセットを含むことが好ましい。
(c)配列番号7に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号8に示す塩基配列からなるプライマー
また本発明のキットは、ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子のDQA1*0101アリルを検出する手段、及びウシ主要組織適合抗原DR分子β鎖をコードするDRB3遺伝子のDRB3*0701アリルを検出する手段を含むものであってもよい。
上述のように、DQA1*0101アリル、又はDQA1*0101アリルとDRB3*0701アリルを検出することにより、ウシ白血病ウイルス(BLV)によるウシ白血病発症の抵抗性を判定することができるため、この判定結果を利用して、ウシ白血病発症の抵抗性を有するウシを作出することができる。また、DRB3*0701アリル、DQA1*0101アリル及びDQA2*22031アリルが存在し、DQA3遺伝子が存在しないハプロタイプ、又はDRB3*14012アリル、DQA1*10012アリル及びDQA2*22021アリルが存在し、DQA3遺伝子が存在しないハプロタイプを検出することにより、ウシ白血病ウイルス(BLV)によるウシ白血病発症の抵抗性を判定することができるため、この判定結果を利用して、ウシ白血病発症の抵抗性を有するウシを作出することができる。
(1)BoLA−DQA1 1stPCR
120μMの各dNTP、1.5mMのMgCl2、400nMのプライマー、及び1.25ユニットのrTaq DNA伸長酵素(TOYOBO)、1μlのゲノムを含む25μlの1×rTaq緩衝液を94℃で2分間の変性処理後、94℃で20秒;60℃で20秒、及び72℃で40秒の処理を1サイクルとして15サイクルの処理の後、72℃で4分間伸長させた。プライマーは、BoLA−DQA1第2エクソンをPCR法により特異的に増幅できるDQA1intL2及びDQA1−677Rを用いた(配列番号3及び4)。
1stPCR産物のうち1μlを120μMの各dNTP、1.5mMのMgCl2、400nMのプライマー、及び0.5ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素(Applied Biosystems)を含む24μlのGene AmpR Gold緩衝液を95℃で10分間の変性処理後、94℃で20秒;60℃で20秒、及び72℃で40秒の処理を1サイクルとして30サイクルの処理の後、72℃で4分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるDQAintL3及びDQA1exREVver2.1を用いた(配列番号5及び6)。これによって、355bpのDNA断片が得られた。PCR産物をエチヂウムブロマイド入り2%アガロースゲルで電気泳動をして、DNAが増幅されているか確認した。
シーケンスプライマーとしてDQAintL3.1及びDQA1ex2REVver1.1を用いた(配列番号7及び8)。CEQTMDTCS Quick Start Kit(BECKMAN)をシーケンス反応に用いた。1μlのPCR産物、2μlの10pmol/μlプライマー、4μlのDTCS Quick Start Mix(BECKMAN)、4μlの2.5×Sequencing Buffer(Edge Biosystems)、及び滅菌水9μlを混和し、95℃で20秒;50℃で20秒;60℃で4分間の処理を1サイクルとして30サイクルの処理を行った。シーケンスPCR産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS(PRINCETON SEPARATIONS)を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー(BECKMAN COULTER)用のSample Loading Solution(BECKMAN)20μlに溶解し、CEQTM2000XL DNA Analysis System(BECKMAN COULTER)でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、BLASTを使用してアリルの塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、アリルを決定した。
(1)BoLA−DQA2 1stPCR
120μMの各dNTP、1.5mMのMgCl2、400nMのプライマー、及び0.5ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素(Applied Biosystems)、1μlのゲノムを含む25μlのGene AmpR Gold緩衝液を95℃で10分間の変性処理後、95℃で1分間;55℃で30秒、及び72℃で40秒の処理を1サイクルとして15サイクルの処理の後、72℃で4分間伸長させた。プライマーは、BoLA−DQA2第2エクソンをPCR法により特異的に増幅できるDQA2intL06及びQA006を用いた(配列番号9及び10)。
1stPCR産物のうち1μlを同条件の試薬24μlに混和し、95℃で10分間の変性処理後、95℃で1分間;63℃で30秒、及び72℃で40秒の処理を1サイクルとして35サイクルの処理の後、72℃で4分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できるDQA2intL06及びDQA2exon2<−1を用いた(配列番号9及び11)。これによって、283bpのDNA断片が得られた。PCR産物をエチヂウムブロマイド入り2%アガロースゲルで電気泳動をして、DNAが増幅されているか確認した。
シーケンスプライマーとしてDQA2intL06及びDQA2exon2<−1を用いた(配列番号9及び11)。CEQTMDTCS Quick Start Kit(BECKMAN)をシーケンス反応に用いた。1μlのPCR産物、2μlの10pmol/μlプライマー、4μlのDTCS Quick Start Mix(BECKMAN)、4μlの2.5×Sequencing Buffer(Edge Biosystems)、及び滅菌水9μlを混和し、95℃で20秒;50℃で20秒;60℃で4分間の処理を1サイクルとして30サイクルの処理を行った。シーケンスPCR産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS(PRINCETON SEPARATIONS)を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー(BECKMAN COULTER)用のSample Loading Solution(BECKMAN)20μlに溶解し、CEQTM2000XL DNA Analysis System(BECKMAN COULTER)でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、BLASTを使用してアリルの塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、アリルを決定した。
Claims (16)
- 被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖の75番目のアミノ酸がバリンであるか否かを判定することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
- 被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子における配列番号1に示される塩基配列を有するDQA1*0101アリルを検出することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
