CN113985017A - 分子传感器及相关方法 - Google Patents

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Abstract

公开了配置成检测单分子的电子传感器以及使用和制造这种电子传感器的方法。一种传感器可包括通过传感器间隙隔开的源电极和漏电极；栅电极，其中源电极，漏电极和栅电极配合形成电极电路；和跨越所述传感器间隙桥接，连接源电极和漏电极的桥分子；和耦合到桥分子的探针，其中通过监测电极电路的参数能检测探针与核酸的相互作用。在各种实例中，核酸包含DNA或RNA。

Description

分子传感器及相关方法
本申请是申请日为2016年12月28日、申请号为201680083636.4、 发明名称为“分子传感器及相关方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本公开涉及电子传感器装置。具体而言，本公开涉及在测量电路中包 括一个或多个生物分子组件，并且可用于核酸测序的电子传感器装置。
背景技术
由于所需的灵敏度以及存在许多潜在的噪音源，在分子尺度上测量性 质存在很多挑战。因此，在描述用于此目的的传感器时，清楚所有测量误 差的来源是有帮助的。一般而言，对于任何可能被测量的系统或对象，测 量的状态m仅仅是实际系统状态a的近似值。这可能是由于许多因素中的 任何造成的，例如由传感器的操作、读出过程或信号解释导致的反映错误 的不完美的信号解释，以及可能因为在某些情况下将传感器与系统接触会 干扰系统的状态。测量的状态m不同于实际的状态a反映了合并的传感器、 读出和解释的测量误差。理想情况下，构建传感器系统以尽可能减小这种 测量误差。
为了测量分子级别的状态，例如在对DNA分子进行测序的情况下， 已经致力于建立传感器系统，其中传感器装置具有与感兴趣分子接触的 “探针”，优选在单分子尺度上，而传感器装置的其他特征处于较大的纳米 或微米尺度以为了制造传感器装置或将它们集成到信号传导系统中。
具体而言，生物传感器是一种分析装置，其将生物识别成分功能性地 整合到信号转导系统中，以测量生物相关分子(例如DNA，RNA或蛋白 质)的性质。这种整合提供了生物事件向可检测电信号的快速和方便的转 换。在已经设计的各种电生物传感架构中，基于场效应晶体管(FET)的 系统看起来很有前景，因为它们可以直接将靶分子(例如生物分子)和FET 表面之间的相互作用转化为可检测的电信号。在典型的FET装置中，电流 沿着连接到两个电极(也被称为源电极和漏电极)的通道流动。源电极和 漏电极之间的通道电导可以通过第三电极(也称为栅电极)来调制，该第 三电极通过薄介电绝缘层耦合至通道。FET可用于检测靶化学品并测量各 种商业应用的化学浓度。经典和广泛使用的例子是基于FET的pH传感器， 用于测量氢离子浓度。这是Bergveld在二十世纪七十年代推出的，用于固 态pH传感器。离子敏感场效应晶体管(ISFET)装置的一般领域扩展了 其他化学浓度测量的概念。
目前的FET型生物传感器系统的局限性在于它们的灵敏度。目前的生 物传感器系统不能进行单分子检测和鉴定。同样，他们无法监测单分子反 应动力学。FET型生物传感器的这些灵敏度限制阻止其在重要的生物化学 测定中(例如在单分子测序反应中)用作检测器。
改善FET生物传感器灵敏度的一些努力集中于使用碳纳米结构(例如 碳纳米管)来形成电极之间的通道。然而，碳纳米结构在生物传感器功能 化方面提出了各种障碍。特别是，无法在特定的理想原子位置处的附连位 点中进行工程设计，从而附连功能性或敏感性探针分子。此外，目前对碳 纳米结构合成的精度，控制和规模的限制对于单个传感器的灵敏度和可靠 生产，建立高密度可扩展的传感器阵列以及传感器制造的商业可行性提出了更多挑战。目前的碳纳米管合成方法通常产生长度大约为100nm或更长 的结构，该尺度很可能在多传感器平台上对灵敏度和传感器密度造成限制。
因此，需要这样的分子级电子生物传感器装置，其具有与增加的灵敏 度和精确度兼容的架构，可靠的工程设计，并且还与高效且商业可行的制 造方法兼容以用于在多传感器平台上实现增加的传感器密度。同样，也需 要制造这种传感器装置的改进方法。
发明内容
本公开总体上涉及传感器，包括传感器的系统以及形成和使用传感器 和系统的方法。示例性的传感器可以用于例如对分子，例如DNA，RNA 或其他寡核苷酸进行测序。尽管本公开的各种实施方式解决现有技术传感 器的缺点的方式在下面更详细地讨论，但是一般而言，本公开提供了相对 简单且制造便宜的传感器。
在本公开的各种实施方式中，传感器包括：源电极；通过传感器间隙 与源电极隔开的漏电极；栅电极，其中源电极，漏电极和栅电极配合形成 电极电路；和桥分子，所述桥分子跨越所述传感器间隙进行桥接，并连接 源电极和漏电极；和耦合到桥分子的探针，其中通过监测电极电路的至少 一个参数能检测探针与核酸的相互作用。在各种示例中，核酸包含DNA 或RNA，或其变体。
在各种实施方式中，传感器的探针包含酶，例如DNA聚合酶，逆转 录酶，核酸外切酶或解旋酶。在一些情况下，探针可包含DNA聚合酶， 例如Phi29，PolI或其突变体。
在各种实施方式中，桥分子可包含抗体，双链DNA或蛋白质α-螺旋。 例如，抗体可以包含IgG抗体，例如IgG抗体，其识别源电极或漏电极上 的至少一个接触点或识别源电极和漏电极上的接触点。其他桥分子可包括 核酸双链体，例如DNA双链体，DNA-RNA杂交双链体，DNA-PNA杂交 双链体，PNA-PNA双链体或DNA-LNA杂交双链体。
根据本公开的各种实施方式，传感器包括耦合到第一电极的第一触点， 耦合到第二电极的第二触点，在第一触点和第一电极中的一个以及第二触 点和第二电极中的一个之间限定的传感器间隙，和包括第一端和第二端的 桥分子，其中桥分子在第一端耦合到第一触件并在第二末端耦合到第二触 件。根据这些实施方式的各个方面，桥分子是生物聚合物，或桥分子是化 学合成的。根据其他方面，传感器包括第三或栅电极。在这些情况下，可以使用栅电极来调谐和/或激活传感器装置。根据其他方面，传感器间隙具 有约5nm至约30nm的传感器间隙尺寸。根据其他方面，第一端或桥分子 包含第一自组装锚；根据另外的方面，第二端包括第二自组装锚。示例性的 桥分子可以包括以下属性中的一个或多个：桥分子可以是线性的(例如， 线性生物聚合物)，桥分子具有小于桥分子的持续长度的端到端长度，并 且桥分子包括被配置为近似传感器间隙的尺寸的端到端长度。示例性的桥 分子包括核酸双链体，例如DNA双链体，DNA-RNA杂交双链体， DNA-PNA杂交双链体，PNA-PNA双链体或DNA-LNA杂交双链体。示例 性的传感器包括附连到桥分子上的探针。探针可以被配置为与单个靶分子 结合。示例性探针可以包括或者是被配置成在溶液中反应期间与靶分子接 合的酶。
根据本公开的其他实施方式，传感器包括覆盖基材表面的第一电极， 覆盖基材表面的第二电极，在第一电极和第二电极之间(或附连到电极的 触件之间)限定的传感器间隙，以及包含第一端和第二端的桥分子，其中 所述桥分子在所述第一端处耦合至第一触件并且在所述第二端处耦合至 第二触件。传感器间隙可以包括约5nm至约30nm的传感器间隙尺寸。根 据这些实施方式的各个方面，桥分子是生物聚合物，或桥分子是化学合成 的。根据其他方面，传感器包括第三或栅电极。在这些情况下，可以使用 栅电极来调谐和/或激活传感器装置。根据其他方面，第一端或桥分子包含 第一自组装锚；根据另外的方面，第二端包括第二自组装锚。示例性的桥分 子可以包括本文所述的一个或多个属性。示例性的桥分子包括核酸双链体， 例如DNA双链体，DNA-RNA杂交双链体，DNA-PNA杂交双链体， PNA-PNA双链体或DNA-LNA杂交双链体。示例性的传感器包括附连到 桥分子上的探针。示例性的传感器包括附连到桥分子上的探针。探针可以 被配置为与单个靶分子结合。示例性探针可以包括或者是被配置成在溶液 中反应期间与靶分子接合的酶。
根据其他示例性实施方式，系统包括如本文所述的传感器。该系统可 以另外包括一个或多个电路，例如使用基材形成的电路，所述基材用于形 成传感器或者传感器驻留在其上。系统可以附加地或可选地包括其他电路 和/或设备，从而例如从信号中去除噪音和/或辅助对信号的解释。
根据本公开的其他实施方式，方法包括提供传感器，例如本文所述的 传感器；使核酸模板与聚合酶接触，其中所述聚合酶与包含传感器的一部 分的桥分子耦合；提供核苷酸碱基混合物；通过聚合酶进行掺入事件，所 述掺入事件包括将来自核苷酸碱基混合物的核苷酸掺入合成的核酸中；并 检测由掺入事件产生的信号。根据这些实施方式的各个方面，方法还可以 包括向传感器施加电势的步骤-从而例如调谐或激活传感器。根据另外的方 面，可以从信号中去除噪音。
根据其他实施方式，制造生物分子感测装置的方法包括以下步骤：在 基材表面上形成第一电极和第二电极，其中第一电极和第二电极通过电极 间隙分开；将第一触件放置在所述第一电极上并且将第二触件放置在所述 第二电极上，其中所述第一触件和所述第二触件被触件间隙分开；并将桥分 子附着到第一触件和第二触件。示例性方法可以进一步包括使桥分子与探 针接触以将探针与桥分子耦合的步骤。
并且，根据本公开的其他实施方式，对寡核苷酸进行测序的方法包括 使用如本文所述的一个或多个传感器。
附图说明
本发明的主题将在说明书结束部分特别指出并明确地要求保护。然而， 通过参考结合附图考虑的详细描述和权利要求，可以最好地获得对本公开 的更完整的理解。
图1显示了根据各种实施方式的传感器的示意图；
图2A和2B显示了根据各种实施方式的传感器装置的视图；
图3显示了根据各种实施方式的传感器的一部分的轮廓图；
图4显示了根据各种实施方式的包含生物聚合物桥分子的传感器；
图5显示了根据各种实施方式的包含生物聚合物桥分子的传感器；
图6A和6B显示了根据各种实施方式的传感器装置的视图；
图7显示了根据各种实施方式的噪音去除之前和之后的信号迹线；
图8显示了根据各种实施方式的使用CMOS技术制造电极的方法的 工艺流程；图9显示了根据各种实施方式的使用CMOS技术制造触件的方 法的工艺流程；图10显示了根据各种实施方式的使用CMOS技术制造触 件并沉积预制的触件颗粒(contact paticles)的方法的工艺流程；
图11A-11C显示了根据各种实施方式的使用CMOS技术制造的传感 器装置的视图；图12显示了根据各种实施方式的生物聚合物桥自组装之 后的触件阵列的扫描电子显微照片；图13显示了在根据各种实施方式的 传感器的生物聚合物桥自组装事件期间产生的信号迹线；图14显示了在 探针结合根据各种实施方式的传感器的生物聚合物桥的过程期间产生的 信号迹线；图15显示了在模板结合根据各种实施方式的探针期间产生的 信号迹线；图16显示了通过根据各种实施方式的探针在模板依赖性碱基 掺入期间产生的信号迹线；图17显示了由根据各种实施方式的传感器进 行的单个模板依赖性碱基掺入事件所产生的信号迹线；
图18显示了根据各种实施方式的传感器在各种实验条件下产生的信 号迹线；图19显示了响应于包含未修饰的和5-甲基胞嘧啶修饰的核苷酸 的靶标的在各种条件下由根据各种实施方式的传感器产生的信号迹线；图 20显示了在各种实验条件下响应于长模板序列的由根据各种实施方式的 传感器产生的信号迹线；
图21显示了根据各种实施方式的化学合成的桥分子；
图22显示了一般的自组装过程，其中分子电路元件，例如生物聚合 物，在电路中的目标位置内与正电极和负电极结合，桥接它们以形成组装 的分子电路；
图23显示了在电路自组装中使用材料接触点。显示为“A”的接触点是 一个空间定位的，精确定位的材料元件，可以指导精确的自组装，并提供 电子或机械连接。左侧显示了添加接触点并附连分子元件的基本步骤。右 侧显示这如何产生所需电路。基团“B”是桥连分子上的共轭基团，其可以 选择性地结合到接触点；
图24说明了在一系列组装步骤中使用另外的接触基团“C”以特异性 地使表示为椭圆的另外分子组分“D”(带缀合结合位点“E”)结合至一级桥 分子；
图25显示了电流中的尖峰如何与传感器装置的自组装中的每个步骤 相关；
图26是桥触件(绿色框)和非桥触件(红色框)的理想图像的图形 表示；
图27是桥接反应和标记反应后的基材的电子显微镜图像。绿色方块 突出显示具有良好形成的桥的触件；
图28是桥接至金接触点阵列的更高效率的20nm双链DNA的图像。 为了成像目的，桥用小金点标记。绿色方块突出显示了良好形成的桥的例 子。由于在高盐缓冲溶液中沉积，更高水平的与金接触点和桥的结合(桥 接反应条件：1μM桥浓度与结合阵列在5X TBS缓冲液中孵育1小时)；
图29是结合金点接触点测试阵列的α-螺旋肽桥的图像；
图30是IgG抗体桥结合的图像；
图31显示了桥分子上的电测量的测试装置的示意图；
图32显示了电流对时间的曲线图，显示了指示桥-电极结合事件的三 个尖峰；
图33是标记的桥的EM图像；
图34是金电极的dSDNA桥接的EM图像；
图35说明了用于在所需位置制造小珠的方法(1)的步骤。从图中的 左上方开始，在基材(蓝色)上涂覆一层抗蚀剂(灰色)，其具有直径为 D的开口盘。然后将一层粘合剂(绿色)沉积到盘中。然后将通过标准方 法制造的预制珠的溶液暴露于此，其中珠具有直径d，使得空间位阻允许 每个粘合盘仅一个珠。除去抗蚀剂后，残留的是直径为d的珠，位于粘性盘中心附近，但尺寸小于盘直径D；
图36显示了用于建立来自图35的小珠的过程(1)的步骤，以3D透 视图和俯视图显示。从基材开始，使用标准图案化和沉积方法将直径为D 的材料的粘合盘沉积到在抗蚀剂涂层(灰色)中呈现的图案中。暴露于珠 并除去抗蚀剂导致珠附着在粘合剂贴片上，并且空间位阻使得每个粘合剂 盘仅有一个珠。因此，该方法在所需位置建立了珠，其直径小于图案化过 程所规定的直径。特别地，这允许以超过图案化方法的分辨率制造接触点；
图37显示了方法(2)实施方式(a)的步骤：从左上方开始，在合 适的基材(蓝色)上沉积矩形的宽度为W的珠材料(金)，其在退火时 和在表面张力的作用下分解成一排珠。然后，使可移除抗蚀剂(红色)的 保护层图案化并沉积，保护将包含单个珠的区域。除去剩余的珠，然后除 去抗蚀剂，在原始矩形材料的优选末端附近留下单个珠；
图38显示了方法(2)的替代实施方式b，其中与图37中所示的实施 方式相反，最终沉积层(红色)用于覆盖不需要的珠，仅在优选端暴露珠 并可用于更大的纳米装置；
图39A显示了方法(2)的一个优选实施方式的示例，其中所使用的 图案化方法是电子束光刻，并且目标是在两个电极条的近端处制造珠。该 图描绘了贯穿将矩形层分解成珠，以及在每个矩形的优选端处实现单珠的 最终步骤之前的过程；
图39B是电子显微镜图像，显示了图39A的方法在由升高和凹陷的 基材脊组成的基材上付诸实施，金层沉积在基材脊上并允许其分解成珠。 图像显示珠的直径明显小于矩形条带的下方宽度，并且变窄(凹陷)的条 带足够小以形成单行珠；
图40显示了珠形成过程(3)，其中产生矩形图案，并且沉积粘附材 料1(蓝色)，接着是材料2(金)，接着是界面层，例如由真空破坏诱 导的氧化(灰色)，以建立最左上方的配置。然后(箭头)将材料3沉积 在薄层(再次显示为金)中，其可以是与2相同的材料，然后(箭头)保 护层(红色)被图案化并沉积，例如氧化硅，使优选端的小区域暴露。然 后进行(箭头)退火，这使得由保护层和界面层界定的小块材料3断裂并 成珠，形成直径小于并且具有一级图案尺寸的材料珠3，位于矩形区域的 末端；
图41说明使用方法(1)或(2)制备的珠阵列。在方法(1)的情况 下，初始图案化和材料沉积过程可用于在基材上形成粘合材料盘阵列(由 虚线圆圈表示的原始足迹)。然后该方法将沉积所示的预成形珠。或者， 如果使用方法(2)，则可以基于沉积的初始材料矩形阵列，通过单个保 护步骤建立整个珠列；
图42显示了珠光处理方法的使用，以便为分子电子装置阵列产生纳 米接触点。将珠阵列定位成使得每对电极接收一对珠作为接触点，定位在 电极的末端附近；
图43显示沉积在粘附表面上的金珠的电子显微镜图像。珠是直径约5 nm至10nm的金纳米颗粒；
图44显示对照样品的电子显微镜图像，所述对照样品包含粘附于未 衍生的硅表面的金珠；
图45显示沉积在衍生化粘附表面上的金珠的原子力显微镜(AFM) 图像。珠是直径约5nm至10nm的金纳米颗粒；
图46A显示了平板图，其显示了沉积到孔中的各种浓度的金纳米颗粒， 其中缓冲液、亲和抗体、天然血清和对照非特异性小鼠IgG进行三列重复， 各行显示各种稀释度；
图46B是来自ELISA板的最终读数的颜色编码强度图；
图46C是数字ELISA读数的对应表；
图46D描绘了以图形形式总结的最终数据结果，显示具有特异性亲和 力的抗体在沉积在表面上的珠浓度的整个范围内对表面珠具有比各种对 照更大的结合；
图47说明了用于测量DNA序列的分子电子电路的一种优选形式。酶 耦合在源电极和漏电极之间，以形成包括用于测量电特性的仪表的电路， 例如施加的源电极-漏电极和栅电极电压下的电流，或类似的系统性质(例 如恒定施加电流下的电压)。作为时间迹线的测量性质S(t)反映了DNA 的基础序列，这是由于酶对DNA的处理作用，以及在该处理期间其作为 电子成分的可变特性；
图48列出了常见的甲基化形式的核酸碱基。当这些存在于DNA中时， 希望能够读出它们在序列中的存在，因为这可能具有生物相关性；
图49以更标准的源电极-漏电极-栅电极几何形状显示了图1；
图50说明了用于测量DNA序列的分子电子电路的另一种优选形式的 示意图。酶作为次级元件耦合到源电极和漏电极之间的一级导电元件，以 形成其中酶可以提供门控功能以及传导的电路。该电路包括用于测量电性 质的仪表，例如施加的源电极-漏电极和栅电极电压下的电流，或类似的系 统性质(例如恒定施加电流下的电压)。作为时间迹线的测量性质S(t)反 映了DNA的基础序列，这是由于酶对DNA的处理作用，以及在该处理期 间其作为电子成分的可变特性；图51描绘了在更具描述性的优选实施方 式中的图1的示意图，其具有来自半导体装置的源电极-漏电极-栅电极几 何形状，以及作为一级导电元件的电极之间的分子桥，以及将酶耦合到桥 的耦合点或共轭基团(作为确保接近的一种手段)，和潜在电连接；
图52说明了优选的实施方式，其中酶包含聚合酶，其延伸引发的单 链DNA模板，假设存在含有dNTP的合适缓冲液。掺入过程(所示的A 核苷酸的掺入)在测量的电流迹线中产生相应的可识别特征，从而确定序 列；
图53显示了当存在可检测的掺入信号时的测序的实施方式，其被指 示为测量的电路参数中的信号尖峰，例如电流i。进行单核苷酸类型A，C， G，T的试验流程，通过洗涤步骤分离(核苷酸流动的时间和由时间轴上 的字母和下划线指示的洗涤)，并且得到的观察到的信号尖峰确定序列， 如所示。注意，均聚物序列系列，例如“TT”，在相应的试验流程中表示为 多个掺入尖峰。显示的是流动A碱基的结果，其中A被掺入并产生信号 尖峰，并且对应所得的DNA序列的下一个碱基；
图54描绘了使用修饰的核苷酸产生可检测的信号。表示每个dNTP 带有修饰组(表示为红球)的情况，该修饰组对掺入过程的电流具有可检 测的影响。这种修饰可以在可切割的γ磷酸盐上，因此通过聚合酶除去， 或者可以在感测反应后进行的单独的切割反应中切割。显示的是掺入了修 饰后的A碱基的情况。这里说明了这个概念，其中四个不同的修饰组表示 为四个不同数量的附连球(G：1，A：2，T：3，C：4)，从而增强了迹 线以在每个核苷酸的痕迹内具有相同数量的次要尖峰；
图55描绘了当在试验流动方法中使用可检测的掺入信号时，在测序 实施方式中使用修饰的核苷酸来增强掺入信号。表示每个dNTP带有修饰 组(表示为红球)的情况，该修饰组对掺入过程的电流具有可检测的影响。 这种修饰可以在可切割的γ磷酸盐上，因此通过聚合酶除去，或者可以在 感测反应后进行的单独的切割反应中切割。显示的是试验流程的A步骤， 其中A是掺入的正确碱基；
图56显示了序列信息的动力学编码。掺入尖峰之间的时间表明碱基 被掺入，这里dNTP浓度的差异表明：A处于最低浓度，因此尖峰之间的 长时间表示A掺入的预期等待时间，而G处于最高浓度，因此，尖峰之 间的最短时间表示G掺入(第一间隔)；
图57说明了桥的优选实施方式，其是通过硫醇键(DNA末端的硫醇 化核苷酸或位于α螺旋末端的半胱氨酸)与金触件耦合的螺旋聚合物 (dsDNA或蛋白质α螺旋)，并且具有特异性合成的内部生物素，用于耦 合与酶缀合的链霉亲和素；
图58说明了桥的另一个优选实施方式，作为IgG蛋白(天然的或工 程化的)，其对电极上的接触点具有特异性亲和力(对一级接触点材料的 亲和力，或表面的抗原衍生化)，通过IgG特异性结合蛋白(例如抗IgG 抗体，或蛋白A或蛋白G)耦合，其与目标蛋白质缀合，或者目标蛋白质 可以使用天然或工程化的缀合位点直接与IgG缀合；
图59说明了使用所述方法的不同实施方式对来自相同(或复制)DNA 模板的重复测序的部分序列信息的组合，以获得完整信息。蓝色迹线表示 来自每个单独示例的部分信息，相对于组合信息的灰色迹线(在单次测序 运行中不能直接观察到)。在此指示，对模板进行测序(左实施方式)以 产生部分信息(显示，仅可检测A碱基)，并再次(右实施方式，指示桥 和酶的变化)，以产生互补或辅助测序信息(显示，检测到G，T，C)， 然后将其组合以获得完整序列。两个测序实施方式可以使用复制模板在物 理上或时间上隔离和独立，或者可以是在不同时间的相同传感器系统的不 同状态-可能由缓冲液变化，温度变化或诸如栅电压的施加电压的变化产生 -重读相同的模板。任何数量的这种互补实施方式可以将它们的信息组合以 改进最终序列确定；
图60说明了其中酶是外切核酸酶的实施方式。通过酶构象，DNA构 象和释放的核苷酸对电路参数的影响产生信号；
图61说明了一个实施方式，其中进行性酶是DNA解旋酶，解开双链 DNA模板；
图62说明了一个实施方式，其中酶是由蛋白质纳米孔和具有DNA易 位能力的运动蛋白酶形成的复合体；
图63显示了集成芯片传感器阵列装置。这种形式提供了一种同时从 多个序列中大规模并行检测序列的方法，以及在每个位点部署不同或相同 的传感器构造的选项，用于对序列数据进行稳健的平均或数据整合，以便 复制单个DNAS片段；
图64A说明终止子测序过程中的试运行。在存在dNTP(蓝色)和双 脱氧终止剂，ddNTP(紫色)的混合物的情况下，进行聚合和感测，产生 掺入尖峰，用于计数所示的碱基位置(所示的位置8)，直至终止子随机 掺入。在反应结束时，进行传感测量，以识别终止子碱基(在这种情况下 为A)。因此，基础序列在位置8处具有A。通过在该模板，或复制模板 上重复这样的测量，并合并信息，可以确定沿模板的所有位置处的完整碱 基序列；
图64B说明了终止子测序的备选实施方式，其中在给定的反应中仅使 用单碱基终止子，在所示的情况下，A双脱氧终止(ddATP，紫色)。在 这种模式下，当反应终止时，暗示所讨论的碱基是A，终止子，并且掺入 尖峰的数量计数给出了该A在模板中的位置。使用复制模板为A重复多 次运行将随机确定模板中的所有A位置，并分别对其他终止子碱基C，G， T执行类似的一系列运行，将确定模板中所有这些碱基的相应位置，从而 确定整个序列；
图64C显示了终止子测序的实施方式，其中将感兴趣的复制模板加载 到所指示的每个芯片中，并且从顶部系列中指示的并行传感器阵列上的一 次运行累积所有A终止数据，并且对于C-，G-和T-终止反应也类似，并 积累每个单基因结果(红色箭头)以确定所讨论模板的完整序列；
图65说明了在分子传感器中使用DNA杂交探针代替附连的酶，以及 通过监测诸如电流的电路参数来检测杂交。杂交由不同的电流水平指示。 一个优选的实施方式是通过位于探针中的生物素化碱基将DNA杂交探针 与链霉抗亲和素(橙色基团)耦合。这种形式的探针和检测测量支持通过 杂交进行测序，该杂交基于使用一组信息探针针对复制的模板分子聚合的 许多此类测量；
