CN108344863A - 一种基于适配体-纳米金传感的纳米孔检测微囊藻毒素的新方法 - Google Patents

一种基于适配体-纳米金传感的纳米孔检测微囊藻毒素的新方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种基于适配体‑纳米金传感的纳米孔检测微囊藻毒素的新方法。本发明提供的以适配体‑纳米金络合物为检测标靶，通过利用微囊藻毒素与适配体的特异性相互作用实现单分子纳米孔间接检测微囊藻毒素的目标，本方法利用络合物体积大同时减弱表面荷电性的特点，与单纯检测小分子微囊藻毒素相比，能大幅度提高纳米孔检测的灵敏度和信噪比，检测下限可以达到0.1nM，比近期发表的通过其他方式检测MC‑LR的结果要好。

Description

一种基于适配体-纳米金传感的纳米孔检测微囊藻毒素的新 方法
技术领域
本发明属于分子检测领域，具体涉及一种基于适配体-纳米金传感的纳米孔检测微囊藻毒素的新方法。
背景技术
藻毒素是蓝藻细菌繁殖过程中产生的致命性氰基毒素中的一种，它广泛存在于海水和淡水中，世界卫生组织规定水体里藻毒素最高允许含量为1ug/L。藻毒素污染问题已引起全世界的高度重视和深入研究，对淡水中的藻毒素进行监测和分析研究，对于评价食品质量、保护人类健康和维持社会经济可持续发展具有重要的现实意义。为了促进食品行业健康发展，减少藻毒素从食物链进人人体，建立一种快速、方便、简单、可靠的环境中藻毒素含量检测的技术至关重要。特别是针对现在环境分析中水体污染物的检测评估及处理方面，急需要开发新的、便捷、低成本的检测手段和方法来控制关乎人类健康的水源质量。
目前国内外检测藻毒素的方法有很多种，包括用高效液相色谱法检测，基于酶和抗体的免疫传感法，荧光和紫外以及比色法，当然用的最多的还是电化学传感方法。这些方法大多操作繁琐或需要标记，以及大型设备需求和操作费时，灵敏度不高等缺点。
因此提供一种检测藻毒素的方法，该方法采用单分子纳米孔检测技术配合适配体-纳米金体系用于检测藻毒素，具有高灵敏性、高特异性、实时快速、成本低廉的优点。
发明内容
针对上述存在的技术问题，本申请的发明团队提出了一种新型单分子纳米孔间接检测水体微囊藻毒素的方法，通过创造性的将微囊藻毒素适配体与纳米金结合作为检测媒介间接检测藻毒素与适配体特异性相互作用后的络合物穿过纳米孔的特征电流信号，从而建立一套高灵敏度、高特异性的水体藻毒素传感体系。
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种微囊藻毒素的适配体-纳米金体系，其对于结合微囊藻毒素具有高特异性。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种微囊藻毒素的适配体-纳米金体系，其包含微囊藻毒素适配体DNA-纳米金的络合物、cDNA-纳米金的络合物，其中适配体DNA与微囊藻毒素能够特异性结合，适配体DNA为带有末端巯基的藻毒素适配体DNA，cDNA与所述适配体DNA部分互补。
适配体DNA及cDNA通过其末端巯基与纳米金形成巯基-金共价键来固定在金纳米粒子上。在上述微囊藻毒素的适配体-纳米金体系中，通过适配体与其互补链互补，适配体DNA-纳米金的络合物与cDNA-纳米金的络合物特异性结合形成纳米金网络。
作为优选的方案，上述适配体DNA-纳米金与cDNA-纳米金的络合物中，适配体DNA采用的纳米金的尺寸更小。
进一步优选的，适配体DNA-纳米金的络合物中，纳米金的尺寸为5nm；所述cDNA-纳米金的络合物中，纳米金的尺寸为20nm。
作为优选的方案，上述微囊藻毒素的适配体-纳米金体系的制备过程包括：
1)将适配体DNA、与适配体DNA的部分互补链段cDNA中的S-S键还原打断形成独立的链段；
2)将独立链段的适配体DNA加入到纳米金水溶液中，搅拌，形成适配体DNA-纳米金络合物水溶液(见附图1a)；
3)将独立链段的cDNA加入到纳米金水溶液中，搅拌，形成cDNA-纳米金络合物水溶液；
4)将适配体DNA-纳米金的络合物水溶液与cDNA-纳米金的络合物水溶液混合并搅拌反应，适配体DNA与cDNA充分互补结合形成纳米金粒子网络(见附图1b)，离心获得结合的络合物。
