JP2001238679A - 牛白血病の発症抵抗性の判定方法 - Google Patents
牛白血病の発症抵抗性の判定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ウシ個体のウシ白血病ウイルス(BLV) に対す
る白血病発症の抵抗性を遺伝子工学的な手法で簡便かつ
高精度に判定する方法を提供する。 【解決手段】 ウシ白血病ウイルスBLV に対するウシの
白血病発症の抵抗性を判定する方法であって、ウシ個体
のウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番
号74で特定されるアミノ酸がGluであり、アミノ酸番号7
7で特定されるアミノ酸がArgであり、かつアミノ酸番号
78で特定されるアミノ酸がVal であるウシ個体を白血病
に対する発症抵抗性ありと判定する方法、及びさらにア
ミノ酸番号71で特定されるアミノ酸がLys又はArgである
場合にそのウシ個体を白血病に対する発症抵抗性が高い
と判定する方法。
る白血病発症の抵抗性を遺伝子工学的な手法で簡便かつ
高精度に判定する方法を提供する。 【解決手段】 ウシ白血病ウイルスBLV に対するウシの
白血病発症の抵抗性を判定する方法であって、ウシ個体
のウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番
号74で特定されるアミノ酸がGluであり、アミノ酸番号7
7で特定されるアミノ酸がArgであり、かつアミノ酸番号
78で特定されるアミノ酸がVal であるウシ個体を白血病
に対する発症抵抗性ありと判定する方法、及びさらにア
ミノ酸番号71で特定されるアミノ酸がLys又はArgである
場合にそのウシ個体を白血病に対する発症抵抗性が高い
と判定する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウシ白血病ウイル
スBLV に対するウシの白血病発症の抵抗性を評価する方
法に関する。
スBLV に対するウシの白血病発症の抵抗性を評価する方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】主要組織適合抗原(MHC) は、生体の感染
防御機構において自己−非自己の識別に関与する分子で
あり、α鎖及びβ2MからなるクラスＩとα鎖及びβ鎖か
らなるクラスIIとからなり、それぞれのα１とα２ドメ
イン及びα１とβ１ドメインには抗原ペプチドを噛み込
む溝が存在している。そして、この溝に収容された断片
化ペプチドのみがＴ細胞レセプターによって認識される
という特徴を有しており、クラスＩを認識したCD8+細胞
によって細胞死（細胞性免疫）が達成され、クラスIIを
認識した CD4+ 細胞によって主として抗体産生（液性免
疫）が誘導される。
防御機構において自己−非自己の識別に関与する分子で
あり、α鎖及びβ2MからなるクラスＩとα鎖及びβ鎖か
らなるクラスIIとからなり、それぞれのα１とα２ドメ
イン及びα１とβ１ドメインには抗原ペプチドを噛み込
む溝が存在している。そして、この溝に収容された断片
化ペプチドのみがＴ細胞レセプターによって認識される
という特徴を有しており、クラスＩを認識したCD8+細胞
によって細胞死（細胞性免疫）が達成され、クラスIIを
認識した CD4+ 細胞によって主として抗体産生（液性免
疫）が誘導される。
【０００３】MHC は最も多型に富んだ遺伝子群であり、
そのハプロタイプによってペプチド収容溝のポケットの
位置、形、大きさ、及び性状が異なり、それに伴って噛
み込まれる断片化ペプチドの結合状態が変化し、個体ご
との免疫応答及び疾患感受性を決定しているものと考え
られている。MHC ハプロタイプと疾患抵抗性（抗病性）
又は発症可能性（易病性）との相関については、例え
ば、ヒト免疫不全ウイウス(HIV)、成人Ｔ細胞白血病ウ
イルス(HTLV)、及びマラリヤに関する報告がある。一
方、ウシMHC(BoLA) クラスII遺伝子については、これま
でに DQA, DQB, DRA,DRB, DNA, DOB, DYA, 及びDYB 遺
伝子の存在が推測されている。なかでも、DRB遺伝子座
において同定されている３つの遺伝子(DRB1 〜B3) のう
ち、DRB3については機能的な蛋白質をコードすることが
知られており、現在までに73種類の対立遺伝子の存在が
明らかにされている。しかしながら、ウシの感染性疾患
とウシMHC(BoLA) ハプロタイプとの相関については従来
ほとんど報告がない。
そのハプロタイプによってペプチド収容溝のポケットの
位置、形、大きさ、及び性状が異なり、それに伴って噛
み込まれる断片化ペプチドの結合状態が変化し、個体ご
との免疫応答及び疾患感受性を決定しているものと考え
られている。MHC ハプロタイプと疾患抵抗性（抗病性）
又は発症可能性（易病性）との相関については、例え
ば、ヒト免疫不全ウイウス(HIV)、成人Ｔ細胞白血病ウ
イルス(HTLV)、及びマラリヤに関する報告がある。一
方、ウシMHC(BoLA) クラスII遺伝子については、これま
でに DQA, DQB, DRA,DRB, DNA, DOB, DYA, 及びDYB 遺
伝子の存在が推測されている。なかでも、DRB遺伝子座
において同定されている３つの遺伝子(DRB1 〜B3) のう
ち、DRB3については機能的な蛋白質をコードすることが
知られており、現在までに73種類の対立遺伝子の存在が
明らかにされている。しかしながら、ウシの感染性疾患
とウシMHC(BoLA) ハプロタイプとの相関については従来
ほとんど報告がない。
【０００４】特に、ヒト免疫不全ウイウス (HIV)と同様
にウイルス増殖を調節する遺伝子PXを有しており、HTLV
-Iに最も近縁のレトロウイルスであるウシ白血病ウイル
ス(BLV) については、ウシMHC(BoLA) ハプロタイプと持
続性リンパ球増多症との相関に関して米国のグループが
抗病性を中心に報告しているが、白血病発症可能性との
関連性の報告は全くない。このウイルスに感染したウシ
の割合（日本における感染率）は10〜20％であり、その
うちの1 〜2 ％は10〜15年程度という長期の潜伏期間の
後に極めて悪性の地方病性ウシ白血病を発症して死に至
るので、このウイルスが引き起こす畜産農家への経済的
損失は非常に深刻である。ウシMHC(BoLA)ハプロタイプ
の解析によってBLV 感染後のウシの発症可能性を簡単に
判定できるようになれば、発症抵抗性のウシを予め選択
して飼育することが可能になり、極めて安全にウシの飼
育を継続することが可能になるものと期待される。
にウイルス増殖を調節する遺伝子PXを有しており、HTLV
-Iに最も近縁のレトロウイルスであるウシ白血病ウイル
ス(BLV) については、ウシMHC(BoLA) ハプロタイプと持
続性リンパ球増多症との相関に関して米国のグループが
抗病性を中心に報告しているが、白血病発症可能性との
関連性の報告は全くない。このウイルスに感染したウシ
の割合（日本における感染率）は10〜20％であり、その
うちの1 〜2 ％は10〜15年程度という長期の潜伏期間の
後に極めて悪性の地方病性ウシ白血病を発症して死に至
るので、このウイルスが引き起こす畜産農家への経済的
損失は非常に深刻である。ウシMHC(BoLA)ハプロタイプ
の解析によってBLV 感染後のウシの発症可能性を簡単に
判定できるようになれば、発症抵抗性のウシを予め選択
して飼育することが可能になり、極めて安全にウシの飼
育を継続することが可能になるものと期待される。
【０００５】一方、本発明者らは、先にウシMHC(BoLA)
クラスII遺伝子のうち、DRB 遺伝子座の構造を解析し
て、DRB3遺伝子(BoLA-DRB3) 及びその遺伝子産物の構造
を明らかにした (Biochem. Biophys. Res. Commun., 20
9, pp.981-988, 1995)。本発明者はさらにこの遺伝子の
機能を研究するうち、白血病発症牛と未発症牛とでは、
BoLA-DRB3 の中で特に多型が認められる第二エクソン
（β１ドメイン）からの遺伝子産物において、明らかに
アミノ酸配列の異なる部分が存在することを見いだし
た。また、このアミノ酸置換が、BLV に対する発症可能
性及び発症抵抗性に直接関与していることを見いだし
た。このような知見を基にして、本発明者らは、ウシ白
血病ウイルスBLV に対するウシの白血病発症の抵抗性を
判定する方法であって、ウシ個体のウシMHC ClassII DR
β鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号78で特定されるアミ
ノ酸がVal であるウシ個体を白血病の発症抵抗性ありと
判定する方法を完成した（国際公開98/3680号）。
クラスII遺伝子のうち、DRB 遺伝子座の構造を解析し
て、DRB3遺伝子(BoLA-DRB3) 及びその遺伝子産物の構造
を明らかにした (Biochem. Biophys. Res. Commun., 20
9, pp.981-988, 1995)。本発明者はさらにこの遺伝子の
機能を研究するうち、白血病発症牛と未発症牛とでは、
BoLA-DRB3 の中で特に多型が認められる第二エクソン
（β１ドメイン）からの遺伝子産物において、明らかに
アミノ酸配列の異なる部分が存在することを見いだし
た。また、このアミノ酸置換が、BLV に対する発症可能
性及び発症抵抗性に直接関与していることを見いだし
た。このような知見を基にして、本発明者らは、ウシ白
血病ウイルスBLV に対するウシの白血病発症の抵抗性を
判定する方法であって、ウシ個体のウシMHC ClassII DR
β鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号78で特定されるアミ
ノ酸がVal であるウシ個体を白血病の発症抵抗性ありと
判定する方法を完成した（国際公開98/3680号）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明の課題は、ウシ白血病ウイルス(BLV) と
ウシMHC(BoLA) ハプロタイプとの相関を解明し、ウシ個
体のウシ白血病ウイルス(BLV) に対する白血病発症の抵
抗性を遺伝子工学的な手法で簡便かつ高精度に判定する
方法を提供することにある。より具体的には、上記の国
際公開98/3680号に記載された判定方法よりもさらに高
精度な判定を可能にする判定方法を提供することが本発
