CN114555832A - 鉴定核酸序列中组分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于聚合酶合成用电子方法在单分子水平鉴定或测序DNA或RNA分子的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年5月27日提交的美国临时申请序列号62/853,119和2019年6月14日提交的美国临时申请序列号62/861,675的优先权，其整体公开内容通过引用纳入本文。
技术领域
本发明的实施方式涉及用于电子测序器件的方法和生物化学材料，以利用酶读取核酸序列中的单个核苷酸。
现有技术和背景
在整篇本申请中，引用了本发明所涉及的各种出版物、专利和专利申请。这些出版物全文的公开内容被描述为本领域的现有技术。另外，在本申请中，本发明主要通过DNA和DNA聚合酶合成来说明。只需稍作修改，相同的机制、原理和特征也适用于RNA和RNA聚合酶合成，例如用三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)替换三磷酸核苷(NTP)，用核糖替换脱氧核糖，等等。
现有技术(US 9,862,998和10,233,493)公开了一种通过监测用荧光染料标记的DNA聚合酶的构象变化检测核苷酸纳入DNA的方法。根据酶和染料，不同的核苷酸(包含天然存在的和修饰的核苷酸)产生不同的荧光发射的幅度和持续时间。该方法从核酸分子的整体中确定核苷酸序列。
另一项现有技术已经证明，碳纳米管电荷传感器(图1)可以电子实时监测单DNA聚合酶将单个天然存在的核苷酸纳入DNA引物的过程1，使得这种电子器件可能有潜力用于核酸聚合物的测序。然而，电信号(表现为尖峰)不能被有效地应用于单个地鉴定纳入的核苷酸。如下表所示(采用参考文献1)，DNA聚合酶纳入的电信号衍生的特征参数之间存在重叠，与在天然存在的核苷酸之间的重叠相对应。因此，无论是τlo、τhi或H值都不足以任何程度的可靠性鉴定具体dNTP的纳入。
一项现有技术申请(WO 2016/183218)声称，一种混合物，其中一个或多个天然核苷酸三磷酸被具有非天然部分的类似物替代，其以可区分的方式改变信号极性，而不损害该类似物在测序期间与其模板链中的同源核苷酸进行碱基配对的能力。例如，α-硫代-dATP导致信号极性的负变化，2-硫代-dTTP导致信号极性的正变化，因此它们可以被用于通过所述器件电荷传感器来区分模板中的T和A(其结构见图2)。然而，Weiss及其同事报道了2-硫代嘧啶-5′-三磷酸(2-硫代-dNTP)类似物产生了混合行为，其中DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)活性在1分钟内产生负偏移，而在另一分钟内产生正偏移。2这表明，对核碱基的沃森-克里克碱基配对边缘的修饰导致电子信号的不确定性，进而导致了用于核酸测序的确定核苷酸纳入的不确定性。
如图4所示，在错配和匹配的dNTP3以及不同的DNA聚合酶4之间，三磷酸核苷酶促纳入到DNA链上具有相似的动力学途径。通常，由DNA聚合酶催化的DNA聚合是动力学控制过程。该过程中涉及有几个主要步骤：(1)构象关闭，(2)三磷酸偶联至DNA的3’末端，和(3)DNA移位和构象重新打开，其中偶联反应是限速步骤(rate-limiting step)。图4表明，错配碱基对不会显著影响DNA聚合酶的关闭和重新打开，但会影响酶催化的过渡态(TS)。因此，对天然存在的核苷的非碱基配对部分的修饰应当能够调节它们的动力学参数，使它们能够被电子传感器所区分。
附图简要说明
