CN109406477A - 一种检测dna甲基转移酶活性的荧光生物传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于催化发夹自组装检测DNA甲基转移酶活性的荧光生物传感器，基于甲基化后的目标物与核酸探针特异性识别，利用催化发夹自组装不断形成三通路结构，同时循环放大Trigger，在三通路的末端，通过碱基互补配对结合含有荧光基团的Signal probe，最后利用了核酸内切酶IV的切割位点（AP位点），实现定位切割，释放荧光基团产生一定强度的荧光信号的生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，弥补了现有对DNA甲基化检测的不足，实现对甲基化的快速，准确的定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于催化发夹自组装检测DNA甲基转移酶活性的荧光生物传感器，还涉及其制备方法。
背景技术
DNA甲基化在细胞增殖中起重要作用，衰老和基因转录。两种过度甲基化（超甲基化）和缺乏甲基化（低甲基化）已经在多种类型的癌症中被鉴定出来，例如乳腺癌，卵巢癌，和肺癌。在许多人中病例，异常的DNA甲基化模式已经存在与异常的DNA MTase活性相关，因此，DNA甲基化被公认为新一代癌症生物标志物和新的抗肿瘤治疗的药理学靶点。
目前已经开发了多种用于DNA MTase的方法测定，如放射性测定，高效液体色谱（HPLC）、种免疫化学方法和凝胶电泳。但是，大多数都需要放射性标记的基板，种复杂的仪器，和特殊抗体，费时费力操作。已经有了的新方法开发用于DNA MTase测定，例如比色法，荧光测定法，和生物发光测定法。但是，这些方法通常涉及繁琐的纳米粒子制备，双荧光团猝灭剂双标记，和长的分析时间。因为他们的独特优势低成本，快速响应和小型化，电化学方法已被广泛应用于DNA甲基化测定，但它们需要繁琐的表面改性电极。因此，一种灵敏度高且简单的简单方法对于DNA MTase测定是具有实际意义的。
发明内容
为了解决以上现有技术中检测DNA甲基转移酶活性的方法特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于催化发夹组装放大的荧光法检测DNA甲基转移酶活性的生物传感器。
一种检测DNA甲基转移酶活性的荧光生物传感器，包括均相反应液、目标物、辅酶SAM、MTase链、限制性内切酶Dpnl、H1链、H2链、H3链、核酸内切酶IV、Signal probe链；
所述的均相反应液包括灭菌水、1×的Dam缓冲液；
所述的DNA链的序列如下：
MTase如SEQ No.1所示；
H1如SEQ No.2所示；
H2如SEQ No.3所示；
H3如SEQ No.4所示；
Signal probe如SEQ No.5所示；
所述的Signal probe序列 的5’端第三个碱基T上修饰饰猝灭基团Dabcyl，第五个碱基上修饰四氢呋喃碱基位点；3’端第5个碱基修饰荧光基团FAM。
所述的辅酶SAM为提供甲基化的辅酶。
所述的目标物为甲基转移酶Dam。
上述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将目标物即甲基转移酶Dam、Dam缓冲液、MTase链以及提供甲基化的辅酶SAM同时加入到均相反应液中，反应结束后得到甲基化产物；
（2）向步骤（1）的甲基化产物中加入限制性内切酶Dpnl、H1链、H2链、H3链、核酸内切酶IV、Signal probe链、1×cutsmart反应缓冲液，完成甲基化切割以及催化发夹自组装反应；
（3）将b步反应后的溶液（10 μL）稀释至70 μL，荧光仪激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围450nm-530nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
所述的步骤（1）中MTase链的加入量为0.5μM；SAM的加入量为160μM，Dam的加入量为10U。
所述的步骤（2）中甲基化产物、限制性内切酶Dpnl、1×cutsmart反应缓冲液、H1链、H2链、H3链、Signal probe的加入量比值为：5 μL：1μL：2μL：1μM：1μM：1μM：5μM；
所述的限制性内切酶Dpnl的浓度为20U/μL；所述的核酸内切酶的最终浓度为0.5U/μL。
所述的步骤（1）的反应条件为37℃，60 min。
所述的步骤（2）的反应条件为37℃，90 min。
本发明中一共用到了5条DNA链，其序列分别是：
MTase：GAAGGATCACTACTCCCTAACATCTCAAGGATCCTTC
H1：
GTGGATACGTTTCCTTGAGATGTTAGGGAGTAGTGATAACGTCACAACTCACTACTCCCTAACATCGATTAGC
H2：
GTGGATGATGTTAGGGAGTAGTGAGTTGTGACGTTAAACATCTCAAGGTAACGTCACAACTCACTAGATTAGC
H3：
GTGGATTAGTGAGTTGTGACGTTACCTTGAGATGTTTCACTACTCCCTAACATCTCAAGGTAACGTGATTAGC
Signal probe：5’-GCT(Dabcyl)AAxCAT(FAM)CCAC-3’
其中Signal probe 的5’端第三个碱基T上修饰饰猝灭基团Dabcyl，3’端第5个碱基修饰荧光基团FAM。MTase链含有特定的甲基化序列(GATC)，在提供甲基化的辅酶SAM以及甲基转移酶DAM的作用下，MTase链甲基化，加入特异性甲基化内切酶Dpnl，会形成一条序列为TCACTACTCCCTAACATCTCAAGGA的Trigger，Trigger用于打开H1，继而打开H2，H3，在打开H3的同时挤下Trigger，Trigger用于进一步的催化发夹自组装。在形成好的三通路DNA构象上，加入Signal probe，Signal probe通过碱基互补配对形成双链，在核酸内切酶IV作用下，将Signal probe剪切成两部分，使得荧光基团（FAM）和猝灭集团（Dabcyl）分离，从而产生荧光信号。通过测量荧光强度来定量检测DNA甲基化。
本发明中DNA甲基转移酶的检测是在均相溶液中实现的，通过催化发夹自组装、核酸内切酶IV的配合实现信号的循环放大，从而实现DNA甲基化的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