明の課題である。また、本発明の別の課題は、上記の判
定方法に有用なプライマー・セットを提供することにあ
る。
の手段】本発明の課題は、ウシ白血病ウイルス(BLV) と
ウシMHC(BoLA) ハプロタイプとの相関を解明し、ウシ個
体のウシ白血病ウイルス(BLV) に対する白血病発症の抵
抗性を遺伝子工学的な手法で簡便かつ高精度に判定する
方法を提供することにある。より具体的には、上記の国
際公開98/3680号に記載された判定方法よりもさらに高
精度な判定を可能にする判定方法を提供することが本発
明の課題である。また、本発明の別の課題は、上記の判
定方法に有用なプライマー・セットを提供することにあ
る。
【０００７】本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭
意研究を行ったところ、特にウシMHCClassII DRβ鎖の
β１ドメインのアミノ酸番号77で特定されるArgがウシ
白血病の発症抵抗性に重要な意義を有していることを見
出し、本発明を完成するに至った。
意研究を行ったところ、特にウシMHCClassII DRβ鎖の
β１ドメインのアミノ酸番号77で特定されるArgがウシ
白血病の発症抵抗性に重要な意義を有していることを見
出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、ウシ白血病ウイルスBL
V に対するウシの白血病発症の抵抗性を判定する方法で
あって、ウシ個体のウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメ
インのアミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGlu（グ
ルタミン酸）であり、アミノ酸番号77で特定されるアミ
ノ酸がArg（アルギニン）であり、かつアミノ酸番号78
で特定されるアミノ酸がVal （バリン）であるウシ個体
を白血病に対する発症抵抗性ありと判定する方法を提供
するものである。
V に対するウシの白血病発症の抵抗性を判定する方法で
あって、ウシ個体のウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメ
インのアミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGlu（グ
ルタミン酸）であり、アミノ酸番号77で特定されるアミ
ノ酸がArg（アルギニン）であり、かつアミノ酸番号78
で特定されるアミノ酸がVal （バリン）であるウシ個体
を白血病に対する発症抵抗性ありと判定する方法を提供
するものである。
【０００９】また、本発明により、ウシ白血病ウイルス
BLV に対するウシの白血病発症の抵抗性を判定する方法
であって、ウシ個体のウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ド
メインのアミノ酸番号71で特定されるアミノ酸がLys
（リジン）又はArgであり、アミノ酸番号74で特定され
るアミノ酸がGluであり、アミノ酸番号77で特定される
アミノ酸がArgであり、かつアミノ酸番号78で特定され
るアミノ酸がValであるウシ個体を白血病に対する発症
抵抗性が高いと判定する方法を提供するものである。こ
れらの発明の好ましい態様によれば、ウシ白血病ウイル
スBLV に感染したウシに対して行う上記方法が提供され
る。
BLV に対するウシの白血病発症の抵抗性を判定する方法
であって、ウシ個体のウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ド
メインのアミノ酸番号71で特定されるアミノ酸がLys
（リジン）又はArgであり、アミノ酸番号74で特定され
るアミノ酸がGluであり、アミノ酸番号77で特定される
アミノ酸がArgであり、かつアミノ酸番号78で特定され
るアミノ酸がValであるウシ個体を白血病に対する発症
抵抗性が高いと判定する方法を提供するものである。こ
れらの発明の好ましい態様によれば、ウシ白血病ウイル
スBLV に感染したウシに対して行う上記方法が提供され
る。
【００１０】本発明の別の態様によれば、ウシ白血病ウ
イルスBLV に対するウシの白血病発症の抵抗性を判定す
る方法であって、下記の工程： (1)ウシ個体から分離したゲノムDNA をポリメラーゼ連
鎖反応(PCR) により増幅してウシMHC ClassII DRβ鎖の
β１ドメインの一部又は全部をコードするDNA を含むPC
R 産物を調製する工程：及び (2)上記PCR 産物に含まれるDNA によりコードされるア
ミノ酸配列において、ウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ド
メインのアミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGluで
あり、アミノ酸番号77で特定されるアミノ酸がArgであ
り、かつアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がVal で
あるウシ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する工
程；を含む方法が提供される。
イルスBLV に対するウシの白血病発症の抵抗性を判定す
る方法であって、下記の工程： (1)ウシ個体から分離したゲノムDNA をポリメラーゼ連
鎖反応(PCR) により増幅してウシMHC ClassII DRβ鎖の
β１ドメインの一部又は全部をコードするDNA を含むPC
R 産物を調製する工程：及び (2)上記PCR 産物に含まれるDNA によりコードされるア
ミノ酸配列において、ウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ド
メインのアミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGluで
あり、アミノ酸番号77で特定されるアミノ酸がArgであ
り、かつアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がVal で
あるウシ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する工
程；を含む方法が提供される。
【００１１】また、ウシ白血病ウイルスBLV に対するウ
シの白血病発症の抵抗性を判定する方法であって、下記
の工程： (1)ウシ個体から分離したゲノムDNA をポリメラーゼ連
鎖反応(PCR) により増幅してウシMHC ClassII DRβ鎖の
β１ドメインの一部又は全部をコードするDNA を含むPC
R 産物を調製する工程：及び (2)上記PCR 産物に含まれるDNA によりコードされるア
ミノ酸配列において、ウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ド
メインのアミノ酸番号71で特定されるアミノ酸がLys又
はArgであり、アミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がG
luであり、アミノ酸番号77で特定されるアミノ酸がArg
であり、かつアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がVa
l であるウシ個体を白血病に対する発症抵抗性が高いと
判定する工程；を含む方法が本発明により提供される。
シの白血病発症の抵抗性を判定する方法であって、下記
の工程： (1)ウシ個体から分離したゲノムDNA をポリメラーゼ連
鎖反応(PCR) により増幅してウシMHC ClassII DRβ鎖の
β１ドメインの一部又は全部をコードするDNA を含むPC
R 産物を調製する工程：及び (2)上記PCR 産物に含まれるDNA によりコードされるア
ミノ酸配列において、ウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ド
メインのアミノ酸番号71で特定されるアミノ酸がLys又
はArgであり、アミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がG
luであり、アミノ酸番号77で特定されるアミノ酸がArg
であり、かつアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がVa
l であるウシ個体を白血病に対する発症抵抗性が高いと
判定する工程；を含む方法が本発明により提供される。
【００１２】さらに本発明により、白血病に対する発症
抵抗性が高いウシ個体を簡便に選別する方法が提供され
る。この方法は、下記の工程： (1) ForwardプライマーとしてDRB40及びReverse プライ
マーとしてSRB3を用いてウシ個体から分離したゲノムDN
A をポリメラーゼ連鎖反応(PCR) により増幅してウシMH
C ClassII DRβ鎖のβ１ドメインの一部又は全部をコー
ドするDNA を含むPCR 産物を調製する工程：及び (2)上記PCR産物がPstI及びDraIIIで消化されない場合に
そのウシ個体が白血病に対する発症抵抗性が高いと判定
する工程を含む方法が提供される。この方法で選別され
たウシ個体は、MHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインにお
いてアミノ酸番号71で特定されるアミノ酸がLys又はArg
であり、アミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGluで
あり、アミノ酸番号77で特定されるアミノ酸がArgであ
り、かつアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がValで
ある。
抵抗性が高いウシ個体を簡便に選別する方法が提供され
る。この方法は、下記の工程： (1) ForwardプライマーとしてDRB40及びReverse プライ
マーとしてSRB3を用いてウシ個体から分離したゲノムDN
A をポリメラーゼ連鎖反応(PCR) により増幅してウシMH
C ClassII DRβ鎖のβ１ドメインの一部又は全部をコー
ドするDNA を含むPCR 産物を調製する工程：及び (2)上記PCR産物がPstI及びDraIIIで消化されない場合に
