CN105820947B - Dna测序装置及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供了一种DNA测序装置及使用方法,该装置主要包括：在硅基衬底上设置有氮化硅薄膜，在氮化硅薄膜上方有底层接触电极，底层接触电极上方覆盖有底层石墨烯微带，在底层石墨烯微带上有六方氮化硼微带，在六方氮化硼微带上设置有顶层石墨烯微带，底层石墨烯微带、六方氮化硼微带和顶层石墨烯微带构成石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔异质结。本发明采用了纳米孔中纵向离子电流阻塞、纳米孔顶层石墨烯微带中横向隧穿电流变化、纳米孔顶层和底层石墨烯微带间纵向隧穿电流变化三组数据解析测序的新思想，可以提供单链DNA分子穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔时的更多信息，改善了传统纳米孔离子电流阻塞法信噪比低、易受外界干扰等问题。

Description

DNA测序装置及使用方法

技术领域

本发明涉及DNA测序技术领域，尤其涉及一种DNA测序装置及使用方法。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)测序技术是现代生命科学研究的核心技术之一。从基于荧光标记Sanger法的第一代测序技术到以循环阵列合成测序法为代表的第二代测序技术，极大地改变了人们研究所有生命蓝图的方式，推动了基因组学及其相关学科的创立与发展。

然而，经过数十年的发展，第一代测序技术由于对电泳分离技术的依赖，在速度和成本方面都已达到了极限。第二代测序技术由于对荧光或者化学发光物质的依赖，使得仪器设备、生化试剂的成本难以显著降低。为实现百美元人类基因组(HDG)目标，迫切需要一种新型的不使用任何标记的直接测序方法。在所有以低成本、高通量、直接测序为目标的新一代DNA测序技术中，基于纳米孔的单分子测序被认为是最有希望的DNA测序技术。

截止目前，在已经报道的各种基于纳米孔的DNA单分子测序方法中，离子电流阻塞法提出的最早，研究也最为广泛。这种方法的基本原理如下，测序反应腔被带有纳米孔的膜一分为二，单链DNA分子被加入到膜的一边，在膜另一边正电位电极的吸引下，带有负电荷的单链DNA分子进入纳米孔，并从膜的一边滑动到膜的另一边,单链DNA分子穿越纳米孔时会对原有的纳米孔中的离子电流造成阻塞，离子电流会急剧下降到原电流的10％左右，研究人员通过对 DNA分子穿越纳米孔过程中的穿越时间(t)、阻塞发生的间隙(Δt)以及阻塞电流(I_B)的定量分析来实现DNA分子测序。

然而，这种纳米孔离子电流阻塞法在实际应用中面临一些根本性的问题。早期所采用的生物分子纳米孔(其典型代表是α-溶血素蛋白分子

(proteinα-hemolysin)构成的纳米孔)稳定性差、寿命短，对环境因素极其敏感,且生物分子纳米孔的孔径难以人工控制，内部孔径仅约为1.5nm，只能容许单链核酸分子穿越，因此不能用它来研究双链DNA、RNA或聚核苷酸等大分子的结构性质。

目前普遍采用的固态纳米孔(Solid-state Nanopore)虽然克服了上述生物分子纳米孔的缺点，但是也存在如下问题：第一，固态纳米孔通道长度较长(一般在10nm以上)，可以容纳多个碱基，从而难以分辨每个碱基对离子电流的阻塞作用；第二，当单个碱基占据纳米孔时只有大约100个离子穿过纳米孔，而4个碱基在结构上只有数个原子的差异，这种细微的结构化差异导致离子电流变化很微弱，以至于研究人员很难区分出每个碱基。从而，这种基于固态纳米孔的离子电流阻塞法的测序精度有待进一步提高。

发明内容

本发明的实施例提供了一种DNA测序装置及使用方法，以实现DNA分子的准确、高效、低成本测序。

为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案。

根据本发明的一个方面，提供了一种DNA测序装置，包括：

在硅基衬底上设置有氮化硅薄膜，在氮化硅薄膜上方设置有底层接触电极，底层接触电极上方覆盖有底层石墨烯微带，在底层石墨烯微带上设置有六方氮化硼微带，在六方氮化硼微带上设置有顶层石墨烯微带，所述底层石墨烯微带、所述六方氮化硼微带和所述顶层石墨烯微带构成了石墨烯—六方氮化硼—石墨烯异质结，在石墨烯—六方氮化硼—石墨烯异质结中心刻蚀有石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔。

