CN111566224A - 用于核酸测序的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了用于测序核酸分子的方法和系统。方法可以包括对双链核酸或单链核酸进行测序。测序可以包括使用偶联至静电部分的核苷酸。静电部分可以通过传感器阵列检测。静电部分可以是在掺入核苷酸后从核酸分子切割的可逆静电部分。静电部分可以是不可逆静电部分。可以将包含不可逆静电部分的核苷酸掺入核酸分子，由传感器阵列检测，并交换为不可检测的核苷酸。
Description
交叉引用
本申请要求于2017年9月21日提交的美国临时专利申请号62/561,358以及于2018年4月9日提交的美国临时专利申请号62/655,083的权益，其各自通过引用整体并入本文。
背景技术
阐明整个人类基因组的目标已引起了对快速核酸(例如，DNA)测序技术的关注，无论是小规模还是大规模应用。重要的参数是测序速度、可以在单个测序运行过程中读取的序列长度以及产生测序信息所需的核酸模板的量。大规模基因组项目目前过于昂贵，以至于不能针对大量的受试者(例如，患者)实际地开展。此外，由于对人类疾病的遗传基础的了解增多，对于临床应用负担得起的精确的、高通量DNA测序的需求将会不断增加。用于确定核酸单分子的碱基对序列的实用方法(包括具有高速和长读取长度的那些方法)可提供测量能力。
核酸测序是一种可以用来提供核酸样品的序列信息的过程。这样的序列信息可帮助诊断和/或治疗患有病症的受试者。例如，受试者的核酸序列可以用来鉴定、诊断遗传病以及可能地开发其治疗。作为另一示例，对病原体的研究可导致对接触传染病的治疗。然而遗憾的是，现有技术中存在的测序技术较为昂贵，并且可能无法在一定的时间段内和/或以一定的精确度提供序列信息，从而可能无法足以诊断和/或治疗患有病症的受试者。
发明内容
本公开内容提供了用于样品分析或鉴别如核酸测序的方法和系统。本公开内容提供了可在不使用颗粒(如珠子)的情况下实现样品制备和鉴别(例如，测序)的方法和系统。与其他系统和方法相比，这可使样品能够以显著降低的成本和复杂性来进行制备和鉴别。
在一方面，本公开内容提供了用于检测核酸分子的方法，其包括：提供与传感器阵列相邻的多个双链核酸分子，其中多个双链核酸分子中的给定双链核酸分子与传感器阵列中的给定传感器相邻放置，其中给定双链核酸分子包含第一单链核酸分子和与第一单链核酸分子具有序列互补性的第二单链核酸分子，并且其中给定传感器电偶联至包含给定双链核酸分子的电荷双层；使第二单链核酸分子的至少一部分经历从第一单链核酸分子的释放，以提供第一单链核酸分子的不与第二单链核酸分子杂交的区段；使区段与个体核苷酸接触以使区段经历从个体核苷酸生成第三单链核酸分子的核酸掺入反应，其中第三单链核酸分子与第一单链核酸分子具有序列互补性；以及在进行核酸掺入反应时，使用给定传感器检测指示个体核苷酸掺入第三单链核酸分子的信号，从而确定区段的序列和/或长度。
在一些实施方案中，释放第二单链核酸分子的至少一部分形成侧翼(flap)。在一些实施方案中，从第二单链核酸分子切割侧翼。在一些实施方案中，在检测指示个体核苷酸的掺入的信号后切割侧翼。在一些实施方案中，由侧翼核酸内切酶切割侧翼。在一些实施方案中，侧翼核酸内切酶是嗜中温的。
在一些实施方案中，第二单链核酸分子选自核酸亚单位文库。在一些实施方案中，核酸亚单位文库包含随机序列。在一些实施方案中，核酸亚单位文库中的给定核酸亚单位包含至少五个核苷酸。在一些实施方案中，核酸亚单位文库中的给定核酸亚单位具有至少六种核苷酸。在一些实施方案中，核酸亚单位文库包含肽核酸或锁核酸。
在一些实施方案中，第二单链核酸分子包含一个或多个可检测标记。在一些实施方案中，第二单链核酸分子或其部分从第一单链核酸分子的释放产生可检测信号。
在一些实施方案中，多个双链核酸分子偶联至多个珠子。在一些实施方案中，给定双链核酸分子偶联至多个珠子中的给定珠子，并且电荷双层与给定珠子的表面相邻。在一些实施方案中，多个双链核酸分子偶联至传感器阵列的一个或多个表面。在一些实施方案中，给定双链核酸分子偶联至给定传感器的表面，并且电荷双层与该表面相邻。
