CN105136882B - 基于dna模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测dna甲基转移酶活性的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于DNA模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测DNA甲基转移酶活性的检测方法。制备了正四面体DNA探针,该正四面体DNA的顶点是一段含有可甲基化的CpG位点的DNA探针,其余三个支点分别标记了巯基。利用金‑硫键,正四面体DNA探针共价修饰在金电极表面。因此本发明利用有无DNA模拟酶催化苯胺聚合的不同电化学信号实现检测DNA甲基转移酶活性的目的。本发明制备的正四面体DNA探针富含双螺旋DNA,为苯胺聚合提供大量的模板,且无需制备复杂材料和标记DNA探针,可避免材料制备及标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐,重现性差的缺陷。本发明具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。
Description
技术领域
本发明属于一种识别特殊甲基化位点和定量分析DNA甲基转移酶活性的生物传感技术,具体是指DNA甲基化后,被甲基化敏感的限制性内切酶识别并切割特定的序列后,观测电化学信号分子聚苯胺信号的改变,特别涉及了基于DNA模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测DNA甲基转移酶活性的检测方法。
背景技术
DNA甲基化是指甲基转移酶将甲基自由基共价结合到特定DNA序列中的胞嘧啶(C)上。这是表观遗传学中重要事件之一,在基因转录、真核生物发展、细胞分化和各种人类疾病的发病机理如癌症中起着至关重要的作用。
在正常细胞中,大多数位于启动子区域中CpG岛(成百上千个CpG重复)是未甲基化的,它的下游基因是在转录活跃的状态下。相反,在癌症细胞中启动子区域的CpG岛是呈现甲基化的状态,那么它的下游基因比如肿瘤抑制基因是始终保持沉默的状态。基因启动子区域的CpG岛异常甲基化将会改变正常的细胞功能和表型。对于大规模的表观遗传事件、疾病诊断和研究生物对不同环境条件的响应,DNA甲基化一直被认为是潜在的生物标志物。因此,分析DNA甲基化对遗传性疾病的早期诊断是很重要的。特别是识别特定序列的CpG甲基化有利于诊断癌症的类型,提供基因表达机理的依据以及开发用于治疗与CpG甲基化相关癌症的新药。
目前,DNA甲基化检测主要涉及的技术是基于DNA上甲基胞嘧啶和胞嘧啶的区别。例如,重亚硫酸盐处理、限制性内切酶、分子与生物/化学结合、电化学方法、各种各样的基于聚合酶链式反应技术(PCR)、荧光分析方法、比色方法、高效液相色谱方法。两种广泛使用的方法是基于重亚硫酸盐处理的方法和基于限制性内切酶的分析方法。在重亚硫酸盐分析方法中,在重亚硫酸盐处理下胞嘧啶脱氨基后转化为尿嘧啶,而甲基胞嘧啶没有改变是由于其低的反应性。还有在重亚硫酸盐处理后,DNA上的甲基胞嘧啶通过PCR来放大。在基于限制性内切酶的分析方法中,限制性内切酶能敏感地识别甲基化的位点和对特定序列的DNA进行切割。当特定序列上的胞嘧啶被甲基化以后,限制性内切酶的功能将会被抑制。虽然这种方法会因为限制性内切酶对特定序列的DNA没有完全作用,而有时会产生假阳性反应,但是它仍然可以提供一个经济的方法,在不知道主序列时来阐明序列上甲基化的位置。因为甲基转移酶在细胞分化和发展、基因表达、肿瘤发生和遗传性疾病中扮演着一个重要的角色,所以评估甲基转移酶活性在药物发现和临床诊断的领域中是很重要的。甲基转移酶已经成为一种治疗癌症的新颖的家庭药理目标。因此,发展一种敏感、选择性好、简单和经济的方法来检测甲基化转移酶活性十分必要。
发明内容
发明目的:针对现有技术的问题,本发明中针对基因中CpG位点进行分析的DNA甲基化检测和测定甲基转移酶活性方法,它具有快速、简便、无标记、经济、准确地确定DNA甲基化位点和检测甲基转移酶活性。