图66说明将杂交探针掺入传感器的替代实施方式，其中探针形成桥 分子的全部或部分。在一个优选的实施方式中，含有探针的DNA将使用 金-硫醇键(用DNA中的硫醇化核苷酸和金接触点)耦合至接触点。该图 说明了三种不同的方式，例如杂交探针可以配置为DNA桥分子的全部或 部分。在较低的情况下，探针可以进一步部分地与下面的DNA杂交，以与靶标建立竞争性杂交以增加严谨性；
图67显示通过使用酶促延伸(由蓝色箭头指示的探针的3'可延伸末 端)掺入一个或多个碱基(可能包括可检测基团(紫色))以增强信号来 增强一级杂交信号的一个示例。这种酶促延伸既增加了严谨性/检查正确配 对，也增强了电子传感器信号的增强手段，如当前图中的三个水平所示(没 有杂交，杂交，延伸产物存在)。在单碱基延伸的情况下，如果碱基相同 性是可检测的(来自四个dNTP，或通过一系列单独的dNTP延伸试验)， 它还可以添加多一个的序列信息碱基，增强该方法的测序能力；
图68显示了封装在微孔或纳米孔中的传感器，其可以在整体/宏观过 程中密封和未密封。这使反应物和反应产物定位，以促进其他检测模式。 这也可以从每个孔的多种传感器类型或每个传感器的多个探针分子中受 益，使得进行性酶可以与探针一起存在以检测反应产物；
图69显示了通常用于实验工作的桥和探针分子结构的细节。在这种 情况下，桥是双链DNA分子，显示20nm长度(60个碱基)，在两个5' 末端都具有硫醇基团，用于耦合金属电极上的金触件；
图70显示了用于分子传感器上的电测量的测试装置的示意图。在图 70的上部，显示了电极-基材结构的横截面和附接到分析器，用于施加电 压和测量通过桥分子的电流。在图70的下部，显示了用于桥接电路的电 极阵列的透视图；
图71A是具有用于桥接的金金属点触件的钛电极阵列的电子显微镜 图像。电极位于硅基材上并通过电子束光刻产生；
图71B是图71A中的电极间隙之一的电子显微镜特写图像，显示7mm 的电极间隙和15mm金-金间距的金点接触间隙；
图71C是来自图71B的单电极间隙的电子显微镜特写图像，显示了 在两个电极的尖端处的大约10nm直径的金点；
图72显示了电极测试芯片架构。在这种情况下，使用电子束光刻在1 cm硅基材上形成电极阵列。图72中的三个SEM图像系列以低至电极间 隙的10nm尺度的增加的分辨率显示20个电极对；
图73显示了传感器装置的实施方式，其中氧化硅钝化层用于保护电 极免受溶液影响。钝化中的开口暴露出nm尺度的电极区域，和10微米尺 度的电接触垫；
图74显示了用于支持液体溶液受控地暴露于传感器芯片表面的流动 池的实施方式。流动池是模塑的PDMS聚合物；
图75显示了固定在芯片运载体中用于电测量的芯片；
图76说明组装的传感器复合体的电导率，显示在湿(稀盐缓冲液) 和干(空气)条件下测量的DNA桥分子和完整的传感器复合体(与聚合 酶桥接)的电流-电压(IV)特征，以及空气、水和稀盐缓冲液中的开路 电极的对照。该图显示，桥和传感器复合体在1伏的施加源电极-漏电极电 压下传导大约100毫皮安(mpico-Amp)电流。通过SMU在半导体参数 分析仪上进行测量；
图77显示了对分子传感器自组装到金点接触电极上的电子监测。电 流对比时间的测量用于监测桥和分子传感器复合体的组装。左上：阶段1： 双链DNA桥组装，5'末端的硫醇基团组装到电极金接触点上，如电流跳跃 所示。右上：阶段2：聚合酶-链霉亲和素复合体与dsDNA桥上的生物素 化位点结合，如电流跳跃所示。右下：阶段3：引发的单链DNA模板与聚合酶结合以完成复合体，如电流对比时间中的尖峰所示；
图78显示了在两个放大水平下的最终组装结构的电子显微镜图像。 在放大图像中，桥复合体在没有任何标记的情况下可见，被视为连接电极 的模糊高对比度区域(由绿色箭头指向)；
图79是用传感器测量掺入信号的四个图，说明用传感器测量掺入信 号，并显示由提供各种引发的单链DNA测序模板和用于掺入和聚合的 dNTP的传感器产生的电流信号。在每种情况下，主要信号尖峰代表来自 离散掺入事件的信号，其中聚合酶向延伸链添加另一个碱基。左上：模板 是20个T碱基；右上，模板是20个G碱基；左下，模板是20个A碱基； 右下，模板是20个C碱基。观察到的近似掺入速率为每秒10-20个碱基， 与标准酶动力学一致，除了由于速率限制因素(例如较低的dNTP浓度) 导致的每秒约1个碱基的较低速率；
图80显示了从单碱基掺入事件产生的信号的特写。该信号具有双峰 结构，除了检测掺入事件外，还可用于帮助表征碱基的特性；
图81说明了感测甲基化碱基的实施方式。该图显示了传感器用于感 测模板中甲基化状态或单个甲基化碱基的潜在用途。该图显示了由模板的 未甲基化对比甲基化部分(绿色迹线)产生的不同信号。更高的信号来自 未甲基化部分，而不是甲基化部分。所示实验由测量所示传感器芯片上所 示模板序列的一系列不同溶液添加物的迹线组成。dCTP流产生单碱基掺 入峰，然后添加dGTP使得掺入能够穿过模板的CG道行进，突出显示甲 基化对比未甲基化模板的信号差异；
图82显示了传感器的长读取能力。该图显示了读取或分析长DNA片 段的潜力，这对于数据的长程连续性很重要的应用而言是重要的，例如全 基因组序列的从头组装。DNA模板是5.4kb PhiX病毒基因组。左图：来 自模板的低时间分辨率读取(dNTP混合物)的差异信号，对比没有聚合 的后续对照(终止子ddNTP混合物，聚合酶活性被阻断)。右图：具有 可见长模板DNA的电极的SEM图像；
图83A显示包含肽α-螺旋桥分子的传感器的实施方式。在一个付诸 实施的特定的优选实施方式中，桥分子包括具有66个氨基酸序列的肽；
图83B显示完全组装的传感器的实施方式，其包含通过已知的生物素 -中性亲和素结合反应与中性亲和素分子耦合的α-螺旋桥，以及通过与聚 合酶上的表面半胱氨酸缀合的其他生物素-马来酰亚胺接头(其通过已知的 马来酰亚胺-半胱氨酸共价耦合反应)附连的聚合酶；
图84A显示实施例9中使用的修饰的C核苷酸(作为与图84B中描 绘的dCP4-Cy7的混合物)，以增强来自聚合酶掺入的信号；
图84B显示实施例9中使用的修饰的C核苷酸(作为与图84A中描 绘的dCP4-乳糖的混合物)，以增强来自聚合酶掺入的信号；
图85A显示了来自使用α-螺旋肽桥的序列传感实验的数据。该图是 测试芯片上电极的电流-电压迹线，其已经与肽桥分子在PBS缓冲液中以 1μM肽浓度孵育1小时，以便将桥附连至金触件。在2伏施加的源电极- 漏电极处实现3纳安电流的最高电流迹线表明具有桥分子的电极到位；
图85B显示了来自使用α-螺旋肽桥的序列传感实验的其他数据。该图 是电流-时间迹线，显示在大约10秒至50秒的时间，当桥接传感器暴露于 具有施加的2伏源-漏电压的中性亲和素溶液时，后续中性亲和素与桥结合 的特征；
图85C显示了来自使用α-螺旋肽桥的序列传感实验的其他数据。该图 是电流-时间迹线，显示聚合酶-马来酰亚胺-生物素结合中性亲和素-桥复 合体的特征，在10-20秒的时间，当后者暴露于前者的溶液时；和
图85D显示了来自使用α-螺旋肽桥的序列传感实验的其他数据。该 图显示了当向组装的传感器提供含有模板DNA的溶液时产生的测序信号， 其序列具有一系列GT重复：(10xGT)TTT(10x GT)AAA(10x GT)CCC (10x GT)。图中注释了这些信号的一种可能的解释，其中主要尖峰对应于 模板的GT重复痕迹，并且总共三种不同的模板DNA分子在所示的45秒期间与传感器接合。
具体实施方式
此处各示例性实施例的详细描述参照附随的图片，这些制图和图片通 过说明显示示例性实施例及其最佳模式。尽管这些示例性实施例被充分详 细地描述以使本领域技术人员能够实施本发明，但是应当理解其他实施例 也可实现并且可做出逻辑、化学和机械改变而不背离本发明的精神和范围。 因而，此处提供的详细描述仅仅出于说明的目的而非限制。例如，除非另 外说明，任何方法或过程描述中所述的步骤可以任何次序执行且不必然受 所提供的次序的限制。此外，任何对单数的引用均包括复数实施例，并且 任何对一个以上组件或步骤的引用可包括单个实施方式或步骤。此外，对 附连、固定、连接等的任何引用可以包括永久的、可移除的、临时的、部 分的、完整的和/或任何其他可能的附连选项。另外，任何对无接触(或类 似短语)的引用也可包括减少接触或最小接触。
在各种实施方式中，单分子生物传感器装置可以包括第一电极和第二 电极。第一电极和第二电极被由电极和/或附连到电极的触件限定的传感器 间隙分开。第一和第二电极可以通过跨越传感器间隙的桥分子缀合。桥分 子可以包含生物聚合物，如核酸或氨基酸聚合物。该桥还可以包含化学合 成的分子，其可以包括合成有机分子，包含生物聚合物单体的合成类似物 的聚合物，或非源自生物分子的其他全合成单体。“生物聚合物”和“化学合 成的分子”之间的差异并不意味着如此严格地字面意义，以排除将天然生 物聚合物改性为有用的桥分子的合成转化的可能性，例如，合成修饰否则 天然存在的多核酸序列的3'和5'末端，用于随后的结合和桥接。无论由生 物聚合物还是由合成分子组成的桥分子都可以具有已知的原子精确的分 子结构。桥分子与电极的附连可能由触件介导。探针分子或分子复合体可 以缀合至桥分子上。探针可以是生物分子，例如配置成与单个靶分子相互 作用的酶。在各种实施方式中，传感器装置可以包括并联排列的多个单分 子生物传感器。这种多传感器装置可以用于执行靶标和其他分子的复杂混 合物中的多个单独靶分子的并行检测、区分和/或表征或鉴定。
图1显示了包括根据各种实施方式的传感器101的传感器装置100的 示意图。传感器101包括第一电极102和第二电极103。传感器101还可 以包括栅104，如下详述。传感器101可以进一步包括在功能上缀合至第 一电极102和第二电极103的传感器复合体105。在各种实施方式中，传 感器复合体可以经由连接到相应电极的第一触件106和第二触件107缀合 至电极。传感器复合体105可以包含多个组分，如桥分子和探针分子，如 下详述。传感器复合体105可以与周围环境相互作用，从而使得传感器101 能够执行感测功能。例如，如图1所示，传感器复合体105可以与例如 DNA分子的靶分子108相互作用，并且传感器装置可以用于检测靶分子 的存在和/或性质。
在各种实施方式中，传感器装置100和传感器101可以可操作地连接 到电路120以检测传感器101的电性质的变化。电路120优选是具有与传 感器101接近的微尺度的集成电路，但电路120也可以体现为外部电表， 例如台式电流计。传感器装置100可以包括多个传感器101。集成电路120 可以包括可以使用CMOS制造方法制造的电路架构。集成电路120可以包 括用于每个传感器101的电子测量电路，其在提供对传感器的支持的相同 芯片内制造。换句话说，传感器装置100可以包括集成微电路中的传感器101和集成电路120。集成电路120可以进一步包括用于连接到外部信号 处理系统121的读出电路和输入/输出特征。
在各种实施方式中，使用位于具有传感器101的公共半导体芯片上的 集成电路120可以减少可由宏观外部电路元件产生的读数中的电子噪音源。 例如，这种电路可以是混合信号CMOS传感器，包括少量晶体管，取决于 灵敏度和读出的性能要求，少量晶体管的范围为1至200。在各种实施方 式中，这种电路可用于测量单个传感器101中的电流。此外，传感器装置 100可以包括集成电路120，集成电路120包括用于传感器阵列101的传 感器/读出电路，以便支持同时操作与相同样品接触的大量传感器。
在各种实施方式中，由传感器101接触的样品将包含液相样品。包含 样品的溶液可能非常稀且离子强度低，以减少使用传感器进行的电测量中 的噪音。所获取的信号通常将是在传感器中的电极102和103之间流动的 电流，但它可以是相关的可观察的电子参数，例如电极之间的电压，电极 之间的电阻/电导或栅极电压。
在各种实施方式中，集成微芯片形式中的传感器101和集成电路120 的配置适合于使用调制解调器CMOS制造方法进行制造，这有助于具有高 度紧凑架构的传感器装置的生产。在各种实施方式中，用于传感器的集成 电路可以位于传感器间隙的大约100μm内，或者在传感器间隙的大约 50μm内，或者在传感器间隙的大约20μm内，或者在传感器间隙的大约 10μm内或者在传感器间隙的约5μm内，或者在传感器间隙的约1μm内。 此外，在各种实施方式中，传感器装置可以包括多个传感器，每个传感器 具有位于上述参数内的相关集成电路。
信号处理系统121可以被配置为提供传感器设备100的电子控制并且 接收，存储和分析从传感器设备和其中的每个传感器101接收的信号。信 号处理系统121可以包括具有处理器和/或软件的计算机系统，该处理器和 /或软件被配置为执行电子控制功能，包括对施加到每个传感器101的电压 和电流的控制，以及对从每个传感器101接收的信号执行信号处理功能。
例如并且如图1所示，包括传感器101的传感器装置100可用于进行 核酸测序反应。在装置的操作期间，可以在传感器101的第一电极和第二 电极之间施加电压，其中传感器与靶标的相互作用产生对流过生物聚合物 桥分子的电流的调制(参见例如333，图3)，其可以使用集成电路120 和信号处理系统121来测量。传感器101可以随着时间t产生信号模式122， 其中传感器响应于传感器复合体与靶分子108的特征的相互作用而产生信 号特征123。信号处理系统121可以接收并处理信号模式，并响应于信号 模式提供序列输出124，在该情况中信号模式是对信号的解释。
在各种实施方式中，单分子生物传感器可以采取晶体管的形式，例如 场效应晶体管(FET)，其中附连的桥分子和/或探针、和/或靶分子和/或 溶液相分子非常接近这些部件，用作电路中的通道或导电路径。在这样的 实施方式中，包含单个探针分子的传感器复合体可以被配置成与单个靶分 子结合或相互作用，如下详述，由此提供具有单分子灵敏度的生物传感器。 例如在多栅装置的情况下，这样的晶体管实施方式可以包括两个或三个端子晶体管，或者可能包括更多的端子。
图2A和2B显示了根据各种实施例的传感器装置200的视图。在传 感器装置200的图示中未显示传感器复合体。传感器装置200包括多个传 感器201，每个传感器包括第一电极202和第二电极203。每个传感器可 以进一步包括传感器间隙239。在所示的实施方式中，每个传感器包括附 连到第一电极的第一触件206和附连到第二电极的第二触件207。在各种 实施方式中，电极可以设置在半导体基材表面上。例如，传感器装置200 可以包括覆盖二氧化硅层261的氮化硅层260。传感器装置200可以进一 步包括在其上设置有电极的半导体基材层下面的掩埋栅极204。上述各种 组件可以制造在例如硅芯片263的支撑件上。如图2A所示，第一电极201， 第二电极202和栅极204中的每一个可以连接到信号处理系统221，信号 处理系统221可以是外部计量器，如图所示，但也可以是集成电路(细节 未显示)。
现在参照图3，更详细地显示传感器301和传感器复合体305的一部 分的轮廓图。传感器301包括第一电极302和第二电极303。第一电极302 和第二电极303可以设置在基材320上。在各种实施方式中，传感器301 可以进一步包括分别可操作地缀合至第一电极302和第二电极303的第一 触件306和第二触件307。然而，不严格需要触件，并且根据本公开的传 感器不需要包括第一和第二触件。第一电极302和第二电极303的端部限 定电极间隙330。类似地，对于包括触件的传感器例如传感器301来说， 第一触件306和第二触件307之间的距离限定了触件间隙331。任何给定 的第一触件和第二触件的触件间隙的实际尺寸可以根据触件的配置和用 于参考的触件的点而变化。例如，对于图1所示的半球形第一触件306和 第二触件307，如图3所示，触件间隙331的尺寸可以在触件的最近点之 间或从中心到中心之间测量。在各种实施方式中，电极间隙和触件间隙中 的一个，或者共同限定的间隙或者通过电极和/或触件的各种组合限定的间 隙可以被称为传感器间隙。
继续参考图3，传感器301还包括传感器复合体305。在各种实施方 式中，传感器复合体305可以包括桥分子333和探针334。探针334可以 通过接头337与桥分子333缀合，接头337在此显示为链霉亲和素-生物素 复合体，其中生物素共价整合到DNA桥333的核苷酸中，并且链霉亲和 素化学地、共价交联到聚合酶334。下面更详细地描述传感器复合体305 的各个部件中的每一个。
在各种实施方式中，桥分子333可以包含化学合成的桥分子或生物聚 合物桥分子。化学合成的桥分子或生物聚合物桥分子可被配置成在结构上 和功能上跨越传感器间隙。例如，化学合成的分子或生物聚合物分子可以 通过下述来配置：选择和使用原子上精确的分子亚单元(例如，用于掺入 聚合物桥分子中的单体单元)，其提供具有已知或可预测结构参数的桥分 子的构建；掺入促进自组装至触件点以及探针分子自组装至桥分子的特征； 以及用于电极的电连接的合适的电化学性质。
化学合成的桥分子是可由合成有机化学领域的技术人员组装的分子。 例如，化学合成的分子可以包含聚吡咯，聚苯胺或聚噻吩骨架。简要参考 图21，图示了基于聚噻吩而化学合成的桥分子2100的一般结构的示例。 化学合成的桥分子2100可以包含形成桥分子的主链的噻吩环2101的链， 在探针支撑部分2102的任一侧上具有n1和n2噻吩环，所述探针支撑部 分可以配置在桥分子2100中的特定位置处。因为每个噻吩环2101的宽度 约为0.3nm，所以可以构建包含约10至约100个环的化学合成的桥分子以 跨越约3nm至约30nm的间隙。化学合成的桥分子的末端(例如A1和A2) 可以包含巯基或胺基，或配置成结合电极或触件材料的其他基团。化学合 成的桥分子也可以用适于提供探针分子附连的接头(例如L)构型。根据 本公开的各种实施方式，可以使用由本领域普通技术人员现在已知的或可 以在下文中设计的任何合适的主链部分组成的任何其他化学合成的桥分 子配置。
如本文所用，术语“生物聚合物”可以包括包含至少一个单体单元的任 何分子，所述单体单元可由活生物体产生的，尽管包含生物聚合物或聚合 物本身的实际单体单元不需要由生物体产生并且可以是体外合成。生物聚 合物的例子包括多核苷酸，多肽和多糖，包括其众所周知的形式，如DNA， RNA和蛋白质。包含生物聚合物的桥分子可以包括简单的“卷曲螺旋”配置 的多链聚合物蛋白质(如在胶原蛋白中)或者重链和轻链聚合物蛋白质的更复杂的折叠，例如在免疫球蛋白分子(例如IgG)中。这种包含生物聚 合物的复合体还包括常见的核酸双螺旋，例如DNA双螺旋，其是通过氢 键结合成螺旋双链的两条DNA单链分子，PNA-PNA双链体以及 DNA-RNA，DNA-PNA和DNA-LNA杂交双链体。生物聚合物分子不需 要天然存在或由生物体产生才被分类为生物聚合物。相反，出于本公开的 目的，术语“生物聚合物”可以包括酶促合成以及非酶合成的分子，并且同 样可以包括包含天然存在的单体单元的合成类似物的分子。例如，生物聚 合物可以包含肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)，具有增强的稳定性的 DNA和RNA的合成类似物。另外，生物聚合物可以包含可以加入到分子 中的各种修饰中的任何一种。使用生物聚合物桥分子可以提供各种益处， 包括合成具有用于传感器功能的适合尺寸和化学性的精确控制结构，它们 可以与传感器的靶分子(例如，与相同的液体缓冲介质兼容)天然相容， 生物技术行业已经开发了设计、工程改造和合成这些分子并且经济地制造 它们并具有高质量控制的广泛能力。
桥分子可以被配置为跨越传感器间隙并且以适于在桥分子和电极和/ 或触件之间提供电子通信的方式缀合至传感器间隙的任一侧上的电极和/ 或触件。
在各种实施方式中，桥分子可以包含线性生物聚合物，例如双链DNA 螺旋或α-螺旋多肽。如图3所示，桥分子333包含线性生物聚合物双链 DNA桥分子，其具有耦合至第一触件306的第一端334和耦合至第二触 件307的第二端335。
在各种实施方式中，刚性桥结构可提供在组装传感器复合体期间和之 后采取明确配置的优点。不希望受理论束缚，线性生物聚合物可以包含可 通过其弯曲刚度描述的半柔性聚合物。在短尺度上，线性生物聚合物可能 表现为刚性聚合物，需要强大的力才能弯曲聚合物，而在更长的尺度上， 线性生物聚合物可能更容易弯曲或弯折。线性生物聚合物在一定环境条件 下基本表现为刚性分子的特征弯曲长度量度被称为持续长度。持续长度可 以取决于弯曲力施加在聚合物上的环境条件，其中例如周围环境的温度和 离子条件等的变量影响持续长度。线性生物聚合物例如双链DNA的持续 长度可以基于理论建模估计，或者可以根据经验就对应于预定实验条件的 一组环境条件进行测量，其中可以使用根据各种实施方式的装置。例如， 在可能接近使用根据本公开的各种实施方式的传感器的条件的各种条件 下，已经计算了约30nm至约80nm的双链DNA的持续长度，和约80nm 至约100nm的α-螺旋肽的持续长度。因此，在各种实施方式中，沿着其 长轴测量的具有端到端长度小于上述相应持久长度参数的双链DNA分子 或α-螺旋肽可表现为基本上刚性的聚合物，从而在装置组装和性能方面提 供某些优点或益处。
在各种实施方式中，使用由DNA或氨基酸组成的线性生物聚合物允 许基于生物聚合物的单体组成(即，一级结构)直接构建具有预定长度的 纳米级传感器组件。不希望受理论束缚，使用具有小于持续长度的端到端 长度的线性生物聚合物可以提高根据各种实施方式的生物分子感测装置 的构建期间自组装步骤的效率。使用这种线性生物聚合物提供了将生物聚 合物桥分子的规格保持在其参数中的能力，其中它们的微机械性能比可能 弯曲或折叠的较长的线性生物聚合物更可预测，由此减少例如在桥分子合 成、处理、自组装或传感器操作期间的不希望的随机效应的影响。此外， 线性生物聚合物的使用允许对桥分子长度至传感器间隙(即，电极间隙和 /或触件间隙的尺寸和结构)的精确指定，提供了易于测试理论结构模型和 装置改进的性能的进一步能力和进行渐进式、控制良好和经验可测的修改 的进一步能力。在各种实施方式中，线性生物聚合物桥分子可以被配置为 使第一端处的第一自组装锚和第二端处的第二自组装锚二者与第一触件 和第二触件之一的错配率均降低，这是由于在传感器装置中使用的规模 (例如，约5nm和约30nm之间的端到端长度)下线性生物聚合物桥分子 的本质上刚性的性质。类似地，生物聚合物桥分子可以被配置为提供降低 的单端耦合速率。这可能是由于基本上刚性的桥分子一旦在第一触件处耦合，由于触件的间隔而限制第二端在所需的第二触件点附近花费更多时间， 由此增加了期望的第二耦合反应速率。
如上所述，生物聚合物桥分子可以包含双链DNA分子。在各种实施 方式中，双链DNA可以包含巯基修饰的寡核苷酸，其含有巯基修饰的核 苷酸或碱基。巯基修饰的核苷酸可以包含被配置为结合金纳米珠或类似表 面触件的自组装锚。在各种实施方式中，自组装锚可以包含5'-巯基修饰的 核苷酸，其可以位于寡核苷酸的5'端或附近。双链DNA分子可以包含寡 核苷酸的互补对，每个寡核苷酸包含5'-巯基修饰的核苷酸，使得组装的双 链DNA包含位于双链DNA的两个末端的自组装锚。例如，在各种实施方 式中，双链DNA分子可以包含具有以下序列的寡核苷酸：
5'-/5ThioMC6-D/TGC GTA CGT ATG TCA TGA ATG GCG CAG ACT GAT GTC CTATGA CGT CGC TAC TGC AGT ACT-3'(SEQ ID NO:1)， 和
5'-/5ThioMC6-D/AGT ACT GCA GTA GCG ACG TCA TAG GAC A/iBiodT/C AGT CTGCGC CAT TCA TGA CAT ACG TAC GCA-3'(SEQ ID NO:2)，其中“/5ThioMC6-D/”表示5'-巯基修饰剂，“/iBiodT/”表示内部 生物素修饰的脱氧胸苷核苷酸(集成DNA科技公司，爱荷华州科拉尔维 尔市)。当彼此退火时，这些寡核苷酸提供的双链DNA分子具有位于分 子两端的5'-巯基修饰的核苷酸作为第一和第二自组装锚。