在一些实施方案中，该方法进一步包括提供与区段相邻的引发位点，并在引物从引发位点延伸时生成第三单链核酸分子。在一些实施方案中，引发位点是与第一单链核酸分子具有序列互补性的引物序列。在一些实施方案中，该方法进一步包括使用聚合化酶掺入个体核苷酸。在一些实施方案中，给定传感器包含至少两个电极。
在一些实施方案中，个体核苷酸的至少一个子集包含阻止另外的核苷酸与第一单链核酸分子稳定杂交的可逆终止子。在一些实施方案中，在个体核苷酸掺入第三单链核酸分子之后并且在另一个个体核苷酸掺入第三单链核酸分子之前移除可逆终止子。
在一些实施方案中，个体核苷酸的至少一个子集包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记是静电部分。在一些实施方案中，可检测标记偶联至个体核苷酸的至少一个子集的核碱基。在一些实施方案中，个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，每种不同类型的核苷酸可逆地偶联至单一类型的可检测标记。在一些实施方案中，个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，每种不同类型的核苷酸可逆地偶联至不同类型的可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记通过一种或多种偶联机制可逆地偶联至不同类型的核苷酸。在一些实施方案中，可检测标记通过单一偶联机制可逆地偶联至不同类型的核苷酸。在一些实施方案中，在检测指示个体核苷酸的掺入的信号后移除可检测标记。在一些实施方案中，个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，并且使区段按顺序与不同类型的核苷酸接触。
在一些实施方案中，在核酸掺入反应期间的给定时间点，使区段与第一类型的个体核苷酸接触，并且在核酸掺入反应期间的随后时间点，使区段与第二类型的个体核苷酸接触，其中第一类型不同于第二类型。在一些实施方案中，个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，并且使区段同时与不同类型的核苷酸接触。
在一些实施方案中，指示个体核苷酸的掺入的信号是稳态信号。在一些实施方案中，在个体核苷酸的掺入之后检测指示个体核苷酸的掺入的信号一次。在一些实施方案中，在个体核苷酸的掺入之后检测指示个体核苷酸的掺入的信号至少两次。在一些实施方案中，指示个体核苷酸的掺入的信号是瞬时信号。在一些实施方案中，指示个体核苷酸的掺入的信号是由电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。
在一些实施方案中，多个双链核酸分子是双链核酸分子的克隆群。在一些实施方案中，重复该方法直至确定第一单链核酸分子的序列。
在另一方面，本公开内容提供了用于检测核酸分子的方法，其包括：提供与传感器阵列相邻的多个单链核酸分子，其中多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子与传感器阵列中的给定传感器相邻放置，其中给定传感器电偶联至包含第一单链核酸分子的电荷双层；使第一单链核酸分子与个体核苷酸接触以使第一单链核酸分子经历从个体核苷酸生成第二单链核酸分子的核酸掺入反应，其中第二单链核酸分子与第一单链核酸分子具有序列互补性，其中个体核苷酸的至少一个子集包含可检测标记；以及在进行核酸掺入反应的同时或之后，使用给定传感器检测来自可检测标记的信号，该信号指示个体核苷酸掺入第二单链核酸分子，从而确定第一单链核酸分子的序列和/或长度。
在一些实施方案中，多个单链核酸分子偶联至多个珠子。在一些实施方案中，第一单链核酸分子偶联至多个珠子中的给定珠子，并且电荷双层与给定珠子的表面相邻。在一些实施方案中，多个单链核酸分子偶联至传感器阵列的一个或多个表面。在一些实施方案中，第一单链核酸分子偶联至给定传感器的表面，并且电荷双层与该表面相邻。
在一些实施方案中，该方法进一步包括提供与第一单链核酸相邻的引发位点，并在引物从引发位点延伸时生成第二单链核酸分子。在一些实施方案中，引发位点是与第一单链核酸分子具有序列互补性的引物序列。在一些实施方案中，引发位点是自引发环。在一些实施方案中，该方法进一步包括使用聚合化酶掺入个体核苷酸。在一些实施方案中，给定传感器包含至少两个电极。
