JP2018121593A - ウシ白血病ウイルス(blv)プロウイルスロードの判定方法およびその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の(1)〜(3)の少なくとも一種の領域または該領域に対応する領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロードが高プロウイルスロードであるか、または、高プロウイルスロードとなる可能性があるかを判定する。(1)Bos_taurus_UMD_3.1の第22染色体27116737〜27362842番目の塩基領域(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27383176〜27444064番目の塩基領域(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28193501〜28311070番目の塩基領域
【選択図】なし
Description
<1> 以下の(1)〜(3)の少なくとも一種の領域または該領域に対応する領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロードが高プロウイルスロードであるか、または、高プロウイルスロードとなる可能性があるかを判定する、ウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロードの判定方法。
(1)Bos_taurus_UMD_3.1の第22染色体27116737〜27362842番目の塩基領域
(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27383176〜27444064番目の塩基領域
(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28193501〜28311070番目の塩基領域
<2> 上記検出した一塩基多型において、該多型における塩基がリスクアレルである場合に高プロウイルスロードである、または、高プロウイルスロードとなる可能性があると判定することをさらに含む、<1>に記載の判定方法。
<3> 上記検出した一塩基多型において、リスクアレルのホモ接合体、リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体、および非リスクアレルのホモ接合体のいずれであるかによって、プロウイルスロードの程度および高プロウイルスロードとなる可能性を判定する、<1>または<2>に記載の判定方法。
<4> 上記(1)〜(3)の少なくとも一種の領域または該領域に対応する領域に存在する一塩基多型として、下記の(4)〜(7)よりなる群から選ばれる少なくとも1種の一塩基多型または該一塩基多型に対応する一塩基多型を検出することを含む、<1>〜<3>の何れかに記載の判定方法。
(4)Bos_taurus_UMD_3.1の第22染色体27280154番目の塩基におけるG/Aの多型
(5)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27421348番目の塩基におけるG/Aの多型
(6)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28223274番目の塩基におけるG/Aの多型
(7)上記(4)〜(6)のいずれかの多型と連鎖不平衡にある多型。
<5> 以下の(1)〜(3)の少なくとも一種の領域または該領域に対応する領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてウシ白血病可能性またはウシ白血病発症リスクの判定をする、ウシ白血病の判定方法。
(1)Bos_taurus_UMD_3.1の第22染色体27116737〜27362842番目の塩基領域
(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27383176〜27444064番目の塩基領域
(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28193501〜28311070番目の塩基領域
<6> 下記(1)〜(4)の何れかの一塩基多型または該一塩基多型に対応する一塩基多型を含む領域を増幅することのできるプライマーを含む、ウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロード判定用試薬。
(1)Bos_taurus_UMD_3.1の第22染色体27280154番目の塩基におけるG/Aの多型
(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27421348番目の塩基におけるG/Aの多型
(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28223274番目の塩基におけるG/Aの多型
(4)上記(1)〜(3)のいずれかの多型と連鎖不平衡にある多型。
<7> 下記(1)〜(4)の何れかの一塩基多型または該一塩基多型に対応する一塩基多型を含む領域の15塩基以上の配列またはその相補配列を有するプローブを含む、ウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロード判定用試薬。
(1)Bos_taurus_UMD_3.1の第22染色体27280154番目の塩基におけるG/Aの多型
(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27421348番目の塩基におけるG/Aの多型
(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28223274番目の塩基におけるG/Aの多型
(4)上記(1)〜(3)のいずれかの多型と連鎖不平衡にある多型。
本発明のウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロードの判定方法は、以下の(1)〜(3)の少なくとも一種の領域または該領域に対応する領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロードが高プロウイルスロードであるか、または、高プロウイルスロードとなる可能性があるかを判定することを含む。