均相中发生的反应主要有：MTase在提供甲基化的辅酶SAM以及甲基转移酶DAM的作用下进行甲基化，将在甲基化完成得到的MTase链中加入特异性甲基化内切酶Dpnl，会形成一条序列为TCACTACTCCCTAACATCTCAAGGA的Trigger，Trigger用于打开H1，继而打开H2，H3，在打开H3的同时挤下Trigger，Trigger用于进一步的催化发夹自组装。在形成好的三通路DNA构象上，加入Signal probe，Signal probe通过碱基互补配对形成双链，核酸内切酶IV能够剪切Signal probe中间的四氢呋喃碱基位点（TAP位点）使得Signal probe断裂分开，从而荧光基团（FAM）和猝灭集团（Dabcyl）分离，产生荧光信号。通过测量荧光强度来定量检测DNA甲基化。
本发明基于甲基化后的目标物与核酸探针特异性识别，利用催化发夹自组装不断形成三通路结构，同时循环放大Trigger，在三通路的末端，通过碱基互补配对结合含有荧光基团的Signal probe，最后利用了核酸内切酶IV的切割位点（AP位点），实现定位切割，释放荧光基团产生一定强度的荧光信号的生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，弥补了现有对DNA甲基化检测的不足，实现对甲基化的快速，准确的定量检测。
本发明的有益效果：
1. 特异性高
甲基化后的目标物与核酸探针特异性识别，具有高特异性；利用了核酸内切酶IV的切割位点（AP位点），实现定位切割，释放荧光基团的高特异性。
2. 灵敏度好
利用催化发夹自组装不断形成三通路结构，同时循环放大Trigger，具有放大信号的功能。该传感器的反应条件温和，反应速度快；由于使用荧光法，其检测方法操作简便、检测周期短；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。
3. 速度快、成本低
制备方法简单，性能稳定，荧光检测的重复性好，适用于与疾病相关的Dam检测和生物传感器产业化的实际应用；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为该实验的原理图；
图2为实施例1检测结果图；
图3为实施例2检测结果图；
图4为实施例3检测结果图；
图5为实施例4检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1荧光强度随核酸内切酶IV浓度的变化
所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a、将灭菌水，1×的Dam缓冲液（buffer），0.5μM MTase链和160μM的SAM，10U的Dam加入到预先准备好的灭菌的EP管中。在37℃下孵育60min。
b、向该EP管中加入a反应完成的目标物（5 μL）、加入1μLDpnl（20U/μL），1×cutsmart反应缓冲液2μL，H1 H2 H3各1μM，Signal probe取5μM， 1 μL核酸内切酶IV（浓度分别为0.1U/μL、0.2U/μL、0.3U/μL、0.5U/μL、0.8U/μL、1.0 U/μL）、37℃的恒温箱中孵育90min；
c、将b步反应后的溶液（10 μL）稀释至70 μL，用荧光仪在518nm处检测荧光。
荧光仪激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围450nm-530nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20 min。
10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。
结果见图2，从图中可以看出，随着核酸内切酶IV量的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在酶量达到100Uml之后，荧光强度基本不变。说明酶修复循环所需核酸内切酶IV量为0.5U/μL。
实施例2 荧光强度随目标物浓度的变化
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法：
所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a、 将灭菌水，1×的Dam缓冲液（buffer），0.5μM MTase链和160μM的SAM， Dam（0.005to 40 U/mL）加入到预先准备好的灭菌的EP管中。在37℃下孵育60min。
b、向该EP管中加入a反应完成的目标物（5 μL）、加入1μLDpnl（20U/μL），1×cutsmart反应缓冲液2μL，H1 H2 H3各1μM，Signal probe取5μM， 0.5U/μL核酸内切酶IV、37℃的恒温箱中孵育90min；
c、将b步反应后的溶液（10 μL）稀释至70 μL，用荧光仪在518nm处检测荧光。
荧光仪激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围450nm-530nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20 min。
10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。
结果见图3，从图中可以看出，随着目标物浓度的增加，实验得到的荧光强度不断增强，所作标准曲线，计算回归方程为F=880.42+185.68×LgC UDG (U/mL)，相关系数为0.977。
实施例3荧光强度随H1 H2 H3链浓度的变化
所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a、将灭菌水，1×的Dam缓冲液（buffer），0.5μM MTase链和160μM的SAM，10U的Dam加入到预先准备好的灭菌的EP管中。在37℃下孵育60min。
b、向该EP管中加入a反应完成的目标物（5 μL）、加入1μLDpnl（20U/μL），1×cutsmart反应缓冲液2μL，H1 H2 H3（浓度分别为10μM，1μM，0.5μM，0.1μM，0.01μM），Signalprobe取5μM， 0.5U/μL酸内切酶IV、37℃的恒温箱中孵育90min；
c、将b步反应后的溶液（10 μL）稀释至70 μL，用荧光仪在518nm处检测荧光。
荧光仪激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围450nm-530nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
1、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20 min。