在一些实施方案中，个体核苷酸的至少另一个子集包含阻止另外的核苷酸与第一单链核酸分子稳定杂交的可逆终止子。在一些实施方案中，在个体核苷酸掺入第二单链核酸分子之后并且在另一个个体核苷酸掺入第二单链核酸分子之前移除可逆终止子。
在一些实施方案中，可检测标记是静电部分。在一些实施方案中，可检测标记偶联至个体核苷酸的至少一个子集的核碱基。在一些实施方案中，个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，每种不同类型的核苷酸可逆地偶联至单一类型的可检测标记。在一些实施方案中，个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，每种不同类型的核苷酸可逆地偶联至不同类型的可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记通过一种或多种偶联机制可逆地偶联至不同类型的核苷酸。在一些实施方案中，可检测标记通过单一偶联机制可逆地偶联至不同类型的核苷酸。在一些实施方案中，在检测指示个体核苷酸的掺入的信号后移除可检测标记。
在一些实施方案中，个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，并且使第一单链核酸分子按顺序与不同类型的核苷酸接触。在一些实施方案中，在核酸掺入反应期间的给定时间点，使第一单链核酸分子与第一类型的个体核苷酸接触，并且在核酸掺入反应期间的随后时间点，使第一单链核酸分子与第二类型的个体核苷酸接触，其中第一类型不同于第二类型。在一些实施方案中，个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，并且使第一单链核酸分子同时与不同类型的核苷酸接触。
在一些实施方案中，指示个体核苷酸的掺入的信号是稳态信号。在一些实施方案中，在个体核苷酸的掺入之后检测指示个体核苷酸的掺入的信号一次。在一些实施方案中，在个体核苷酸的掺入之后检测指示个体核苷酸的掺入的信号至少两次。在一些实施方案中，指示个体核苷酸的掺入的信号是瞬时信号。在一些实施方案中，指示个体核苷酸的掺入的信号是由电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。
在一些实施方案中，多个单链核酸分子是第一单链核酸分子的克隆群。在一些实施方案中，第一单链核酸分子包含自引发环。在一些实施方案中，重复该方法直至确定第一单链核酸分子的序列。
在另一方面，本公开内容提供了用于检测核酸分子的方法，其包括：提供与传感器阵列相邻的多个单链核酸分子，其中多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子与传感器阵列中的给定传感器相邻放置；使第一单链核酸分子经历核酸掺入反应以生成作为与第一单链核酸分子互补的生长链的第二单链核酸分子，其中核酸掺入反应包括交替且按顺序地(i)掺入包含可检测标记的第一多个核苷酸中的个体核苷酸，和(ii)掺入不包含可检测标记的第二多个核苷酸中的个体核苷酸；以及在进行核酸掺入反应的同时或之后，使用给定传感器从包含可检测标记的双层中检测指示电荷或电导率变化的信号，从而确定第一单链核酸分子的序列和/或长度。
在一些实施方案中，第一多个核苷酸包含阻止另外的核苷酸与第一单链核酸分子稳定杂交的终止子。在一些实施方案中，第一多个核苷酸包含双脱氧核苷酸。在一些实施方案中，第二多个核苷酸包含阻止另外的核苷酸与第一单链核酸稳定杂交的可逆终止子。在一些实施方案中，在第一多个核苷酸中的个体核苷酸与第二多个核苷酸中的个体核苷酸交换之后移除可逆终止子。
在一些实施方案中，第一多个核苷酸与第二多个核苷酸交换。在一些实施方案中，第二多个核苷酸的掺入通过沿着第一单链核酸分子在未掺入来自第一多个核苷酸的个体核苷酸的位置处掺入来自第二多个核苷酸的个体核苷酸来校正相位误差。在一些实施方案中，该方法进一步包括使用来自第一多个核苷酸的个体核苷酸继续核酸掺入反应。