(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27383176〜27444064番目の塩基領域
(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28193501〜28311070番目の塩基領域
BLVに感染すると、感染した細胞の染色体に1コピーのプロウイルスDNAが組み込まれる。感染細胞数が多ければ多いほどプロウイルスのDNAコピー数は増加するので、プロウイルスDNAのコピー数は感染細胞数に対応する。本明細書において、「プロウイルスロード」とは、所定の細胞数あたりのプロウイルスコピー数を示すものであり、生体中のプロウイルス感染細胞数の指標である。高プロウイルスロードとは、無作為に収集したBLV感染牛のプロウイルス量をK−means法によって4つのクラスターに分類したときに、一番高いプロウイルス量を示すクラスターと2番目に高いプロウイルス量を示すクラスターとの範囲のプロウイルス量として定義したものである。また、3番目に高いプロウイルス量を持つクラスターを「中程度」、最も低いプロウイルス量を持つ集団を「低プロウイルス量」として定義する。
例えば、プロウイルスロードは、末梢血リンパ球105細胞当たりのプロウイルスのコピー数として表される。ここで、一実施形態では、プロウイルスロードは、数値の大きさによって、高プロウイルスロード、中程度プロウイルスロード、低プロウイルスロードとして定義することができる。
高プロウイルスロードの一例としては、末梢血リンパ球105細胞当たり、プロウイルスロードが42605コピー/105細胞より大きい場合とすることができる。「高」の中でも76397コピー/105細胞より大きいものを「非常に高」として分類することもできる。
また、「低プロウイルスロード」を13819コピー/105細胞以下、「中程度プロウイルスロード」を14237コピー/105細胞より高く40698コピー/105細胞以下の範囲として分類することもできる。
Bos_taurus_UMD_3.1における第22番染色体27116737〜27362842番目の塩基領域に存在する具体的なSNPとしては、rs110616206を挙げることができる。ここで、rs番号はNational Center for BiotechnologyInformationのdbSNPデータベース(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)の登録番号を示す。SNPは、この27116737〜27362842番目の塩基領域のContactin-3(CNTN3)遺伝子が含まれる連鎖不平衡ブロックに位置するものであり得る。
なお、上記3つのSNPのうち、rs110616206およびrs29026690の場合、A(リスクアレル)はマイナーアレルである。rs17872126の場合のA(リスクアレル)は、メジャーアリルである。ここで、上記したrs110616206、rs29026690およびrs17872126におけるグアニン(G)/アデニン(A)の多型は、ゲノムのアンチセンス方向の配列における塩基で示しているが、その相補配列において解析する場合は、これらの塩基の相補塩基であるシトシン(C)/チミン(T)が該多型に対応する多型である。
(5)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27421348番目の塩基におけるG/Aの多型
(6)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28223274番目の塩基におけるG/Aの多型
(7)上記(4)〜(6)のいずれかの多型と連鎖不平衡にある多型。
検査対象の試料の由来となる被験対象動物は、ウシであり、ウシ(Bos taurus)、コブウシ(Bos indicus)およびスイギュウ(Bubalus bubalis)等が挙げられる。ウシとしては、乳用種、肉用種、乳肉兼用種、役用種、役肉兼用種等が挙げられる。具体的には、例えば、黒毛和種、日本短角種等の和牛、ホルスタイン、ジャージーおよび各国の在来種等の品種が挙げられるが、これらに限定されない。
一塩基多型の検出の対象となる検査試料は、ゲノムDNAを含む試料であれば特に制限されない。例えば、任意の生物学的試料、例えば血液、骨髄液、尿等の体液、口腔粘膜、肝臓等の組織細胞、体毛等が挙げられる。SNPの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料からゲノムDNAを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。ゲノムDNA等は、これらの試料より常法に従い抽出、精製し、調製することができる。なお、場合によっては、cDNA、またはmRNAを使用することもできる。
検査試料から一塩基多型を検出するにあたっては、好ましくは、まず一塩基多型を含む部分を増幅する。増幅は、例えばPCR法によって行われるが、他の公知の増幅方法、例えばNASBA法、LCR法、SDA法、LAMP法等で行ってもよい。PCRに用いる具体的プライマーについて以下の〔2.ウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロード判定用プライマー〕にて説明する。
一塩基多型の検出は、シークエンス解析、インベーダーアッセイ、ハイブリダイゼーション等で行うことができる。例えば、変性勾配ゲル電気泳動法(DGGE denaturing gradient gel electrophoresis)、一本鎖コンフォメーション多型解析(SSCP:singlestrandconformation polymorphism)、対立遺伝子特異的PCR(allele-specific PCR)、ASO(allele-specificoligonucleotide)によるハイブリダイーゼーション法、ミスマッチ部位の化学的切断(CCM:chemicalcleavage of mismatches)、HET(hetero duplex method)法、PEX(primer extension)法、RCA(rolling circleamplification)法等を用いて行ってもよい。