技术方案:为了解决上述技术问题,本发明提供了一种基于DNA模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测DNA甲基转移酶活性的检测方法,包括以下步骤:
(1)正四面体DNA探针和目标DNA的选取:所述正四面体DNA探针和目标DNA部分互补,都包含可甲基化的CpG位点,并且目标DNA的3'尾部多出富含鸟嘌呤的序列;
(2)正四面体DNA探针的组装与其共价修饰到金电极表面;
(3)正四面体DNA探针与目标DNA的杂交;
(4)甲基化转移酶对CpG位点进行甲基化;
(5)对甲基化敏感的限制性内切酶(HpaⅡ)作用CpG位点;
(6)加入氯化血红素;
(7)加入双氧水和苯胺;
(8)利用电化学工作站对修饰电极进行检测。
其中,上述苯胺聚合生成电化学信号分子聚苯胺。其中,上述苯胺在缓冲液中的终浓度为5 ~ 150 mM。
其中,上述检测方法的具体步骤如下:取三条5'端标记巯基的DNA和一条3’端标记一段含有CpG位点的DNA,以1:1:1:1的比例加入到甲基化作用的缓冲溶液中,90 ~ 95 ℃反应5 ~ 10分钟,4 ~ 8 ℃反应0.5 ~ 1小时后得到正四面体DNA探针;取正四面体DNA探针溶液滴加到金电极表面,室温反应12 ~ 24小时后,取目标DNA溶液滴加到金电极表面,37 ℃反应2 ~ 3小时;然后在金电极上加入甲基转移酶使其CpG位点上的胞嘧啶甲基化,37 ℃反应1 ~ 2小时后,加入限制性内切酶HpaⅡ,37 ℃反应2 ~ 3小时;加入氯化血红素,37 ℃反应0.5 ~ 1分钟;最后加入苯胺和过氧化氢,室温条件反应1 ~ 1.5小时后,对修饰后的金电极在电化学检测的缓冲溶液中进行电化学检测。电极上每步反应结束后都需要用缓冲溶液清洗电极。
其中,上述的正四面体DNA探针和目标DNA浓度在缓冲液中的终浓度分别为1 ~ 5μM。
其中,上述用于甲基化作用的缓冲溶液为含有NaCl、MgCl2、BSA和DTT的pH 7 ~ 8的10 ~ 80 mM 的Tris-HCl,所述NaCl初始浓度为100 ~ 500 mM,MgCl2初始浓度为2 ~ 10mM,BSA初始浓度为0.05 ~ 5 mg/mL,DTT初始浓度为0.05 ~ 10 mM。
其中,上述用于电化学检测的缓冲溶液为pH 3.5 ~ 4.5的80 ~ 150 mM HAc-NaAc。当缓冲液的pH值低于苯胺的pKa值时,质子化的苯胺带正电荷,可以通过静电作用富集在带负电荷的DNA链上,在DNA模拟酶和过氧化氢的存在下,苯胺发生聚合反应生成聚苯胺。
其中,上述甲基转移酶在缓冲液中的终浓度为0 ~ 20 U/mL。
其中,上述限制性内切酶HpaⅡ在缓冲液中的终浓度为10 ~ 20 U/mL。
其中,上述氯化血红素在缓冲液中的终浓度为2.0 ~ 4.0 μM。氯化血红素(hemin)和富含鸟嘌呤的DNA形成G-四连体的DNA模拟酶,作为一类新兴的人工模拟酶,在近几年来得到了飞速的发展,其催化作用的研究引起越来越多的关注,它具有与辣根过氧化物酶相似的活性,能有效地催化以过氧化氢为媒介的反应。DNA模拟酶具有易合成与复制、可修饰、热稳定性好、不易水解等特点,可以代替辣根过氧化物酶用来催化苯胺聚合生成聚苯胺。
其中,上述过氧化氢在缓冲液中的终浓度为20 ~ 100 mM。
其中,上述苯胺在缓冲液中的终浓度为5 ~ 150 mM。
本发明制备了正四面体DNA探针,该正四面体DNA的顶点是一段含有可甲基化的CpG位点的DNA探针,其余三个支点分别标记了巯基。利用金-硫键,正四面体DNA探针共价修饰在金电极表面,正四面体DNA探针与尾部富含鸟嘌呤的目标DNA杂交形成双螺旋结构的DNA链,在CpG位点没有被甲基化的情况下,限制性内切酶会识别特定序列(5'-CCGG-3')并切割,目标DNA从电极上脱落,因而不会有DNA模拟酶生成,无法催化苯胺聚合,电化学信号弱;如果,CpG位点上的胞嘧啶在甲基转移酶的作用下对其特定位点进行甲基化,对甲基化敏感的限制性内切酶就不会识别并切割特定的序列,然后利用氯化血红素(hemin)结合目标DNA尾部的富含鸟嘌呤序列生成具有类似辣根过氧化物酶催化活性的DNA模拟酶,该DNA模拟酶在过氧化氢的存在下催化苯胺在双螺旋DNA上聚合生成电化学信号分子聚苯胺,电化学信号强。此法通过有无DNA模拟酶催化苯胺聚合的不同电化学信号实现检测DNA甲基转移酶活性的目的。