そのウシ個体が白血病に対する発症抵抗性が高いと判定
する工程を含む方法が提供される。この方法で選別され
たウシ個体は、MHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインにお
いてアミノ酸番号71で特定されるアミノ酸がLys又はArg
であり、アミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGluで
あり、アミノ酸番号77で特定されるアミノ酸がArgであ
り、かつアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がValで
ある。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の方法は、ウシ白血病ウイ
ルスBLV に感染したウシ、又はウシ白血病ウイルスBLV
に未感染のウシについて、その個体の白血病発症の抵抗
性を判定する方法である。ウシ個体がウシ白血病ウイル
スBLV に感染しているか否かは、抗ウシ白血病ウイルス
BLV 抗体を用いた試験により容易に確認することが可能
である。
ルスBLV に感染したウシ、又はウシ白血病ウイルスBLV
に未感染のウシについて、その個体の白血病発症の抵抗
性を判定する方法である。ウシ個体がウシ白血病ウイル
スBLV に感染しているか否かは、抗ウシ白血病ウイルス
BLV 抗体を用いた試験により容易に確認することが可能
である。
【００１４】本発明の好ましい態様では、ウシ個体から
ゲノムDNA を分離した後、PCR 法によってウシMHC Clas
sII のDRβ鎖のβ１ドメイン (DRB3遺伝子の第二エクソ
ン)の一部又は全部をコードする遺伝子を特異的に増幅
し、得られたPCR 産物のシークエンシングを行ってβ１
ドメインのアミノ酸番号71から78で特定されるアミノ酸
配列を推定する。このアミノ酸配列において、アミノ酸
番号74で特定されるアミノ酸がGluであり、アミノ酸番
号77で特定されるアミノ酸がArgであり、かつアミノ酸
番号78で特定されるアミノ酸がVal であるウシ個体は白
血病に対する発症抵抗性ありと判定される。また、アミ
ノ酸番号71で特定されるアミノ酸がLys又はArgであり、
アミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGluであり、ア
ミノ酸番号77で特定されるアミノ酸がArgであり、かつ
アミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がVal であるウシ
個体は白血病に対して高い発症抵抗性を有していると判
定される。
ゲノムDNA を分離した後、PCR 法によってウシMHC Clas
sII のDRβ鎖のβ１ドメイン (DRB3遺伝子の第二エクソ
ン)の一部又は全部をコードする遺伝子を特異的に増幅
し、得られたPCR 産物のシークエンシングを行ってβ１
ドメインのアミノ酸番号71から78で特定されるアミノ酸
配列を推定する。このアミノ酸配列において、アミノ酸
番号74で特定されるアミノ酸がGluであり、アミノ酸番
号77で特定されるアミノ酸がArgであり、かつアミノ酸
番号78で特定されるアミノ酸がVal であるウシ個体は白
血病に対する発症抵抗性ありと判定される。また、アミ
ノ酸番号71で特定されるアミノ酸がLys又はArgであり、
アミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGluであり、ア
ミノ酸番号77で特定されるアミノ酸がArgであり、かつ
アミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がVal であるウシ
個体は白血病に対して高い発症抵抗性を有していると判
定される。
【００１５】対立遺伝子の少なくとも一方においてβ１
ドメインの上記アミノ酸配列が上記の特定のアミノ酸残
基を含む場合には、そのウシ個体は白血病に対して抵抗
性を有しているが、上記の判定をより正確に行うために
は、対立遺伝子（ハプロタイプ）における上記アミノ酸
配列を比較することが好ましい。両方の対立遺伝子の上
記アミノ酸配列(アミノ酸番号71-78)において、アミノ
酸番号74で特定されるアミノ酸がGluであり、アミノ酸
番号77で特定されるアミノ酸がArgであり、かつアミノ
酸番号78で特定されるアミノ酸がVal であるウシ個体は
白血病に対して発症抵抗性が高い。また、両方の対立遺
伝子の上記アミノ酸配列(アミノ酸番号71-78)におい
て、アミノ酸番号71で特定されるアミノ酸がLys又はArg
であり、アミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGluで
あり、アミノ酸番号77で特定されるアミノ酸がArgであ
り、かつアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がVal で
あるウシ個体は白血病に対して特に高い抵抗性を有して
いる。
ドメインの上記アミノ酸配列が上記の特定のアミノ酸残
基を含む場合には、そのウシ個体は白血病に対して抵抗
性を有しているが、上記の判定をより正確に行うために
は、対立遺伝子（ハプロタイプ）における上記アミノ酸
配列を比較することが好ましい。両方の対立遺伝子の上
記アミノ酸配列(アミノ酸番号71-78)において、アミノ
酸番号74で特定されるアミノ酸がGluであり、アミノ酸
番号77で特定されるアミノ酸がArgであり、かつアミノ
酸番号78で特定されるアミノ酸がVal であるウシ個体は
白血病に対して発症抵抗性が高い。また、両方の対立遺
伝子の上記アミノ酸配列(アミノ酸番号71-78)におい
て、アミノ酸番号71で特定されるアミノ酸がLys又はArg
であり、アミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGluで
あり、アミノ酸番号77で特定されるアミノ酸がArgであ
り、かつアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がVal で
あるウシ個体は白血病に対して特に高い抵抗性を有して
いる。
【００１６】ウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインの
アミノ酸配列については、間ら（Aida, Y., et al., Bi
ochem. Biophys. Res. Commun., 209, pp.981-988, 199
5）による報告がある。国際公開98/3680号の第１図に
は、ウシMHC ClassII DRβ鎖のmRNA の構造(A) 及び cD
NA の全長と遺伝子産物のアミノ酸配列(B) が示されて
いるが、図中、β１ドメインはアミノ酸番号１からアミ
ノ酸番号94までのアミノ酸配列により特定される部分で
ある。
アミノ酸配列については、間ら（Aida, Y., et al., Bi
ochem. Biophys. Res. Commun., 209, pp.981-988, 199
5）による報告がある。国際公開98/3680号の第１図に
は、ウシMHC ClassII DRβ鎖のmRNA の構造(A) 及び cD
NA の全長と遺伝子産物のアミノ酸配列(B) が示されて
いるが、図中、β１ドメインはアミノ酸番号１からアミ
ノ酸番号94までのアミノ酸配列により特定される部分で
ある。
【００１７】本発明の判定方法の対象となるウシは特に
限定されず、ウシ白血病ウイルスBLVに感染する可能性
があり、感染により白血病を発症する可能性があるもの
であれば、乳用種、乳肉兼用種、肉用種、役用種、及び
役肉兼用種などのいかなるウシを対象としてもよい。具
体的には、例えば、黒毛和種、日本短角などの和牛、ホ
ルスタイン、ジャジー、ヘレフォード、アバディーンア
ンガス、フリーシャン等の品種を挙げることができる
が、これらの品種に限定されることはない。
限定されず、ウシ白血病ウイルスBLVに感染する可能性
があり、感染により白血病を発症する可能性があるもの
であれば、乳用種、乳肉兼用種、肉用種、役用種、及び
役肉兼用種などのいかなるウシを対象としてもよい。具
体的には、例えば、黒毛和種、日本短角などの和牛、ホ
ルスタイン、ジャジー、ヘレフォード、アバディーンア
ンガス、フリーシャン等の品種を挙げることができる
が、これらの品種に限定されることはない。
【００１８】ウシ個体からゲノムDNA を調製するための
試料としては、末梢血や臓器などを利用することができ
る。臓器としては、例えば、リンパ節などの組織片を用
いることができる。上記の試料からゲノムDNA を調製す
る方法としては、当業者に利用可能なものであればいか
なるものを利用してもよい。試料として末梢血白血球、
又は末梢血リンパ球を用いる場合には、例えば、Hughes
らの方法 (Hughes, S.H.et al., Cell, 15, pp.1397-14
10, 1978)を用いることができる。臓器を用いる場合に
は、例えば、凍結した組織片をハサミで薄切した後、ド
デシル硫酸ナトリウム、フェノール−クロロホルム法
(Mcknight, G.S., Cell, 14, pp.403-413,1978) により
調製することができる。また、細胞からのゲノムDNA の
簡便抽出法を用いてもよい。その具体例は、国際公開98
/3680号の実施例に示されている。
試料としては、末梢血や臓器などを利用することができ
る。臓器としては、例えば、リンパ節などの組織片を用
いることができる。上記の試料からゲノムDNA を調製す
る方法としては、当業者に利用可能なものであればいか
なるものを利用してもよい。試料として末梢血白血球、
又は末梢血リンパ球を用いる場合には、例えば、Hughes
らの方法 (Hughes, S.H.et al., Cell, 15, pp.1397-14
10, 1978)を用いることができる。臓器を用いる場合に
は、例えば、凍結した組織片をハサミで薄切した後、ド
デシル硫酸ナトリウム、フェノール−クロロホルム法
(Mcknight, G.S., Cell, 14, pp.403-413,1978) により
調製することができる。また、細胞からのゲノムDNA の
簡便抽出法を用いてもよい。その具体例は、国際公開98
/3680号の実施例に示されている。
【００１９】調製したゲノムDNA をPCR 法により増幅す
るにあたり使用するプライマーとしては、ウシMHC Clas