本発明は、さらに、以下の(1)〜(3)の少なくとも一種の領域または該領域に対応する領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてウシ白血病可能性またはウシ白血病発症リスクの判定をする、ウシ白血病の判定方法も提供する。
(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27383176〜27444064番目の塩基領域
(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28193501〜28311070番目の塩基領域
一例では上記の(1)〜(3)の少なくとも一種の領域または該領域に対応する領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてプロウイルスロードの判定をし、該プロウイルスロードの判定結果に基づいてウシ白血病の判定をする。
すなわち、本発明において、「ウシ白血病の判定」とはウシ白血病の発症リスクの有無およびウシ白血病の発症の有無の判定を含む。本発明の判定方法は、上記染色体領域のSNPの分析を行い、SNPの分析結果から、高プロウイルスロードであるか否か、または、高プロウイルスロードとなる可能性があるか否か、および/またはプロウイルスロードの程度を、ウシ白血病の発症リスクおよび/または発症の有無と関連付けるものである。上記の(1)〜(3)の少なくとも一種の領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてプロウイルスロードを判定する工程は、上述のウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロードの判定方法に記載の方法の項目に記載の方法を適用することができる。
本発明は、ウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロード判定用プライマーも提供する。本発明のプライマーは本発明のウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロードの判定方法に用いることができる。本発明のプライマーは、下記(1)〜(4)の何れかの一塩基多型または該一塩基多型に対応する一塩基多型を含む領域を増幅することのできる、ウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロードの判定用プライマーである。
(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27421348番目の塩基におけるG/Aの多型
(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28223274番目の塩基におけるG/Aの多型
(4)上記(1)〜(3)のいずれかの多型と連鎖不平衡にある多型。
プライマーは、前記の一塩基多型部位を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において1またはそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
一塩基多型の検出は、一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーショ
ンによっても行うことができる。一例のウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロードの判定用プローブは、下記(1)〜(4)の何れかの一塩基多型または該一塩基多型に対応する一塩基多型を含む領域の15塩基以上の配列またはその相補配列を有する。
(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27421348番目の塩基におけるG/Aの多型
(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28223274番目の塩基におけるG/Aの多型
(4)上記(1)〜(3)のいずれかの多型と連鎖不平衡にある多型。
本発明はウシ白血病ウイルス(BLV)のプロウイルスロード判定用試薬も提供する。このような判定用試薬は、上述した本発明のプライマーおよびプローブの少なくとも1つを含む。一実施形態のBLVプロウイルスロード判定用試薬は、上述した本発明のプライマーを含んでおり、別の実施形態のBLVプロウイルスロード判定用試薬は、上述した本発明のプローブを含んでいる。さらに別の実施形態のBLVプロウイルスロード判定用試薬は、本発明のプライマーおよびプローブの両方を含んでいる。また、上述のプライマーおよびプローブの少なくとも1つの他に、必要に応じて、一塩基多型解析に使用される、1)各種試薬および器具(ポリメラーゼ、バッファー、各dNTP、ピペット等)、2)試料を調製するための各種試薬および器具(試験管、バッファー等)、3)DNA増幅断片を解析するための各種試薬および器具(電気泳動ゲル材料、ピペット等)、4)検出キットの使用説明書、等の少なくとも1つを備えていてもよい。
に限定されない。
4歳より高い年齢の444個体の黒毛和種からEDTA-2Naを用いて血液を採取した。続いて、QIAsymphony kit(QIAGEN K.K., Japan)を用いて全血からゲノムDNAを抽出した。
(ジェノタイピング)
被験ウシをBovineSNP50 DNA Analysis BeadChip(illuminaInc., San Diego, CA)を用いてジェノタイピングを行った。
BoLA-DRB3アレルはTakeshima et al., J Dairy Sci,92(6):2965-2970, 2009によって報告されたタイピング方法に基づいたPCRによってジェノタイピングされた。概略的には、PCRはDRB3FRWおよびDRB3REVのプライマーペアを用いて行った。PCR断片はExoSAP-IT PCR product purification kit(USBCorp., Cleveland, OH)を用いて精製し、BigDye Terminator CycleSequencing Kit(ThrmoFisher Scientific, Waltham, MA)を用いて配列決定した。配列データは、Assign 400ATF ver. 1.0.2.41 software(ConexioGenomics, Fremantle, Australia)を用いて解析した。