有益效果:本发明相对于现有技术,具有以下优点:
(1)本发明无需标记,可避免现有技术中对甲基化与未甲基化DNA进行标记而导致检测成本高、准确性差的缺点。
(2)利用限制性内切酶来识别特殊位点并切割来确认特殊位点的甲基化,提高其特异性。
(3)本发明的正四面体DNA探针富含双螺旋DNA,为苯胺聚合提供大量的模板,且无需制备复杂材料和标记DNA探针,可避免材料制备及标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐,重现性差的缺陷。本发明具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。
附图说明
图1显示了基于正四面体DNA信号放大和DNA模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测DNA甲基转移酶活性的检测方法的流程图;
图2显示了金电极表面聚苯胺的电化学表征:(A)循环伏安图(CV);(B)差分脉冲伏安图(DPV)。a:没有加甲基转移酶;b:加甲基转移酶。从图中可以看出有甲基化转移酶存在的金电极成功实现苯胺聚合生成聚苯胺。其电化学信号明显强于没有加甲基转移酶的信号。
图3显示了金电极表面聚苯胺的(A)扫描电镜图(SEM)和原子力显微镜图(AFM)。从图中可以看出有甲基化转移酶存在时,聚苯胺成功聚合在金电极表面。
图4显示了检测甲基转移酶活性的差分脉冲伏安图;A:在不同量的甲基转移酶作用下,得到的差分脉冲伏安图(甲基转移酶的浓度:(a)0、(b)0.05、(c)0.1、(d)0.5、(e)1、(f)2.5、(g)5、(h)10、(i)15、(j)20 U/mL);B:差分脉冲伏安信号强度与甲基转移酶浓度的标准曲线;插图:差分脉冲伏安信号强度与甲基转移酶之间的线性关系;从图中可以看出甲基转移酶M.SssI在0.05 U/mL到10 U/mL呈良好的线性关系。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
本实验中用到的试剂和仪器:
限制性内切酶(HpaⅡ)、甲基转移酶(M.SssI)、S-腺甲硫氨酸(SAM)(Thermo,Scientific,美国);苯胺(aniline)、氯化血红素(hemin)、过氧化氢(H2O2)、牛血清蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)(国药集团化学试剂有限公司);扫面电子显微镜(SEM,JEM-2100,JEOL,日本);原子力显微镜(AFM,Nanoscopy IIIa,美国);CHI660电化学工作站(上海辰华仪器有限公司),三电极体系:金电极(直径2 mm)为工作电极,铂丝电极为辅助电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极。
所用到人工合成的DNA序列(5’-3’)(上海生物工程有限责任公司):
(1)用于合成正四面体DNA探针的四条DNA:
tetra-A:ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAG
AGCCGCCATAGTATTTTTTGTAGATCCGGTTCATA
tetra-B:SH-(CH2)6-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAA
TAGATGCGAGGGTCCAATAC
tetra-C:SH-(CH2)6-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGA
ATCTACTATGGCGGCTCTTC
tetra-D:SH-(CH2)6-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGT
TTGTATTGGACCCTCGCAT
(2)目标DNA:GGGTAGGGCGGGTTGGGGGGGGCTCTTCCGCCAGCA
TATGAACCGGATCTAC
标注下划线加粗的序列是限制性内切酶特定识别并切割的序列,标注斜体加粗的序列是用于生成DNA模拟酶的富G序列。
实施例1:
基于DNA模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测DNA甲基转移酶活性的分析方法,检测步骤是:
电极修饰步骤:取tetra-A,tetra-B,tetra-C,tetra-D以1:1:1:1的比例加入到缓冲溶液中,90 ℃反应5分钟,4 ℃反应0.5小时后得到正四面体DNA探针。取正四面体DNA探针溶液滴加到金电极表面,室温反应12小时后,取目标DNA溶液滴加到金电极表面,37 ℃反应2小时。电极上每步反应结束后都需要用缓冲溶液清洗电极。
甲基转移酶活性检测步骤:在修饰电极表面加入不同量的M.SssI (0、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、15、20 U/mL)和50 μM SAM充分混匀后,37 ℃恒温反应1小时,然后加入10U HpaⅡ,混匀后,继续37 ℃恒温反应2.5小时后,加入氯化血红素(hemin),37 ℃反应1小时,最后加入苯胺和过氧化氢,室温条件反应1.5小时后,对修饰后的金电极进行电化学检测。分析得到差分脉冲伏安谱图,作出甲基转移酶线性图。实验结果见图2:甲基化的差分脉冲伏安信号明显强于不加甲基转移酶的信号;图3:在有甲基化转移酶存在的金电极成功实现苯胺聚合生成聚苯胺;图4:甲基转移酶M.SssI在0.05 U/mL到10 U/mL呈良好的线性关系,检测限是0.015 U/mL。说明对DNA甲基化的检测效果好。
实施例2
基于DNA模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测DNA甲基转移酶活性的分析方法,检测步骤是:
电极修饰步骤:取tetra-A,tetra-B,tetra-C,tetra-D以1:1:1:1的比例加入到缓冲溶液中,95℃反应5分钟,8 ℃反应0.5小时后得到正四面体DNA探针。取正四面体DNA探针溶液滴加到金电极表面,室温反应24小时后,取目标DNA溶液滴加到金电极表面,37 ℃反应3小时。电极上每步反应结束后都需要用缓冲溶液清洗电极。
甲基转移酶活性检测步骤:在修饰电极表面加入不同量的M.SssI(0、0.02、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 U/mL)和50 μM SAM充分混匀后,在37 ℃恒温反应2小时,然后加入15 U HpaⅡ,混匀后,继续37 ℃恒温反应2.5小时后,加入氯化血红素(hemin),37 ℃反应1小时,最后加入苯胺和过氧化氢,室温条件反应1.5小时后,对修饰后的金电极进行电化学检测。实验结果:甲基转移酶M.SssI在0.1 U/mL到10 U/mL呈良好的线性关系,检测限是0.05 U/mL。
实施例3
基于DNA模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测DNA甲基转移酶活性的分析方法,检测步骤是:
电极修饰步骤:取三条5'端标记巯基的DNA和一条3'端标记一段含有CpG位点的DNA,以1:1:1:1的比例加入到缓冲溶液中,90 ℃反应10分钟,4 ℃反应60分钟后得到正四面体DNA探针。取正四面体DNA探针溶液滴加到金电极表面,室温反应18小时后,取目标DNA溶液滴加到金电极表面,37 ℃反应2.5小时。电极上每步反应结束后都需要用缓冲溶液清洗电极。