图1：一种现有技术器件，由附接到两个电极(源极和漏极)的碳纳米管构成，并用DNA聚合酶官能化以实时监测酶活性。
图2：修饰核苷酸α-硫代-dATP和2-硫代-dTTP的化学结构。
图3：单分子DNA测序器件的示意图，在附接至两个电极的纳米结构上具有聚合酶，(a)DNA纳米结构，(b)肽纳米结构。
图4：(a)由不同DNA聚合酶PolβWT、R258A突变体、KF和Pol X纳入单核苷酸的自由能分布；(b)由Polβ对比I260Q突变体纳入匹配和错配dNTP的定性自由能分布。
图5：将核苷酸底物纳入DNA链的反应。
图6：天然存在的三磷酸核苷的化学结构。
图7：γ-取代的天然存在的三磷酸核苷的化学结构。
图8：天然存在的三磷酸核苷的β，γ-X类似物的化学结构。
图9：天然存在的α-硫代-三磷酸核苷(α-硫代-dNTP)的化学结构。图10：天然存在的α-硼烷代(borano)-三磷酸核苷(α-硼烷代-dNTP)的化学结构。
图11：天然存在的α-硼烷代-α-硫代-三磷酸核苷(α-硼烷代-α-硫代-dNTP)的化学结构。
图12：天然存在的α-硒代-三磷酸核苷(α-硒代-dNTP)的化学结构。
图13：天然存在的α-R-磷酰基-β，γ-二磷酸脱氧核糖核苷的化学结构。
图14：两个氧桥都被修饰的天然存在的三磷酸核苷的化学结构(β，γ-X-α-Z-dNTP)。
图15：具有γ-和α-磷之一的氧被其他原子或有机基团替代的天然存在的三磷酸核苷的化学结构。
图16：糖环氧被其他原子替代的核苷酸的化学结构。
图17：代表性的异种核酸(xeno nucleic acid)(XNA)核苷的化学结构。
图18：本发明中沃森克里克碱基对和修饰位点的示意图。
图19：修饰的嘧啶核碱基的化学结构。
图20：修饰的嘌呤核碱基的化学结构。
发明概述
本发明包括与DNA聚合酶偶联的生物聚合物纳米结构，作为用于核酸测序的电子传感器(见图3a，DNA纳米结构，和图3b，肽纳米结构)，如公开于临时专利申请US 62/794,096、US 62/812,736、US 62/833,870和US62/803,100，其通过引用全文纳入本文。图3所示的DNA纳米结构和肽纳米结构在某些条件下通过隧穿和跃迁都是电子电荷导体。DNA聚合酶在预定位置附接到纳米结构，每个都通过一个短的柔性接头。对于测序，DNA聚合酶首先与目标-引物双链体形成二元复合物，以“开放”构象存在，其可以进而与正确的三磷酸核苷通过沃森-克里克碱基配对形成三元复合物。在金属离子的存在下，三元复合物将DNA聚合酶转变为“关闭”构象，促进延伸反应。当形成新的磷酸二酯键时，双链体末端的新生碱基对被过度拉伸，引发与最近邻碱基对的堆叠相互作用。这一过程使DNA和DNA聚合酶向相反方向位移，从而为下一轮纳入产生开放构象。5所有这些机械运动，包括构象变化和DNA移位，都会对下方的纳米结构施加力并扰乱其碱基配对和堆叠，产生作为核苷酸纳入特征的电荷传输波动。本发明提供了用于鉴定构成生物聚合物(例如DNA和RNA)的单个组分(或单元或碱基)的方法和化学品。例如，为了测序目标DNA分子，我们使用它作为模板在所述纳米结构测序器件上进行DNA合成，根据沃森克里克碱基配对原则，三磷酸核苷底物被纳入延长的DNA链。通过读取核苷酸纳入来确定DNA序列。最近的研究表明，DNA合成是两个Mg2+离子辅助的逐步缔合SN2反应，6尽管在DNA合成过程中可能存在第三个二价金属离子。7此外，在DNA聚合酶催化的DNA合成过程中，从该SN2反应中释放的焦磷酸(PPi)基团被水解为磷酸。DNA聚合的一般机制示于图5。延长链的末端3’氧充当亲核试剂，攻击进入的dNTP的α-磷原子形成P-O共价键，伴随焦磷酸的释放，焦磷酸进而被水解成磷酸。基于反应机制，本发明提供了修饰的核苷酸底物，其以不同于天然存在的核苷酸的方式影响聚合酶酶促反应的动力学，在纳米结构中产生可区分的电信号，其可被用于区分目标DNA模板中的单个核苷酸，使得目标DNA可以被测序。