BLVのプロウイルスロードは、BLV-CoCoMo-qPCR-2法(理研ジェネシス、神奈川、日本)を用いて676個体のウシにおける1つのタイムポイントにおいて測定した。概略的には、BLVのlong terminal repeat regionをCoCoMo-FRW(配列番号6の配列と配列番号7の配列の1:10の混合)およびCoCoMo-REV(配列番号8)、およびFAM-BLVプローブ(5’-FAM-CTCAGCTCTCGGTCC-NFQ-MGB-3’(配列番号9))を用いて増幅した。内部コントロールとして、DRA-F(配列番号10)およびDRA-R(配列番号11)およびFAM-DRプローブ(5’-FAM-TGTGTGCCCTGGGC-NFQ-MGB-3’(配列番号12))を用いてBoLA-DRA遺伝子を増幅した(Takeshima et al., ArchVirol 160(5):1325-1332, 2015.)。
Claims (7)
- 以下の(1)〜(3)の少なくとも一種の領域または該領域に対応する領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロードが高プロウイルスロードであるか、または、高プロウイルスロードとなる可能性があるかを判定する、ウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロードの判定方法。
(1)Bos_taurus_UMD_3.1の第22染色体27116737〜27362842番目の塩基領域
(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27383176〜27444064番目の塩基領域
(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28193501〜28311070番目の塩基領域 - 上記検出した一塩基多型において、該多型における塩基がリスクアレルである場合に高プロウイルスロードである、または、高プロウイルスロードとなる可能性があると判定することをさらに含む、請求項1に記載の判定方法。
- 上記検出した一塩基多型において、リスクアレルのホモ接合体、リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体、および非リスクアレルのホモ接合体のいずれであるかによって、プロウイルスロードの程度および高プロウイルスロードとなる可能性を判定する、請求項1または2に記載の判定方法。
- 上記(1)〜(3)の少なくとも一種の領域または該領域に対応する領域に存在する一塩基多型として、下記の(4)〜(7)よりなる群から選ばれる少なくとも1種の一塩基多型または該一塩基多型に対応する一塩基多型を検出することを含む、請求項1〜3の何れか一項に記載の判定方法。
(4)Bos_taurus_UMD_3.1の第22染色体27280154番目の塩基におけるG/Aの多型
(5)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27421348番目の塩基におけるG/Aの多型
(6)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28223274番目の塩基におけるG/Aの多型
(7)上記(4)〜(6)のいずれかの多型と連鎖不平衡にある多型。 - 以下の(1)〜(3)の少なくとも一種の領域または該領域に対応する領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてウシ白血病可能性またはウシ白血病発症リスクの判定をする、ウシ白血病の判定方法。
(1)Bos_taurus_UMD_3.1の第22染色体27116737〜27362842番目の塩基領域
(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27383176〜27444064番目の塩基領域
(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28193501〜28311070番目の塩基領域 - 下記(1)〜(4)の何れかの一塩基多型または該一塩基多型に対応する一塩基多型を含む領域を増幅することのできるプライマーを含む、ウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロード判定用試薬。
(1)Bos_taurus_UMD_3.1の第22染色体27280154番目の塩基におけるG/Aの多型
(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27421348番目の塩基におけるG/Aの多型
(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28223274番目の塩基におけるG/Aの多型
(4)上記(1)〜(3)のいずれかの多型と連鎖不平衡にある多型。 - 下記(1)〜(4)の何れかの一塩基多型または該一塩基多型に対応する一塩基多型を含む領域の15塩基以上の配列またはその相補配列を有するプローブを含む、ウシ白血病ウイルス(BLV)プロウイルスロード判定用試薬。
(1)Bos_taurus_UMD_3.1の第22染色体27280154番目の塩基におけるG/Aの多型
(2)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体27421348番目の塩基におけるG/Aの多型
(3)Bos_taurus_UMD_3.1の第23染色体28223274番目の塩基におけるG/Aの多型
(4)上記(1)〜(3)のいずれかの多型と連鎖不平衡にある多型。
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