2、10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。
结果见图4，从图中可以看出，随着H1、H2、H3浓度的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在H1、H2、H3浓度达到1 μM之后，荧光强度基本不变。说明实验所需的H1、H2、H3链量为1μM。
实施例4荧光强度随反应时间的变化
所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a、将灭菌水，1×的Dam缓冲液（buffer），0.5μM MTase链和160μM的SAM，10UDam浓度分别为加入到预先准备好的灭菌的EP管中。在37℃下孵育60min。
b、向该EP管中加入a反应完成的目标物（5 μL）、加入1μL Dpnl（20U/μL）、1×cutsmart反应缓冲液2μL，H1 H2 H3各1μM，Signal probe取5μM， 0.5U/μL核酸内切酶IV、37℃的恒温箱中孵育10 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min；
c、将b步反应后的溶液（10 μL）稀释至70 μL，用荧光仪在518nm处检测荧光。
荧光仪激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围450nm-530nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
1、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20 min。
2、10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。
检测结果见图5，从图中可以看出，随着反应时间的增加，荧光强度不断增强，在反应时间达到90 min之后，荧光强度基本不变。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种检测DNA甲基转移酶活性的荧光生物传感器及其制备方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
gaaggatcac tactccctaa catctcaagg atccttc 37
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
gtggatacgt ttccttgaga tgttagggag tagtgataac gtcacaactc actactccct 60
aacatcgatt agc 73
<210> 3
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
gtggatgatg ttagggagta gtgagttgtg acgttaaaca tctcaaggta acgtcacaac 60
tcactagatt agc 73
<210> 4
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
gtggattagt gagttgtgac gttaccttga gatgtttcac tactccctaa catctcaagg 60
taacgtgatt agc 73
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
gctaacatcc ac 12
Claims (8)
1.一种检测DNA甲基转移酶活性的荧光生物传感器，其特征在于，包括均相反应液、目标物、辅酶SAM、MTase链、限制性内切酶Dpnl、H1链、H2链、H3链、核酸内切酶IV、Signalprobe链；
所述的均相反应液包括灭菌水、1×的Dam缓冲液；
所述的DNA链的序列如下：
MTase如SEQ No.1所示；
H1如SEQ No.2所示；
H2如SEQ No.3所示；
H3如SEQ No.4所示；
Signal probe如SEQ No.5所示；
所述的Signal probe序列 的5’端第三个碱基T上修饰饰猝灭基团Dabcyl，第五个碱基上修饰四氢呋喃碱基位点；3’端第5个碱基修饰荧光基团FAM。
2.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的辅酶SAM为提供甲基化的辅酶。
3.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述的目标物为甲基转移酶Dam。
4.一种权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将目标物即甲基转移酶Dam、Dam缓冲液、MTase链以及提供甲基化的辅酶SAM同时加入到均相反应液中，反应结束后得到甲基化产物；
（2）向步骤（1）的甲基化产物中加入限制性内切酶Dpnl、H1链、H2链、H3链、核酸内切酶IV、Signal probe链、1×cutsmart反应缓冲液，完成甲基化切割以及催化发夹自组装反应；
（3）将b步反应后的溶液（10 μL）稀释至70 μL，荧光仪激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围450nm-530nm，读取荧光信号变化，检测目标物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中MTase链的加入量为0.5μM；SAM的加入量为160μM，Dam的加入量为10U。
6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中甲基化产物、限制性内切酶Dpnl、1×cutsmart反应缓冲液、H1链、H2链、H3链、Signal probe的加入量比值为：5 μL：1μL：2μL：1μM：1μM：1μM：5μM；所述的限制性内切酶Dpnl的浓度为20U/μL；所述的核酸内切酶的最终浓度为0.5U/μL。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）的反应条件为37℃，60min。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）的反应条件为37℃，90min。
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