作为优选的方案，上述S-S键还原打断的方法为加入TCEP的TE缓冲液。
作为优选的方案，步骤2)和步骤3)的络合物水溶液中加入Tween 20和PEG-SH溶液，使纳米金-DNA复合物能稳定存在于水溶液中而不团聚。
本发明的目的之二在于提供一种目的一的体系在用于检测微囊藻毒素的用途，其用于检测微囊藻毒素具有灵敏度高、特异性强和成本低的优点。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
向目的一的微囊藻毒素的适配体-纳米金体系加入微囊藻毒素(MC-LR)，适配体会释放它的互补链而与微囊藻毒素结合，导致纳米粒子网络体系打开，带互补链的大纳米金颗粒随着离心而沉降，结合了MC-LR的带适配体的小纳米金颗粒由于尺寸小，在一定的离心条件下无法沉降而留在上层液中并用于后续的检测。
本方法利用络合物体积大同时减弱表面荷电性的特点，与单纯检测小分子微囊藻毒素相比，能大幅度提高纳米孔检测的灵敏度和信噪比。
本发明的目的之三在于提供一种用于检测微囊藻毒素的适配体-纳米金传感方法，其灵敏度高、特异性强。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种用于检测微囊藻毒素的适配体-纳米金传感方法，以微囊藻毒素适配体DNA-纳米金的络合物作为媒介，所述媒介与cDNA-纳米金的络合物结合；其中适配体DNA与微囊藻毒素能够特异性结合，适配体DNA为带有末端巯基的藻毒素适配体DNA，cDNA与适配体DNA部分互补。当微囊藻毒素存在时，代替cDNA-纳米金的络合物与所述媒介结合形成带微囊藻毒素的纳米粒子用于检测。见附图1。
作为优选的方案，上述适配体DNA-纳米金与所述cDNA-纳米金的络合物中，适配体DNA采用的纳米金的尺寸更小。
进一步优选的，上述适配体DNA-纳米金的络合物中，纳米金的尺寸为5nm；cDNA-纳米金的络合物中，纳米金的尺寸为20nm。
作为优选的方案，上述传感方法包括以下步骤：
1)将适配体DNA、与适配体DNA的部分互补链段cDNA中的S-S键还原打断形成独立的链段；
2)将独立链段的适配体DNA加入到纳米金水溶液中，搅拌，形成适配体DNA-纳米金络合物水溶液(见附图1a)；
3)将独立链段的cDNA加入到纳米金水溶液中，搅拌，形成cDNA-纳米金络合物水溶液；
4)将适配体DNA-纳米金的络合物水溶液与cDNA-纳米金的络合物水溶液混合并搅拌反应，适配体DNA与cDNA充分互补结合形成纳米金粒子网络(见附图1b)，离心获得结合的络合物；
5)溶解步骤4)获得的结合的络合物，加入微囊藻毒素，搅拌后离心，带微囊藻毒素的纳米粒子在上层液中(见附图1c)。
作为优选的方案，上述S-S键还原打断的方法为加入TCEP的TE缓冲液。
作为优选的方案，步骤2)和步骤3)的络合物水溶液中加入Tween 20和PEG-SH溶液，使纳米金-DNA复合物能稳定存在于水溶液中而不团聚。
作为优选的方案，步骤4)中离心2～5次，且每次离心后用PBST溶液清洗沉淀物。
进一步优选的，离心条件为14000RPM转速离心10分钟。
本发明的目的之四在于提供一种目的三的传感方法在用于检测微囊藻毒素的用途，目的三的传感方法获得的带微囊藻毒素的纳米粒子可用于后续检测。
本发明的目的之五在于提供一种纳米孔电学检测微囊藻毒素的方法，其具有操作简单且灵敏度高、特异性强的优点。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
通过目的三所述的传感方法获得带微囊藻毒素的纳米粒子，通过施加电压驱使所述粒子过纳米孔，产生过孔阻塞电流信号，根据电流信号的幅值和阻塞时间分析过孔粒子信息。
作为优选的方案，将目的三的方法获得的带微囊藻毒素的纳米粒子加入自制的装有1M KCL Tris缓冲液的flowcell的cis端，并插入银电极。