双链DNA分子桥还可以进一步包含生物素接头组分以促进探针分子 与互补性亲和素型接头组分连接。在不同的实施方式中，如上述反向寡核 苷酸序列所示，可以将生物素修饰的寡核苷酸掺入双链DNA分子桥的寡 核苷酸之一中。在各种实施方式中，生物素修饰的寡核苷酸是内部修饰， 例如通过经修饰的胸苷残基(生物素-dT)。可以使用各种生物素修饰配 置，包括通过C6间隔物附连胸苷，通过三甘醇间隔物附连，通过光裂解 间隔臂附连，双生物素修饰，脱硫生物素修饰和生物素叠氮化物修饰。本 领域技术人员现在已知的或可以在下文中设计并且可以对寡核苷酸进行 以促进与探针分子的连接的其他修饰在本公开的范围内。类似地，具有蛋 白质结合伴侣的其他常见小分子如地高辛可以起到与生物素相似的作用， 用于在桥分子中精确原子指定的点处与探针分子缀合的目的。
在各种实施方式中，肽生物聚合物桥分子可以包含适合于提供各种期 望的桥分子结构和性能特征(包括电极或触件结合特征，结构特征，电性 能特征等)的各种构型和/或特征。例如，肽生物聚合物桥可以在氨基端和 羧基端之一或两者处包含L-半胱氨酸残基而用作自组装锚，通过巯基-金 属结合至参与强巯基结合的特定金属触件，如金，钯或铂。在其他实施方 式中，生物聚合物桥分子可包含具有选择性和强结合金触件的已知能力的肽，用于自组装和电-机械连接到电路中。具体的这种肽包括具有以下氨基 酸序列的那些：MHGKTQATSGTIQS(SEQ ID NO:3)，VSGSSPDS(SEQ ID NO:4)，和LKAHLPPSRLPS(SEQ ID NO:5)。针对这种性质选择的其他肽 可以类似地结合其他特定的金属或材料触件。例如，VPSSGPQDTRTT (SEQ ID NO：6)是已知的铝结合肽，并且MSPHPHPRHHHT(SEQ ID NO： 7)是已知的二氧化硅结合肽。在各种其他实施方式中，生物聚合物桥分 子可以包含肽序列，其包括选自以下氨基酸序列基序之一的一个或多个氨 基酸基序的重复，下述氨基酸序列基序已知有利于形成稳定的α-螺旋构象， 提供线性、刚性导电桥：EAAAR(SEQ ID NO:8)，EAAAK(SEQ ID NO:9)， EEEERRRR(SEQ ID NO:10)，和EEEEKKKK(SEQ ID NO:11)。这样的 肽生物聚合物桥分子还可以包含由具有共价附连的生物素的赖氨酸残基 组成的修饰氨基酸，以在精确原子限定的位置处为向探针分子复合体的基 于亲和素的缀合提供缀合点。修饰的赖氨酸可以代替这种肽序列基序中的 标准赖氨酸或精氨酸残基，以另外保持或最小程度地改变α-螺旋的性质。
在各种实施方式中，生物聚合物桥分子可具有其他配置。例如并且如 图4所示，生物聚合物桥分子433可包含弯曲、折叠或包含一定程度的二 级结构的线性生物分子。在各种实施方式中，生物聚合物桥分子可以进一 步包含具有三级和/或四级结构的分子，包括球形蛋白质，抗体和多亚基蛋 白质复合体。图5显示一个示例，其中生物聚合物桥分子533包含免疫球 蛋白G蛋白(IgG)。在所示实施方式中，电触件(506，507)是金纳米 颗粒，并且IgG已经以特定亲和力建立以结合这些颗粒。
类似于传感器301，图4和图5所示构型各自包含经由接头(分别为 437和537)耦合至生物聚合物桥分子的探针(分别为436和536)。所示 实施方式旨在举例说明可耦合至包含不同材料和配置的电极或触件的可 能的生物聚合物桥分子配置的范围，在不同结构配置中包含不同金属或非 金属导电或半导体触件。在各种实施方式中，可进一步涂覆、处理或衍生 电极或触件以使用产品(例如InnovaCoat GOLD纳米颗粒(Innova生物科 学公司)的产品)促进桥组装和/或附连。
根据各种实施方式的探针可以包含任何合适的分子或多组分分子复 合体。可以基于待由传感器检测的分子或待监测的生物化学反应来选择探 针。探针的各种示例包括肽，蛋白质，酶，核酸，核酶，催化DNA等。 在各种实施方式中，酶可以包含溶菌酶，激酶或聚合酶。根据本公开的各 种实施方式，响应于底物或靶分子的结合或加工而呈现物理，化学或电子 配置的特定变化的任何分子或复合体可用作探针。
在各种实施方式中，探针可包含适合于与单个DNA或RNA靶分子相 互作用的酶，例如聚合酶或逆转录酶。催化核苷酸碱基模板依赖性掺入生 长的寡核苷酸链中的酶响应顺序遇到模板链核酸碱基和/或掺入模板特异 性天然或类似碱基(即掺入事件)而发生构象变化。这种构象变化可以调 节通过与探针耦合的桥分子的电流，从而以取决于模板分子的方式提供序 列特异性信号模式。如上所述，信号模式可以由信号处理系统检测并翻译 为序列数据输出。此外，靶核酸序列中修饰的核苷酸的存在可以在信号模 式中产生独特的构象变化和相应的信号特征，其可以使传感器装置和信号 处理系统能够逐个碱基地直接确定例如靶序列中碱基的甲基化。这种无标 记的直接测序方法可以允许使用包含对应于DNA的全部四个碱基的天然 和/或类似碱基的混合物的核苷酸碱基混合物在测序反应中区分核苷酸特 异性掺入事件，尽管也可以使用包括顺序地以串行和/或循环方式提供单独 的天然或类似碱基的测序过程。使用逆转录酶作为探针分子可以类似地实 现RNA分子的直接测序，而不需要中间cDNA转化步骤。
在各种实施方式中并且如上简述，探针可以通过自组装接头附连到桥 分子。自组装接头可以包含适合于将第一生物分子附连于第二生物分子的 多种结构中的任何一种。在各种实施方式中，自组装接头可以包括第一接 头组分和与第一接头组分互补的第二接头组分。第一接头组分和第二接头 组分可以通过自组装连接以基于第一接头组分对第二接头组分的亲和性 形成组装接头。第一接头组分可以例如与桥分子关联，并且第二接头组分 可以与探针关联。可以将与桥分子相关联的接头组分设计成桥分子中的特 定位点，使得探针与桥的自组装在桥分子上的预定位置处产生探针与桥分 子的耦合。选择用于与探针关联的接头组分可以被配置成使探针和靶之间 的干扰最小化，涉及接头组分的大小和它与探针缀合的位置两方面。以这 种方式，连接互补的第一和第二接头组分可以提供探针与桥分子的功能性 附连。自组装接头可以包含生物素-亲和素耦合机制，具有亲和素(或其他 亲和素样)蛋白质第一接头组分和生物素小分子第二接头组分，这些组分 彼此形成强的非共价键。其他亲和素样蛋白包括链霉亲和素，根霉亲和素 (rhizavidin)，慢根霉亲和素(bradavidin)，中和亲和素(NeutrAvidin)， 其他各种氨基酸修饰形式的亲和素或链霉亲和素，以及保留生物素结合功 能的这种亲和素的二价或单体衍生物。在各种实施方式中，例如，生物素 可以缀合至桥分子并且链霉亲和素缀合至探针分子。自组装接头还可以包 含用于生物缀合的众所周知的点击化学摂机制。自组装接头还可以包含抗 原-抗体耦合(例如与缀合至探针分子的抗体缀合的桥分子上存在的抗原)。 自组装接头还可以包含例如SpyCatcher肽第一接头组分和SpyTag肽第二 接头组分，其中两个组分结合形成不可逆的共价键。本领域普通技术人员 现在已知或可能在下文中设计的任何配置中的任何其他自组装接头系可 用于将探针耦合至桥分子。
在各种实施方式中，传感器不需要包含不同于桥分子的探针分子。相 反，桥分子本身可以被配置成被靶分子作用。例如，桥可以包含蛋白质结 合位点，如激酶结合位点，并且可用于基于靶蛋白与桥的结合和/或靶蛋白 对桥的修饰来检测样品中相应蛋白质的存在和/或活性。
现在参考图6A和图6B，显示了具有和不具有传感器外壳的部分制造 的传感器装置600的透视图。传感器装置600是包括掩埋栅极640的三末 端传感器装置。图6A中所示的装置600包括传感器装置的各种特征，所 述传感器装置可以使用CMOS制造技术制造，例如位于基材641和氧化物 642下方的栅极640，以及由电极间隙630分开的第一电极602和第二电 极603，并且每个电极具有附连的触件606/607。上述各种传感器复合体组 分(包括桥分子和探针)的附连可以在下游自组装步骤中进行。在各种实 施方式中并且如图6B所示，传感器装置600可首先配置有外壳643，外 壳643配置成围绕传感器间隙630围住或形成流动单元，之后通过使传感 器与包含桥和/或探针分子的溶液接触完成传感器的组装。同样，外壳643 也可以用于进行测定，例如测序反应。外壳643可以单独形成并附连到包 括装置600的结构。
生物分子检测和核酸碱基区分
在各种实施方式中，提供了用于检测例如装置100(图1)的单分子 感测装置的动态性(dynamics)和动力学(kinetics)的方法。用于测量包 含桥分子的传感器101的电导变化的任何方法可用于监测本文所述的传感 器装置。在各种实施方式中，可以将小于约10V的电压施加到包含生物分 子桥分子的传感器，并且在下面更详细描述的各种实施方式中，施加约 0.5V的电压。可以使用集成电路120测量流过传感器的电流作为时间的函 数。通过传感器复合体105中的探针的靶标结合和/或加工事件(即，在酶 促探针的情况下的酶活性)可以产生传感器101的电导率的变化，调制测 量的电流以产生随时间t的信号模式122，包括信号特征123。包括结构、 化学和电子变化(即酶，底物和周围溶液中的电荷分布)的相关的构象变 化和这种事件可以包括靶标结合和加工的动力学特征，其中产生电流波动 的各种事件包括可以使用本领域已知的信号处理技术来测量、记录、鉴别、 分析或存储的信号特征123。信号特征可以包括一系列可能形式中的任何 形式，包括具有三角形、正弦形状或具有任何数量的傅立叶分量的小波。 例如，在传感器中用作探针的聚合酶可为与模板碱基(即靶分子特征)和 /或模板依赖性核苷酸掺入(即聚合酶动力学特征是模板碱基依赖性的)的 每个离散相互作用提供聚合酶动力学特征，其中核酸模板靶标包含靶分子 中离散位置处的靶分子特征序列(即，第一，第二和第n靶分子位置处的 第一，第二和第n靶分子特征)，每个靶分子特征在根据本公开的传感器 的检测期间产生对应的信号特征。n个靶分子特征可以对应于单链DNA 模板分子(即，靶标)的n个连续碱基，其通过聚合酶加工以顺序地在这 n个靶分子特征处掺入互补核苷酸。包括一系列信号特征的信号模式的幅 度、持续时间和形状可以编码靶特异性传感器响应，其可以使用信号处理 系统121分析以将信号模式与信号解释图进行比较以确定靶标。增加信号 检测和分析的时间分辨率可以提供进一步解析探针-靶标相互作用的动力 学可变性、转变和中间状态的能力。
由于核苷酸掺入的保真度对于准确的核酸测序是极为重要的，因此在 各种实施方式中，测序方法可依赖于增加基于模板的核苷酸掺入的构象变 化的类似物碱基，由此产生更清楚的信号，和/或以其他方式提供区分类似 物碱基掺入的增强能力，从而提供了提高的测序准确度。可以用于增强模 板依赖性核苷酸掺入的动力学或动态学区分的非标记类似物碱基是众所 周知的，并且可以包括核苷酸的脱氧核糖或核糖和磷酸部分以及嘌呤和嘧 啶碱基的修饰。具体而言，这可以包括向核苷酸的γ-磷酸酯添加额外的基 团，其接受在掺入期间切割掉的大量且多样化的分子修饰，因此不会永久 影响生长链及其与聚合酶的相互作用。
在各种实施方式中，方法可以提供核酸模板序列中未修饰和修饰的核 苷酸碱基的检测。例如，方法可能适用于区分修饰的模板核苷酸，包括 N6-甲基腺苷，N4-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，5-甲酰基 胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶碱基，以及受损的模板序列位置，如无碱基位点。 不希望受理论束缚，在测序反应期间将核苷酸催化掺入互补核酸链的DNA 聚合酶可以以取决于模板链中核苷酸的种类的方式显示差异性聚合酶动 力学。使用根据本公开的装置和方法，基于检测到对应于掺入事件的电子 特征，可以近实时地确定核酸模板中的核苷酸碱基的种类。与依赖于检测 与荧光团标记的核苷酸掺入相关的荧光信号的其他系统和方法不同，不需 要基于荧光的检测试剂和信号检测装置，从而降低了该方法的成本和复杂 性。
在各种实施方式中，方法可以包括从信号迹线去除噪音。去除噪音可 以包括进行信号处理，例如去除60Hz线路噪音。去除信号迹线中的噪音 可以减少信号迹线解释的误差。在图7中显示了从信号中去除60Hz线路 噪声之前(上信号迹线)和之后(下信号迹线)，通过对12碱基核酸模 板测序产生的信号迹线的示例。取决于这种噪音的特性，可以使用各种噪 音去除方法，并且这些方法对于信号处理领域的技术人员是众所周知的。
在各种实施方式中，确定与传感器结合的靶标的序列的信号处理可以 包括对靶标的种类的概率确定，而不是对序列的精确确定。靶分子的实际 序列可以是许多可能的独特序列之一，每个可能的独特序列具有独特的理 论信号。确定靶分子的序列可能需要将实验测量的信号与包括独特理论信 号数据库的信号解读图进行比较。可基于下述方法来生成信号解译图：使 用已知靶标序列产生的训练数据集或库，基于正和负控制测量的信号处理 以减少例如噪音、模糊、漂移等的信号伪像，以及应用机器学习和/或统计 方法，如神经网络、聚类、曲线拟合、模型拟合、贝叶斯推断等。
传感器装置的制造和组装
在本公开的各种实施方式中，提供了生产如本文所述的分子生物传感 器装置的方法。生产分子生物传感器装置的方法可以包括CMOS制造工艺 和分子生物学方法的组合。CMOS制造工艺可以包括本领域公知的高分辨 率光学光刻方法，并且适合于商业规模生产集成电路，包括例如FET的装 置。在各种实施方式中，可以使用CMOS制造工艺来产生包括个体传感器 的集成电路，所述个体传感器具有沉积在半导体基材上的第一电极和第二 电极，其中第一电极和第二电极由精确限定的传感器间隙分开。在一个优 选实施方式中，将选择纳米电极、间隙和触件设计以便完全在CMOS工艺 内制造。特别地，如果为这些元件选择了特定简单的几何形状，则可以使 用高分辨率光学光刻方法制作它们，例如极紫外(EUV)和深紫外(DUV) 光源，结合相移掩模，多重图案化以及用于实现最高分辨率CMOS制造节 点的其他技术，包括当前和未来的16nm节点，14nm节点，10nm节点， 7nm节点和5nm节点，如通过特定制造设备所呈现，例如主要铸造公司(如 TSMC或格罗方德公司(GlobalFoundries))的那些设备所呈现。这些过 程具有独特的高分辨率，可用于制作某些特定的图案特征，例如直线段， 直线切割和圆形点。在纳米电极，纳米触件和/或间隙几何形状的设计中使 用这些工艺特定的几何元件可以便于根据相关CMOS工艺中的各种实施方式制造传感器装置。然而，通常所采用的制造技术还可以包括例如电子 束光刻，纳米压印光刻之类的非CMOS工艺方法，或者例如聚焦离子束铣 削和等离子蚀刻之类的铣削和蚀刻技术。分子生物学制造方法可以包括在 对原子构型进行精确控制的情况下合成期望的桥分子，并且在适合允许生 物分子与上游CMOS或其他制造方法过程中产生的电子传感器组件(和/ 或与其他生物分子)在特别设计的自组装反应过程中相互作用和耦合的条 件下，递送液相中的这些生物分子溶液。
在各种实施方式中，本文描述的制造传感器装置的方法可以包括以下 步骤：制造集成电路微芯片，制造传感器电极和/或触件，合成桥生物分子， 将桥生物分子组装到电极和/或触件，将探针耦合至桥生物分子，并将传感 器装置封装在流动池中。在各种实施方式中，传感器可以包括双末端电路， 或者传感器可以包括具有栅极的三末端电路。在各种实施方式中，栅极可 以具有掩埋栅极配置；然而，也可以使用横向栅极和其他栅极配置，包括finFET结构。
在各种实施方式中，电极、触件和/或栅极可以由导电金属材料构成。 例如，电极，触件和/或栅极可以包括铝，钛，铬，铜，金，钯，铂等。在 各种实施方式中，电极，触件和/或栅极可以包括半导体材料，包括可用于 制造n型和p型半导体电极的掺杂半导体材料。在各种实施方式中，电极 和附连到电极的触件可以包括相同的材料，并且在各种其他实施方式中， 触件可以包括与其所附连的电极不同的材料。
在各种实施方式中，电极可具有任何合适的结构配置。例如，电极可 以包括大致矩形的横截面，尽管其他几何和不规则的横截面轮廓也是可能 的并且在本公开的范围内。在各种实施方式中，电极可以具有小于约30nm， 或小于约25nm，或小于约20nm，或小于约15nm，或小于约14nm，或小 于约13nm，或小于约12nm，或小于约11nm，或小于约10nm，或小于约 9nm，或小于约8nm，或小于约7nm，或小于约6nm，或小于约5nm，或 小于约4nm，或小于约3nm的最大横截面尺寸(即，电极的电极横截面中 的最大尺寸)。
类似地，在各种实施方式中，触件可以具有任何合适的结构配置。例 如，触件可以包括大致半球形或半球形的横截面轮廓，但是其他几何和不 规则的横截面轮廓也是可能的并且在本公开的范围内。在各种实施方式中， 触件可以具有小于约20nm，或小于约15nm，或小于约14nm，或小于约 13nm，或小于约12nm，或小于约11nm，或小于约10nm，或小于约9nm， 或小于约8nm，或小于约7nm，或小于约6nm，或小于约5nm，或小于约 4nm，或小于约3nm的最大横截面尺寸(即，触件的触件横截面中的最大 尺寸)。
在各种实施方式中，第一电极和第二电极可以被交替地称为源极和/ 或漏极，并且在各种实施方式中，源极和/或漏极可以包括与电极不同的结 构部件。
制造方法可以包括使用光刻方法来限定基材表面上的第一电极位置 和第二电极位置。第一电极位置和第二电极位置可被限定为在完成电极制 造时在它们之间产生精确限定的电极间隙。类似地，在各种实施方式中， 制造方法可以包括使用光刻方法来限定第一触件位置和第二触件位置。第 一触件位置和第二触件位置可被限定为在完成触件制造时在它们之间产 生精确限定的触件间隙。同样，可以使用限定的结构来配置触件。下面将更详细地描述可用于制造生物传感器的各种方法。
现在参考图8，显示了用于制造电极的光刻方法800。在各种实施方 式中，制造方法可以开始于微芯片基材(例如硅基材880)，其覆盖有氧 化硅层881，抗蚀剂层882。抗蚀剂层可以包含任何合适的抗蚀剂材料， 例如聚(甲基丙烯酸甲酯)。根据本公开，粘合促进剂也可以用于制造过 程中。在所示实施方式中，使用电子束光刻来曝光抗蚀剂层并且在抗蚀剂 层中限定第一电极轨道883和第二电极轨道884(步骤810)。在光刻步 骤之后，显影该抗蚀剂(步骤820)以去除光刻步骤中限定的区域中的抗 蚀剂。接下来，可进行沉积步骤(步骤830)以在基材表面上形成第一电 极802和第二电极803。可以使用任何合适的材料和沉积方法，包括例如 金属溅射涂覆。类似地，可以在进行沉积步骤之前进行任何合适的基材表面处理，例如施加中间附连层以在电极和基材之间提供适当的结合。在各 种实施方式中，第一和第二电极使用溅射沉积方法由金制成。在沉积步骤 之后，进行剥离步骤(步骤840)以去除剩余的抗蚀剂，从而将第一电极 和第二电极设置在基材的表面上。
在各种实施方式中，用于制造纳米电极的光刻方法例如方法800可实 现高度精确的电极配置。例如，可以将电极配置为具有一致的长度，宽度 和厚度规格。在各种实施方式中，电极可具有约10nm至约40nm的宽度， 例如约20nm的宽度。类似地，由第一电极和第二电极限定的电极间隙可 以被配置为具有精确的电极间隙尺寸。在各种实施方式中，电极间隙尺寸 可以在约3nm与约30nm之间。例如，根据各种实施方式的传感器中的一 对电极的电极间隙可以为约3nm至约30nm，或约4nm至约25nm，或约 5nm至约20nm，或在约6nm至约17nm，或约7nm至约15nm。在各种实 施方式中，可以制造具有约3nm，约4nm，约5nm，约6nm，约7nm，约8nm，约9nm，约10nm，约11nm，约12nm，约13nm，约14nm或约15nm 的尺寸的电极间隙。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，上述各 种方法步骤可以用于，使用CMOS制造和/或其他微电子制造方法，以适 于传感器装置的商业规模生产的过程，以高密度并行生产具有高度精确的 物理规格的多对电极。
不希望受理论束缚，提供具有如上所述的具有电极间隙尺寸的电极间 隙(或传感器间隙)的传感器可以提供关于传感器性能和/或制造的各种优 点。例如，对于尺寸低于约3nm的电极间隙，通过溶液(即样品环境)的 电流传导的伪源和体积将开始增加，产生增加的噪音。另外，这种间隙可 能不够大以容纳各种感兴趣的探针分子，例如酶。此外，这种间隙与当前 的CMOS制造能力不兼容。对于大于约30nm的电极间隙，以原子上精确 规格的制造桥分子(例如通过使用生物聚合物或化学合成的分子)的成本 和复杂性显着提高，并且各种桥分子的刚性随着长度超过约30nm而降低。 同样，超过这些长度时许多分子的电导率大大低于有用参数，并且更大的 长度也限制了在高密度阵列中紧密包装传感器的能力。因此，具有约3nm 至30nm范围内的电极间隙的传感器可以在传感器装置的功能、可制造性、可扩展性和经济性方面提供某些优点。
根据上述方法制造的传感器装置的示例在图11A-11C中显示，分别显 示了37倍、5000倍和50000倍放大倍数的传感器装置1000的表面扫描电 子显微照片。传感器装置1000包括用于20个传感器的纳米电极和纳米触 件，以及用于连接到外部电流计的引线和垫。位于基材表面上的垫和引线 在图11A中清晰可见。传感器电极表现为图11B中心的较亮的垂直带。 在图11C中，可以清楚地看到第一电极1102和第二电极1103以及限定在 第一和第二电极之间的电极间隙1120。
在各种实施方式中并且现在参考图9，制造生物分子感测装置的方法 可以包括用于制造和/或确定触件位置的光刻方法900。在各种实施方式中， 制造方法可以开始于微芯片，该微芯片包括其上设置有第一电极802和第 二电极803的基材。微芯片可以包括覆盖有氧化硅层881和合适的抗蚀剂 层982的硅基材880。在所示实施方式中，使用电子束光刻来曝光抗蚀剂 层并且在抗蚀剂层中限定第一触件位置985和第二触件位置986(步骤 910)。在各种实施方式中，触件位置可被限定为覆盖第一电极和第二电 极中的一个，例如邻近电极间隙的电极远端附近。如下所述，限定触件的 尺寸和模式可以有助于确定在稍后的工艺步骤中形成的触件的尺寸和形 状。在光刻步骤之后，显影该抗蚀剂(步骤920)以去除光刻步骤中限定 的触件位置中的抗蚀剂。接下来，可进行沉积步骤(步骤930)以在第一 和第二电极表面上形成第一触件906和第二触件907。至于电极，可以使 用任何合适的材料和沉积方法。类似地，可以在进行沉积步骤之前进行任 何合适的基材表面处理，例如施加中间附连层以在电极和基材之间提供适 当的结合。触件可以包括与电极不同的材料，或者触件可以包括用于制造 电极的相同材料。在各种实施方式中，第一和第二触件使用电化学沉积方法由金制成。在沉积步骤之后，进行剥离步骤(步骤940)以去除剩余的 抗蚀剂，留下设置在第一和第二电极的表面上的第一触件和第二触件。
可选地，在各种实施方式中，用于制造触件的方法可以包括预制的触 件纳米颗粒的沉积。预制的触件纳米颗粒可以沉积到形成在抗蚀剂层中的 空隙中并且被配置为接收触件纳米颗粒并将其定位在触件位置处，或者可 以使用化学衍生层沉积触件纳米颗粒以实现在触件位置处的附连。
如图10所示，将预制的触件颗粒沉积到在抗蚀剂层中形成的空隙中 的方法1000可以包括关于步骤910和920的上述方法900的相同步骤。 在产生被配置为接收预制的触件颗粒的空隙之后，包含多个预制的触件颗 粒1087的溶液可以与装置接触(步骤1030)，并且使用压力、混合、表 面张力、浮力、离心力或其他方法将颗粒引入空隙。在沉积颗粒之后，可以去除过量的溶液和颗粒。可以进行如上文关于步骤940所述的剥离步骤 以去除剩余的抗蚀剂，并且预制的触件颗粒可以随后在必要时任选退火至 电极，以形成牢固附连的第一和第二触件(1006,1007)。