本发明中使用的DNA聚合酶包括根据结构同源性被分类为A、B、C、D、X、Y和RT族的DNA聚合酶。例如，A族中的DNA聚合酶包括T7 DNA聚合酶和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)Pol I；B族中的DNA聚合酶包括T4 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶和RB69；C族中的DNA聚合酶包括大肠杆菌DNA聚合酶III。DNA聚合酶的RT(逆转录酶)族包括，例如，逆转录病毒逆转录酶和真核生物的端粒酶。
具体实施方式
在一些实施方式中，聚合酶被附接至纳米结构，加入由DNA引物和待测序目标构成的双链体，然后加入三磷酸核苷或dNTP的混合物。在存在金属离子的情况下，根据沃森克里克配对原则，DNA聚合酶将dNTP纳入DNA引物，且每个纳入步骤引发电尖峰(electricspike)，被记录在传感器中。
上述所述三磷酸核苷混合物包括：
·0-4个天然存在的三磷酸核苷(图6)。
·0-4个γ-取代的天然存在的三磷酸核苷(图7)。取代基是供电子基团或吸电子基团，它们会影响DNA聚合酶的活性，8并且还可能影响焦磷酸向磷酸的水解，从而导致反应速率和进而电信号改变。
·0-4个天然存在的三磷酸核苷的β，γ-X类似物(图8)。在类似物中，X部分取代天然存在的三磷酸核苷的β，γ-桥接O，这改变了双膦酸盐(BP)离去基团的立体电子特性，而不影响碱基配对。因此，这些三磷酸类似物调节DNA聚合酶的纳入速率，其受离去基团影响。9-11由于纳入是动力学控制过程，因此可以相应地调节相应的电信号。
·0-4个α-硫代-dNTP(图9)。这些修饰的三磷酸被DNA聚合酶纳入DNA引物。5′-O-(1-硫代-三磷酸)脱氧核糖核苷和核糖核苷的Sp-非对映异构体是天然存在的核苷酸的类似物，且很容易被DNA聚合酶或RNA聚合酶纳入核酸。12，13
·0-4个α-硼烷代-dNTP(图10)。α-硼烷代-dNTP和α-硼烷代-NTP是DNA聚合酶和RNA聚合酶的优良底物，允许DNA和RNA的容易的酶促合成。14，15
●0-4个α-硼烷代-α-硫代-dNTP(图11)。16
●0-4个α-硒代-dNTP(图12)。这些修饰的dNTP可以被纳入DNA。然而，用α-硒代-dNTP的DNA聚合比天然dNTP慢。在缺乏DNA模板的情况下，α-硒代-dNTP抑制引物自延伸。17
·0-4个α-R-磷酰基-β，γ-二磷酸脱氧核糖核苷(图13)。这些底物产生不带电荷的核酸骨架18，这促进不同底物的纳入产生的电信号之间的进一步区分。
·0-4个β，γ-X-α-Z-dNTP类似物(图14)，其促进不同底物的纳入产生的电信号之间的进一步区分。
·0-4个γ-R-α-Z-dNTP类似物(图15)，其促进不同底物的纳入产生的电信号之间的进一步区分。
在一些实施方式中，所述三磷酸核苷包含经修饰的糖。图16显示了修饰的一种形式，其中糖环中的氧被另一个原子替换。这些原子具有不同的电子负性，这会影响相邻3’-OH的pKa，进而影响其亲核性。例如，2′-脱氧-4′-硫代核糖核苷5′-三磷酸(dSNTP)，其中X＝S、R＝H、碱基＝A、C、G、T，具有未修饰的三磷酸，可被用作DNA聚合酶的底物。19dSNTP已经表现出与相应的天然dNTP不同的反应速率和效率。