甲基转移酶活性检测步骤:在修饰电极表面加入不同量的M.SssI (0、0.03、0.09、3、6、9、12、15、20 U/mL)和50 μM SAM充分混匀后,37 ℃恒温反应1小时,然后加入20 U HpaⅡ,混匀后,继续37 ℃恒温反应2.5小时后,加入氯化血红素(hemin),37 ℃反应1小时,最后加入苯胺和过氧化氢,室温条件反应1.5小时后,对修饰后的金电极进行电化学检测。实验结果:甲基转移酶M.SssI在0.03 U/mL到15 U/mL呈良好的线性关系,检测限是0.02 U/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种基于DNA模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测DNA甲基转移酶活性的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)正四面体DNA探针和目标DNA的选取:所述正四面体DNA探针和目标DNA部分互补,都包含可甲基化的CpG位点,并且目标DNA的3’尾部多出富含鸟嘌呤的序列;
(2)正四面体DNA探针的组装与其共价修饰到金电极表面;
(3)正四面体DNA探针与目标DNA的杂交;
(4)甲基化转移酶对CpG位点进行甲基化;
(5)对甲基化敏感的限制性内切酶作用CpG位点;
(6)加入氯化血红素;
(7)加入双氧水和苯胺;
(8)利用电化学工作站对修饰电极进行检测;
所述检测方法的具体步骤如下:取三条5'端标记巯基的DNA和一条3’端标记一段含有CpG位点的DNA,以1:1:1:1的比例加入到甲基化作用的缓冲溶液中,90~95 ℃反应5~10分钟,4~8 ℃反应0.5~1小时后得到正四面体DNA探针;取正四面体DNA探针溶液滴加到金电极表面,室温反应12~24小时后,取目标DNA溶液滴加到金电极表面,37 ℃反应2~3小时;然后在金电极上加入甲基转移酶使其CpG位点上的胞嘧啶甲基化,37 ℃反应120min后,加入限制性内切酶HpaⅡ,37℃反应2~3小时;加入氯化血红素,37 ℃反应0.5~1分钟;最后加入苯胺和过氧化氢,室温条件反应1.5小时后,对修饰后的金电极在电化学检测的缓冲溶液中进行电化学检测;所述的正四面体DNA探针和目标DNA浓度在缓冲液中的终浓度分别为1 ~ 5μM,所述甲基化作用的缓冲溶液为含有NaCl、MgCl2、BSA和DTT的pH 7 ~ 8的10 ~ 80 mM 的Tris-HCl,所述NaCl初始浓度为100 ~ 500 mM,MgCl2初始浓度为2 ~ 10 mM,BSA初始浓度为0.05 ~ 5 mg/mL,DTT初始浓度为0.05 ~ 10 mM,所述用于电化学检测的缓冲溶液为pH3.5 ~ 4.5的80 ~ 150 mM HAc-NaAc,所述甲基化转移酶在缓冲液中的终浓度为0 ~ 20 U/mL,所述限制性内切酶在缓冲液中的终浓度为10 ~ 20 U/mL,所述氯化血红素在缓冲液中的终浓度为2 ~ 4 μM,所述过氧化氢在缓冲液中的终浓度为100 mM,所述苯胺在缓冲液中的终浓度为120 mM;
所述三条5'端标记巯基的DNA分别为tetra-B,tetra-C,tetra-D,一条3’端标记一段含有CpG位点的DNA为 tetra-A,
tetra-A序列为:
ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTTTTGTAGATCCGGTTCATA,
tetra-B序列为:
SH-(CH2)6-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC,
tetra-C序列为:
SH-(CH2)6-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC,
tetra-D序列为:
SH-(CH2)6-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT,
目标DNA序列为:
GGGTAGGGCGGGTTGGGGGGGGCTCTTCCGCCAGCATATGAACCGGATCTAC。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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