在一些实施方案中，可检测标记是不可移除的。在一些实施方案中，可检测标记是静电部分。在一些实施方案中，可检测标记偶联至第一多个核苷酸中的个体核苷酸的核碱基。在一些实施方案中，第一多个核苷酸中的个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，每种不同类型的核苷酸偶联至单一类型的可检测标记。在一些实施方案中，第一多个核苷酸中的个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，每种不同类型的核苷酸偶联至不同类型的可检测标记。
在一些实施方案中，给定传感器电偶联至包含第一单链核酸分子的电荷双层。在一些实施方案中，多个单链核酸分子偶联至多个珠子。在一些实施方案中，第一单链核酸分子偶联至多个珠子中的给定珠子，并且电荷双层与给定珠子的表面相邻。在一些实施方案中，多个单链核酸分子偶联至传感器阵列的一个或多个表面。在一些实施方案中，第一单链核酸分子偶联至给定传感器的表面，并且电荷双层与该表面相邻。
在一些实施方案中，该方法进一步包括提供与第一单链核酸相邻的引发位点，并在引物从引发位点延伸时生成第二单链核酸分子。在一些实施方案中，引发位点是与第一单链核酸分子具有序列互补性的引物序列。在一些实施方案中，引发位点是自引发环。在一些实施方案中，该方法进一步包括使用聚合化酶掺入个体核苷酸。
在一些实施方案中，给定传感器包含至少两个电极。在一些实施方案中，个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，并且使第一单链核酸分子按顺序与不同类型的核苷酸接触。在一些实施方案中，在核酸掺入反应期间的给定时间点，使第一单链核酸分子与第一类型的个体核苷酸接触，并且在核酸掺入反应期间的随后时间点，使区段与第二类型的个体核苷酸接触，其中第一类型不同于第二类型。在一些实施方案中，个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，并且使第一单链核酸分子同时与不同类型的核苷酸接触。
在一些实施方案中，指示个体核苷酸的掺入的信号是稳态信号。在一些实施方案中，在个体核苷酸的掺入之后检测指示个体核苷酸的掺入的信号一次。在一些实施方案中，在个体核苷酸的掺入之后检测指示个体核苷酸的掺入的信号至少两次。在一些实施方案中，指示个体核苷酸的掺入的信号是瞬时信号。在一些实施方案中，指示个体核苷酸的掺入的信号是由电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。
在一些实施方案中，多个单链核酸分子是第一单链核酸分子的克隆群。在一些实施方案中，重复该方法直至确定第一单链核酸分子的序列。在一些实施方案中，第一单链核酸分子是与给定传感器相邻的多个单链核酸分子的一部分，其中包括第一单链核酸分子在内的多个单链核酸分子中的个体单链核酸分子与模板单链核酸分子具有序列同源性。
在另一方面，本公开内容提供了用于检测核酸分子的系统，其包含：包含多个传感器的传感器阵列，其中在使用过程中，多个双链核酸分子中的给定双链核酸分子与传感器阵列中的给定传感器相邻放置，其中给定双链核酸分子包含第一单链核酸分子和与第一单链核酸分子具有序列互补性的第二单链核酸分子，其中给定传感器电偶联至包含给定双链核酸分子的电荷双层；以及可操作地耦合至传感器阵列的一个或多个计算机处理器，其中一个或多个计算机处理器被单独或共同编程以(i)使第一单链核酸分子的未与第二单链核酸分子杂交的区段与个体核苷酸接触，以使区段经历从个体核苷酸生成第三单链核酸分子的核酸掺入反应，其中第三单链核酸分子与第一单链核酸分子具有序列互补性，并且(ii)在进行核酸掺入反应的同时或之后，使用给定传感器检测指示个体核苷酸掺入第三单链核酸分子的信号，从而确定区段的序列和/或长度。
在一些实施方案中，在使用过程中，多个双链核酸分子偶联至多个珠子。在一些实施方案中，在使用过程中，给定双链核酸分子偶联至多个珠子中的给定珠子，并且电荷双层与给定珠子的表面相邻。在一些实施方案中，在使用过程中，多个双链核酸分子偶联至传感器阵列的一个或多个表面。在一些实施方案中，在使用过程中，给定双链核酸分子偶联至给定传感器的表面，并且电荷双层与该表面相邻。在一些实施方案中，给定传感器包含至少两个电极。