在一些实施方式中，所述三磷酸核苷包含核糖(图16，R＝OH)。RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)被附接至DNA纳米结构器件以进行RNA测序。该酶是脊髓灰质炎病毒RdRP等。
在一些实施方式中，所述三磷酸核苷具有包含人工遗传聚合物异种核酸(XNA)的核苷单元，其为一组骨架结构不同于自然界中发现的核酸聚合物的核酸聚合物，能够与DNA核碱基特异性碱基配对(图17)。一些XNA具有糖单元柔性或刚性构象，而其他XNA具有与其天然存在的对应物不同的构型和结构。这些使它们与酶中目标的结合不同于那些天然存在的对应物。此外，与天然存在的对应物相比，一些XNA携带供电子基团或吸电子基团，使得其相邻OH具有更多或更少亲核性。例如，TNA可以通过实验室进化的聚合酶被纳入DNA引物中，该聚合酶衍生自分离自超嗜热古菌种极端嗜热古菌(Thermococcus kodakarensis)(Kod)的复制性B族聚合酶。20,21这些XNA底物可用于将特定的DNA核苷酸与目标DNA中的其余核苷酸区分开来。
在一些实施方式中，附接到生物聚合物纳米结构传感器的用于RNA测序的RNA聚合酶包括但不限于：病毒RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶；真核生物RNA聚合酶例如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV和RNA聚合酶V；以及古菌RNA聚合酶。附接到传感器的RNA聚合酶被加入经典三磷酸核糖核苷的混合物用于读取RNA序列。
在一些实施方式中，所述混合物包含
·0-4个经典三磷酸核糖核苷。
·0-4个其三磷酸经修饰的核糖核苷酸(图16，R＝OH)
·0-4个修饰的三磷酸核糖核苷，具有如图16所示的通用结构，其中R＝OH。
·0-4个XNA三磷酸(图17)。
本发明进一步提供了经修饰的碱基，以进一步调节DNA聚合酶和RNA聚合酶的反应性。为了维持聚合酶的保真度，我们保留修饰碱基的WC边缘不改变，如图18所示。这些化合物具有保留的用于插入正确的进入核苷酸的沃森克里克氢键合边缘的共同特征，按照沃森克里克碱基配对原则和氢键合受体位点与模板相互作用，用于聚合酶与小沟的碱基对相互作用。22，23因此，这些修饰不会干扰酶的保真度。在一些实施方式中，所述三磷酸核苷由其5-位由一系列吸电子基团、供电子基团、以及乙基、乙烯和乙炔修饰的嘧啶碱基构成，多种官能团附接其上(图19)。这些修饰允许我们调节酶促反应的过渡态。
在一些实施方式中，所述三磷酸核苷由其7-位由一系列吸电子基团、供电子基团、以及乙基、乙烯和乙炔修饰的嘌呤碱基构成，多种官能团附接其上(图20)。这些修饰允许我们调节酶促反应的过渡态。
在一些实施方式中，三磷酸核苷由所述修饰的碱基、修饰的糖或糖类似物，以及修饰的三磷酸或三磷酸类似物构成。
在一些实施方式中，多个纳米结构传感器被用于并行读取核酸序列。多个纳米结构传感器可以被制造为阵列形式，在固体表面或孔中，纳米结构传感器的数量为10至109，优选103至107或更优选104至106。
所述阵列中的所有纳米结构传感器被配置为具有一种类型的核酸聚合酶或不同类型的核酸聚合酶。
目标样本可以是双链或单链的、线性或环状DNA。目标样本可以是双链或单链的、线性或环状RNA。测序引物可以是DNA、RNA、DNA和RNA的偶联物，或含有修饰核苷的DNA。