sII のDRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号75から78ま
での部分アミノ酸配列又はβ１ドメインの全長をコード
する遺伝子を含むDNA を増幅できるものであれば、いか
なるものを用いてもよい。
るにあたり使用するプライマーとしては、ウシMHC Clas
sII のDRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号75から78ま
での部分アミノ酸配列又はβ１ドメインの全長をコード
する遺伝子を含むDNA を増幅できるものであれば、いか
なるものを用いてもよい。
【００２０】本発明の方法に特に好適に使用可能なプラ
イマーのセットとして、サイクルシークエンシング及び
ダイナビーズDNA 直接シークエンス等の直接シークセン
ス法が可能な下記のプライマーセット(1) ： Ａプライマー：5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCAC
ATTTCCT-3'；及び Ｂプライマー：5'-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTG
AAACTC-3' を挙げることができる。
イマーのセットとして、サイクルシークエンシング及び
ダイナビーズDNA 直接シークエンス等の直接シークセン
ス法が可能な下記のプライマーセット(1) ： Ａプライマー：5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCAC
ATTTCCT-3'；及び Ｂプライマー：5'-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTG
AAACTC-3' を挙げることができる。
【００２１】また、制限酵素サイトを付加したプライマ
ーセットとして、プライマー・セット(2) Ａプライマー：5'-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-
3'；及び Ｂプライマー：5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3'、 又はプライマー・セット(3) Ａプライマー：5'-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3'、5'-GG
AGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3' 、及び 5'-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' からなる群から選ばれるプライマー； Ｂプライマー：5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' を利用することができる。
ーセットとして、プライマー・セット(2) Ａプライマー：5'-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-
3'；及び Ｂプライマー：5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3'、 又はプライマー・セット(3) Ａプライマー：5'-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3'、5'-GG
AGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3' 、及び 5'-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3' からなる群から選ばれるプライマー； Ｂプライマー：5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' を利用することができる。
【００２２】特に、プライマー・セット(3) を用いて増
幅したPCR アリルをPstIで消化した後、切断パターンの
違いを判定することにより、そのウシ個体が白血病抵抗
性であるか否かを簡便に判定できる。
幅したPCR アリルをPstIで消化した後、切断パターンの
違いを判定することにより、そのウシ個体が白血病抵抗
性であるか否かを簡便に判定できる。
【００２３】さらに、プライマー・セット(4)： Ａプライマー DRB40：5'-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-
3'、 ＢプライマーSRB3：5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' 又はプライマー・セット(5)： Ａプライマー DRB100：5'-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3' ＢプライマーSRB3：5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' を用いて増幅したPCR アリルにPstI及びDraIIIを作用さ
せ、増幅産物が消化されなかった場合には、そのウシ個
体はウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸
番号71で特定されるアミノ酸がLys又はArgであり、アミ
ノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGluであり、アミノ
酸番号77で特定されるアミノ酸がArgであり、かつアミ
ノ酸番号78で特定されるアミノ酸がVal であると判定で
き、白血病に対して高い抵抗性を有することが簡便に判
定できる。もっとも、本発明の方法に利用可能なプライ
マー及びプライマー・セットはこれらに限定されること
はない。
3'、 ＢプライマーSRB3：5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' 又はプライマー・セット(5)： Ａプライマー DRB100：5'-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3' ＢプライマーSRB3：5'-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3' を用いて増幅したPCR アリルにPstI及びDraIIIを作用さ
せ、増幅産物が消化されなかった場合には、そのウシ個
体はウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸
番号71で特定されるアミノ酸がLys又はArgであり、アミ
ノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGluであり、アミノ
酸番号77で特定されるアミノ酸がArgであり、かつアミ
ノ酸番号78で特定されるアミノ酸がVal であると判定で
き、白血病に対して高い抵抗性を有することが簡便に判
定できる。もっとも、本発明の方法に利用可能なプライ
マー及びプライマー・セットはこれらに限定されること
はない。
【００２４】PCR 法に用いるDNA 量は適宜選択可能であ
るが、例えば、末梢血白血球又は末梢血リンパ球を用い
る場合には 0.1〜0.5 μg 程度である。また、上記のよ
うにして増幅されたDNA (PCR産物)のシークエンス決定
法としては、当業者に利用可能なものであればいかなる
ものを利用してもよいが、例えば、直接シークエンス法
などを用いることが好ましい。その具体例は、国際公開
98/3680号の実施例に詳細に記載されている。
るが、例えば、末梢血白血球又は末梢血リンパ球を用い
る場合には 0.1〜0.5 μg 程度である。また、上記のよ
うにして増幅されたDNA (PCR産物)のシークエンス決定
法としては、当業者に利用可能なものであればいかなる
ものを利用してもよいが、例えば、直接シークエンス法
などを用いることが好ましい。その具体例は、国際公開
98/3680号の実施例に詳細に記載されている。
【００２５】なお、多くのウシはヘテロ接合体(heteroz
ygote)であり、父親又は母親由来の対立遺伝子の塩基配
列が異なると、直接シークエンス法ではどちらの対立遺
伝子なのかを決定することができないことがある。この
ような場合、上記のプライマー・セット(2) を用いて増
幅されたPCR 産物を制限酵素EcoRIおよびSal Iで消化
後、ベクターにサブクローニングして、片方の対立遺伝
子のみの塩基配列を決定して比較することにより、もう
一方の対立遺伝子の塩基配列を確実に決定することが可
能になる。より正確に遺伝子情報を得るためには、PCR
産物から両方の対立遺伝子をサブクローニングしてそれ
ぞれの塩基配列を決定することが好ましい。その具体的
方法及び利用可能なプライマーも国際公開98/3680号の
実施例に詳細に記載されている。
ygote)であり、父親又は母親由来の対立遺伝子の塩基配
列が異なると、直接シークエンス法ではどちらの対立遺
伝子なのかを決定することができないことがある。この
ような場合、上記のプライマー・セット(2) を用いて増
幅されたPCR 産物を制限酵素EcoRIおよびSal Iで消化
後、ベクターにサブクローニングして、片方の対立遺伝
子のみの塩基配列を決定して比較することにより、もう
一方の対立遺伝子の塩基配列を確実に決定することが可
能になる。より正確に遺伝子情報を得るためには、PCR
産物から両方の対立遺伝子をサブクローニングしてそれ
ぞれの塩基配列を決定することが好ましい。その具体的
方法及び利用可能なプライマーも国際公開98/3680号の
実施例に詳細に記載されている。
【００２６】実施例 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する
が、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはな
い。なお、以下の実施例において用いられるプライマー
の使用意義とウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインの
タイピングの詳細については、特願平11-373483号明細
書に記載されている。