在一些实施方案中，在使用过程中，指示个体核苷酸的掺入的信号是稳态信号。在一些实施方案中，在个体核苷酸的掺入之后检测指示个体核苷酸的掺入的信号一次。在一些实施方案中，个体核苷酸掺入了可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记是静电部分。在一些实施方案中，在个体核苷酸的掺入之后检测指示个体核苷酸的掺入的信号至少两次。在一些实施方案中，在使用过程中，指示个体核苷酸的掺入的信号是瞬时信号。在一些实施方案中，在使用过程中，指示个体核苷酸的掺入的信号是由电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。
在另一方面，本公开内容提供了用于检测核酸分子的系统，其包含：包含多个传感器的传感器阵列，其中在使用过程中，多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子与传感器阵列中的给定传感器相邻放置，其中给定传感器电偶联至包含第一单链核酸分子的电荷双层；以及可操作地耦合至传感器阵列的一个或多个计算机处理器，其中一个或多个计算机处理器被单独或共同编程以(i)使第一单链核酸分子与个体核苷酸接触，以使第一单链核酸分子经历从个体核苷酸生成第二单链核酸分子的核酸掺入反应，其中第二单链核酸分子与第一单链核酸分子具有序列互补性，其中个体核苷酸的至少一个子集包含可检测标记，并且(ii)在进行核酸掺入反应的同时或之后，使用给定传感器检测来自可检测标记的信号，该信号指示个体核苷酸掺入第二单链核酸分子，从而确定第一单链核酸分子的序列和/或长度。
在一些实施方案中，在使用过程中，多个单链核酸分子偶联至多个珠子。在一些实施方案中，在使用过程中，第一单链核酸分子偶联至多个珠子中的给定珠子，并且电荷双层与给定珠子的表面相邻。在一些实施方案中，在使用过程中，多个单链核酸分子偶联至传感器阵列的一个或多个表面。在一些实施方案中，在使用过程中，第一单链核酸分子偶联至给定传感器的表面，并且电荷双层与该表面相邻。在一些实施方案中，给定传感器包含至少两个电极。在一些实施方案中，可检测标记是静电部分。
在一些实施方案中，在使用过程中，指示个体核苷酸的掺入的信号是稳态信号。在一些实施方案中，在个体核苷酸的掺入之后检测指示个体核苷酸的掺入的信号一次。在一些实施方案中，在个体核苷酸的掺入之后检测指示个体核苷酸的掺入的信号至少两次。在一些实施方案中，在使用过程中，指示个体核苷酸的掺入的信号是瞬时信号。在一些实施方案中，在使用过程中，指示个体核苷酸的掺入的信号是由电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。
在另一方面，本公开内容提供了用于检测核酸分子的系统，其包含：包含多个传感器的传感器阵列，其中在使用过程中，多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子与传感器阵列中的给定传感器相邻放置；以及可操作地耦合至传感器阵列的一个或多个计算机处理器，其中一个或多个计算机处理器被单独或共同编程以(i)使第一单链核酸分子与个体核苷酸接触，以使第一单链核酸分子经历核酸掺入反应以生成第二单链核酸分子，其中核酸掺入反应包括交替且按顺序地掺入包含可检测标记的第一多个核苷酸中的个体核苷酸以及将第一多个核苷酸中的个体核苷酸与不包含可检测标记的第二多个核苷酸中的个体核苷酸交换，并且(ii)在进行核酸掺入反应的同时或之后，使用给定传感器从包含可检测标记的双层中检测指示电荷或电导率变化的信号，从而确定第一单链核酸分子的序列和/或长度。
在一些实施方案中，在使用过程中，给定传感器电偶联至包含第一单链核酸分子的电荷双层。在一些实施方案中，在使用过程中，多个单链核酸分子偶联至多个珠子。在一些实施方案中，在使用过程中，第一单链核酸分子偶联至多个珠子中的给定珠子，并且电荷双层与给定珠子的表面相邻。在一些实施方案中，在使用过程中，多个单链核酸分子偶联至传感器阵列的一个或多个表面。在一些实施方案中，在使用过程中，第一单链核酸分子偶联至给定传感器的表面，并且电荷双层与该表面相邻。在一些实施方案中，给定传感器包含至少两个电极。在一些实施方案中，可检测标记是静电部分。