使用先前临时专利申请(参考US 62/794,096、US 62/812,736、US 62/833,870和US62/803,100)中提供的附接化学，聚合酶可以被附接至生物聚合物纳米结构传感器的预定的一个或多个位置处。在许多实施方式中，DNA纳米结构在预定的一个或多个DNA核苷处被有机官能团官能化。而DNA聚合酶被生物工程化改造为含有非天然氨基酸，具有针对DNA纳米结构中的那些进行点击反应的功能。
在一些实施方式中，在上述所有描述中的生物聚合物纳米结构被固体纳米线替代，其由选自下组的材料制成：铂(Pt)、钯(Pd)、钨(W)、金(Au)、铜(Cu)、钛(Ti)、钽(Ta)、铬(Cr)、TiN、TiNx、TaN、TaNx、银(Ag)、铝(Al)和其他金属，优选Pt、Pd、Au、Ti和TiN。纳米线长度为3nm至10μm，优选20nm至1μm；宽度为5nm至50nm，优选5nm至20nm；以及厚度为3nm至50nm，优选4nm至10nm。所有三磷酸核苷和三磷酸核糖核苷的设计、修饰、变异，天然的或非天然的，它们与聚合酶的相互作用、它们的使用方法以及区分单个核苷酸的原则都适用于聚合酶-纳米线偶联的DNA/RNA测序系统。在一些其他实施方式中，纳米线是具有与纳米线相似尺寸的单层或多层石墨烯片或碳纳米管。
在一些实施方式中，以上所有描述中的纳米结构被分子线替代，例如公开于专利申请WO2018208505、US20180305727A1和WO2018136148A1中的那些。所有三磷酸核苷和三磷酸核糖核苷的设计、修饰、变异，天然的或非天然的，它们与聚合酶的相互作用、它们的使用方法以及区分单个核苷酸的原则都适用于聚合酶-分子线偶联的DNA/RNA测序系统。
在一些实施方式中，DNA聚合酶被直接附接至两个电极，桥接两个电极之间的纳米间隙并允许电子或电流通过，例如公开于专利申请WO2018208505、US20180305727A1和WO2018136148A1中的那些。出于DNA/RNA测序的目的，上述提及的三磷酸核苷和三磷酸核糖核苷的设计、修饰、变异，天然的或非天然的，它们与聚合酶的相互作用、它们的使用方法以及区分单个核苷酸的原则都适用于仅聚合酶的DNA/RNA测序系统。
在一些实施方式中，所有上述纳米间隙桥接构型，例如生物聚合物纳米结构、分子线、纳米线和直接接触聚合酶的纳米间隙电极，可以与栅极组合以形成FET型聚合酶测序系统，例如公开于临时专利申请US62/833,870中的那些。尽管聚合酶构象变化影响通过纳米间隙的电信号的机制有所不同，但三磷酸核苷和三磷酸核糖核苷的设计、修饰、变异，天然的或非天然的，它们与聚合酶的相互作用、它们的使用方法以及区分单个核苷酸的原则也适用于FET型聚合酶DNA/RNA测序系统。
一般性说明：
专利或专利申请在被提及处纳入本文。引用的期刊出版物列于被引文献中。
除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然通过本发明实施方式介绍本发明，并且相当详细地描述了这些实施方式，但它们不应局限或以任何方式限制所附权利要求书的范围。本领域的技术人员将容易地明白另外的优点和修改。因此，本发明在其更广泛的方面不限于所示和描述的具体细节、代表性装置、设备和方法以及说明性示例。因此，与这些细节有差异也仍然符合本发明的总体构思。
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Claims (24)
1.一种用于生物聚合物的鉴定、表征或测序的系统，其包括，
(a)非导电性基材；
(b)第一电极和第二电极彼此相邻放置在所述非导电性基材上形成的纳米间隙；
(c)纳米结构，被配置为尺寸相当于所述纳米间隙并且通过化学键一端附接到所述第一电极，另一端附接到所述第二电极桥接所述纳米间隙；