本发明使用新型单分子纳米孔检测技术，该技术具有高灵敏度，高特异性，实时快速等优点，广泛应用于单分子DNA,RNA,蛋白质及纳米粒子的尺寸及表面功能化的检测中，是目前检测生物单分子使用最广泛的技术之一。本发明联合藻毒素适配体及纳米金作为检测标靶，通过藻毒素与适配体的特异性相互作用引起的纳米粒子体系的改变从而通过纳米孔电学方式来检测藻毒素的存在。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的基于适配体-纳米金传感的纳米孔检测微囊藻毒素的方法，创造性的将微囊藻毒素适配体与纳米金结合作为检测媒介，建立了一套高灵敏度、高特异性的水体藻毒素检测。
2)本方法利用络合物体积大同时减弱表面荷电性的特点，与单纯检测小分子MC-LR相比，能大幅度提高纳米孔检测的灵敏度和信噪比，检测下限可以达到0.1nM，比近期发表的通过其他方式检测MC-LR的结果更好，准确性更高，且操作快捷、成本低廉。
附图说明
图1为本发明检测原理示意图，其中a:适配体DNA-纳米金的络合物的形成，b:适配体DNA-纳米金的络合物与cDNA-纳米金的络合物结合，c:检测体系中带微囊藻毒素的纳米粒子的形成示意图，d:纳米孔电学检测微囊藻毒素示意图。
图2为利用纳米孔检测0.1nM的微囊藻毒素的电流及阻塞时间分布统计图，其中A:电流幅值和阻塞时间的统计散点图，B:电流幅值与事件数的统计图，C:阻塞时间与时间数的统计柱状图。
具体实施方式
以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1微囊藻毒素的适配体-纳米金体系
第一步：适配体纳米金复合物的制备
首先在1.5ml的离心管中，将10uM的带有末端巯基的藻毒素适配体DNA(aptamer)与aptamer的部分互补链段(cDNA)分别与20uM的TCEP的TE缓冲液室温下持续搅拌作用60分钟，将末端带巯基的DNA链段中的S-S键还原打断形成独立的链段。
然后将还原好的2uM的适配体DNA(aptamer)水溶液加入到400ul的纳米金水溶液中，室温下持续搅拌30分钟。金纳米粒子我们采用了两种尺寸分别为5nm和20nm，为了后续反应能进行有效的离心分离。反应结束后再往体系中加入1wt％的Tween 20溶液和10uM的PEG-SH溶液并持续搅拌10分钟，加入Tween 20和PEG-SH目的是使纳米金-DNA复合物能稳定存在于水溶液中而不团聚。最后，再在配好的纳米金-DNA溶液中加入10M的NaCl溶液并持续搅拌60分钟。
第二步：复合纳米粒子体系的制备
将适配体DNA(aptamer)-纳米金的络合物水溶液与cDNA-纳米金的络合物水溶液混合并在室温条件下持续搅拌反应过夜，让适配体DNA(aptamer)与cDNA充分互补结合形成金纳米粒子网络。
以上过程制备得到本发明的用于检测微囊藻毒素的适配体-纳米金体系。
实施例2检测微囊藻毒素
第一步：制备微囊藻毒素的适配体-纳米金体系
与实施例1过程相同。
第二步：获得形成网络的粒子
将第一步的纳米金混合溶液通过高速离心10分钟，把形成了网络的粒子沉降下来，没有结合的分散粒子就会留在上层液中。共离心三次，每次去除上层清液并用PBST溶液清洗沉淀物。
第三步：微囊藻毒素(MC-LR)与适配体的相互作用
将上一步分离清洗的纳米粒子网络用含有5mM MgCl2的50mM Tris-buffer溶液稀释溶解，而后平行分别加入0.1,1,10,100,2000nM MC-LR缓冲溶液，再在室温下持续搅拌2小时，之后以14000RPM转速离心10分钟，由于MC-LR与适配体的特异性结合，适配体会释放它的互补链而与MC-LR结合，导致纳米粒子网络体系打开，带互补链的大纳米金颗粒随着离心而沉降，结合了MC-LR的带适配体的小纳米金颗粒由于尺寸小，在一定的离心条件下无法沉降而留在上层液中，以便接下来做纳米孔检测。
第四步：微囊藻毒素(MC-LR)的纳米孔间接检测
将上述离心后的上层清液加入自制的装有1M KCLTris缓冲液的flowcell的cis端，插入银电极，通过施加一定的电压驱使带微囊藻毒素(MC-LR)的纳米粒子过孔，从而产生过孔阻塞电流信号，通过记录的电流信号幅值和阻塞时间来分子过孔离子的分子信息，0.1nM的检测结果见附图2。