在一些实施方案中，在使用过程中，指示个体核苷酸的掺入的信号是稳态信号。在一些实施方案中，在个体核苷酸的掺入之后检测指示个体核苷酸的掺入的信号一次。在一些实施方案中，在个体核苷酸的掺入之后检测指示个体核苷酸的掺入的信号至少两次。在一些实施方案中，在使用过程中，指示个体核苷酸的掺入的信号是瞬时信号。在一些实施方案中，在使用过程中，指示个体核苷酸的掺入的信号是由电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。
从其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案的以下详细描述中，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。将会理解，本公开内容能够具有其他的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和描述将被视为本质上是说明性的而不是限制性的。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入于此，其程度如同具体地和个别地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。在通过引用而并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相抵触的情况下，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对在其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的具体描述和附图(本文也称为“图”)，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解；在附图中：
图1示出了偶联至珠子的非结构化模板核酸分子的模型图；
图2示出了偶联至珠子的结构化模板核酸分子的模型图；
图3示出了用于松弛模板测序的示例处理流程；
图4A-图4D示出了双链测序方法和使用标记的和未标记的核苷酸的测序结果的示例；图4A示出了单链测序结果与双链测序结果之间的示例比较；图4B示出了使用聚阴离子静电部分的双链测序的示例测序结果；图4C示出了使用聚阳离子静电部分的双链测序的示例测序结果；图4D示出了使用聚阴离子静电部分和聚阳离子静电部分二者的双链测序的示例测序结果；
图5示出了双链测序的示例方法；
图6示出了使用随机六聚体的双链测序的示例方法；
图7A和图7B示出了具有可逆终止子的双链测序的示例方法；图7A示出了使用可逆终止子和侧翼核酸内切酶的双链测序的示例方法；图7B示出了使用可逆终止子和核酸亚单位的双链测序的示例方法；
图8示出了针对每种类型的核苷酸使用不同类型的静电部分的示例测序方法；
图9示出了针对每种类型的核苷酸使用单一类型的静电部分的示例测序方法；
图10示出了使用静电部分和可逆终止子的测序的示例方法；
图11A和图11B示出了使用第二单链核酸分子上的可检测标记的双链测序的示例方法；图11A示出了使用由侧翼核酸内切酶切割的可检测标记的示例测序方法；图11B示出了使用可检测标记和可逆终止子的示例测序方法；
图12A和图12B示出了使用可检测标记和侧翼核酸内切酶的双链测序的示例方法；图12A示出了使用可检测标记和嗜中温侧翼核酸内切酶的双链测序的示例方法；图12B示出了使用可检测标记和热稳定侧翼核酸内切酶的双链测序的示例方法；
图13A和图13B示出了使用可检测标记、侧翼核酸内切酶和可逆终止子的双链测序方法的示例方法；图13A示出了使用可检测标记、嗜中温侧翼核酸内切酶和可逆终止子的双链测序的示例方法；图13B示出了使用可检测标记、热稳定侧翼核酸内切酶和可逆终止子的双链测序的示例方法；
图14A示出了使用可检测标记和核酸亚单位的双链测序的示例方法；
图14B示出了使用可检测标记、核酸亚单位和可逆终止子的双链测序的示例方法；
图15示出了用于焦磷酸解作用介导的终止子交换测序的示例方法；
图16示出了被编程或以其他方式配置用于实现本文提供的方法的计算机系统；