(d)附接到所述纳米结构上并配置为进行生物聚合物合成反应的DNA或RNA聚合酶；
(e)促进生物聚合物合成反应的反应混合物；
(f)施加在所述第一电极和所述第二电极之间的偏压；
(g)记录通过所述纳米结构的电流波动的器件，所述电流波动是由附接到所述纳米结构上的聚合酶引发的构象改变导致的所述纳米结构内部变形导致的；和
(h)用于数据分析鉴定生物聚合物或生物聚合物的亚单位的软件；
其中所述生物聚合物是DNA分子、RNA分子或寡核苷酸或其组合，并且是双链或单链的、线性或环状的、天然的、修饰的或合成的及其组合。
2.如权利要求1所述的系统，其中，所述非导电性基材包括：硅、氧化硅、氮化硅、玻璃、二氧化铪、其他金属氧化物、任何非导电性聚合物膜、具有氧化硅或氮化硅或其他非导电性涂层的硅、具有氮化硅涂层的玻璃、其他非导电性有机材料和/或任何非导电性无机材料。
3.如权利要求1所述的系统，其中所述纳米结构是下述的其中之一或其组合：
(a)DNA纳米结构，由天然的、修饰的或合成的脱氧核糖核酸制成；
(b)RNA纳米结构，由天然的、修饰的或合成的核糖核酸制成；
(c)肽纳米结构，由天然的、修饰的或合成的氨基酸制成；和
(d)分子线，由任何一种或多种天然的、修饰的或合成的导电性生物聚合物制成。
4.如权利要求1所述的系统，其中所述纳米结构包含固体纳米线，由选自下组的金属材料制成：铂(Pt)、钯(Pd)、钨(W)、金(Au)、铜(Cu)、钛(Ti)、钽(Ta)、铬(Cr)、TiN、TiNx、TaN、TaNx、银(Ag)、铝(Al)和其他金属，及其组合。
5.如权利要求1所述的系统，其中所述纳米结构包括单层的或多层的碳纳米管或石墨烯片，或其组合。
6.如权利要求1所述的系统，其中所属纳米结构是所述聚合酶，其中所述聚合酶被直接附接至所述两个电极，桥接所述纳米间隙，并允许所述电子电流通过。
7.如权利要求1所述的系统，其中所述DNA聚合酶选自下组：天然的、突变的、表达的或合成的A、B、C、D、X、Y和RT族的DNA聚合酶，其包括T7 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Taq聚合酶、DNA聚合酶Y、DNA聚合酶Pol I、Pol II、Pol III、Pol IV和Pol V、Polα(阿尔法)、Polβ(贝塔)、Polσ(西格玛)、Polλ(兰姆达)、Polδ(德尔塔)、Polε(艾普希龙)、Polμ(缪)、Pol I(埃欧塔)、Polκ(卡帕)、polη(艾塔)和末端脱氧核苷酰转移酶、端粒酶，及其组合。
8.如权利要求1所述的系统，其中所述RNA聚合酶选自下组：天然的、突变的、表达的或合成的病毒RNA聚合酶，其包括T7 RNA聚合酶；和真核生物RNA聚合酶，其包括RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV和RNA聚合酶V；以及古菌RNA聚合酶，及其组合。
9.如权利要求1所述的系统，其进一步包括配置为用作栅电极的第三电极，其中与所述第一和所述第二电极一起形成FET型纳米间隙器件。
10.如权利要求1所述的系统，其中所述反应混合物包含以下三磷酸核苷混合物的至少其一或其组合：
(a)至少天然存在的三磷酸核苷；
(b)至少γ-取代的天然存在的三磷酸核苷，其包含供电子基团或吸电子基团；
(c)至少天然存在的三磷酸核苷的β，γ-X类似物，具有取代了天然存在的三磷酸核苷的β，γ-桥接O的X部分；
(d)至少α-硫代-dNTP或α-硫代-NTP；
(e)至少α-硼烷代-dNTP或α-硼烷代-NTP；