が、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはな
い。なお、以下の実施例において用いられるプライマー
の使用意義とウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインの
タイピングの詳細については、特願平11-373483号明細
書に記載されている。
【００２７】(A)材料と方法 (1)PCT-SBT法 120 μMの各dNTP、1.5 mMのMgCl2、0.2μMの各プライマ
ー、2ユニットの組み替えTa1 DNA伸長酵素(rTaq)(TOYOB
O)を含む50μlの×1 rTaq緩衝液 [10mM Tris-HCl, 50mM
KCl, 0.1% TritonX-100]にウシ個体より簡易抽出法に
より調製したゲノムDNA 20〜40 μgを溶解した。変性処
理を95℃で 5分間行い、次に95℃で40秒;60℃で30秒;
及び72℃で40秒の処理を1サイクルとして20サイクルの
処理の後、さらに72℃で2分間伸長させた。プライマーと
しては、ウシMHC Class II DRβ鎖：BoLA-DRβ) のβ1
ドメインをコードするDRB3遺伝子の第二エクソンをPCR
法により特異的に増幅できるプライマーを用いた。 ERB3N : 5'- GGA ATT CCT CTC TCT GCA GCA CAT TTC C
-3' HL031 : 5'- TTT AAA TTC GCG CTC ACC TCG CCG CT-3'
ー、2ユニットの組み替えTa1 DNA伸長酵素(rTaq)(TOYOB
O)を含む50μlの×1 rTaq緩衝液 [10mM Tris-HCl, 50mM
KCl, 0.1% TritonX-100]にウシ個体より簡易抽出法に
より調製したゲノムDNA 20〜40 μgを溶解した。変性処
理を95℃で 5分間行い、次に95℃で40秒;60℃で30秒;
及び72℃で40秒の処理を1サイクルとして20サイクルの
処理の後、さらに72℃で2分間伸長させた。プライマーと
しては、ウシMHC Class II DRβ鎖：BoLA-DRβ) のβ1
ドメインをコードするDRB3遺伝子の第二エクソンをPCR
法により特異的に増幅できるプライマーを用いた。 ERB3N : 5'- GGA ATT CCT CTC TCT GCA GCA CAT TTC C
-3' HL031 : 5'- TTT AAA TTC GCG CTC ACC TCG CCG CT-3'
【００２８】上記のPCRで得られた産物のうち1 μlを8
種類の対立遺伝子群特異的プライマー及び全ての対立遺
伝子を増幅できるForwardプライマーを用いたPCR (PCR-
SSP)法で増幅させた。120 μMの各dNTP、1.5 mMのMgC
l2、0.2μMの対立遺伝子群特異的Forwardプライマー、2
00μMのReverseプライマー、及び1ユニットのAmpliTaq
GoldTM DNA 伸長酵素（PE Biosystems）、1 μlの上記P
CR産物を含む25 μlの×1GeneAmpR Gold Bufferに対し
て変性処理を95℃で 10分間行い、次に95℃で1分間; 64
℃で30秒; 及び72℃で30秒の処理を1サイクルとして20
サイクルの処理を行い、 さらに72℃で5分間 伸長させ
た。
種類の対立遺伝子群特異的プライマー及び全ての対立遺
伝子を増幅できるForwardプライマーを用いたPCR (PCR-
SSP)法で増幅させた。120 μMの各dNTP、1.5 mMのMgC
l2、0.2μMの対立遺伝子群特異的Forwardプライマー、2
00μMのReverseプライマー、及び1ユニットのAmpliTaq
GoldTM DNA 伸長酵素（PE Biosystems）、1 μlの上記P
CR産物を含む25 μlの×1GeneAmpR Gold Bufferに対し
て変性処理を95℃で 10分間行い、次に95℃で1分間; 64
℃で30秒; 及び72℃で30秒の処理を1サイクルとして20
サイクルの処理を行い、 さらに72℃で5分間 伸長させ
た。
【００２９】a)対立遺伝子群特異的Forwardプライマー:
BoLA-DRB3 第二エクソンがコードするアミノ酸の配列に
より、対立遺伝子を8群に分け、各々を特異的に増幅で
きる以下のプライマーを設計した。 sp1: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC ACA TTT CCT G
CA GTA TC -3' sp2: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC ACA TTT CCT G
GA GTA TTC TAA -3' sp3: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC ACA TTT CCT G
GA GTA TTA -3' sp4: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC ACA TTT CCT G
GA GTA TTG -3' sp5: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAC ATT TCC TGG A
GT ATG -3' sp6: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT GCA CA TTT CCT G
GA GTA TC -3' sp7: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC ACA TTT CCT G
GA GTA TA -3' sp8: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAC A TTT CCT G
GA GTA TTC TAC -3' b)全ての対立遺伝子群を増幅できるForwardプライマ
ー： DRB3ALL: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATT CCT CTC T
CT GCA GCA CAT TTC CTG-3' c) Reverseプライマー:全ての対立遺伝子を増幅できプ
ライマーとして以下のプライマーを設計した。 DRB3B : 5'- CAG GAA ACA GCT ATG ACC CGC CGC TGC AC
A GTG AAA CTC -3'
BoLA-DRB3 第二エクソンがコードするアミノ酸の配列に
より、対立遺伝子を8群に分け、各々を特異的に増幅で
きる以下のプライマーを設計した。 sp1: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC ACA TTT CCT G
CA GTA TC -3' sp2: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC ACA TTT CCT G
GA GTA TTC TAA -3' sp3: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC ACA TTT CCT G
GA GTA TTA -3' sp4: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC ACA TTT CCT G
GA GTA TTG -3' sp5: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAC ATT TCC TGG A
GT ATG -3' sp6: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT GCA CA TTT CCT G
GA GTA TC -3' sp7: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC ACA TTT CCT G
GA GTA TA -3' sp8: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAC A TTT CCT G
GA GTA TTC TAC -3' b)全ての対立遺伝子群を増幅できるForwardプライマ
ー： DRB3ALL: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATT CCT CTC T
CT GCA GCA CAT TTC CTG-3' c) Reverseプライマー:全ての対立遺伝子を増幅できプ
ライマーとして以下のプライマーを設計した。 DRB3B : 5'- CAG GAA ACA GCT ATG ACC CGC CGC TGC AC
A GTG AAA CTC -3'
【００３０】PCR産物を2%アガロースゲルで電気泳動後、
エチジウムブロマイドで染色を施した。検出された増
幅産物のバンドが1つの場合は全ての対立遺伝子を増幅
できるプライマーを用いたPCR産物を用い、2つの増幅産
物が確認された場合は2つのPCT産物を用いて、以下のシ
ーケンスプライマーにより塩基配列を決定した。 M13(-21): 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT - 3' M13rev: 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC - 3'
エチジウムブロマイドで染色を施した。検出された増
幅産物のバンドが1つの場合は全ての対立遺伝子を増幅
できるプライマーを用いたPCR産物を用い、2つの増幅産
物が確認された場合は2つのPCT産物を用いて、以下のシ
ーケンスプライマーにより塩基配列を決定した。 M13(-21): 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT - 3' M13rev: 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC - 3'
【００３１】PCR産物をそれぞれ1 μlずつBigDyeTM Ter
minator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Bi
osystems)およびhalf BD (GENPAK Ltd.)を用いたシーケ
ンス反応に用いた。PCR産物1 μl、3 pmolプライマー 1