或者，使用化学衍生化处理来沉积预制的触件纳米颗粒的方法可以包 括与上文关于图9中所示的方法所描述的步骤910和920相似的步骤。例 如，一种与硅基材表面相容的广泛使用的表面衍生化是硅烷化，其可以包 括用分子如氨基硅烷(例如APTES)或巯基硅烷(例如MPTES)涂覆基 材表面。这些分子粘附在硅表面上，然后它们的暴露端容易交联到其他材 料如金纳米颗粒上，从而将它们结合到表面上。然后，在类似于步骤930 的步骤中，可以应用这种衍生化处理而不是沉积触件金属或其他材料。在 进行类似于步骤940的剥离步骤之后，第一电极和第二电极将在旨在附连 第一触件和第二触件的位置处包括表面衍生化。包含衍生化电极表面的装 置可以与包含多个预制触件颗粒的溶液接触。颗粒可具有与衍生的电极表 面互补或与其特异性结合的表面或涂层，从而将触件颗粒定位到限定的触 件位置。根据需要，可以在去除步骤中去除衍生化处理和任何颗粒涂层， 并且如上所述将预制的触件颗粒退火至电极。这种方法的一个例子是使用 APTES涂覆的硅表面特异性结合金纳米颗粒。
在各种实施方式中，可通过各种直接手段产生触件结构，例如通过使 用原子力显微镜(AFM)将金纳米颗粒珠定位在电极上，或通过沉积过量 珠，随后通过AFM去除不需要的珠。
在各种其他实施方式中，可通过例如使用聚焦离子束(FIB)铣削移 除材料来原位形成触件结构和/或电极间隙。例如，可以使用FIB将电极间 隙刻入先前建立的连续金属纳米线中，由此在形成电极间隙的同时形成第 一电极和第二电极。
在制造传感器或传感器阵列的电极和触件之后，可以将传感器封装在 适于允许将液体溶液可控地引入传感器的流动池或类似装置中。将传感器 芯片封装在流动池中通常通过用PDMS或其他聚合物或塑料来模制流动 池并使用其包围芯片，将制造的电极和触件适当暴露以用于桥和探针组装 以及随后的使用完整传感器的测定。在各种实施方式中，表面钝化处理可 以施加到基材表面和暴露电极的部分以减少可能由于与液体样品接触而发生的电噪音。可以应用钝化处理以使电极和/或触件在传感器间隙的区域 中未被处理。例如，在各种实施方式中，与传感器间隙对齐的30nm宽的 区域可以不被处理。钝化处理可以在用流动池封装传感器芯片之前进行。 当施加约0.5V的电压并且将传感器浸入适用于支持酶(例如DNA聚合酶 I酶)活性的低离子强度缓冲溶液中时，根据各种实施方式的传感器可具 有小于约1pA，或小于约0.9pA，或小于约0.8pA，或小于约0.7pA，或小 于约0.6pA，或小于约0.5pA，或者小于约0.4pA，或者小于约0.3pA，或 者小于约0.2pA的电子噪音。
生物聚合物桥的制造可以通过可用于合成生物聚合物分子的各种方 法中的任一种来进行，包括体内合成方法，体外酶促合成方法，化学合成 方法或其任何组合。本领域普通技术人员熟知用于产生适合用作根据本公 开的桥分子的生物聚合物分子的各种方法。同样，用于衍生或修饰生物聚 合物桥分子以提供如本文所述的锚或接头组分的方法同样是众所周知的。 本文所述的各种特定的生物聚合物桥分子通过举例的方式提供，且不应被解释为限制本公开的范围，并且可根据本公开的各种实施方式使用合成的 桥分子。
在各种实施方式中，生物聚合物桥分子与探针的附连可以通过自组装 化学反应来进行。同样，生物聚合物桥分子与电极或触件的附连也可以通 过自组装化学反应来进行。这种自组装反应可以通过使要附连的两个组分 经由包含至少一种组分的溶液而彼此接触来进行。在各种实施方式中，生 物聚合物桥与探针的附连可以在桥附连至电极或触件之前、之后或同时进 行。类似的考虑适用于由合成化学产生的桥分子。
在各种实施方式中，制造传感器装置的方法包括将生物聚合物桥分子 组装到第一电极和第二电极。桥分子组装步骤可以包括自组装步骤。可以 通过使包含第一和第二电极的部分构建的传感器装置与包含桥分子的溶 液接触来进行自组装。基于桥分子的第一端和第二端与第一电极和第二电 极之间的亲和力，桥分子可以自组装到第一电极和第二电极。在各种实施 方式中，传感器组分的自组装可以通过传感器装置电子监控，如以下在实 施例2中以及参照图13-15所述。电子监控可以提供质量控制功能，并用 于识别正确组装的设备中的传感器。未提供在预定参数内的组装过程信号 的传感器电路的信号可以在使用该装置进行下游分析(例如测序分析)中 弃去。
实施例1
生物聚合物桥自组装
使用包含5'-巯基修饰的SEQ ID NO：1所示的寡核苷酸和包含5'-巯 基修饰和内部生物素修饰的SEQ ID NO：2所示的寡核苷酸构建端到端长 度约20nm的双链DNA生物聚合物桥分子。使用链霉亲和素-金标签将桥 分子标记用于可视化目的。使用电子束光刻技术制造金纳米颗粒触件的测 试阵列1200(图12)以沉积成对的金触件，每对触件限定约20nm的中心 到中心的触件间隙。将包含金标记的桥分子的缓冲溶液与金纳米颗粒触件 的测试阵列接触。在短暂的孵育期后，除去过量的溶液，洗涤阵列并通过 扫描电子显微镜(SEM)成像。图12显示了显示金触件1270和金标签1271 的排列的SEM图像。对于几个触件对(用箭头表示)，可以看到布置在 触件对之间的金标签1271，表明生物分子桥分子成功地自组装至触件对。
实施例2
检测自组装步骤
使用电子束光刻技术制造具有单个传感器的传感器装置，该传感器包 括附连到电极的金触件，具有约20nm的中心到中心的触件间隙。该传感 器用PDMS流动池封装，该流动池包括1mm宽×0.4mm高的通道，该通道 任一端打开以允许将液体引入流动池内部的第一端，并将液体从流动池的 第二端排出，以及池接触传感器的溶液。流动池通道的方向与包含传感器 的电极方向正交，传感器位于流动池通道长度的大约中间。将低离子强度 缓冲溶液引入流动池中，并且在随后的下述整个连续步骤中将0.5V电势 施加至传感器：双链DNA桥分子的引入和自组装(如上文实施例1所述， 但是没有金标签)(图13)，链霉亲和素标记的Klenow片段的引入和结 合(图14)，50个碱基引发的单链DNA分子的引入和结合(图15)， 和dNTP混合物的引入以通过Klenow片段启动基于模板的合成(图16)。 DNA模板分子的序列包括以聚A区域为特征的下列寡核苷酸序列：
5’-cgc cgc gga gcc aag aaa aaa aaa aaa aaa aaa aa ttgcatgtcctgtga-3’
并且所用的引物是：
3’-aac gta cag gac act-5’
另外，使用聚C，G和T区代替聚A区的相似序列用于研究不同模板 碱基的作用。
如图13所示，测得的电流在三秒的期间上升。信号迹线中的两个拐 点(A和B)被认为对应于5'-巯基修饰的端碱基锚与第一和第二触件的结 合。引入包含链霉亲和素标记的Klenow片段的溶液后的信号迹线(图14) 显示在约1.5秒处电流的急剧增加，其可能对应于接触并结合生物聚合物 桥的生物素接头组分的Klenow片段酶的链霉亲和素接头组分。在图15中， 在将模板链引入流动池之后的信号迹线中存在尖锐的信号峰，该峰被解释 为对应于Klenow片段的模板结合。图16显示在引入包含全部用于DNA 碱基的dNTP混合物之后测量的信号迹线，在大约1秒处同样表现出明显 的信号特征。这可能表示合成的双链体从聚合酶解离，并且约0.7秒至约 0.95秒的信号迹线可对应于由传感器产生的响应于基于结合模板DNA的 核苷酸掺入的动力学特征。
实施例3
核苷酸碱基掺入的检测
包含生物聚合物桥分子和Klenow片段探针的传感器装置如上述实施 例2中所述制造和组装。响应于使用不同长度和序列组成的单链DNA模 板进行的DNA合成反应，使用传感器装置产生信号迹线。图17显示了用 于提供掺入单个碱基的模板序列的信号迹线。0.5秒处的信号特征被解释 为对应于Klenow片段的模板依赖性活性和碱基掺入，并且在0.6秒之后 的弱得多的信号特征被解释为对应于系统中的某种形式的噪音或伪信号。 图18显示了各种模板区的信号迹线。上述实施例2中所述的模板和引物 用于所示的反应。
顶部和底部信号迹线是对照实验，其中不含dNTP的缓冲液被引入传 感器。响应于下述步骤产生第二，第三和第四信号迹线(从顶部到底部)： 向溶液中引入dTTP(预期导致由模板的20个A碱基引导的20个掺入事 件)，随后添加dCTP(预期允许由GAA三联体以3'至5'在模板中引导另 外3个掺入)，然后添加dNTP(预期如模板的剩余12个碱基所引导而聚合)，从而产生的信号来自20、3、和12个掺入事件。包含位于每个信号 迹线的箭头之间的信号特征的信号迹线被解释为对应于由模板依赖性酶 活性引起的信号调制。这些扰动的信号区域的相对持续时间在20：3：12 的预期比例中，并且第三个这样的迹线显示可以对应于12个离散的掺入 事件的清晰尖峰。图7显示了通过使用上述装置和具有12个未配对模板碱基的上述模板进行的DNA合成反应产生的信号迹线的其他示例。这些 结果表明根据各种实施方式的传感器可以产生包含响应于模板依赖性 DNA聚合酶探针活性的信号特征的信号迹线。这也证明了在澄清信号中 去除噪音的价值：图7的上图是原始测量信号，下图已经过信号处理以去 除噪音，在这种情况下，通过带通滤波器消除了特定的60Hz线路噪音。
实施例4
甲基化模板碱基的检测
包含生物聚合物桥分子和Klenow片段探针的传感器装置如上述实施 例2中所述制造和组装。响应于使用包含胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶修饰的核 苷酸的单链DNA模板进行的DNA合成，使用传感器装置产生信号迹线。 模板序列包括具有序列5’-13x(N)-5x(GmC)-5x(GC)-G-3’(即5’-NNN NNN NNN NNN NGmC GmCG mCGmC GmCG CGC GCG CGC G-3’(SEQ IDNO:12)，其中N是任何标准核苷酸，并且其中mC是5-甲基胞嘧啶)的 未配对碱基核苷酸。设计该模板序列以产生具有序列 5’-C-5x(GC)-5x(GC)-13x(N)-3’(即5’-CGC GCG CGC GCGCGC GCG CGC NNN NNN NNN NNN N-3’(SEQ ID NO:13))的互补合成链，其中加下划线 的鸟苷碱基对应于模板链中5-甲基胞嘧啶修饰的核苷酸的位置。向传感器 施加0.5V电压，并且在连续引入下述和用其孵育的过程中全程测量电流： 水，缓冲液，dCTP缓冲溶液，dGTP缓冲溶液以及具有所有四种dNTP碱 基的混合物的缓冲溶液。预期结果将是单个dCTP掺入事件，然后是20 个dGTP和dCTP掺入事件，其中前10个针对未修饰的胞嘧啶碱基，而后 10个针对5-甲基胞嘧啶修饰的核苷酸。在这20个事件中的第二个10个事 件中，甲基化的检测将显示为信号的不同特征。
在与每种试剂孵育期间产生的信号迹线在图19中显示。用水和缓冲 液孵育产生非常低的基线电流，几乎没有变化。添加包含dCTP的溶液产 生对应于针对模板前导碱基G的dCTP的单个碱基掺入的尖锐序列特征。 添加dGTP，产生包含dCTP和dGTP二者的溶液，允许通过对应于未修饰 的核苷酸的10个碱基掺入进行合成随后通过对应于模板链中的5-甲基胞 嘧啶碱基的10碱基掺入进行合成。在该孵育期产生的信号迹线显示具有 从约0.35秒到约0.5秒的较高电流的信号特征，随后是具有从约0.5秒到 约0.65秒的较低电流的信号特征。响应于模板序列的甲基化状态对聚合酶 和所得信号调制的影响，信号幅度的这种变化被解释为传感器信号的明显 变化。该证据支持根据本公开的各种实施方式的传感器直接区分测序反应 过程中靶序列中存在修饰的核苷酸的能力。
实施例5
检测长DNA链读数上的信号
包含生物聚合物桥分子和Klenow片段探针的传感器装置如上述实施 例2中所述制造和组装。响应于使用包含衍生自phi X 174噬菌体的基因 组的大约5400bp模板序列的单链DNA模板进行的DNA合成，使用传感 器装置产生信号迹线。在实验测序反应中提供dNTP混合物，同时提供 ddNTP(双脱氧核苷酸三磷酸酯)混合物用于对照反应。ddNTP混合物在一次掺入这种双脱氧终止剂后终止聚合过程，因此基本上不会产生测序感 应信号。这些数据是在20毫秒采样分辨率下获取的，这个数据过于粗糙， 无法观察到单独的掺入尖峰，但是允许在超过300秒的时间内收集数据， 时间足够长，以每秒约20个碱基的预期酶速率观察整个聚合过程。
图20显示了与使用ddNTP混合物的对照反应(下迹线)相比，由dNTP 混合物(上信号迹线)的实验反应产生的信号迹线。实验测序运行的信号 迹线包括对照反应中缺乏的许多不同的总体信号特征(用箭头标出)并且 产生了比对照反应更高的电流。在所示的100秒时间段产生的信号迹线表 明，根据本公开的各种实施方式的传感器可适合于，在扩展的测序运行以 获得长模板序列的过程中，响应于DNA聚合酶探针的基于模板的核苷酸 掺入活性产生可检测信号。因此，此类传感器可以处理的长度或模板没有 直接限制。
实施例6
分子桥自组装
该实施例教导了制造分子电子电路的分子桥组分的新方法。在分子电 子学领域中，将桥分子插入纳米级电路中是常见的制造挑战。通常，分子 元件在两个电极之间连接，如图22所示。分子电子学中的常见问题是在 电极之间组装给定的分子电路元件，如图所示。最终的装置需要在电极和 形成桥的分子之间具有良好的机械和良好的电连接。由于纳米级尺寸和大 量电极对使得任何手动组装不可行，所以还优选该装置自组装成这种桥接配置。
该实施例的目的是为分子电子学应用提供分子桥结构。这些是跨越电 极的精确自组装电路元件，其提供各种电子用途。这包括特定的物质组成， 用于建立这些物质的制造，以及与确保这些结构的质量有关的方法。这包 括这种桥分子系统的特定优选实施方式。
该实施例教导了用于建立一类电路的特定系统及其特定的优选实施 方式。解决此问题的优选方式是引入高度局部化，精确定位的材料颗粒或 贴片，其在本文中称为纳米“接触点”，其满足引导自组装的一些或全部需 要，并且提供机械和电连接。图23中显示了用于这些目的的这种接触点 的使用。为此目的，接触点由合适的材料制成，其(i)选择性地结合靶分 子上的缀合物基团；(ii)高度空间定位；(iii)精确位于所需的位置； 和(iv)就地与基材结合。如图23所示，接触点“A”是一个空间定位的， 精确定位的材料元件，可以指导精确的自组装，并提供电子或机械连接。 在图23的左侧显示了将接触点“A”添加到电极然后附连分子元件的基本 步骤。最终结果是图23右侧所示的所需电路。元素“B”是桥连分子上的共 轭基团，其可以选择性地结合到接触点“A”。为此所需的接触点-桥分子 系统的关键性质是：(1)接触点在空间上高度局部化(“小”或“点状”)； (2)接触点具有精确预定义的指定位置；(3)接触点采用正确的材料配 置制成以支持其功能；和(4)桥分子在两端构建有共轭基团，其特异性 地结合接触点。
相同的性质比这里所示的电路结构的示例具有更广泛的实用性，例如 在直接或间接作为支撑脚手架的定向组装各种纳米机电装置中起作用。
这种接触点/桥分子系统可以进一步具有内部触件，其中后续分子可以 通过一系列组装步骤附连以形成更复杂的分子构建体，如果原位进行则这 些组装步骤是最有效的。由电极上和桥分子内部的接触点引导的这一系列 组装步骤如图24所示。如图24所示，另外的接触基团“C”用于在一系列 组装步骤中将具有缀合物结合位点“E”的其他分子组分“D”特异性结合至 一级桥分子。具体地，当在原位执行时，这些组装步骤可以用底层电路电 子地监控，以提供知道何时/是否已经实现适当组装的手段。通过装置内部 电流监测的该组装在图25中显示。图25显示了电流中的尖峰如何与传感 器装置的自组装中的每个步骤相关。监测组装的能力是原位组装过程与底 层电路的电流感测特性相结合的优点。通常，本实施例提供了一种系统， 其中，对于给定电极：(i)在电极上建立纳米接触点；(ii)在能够跨越 接触点之间的间隙的桥分子的两个点处提供缀合物特异性结合基团；(iii) 在具有缀合物特异性结合基团的桥分子中鉴定内部结合基团；(iv)附连 在桥上的其他分子元件特异性地附连缀合物；(v)一系列结合事件在电 极上原位进行，包括一级桥结合和二级分子结合；和(vi)通过在施加电 压下跟踪电路中的内部电流来监测结合事件的完成。
具体地，接触点可以是第一材料的珠，通过任何纳米制造方法沉积在 包含第二材料的电极上，使得材料特异性结合可以用于引导自组装。在此， 不同的材料可以称为例如“材料1”和“材料2”。
具体地，珠可以是金属的，并且在优选的实施方式中，珠是金。在这 种情况下，桥分子上的基团可以是含有硫醇取代基(-SH)的任何基团， 或是可以还原成游离巯基的硫化物基团(例如，通过活化，裂解二硫化物 或瞬时)，然后，它将参与特定的，众所周知的硫醇-金键合。
此外，还有众所周知的与金，以及其他材料，包括金属和半导体材料 键合的短肽。给定用于接触珠材料1的这种肽，桥可以是在可以跨越接触 点的两个不同“末端”位点带有两个这样的肽结构域的任何蛋白质。然后， 肽-材料结合可以提供特定的接触点结合。具体地，如果桥分子是工程化蛋 白，则它可以将这些肽工程化成线性序列，优选具有使肽更易于外部结合 的接头基团。优选的连接基团是富含甘氨酸和丝氨酸的肽接头，例如GS 或GGGS。可以将这些肽工程化到形成蛋白质桥的单链上，或者可以组装 以形成多链蛋白的多个链上的两个位点。
一个优选实施方式由特定系统组成，其中建立金珠作为接触材料1， 其不同于电极材料2。金是衍生物，具有半胱氨酸封端的肽，其进一步含 有间隔物和接头，然后是以肽抗原终止，其中存在特异性免疫球蛋白-G (IgG)抗体，或具有至少两个相同结合臂的任何其他抗体。半胱氨酸将 通过硫醇键特异性结合金。然后，肽抗原的特异性抗体可以结合以形成金 珠接触之间的桥。此外，在该系统中，与任何其他蛋白质(例如酶)交联 的抗IgG抗体可以发挥特异性结合其他分子组分的作用。对于特定的优选 实施方式，衍生肽可以由CALNN肽，富含GS的柔性接头，然后是“FLAG- 标签”抗原肽(DYKDDDDK)组成，例如CALNNGSGSDYKDDDDK组成。 该肽具有商业上可获得的成熟的抗FLAG IgG抗体，其在该特定背景下形 成将针对这些金-肽接触点自组装的分子桥。例如，如果这是小鼠抗FLAG 抗体，则抗小鼠IgG(例如山羊抗小鼠IgG)将特异性结合桥，并且可以 交联至耦合至该桥所需要的任何其他蛋白。
另一个优选的实施方式是接触点材料包含通过在每个电极末端的纳 米加工建立的金珠，并且桥分子包含双链DNA(dsDNA)分子，其在每 条单链的5'和/或3'末端具有作为修饰的核苷酸整合的硫醇基团(硫醇化的 核苷酸)，使得在任一末端有一个或两个硫醇基团。另外的硫醇化核苷酸 可以位于dsDNA末端附近，以提供更多的硫醇-金连接。这将优先在桥分 子框架中自组装。另外，单个生物素化的核苷酸可以特异性地掺入dsDNA 的内部，优选地在一条链的中间碱基处。这为链霉亲和素分子(天然的或 改变的)提供了特异性连接位点。链霉亲和素可以与任何其他所需蛋白质 (例如酶)交联，以形成该系统的二级耦合分子。
另一个优选的实施方式是，接触点材料包括通过在每个电极末端的纳 米加工建立的金珠，并且桥分子是蛋白质α-螺旋分子，其在氨基和羧基末 端处/附近具有半胱氨酸氨基酸，这些可以形成与金接触点的特定硫醇-金 连接。这将优先在桥分子框架中自组装。另外，单个生物素化的氨基酸可 以特异性地掺入内部α-螺旋，优选地在一条链的中间碱基处。这为链霉亲 和素分子(天然的或改变的)提供了特异性连接位点。链霉亲和素可以与任何其他所需蛋白质(例如酶)交联，以形成该系统的二级耦合分子。
另一个优选的实施方式基于IgG抗体作为桥分子。可以针对抗原产生 这样的抗体，并且任何产生包含抗原的接触点的方法将允许相关的IgG抗 体使用IgG上两个Fab臂的特异性抗原-抗体结合来特异性结合两个接触 点。此外，在该系统中，与任何其他蛋白质(例如酶)交联的抗IgG抗体 可以发挥特异性结合其他分子组分的作用。
在该IgG系统的另一个优选实施方式中，抗体将针对金纳米颗粒产生， 注射到宿主动物，优选小鼠或兔子中。由这些动物产生的抗体可以具有各 种形式的金颗粒结合特异性，因此当材料1触件是金珠时，可以起到上述 IgG组分的作用，与用于疫苗接种的金纳米颗粒足够相似。这种抗体具有 的特异性可以是材料特异性的(金)，以及潜在的尺寸特异性，对于疫苗 接种纳米颗粒的大致尺寸。
在该IgG系统的另一个优选实施方式中，3-10nm尺寸范围(直径) 的金纳米颗粒将用于疫苗接种，并且不同的制造工艺将在电极上建立相当 大小的金珠接触点。
在该IgG系统的另一个优选实施方式中，将在接种疫苗中使用3至 10nm尺寸范围(直径)的金纳米颗粒，并通过测试其血清和/或分离的纯 化的IgG(例如通过ELISA测定)针对它们对一系列尺寸的金纳米颗粒的 结合反应来选择动物，以便鉴定对一定尺寸范围的金颗粒或一般金颗粒具 有特异性亲和力的特定IgG源。然后，这些IgG形成用于相关金接触点的 桥分子系统(特定尺寸范围，或一般金珠)。
在该IgG系统的另一个优选实施方式中，鉴定为产生具有接触特异性 结合的所需IgG的动物然后经历杂交瘤融合过程以产生一组单克隆抗体。 然后筛选来自该组的抗体的IgG结合特性，以选择所需的单克隆抗体。这 些是分子桥系统的IgG的优选来源。这提供了具有特定性质的精确分子， 其可以无限量地大量生产。
在建立IgG系统的该方法的另一个优选实施方式中，鉴定为产生具有 接触特异性结合的所需IgG的动物然后进行B细胞受体深度测序，以鉴定 潜在IgG可变结构域的候选DNA序列，并且所需受体序列经克隆和表达， 并重新测试其金颗粒结合活性，以获得所需IgG抗体的特定单克隆形式。
在该IgG系统的另一个优选实施方式中，IgG分子直接由起始模板工 程改造，所述起始模板在结合口袋的可变结构域中具有材料结合肽。这可 包括包含具有特定硫醇-金连接的半胱氨酸氨基酸，或可包括标准或新型金 结合肽，优选具有合适的富含GS的接头以增强可及性。完全工程化的IgG 将形成具有金珠接触的分子桥系统。或者，可以使用结合其他材料的肽， 与由所述材料制成的接触点相容。此外，分子筛选方法，如噬菌体展示筛 选，可用于鉴定用于分子桥系统的新型此类物质结合肽，以进一步扩展可 用于接触点的材料类型，或改善桥分子的给定材料接触点的结合性质。
在上述IgG桥系统的另一个实施方式中，二级结合分子可以基于蛋白 A或蛋白G，而不是关联抗IgG抗体。
在另一个实施方式中，可以直接工程改造酶以在该系统中形成一级桥 分子。这可以通过以上述方式工程改造酶蛋白以携带物质结合肽结构域或 半胱氨酸残基，和/或通过在标准Spy-Catcher肽缀合系统中工程化，在蛋 白质上具有Spy或Catcher结构域，和包含接触点的一部分的缀合肽来实 现。一般而言，对于要进行的两个连接，可以使用硫醇连接，材料结合肽 和Spy-Catcher肽对的组合来实现两个附着点，甚至可以定义触件的优选 取向，如果采用两个不同接触点耦合系统(例如，一个接触点的硫醇-金键 连接，另一个接触点的Spy-Catcher连接)。
对于所有这些分子桥系统，建立桥组合物的优选方法是进行一系列原 位结合反应，并主动监测装置电流。然后，电流的变化确定了已经实现不 连续组装步骤的点：开路，一级桥结合，二级分子结合。在另一个优选实 施方式中，第三电极(掩埋栅电极)用于施加栅电极电压，该栅电极电压 可用于进一步调谐观察到的电流水平。另外，在其他实施方式中，对AC 信号的响应/电压光谱可用于在组装期间和之后为系统的各种构造提供识 别指纹。
在另一个优选实施方式中，通过电压引起的桥结构的喷射，可以使用 该栅电极和施加的电压来“重置”结。合适的高电压/电流通常会部分或完全 破坏/降解任何分子桥结构。这可以与合适的“再生缓冲液(stripping buffer)” 结合进行，所述“再生缓冲液”可以具有电压可诱导的酸度或pH变化，或 来自溶液的局部降解因子的其他电压诱导。
而且，在某些实施方式中，施加的电压(源电极-漏电极或栅电极) 可潜在地提供电压增强的组装，以加速或驱动组装过程。