进一步地，包括：置于电解质溶液中的硅基衬底，在硅基衬底上设置有金字塔型微腔，在金字塔型微腔顶部生长有氮化硅薄膜，氮化硅薄膜上刻蚀有矩形通孔。

进一步地，在顶层石墨烯微带上设置有两个顶层接触电极，石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔将反应腔分成上下两个部分，置于反应腔上部的外接电极接正电位，置于反应腔下部的外接电极接负电位。

进一步地，外接电极、微弱离子电流测量设备和可变电压源构成了纵向微弱离子电流测量回路；

分布在石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔左右两边的一对顶层接触电极、横向微弱隧穿电流测量设备和可变电压源构成了横向隧穿电流测量回路；

分布在石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔上下两边的右侧顶层接触电极、底层接触电极、纵向微弱隧穿电流测量设备和可变电压源构成了纵向隧穿电流测量回路。

进一步地，所述石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔的直径为1—10nm，所述六方氮化硼微带为1—3层六方氮化硼。

进一步地，所述顶层石墨烯微带为单层或多层石墨烯，所述底层石墨烯微带为单层或多层石墨烯。

进一步地，用于产生驱动单链DNA分子穿过石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔的静电场由可变电压源提供，可变电压源的偏置电压应为0.05— 0.2V，反应腔上部的外接电极接正电位，反应腔下部的外接电极接负电位。

进一步地，位于石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔左、右两侧的顶层接触电极分别接正电位和负电位，位于石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔下部的底层接触电极接正电位。

根据本发明的另一个方面，提供了一种DNA测序装置的测序方法，包括：

将单链的DNA分子加入到盛有电解质溶液的测序反应腔下部，在静电场的驱动下，单链DNA分子成线状穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔，最后进入测序反应腔上部；

采用纵向微弱离子电流测量设备对单链DNA分子穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔过程中的穿越时间t、纵向离子电流发生阻塞的间隔时间Δ t₁、阻塞离子电流的大小I_B进行定量测量；

采用横向微弱隧穿电流测量设备对顶层石墨烯微带中的横向隧穿电流发生改变的时间间隔Δt₂、横向隧穿电流的大小I_T-horizontal进行定量测量；

采用纵向微弱隧穿电流测量设备对顶层石墨烯和底层石墨烯之间的隧穿电流发生改变的时间间隔Δt₃、纵向隧穿电流的大小I_T-vertical进行定量测量；

通过对所测得的三组数据进行解析计算：DNA分子序列Sequence＝f(t,Δ t₁,I_B,Δt₂,I_T-horizontal,Δt₃,I_T-vertical)，即可获得DNA分子的序列信息。

由上述本发明的实施例提供的技术方案可以看出，本发明采用了DNA分子穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔时，纳米孔中纵向离子电流阻塞、纳米孔顶层石墨烯微带中横向隧穿电流变化、纳米孔顶层和底层石墨烯微带间纵向隧穿电流变化三组数据解析测序的新思想。采用这种三组数据解析测序可以提供单链DNA分子穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔时的更多信息，改善了传统纳米孔离子电流阻塞法信噪比低、易受外界干扰等问题。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的一种基于石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔的DNA测序装置的结构示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的任一单元和全部组合。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语 (包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以几个具体实施例为例做进一步的解释说明，且各个实施例并不构成对本发明实施例的限定。

为了实现DNA分子的准确、高效、低成本测序，本发明实施例提供的一种基于石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔的DNA测序装置的结构如图1所示，该装置是以石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔为核心组装的测序装置。该装置具体包括置于电解质溶液3中的硅基衬底1，在硅基衬底1上刻蚀有金字塔型微腔8，金字塔型微腔8顶部有生长的氮化硅薄膜20，氮化硅薄膜20中间刻蚀有矩形通孔6，氮化硅薄膜20用来保证硅基衬底1和底层石墨烯微带4之间的绝缘。

在氮化硅薄膜20上方设置有底层接触电极19，底层接触电极19上方覆盖有底层石墨烯微带4，在底层石墨烯微带4上有六方氮化硼微带18，在六方氮化硼微带18上设置有顶层石墨烯微带13，底层石墨烯微带4、六方氮化硼微带 18和顶层石墨烯微带13构成了一个石墨烯—六方氮化硼—石墨烯异质结，在异质结的中心刻蚀有石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5，在顶层石墨烯微带13上设置有一对(两个)顶层接触电极12。