- 被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法であって、
(a)被験ウシからゲノムDNA又はmRNAを調製するステップ、
(b)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子のDQA1*0101アリルを検出するステップ、
を含み、DQA1*0101アリルの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。 - ステップ(b)が、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法(PCR−SBT)により行われる、請求項3記載の方法。
- ステップ(b)が、
(b1)配列番号3に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号4に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、又は
(b2)配列番号5に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号6に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
あるいは(b1)及び(b2)の両方のステップを含む、請求項3又は4記載の方法。 - ステップ(b)が、
(b3)得られた増幅産物の塩基配列を決定するステップ、
をさらに含む、請求項5記載の方法。 - 被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖の75番目のアミノ酸がバリンであるか否か、並びにウシ主要組織適合抗原DR分子β鎖の74番目、77番目及び78番目のアミノ酸がそれぞれグルタミン酸、アルギニン及びバリンであるか否かを判定することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
- 被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子における配列番号1に示される塩基配列を有するDQA1*0101アリルを検出すること、並びにウシ主要組織適合抗原DR分子β鎖の74番目、77番目及び78番目のアミノ酸がそれぞれグルタミン酸、アルギニン及びバリンであるか否かを判定することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
- 被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子における配列番号1に示される塩基配列を有するDQA1*0101アリルを検出すること、及びウシ主要組織適合抗原DR分子β鎖をコードするDRB3遺伝子における配列番号14に示される塩基配列を有するDRB3*0701アリルを検出することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
- 被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法であって、
(a)被験ウシからゲノムDNA又はmRNAを調製するステップ、
(b)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子のDQA1*0101アリルを検出するステップ、
(c)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DR分子β鎖をコードするDRB3遺伝子のDRB3*0701アリルを検出するステップ、
を含み、DQA1*0101アリル及びDRB3*0701アリルの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。 - ステップ(b)及び(c)が、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法(PCR−SBT)により行われる、請求項10記載の方法。
- 被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原DR分子β鎖をコードするDRB3遺伝子における配列番号14に示される塩基配列を有するDRB3*0701アリルを検出すること;ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子における配列番号1に示される塩基配列を有するDQA1*0101アリルを検出すること;ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA2遺伝子における配列番号22に示される塩基配列を有するDQA2*22031アリルを検出すること;及びウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA3遺伝子の存在を検出することを含む、被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法。
- 被験ウシにおけるウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定する方法であって、
(a)被験ウシからゲノムDNA又はmRNAを調製するステップ、
(b)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DR分子β鎖をコードするDRB3遺伝子のDRB3*0701アリルを検出するステップ、
(c)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子のDQA1*0101アリルを検出するステップ、
(d)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA2遺伝子のDQA2*22031アリルを検出するステップ、
(e)ゲノムDNA又はmRNAにおけるウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA3遺伝子の存在を検出するステップ、
を含み、DRB3*0701アリル、DQA1*0101アリル及びDQA2*22031アリルが存在し、DQA3遺伝子が存在しないハプロタイプの存在は、該被験ウシがウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有することを示すものである、上記方法。 - 請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法を用いてウシ白血病発症に対する抵抗性を有すると判定されたウシを用いてウシを作出することを特徴とする、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を有するウシの作出方法。
- ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子のDQA1*0101アリルを検出する手段を含むことを特徴とする、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定するためのキット。
- ウシ主要組織適合抗原DQ分子α鎖をコードするDQA1遺伝子のDQA1*0101アリルを検出する手段、及びウシ主要組織適合抗原DR分子β鎖をコードするDRB3遺伝子のDRB3*0701アリルを検出する手段を含むことを特徴とする、ウシ白血病ウイルス感染によるウシ白血病発症に対する抵抗性を判定するためのキット。
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