在另一个优选的实施方式中，上述所有方法都与产生这种分子桥系统 的大阵列相容。在该背景下，对来自阵列中各个装置的装置电流的实时监 控确定哪些装置形成良好，并且在某些系统中对各个装置电压的控制将实 现电压定向或加速组装，以及装置的电压定向重置/重新初始化/剥离。
在各种实施方式中，用于产生分子桥的系统和方法包括在电极末端上 建立纳米接触点；在一级桥分子上的两个点建立共轭结合基团；任选地在 桥分子和具有用于内部接触点的共轭基团的二级分子内建立内部接触点； 并允许在一系列反应中进行自组装，由通过底层电路的电流监测，以确定 确实发生了不连续组装事件。在各种示例中，接触点是第一材料，材料1 的珠，电极是不同的材料，材料2，并且缀合物结合基团是具有材料1-特 异性结合能力的基团。例如，材料1包含材料特异性结合肽，并且该肽用 作缀合物基团。
在各种实施方式中，材料1是金，并且材料特异性结合肽是已知的金 结合肽之一。在其他方面，材料1是金，并且共轭基团含有硫醇基团，用 于金-硫醇连接作为特异性结合。此外，材料1可以是金，并且材料特异性 结合肽是氨基酸半胱氨酸，其包含在缀合物结合基团中。
在其他实施方式中，材料1是金，并且桥分子是双链DNA，两端具 有含硫醇的核苷酸。或者，材料1是金，桥分子是双链DNA，两端具有 含巯基的核苷酸，并且存在内部生物素化的核苷酸，并且二级分子是链霉 亲和素(天然的或突变的)，任选地交联至其他蛋白质，特别是酶，特别 是聚合酶。在其他方面，材料1是金，并且桥分子是在两个末端处或附近 含有半胱氨酸的α-螺旋蛋白，以通过金-硫醇连接提供材料特异性结合。
在各种实施方式中，可以存在内部生物素化的氨基酸，并且二级分子 是链霉亲和素(天然的或突变的)，任选地交联至其他蛋白质，特别是酶， 特别是聚合酶。材料1可包含特定IgG抗体A的抗原，其中A通过与抗 原的特异性结合形成桥分子。
在其他示例中，与其他蛋白质(特别是酶，特别是聚合酶)交联的抗 A抗IgG抗体形成该系统的二级分子。在这些IgG系统中，材料1可以是 通过纳米制造工艺建立的金珠，用在一端具有半胱氨酸基团的肽衍生化， 并且包括肽抗原和特异性IgG抗体，A。衍生肽可以由CALNN组成，具 有0个或更多个氨基酸的富含GS的间隔物，接着是FLAG-标签肽抗原， 并且抗体A是[宿主]-抗-FLAG IgG，并且二级结合分子是抗-[宿主]-IgG， 其中[宿主]是任何标准抗体宿主动物，特别是小鼠，山羊，兔，并且二级 IgG任选地与任何其他蛋白质(特别是酶，特别是聚合酶)缀合。
桥分子可以是通过用材料1的纳米颗粒接种宿主动物而产生的IgG抗 体，并且该材料1特异性是桥结合的基础。在该系统中，二级分子是同源 抗IgG，其可任选地与另一种蛋白质，特别是酶，特别是聚合酶交联。或 者，二级分子可以是蛋白A或蛋白G，其特异性结合IgG，任选地与另一 种蛋白质(特别是酶，特别是聚合酶)交联。材料1可以是金，和通过用金纳米颗粒接种宿主动物产生的抗体。例如，尺寸在3nm至10nm范围内 的金纳米颗粒，特别是在小鼠或兔的宿主动物中，特别是，抗体基于它们 对一系列尺寸的金纳米颗粒的结合特征进行预选。
抗体可以作为源自选择具有良好抗体结合反应的宿主动物的单克隆 抗体产生，并且进一步选择具有针对通过给定纳米制造工艺制造的金珠接 触的良好结合响应。
基于B细胞受体测序和克隆，抗体可以从选择具有良好抗体结合反应 的动物工程改造，并且进一步选择具有针对通过给定纳米制造工艺制造的 金珠触件的良好结合响应的克隆。
在一些示例中，桥分子可以是在IgG模板上工程化的合成蛋白，在 Fab结合口袋的可变结构域中具有特定的氨基酸序列，这种序列包含材料 1-结合肽，与富含GS的肽接头结合。二级结合由同源抗IgG抗体提供， 可能与另一种蛋白质(特别是酶，特别是聚合酶)交联。对于这样的工程 化蛋白质，对于二级结合的替代方法，还可以在二级接触位点以特异性结 合肽的形式工程化，其可以结合其他工程化蛋白质(尤其是工程化酶，尤 其是工程化聚合酶)中的缀合肽，特别是以这种方式使用Spy-Catcher肽 缀合系统(将Spy或Catcher肽工程化到IgG模板中)。材料1可以是金， 并且工程化到结合口袋中的材料特异性肽可以包含半胱氨酸，金结合肽， 以及富含GS的接头和间隔物。
在各种实施方式中，一级桥分子可包含蛋白质，优选酶，优选聚合酶， 其已被工程化以直接包括与接触点缀合成其线性蛋白质序列，或其复合链 的序列(如果它是一种多聚体蛋白质)的结合基团。
接触点可以包括Spy或Catcher结构域，并且蛋白质可以包括缀合肽， 并且Spy-Catcher肽缀合系统提供与接触点的耦合。接触材料可以是金， 并且蛋白质含有半胱氨酸氨基酸或金结合肽作为结合基团，与富含GS的 接头一起，以提供与电极接触点的耦合。
在各种实施方式中，栅电极电压用于在过程监控方面提供另一电压控 制。例如，栅电极电压和施加的源电极/漏电极电压用于执行电压光谱，I-V 表征或AC信号响应，以进一步表征构造阶段和产生的分子桥配置，并鉴 定良好形成的结构。栅电极电压和施加的源电极/漏电极电压用于加速桥形 成，并消除不正确形成的桥构造。
在各种示例中，分子桥构建体可以以大阵列布置，例如在电极阵列上， 包括鉴定良好形成的位点，以及利用电压定向感测和致动重置/剥离/重新 初始化位点。
这里，在实施例6中，图26至34显示了上述实施方式的实验结果， 下面将更详细地讨论。第一组图显示了通过硫醇-金定向结合在金接触点对 的测试阵列上结合/桥接的各种类型的桥分子。这包括DNA，肽和抗体桥。 下一组图显示通过硫醇-金定向结合用金接触点或靶标与电极结合/桥接， 通过成像和电测量评估结果。
图26至34进一步提供：结合试验阵列：dsDNA桥；结合试验阵列： dsDNA桥，改进的结合；结合试验阵列：肽α螺旋桥；结合试验阵列：IgG 抗体桥；电桥/绑定测量的测试设置示意图；带金点触件的测试电极；桥接 和分子组装的电信号；桥分子与成像结合的电信号；和带有标记桥的电极 的图像。
现在参考图26，显示了桥触件(绿色框)和非桥触件(红色框)的理 想图像的图解表示。在图27中，双链DNA分子用于在金-点接触点之间 形成桥。在该实施例中，桥分子是20nm长(60个碱基)的双链DNA分 子，在每条链的5'末端上具有硫醇基团，用于与接触点的硫醇-金结合。通 过电子束光刻在硅基材上形成金点。DNA桥在一条链上具有生物素化的碱基30，用于结合生物素-金标记物以允许标记的桥的电子显微镜成像。 图27显示桥接反应和标记反应后的基材的EM图像。绿色方块突出显示 具有良好形成的桥的触件。
图28是桥接至金接触点阵列的更高效率的20nm双链DNA的图像。 为了成像，桥用小金点标记。绿色方块突出了良好形成的桥示例。由于在 高盐缓冲溶液中沉积，更高水平的与金接触点和桥的结合(桥接反应条件： 1μM桥浓度与结合阵列在5X TBS缓冲液中孵育1小时)。
图29是结合金点接触点测试阵列的α-螺旋肽桥的图像。桥分子是长 度为10nm的肽α-螺旋，末端具有半胱氨酸氨基酸，用于通过半胱氨酸的 硫醇基团的硫醇与金结合。桥通过内部赖氨酸-生物素标记，用链霉亲和素 -金珠标记。没有多少接触金点具有成键桥，并且许多金点对具有位于点之 间的桥，与点到点桥一致。对于该实验，肽桥接反应条件是：1μM桥浓 度在1X PBS缓冲液中孵育1小时。绿色方块突出了良好形成的桥示例。
图30是IgG抗体桥结合的图像。金点触件阵列首先通过半胱氨酸/硫 醇-金结合用CALNN-FLAG-标签肽衍生化。抗FLAG标签IgG通过特异 性亲和结合与FLAG标签结合。使用结合IgG恒定结构域的金点蛋白-A 标记标记抗体位置用于成像。图30显示与金触件/CALNN-FLAG结合的 抗IgG。几个点对显示位于点之间的抗体，表明完全形成桥，并且IgG臂 跨越所述点。绿色方块突出显示了良好形成的桥的例子。
图31显示了用于桥分子上的电测量的测试装置的示意图。在图的上 部显示了电极-基材结构的横截面和附接到分析器，用于施加电压和测量通 过桥分子的电流。在图的下部，显示了用于桥接电路的电极阵列的透视图。 每对电极在金属-1电极上具有金属-2接触点。
图32-33显示了桥分子结合的电特征。在图32中，电流对时间显示 三个尖峰，指示桥-电极结合事件。图33是对于相同电极的标记的桥的EM 图像，显示了与最右侧电极(绿色箭头)结合的三个桥，与观察到的三个 信号尖峰相符。这些不会桥接电极间隙，但表明即使没有跨越电极，桥分 子的结合也可以产生可检测的电信号。
图34是金电极的dSDNA桥接的EM图像。显示在一条链的3'和5' 末端上具有硫醇基团的20nm dsDNA桥结合为金涂覆的电极之间的桥(绿 色箭头)。该桥通过金点-链霉亲和素标记在中心生物素化碱基处用金点标 记。电极在硅上的5nm铬基材上具有15nm的金层。表面被氧化硅层钝化， 开口区域宽20nm，以暴露电极的金表面以进行桥接(暗水平带是暴露区 域，没有氧化硅覆盖)。
实施例7
在电极上引入纳米-接触点
该实施例说明了制造用于在基材(例如电极)上制备珠的新方法，其 具有精确的位置，形状和尺寸。这些方法的一个关键新颖特征是它们提供 了一种将珠定位在基材上的方式，该基材的直径小于该过程中使用的图案 化方法的基本图案特征。
该实施例涉及将在固体基材上展开的纳米颗粒，具有精确的位置和小 的尺寸。一个优选的应用是使用纳米级材料颗粒作为基材上的“接触点”， 以便将以下类型的事件在空间上定位到纳米级的明确定义的理想位置，特 别是机械连接，电连接和自组装。
上面讨论了对此的一种可能需要，并且在创建所需分子级电路的背景 下在图22中更详细地说明。这里，分子元件将在两个电极之间连接。这 是分子电子学领域的常见问题。
解决此问题的一个优选方式是引入高度局部化，精确定位的材料颗粒， 其在本文中称为纳米“接触点”，其满足引导自组装的一些或全部需要，并 且提供机械和电连接。上面讨论并在图23中显示了这种接触点的使用， 其中元件“A”是接触点。为此目的，接触点由合适的材料制成，该材料选 择性地结合靶分子，在空间上高度局部化，并且精确地位于所需位置。
该应用所需的纳米颗粒的关键性质是(1)它在空间上高度局部化(必 须是“小”或“点状”)；(2)它具有精确预定的指定位置；和(3)由适当 的材料制成，以支持其功能。
相同的属性比这里显示的电路结构的例子具有更广泛的实用性。例如， 在等离子体共振装置的领域中，其中纳米颗粒与电磁能的相互作用是关键 问题。
通常难以高效地制造在基材上具有所需小尺寸和精确位置的纳米级 珠。纳米级光刻或铣削的标准方法可用于在基材上形成所需材料的盘，其 形状和直径通过一级图案化工艺设定。这些包括众所周知的图案化方法， 例如电子束光刻，光刻，UV光刻，极紫外光刻和压印光刻，以及离子束 铣削，结合各种材料沉积方法，例如溅射或气相沉积。该标准方法的最重 要的限制是材料盘的直径由图案化工艺设定，并且图案化工艺的最小分辨 率可能对于提供所需的纳米级珠尺寸而言不够小。如果所需的珠的直径低 于10nm，这是接近或超过大多数现代光学，UV或电子束光刻系统或离 子束铣削系统的分辨率极限，则情况尤其如此。本发明是一种使用这些标 准高效图案化方法在基材上制造精确定位的珠的方法，其中珠的直径小于 一级图案化工艺的分辨率极限。这些珠也是精确定位，具有精确定义的形状。
该实施例教导了制造精确控制的尺寸，形状和位置的珠的三种示例性 方法，其直径明显小于该过程中使用的一级图案生成方法的最小特征尺寸。 方法如下：
在图35和36中显示了第一种方法，在此称为“过程(1)”。第一种 方法由通过标准图案化方法将盘图案化成保护抗蚀剂层组成。该步骤产生 保护性抗蚀剂层，其中基材上的所需盘区域被暴露。接下来是沉积工艺以 沉积粘合剂材料，这可以再次通过标准沉积或涂覆方法完成，这取决于粘 合剂材料的化学性质。粘合剂材料应该能够粘合到基材上，并且还能粘合 到珠材料上。然后将其暴露于含有所需珠的溶液中，所述珠预先通过制备 大量纳米颗粒(例如胶体悬浮液)的标准方法制备，然后其可以在粘合盘 上就地粘合。如果珠足够大并且浓度低，则物理尺寸限制(通常称为“空 间位阻”)将允许至多一个珠在盘处结合。然后将抗蚀剂溶解，留下附着 的珠。作为替代实施方式，可以在该步骤顺序中首先去除抗蚀剂，但是一 旦一级珠就位，其存在有助于限制其他珠进入粘合剂区域，因此前一种方 法是优选实施方式。粘合剂在该方法中可以是永久性的，或者在另一个实 施方式中，它可以是该方法的一个短暂方面，通过溶解除去，将珠留在原 位，可能与将珠结合到基材的加料工艺步骤相结合。在任何情况下，特别 注意，该珠的直径可以小于盘子本身，并且否则位于粘性盘的中心附近。 特别地，具有盘直径一半的珠将提供适当的尺寸排除，使得每个盘仅可以 结合一个珠。
图35说明了用于在所需位置制造小珠粒的方法(1)的步骤。从图35 的左上方部分开始，在基材(蓝色)上涂覆一层抗蚀剂(灰色)，其具有 直径为D的开口盘。然后将一层粘合剂(绿色)沉积到盘中。然后将通过 标准方法制造的预制珠的溶液暴露于此，其中珠具有直径d，使得空间位 阻仅允许每个粘合盘一个珠粒。除去抗蚀剂后，残留的是直径为d的珠，位于粘性盘中心附近，但尺寸小于盘直径D。该过程在图36中更清楚地 以3D描绘，显示了过程(1)的关键元件的透视图和俯视图。
第二种方法“过程(2)”在图37，38，39A和39B中显示。从基材开 始，使用任何标准图案化方法来图案化宽度为W，长度大于宽度的矩形区 域，并且使用任何标准沉积方法来沉积一定厚度的期望珠材料M的固相 薄层，形成这种矩形图案。然后使用合适的退火工艺对该构象进行退火， 这将允许系统朝向最小能量的构象进化。在适当的条件下，这将导致沉积 的材料条在表面张力的作用下破碎成珠，形成一排较小直径的珠，它们共 同包含相同体积的材料。所得到的材料M珠的直径小于条带的宽度W， 并且仍然精确地居中靠近相同的中心线。珠-珠间距在统计上是相似的，并 且该间距也可以明显大于珠直径。该过程的最后一步旨在仅在原始条带的 优选末端附近产生单个暴露的珠。
实现此目的的这种过程的两个替代实施方式是：
(a)通过标准图案化方法用可沉积的可去除材料/抗蚀剂层保护最靠 近条带末端的珠，然后洗去所有其他珠，然后暴露受保护的珠以到达初始 条带的末端附近所需的单个暴露珠；或
(b)用标准图案化和沉积方法沉积覆盖珠的层，除了最接近条带末 端的层之外，再次仅留下最接近条带优选末端的所需珠。
通过任何手段，保留最接近条带的引导端的单个暴露的珠。该珠也将 具有精确限定的形状，其可以是接近球形的，但通常由所涉及的材料的体 积和表面相互作用能以及退火过程限定。退火通常通过将系统浸入合适的 环境介质(其在优选实施方式中可以是真空，或空气，或惰性气体，例如 氮气)，然后将系统的温度升高一段时间来进行。为了进行这种珠化过程， 沉积材料，基材材料和环境介质必须具有合适的物理性质。优选的实施方 式将具有以下性质：(i)材料-基材表面张力超过基材-环境表面张力；和 (ii)该材料将在不破坏基材的温度下退火或熔化。
在这些有利条件下，加热到适当的退火温度，通常远低于熔点，材料 将变得可移动，并且允许经过适当的退火时间，材料将在表面张力的作用 下破碎成一排珠，通常形成小得多的圆形珠。如果在材料和基材之间存 在非常大的表面张力，则珠将近似球形，并且否则根据表面张力成形。该 珠的直径d将小于初始沉积图案的宽度W。因此，该过程实现了直径d的 接触点，其明显小于初始图案化过程的极限。该珠位置也将保持聚焦在原 始斑点中心附近的，因此也保持精确指定的位置，同时增强空间定位。该 方法的另一个关键的新颖优点是，即使初始沉积材料层具有不规则性，所 得到的珠也具有明确定义的形状，因为最终的珠形状由表面张力而不是初 始沉积图案限定。
在图37，38和39A-B中捕获该第二种方法如下：
图37显示了方法(2)实施方式(a)的步骤：从该图的左上方开始， 在合适的基材(蓝色)上沉积矩形的宽度为W的珠材料(金)，其在退 火时和在表面张力的作用下分解成一排珠。然后，图案化并沉积可移除抗 蚀剂(红色)的保护层，保护将包含单个珠的区域。除去剩余的珠，然后 除去抗蚀剂，在原始矩形材料的优选末端附近留下单个珠。图38显示了 方法(2)的替代实施方式b，其中与图37中所示的实施方式相反，最终 沉积层(红色)用于覆盖不需要的珠，仅在优选端留下珠并且接触并可用 于更大的纳米装置。
图39A显示了方法(2)的一个优选实施方式的示例，其中所使用的 图案化方法是电子束光刻，并且目标是在两个电极条的近端处制造珠。该 图描绘了贯穿将矩形层分解成珠的过程，并且在最终步骤之前在每个矩形 的优选端处实现单珠子的过程。图39B是电子显微镜图像，显示了图39A 的方法在由升高和凹陷的基材脊组成的基材上付诸实施，金层沉积在基材 脊上并允许其分解成珠。图像显示珠的直径明显小于矩形条带的下方宽度，并且变窄(凹陷)的条带足够小以形成单行珠。
第三种方法“过程(3)”在图40中显示。从基材开始，使用任何标准 图案化方法来图案化宽度为W，长度大于宽度的矩形区域。该矩形图案可 以进一步是钝的，但是在优选实施方式中也指向要在其上形成珠的指定端 部，这可以提高珠定位精度。然后，使用任何标准沉积方法将第一材料层 1(蓝色)沉积到该图案中，即第二材料2的粘合材料，意味着材料2牢 固地粘附到其上，到退火时不会发生成珠的点，如图37所示。第二材料2 也沉积在相同的图案中。然后在该表面处建立薄的界面层(灰色)，该表 面是任何材料层，或分子晶格结构的改变，其产生否则将存在的体结构的 破坏；在一个优选的实施方式中，这是通过在真空系统中引入破裂，允许 暴露于空气来完成的，这允许在表面形成氧化层。在建立界面层之后，以 相同的图案制造另外的薄层沉积材料3，其是所需的珠材料，并且在优选 实施方式中，材料3与材料2相同。这种构象然后通过沉积厚的钝化层来 保护，该钝化层使得仅小尺寸的优选端部被暴露。然后，在与上述方法2 相同的考虑下，该构象进行退火。在本构象中，暴露的薄材料层3将在退 火的作用下破裂并成珠，如上面方法2中所讨论的，形成尺寸小于暴露区 域的珠。由于材料1是粘合层，即使在材料2和3是相同材料的优选实施 方式中，材料2层也不会在该退火过程下成珠。界面层是瞬态的并且在该 过程中将被置换，特别是在优选的实施方式中，其中它是氧化层并且退火 在升高的温度下进行。结果是所需材料3的珠，其直径小于图案尺寸并且 位于原始矩形图案的所需端部附近。如上所述，在优选实施方式中，材料 2和3是相同的材料，氧化层作为界面层，并且在另一个优选实施方式中，该材料是金，产生具有超分辨尺寸的金珠，于金支撑表面上。
通常，这三个过程(1)，(2)和(3)可用于产生以有序，指定的 阵列图案布置的珠，以支持更广泛的纳米加工需求。图41显示了如何可 以容易地使用过程(1)来制造粘合剂盘阵列，并且因此将高效地将粘合 剂材料的图案化沉积转变成超分辨，精确定位和精确成形的珠阵列。因此， 它为有序的纳米级珠阵列提供了高效的制造工艺，其分辨率超过了初步图 案化工艺所能达到的分辨率。图41说明使用方法(1)或(2)制备的珠 阵列。在方法(1)的情况下，初始图案化和材料沉积过程可用于在基材 上形成粘合材料盘阵列(由虚线圆圈表示的原始足迹)。然后该方法将沉 积所示的预成形珠。或者，如果使用方法(2)，则可以基于沉积的初始 材料矩形阵列，通过单个保护步骤建立整个珠列。图41显示了有序的， 图案化的珠阵列的一部分，其可能在基材上任何程度。
图42显示了使用这些制造工艺来生产珠阵列的一个优选应用，其将 在制造图34中所示类型的分子电子装置阵列中。所描述的阵列工艺将用 于制造位于电极对的尖端处的阵列珠，如图40所示。注意，方法(2)和 (3)特别适合于这种特定类型的图案，因为单个保护步骤(图38和39A 中的红色层)可以保护并在电极的末端建立一整排珠。图41中的这种珠可以用作分子电子电路的纳米接触点，如图34所示。工艺中珠的使用将 是用于以可放大阵列形式生产最终分子电子装置的整个制造工艺的一部 分。这尤其可以用于在单个集成电路芯片上产生许多这种装置的阵列。
在各种实施方式中，本公开提供了一种用于沉积直径小于原始图案的 珠的方法，包括：提供基材材料；提供图案生成和粘合剂沉积工艺；在溶 液中提供多种预制珠；使用图案生成和粘合剂沉积工艺在基材上建立粘合 剂材料贴片或盘，通过图案化工艺设定其直径，并通过抗蚀剂涂层保护基 材的其余部分；并将在溶液中的多个预制珠暴露于粘合剂，粘合在其上， 其中预制珠的直径足够大，使得仅有空间供一个珠可以粘合在粘合材料盘上；并在珠结合之前或之后，除去抗蚀剂涂层，使珠分离，粘合到粘合剂 贴片上。在各种实施方式中，最终珠的直径可小于约20纳米。在其他实 施例中，珠直径可小于约10纳米。
在各个方面，图案生成过程可以包括以下的任何一种：电子束光刻； 光刻；UV光刻；极紫外光刻；X射线光刻；纳米压印光刻；和离子束铣 削。
在各种实施例中，前述过程可用于形成有序的珠阵列，其中珠位置的 图案由一级图案化过程引导。例如，珠图案可以使得珠相对于用于分子电 子装置的阵列的电极图案放置在接触点位置。在一些方面，该过程可以包 括在单个芯片上制造超过100个接触点。在其他示例中，该过程可以包括 在单个芯片上制造超过10,000个接触点，或者在单个芯片上制造甚至超过 1,000,000个接触点。
在各种实施方式中，预制珠可包含金属纳米颗粒，例如胶体金纳米颗 粒。在一些实施例中，预制珠包含金纳米颗粒，并且粘合剂包含硫醇化硅 烷材料。
在前述方法的各个方面，当随后除去粘合剂材料时，将颗粒就地留在 由其他主动或被动手段粘合的基材上。在一些实施例中，预制纳米颗粒的 直径等于或大于粘合剂盘直径的1/2，允许至多一个这样的颗粒结合。
在其他实施例中，粘合剂可以被图案化成除盘之外的一些其他形状。
在前述方法的变型中，采用手段以有利于每个粘合剂位点沉积的单个 颗粒，例如：粒度(较大直径是有利的)以及这些其他限制因素中的任何 一个或全部：抗蚀剂中凹陷的纵横比(高深度/宽度是有利的)，预制颗粒 溶液的浓度(较低浓度是有利的)，一级珠与不能结合的另一种珠的混合 物，其存在用于尺寸排除目的(更多这样的置换珠是有利的)以防止多个 一级珠接触一个位点，和结合反应的持续时间(更短的时间是有利的)。
珠可以以这样的方式沉积，即每个位点可以附连一个以上的珠，但是 这样，根据加载位点的随机过程，其在精确附连点和附连时间上是随机的 (泊松加载统计学)，一些部分的位点将获得良好形成的位点所需的单个 珠。
纳米颗粒可以进一步包括增加其有效直径的可去除涂层，以便尺寸排 除以限制到每个粘合剂位点沉积1个颗粒，并且在暴露于纳米颗粒的溶液 结束之后，在随后的处理步骤中去除所述涂层。
实施例7给出了本发明的实验结果，其中预形成的纳米级珠沉积在表 面上，并粘附到图案化区域，以在所需位置处建立珠，用作自组装分子装 置的接触点。所显示的ELISA测定结果进一步证明，如所教导的，与表面 结合的珠保留了特定分子结合的功能，这是分子自组装反应的基础。
图43至46A-D进一步解释了这些结果，并且包括：珠与适当衍生的 表面区域的结合的EM图像；显示未衍生的表面区域上没有珠的EM图像； 与衍生化表面区域结合的珠的AFM图像；和表面结合金珠上的功能性分 子结合试验。
图43显示沉积在粘附表面上的金珠的电子显微镜图像。珠是直径约5 nm至10nm的金纳米颗粒。粘附表面是用市售的“分子胶”衍生的硅晶片， 该分子胶使用纳米级聚合物基质(Mix&GoTM，来自Anteo诊断公司(Anteo Diagnostics,Inc.))方便地结合多种材料表面。沉积缓冲液使用的是碳酸 盐缓冲液。图像显示珠以高密度附着在表面上，表明高效沉积。
图44显示对照样品的电子显微镜图像，所述对照样品包含粘附于未 衍生的硅表面的金珠。这表明珠的表面粘附的背景水平非常低，没有适当 的衍生化来引导表面结合，并且没有适当的沉积缓冲剂。因此，表面的图 案化衍生化可用于将珠结合精确地引导至图案化区域，而在未衍生化区域 上没有沉积。