μl、Terminator Ready Reaction Mix 1 μl、half BD
3 μl、及び滅菌水4 μlを混合し、添付の説明書に記
載された条件に従って96℃で10秒; 50℃で5秒; 及び60
℃で4分間の処理を1サイクルとして25サイクルの処理を
行い、説明書に従ってエタノール沈殿し、ABI310シーケ
ンサー用のTSR 10 μlに溶解し、ABI310 (PE Biosystem
s)でシーケンスを行った。それぞれの対立遺伝子の塩基
配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合
し、対立遺伝子を決定した。
minator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Bi
osystems)およびhalf BD (GENPAK Ltd.)を用いたシーケ
ンス反応に用いた。PCR産物1 μl、3 pmolプライマー 1
μl、Terminator Ready Reaction Mix 1 μl、half BD
3 μl、及び滅菌水4 μlを混合し、添付の説明書に記
載された条件に従って96℃で10秒; 50℃で5秒; 及び60
℃で4分間の処理を1サイクルとして25サイクルの処理を
行い、説明書に従ってエタノール沈殿し、ABI310シーケ
ンサー用のTSR 10 μlに溶解し、ABI310 (PE Biosystem
s)でシーケンスを行った。それぞれの対立遺伝子の塩基
配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合
し、対立遺伝子を決定した。
【００３２】(2)PCR-RFLP法 (a)ForwardプライマーとしてウシMHC ClassII DRβ鎖の
β１ドメインの40-62番目の塩基と相補鎖を作るDRB40
(5'-GAG TGT CAT TTC TTC AAC GGG AC-3')、及びRevers
e プライマーとしてSRB3を使用してウシ個体より簡易抽
出法により調製したゲノムDNAをPCR増幅した。94℃で4
分間熱変性した後、 変性(94℃)1分間、アニーリング(63
℃) 2分間、伸長(72℃)2分間を１サイクルとして30サイ
クルの増幅を行い、 最後に伸長(72℃)を10分間行った。
247bpのPCR産物の増幅が予想された。
β１ドメインの40-62番目の塩基と相補鎖を作るDRB40
(5'-GAG TGT CAT TTC TTC AAC GGG AC-3')、及びRevers
e プライマーとしてSRB3を使用してウシ個体より簡易抽
出法により調製したゲノムDNAをPCR増幅した。94℃で4
分間熱変性した後、 変性(94℃)1分間、アニーリング(63
℃) 2分間、伸長(72℃)2分間を１サイクルとして30サイ
クルの増幅を行い、 最後に伸長(72℃)を10分間行った。
247bpのPCR産物の増幅が予想された。
【００３３】(b)ForwardプライマーとしてウシMHC Clas
sII DRβ鎖のβ１ドメインの100-122番目の塩基と相補
鎖を作るDRB100 (5'-GGA GAA GAG TTC GTG CGC TTC GA-
3')、及びReverseプライマーとしてSRB3を使用してウシ
個体より簡易抽出法により調製したゲノムDNAをPCR増幅
した。94℃で4分間で熱変性した後、 変性(94℃)1分間、
アニーリング(66℃)2分間、伸長(72℃)2分間を１サイク
ルとして30サイクルの増幅を行い、 最後に伸長(72℃)を
10分間行った。 187bpのPCR産物の増幅が予想された。得
られた(a)及び(b)のPCR産物を2U PstI又は4U DraIIIで3
7℃で2時間消化した後、 5%アガロースゲルを用いて電気
泳動を行い切断パターンを識別した。
sII DRβ鎖のβ１ドメインの100-122番目の塩基と相補
鎖を作るDRB100 (5'-GGA GAA GAG TTC GTG CGC TTC GA-
3')、及びReverseプライマーとしてSRB3を使用してウシ
個体より簡易抽出法により調製したゲノムDNAをPCR増幅
した。94℃で4分間で熱変性した後、 変性(94℃)1分間、
アニーリング(66℃)2分間、伸長(72℃)2分間を１サイク
ルとして30サイクルの増幅を行い、 最後に伸長(72℃)を
10分間行った。 187bpのPCR産物の増幅が予想された。得
られた(a)及び(b)のPCR産物を2U PstI又は4U DraIIIで3
7℃で2時間消化した後、 5%アガロースゲルを用いて電気
泳動を行い切断パターンを識別した。
【００３４】(B)結果 (1)PCT-SBT法 各病態を示すBLV感染牛（黒毛和種牛）のMHC ClassII D
Rβ鎖のβ１ドメインの塩基配列を決定した。ウシ白血
病ウイルスBLV に感染しているものの白血病を発症して
いないウシ［リンパ球増多症牛（前癌状態:PL）15頭、
及び未発症牛（抗体陽性健康未発症牛：Healthy）43
頭］、及び白血病発症牛（23頭；Lymphoma）由来のウシ
MHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸を比較し
たところ、未発症健康牛では白血病発症牛に比較して07
01、1302、及び1401の対立遺伝子が有意に多く認められ
た。一方、未発症健康牛に比較してPLおよび発症牛では
1601が有意に高く、発症牛では1001が有意に高かった
（表１）。なお、BLV 感染牛の感染状態は、レヴィーら
(Levy, D., et al., Int. J. Cancer, 19, pp.822-82
7,1977) 及び間ら (Aida, Y., et al., Cancer Res., 5
2, pp.6463-6470, 1992)の基準に基づいて分類した。
Rβ鎖のβ１ドメインの塩基配列を決定した。ウシ白血
病ウイルスBLV に感染しているものの白血病を発症して
いないウシ［リンパ球増多症牛（前癌状態:PL）15頭、
及び未発症牛（抗体陽性健康未発症牛：Healthy）43
頭］、及び白血病発症牛（23頭；Lymphoma）由来のウシ
MHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸を比較し
たところ、未発症健康牛では白血病発症牛に比較して07
01、1302、及び1401の対立遺伝子が有意に多く認められ
た。一方、未発症健康牛に比較してPLおよび発症牛では
1601が有意に高く、発症牛では1001が有意に高かった
（表１）。なお、BLV 感染牛の感染状態は、レヴィーら
(Levy, D., et al., Int. J. Cancer, 19, pp.822-82
7,1977) 及び間ら (Aida, Y., et al., Cancer Res., 5
2, pp.6463-6470, 1992)の基準に基づいて分類した。
【００３５】
【表１】
【００３６】次にその予測されるアミノ酸配列を比較し
た。図１にウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインの各
対立遺伝子の識別番号とアミノ酸残基を示した。図中、
ウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号
９から86の中で対立遺伝子間で異なるアミノ酸配列を示
すアミノ酸残基を示し、左側の数字は対立遺伝子の識別
番号、さらに対立遺伝子の数をｎで、頻度を％で示して
ある。図中、アミノ酸残基は一文字表記で記載した。β
鎖の中でも特に多型が集中しているβ1ドメインの特定
のアミノ酸配列（71、74、77、および78位のアミノ酸配
列：モチーフ）の違いが発症と未発症の間に見いだされ
た。
た。図１にウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインの各
対立遺伝子の識別番号とアミノ酸残基を示した。図中、
ウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号
９から86の中で対立遺伝子間で異なるアミノ酸配列を示
すアミノ酸残基を示し、左側の数字は対立遺伝子の識別
番号、さらに対立遺伝子の数をｎで、頻度を％で示して
ある。図中、アミノ酸残基は一文字表記で記載した。β
鎖の中でも特に多型が集中しているβ1ドメインの特定
のアミノ酸配列（71、74、77、および78位のアミノ酸配
列：モチーフ）の違いが発症と未発症の間に見いだされ
た。
【００３７】次に、モチーフの頻度を算出したところ、
71、74、77、78位のアミノ酸がそれぞれLys/Arg（K/
R）、Glu(E)、Arg(R)、Val(V)である対立遺伝子がPL牛
および白血病発症牛に比較して未発症牛に有意に高かっ
た。一方、Ala71、Ala/Asp74、Thr7 7、Tyr78の対立遺伝
子の頻度が、未発症健康牛に比較してPL牛あるいは発症
牛に有意に高かった（表２）。表中、K71E74R77V78はMH
C ClassII DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号71で特
定されるアミノ酸がLysであり、アミノ酸番号74で特定
されるアミノ酸がGluであり、アミノ酸番号77で特定さ
れるアミノ酸がArgであり、アミノ酸番号78で特定され
るアミノ酸がVal であることを示し、他も同様である。
71、74、77、78位のアミノ酸がそれぞれLys/Arg（K/
R）、Glu(E)、Arg(R)、Val(V)である対立遺伝子がPL牛
および白血病発症牛に比較して未発症牛に有意に高かっ
た。一方、Ala71、Ala/Asp74、Thr7 7、Tyr78の対立遺伝
子の頻度が、未発症健康牛に比較してPL牛あるいは発症
牛に有意に高かった（表２）。表中、K71E74R77V78はMH
C ClassII DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号71で特
定されるアミノ酸がLysであり、アミノ酸番号74で特定
されるアミノ酸がGluであり、アミノ酸番号77で特定さ
れるアミノ酸がArgであり、アミノ酸番号78で特定され
るアミノ酸がVal であることを示し、他も同様である。
【００３８】
【表２】
【００３９】遺伝子型の頻度を比較したところ、74、7
7、78位のアミノ酸がGlu、Arg、Valである対立遺伝子を