底层石墨烯微带4、六方氮化硼微带18和顶层石墨烯微带13构成了本发明装置的核心部件：石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5。所述的石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5把测序反应腔2分成上下两个部分，置于反应腔2上部分的外接电极9接正电位，置于反应腔2下部分的外接电极9接负电位，这两个电极使单链DNA分子7从反应腔2的下部穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5最终到达反应腔2的上部。两个外接电极9与微弱离子电流测量设备11以及可变电压源10构成了纵向微弱离子电流测量回路；分布在石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5左右两边的一对顶层接触电极12和横向微弱隧穿电流测量设备14以及可变电压源15构成了横向隧穿电流测量回路；分布在石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5上下两边的右侧顶层接触电极12和底层接触电极 19与纵向微弱隧穿电流测量设备17以及可变电压源16构成了纵向隧穿电流测量回路。

所述石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5的直径为1—10nm。

所述顶层石墨烯微带13为单层或多层石墨烯。

所述底层石墨烯微带4为单层或多层石墨烯。

所述六方氮化硼微带18为1—3层六方氮化硼。

所述纵向微弱隧穿电流测量设备17为皮安级电流测量仪。

所述微弱离子电流测量设备11为皮安级电流测量仪。

所述横向微弱隧穿电流测量设备14为亚微安级电流测量仪。

用于驱动单链DNA分子7穿过石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5的静电场由可变电压源10提供，所述可变电压源10的偏置电压应为0.05—0.2V，位于石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5左、右两侧的顶层接触电极12应分别接正电位和负电位，位于石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5下部的底层接触电极19应接正电位。

所述电解质溶液11为NaCl、KCl或者LiCl溶液，其浓度为0.8～ 1.5mol/L，pH 值为8.0。

基于石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5的新型DNA测序装置的测序方法：首先将单链DNA分子7加入到盛有电解质溶液3的测序反应腔2下部，在静电场的驱动下，单链DNA分子7成线状穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5，最后进入测序反应腔2的上部。

当单链DNA分子7穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5时，第一，单链DNA分子7会对通过石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5的电解质离子造成阻塞，导致纵向离子电流急剧变化；第二，对顶层石墨烯13中的横向电导产生影响，导致通过顶层石墨烯13中纳米孔左右两边的横向隧穿电流发生变化；第三，对顶层石墨烯13和底层石墨烯4之间的隧穿电导产生影响，导致通过顶层石墨烯13和底层石墨烯4之间的纵向隧穿电流发生剧烈变化。因为构成单链DNA分子7的碱基结构各不相同，所以单链DNA分子7在穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5时，不同碱基所造成的纵向离子电流、横向隧穿电流和纵向隧穿电流的变化也不相同。

采用纵向微弱离子电流测量设备11对单链DNA分子7穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔5过程中的穿越时间t、纵向离子电流发生阻塞的间隔时间Δt₁、阻塞离子电流的大小I_B进行定量测量。

采用横向微弱隧穿电流测量设备14对顶层石墨烯微带13中的横向隧穿电流发生改变的时间间隔Δt₂、横向隧穿电流的大小I_T-horizontal进行定量测量。

采用纵向微弱隧穿电流测量设备17对顶层石墨烯13和底层石墨烯4之间的隧穿电流发生改变的时间Δt₃、纵向隧穿电流的大小I_T-vertical进行定量测量。

最后，通过对所测得的三组数据进行解析计算：DNA分子序列Sequence＝f (t,Δt₁,I_B,Δt₂,I_T-horizontal,Δt₃,I_T-vertical)。

即可获得DNA分子的序列信息。

在实际应用中，可以利用大量已知的DNA分子序列输入到测量装置中，根据测量得到的t,Δt₁,I_B,Δt₂,I_T-horizontal,Δt₃,I_T-vertical，来对上面的计算函数f进行归纳总结，得到计算函数f的具体表现形式。

综上所述，本发明实施例提出的基于石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔的DNA测序装置和现有技术相比，具有如下优点：

本发明采用了DNA分子穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔时，纳米孔中纵向离子电流阻塞、纳米孔顶层石墨烯微带中横向隧穿电流变化、纳米孔顶层和底层石墨烯微带间纵向隧穿电流变化三组数据解析测序的新思想。采用这种三组数据解析测序可以提供单链DNA分子穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔时的更多信息，改善了传统纳米孔离子电流阻塞法信噪比低、易受外界干扰等问题。