图45显示沉积在衍生化粘附表面上的金珠的原子力显微镜(AFM) 图像。珠是直径约5nm至10nm的金纳米颗粒。粘附表面是用市售的“分 子胶”衍生的硅晶片，该分子胶使用纳米级聚合物基质(Mix&GoTM，来 自Anteo诊断公司(Anteo Diagnostics,Inc.))方便地结合多种材料表面。 沉积缓冲液使用的是碳酸盐缓冲液。图像显示具有纳米分辨率的形貌的表 面结构。明亮的白色区域是粘附在表面上的金纳米颗粒的浓度。
图46A-46D显示了结合到表面的金珠的功能测试。数据表明，结合珠 保留了以特定亲和力将单个分子与珠结合的功能，从而证明了分子自组装 用途的适用性。图46A-46D显示了在孔板中进行的ELISA测定的细节， 其中金珠通过上文讨论的方法结合到孔中。在该测定中，针对来自相同批 次的附连到具有Mix&GoTM(Anteo诊断公司)衍生的粘附表面的ELISA 板的孔底部的珠的结合亲和力，测定小鼠(PAS 18037-18041)中产生的 与预形成的5nm金珠特异性结合的抗体。图46A显示了平板图，其显示 了沉积到孔中的各种浓度的金纳米颗粒，具有一式三份的以在行中指示的 各种稀释度的缓冲液，亲和抗体，天然血清和对照非特异性小鼠IgG的柱 状重复.图46B是来自ELISA板的最终读数的颜色编码强度图。图46C 是数字ELISA读数的对应表。最后，图46D描绘了以图形形式总结的最 终数据结果，显示具有特异性亲和力的抗体在沉积在表面上的珠浓度的整 个范围内对表面珠具有比各种对照更大的结合。这表明珠通过ELISA测 定的严格结合和洗涤条件保持与表面结合，并且还保留先前针对感兴趣的 分子(此处为特异性IgG抗体)建立的特异性分子结合特性。
实施例8
使用分子电子传感器的核酸分析
该实施例教导了使用分子电子传感器对核酸，特别是DNA或RNA进 行测序的方法。这种传感器的一个实施方式在图47中显示，如下所述。
确定DNA序列是生物学研究以及遗传学的生物医学和保健应用中的 一个基本重要的测量过程。由于DNA的结构及其在分子生物学中的基本 作用首先由Watson和Crick于1953年阐明，因此一直致力于开发高效的 方法来确定构成给定DNA分子的核酸碱基的序列。天然DNA分子是双 链螺旋，由互补链形成，每个链是由四个核酸碱基组成的生物聚合物，通 常表示为A，G，T和C。对DNA进行测序以确定在该聚合物中这些核酸 碱基的精确序列。第一种确定DNA序列的一般方法是由Sanger在1977 年引入的。通过Hood和其他人的工作，在20世纪80年代后期开发并商 业化了执行Sanger测序过程的自动化机器。这些仪器为人类基因组计划 提供了动力，该计划于2001年确定了人类的参考序列，总计测序成本超过10亿美元。在这项工作的过程中，为开发更高效的DNA测序方法付 出了巨大努力。2004年，Rothberg推出了第一批大规模并行系统并将其 商业化。随后，引入了几个其他大规模平行测序平台，包括可以分析单 个DNA分子，以加工酶的速度实时快速分析分子，或使用电子半导体芯 片传感器装置感测DNA序列的那些平台。能够在1000美元以下对人类 基因组进行测序的系统也在2014年商业化。尽管取得了巨大的进步，但 测序技术仍然有可能变得更快，更便宜，并以更少错误的形式提供更高质 量的序列数据，更长的连续序列读取，或读取RNA或修饰的碱基。这些 仪器还具有很大的潜力，可以变得更小或更便携，更坚固，成本更低，并 且可以大规模生产。此外，存在感兴趣的相关问题，例如RNA分子的测 序，以及确定可能存在于天然存在的DNA中的修饰核苷酸的序列，例如 图48中所示的甲基化核苷酸。当这些常见的甲基化形式存在于DNA中 时，希望能够读出它们在序列中的存在，因为这可能具有生物学相关性。 更一般地，如果DNA含有修饰的或类似的核苷酸或受损的碱基，则可能 需要结合存在标准碱基的序列确定它们的序列。
分子电子学领域出现在20世纪70年代，来自20世纪40年代和50 年代分子键和分子中电子转移理论的基础研究，以及1959年Feynman倡 导的纳米技术的出现。中心前提是单个分子可以形成纳米级电子电路中 的关键组件，充当诸如整流器，开关或传感器等的电路组件。其独特价 值在于它可实现极致的小型化和低功耗电路。另一个价值在于单个分子通过其分子相互作用可以具有作为传感器的独特性质，尤其是用于感测单 个分子的性质。在使用生物分子如蛋白质或酶的生物传感领域尤其如此， 因为这些已经进化出高度复杂和特定的分子迭代。
虽然早期的分子电子装置研究始于20世纪70年代，但仅在20世纪 90年代末和21世纪初，纳米工程的状态才达到了开始广泛研究用单个分 子作为组分集成的电路性质所需的复杂程度。通常，这种分子作为电极 之间的桥集成到电路中，从而可以施加电压。对于作为传感器的应用， 这种桥分子在与靶分析物相互作用时将改变其导电性质。还可以施加“栅 电极”电压，以通过施加的栅电极场进一步调节分子的传感特性。
该实施例的目的是使用分子电子传感器装置证明DNA序列的确定和 相关的核酸分析。这包括可用于此目的的特定装置实施方式，以及使用此 类装置来确定或表征DNA或RNA分子序列的方法。
本文教导了两种可用于核酸分析的分子电子传感器的一般形式。这由 酶(天然的或经过工程改造以具有增强特性)组成，其以某种形式处理靶 核酸，耦合到具有源电极和漏电极，以及用于额外电压控制的栅电极的三 电极装置。一个优选的示意性实施方式示于图1中，其中酶105作为一级 电路元件耦合，并且整个电路配置有测量电特性的仪表(例如在施加的电 压下的电路中的电流，或施加的电流下的电压)，并且其中测量的迹线因 此与和酶105结合的DNA分子108的序列相关。当酶-DNA构象显着改 变通过/在复合体周围的电荷传导时，这种构象是优选的。在这种情况下， “酶”的概念可以比分子生物学中的严格意义更广泛，可以是产生与DNA 分子相互作用的可检测信号的任何分子，其可以与潜在的DNA序列相关。
在该实施例的上下文中，图47说明了用于测量DNA序列的分子电子 电路的一种优选形式的示意图。酶耦合在源极和漏极之间，以形成包括用 于测量电特性的计的电路，例如施加的源极-漏极和栅极电压下的电流，或 类似的系统性质(例如恒定施加电流下的电压)。作为时间迹线的测量性 质S(t)反映了DNA的基础序列，这是由于酶对DNA的处理作用，以及在 该处理期间其作为电子成分的可变特性。
图49描绘了另一个优选的示意性实施方式，其中酶作为二级或并联 电路元件耦合，其可以具有相对于一级导电元件的导电和门控活性，并且 其中整个电路配置有测量电性质的仪表(例如在施加电压下的电路中的电 流，或施加电流下的电压)，并且其中测量的迹线因此与和酶结合的DNA 分子的序列相关。示意图以更标准的源电极-漏电极-栅电极几何形状实现。 当酶-DNA构型变化可以将可变门选电压施加到一级导电元件时，这种配 置是优选的，主要作用为施加依赖于序列的栅电极电压的另一个栅电极。 在这种情况下，“酶”的概念可以比分子生物学中的严格意义更广泛，可以 是产生与DNA分子相互作用的可检测信号的任何分子，其可以直接或间 接与潜在的DNA序列相关。
图50说明了用于测量DNA序列的分子电子电路的另一种优选形式的 示意图。酶作为次级元件耦合到源电极和漏电极之间的一级导电元件，以 形成其中酶可以提供门控功能以及传导的电路。该电路包括用于测量电性 质的仪表，例如施加的源电极-漏电极和栅电极电压下的电流，或类似的系 统性质(例如恒定施加电流下的电压)。作为时间迹线的测量性质S(t)反 映了DNA的基础序列，这是由于酶对DNA的处理作用，以及在该处理期 间其作为电子成分的可变特性。
图51描绘了在更具描述性的优选实施方式中的图1的示意图，其具 有来自半导体装置的源电极-漏电极-栅电极几何形状，以及作为一级导电 元件的电极之间的分子桥，以及将酶耦合到桥的耦合点或共轭基团(作为 确保接近的一种手段)，和潜在电连接。
在教导了这些一般类别的分子电子测序传感装置后，我们现在教导特 定的优选实施方式和使用它们测量或表征序列的方法。
在一个优选的实施方式中，如图52所示，酶是聚合酶，并且DNA分 子是引发的单链，并且酶的进行作用是从溶液中的dNTP合成互补链。假 定存在含有dNTP的合适缓冲液，聚合酶延伸引发的单链DNA模板。掺 入过程(掺入A核苷酸，如图52所示)在测量的电流迹线中产生相应的 可识别特征，从而确定序列。监测被测量的电路参数，例如电流，并且可 以使用特定的迹线特征来检测掺入哪个碱基，从而以异步方式确定模板 DNA的序列。在一个优选实施方式中，在源电极-漏电极和栅电极的恒定 施加电压下监测电流。在另一个优选实施方式中，被测量的电路参数可以 是通过扫描源电极-漏电极电压或栅电极电压而获得的I-V特性，并且该 I-V曲线可以高频率重复测量，使得可以获得完整的I-V曲线，其中碱基正处于掺入过程中。在另一个优选实施方式中，对交流电脉冲的响应可以 用作测量的电路参数，该脉冲以足够高的频率执行以在所讨论的碱基正在 掺入时获得信息。
在另一个优选的实施方式中，如图53所示，当掺入产生可检测的信 号时可以进行测序，但不一定确定掺入的碱基的种类。在这种情况下，可 以依次添加仅含有一个碱基的试验溶液，通过洗涤/冲洗步骤分离，例如A 的试验，洗涤，C的试验，洗涤，G的试验，洗涤，T的试验，洗涤，并 且重复，并且在特定碱基试验期间观察到的结果信号表明掺入了一个或多 个该碱基，因此表明相应的序列。该试验过程以半同步方式无限期地重复 确定序列。
本文进一步公开的是上述两种测序方法的另一种变体，其中可逆终止 子核苷酸通过暴露于ddNTP双脱氧终止子溶液而在第一阶段中掺入，接 着是第二阶段，其中在随后的核苷酸暴露中继续电路感测，收集信号，虽 然核苷酸瞬时存在于聚合酶的结合口袋中，但由于存在终止子而未掺入。 这些暴露可以在所有dNTP的混合物中(当A/C/G/T存在于聚合酶结合口 袋中时具有可区分的迹线时是优选的)或在试验暴露于单独的A，C，G， T溶液时(优选的结合口袋中的停留信号在碱基之间不可区分时)进行。 在任何一种情况下，这些信号在口袋中正确配对的碱基与口袋中错误配对 的碱基之间的某些可检测方式上会有所不同，这反映了正确配对的核苷酸 在结合口袋中具有与错误配对的核苷酸不同的停留特性的事实，即使由于 终止子都不能掺入。通过在足够长的时间从这样的一次或多次暴露收集信 号信息，由于信号差异(例如袋内尖峰的持续时间)，实现了识别正确配 对的碱基。此时，通过反转反应除去终止子，并掺入下一个终止碱基，并 重复该过程。以这种方式，确定序列。因为可以在任意长的时间内收集数 据，所以通过累积足够多的区分信号，可以实现关于正确的下一个碱基的 任何期望的确定性水平。
在前述方法中，教导了可以使用类似的未靶向或靶向引发，如上所述， 以实现未靶向或靶向测序。
还公开了上述一般测序方法可以通过多种方法增强，如下所述。
核苷酸
如图54和图55中所示，修饰的核苷酸可用于产生可区分的或可检测 的信号，其增强掺入的检测，或区分在上述方法中掺入的不同碱基。特别 地，γ磷酸上具有基团的核苷酸可用于瞬时产生可区分的信号，其中增强 基团在聚合酶掺入过程中被切除。具体地，本公开教导了带电基团可用于 产生局部瞬态场效应门选，其增强所测量的电流信号强度或特征。本公开 还教导了可以以试验掺入方式使用具有可去除的可检测基团的核苷酸，并且在每次这样的试验掺入后，可以存在检测步骤，然后是去除可检测基团 的步骤。该公开内容教导这样的基团可以是带电基团，并且检测可以使用 电路的电检测特性，例如电流，或对特定施加电压，电压扫描或AC电压 的响应，可能存在不同的有助于检测的缓冲液，例如低电导率缓冲液，或 激活可检测基团的缓冲液。该公开内容教导了这种修饰的核苷酸也可以具 有终止子基团，然后测序过程可以通过合成的可逆终止子测序的方式进行， 在每次掺入和检测步骤完成后切割终止子和可检测基团。
此外，在所教导的方法中，可以制备不同的核苷酸以具有可区分的动 力学特征，使得由系统实时电参数监测的掺入动力学可用于鉴定每个掺入 的碱基。具体地，不同的动力学特征可能是由于溶液中不同核苷酸的不同 浓度，或者它们的修饰，其改变了掺入动力学。动力学特征可包括掺入尖 峰的高度或宽度，或掺入尖峰之间的时间间隔，如图56中所示。
图56显示了序列信息的动力学编码。掺入尖峰之间的时间表明碱基 被掺入，这里dNTP浓度的差异表明：A处于最低浓度，因此尖峰之间的 长时间表示A掺入的预期等待时间，而G处于最高浓度，因此，尖峰之 间的最短时间表示G掺入(第一间隔)。
酶
还公开了聚合酶可以通过蛋白质工程改造以增强产生的信号来修饰。 其一个优选的实施方式是在其表面上放置带电荷的氨基酸基团，当酶改变 构象并相应地改变局部电场结构时，其可以诱导电流波动。
电路参数
进一步公开了可以设置栅电极电压以最大程度地增强这些掺入或碱 基区分信号。我们教导所施加的AC电压或电压光谱或对特定施加电压波 形的响应可用于增强对掺入或碱基区分的检测。特别地，可以扫描栅电极 -漏电极电压和/或栅电极电压以在特定核苷酸(天然的或修饰的)驻留， 掺入中，已掺入或经历检测过程阶段期间获得系统的I-V特征。这种I-V 特征可以确定存在哪个或哪些碱基。
缓冲液
还公开了该方法中使用的缓冲液(通常含有盐和核苷酸)可以被优化 以产生信号。具体地，缓冲液可以基本上被稀释，例如以减少来自缓冲离 子携带的电流的噪声，或者增加德拜长度和电场穿透溶液的相应程度。在 这样的稀释缓冲液中，我们还教导了待掺入的dNTP可以与镁预先络合， 以增加它们对聚合酶的可及性，同时在溶液中保持相对低浓度的镁离子。
桥
图57和58显示了其他优选实施方式。图57说明了桥的优选实施方 式，其包括通过硫醇键(DNA末端的硫醇化核苷酸或位于α螺旋末端的 半胱氨酸)与金触件耦合的螺旋聚合物(dsDNA或蛋白质α螺旋)，并且 具有特异性合成的内部生物素，用于耦合与酶缀合的链霉亲和素。图58 说明了桥的另一个优选实施方式，作为IgG蛋白(天然的或工程化的)， 其对电极上的接触点具有特异性亲和力(对一级接触点材料的亲和力，或 表面的抗原衍生化)，通过IgG特异性结合蛋白(例如抗IgG抗体，或蛋 白A或蛋白G)耦合，其与目标蛋白质缀合，或者目标蛋白质可以使用天 然或工程化的缀合位点直接与IgG缀合。桥分子是双链DNA分子，通过 分子末端的硫醇化核苷酸与电极上的金接触珠耦合。通过使用DNA内部 的生物素化核苷酸实现耦合，其可以与链霉亲和素缀合，链霉亲和素又可 以与聚合酶缀合。类似地，桥可以是蛋白质α-螺旋，否则类似地耦合和连 接。桥的另一个优选实施方式是IgG抗体分子(天然的或工程化的)，对 源电极和漏电极上的接触点具有合适的特异性亲和力，并且具有由与聚合 酶缀合的IgG结合蛋白(例如抗IgG，蛋白A或蛋白G)介导的耦合，如 图58所示。
重复和整合
如图59中所示，可以整合从利用上述不同特定实施方式执行的独立 测序运行获得的数据，以从部分获取的信息产生完整的测序信息。图59 显示了使用所述方法的不同实施方式对来自相同(或复制)DNA模板的 重复测序的部分序列信息的组合，以获得完整信息。蓝色迹线表示来自每 个单独示例的部分信息，相对于组合信息的灰色迹线(在单次测序运行中 不能直接观察到)。在此指示，对模板进行测序(左实施方式)以产生部 分信息(显示，仅可检测A碱基)，并再次(右实施方式，指示桥和酶的 变化)，以产生互补或辅助测序信息(显示，检测到G，T，C)，然后将 其组合以获得完整序列。两个测序实施方式可以使用复制模板在物理上或 时间上隔离和独立，或者可以是在不同时间的相同传感器系统的不同状态 -可能由缓冲液变化，温度变化或诸如栅电压的施加电压的变化产生-重读 相同的模板。任何数量的这种互补实施方式可以将它们的信息组合以改进 最终序列确定。在一个优选的实施方式中，这可以是相同的传感器-DNA 缀合物，但是在不同的系统条件下，例如缓冲液，dNTP，温度，施加的 电压，监测的电路参数，计量过程的变化等，其中DNA模板以某种方式 重新读取(剥离并重新延伸，通过环形或发夹模板读取以再次询问相同的 链，或互补链)。在另一个优选实施方式中，一个装置制造商可以包含集 成在单个芯片形式上的多种传感器(不同的桥分子，酶等，或者，在一个 优选实施方式中，不同的施加电压)。应用多种重复模板(克隆或PCR 重复)，使得不同的传感器并行地询问它们各自的DNA拷贝。然后整合 这些独立的传感器测量值以获得所研究模板的完整测序信息。在一个优选 实施方式中，传感器的受控特性可基本相同，并且多样性仅提供平均输出 噪声或传感器特性和性能的不受控制的变化的手段。在另一个优选的实施 方式中，具有互补检测能力的不同桥和修饰的酶可以部署在一个芯片上， 暴露于相同的模板，以及测序化学中的相同的一级溶液，以并行产生互补 信息。在另一个优选的实施方式中，所述传感器保留其模板，其在不同的测序运行中，在不同条件下(缓冲液，温度，施加电压，电路计量，dNTP 或dNTP的混合物(天然的或修饰的)的浓度)适当地读取多次(通过剥 离延伸链，或使用圆形或发夹模板)，或不同的测序方法，以产生部分序 列信息的互补采集的一系列时间，其可以被整合以实现更完整的序列信息。
还公开了诸如上述的系统还可以区分DNA链中存在的各种修饰的核 苷酸或碱基类似物，例如图48的甲基化碱基。
在上述方法中，掺入步骤可涉及与获得的信号无法区分的核苷酸，从 而部分确定的序列信息结果(例如，所施加的dNTP混合物可含有核苷酸 的子集，例如{A，T})，和掺入峰值将因此表明掺入该子集的成员。这可 以产生部分序列信息。这些信息可以通过如上所述的重复测序以互补的方 式(不同的核苷酸子集)组合，以进一步确定与不同的部分观察相容的基 础序列。
分子指纹识别
上述方法，例如部分或单独基于可区分的掺入尖峰，可用于进行长程 分子指纹识别。在本申请中，可以采用任何产生局部测序信息的方法，以 产生一段局部测序信息。然后，添加所有四种dNTP，并允许系统自由掺 入一段时间，在此期间检测并计数掺入尖峰，以提供该掺入阶段跨越的碱 基数量的量度。然后，例如通过冲洗dNTP缓冲液来阻滞该阶段，并且恢 复局部测序方法，以确定另一个局部序列特征。可以在长DNA模板的跨 度上重复该过程。得到的序列内容(Si)和它们之间的基本距离估计(di)， 作为列表，{S1，d1，S2，d2，S3，d3......}形成识别DNA片段的总体结构 的指纹。该信息可用于重叠片段集合的大规模结构映射，或用于相对于给 定参考基因组的这种映射。
其他优选的实施方式，其中酶可以是RNA聚合酶或逆转录酶，具有 正在测序的相应DNA或RNA模板。
信号处理和序列分析算法
可能需要信号处理方法根据所获取的信号确定序列。这可以包括使用 训练或校准训练数据的分类器系统的训练或机器学习，以及使用各种去卷 积或分类或隐马尔可夫模型来确定或限制基础序列。该公开内容教导了这 些方法通常是整个序列确定过程的整体部分。在优选实施方式中，这包括 用于对特征进行分段，以及将特征与噪声区分/分类的信号处理方法，以及 与其他候选序列元素相关联的特征之间的信号处理方法。该过程可以包括 从分段信号中提取参数，包括诸如尖峰之间的时间，尖峰高度，持续时间 以及诸如分段信号内的子特征的特征的参数。然后，最终序列确定分析可 以进一步包括将处理后的信号去卷积或拟合到基础序列的模型，并寻找最 拟合数据的模型，以及向这样的拟合分配置信水平或几率的算法。特别是， 分析的一个优选实施方式，其中可以进行预处理以对原始信号进行去噪， 并对原始信号进行分段，以及对原始信号进行归一化，然后通常存在从基础测序产生信号的模型，并且分配了观察到的数据来自基础测序候选者的 几率。然后可以确定最大似然序列。在另一个优选的实施方式中，序列预 测可以定义为测量观察到的信号和预测信号之间的差异的成本函数的优 化，并且优化理论的方法可以用于有效解决这些基础序列的制剂。
上述方法可以测量比完整序列信息量少的DNA的某些性质，例如片 段的长度，或部分序列信息，或可用于将DNA模板分类为几个可能的序 列组之一的信息。这包括单碱基测序或基因分型应用。这还包括片段长度 分析，例如用于微卫星标记分型或键入插入缺失多态性。
如此获得的序列信息可以从相同DNA分子的多个试验或其复制品中 组合，以滤除错误并确定基础序列。我们教导可以去除第二条链，并重新 排序相同的分子，以通过组合这些数据来提高准确性。我们教导如果DNA 分子是圆形的，可以通过线性读取重复测序，以提高准确度，如果它具有 发夹形式，则可以线性读取两条链以获得正向和反向序列信息以提高准确 性。测序技术领域的技术人员已知的这些和其他此类方法与本发明相容。
酶可以是连接酶，检测DNA寡核苷酸的连接并用于获得序列信息， 或对序列进行分类。可以使用多轮连续连接来确定序列，无论是在同一分 子上连续进行还是在不同轮次中进行。通过上述各种方法可以增强连接的 信号。
酶可以是外切核酸酶，如图60中所示，其中碱基的数量或种类在它 们被加工和释放时被检测到。通过上述各种手段可以增强切除或碱基区分 的信号。图60说明了其中酶是外切核酸酶的实施方式。通过酶构象，DNA 构象和释放的核苷酸对电路参数的影响产生信号。
在其他实施方式中，酶可以是解旋酶，如图61中所示，并且当它们 通过解旋酶时检测碱基的数量或种类。通过上述各种方法可以增强切除或 碱基区分的信号，包括特别是通过修饰包含DNA的核苷酸，或对解旋酶 的工程化改变，图61说明了进行性酶是解开双链DNA模板的DNA解旋 酶的实施方式。
酶还可以包含蛋白质纳米孔，如图62中所示。图62说明了一个实施 方式，其中酶是由蛋白质纳米孔和具有DNA易位能力的运动蛋白酶形成 的复合体。具体地，它可以是具有DNA易位功能的进行性酶(例如解旋 酶，聚合酶或病毒运动蛋白)和蛋白质纳米孔的复合体。在该实施方式中， 系统电流或其他电参数或响应的变化反映了正穿过纳米孔的碱基。解卷积 方法可用于重建基础序列。如果在这种情况下DNA是环状的，则可以重 复读取相同的分子以提高准确性。通过上述各种手段可以增强碱基区分的 信号。
测序化学领域的技术人员也理解如何组合本发明的许多上述要素以 产生改进的测序结果。
所有上述方法可以在传感器阵列集成电路芯片上进行，如图63所示， 大规模并行方式包含这种传感器阵列并支持测量电路和数据读出电路，以 实现对在大规模可制造设备上的许多DNA片段进行大规模平行测序。图 63显示了集成芯片传感器阵列装置。这种形式提供了一种同时从多个序列 中大规模并行检测序列的方法，以及在每个位点部署不同或相同的传感器 构造的选项，用于对序列数据进行稳健的平均或数据整合，以便复制单个DNAS片段。特别地，整个传感器可以是具有10nm尺寸的纳米级装置， 并且如果需要，可以使用14nm或更低的CMOS半导体节点在本地集成支 持测量电子器件，从而允许芯片上的高密度集成传感器阵列。这可以在标 准尺寸的单个芯片上实现多达10,000,000个传感器(即单步进曝光区域)。 此外，如果以这种形式应用克隆或复制的DNA分子群，针对可以如上文 和图59中所述的多样或相同的传感器阵列，使得可以将相同分子的多个 读数组合以滤除测序中的错误，以产生准确得多的测序结果。
传感器阵列上的多位点分析
可以将在多个位点引发的长单链DNA片段引入到这样的传感器阵列 中，并且使用任何所述的测序方法，由聚合酶在不同传感器位置捕获的多 个引发位点处开始测序。这提供了从长片段同时获得多个测序读数的新方 法。这既可以加速读取这样的片段，又可以提供可用于组装片段的长程结 构的信息，例如变体的定相，或单倍型分型，或大规模结构分析。
终止子测序