少なくとも一つでも有する個体がPL牛および発症牛に比
較して未発症牛に有意に高かった。この対立遺伝子にお
いて、さらに71位のアミノ酸がLysかArgである対立遺伝
子を両アリルのうち片方でも有する個体の頻度は、PL牛
および発症牛に比較して高かった。一方、Ala74、Th
r77、Tyr78の対立遺伝子をホモで有する個体の頻度は、
発症牛に比較して未発症健康牛に有意に高かった。これ
らの対立遺伝子は、71位のアミノ酸がAla又はLysである
が、Ala71、Ala74、Thr77、Tyr78であるアミノ酸をコー
ドする対立遺伝子をホモ接合で有する個体の頻度は発症
牛で高かった。
7、78位のアミノ酸がGlu、Arg、Valである対立遺伝子を
少なくとも一つでも有する個体がPL牛および発症牛に比
較して未発症牛に有意に高かった。この対立遺伝子にお
いて、さらに71位のアミノ酸がLysかArgである対立遺伝
子を両アリルのうち片方でも有する個体の頻度は、PL牛
および発症牛に比較して高かった。一方、Ala74、Th
r77、Tyr78の対立遺伝子をホモで有する個体の頻度は、
発症牛に比較して未発症健康牛に有意に高かった。これ
らの対立遺伝子は、71位のアミノ酸がAla又はLysである
が、Ala71、Ala74、Thr77、Tyr78であるアミノ酸をコー
ドする対立遺伝子をホモ接合で有する個体の頻度は発症
牛で高かった。
【００４０】また、Lys71、Ala74、Thr77、Tyr78である
アミノ酸をコードする対立遺伝子をホモ接合で有する個
体の頻度はPL牛で高かった。さらに、これら２つの対立
遺伝子をヘテロで有する個体は発症牛で有意に多かっ
た。一方、Ala74、Thr77、Tyr78の対立遺伝子とGlu74、
Arg77、Val78の対立遺伝子をヘテロで有する個体は、未
発症健康牛に有意に多かった。以上の結果から、Gl
u74、Arg77、Val78である対立遺伝子、その中でもLys/A
rg71、Glu74、Arg77、Val78の対立遺伝子を有する個体
がBLVによる白血病発症に対して抵抗性であると結論さ
れた。
アミノ酸をコードする対立遺伝子をホモ接合で有する個
体の頻度はPL牛で高かった。さらに、これら２つの対立
遺伝子をヘテロで有する個体は発症牛で有意に多かっ
た。一方、Ala74、Thr77、Tyr78の対立遺伝子とGlu74、
Arg77、Val78の対立遺伝子をヘテロで有する個体は、未
発症健康牛に有意に多かった。以上の結果から、Gl
u74、Arg77、Val78である対立遺伝子、その中でもLys/A
rg71、Glu74、Arg77、Val78の対立遺伝子を有する個体
がBLVによる白血病発症に対して抵抗性であると結論さ
れた。
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】(2)PCR-RFLP法 黒毛和種牛281頭のMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメイン
の塩基配列を決定したところ、71番目から80番目のアミ
ノ酸配列（塩基配列では211から240）が９種類得られた
(図２A)。このなかで、白血病発症に抵抗性を示すK71E
74R77V78及びR71E7 4R77V78を有する対立遺伝子をSRB3及
びDRB40プライマー又はSRB3及びDRB100プライマーを用
いてPCR増幅し、その産物をPstI及びDraIIIで処理した
ところ、両制限酵素による消化産物は得られず、アガロ
ースゲル上で一本のバンドとして検出された（図２
B）。
の塩基配列を決定したところ、71番目から80番目のアミ
ノ酸配列（塩基配列では211から240）が９種類得られた
(図２A)。このなかで、白血病発症に抵抗性を示すK71E
74R77V78及びR71E7 4R77V78を有する対立遺伝子をSRB3及
びDRB40プライマー又はSRB3及びDRB100プライマーを用
いてPCR増幅し、その産物をPstI及びDraIIIで処理した
ところ、両制限酵素による消化産物は得られず、アガロ
ースゲル上で一本のバンドとして検出された（図２
B）。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> A method for judging a resistance to the onset of bovine leukemia <130> A01095M <160> 19 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 tgtaaaacga cggccagtag cacatttcct gcagtatc 38 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 tgtaaaacga cggccagtag cacatttcct ggagtattct aa 42 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tgtaaaacga cggccagtag cacatttcct ggagtatta 39 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 tgtaaaacga cggccagtag cacatttcct ggagtattg 39 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 tgtaaaacga cggccagtca catttcctgg agtatg 36 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 tgtaaaacga cggccagtgc acatttcctg gagtatc 37 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 tgtaaaacga cggccagtag cacatttcct ggagtata 38 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 tgtaaaacga cggccagtca catttcctgg agtattctac 40 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 caggaaacag ctatgacccg ccgctgcaca gtgaaactc 39 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 ggaattcctc tctctgcagc acatttcc 28 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 tttaaattcg cgctcacctc gccgct 26 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 tgtaaaacga cggccagtat tcctctctct gcagcacatt tcctg 45 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 ggaattcctc tctctgcagc acatttcct 29 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 aagtcgaccg ctgcacagtg aaactc 26 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 gagtgtcatt tcttcaacgg gac 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 ggagaagagt tcgtgcgctt cga 23 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 tgtaaaacga cggccagtct ctctctgcag cacatttcct
【図１】 各病態を示すBLV感染牛（黒毛和種牛）のMHC
ClassII DRβ鎖のβ１ドメインの塩基配列を決定し、
予測されるアミノ酸配列を比較した結果を示した図であ
る。図中、上段の数字はアミノ酸残基の番号を示し、左
側の数字は対立遺伝子の識別番号である。アミノ酸残基
は一文字表記で記載した。
ClassII DRβ鎖のβ１ドメインの塩基配列を決定し、
予測されるアミノ酸配列を比較した結果を示した図であ
る。図中、上段の数字はアミノ酸残基の番号を示し、左
側の数字は対立遺伝子の識別番号である。アミノ酸残基
は一文字表記で記載した。
【図２】 黒毛和種牛281頭から得られたMHC ClassII D
Rβ鎖のβ１ドメインの71番目から80番目の９種類のア
ミノ酸配列、及びそのアミノ酸配列をコードする塩基配
列を制限酵素（PstI及びDraIII）で消化した結果を示し
た図である。図中、(A)は決定された塩基配列とその予
測されるアミノ酸配列を示し、(B)は制限酵素処理の結
果を示す。
Rβ鎖のβ１ドメインの71番目から80番目の９種類のア
ミノ酸配列、及びそのアミノ酸配列をコードする塩基配
列を制限酵素（PstI及びDraIII）で消化した結果を示し
た図である。図中、(A)は決定された塩基配列とその予
測されるアミノ酸配列を示し、(B)は制限酵素処理の結
果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA10 AA11 CA03 CA20 HA09 HA11 HA19 HA20 4B063 QA01 QA05 QA13 QA19 QQ08 QQ43 QQ80 QQ96 QR14 QR32 QR62 QS16 QS25 QS36 4H045 AA11 BA10 CA40 DA86 EA50 EA53 HA05
Claims (5)
- 【請求項１】 ウシ白血病ウイルスBLV に対するウシの
白血病発症の抵抗性を判定する方法であって、ウシ個体
のウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番
号74で特定されるアミノ酸がGluであり、アミノ酸番号7
7で特定されるアミノ酸がArgであり、かつアミノ酸番号
78で特定されるアミノ酸がVal であるウシ個体を白血病