本发明采用了一种石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔新结构。该纳米孔结构的优点在于:第一，克服了生物纳米孔的稳定性差和孔径不易控制的问题；第二，解决了常规固态纳米孔通道太长导致测序分辨率难以达到单个碱基的问题；第三，石墨烯—六方氮化硼—石墨烯异质结提供了一对天然的在亚纳米量级(六方氮化硼厚度)精确对准的石墨烯隧穿电极，克服了隧穿电流测序法电极难以设置的问题。这些优点为实现单碱基分辨率、直接纳米孔测序奠定了基础。

本领域普通技术人员可以理解：附图只是一个实施例的示意图，附图中的模块或流程并不一定是实施本发明所必须的。

本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于装置或系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述得比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。以上所描述的装置及系统实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的情况下，即可以理解并实施。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种DNA测序装置，其特征在于，包括：

在硅基衬底上设置有氮化硅薄膜，在氮化硅薄膜上方设置有底层接触电极，底层接触电极上方覆盖有底层石墨烯微带，在底层石墨烯微带上设置有六方氮化硼微带，在六方氮化硼微带上设置有顶层石墨烯微带，所述底层石墨烯微带、所述六方氮化硼微带和所述顶层石墨烯微带构成了石墨烯—六方氮化硼—石墨烯异质结，在石墨烯—六方氮化硼—石墨烯异质结中心刻蚀有石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔；

还包括：置于电解质溶液中的硅基衬底，在硅基衬底上设置有金字塔型微腔，在金字塔型微腔顶部生长有氮化硅薄膜，氮化硅薄膜上刻蚀有矩形通孔；

在顶层石墨烯微带上设置有两个顶层接触电极，石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔将反应腔分成上下两个部分，置于反应腔上部的外接电极接正电位，置于反应腔下部的外接电极接负电位；

外接电极、微弱离子电流测量设备和可变电压源构成了纵向微弱离子电流测量回路；

分布在石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔左右两边的一对顶层接触电极、横向微弱隧穿电流测量设备和可变电压源构成了横向隧穿电流测量回路；

分布在石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔上下两边的右侧顶层接触电极、底层接触电极、纵向微弱隧穿电流测量设备和可变电压源构成了纵向隧穿电流测量回路。

2.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔的直径为1—10nm，所述六方氮化硼微带为1—3层六方氮化硼。

3.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述顶层石墨烯微带为单层或多层石墨烯，所述底层石墨烯微带为单层或多层石墨烯。

4.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：用于产生驱动单链DNA分子穿过石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔的静电场由可变电压源提供，可变电压源的偏置电压应为0.05—0.2V，反应腔上部的外接电极接正电位，反应腔下部的外接电极接负电位。

5.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：位于石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔左、右两侧的顶层接触电极分别接正电位和负电位，位于石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔下部的底层接触电极接正电位。

6.一种基于权利要求1至5任一项所述的DNA测序装置的测序方法，其特征在于，包括：

将单链的DNA分子加入到盛有电解质溶液的测序反应腔下部，在静电场的驱动下，单链DNA分子成线状穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔，最后进入测序反应腔上部；

外接电极、微弱离子电流测量设备和可变电压源构成了纵向微弱离子电流测量回路；采用纵向微弱离子电流测量设备对单链DNA分子穿越石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔过程中的穿越时间t、纵向离子电流发生阻塞的间隔时间Δt₁、阻塞离子电流的大小I_B进行定量测量；

分布在石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔左右两边的一对顶层接触电极、横向微弱隧穿电流测量设备和可变电压源构成了横向隧穿电流测量回路；采用横向微弱隧穿电流测量设备对顶层石墨烯微带中的横向隧穿电流发生改变的时间间隔Δt₂、横向隧穿电流的大小I_T-horizontal进行定量测量；

分布在石墨烯—六方氮化硼—石墨烯纳米孔上下两边的右侧顶层接触电极、底层接触电极、纵向微弱隧穿电流测量设备和可变电压源构成了纵向隧穿电流测量回路；采用纵向微弱隧穿电流测量设备对顶层石墨烯和底层石墨烯之间的隧穿电流发生改变的时间间隔Δt₃、纵向隧穿电流的大小I_T-vertical进行定量测量；

通过对所测得的三组数据进行解析计算：DNA分子序列Sequence＝f(t,Δt₁,I_B,Δt₂,I_T-horizontal,Δt₃,I_T-vertical)，即可获得DNA分子的序列信息。