终止子测序，其中提供双脱氧终止子ddNTP和dNTP的混合物，使得 来自dNTP(天然的或修饰的以增强信号)掺入的掺入信号尖峰沿模板提 供碱基位置的计数(位置1，2，3，...，L，其中L是碱基中的模板长度)， 直到掺入终止子(天然的或具有添加的检测基团)。然后通过检测程序询 问所述终止子，所述检测程序可以是相同或者不同形式的感测，例如使用 不同的检测缓冲液，温度，或者在优选实施方式中，使用电压扫描或波形 或AC响应或I-V特征以鉴定存在的ddNTP，从而沿模板鉴定指定位置的 碱基。通过组合来自许多这样的测试运行的数据，优选地在如图63中的 传感器阵列芯片上平行执行，提供复制的模板，并且组装结果，可以确定 在每个可能的碱基位置处的碱基种类(1，2，3，......，L)从而确定整个 序列。在终止子测序的另一个优选实施方式中，如图64B所示，可以与仅 与ddATP终止子混合的dNTP进行单独的反应，并且每次这样的运行将鉴 定模板中A碱基的位置，其中反应通过随机掺入ddATP而不是dATP来 终止。执行许多此类运行将鉴定模板中所有A碱基的位置。这优选地在传 感器阵列芯片上的单个平行反应运行中完成，以在一个平行反应中累积所 有这样的A终止数据。类似地，分别进行C-，G-和T-终止的单独反应， 以分别确定这些碱基在模板中的位置，并且所有这些单碱基终止结果的组 合将确定整个序列。图64A说明终止子测序过程中的试运行。在存在dNTP (蓝色)和双脱氧终止剂，ddNTP(紫色)的混合物的情况下，进行聚合 和感测，产生掺入尖峰，用于计数所示的碱基位置(所示的位置8)，直至终止子随机掺入。在反应结束时，进行传感测量，以识别终止子碱基(在 这种情况下为A)。因此，基础序列在位置8处具有A。通过在该模板， 或复制模板上重复这样的测量，并合并信息，可以确定沿模板的所有位置 处的完整碱基序列。
其优选实施方式是使用四个传感器阵列芯片，分别专用于A-，C-， G-和T-终止反应，如图64C所示，以高效地确定基础模板DNA的序列， 每个阵列运行一次高水平反应。
通过杂交测序
进一步公开了通过杂交测序，使用传感器构建体的特殊情况，其中附 连的分子不是酶，而是DNA杂交探针，系在桥上，或者在另一个优选的 实施方式中，探针作为桥的全部或部分起作用，如图65和66所示。最通 常地，桥复合体包括可用的杂交探针，并且存在许多可能的实施方式。在 这种情况下，传感器信号表明是否发生了与靶DNA单链的杂交。如在通常已知的通过杂交过程的测序中，基于许多这样的测量-探针与靶DNA杂 交或不杂交的聚集数据-优选地在诸如图63中的传感器阵列上平行进行- 可以用于推导出哪些可能的基础序列与数据最相容，直至完全确定模板序 列。在该过程中，可以通过延伸反应增强信号，如图67所示，其中酶促 延伸可以包含在包含增加可检测信号的基团上掺入一个或多个碱基。另外， 可以使用栅电极电压来施加电子严谨性以区分/去稳定不正确配对的杂交， 从而减少错误的杂交检测。严谨性也可以基于记录的信号，其可以区分完 美配对和不完美配对，以消除错误的杂交检测。进一步教导的是，还可以 应用本领域技术人员已知的增加严谨性的多种方法，例如使用发夹构型， 由RNA或核苷酸类似物(LNA，PNA等)制成的探针，使用肌苷或其他 通用结合探针碱基，以及酶促加工如聚合酶延伸或连接作为特异性测量。 在芯片形式中，可以平行进行杂交测序。探针杂交与芯片上探针的组合， 结合在溶液中施加的组合的可检测的，可区分的杂交探针组，或已级连接 探针的可测序延伸的一些碱基的结合/连接，可以进一步扩展该方法的测序 能力，即获取更多序列信息的能力。我们还教导了通过在所述探针上包括 可检测标记，或通过组合结合过程解码探针上的结合条形码，可以解码和 鉴定在芯片上匿名放置的杂交探针。具体地，探针可携带组合DNA条形 码，可通过一系列可检测的寡核苷酸杂交解码。探针可以携带光学标签或 条形码，通过先前的光学成像过程解码。我们进一步教导传感器位点的电 子寻址可用于以定向方式沉积杂交探针，从而将已知探针置于所需位点。 我们教导可以使用电压来加速杂交过程，特别是可以使用栅电极电压将游 离DNA模板吸引到探针上，提高杂交速度，并减少所需模板的量。
还公开了使用具有上述分子指纹识别化学的阵列来进行长片段的大 规模平行指纹识别，用于针对参照的结构组装或从头结构组装。
上述过程中使用的探针分子或酶可以通以天然形式，或通过工程改造 修饰，或通过缓冲液的特性(例如诱导的酸或碱)进行电子控制，以实现 或增强它们与DNA的相互作用，或禁用或禁止该相互作用。具体地，这 可能受到例如栅电极电压的影响。我们进一步教导这可以更快地收集数据， 或者在更眼睛(更好的信噪比)条件下收集数据，并且以任何一种方式增 加每单位操作时间收集的净信息量。具体地，在阵列设置中，阵列上的不 同传感器探针或酶的不同电子控制可用于收集多种互补信息，这些信息可 为所讨论的序列或序列性质提供整体更大的信息量。例如，如果电子控制 可以加速或减慢酶处理，则不同的传感器可以更快地处理到片段的不同区 域，然后专注于更准确的局部信息，以沿着提供给传感器阵列的长模板的 长度重复获得更准确的评估。
可以使探针分子在电控制，例如栅电极电压下释放它们的DNA模板。 这可以用于基于获取的测序信息保留所需的片段，并通过从系统释放和冲 洗它们来排出不需要的片段。随后可以从环境溶液中释放和收集所需的片 段用于其他用途，例如更广泛的测序，或通过子序列分析确定可能存在的 修饰或损坏的碱基。这种后续分析可以通过现有手段或其他手段如质谱法 进行。例如，在分析来自癌细胞的DNA，研究已发生的DNA损伤，或研 究在特殊环境(例如神经元细胞或干细胞)中发生的DNA修饰的背景下， 这可能是有意义的。
液体转移和处理
所描述的各种测序方法需要使用一种或多种缓冲液。在这种情况下， 我们教授了几种有效使用这些装置的方式。我们教导将传感器或传感器阵 列放置在流动池中，并使用微流体系统将缓冲液泵入和泵出池。我们还教 导将传感器或传感器阵列芯片本身在不同缓冲容器之间转移，将其浸入每 个缓冲容器中，以实现比泵系统更快速的流体交换。
微孔分离
在这种液体转移的一般考虑的特殊情况下，其也能够实现额外的检测 方法，我们还教导了阵列中的各个传感器可以存在于它们自己的微孔凹陷 (即具有微尺寸容量的孔)中，或者每个微孔中多个这样的传感器，并且 整个传感器阵列包含在大量这样的微孔中，如图68所示。使用单个宏观 覆盖/揭开或密封/开封过程来密封和开封这些孔以同时进行处理和液体转 移。优点是在密封的微孔中，反应物和反应产物被定位并且不会损失到大量流体中，此外任何这样的被捕获的分子在邻近封闭的传感器中重复通过， 这可以促进需要反应物积聚的不同类型的传感反应以在局部产生电子可 检测信号，或者要求给定靶标多次从同一传感器接合和脱离以获得可检测 信号。或者，初始触发分子可能导致信号分子的级联产生，其必须在局部 随时间累积。具体地，如果一级测序反应释放分子(例如聚合酶延伸，释 放H，焦磷酸盐和附连至γ磷酸盐或外切核酸酶的标签，释放下一个碱基 被截断)，这可能是有用的，并且分子传感器包含检测此分子，此类分子 的累积，或由触发分子产生的分子级联所需要的探针。图68显示了封装 在微孔或纳米孔中的传感器，其可以在整体/宏观过程中密封和未密封。这 使反应物和反应产物定位，以促进其他检测模式。这也可以从每个孔的多 种传感器类型或每个传感器的多个探针分子中受益，使得进行性酶可以与 探针一起存在以检测反应产物。
在各种示例中，三端分子电子传感器包括一级源电极和漏电极以及场 效应栅电极，其中探针分子耦合在源电极和漏电极之间或探针分子耦合到 耦合在源电极和漏电极之间的桥分子，并且其中探针分子参与与核酸聚合 物的可检测的相互作用，其中检测包括监测电路参数。在各种示例中，相 对于一组候选序列元件，可检测的相互作用可以与相互作用的核酸聚合物 的序列组成相关。例如，聚合物可以是DNA或RNA的形式，并且候选序 列元件组对于DNA可以是{A，C，G，T}或对于RNA可以是{A，C，G， U}。
在各种实施例中，候选序列元件可包括修饰的核苷酸，并且相关的测 序过程由此鉴定DNA模板中的修饰的核苷酸。修饰的核苷酸可含有各种 形式的甲基C，例如5-甲基-C，并且相关的测序过程由此鉴定DNA模板 中的这些修饰的核苷酸。
在各种实施方式中，探针分子是酶，或DNA或RNA杂交探针。后两 个实施方式的优选构型示于图66。作为示例，探针分子包含DNA聚合酶， 例如Phi29或其突变体，或Pol I或其突变体。
在各种其他非限制性实施例中，探针分子可包含逆转录酶，连接酶， 核酸外切酶，易位DNA的酶，解旋酶，蛋白质纳米孔，与易位酶复合的 蛋白质纳米孔，或核糖体中的任一种。
在非限制性实施例中，桥分子可以是例如双链DNA，蛋白质α-螺旋， IgG抗体，对源电极和漏电极上的接触点具有特异性亲和力的IgG抗体， 或工程改造以为对源电极和漏电极上的接触点具有特异性亲和力的IgG抗 体模板。
在各个方面，耦合到源电极和漏电极的接触点是通过金触点(例如金 珠)和桥分子中的含硫醇基团之间的硫醇-金键。在更具体的示例中，内部 偶合点可以通过桥分子中的生物素，链霉亲和素(天然的或修饰的)和与 链霉亲和素缀合的探针分子。
在多步骤原位组装过程中，可以通过电参数监测传感器元件的组装。 例如，所监测的电参数可以是以下任何一个：在施加的源电极-漏电极电压 和栅电极电压下的源电极-漏电极电流；施加的源电极-漏电极电流下的源 电极-漏电极或栅电极电压；施加的源电极-漏电极电压和栅电极电压下的 源电极-漏电极电流；I-V特性，当源电极-漏电极电压和/或栅电极电压扫 过一系列值时；以及施加到源电极-漏电极或栅电极的相对于施加的电压波 形的电流响应。
在其他方面，探针分子可以是聚合酶，由此可检测信号是通过一系列 核苷酸试验流监测的掺入信号，以确定与聚合酶结合的引发的单链DNA 分子模板的序列。在更具体的示例中，修饰聚合酶以增强掺入信号。同样， 可以修饰核苷酸以增强掺入信号。
在各个方面，探针分子是聚合酶，并且可检测信号是掺入信号，其也 区分不同的碱基，并且在系统暴露于dNTP的混合物时监测该信号以确定 序列。此外，可以修饰聚合酶以增强掺入信号，并且可以修饰核苷酸以增 强不同碱基掺入的可区分信号。
在各种示例中，传感器可用于区分(除了{A，C，G，T}之外)模板 中存在其他修饰碱基，例如5-甲基-C。
在其中探针分子是聚合酶的示例中，可检测信号可以是掺入信号，并 且这可以用于进行终止子测序反应，并且针对每个不同的终止子-A，-C， -G，-T，从而组装模板分子的序列。例如，电测量可以区分四种不同的终 止子，并且终止子测序通过组装许多轮终止子混合物的结果以及终止子的 鉴定来进行。
在其他示例中，探针分子包含DNA或RNA杂交探针，并且来自多种 此类探针的DNA相互作用信号可用于对重复向相应反应提供的DNA片段 进行测序或分类。
在各种示例中，可以部署传感器阵列形式。例如，1,000个或更多个 这样的传感器，或10,000个或更多个这样的传感器，或100,000个或更多 个这样的传感器，或1,000,000个或更多个这样的传感器，或10,000,000 个或更多个这样的传感器，或100,000,000个或更多这样的传感器的阵列。 部署可以在包括CMOS传感器电子器件的芯片上。这种芯片系统可用于通 过平行收集大量探针和DNA相互作用的可检测信号并聚集该信息来对 DNA进行测序。在这些不同的实施方式中，芯片系统可用于进行大量DNA 分子的大规模平行测序，或通过各种终止子测序反应对重复提供的DNA 片段进行终止子测序，每个都以大规模平行方式应用于四个不同的芯片， 或单个芯片上串联的四个反应。
芯片系统可用于通过各种终止子测序反应对重复提供的DNA片段进 行终止子测序，每个终止子测序反应以大规模平行方式应用于四个不同的 芯片上，或者在单个芯片上串联的四个反应进行，以达到必需数量的每种 类型的个体反应。芯片系统可用于通过在单个芯片上以大规模平行方式进 行的各种终止子测序反应来进行对重复提供的DNA片段的终止子测序， 以达到必需数量的个体反应。芯片系统可以与作为概述的测序方法结合使用，以及如所概述的掺入检测信号，以产生应用于阵列的片段的分子指纹 识别，从而共同实现从头片段组装或针对参考的组装。
在这些各种芯片系统中，探针可以是DNA杂交探针的集合，其足以 提供信息以通过在片段上杂交进行测序。探测器标识可以以组合方式编码， 其可以通过一系列解码反应进行解码。例如，解码反应可以包括针对杂交 标签库的杂交反应，并且使用可观察的电路参数通过电子检测杂交信号来 读取所述反应结果。
在一些示例中，探针可以是DNA杂交探针的集合，其足以提供信息 以通过在片段上杂交进行测序，并且将所述片段重复施加于阵列以确定其 序列。
在各种实施方式中，缓冲液修饰或条件可用于改善任何前述实施例中 的信号检测，例如更稀/低离子强度的缓冲液。
可以在基于芯片的传感器阵列上使用多种传感器以制造如上述测序 方法中的补充测量，其进一步组合以实现更高的聚集精度。具体地，当一 个DNA片段以重复方式提供给阵列时，来自阵列上的独立传感器的信息 用于以更高的准确度确定该片段的序列。可以通过桥结构的多样性或修饰 的探针分子的多样性来提供传感器的多样性。在各个方面，传感器的多样 性是通过阵列上的传感器的配置和操作条件的随机(不受控制的)多样性， 并且该信息的聚合构成了去除这种噪声以获得更准确的序列的方式。
在探针分子是聚合酶的示例中，可以以具有不同动力学特征的方式制 备和提供核苷酸，从而提供可检测信号。不同的动力学可能是由于溶液中 不同浓度的核苷酸，并且特征包括掺入信号之间的时间。
在各种实施方式中，传感器的酶是外切核酸酶，并且可以用修饰的碱 基制备DNA模板以增强检测，并且可以进一步修饰核酸外切酶以增强所 述核苷酸的这种检测，并且在外切核酸酶依次切割碱基时获得测序信号。
在各种示例中，探针分子(天然的或修饰的)具有电子控制的能力， 从而可以启用或增强或抑制或禁用其与DNA的反应。例如，就启用或增 强或抑制或禁用其持续合成能力而言，探针分子可以是可以电子控制的酶， 并且这用于提高所收集的序列数据的信息量。具体地，在芯片传感器阵列 形式中，这允许平行获取这种不同获取的测量的多样性，以增加整体信息 量。具体地，在聚合酶的情况下，这可以用于更快地沿模板移动单个聚合 酶，以达到然后减慢并询问施加于所有传感器的长的复制片段的更远的区 域。
在各种实施方式中，可以设置栅电极电压以改善信号检测。
在关于通过杂交测序的实施例中，可以应用电子控制来改善性能，例 如电压驱动的探针附近的模板DNA浓度以加速杂交，基于电压的严格性 以排斥不正确配对的杂交体，或电压循环严格性以退火正确杂交的片段， 或施加的电压，其以区分正确杂交与错配或不适当杂交的方式改变检测到 的信号。
在各种实施方式中，DNA/RNA模板可以电子方式保持或释放，并且 基于序列测定，保留某些片段，释放并除去其余片段，并将保留的片段释 放并捕获在溶液中用于后续使用或另外的分析。
在一些示例中，使用可逆终止子碱基来提供终止反应，以允许更广泛 的电子鉴别感测的时间，以识别所讨论的终止碱基，然后除去终止子并重 复该过程至所需数目的待测序碱基。例如，可逆终止子可以用于通过引入 一种或多种试验核苷酸dNTP混合物使得能够探测下一个碱基，通过终止 子，并且获取由于在正确配对和不正确配对的碱基之间的结合口袋中产生 的瞬时信号中可检测的差异而允许确定下一个碱基的信号数据，然后除去 终止子，并引入另一个可逆终止子以使该过程进入下一步骤，并重复该过 程至所需数目的待测序碱基。
可以使用的引物是不可延伸/终止子引物，并且其中的询问用于进行单 碱基测序，以获得引物后第一碱基的种类。
在各种示例中，酶可以是聚合酶，其用途可以是在引入模板之前用于 引发模板的靶向引物，或者在桥或聚合酶分子上固定的这种引物，以实现 原位靶向测序，可能没有单独的靶向反应步骤。本文中，这些引物可以是 标准寡核苷酸引物，或亲和力增加的引物，或通过重组酶增强的引物，后 者用于引发双链DNA。
在芯片阵列系统中，可以使用在多个位点引发的长DNA分子并将其 引入阵列以由多种聚合酶捕获，并进行多个同时测序反应，或用于确定连 续长DNA分子的变体定相，单倍型，或结构。
在一些示例中，微孔腔室内的多个分子传感器可以设置在芯片上，芯 片上具有大量这样的微孔，并且单个宏观过程以使独立包含的反应和检测 可以在封闭的孔内发生的方式密封和开封这样的孔。这使得许多信号检测 方式成为可能，其中分子传感器探针分子检测由进行性反应本身(聚合或 外切核酸酶)释放或产生的副产物分子，或随后源自这些一级分子的分子 级联分子。
微流体系统和流动池向传感器或传感器阵列提供所需的反应混合物 和缓冲液。
在芯片阵列系统中，芯片可以直接在反应缓冲液的不同容器之间转移， 以实现对测序过程中使用的不同缓冲液的快速暴露。
在其中探针分子是聚合酶的实施例中，这些实施例提供了链置换聚合 酶，结合环化模板或适用于发夹的模板的用途，以便实现读取两条链，或 重复读取相同链以对相同模板产生多次读取以提高准确性。此外，相同模 板的剥离和重新测序可以直接实现相同的目的。
实施例8给出了构建基本传感器的实验结果，其性质，以及它在几种 重要应用设置(例如均聚物长度，单碱基测定，甲基化和长读取)中观察 聚合酶掺入信号的应用。这个示例确定了关键应用程序的付诸实施，并为 其他应用程序可以类似地付诸实施的前提提供了强有力的基础。该示例列 出了，例如，图中所示，分子传感器结构，电测量设置，电极图像，传感 器芯片图像，芯片钝化，流通池，芯片封装，传感器的I-V特性，传感器 自组装的电观察，均聚物DNA中离散聚合酶掺入事件，单碱基检测信号， 甲基化DNA检测和长读取能力的结果。
确定DNA序列是一个至关重要的测量过程。
图69说明了用于该实验工作的分子结构。图69显示了通常用于实验 工作的桥和探针分子结构的细节。在这种情况下，桥是双链DNA分子， 显示20nm长度(60个碱基)，在两个5'末端都具有硫醇基团，用于耦合 金属电极上的金触件。探针分子是聚合酶，这里是大肠杆菌Pol I，与链霉 亲和素蛋白化学交联，链霉亲和素蛋白又与合成DNA寡核苷酸中的生物 素化核苷酸的桥接耦合。图69显示了分子和原子的六个比例。
现在参考图70，显示了用于分子传感器上的电测量的测试装置的示意 图。在图70的上部，显示了电极-基材结构的横截面和附接到分析器，用 于施加电压和测量通过桥分子的电流。在图70的下部，显示了用于桥接 电路的电极阵列的透视图。每对电极在金属-1电极(其是不相似的金属) 上具有金属-2接触点。在本实验中，接触点是金珠或金涂覆的电极尖端， 其支持硫醇化分子通过硫醇-金结合自组装到位。
图71A，71B和71C显示了各种放大水平的电极的电子显微镜图像。 图像是带有金金属点触件的电极，用于桥接。电极位于硅基材上并通过电 子束光刻产生。图71A是电极阵列的EM图像。其中，电极是钛，带有金 点触件。图71B是特写的EM图像，其显示7nm的电极间隙和具有15nm 金-金间距的金点触件。图71C是特写的EM图像，其显示在电极的尖端 处显示大约10nm的金点。
图72显示了电极测试芯片架构。在这种情况下，使用电子束光刻在1 cm硅基材上形成电极阵列。图72中的三个SEM图像系列显示了以增加 的分辨率的20个电极对，低至电极间隙的10nm尺度。
图73显示了在装置上使用钝化层以保护电极免受溶液影响。在这种 情况下，钝化层是氧化硅。钝化中的开口暴露纳米级的电极区域，和10 微米级的电接触垫。
图74显示了用于支持液体溶液受控地暴露于传感器芯片表面的流动 池。在这种情况下，流动池包括模塑的PDMS聚合物。
图75显示了固定在芯片运载体中用于电测量的芯片。
图76列出了组装的传感器复合体的导电性的表征。图76显示在湿(稀 盐缓冲液)和干(空气)条件下测量的DNA桥分子和完整的传感器复合 体(与聚合酶桥接)的电流-电压(IV)特征，以及空气、水和稀盐缓冲 液中的开路电极的对照。图76显示桥和传感器复合体在1伏的施加源电 极-漏电极电压下传导大约100mpico-Amp电流。通过SMU在半导体参数分析仪上进行测量。
图77显示了对具有金点接触电极的分子传感器自组装的电子监测。 电流对比时间的测量用于监测桥和分子传感器复合体的自组装过程。图77 的左上曲线显示：第1阶段：双链DNA桥组装，5'末端的硫醇基团组装到 电极金接触点上，如电流跳跃所示。图77的右上曲线显示：第2阶段： 聚合酶-链霉亲和素复合体与dsDNA桥上的生物素化位点结合，如电流跳 跃所示。图77的右下曲线显示：第3阶段：引发的单链DNA模板与聚合 酶结合以完成复合体，如电流对比时间中的尖峰所示。
图78提供了最终组装的图像。在较高分辨率图像中，桥复合体在没 有任何标记的情况下直接可见，被视为连接电极的模糊高对比度区域(由 绿色箭头指向)。
图79是用传感器测量掺入信号的四个图。图79中的曲线显示了由向 其提供各种引发的单链DNA测序模板和用于掺入和聚合的dNTP的传感 器产生的电流信号。在每种情况下，主要信号尖峰代表来自离散掺入事件 的信号，其中聚合酶向延伸链添加另一个碱基。在图79的左上部分的图 中，模板是20个T碱基；在右上方的图中，模板是20个G碱基；在左下方的图中，模板是20个A碱基；在右下方的图中，模板是20个C碱基。 观察到的近似掺入速率为每秒10-20个碱基，与标准酶动力学一致，除了 由于速率限制因素(例如较低的dNTP浓度)导致的每秒约1个碱基的较 低速率。
图80是从单碱基掺入事件产生的信号的特写。在这种情况下，该信 号具有双峰结构，除了检测掺入事件外，还可用于帮助鉴定碱基。
图81提供了显示甲基化碱基的电感测的图。图81证明了传感器用于 感测模板中甲基化状态或单个甲基化碱基的潜在用途。该图显示了由模板 的未甲基化对比甲基化部分(绿色迹线)产生的不同信号。更高的信号来 自未甲基化部分，而不是甲基化部分。所示实验由测量所示传感器芯片上 所示模板序列的一系列不同溶液添加物的迹线组成。dCTP流产生单碱基 掺入峰，然后添加dGTP使得掺入能够穿过模板的CG道行进，突出显示 甲基化对比未甲基化模板的信号差异。
图82显示了传感器的长读取能力。该图显示了读取或分析长DNA片 段的潜力，这对于数据的长程连续性很重要的应用而言是重要的，例如全 基因组序列的从头组装。DNA模板是5.4kb PhiX病毒基因组。在左图的 电流对时间图中，来自模板的低时间分辨率读取(dNTP混合物)的差异 信号，对比没有聚合的后续对照(终止子ddNTP混合物，聚合酶活性被阻断)。右边的SEM图像显示了可见长模板DNA的电极。
实施例9
具有肽桥传感器的分子传感器检测用修饰的dNTP的碱基掺入信号
传感器的另一个优选实施方式利用蛋白质α-螺旋作为桥接分子。蛋白 质α-螺旋是有利的结构，因为它们相对刚性，已知允许电子转移和电流传 导，并且它们可以合成为具有原子级精确结构规格的肽并具有用于自组装 的耦合基团。这种肽α螺旋桥和相关传感器在图83A和83B中显示。在 该实施例的实验工作中使用的特定肽是具有以下66个氨基酸序列的肽：
CAEAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAA{Lys-Ahx-Biotin}EAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARC(SEQ ID NO:14)
其特征在于基于基序EAAAR的重复序列的61-氨基肽，已知其有利 于肽的α-螺旋结构。末端的半胱氨酸氨基酸提供与铬电极上的金触件的硫 醇-金耦合。将置于肽中的中心赖氨酸修饰为在Ahx(六碳线性氨基己酸) 接头上包含生物素，以支持中性亲和素蛋白的耦合目的的结合。来自肽的 α螺旋长度约为9nm。聚合酶通过已知的马来酰亚胺-半胱氨酸共价结合 反应，通过与聚合酶上的表面半胱氨酸结合的生物素-马来酰亚胺基团与中 性亲和素耦合。
图83A显示了具有肽α-螺旋桥的该实施方式，使用所提及的66个氨 基酸序列肽付诸实践。图83B显示完全组装的传感器，其包含通过已知的 生物素-中性亲和素结合反应与中性亲和素耦合的α螺旋桥，以及通过与 聚合酶上的表面半胱氨酸耦合的其他生物素-马来酰亚胺接头(通过已知的 马来酰亚胺-半胱氨酸共价耦合反应)附连的聚合酶。
在图85A-D中显示了该实施方式的实验上付诸实践。如在其他示例中 那样，通过电子束光刻制造具有20个电极对的测试芯片。电极是铬，沉 积金层以与肽桥耦合。在桥沉积之前立即在氧等离子体清洁器中清洁芯片 240秒。将肽桥与PBS缓冲液中的芯片以1μM浓度孵育1小时。随后， 在PBS中，测量电极的电流-电压特性，将源电极-漏电极电压从0变化到 2伏。选择具有最高电流的电极对用于组装和测序期间的时间监测。通过 针对桥结合提供中性亲和素，针对中性亲和素-桥结合提供聚合酶-马来酰 亚胺-生物素，和针对聚合酶掺入活性提供DNA模板+dNTP的过程监测电 流与时间的关系。如图85A-D所示，产生对应于传感器组装过程的中性亲 和素结合和聚合酶结合阶段的信号尖峰。聚合酶在暴露于模板-核苷酸溶液 时显显示活性，其可以被解释(如所示)为捕获DNA模板，并且掺入互 补碱基的传感器的一系列的三个事件。