实施例3微囊藻毒素与适配体的特异性检测
在实施例2同样的操作条件下检测了蓝藻毒素家族的其他类毒素比如MC-RR,MC-YR以及水体里广泛存在含量丰富的叶绿素等，从电流阻塞信号来看，后三者都没有出现任何信号。但当往这三者的混合物中加入MC-LR后立刻出现了信号，证明只有微囊藻毒素(MC-LR)能与他的适配体aptamer相互作用后产生信号。
验证了本发明选取的适配体与微囊藻毒素(MC-LR)具有特异性相互作用，不受水体其他污染物的强干扰。
综上所述，本发明提供的一种新型的以适配体纳米金络合物为检测标靶的，通过利用微囊藻毒素与适配体的特异性相互作用实现单分子纳米孔间接检测MC-LR的目标，本方法利用络合物体积大同时减弱表面荷电性的特点，与单纯检测小分子MC-LR相比，能大幅度提高纳米孔检测的灵敏度和信噪比，检测下限可以达到0.1nM，比近期发表的通过其他方式检测MC-LR的结果要好。
本发明公开了一种基于适配体-金纳米粒子的单分子纳米孔微囊藻毒素的检测新方法。由于本发明制样简单，操作便捷，成本低廉，具有非常好的应用前景。本方法为提供了一套科学的检测水体强致癌污染物的评估方法，有广阔的应用前景。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种微囊藻毒素的适配体-纳米金体系，其特征在于，所述体系包含微囊藻毒素适配体DNA-纳米金的络合物、cDNA-纳米金的络合物，其中所述适配体DNA与微囊藻毒素能够特异性结合，所述适配体DNA为带有末端巯基的藻毒素适配体DNA，所述cDNA与所述适配体DNA部分互补。
2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述适配体DNA-纳米金与所述cDNA-纳米金的络合物中，适配体DNA采用的纳米金的尺寸更小。
3.根据权利要求2所述的体系，其特征在于，所述适配体DNA-纳米金的络合物中，纳米金的尺寸为5nm；所述cDNA-纳米金的络合物中，纳米金的尺寸为20nm。
4.权利要求1所述的体系在用于检测微囊藻毒素的用途。
5.一种用于检测微囊藻毒素的适配体-纳米金传感方法，其特征在于，所述传感方法以微囊藻毒素适配体DNA-纳米金的络合物作为媒介，所述媒介与cDNA-纳米金的络合物结合；其中所述适配体DNA与微囊藻毒素能够特异性结合，所述适配体DNA为带有末端巯基的藻毒素适配体DNA，所述cDNA与所述适配体DNA部分互补；
微囊藻毒素存在时，代替cDNA-纳米金的络合物与所述媒介结合形成带微囊藻毒素的纳米粒子用于检测。
6.根据权利要求5所述的传感方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将适配体DNA、与适配体DNA的部分互补链段cDNA中的S-S键还原打断形成独立的链段；
2)将独立链段的适配体DNA加入到纳米金水溶液中，搅拌，形成适配体DNA-纳米金络合物水溶液；
3)将独立链段的cDNA加入到纳米金水溶液中，搅拌，形成cDNA-纳米金络合物水溶液；
4)将适配体DNA-纳米金的络合物水溶液与cDNA-纳米金的络合物水溶液混合并搅拌反应，适配体DNA与cDNA充分互补结合形成纳米金粒子网络，离心获得结合的络合物；
5)溶解步骤4)获得的结合的络合物，加入微囊藻毒素，搅拌后离心，带微囊藻毒素的纳米粒子在上层液中。
7.根据权利要求6所述的传感方法，其特征在于，步骤1)中将S-S键还原打断的方法为加入TCEP的TE缓冲液。
8.根据权利要求6所述的传感方法，其特征在于，步骤2)和步骤3)的络合物水溶液中加入Tween 20和PEG-SH溶液。
9.权利要求5所述的传感方法在用于检测微囊藻毒素的用途。
10.一种纳米孔电学检测微囊藻毒素的方法，其特征在于，所述方法通过权利要求5所述的传感方法获得所述带微囊藻毒素的纳米粒子，通过施加电压驱使所述粒子过纳米孔，产生过孔阻塞电流信号，根据电流信号的幅值和阻塞时间分析过孔粒子信息。
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