(f)至少α-硼烷代-α-硫代-dNTP或α-硼烷代-α-硫代-NTP；
(g)至少α-硒代-dNTP或α-硒代-NTP；
(h)至少α-R-磷酰基-β，γ-二磷酸脱氧核糖核苷；
(i)至少β，γ-X-α-Z-dNTP类似物或β，γ-X-α-Z-NTP类似物；和
(j)至少γ-R-α-Z-dNTP类似物或γ-R-α-Z-NTP类似物，
其中所述dNTP被配置用于DNA合成且NTP被配置用于RNA合成。
11.如权利要求1所述的系统，其中所述反应混合物包含以下所述至少其一或其组合：
(a)dNTP或NTP，其包含经修饰的糖，其中所述糖环中的氧被具有不同电子负性的原子替换；
(b)dNTP或NTP，其包含含有人工遗传聚合物异种核酸(XNA)的核苷单元；
(c)dNTP或NTP，其包含5-位由选自下组的分子修饰的嘧啶碱基：吸电子基团、供电子基团、乙基基团、乙烯基、乙炔基及其组合，官能团附接其上；和
(d)dNTP或NTP，其包含7-位由选自下组的分子修饰的嘌呤碱基：吸电子基团、供电子基团、乙基基团、乙烯基、乙炔基及其组合，官能团附接其上；和
其中所述dNTP被配置用于DNA合成且NTP被配置用于RNA合成。
12.如权利要求1所述的系统包含多个纳米间隙传感器，其中每个纳米间隙传感器包括一对电极、纳米结构、聚合酶、反应混合物和与单个纳米间隙相关的任何特征。
13.如权利要求12所述的系统，其中所述多个纳米间隙传感器包含约10至约10亿个纳米间隙的阵列，优选约10,000至约1百万个纳米间隙的阵列。
14.一种用于生物聚合物的鉴定、表征或测序的方法，包括，
(a)提供非导电性基材；
(b)提供第一电极和第二电极，并将它们彼此相邻放置在所述非导电性基材上以形成纳米间隙；
(c)提供纳米结构，其被配置为尺寸相当于所述纳米间隙并且通过化学键一端附接到所述第一电极，另一端附接到所述第二电极桥接所述纳米间隙；
(d)提供附接到所述纳米结构上并配置为进行生物聚合物合成反应的DNA或RNA聚合酶；
(e)提供促进所述生物聚合物合成反应的反应混合物；
(f)在所述第一电极和第二电极之间施加偏压；
(g)记录通过所述纳米结构的电流波动，所述电流波动是由附接到所述纳米结构上的聚合酶引发的构象改变导致的所述纳米结构内部变形导致的；和
(h)提供了用于数据分析鉴定所述生物聚合物或所述生物聚合物的亚单位的软件；和
其中所述生物聚合物是DNA分子、RNA分子或寡核苷酸或其组合，并且是双链或单链的、线性或环状的、天然的、修饰的或合成的及其组合。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述非导电性基材包括：硅、氧化硅、氮化硅、玻璃、二氧化铪、其他金属氧化物、任何非导电性聚合物膜、具有氧化硅或氮化硅或其他非导电性涂层的硅、具有氮化硅涂层的玻璃、其他非导电性有机材料和/或任何非导电性无机材料。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述纳米结构是下述的其中之一或其组合：
(a)DNA纳米结构，由天然的、修饰的或合成的脱氧核糖核酸制成；
(b)RNA纳米结构，由天然的、修饰的或合成的核糖核酸制成；
(c)肽纳米结构，由天然的、修饰的或合成的氨基酸制成；和
(d)分子线，由任何一种或多种天然的、修饰的或合成的导电性生物聚合物制成。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述纳米结构包含固体纳米线，由选自下组的金属材料制成：铂(Pt)、钯(Pd)、钨(W)、金(Au)、铜(Cu)、钛(Ti)、钽(Ta)、铬(Cr)、TiN、TiNx、TaN、TaNx、银(Ag)、铝(Al)和其他金属，及其组合。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述纳米结构包括单层的或多层的碳纳米管或石墨烯片，或其组合。