模板序列具有4个10-GT重复的主要通道。具体来说，模板序列包括：
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAA AGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCCCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT(SEQ ID NO:15)
在所示的数据解释中，GT通道在具有不同输入模板的传感器的三个 连续接合内产生持续活动的尖峰。该实施例说明桥分子的其他优选形式可 以产生作为序列分析基础的掺入信号。
为了增强来自该富含G模板的掺入信号，将修饰的C用于掺入反应 混合物。具体地，dNTP核苷酸混合物中的标准dCTP核苷酸被两种不同 的经修饰的dCTP分子的相等部分的混合物替换，如图84A和84B所示， 其形式被选择为相对于标准dCTP产生显着的电化学变化。图84A中描绘 的这些形式的dC4P-乳糖和图84B中描绘的d4CP-Cy7通过CLICK化学反 应产生。两种形式都用四磷酸酯键取代三磷酸酯键，并且通过DBCO CLICK化学接头，在末端磷酸酯上添加另外的基团。本文使用的基团是糖， 乳糖和染料分子“Cy7”，产生dCP4-乳糖和dCP-Cy7修饰形式的dCTP。将 修饰添加到一级dCTP的γ中，使得在掺入期间，通过聚合酶切除修饰， 仅留下天然产物DNA。该方法允许大的分子扰动，从而允许信号增强， 而不改变可能损害酶功能或进行性的DNA形式。
图85A显示了来自具有α-螺旋肽桥的序列传感实验的数据。该图是 测试芯片上电极的电流-电压迹线，其已经与肽桥分子在PBS缓冲液中以 1μM肽浓度孵育1小时，以便将桥附连至金触件。在2伏施加的源电极- 漏电极处实现3纳安电流的最高电流迹线表明具有桥分子的电极到位。
另外，图85B显示了来自使用α-螺旋肽桥的序列传感实验的其他数据。 该图是电流-时间迹线，显示随后的中性亲和素与桥结合的特征，在大约 10秒至50秒的时间，当桥接传感器暴露于具有2伏的施加的源-漏电压的 中性亲和素溶液时。
图85C显示了来自使用α-螺旋肽桥的序列传感实验的其他数据。该图 是电流-时间迹线，显示在10-20秒时聚合酶-马来酰亚胺-生物素结合中性 亲和素-桥复合体的特征，当后者暴露于前者的溶液时。
最后，图85D显示了来自使用α-螺旋肽桥的序列传感实验的其他数 据。该图显示了当向组装的传感器提供含有模板DNA的溶液时产生的测 序信号，其序列具有一系列GT重复：(10xGT)TTT(10x GT)AAA(10x GT) CCC(10x GT)。图85D中注释了这些信号的一种可能的解释，其中主要尖 峰对应于模板的GT重复痕迹，并且总共三种不同的模板DNA分子在所示的45秒期间与传感器接合。
其他示例
本公开的其他非限制性示例包括以下内容。
一种传感器，包括：耦合到第一电极的第一触点，耦合到第二电极的 第二触点，在第一触点和第一电极中的一个以及第二触点和第二电极中的 一个之间限定的传感器间隙，和包括第一端和第二端的桥分子；其中桥分 子是生物聚合物桥分子；并且其中桥分子在第一端耦合到第一触点并在第 二末端耦合到第二触点。
一种传感器，包括：覆盖基材表面的第一电极；覆盖基材表面的第二 电极；在第一电极和第二电极之间限定的传感器间隙；和包含第一端和第 二端的桥分子；其中传感器间隙包括介于约5nm和约30nm之间的传感器 间隙尺寸；并且其中桥分子在第一端耦合到第一触点并在第二端耦合到第 二触点。
在各种实施方式中，传感器还可包括栅电极。
在各种实施方式中，传感器间隙具有约5nm至约30nm的传感器间隙 尺寸。
在各种实施方式中，桥分子的第一端包含第一自组装锚，和/或桥分子 的第二端包含第二自组装锚。
在各种实施方式中，桥分子包含生物聚合物桥分子。在各种实施方式 中，生物聚合物桥分子的第一和/或第二端通过各种化学反应进行化学修饰。
在各种实施方式中，桥分子包含化学合成的桥分子。
在各种实施方式中，桥分子包含线性生物聚合物。
在各种实施方式中，桥分子的端-端长度小于桥分子的持续长度。
在各种实施方式中，桥分子包括端-端长度，该端-端长度被配置为接 近传感器间隙尺寸。
在各种实施方式中，桥分子包含核酸双链体。
在各种实施方式中，核酸双链体包含DNA双链体，DNA-RNA杂交 双链体，DNA-PNA杂交双链体，PNA-PNA双链体和DNA-LNA杂交双链 体中的一种。
在各种实施方式中，核酸双链体包含硫醇修饰的寡核苷酸。
在各种实施方式中，第一自组装锚和第二自组装锚中的一个包含5'- 硫醇修饰的核苷酸。
在各种实施方式中，核酸双链体还包含内部生物素修饰的核苷酸。
在各种实施方式中，桥分子包含肽序列，并且其中所述第一自组装锚 和所述第二自组装锚中之一包含L-半胱氨酸残基。
在各种实施方式中，当包含桥分子的流体介质与第一触件和第二触件 之一接触时，桥分子被配置为自组装以产生桥分子构象。
在各种实施方式中，传感器还包含探针，其中探针附连至桥分子。
在各种实施方式中，传感器还包含附连至桥分子的接头。
在各种实施方式中，探针配置成与单个靶分子结合。
在各种实施方式中，分子桥和/或探针包含酶。
在各种实施方式中，酶是聚合酶和逆转录酶之一。
在各种实施方式中，靶分子包括多个靶分子特征，每个靶分子特征具 有离散位置，包括在第一位置处的第一靶分子特征，在第二位置处的第二 靶分子特征和在第n位置处的第n靶分子特征。
在各种实施方式中，探针是酶，所述酶被配置为在包含多个不同靶分 子的溶液中的反应期间接合所述靶分子，其中所述反应包括时间段t，并 且其中所述靶分子的接触产生响应于所述多个靶分子特征的所述酶中的 多个构象变化，其中所述多个构型变化中的每一个调节所述传感器中的电 流以产生信号特征。
在各种实施方式中，系统包括如上文所述的传感器。
在各种实施方式中，该系统还包括耦合至所述传感器并被配置为检测 所述信号特征的信号处理系统。
在各种实施方式中，系统和/或传感器被配置为产生信号迹线，该信号 迹线包括在时间段t上检测到的多个信号特征。
在各种实施方式中，该系统还包括信号解释装置。
在各种实施方式中，该信号解释设备包括信号解释映射。
在各种实施方式中，针对来自已知靶序列的信号迹线来校准信号解释 映射。
在各种实施方式中，信号解释装置被配置为响应于由靶序列产生的信 号迹线而返回信号解释。
在各种实施方式中，信号解释包括信号迹线解释与可能的实际序列匹 配的可能性的概率评估。
在各种实施方式中，一种方法包括：提供本文所述任何示例的传感器； 使核酸模板与聚合酶接触，其中所述聚合酶与包含传感器的一部分的桥分 子耦合；任选向传感器施加电势；提供核苷酸碱基混合物；通过聚合酶进 行掺入事件，所述掺入事件包括将来自核苷酸碱基混合物的核苷酸掺入合 成的核酸中；并检测由掺入事件产生的信号。
在各种实施方式中，该方法还包括在时间段t内进行的一系列掺入事 件，其中所述一系列掺入事件产生信号迹线，该信号迹线包括信号特征的 序列。
在各种实施方式中，每个信号特征对应于一系列掺入事件中的一个。
在各种实施方式中，信号迹线还包括噪声，并且其中该方法还包括从 信号迹线中去除噪声。
在各种实施方式中，每个掺入事件产生聚合酶动力学特征，其是模板 碱基依赖性的。
在各种实施方式中，聚合酶动力学特征有助于信号特征。
在各种实施方式中，该方法适合于区分响应于未修饰的模板核苷酸产 生的第一信号特征和响应于修饰的模板核苷酸产生的第二信号特征。
在各种实施方式中，修饰的模板核苷酸是N6-甲基腺苷，N4-甲基胞 嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶，5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶 中的一种。
在各种实施方式中，修饰的模板核苷酸是无碱基位点。
在各种实施方式中，生物分子感测装置包括：在基材表面上形成第一 电极和第二电极，其中第一电极和第二电极通过电极间隙分开；将第一触件 放置在所述第一电极上并且将第二触件放置在所述第二电极上，其中所述 第一触件和所述第二触件被触件间隙分开；并将桥分子附链到第一触件和 第二触件。
在各种实施方式中，生物分子传感装置还包括使桥分子与探针接触以 使探针与桥分子耦合，其中探针通过自组装与桥分子耦合。
在各种实施方式中，将所述桥分子附连到所述第一触件和所述第二触 件包括自组装步骤。
在各种实施方式中，电极间隙和/或接触间隙在约5nm和约30nm之 间。
在各种实施方式中，第一触件和/或第二触件包含直径为约5nm的金 纳米颗粒。
在各种实施方式中，使用光刻方法确定第一触件位置和/或第二触件位 置。
在各种实施方式中，光致抗蚀剂层放置在包括第一电极和第二电极的 基材表面上，并使用光刻方法限定第一触件位置和第二触件位置。
在各种实施方式中，该方法还包括在所述第一触件位置和所述第二触 件位置处对所述基材表面施加表面衍生化处理。
在各种实施方式中，表面衍生化处理包括硅烷化。
在各种实施方式中，该方法还包括沉积金层并且进行剥离步骤以使第 一金触件设置在所述第一电极上和/或使第二金触件设置在所述第二电极 上。
在各种实施方式中，该方法还包括使所述装置与包含多个金纳米颗粒 的溶液接触，并且在所述第一触件位置处引入第一金纳米颗粒和/或在所述 第二触件位置处引入第二金颗粒。
在各种实施方式中，桥分子在使所述桥分子与探针或所述探针接触之 前，所述桥分子通过自组装与所述第一触件和所述第二触件附连。
在各种实施方式中，在通过自组装将所述桥分子附连至所述第一触件 和所述第二触件之前，所述桥分子与所述探针接触以通过自组装形成传感 器复合体。
在各种实施方式中，该方法还包括制造电子耦合到第一电极和第二电 极的集成电路。
在各种实施方式中，集成电路，第一电极和第二电极包括混合信号集 成电路。
在各种实施方式中，使用CMOS制造方法制造集成电路，第一电极 和第二电极。
在各种实施方式中，使用CMOS制造方法制造第一和第二触件。
在各种实施方式中，使用适于制造场效应晶体管的制造方法制造集成 电路，第一电极和第二电极。
此处关于具体示例描述了好处、其他优点以及对问题的解决方案。此 外，此处包含的各种图片中所示的连接线旨在表示各种元素之间的示例性 功能关系和/或物理耦合。应当注意，在实际系统中可提供很多替换或附加 功能关系或物理连接。但是，不应认为这些益处、优点、解决问题的方案， 以及可能产生任何益处、优点或解决方案或者使其更为显著的任何元素是 本发明的关键、需要或必需的特征或元素。因此本发明的范围仅由所附权利要求限制，其中，除非明确指出，否则对单数元素的引用不旨在表示“一 个并且仅有一个”，而是表示“一个或多个”。此外，在权利要求中使用类似 于“A，B或C中的至少一个”的短语的情况下，意图将短语解释为意味着 在实施方式中可以单独存在A，在实施方式中可以单独存在B，在实施方 式中可以单独存在C，或者单个实施方式中可以存在元素A，B和C的任何组合；例如A和B，A和C，B和C，或A和B和C。在所有附图中使 用不同的交叉阴影来表示不同的部分，但不一定表示相同或不同的材料。
本文提供了系统，方法和设备。本文的详细描述中，对“一个实施方 式”，“实施方式”，“示例实施方式”等的引用指示所描述的实施方式可以包 括特定的特征，结构或特性，但是每个实施方式可能不一定包括特定的特 征，结构或特性。而且，这样的短语不一定指相同的实施方式。此外，当 结合实施方式描述特定特征、结构或特性时，认为结合其他实施方式影响 这种特征、结构或特性是在本领域技术人员的知识范围内的，无论是否明 确描述。尽管本文描述的各种示例和实施方式涉及与核酸靶相关的信号检 测方法，但本公开的装置和方法决不限于包含核酸检测和测序的应用。类 似地，虽然本文所述的各种示例和实施方式涉及包含生物聚合物桥分子的 传感器，但化学合成的桥分子在本公开的范围内。在阅读说明书之后，相 关领域的技术人员将清楚如何在替代实施方式中实现本公开。
此外，本公开中的元素、组件或方法步骤不旨在致力于公众，无论权 利要求书中是否明确列举这些元素、组件或方法步骤。此处的权利要求元 素不能根据美国专利法第112条(f)的规定解释，除非使用短语“用于…… 的器件”特意地列举了该元素。如此处所使用的，术语“包括”、“包含”或其 任意其他变型旨在覆盖非排他的包含，使得包括一列元素的过程、方法、 物品或装置不仅包括这些元素而且还可包括并未特意列出的或这些过程、方法、物品或装置固有的其他元素。
序列表
<110> 罗斯韦尔生物技术股份有限公司（ROSWELL BIOTECHNOLOGIES INC.）
<120> 分子传感器及相关方法
<130> 68952.00334
<140> WO PCT/US2016/068922
<141> 2016-12-28
<150> US 62/278,889
<151> 2016-01-14
<150> US 62/278,900
<151> 2016-01-14
<150> US 62/278,907
<151> 2016-01-14
<160> 23
<170> notepad
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 硫醇修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n = 5'-硫醇修饰的胸腺嘧啶
<400> 1
ngcgtacgta tgtcatgaat ggcgcagact gatgtcctat gacgtcgcta ctgcagtact 60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 硫醇修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n = 5'-硫醇修饰的胸腺嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> 内部生物素修饰的脱氧胸腺嘧啶
<400> 2
ngtactgcag tagcgacgtc ataggacanc agtctgcgcc attcatgaca tacgtacgca 60
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽生物聚合物桥分子
<400> 3
Met His Gly Lys Thr Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽生物聚合物桥分子
<400> 4
Val Ser Gly Ser Ser Pro Asp Ser
1 5
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽生物聚合物桥分子
<400> 5
Leu Lys Ala His Leu Pro Pro Ser Arg Leu Pro Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽生物聚合物桥分子
<400> 6
Val Pro Ser Ser Gly Pro Gln Asp Thr Arg Thr Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽生物聚合物桥分子
<400> 7
Met Ser Pro His Pro His Pro Arg His His His Thr
1 5 10
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽生物聚合物桥分子中的氨基酸基序
<400> 8
Glu Ala Ala Ala Arg
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽生物聚合物桥分子中的氨基酸基序
<400> 9
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽生物聚合物桥分子中的氨基酸基序
<400> 10
Glu Glu Glu Glu Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽生物聚合物桥分子中的氨基酸基序
<400> 11
Glu Glu Glu Glu Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未配对的碱基核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13)
<223> n = 任何标准核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(23)
<223> n = 5-甲基胞嘧啶
<400> 12
nnnnnnnnnn nnngngngng ngngcgcgcg cgcg 34
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于未配对的碱基核苷酸序列的互补合成链
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(34)
<223> n = 任何标准核苷酸
<400> 13
cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cnnnnnnnnn nnnn 34
<210> 14
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白质α-螺旋桥分子
<220>
<221> MOD_RES
<222> (32)..(32)
<223> Xaa = 经修饰以在Ahx (六碳线性氨基己酸)接头上包含生物素的赖氨酸(Lys-Ahx-生物素)
<400> 14
Cys Ala Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Xaa
20 25 30
Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu
35 40 45
Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala Ala Arg Cys
50 55 60
<210> 15
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板序列的GT重复道
<400> 15
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt tttgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtaaagtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtcccg tgtgtgtgtg tgtgtgtgt 89
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表征多聚A区域的寡核苷酸序列
<400> 16
cgccgcggag ccaagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaattgca tgtcctgtga 50
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
tcacaggaca tgcaa 15
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头基团
<400> 18
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生肽的部分
<400> 19
Cys Ala Leu Asn Asn
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "FLAG-标签"抗原肽
<400> 20
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生肽
<400> 21
Cys Ala Leu Asn Asn Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
1 5 10 15
Lys
<210> 22
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例输出序列
<400> 22
gattacagat taca 14
<210> 23
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例输出序列
<400> 23
acgtacgtac gta 13

Claims (15)

1.一种传感器，包括：
源电极；
漏电极，通过传感器间隙与所述源电极隔开；
其中所述源电极和所述漏电极配合形成电极电路；
桥分子，包括第一端和第二端，其中所述桥分子连接所述源电极和所述漏电极；和
探针，耦合到所述桥分子；
其中通过监测所述电极电路的至少一个参数能检测所述探针与核酸的相互作用。
2.根据权利要求1所述的传感器，其中所述探针包含酶。
3.根据权利要求1所述的传感器，其中所述探针包含聚合酶。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的传感器，其中所述桥分子包含以下中的至少一种：双链DNA，DNA-RNA杂交双链体，DNA-PNA杂交双链体，PNA-PNA双链体或DNA-LNA杂交双链体、蛋白质和蛋白质α-螺旋。
5.根据权利要求4所述的传感器，其中所述桥分子包含双链DNA螺旋体或α-螺旋多肽。
6.根据权利要求5所述的传感器，其中所述桥分子包含双链DNA螺旋体。
7.根据权利要求5所述的传感器，其中所述桥分子包含α-螺旋多肽。
8.根据权利要求1所述的传感器，其中所述传感器间隙包括介于约5纳米与约30纳米之间的传感器间隙尺寸。
9.根据权利要求1所述的传感器，进一步包括栅电极，其中所述源电极、漏电极和栅电极配合形成电极电路。
10.根据权利要求3所述的传感器，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。
11.根据权利要求10所述的传感器，其中所述DNA聚合酶是Phi29。
12.根据权利要求4所述的传感器，其中所述桥分子被工程化为在所述桥分子的所述第一端和所述第二端都包括材料结合结构域。
13.根据权利要求12所述的传感器，其中所述材料结合结构域中的每个结构域包括富含甘氨酸或丝氨酸的肽接头。
14.根据权利要求12所述的传感器，其中所述桥分子包含双链DNA，并且其中所述材料结合结构域中的每个结构域包括硫醇化核苷酸。
15.一种对核酸进行测序的方法，包括：
提供根据权利要求1-14中任一项所述的传感器；
使核酸模板与聚合酶接触，其中所述聚合酶与包含传感器的一部分的桥分子耦合；
提供核苷酸碱基混合物；
通过所述聚合酶进行掺入事件，所述掺入事件包括将来自所述核苷酸碱基混合物的核苷酸掺入合成的核酸中；和
检测由所述掺入事件产生的信号。
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