に対する発症抵抗性ありと判定する方法。 - 【請求項２】 さらにアミノ酸番号71で特定されるアミ
ノ酸がLys又はArgである場合にそのウシ個体を白血病に
対する発症抵抗性が高いと判定する請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 ウシ白血病ウイルスBLV に対するウシの
白血病発症の抵抗性を判定する方法であって、下記の工
程： (1)ウシ個体から分離したゲノムDNA をポリメラーゼ連
鎖反応(PCR) により増幅してウシMHC ClassII DRβ鎖の
β１ドメインの一部又は全部をコードするDNA を含むPC
R 産物を調製する工程：及び (2)上記PCR 産物に含まれるDNA によりコードされるア
ミノ酸配列において、ウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ド
メインのアミノ酸番号74で特定されるアミノ酸がGluで
あり、アミノ酸番号77で特定されるアミノ酸がArgであ
り、かつアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がVal で
あるウシ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する工
程；を含む方法。 - 【請求項４】 さらにアミノ酸番号71で特定されるアミ
ノ酸がLys又はArgである場合にそのウシ個体を白血病に
対する発症抵抗性が高いと判定する請求項３に記載の方
法。 - 【請求項５】 白血病に対する発症抵抗性が高いウシ個
体を選別する方法であって、下記の工程： (1) ForwardプライマーとしてDRB40又はDRB100及びReve
rse プライマーとしてSRB3を用いてウシ個体から分離し
たゲノムDNA をポリメラーゼ連鎖反応(PCR) により増幅
してウシMHC ClassII DRβ鎖のβ１ドメインの一部又は
全部をコードするDNA を含むPCR 産物を調製する工程：
及び (2)上記PCR産物がPstI及びDraIIIで消化されない場合に
そのウシ個体が白血病に対する発症抵抗性が高いと判定
する工程を含む方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000056093A JP2001238679A (ja) | 2000-03-01 | 2000-03-01 | 牛白血病の発症抵抗性の判定方法 |
| DE60128026T DE60128026D1 (de) | 2000-03-01 | 2001-02-28 | Verfahren zur Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen den Ausbruch von Leukämie bei Rindern |
| US09/794,366 US6815158B2 (en) | 2000-03-01 | 2001-02-28 | Methods for judging resistance to the onset of bovine leukemia |
| AT01104844T ATE360820T1 (de) | 2000-03-01 | 2001-02-28 | Verfahren zur beurteilung der widerstandsfähigkeit gegen den ausbruch von leukämie bei rindern |
| EP01104844A EP1146339B1 (en) | 2000-03-01 | 2001-02-28 | Methods for judging resistance to the onset of bovine leukemia |
| CA002335402A CA2335402A1 (en) | 2000-03-01 | 2001-02-28 | Methods for judging resistance to the onset of bovine leukemia |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000056093A JP2001238679A (ja) | 2000-03-01 | 2000-03-01 | 牛白血病の発症抵抗性の判定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001238679A true JP2001238679A (ja) | 2001-09-04 |
| JP2001238679A5 JP2001238679A5 (ja) | 2007-04-19 |
Family
ID=18577110
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|---|---|---|---|
| JP2000056093A Pending JP2001238679A (ja) | 2000-03-01 | 2000-03-01 | 牛白血病の発症抵抗性の判定方法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1146339B1 (ja) |
| JP (1) | JP2001238679A (ja) |
| AT (1) | ATE360820T1 (ja) |
| CA (1) | CA2335402A1 (ja) |
| DE (1) | DE60128026D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006246881A (ja) * | 2005-02-10 | 2006-09-21 | Institute Of Physical & Chemical Research | ウシ白血病発症に対する抵抗性の判定方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998003680A1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-01-29 | The Institute Of Physical And Chemical Research | Procede permettant d'evaluer la possibilite d'apparition de la leucemie bovine et la resistance a celle-ci |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5567809A (en) | 1986-03-13 | 1996-10-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Methods and reagents for HLA DRbeta DNA typing |
| AU3919693A (en) | 1992-03-17 | 1993-10-21 | Board of Trustees of The University of Illinois at Urbana-Champaign, The | Bovine alleles and genetic markers and methods of testing of and using same |
-
2000
- 2000-03-01 JP JP2000056093A patent/JP2001238679A/ja active Pending
-
2001
- 2001-02-28 DE DE60128026T patent/DE60128026D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-28 AT AT01104844T patent/ATE360820T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-02-28 US US09/794,366 patent/US6815158B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-28 CA CA002335402A patent/CA2335402A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-28 EP EP01104844A patent/EP1146339B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998003680A1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-01-29 | The Institute Of Physical And Chemical Research | Procede permettant d'evaluer la possibilite d'apparition de la leucemie bovine et la resistance a celle-ci |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006246881A (ja) * | 2005-02-10 | 2006-09-21 | Institute Of Physical & Chemical Research | ウシ白血病発症に対する抵抗性の判定方法 |
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| Publication number | Publication date |
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| US20030091984A1 (en) | 2003-05-15 |
| CA2335402A1 (en) | 2001-09-01 |
| EP1146339A2 (en) | 2001-10-17 |
| DE60128026D1 (de) | 2007-06-06 |
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| EP1146339A3 (en) | 2004-01-14 |
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