19.如权利要求14所述的方法，其中所属纳米结构是所述聚合酶，其中所述聚合酶被直接附接至所述两个电极，桥接所述纳米间隙，并允许所述电子电流通过。
20.如权利要求14所述的方法，其中所述DNA聚合酶选自下组：天然的、突变的、表达的或合成的A、B、C、D、X、Y和RT族的DNA聚合酶，其包括T7 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Tag聚合酶、DNA聚合酶Y、DNA聚合酶Pol I、Pol II、Pol III、Pol IV和Pol V、Polα(阿尔法)、Polβ(贝塔)、Polσ(西格玛)、Polλ(兰姆达)、Polδ(德尔塔)、Polε(艾普希龙)、Polμ(缪)、PolI(埃欧塔)、Polκ(卡帕)、polη(艾塔)和末端脱氧核苷酰转移酶、端粒酶，及其组合。
21.如权利要求14所述的方法，其中所述RNA聚合酶选自下组：天然的、突变的、表达的或合成的病毒RNA聚合酶，其包括T7 RNA聚合酶；和真核生物RNA聚合酶，其包括RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV和RNA聚合酶V；以及古菌RNA聚合酶，及其组合。
22.如权利要求14所述的方法，其进一步包括提供配置为用作栅电极的第三电极，其中与所述第一和所述第二电极一起形成FET型纳米间隙器件。
23.如权利要求14所述的方法，其中所述反应混合物包含以下三磷酸核苷混合物的至少其一或其组合：
(a)至少天然存在的三磷酸核苷；
(b)至少γ-取代的天然存在的三磷酸核苷，其包含供电子基团或吸电子基团；
(c)至少天然存在的三磷酸核苷的β，γ-X类似物，具有取代了天然存在的三磷酸核苷的β，γ-桥接O的X部分；
(d)至少α-硫代-dNTP或α-硫代-NTP；
(e)至少α-硼烷代-dNTP或α-硼烷代-NTP；
(f)至少α-硼烷代-α-硫代-dNTP或α-硼烷代-α-硫代-NTP；
(g)至少α-硒代-dNTP或α-硒代-NTP；
(h)至少α-R-磷酰基-β，γ-二磷酸脱氧核糖核苷；
(i)至少β，γ-X-α-Z-dNTP类似物或β，γ-X-α-Z-NTP类似物；和
(j)至少γ-R-α-Z-dNTP类似物或y-R-α-Z-NTP类似物；和
其中所述dNTP被配置用于DNA合成且NTP被配置用于RNA合成。
24.如权利要求14所述的方法，其中所述反应混合物包含以下所述至少其一或其组合：
(a)dNTP或NTP，其包含经修饰的糖，其中所述糖环中的氧被具有不同电子负性的原子替换；
(b)dNTP或NTP，其包含含有人工遗传聚合物异种核酸(XNA)的核苷单元；
(c)dNTP或NTP，其包含5-位由选自下组的分子修饰的嘧啶碱基：吸电子基团、供电子基团、乙基基团、乙烯基和乙炔基及其组合，官能团附接其上；和
(d)dNTP或NTP，其包含7-位由选自下组的分子修饰的嘌呤碱基：吸电子基团、供电子基团、乙基基团、乙烯基和乙炔基，官能团附接其上，
其中所述dNTP被配置用于DNA合成且NTP被配置用于RNA合成。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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