图17示出了包含通过接头偶联至核碱基的可检测标记或效应子的经修饰核苷酸的示例；
图18A-图18C示出了可检测标记的示例；图18A示出了具有赖氨酸残基的聚阳离子静电部分的示例；图18B示出了具有羧酸基团的聚阴离子静电部分的示例；图18C示出了包含组氨酸咪唑残基的转换标记的示例，其可响应于缓冲液的pH在中性状态与正电荷状态之间转换；
图19示出了在不同盐浓度下以及在存在或不存在聚乙二醇(PEG)的情况下聚合化酶的活性；
图20阐明了用于校正测序反应过程中的相位误差的方法；
图21是用于校正相位误差的方法的示例；并且
图22是用于校正相位误差的方法的另一示例。
具体实施方式
尽管本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，此类实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用对本文所述的本发明实施方案的各种替代。
如本文所用的术语“邻近于”一般是指紧邻于、接近于或者在感测或电子范围(或距离)内的。例如，邻近于第二物体的第一物体可与第二物体接触，或者可以不与第二物体接触但可以接近该第二物体。在一些示例中，第一物体至第二物体处于第二物体的约0微米(“百万分之一米”)、0.001微米、0.01微米、0.1微米、0.2微米、0.3微米、0.4微米、0.5微米、1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、10微米或100微米内。
如本文所用的，术语“核酸”通常是指包含一个或多个核酸亚单位的分子。核酸可包含选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的一个或多个亚单位。核苷酸可以包括A、C、G、T或U或其变体。核苷酸可包含可掺入正在生长的核酸链中的任何亚单位。这样的亚单位可为A、C、G、T或U，或者对一种或多种互补A、C、G、T或U具有特异性，或与嘌呤(即，A或G或其变体)或嘧啶(即，C、T或U或其变体)互补的任何其他亚单位。在一些示例中，核酸可以是单链或双链的，在一些情况下，核酸分子是环状的。
如本文所用，术语“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”、“寡核苷酸”、“低聚核苷酸”和“多核苷酸”通常是指可具有各种长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)或其类似物。寡核苷酸通常由以下四种核苷酸碱基的特定序列构成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(在多核苷酸为RNA时，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T))。因此，术语“寡核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示；或者，该术语可应用于该多核苷酸分子本身。可将该字母表示输入至具有中央处理器单元的计算机的数据库中并用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性检索。寡核苷酸可包含一种或多种非标准核苷酸、核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸。在一些情况下，低聚核苷酸可以是指具有最多300个碱基对(bp)、最多200bp、最多100bp、最多90bp、最多80bp、最多70bp、最多60bp、最多50bp、最多40bp、最多30bp、最多20bp、最多10bp或更少碱基对的较短的单链核酸序列。在一些情况下，低聚核苷酸在其3’或5’端可以具有适合用于缀合的–C6-NH2官能团。
经修饰的核苷酸的示例包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤，等等。核酸分子还可在碱基部分(例如，在通常可与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸骨架处被修饰。核酸分子还可含有胺修饰的基团，如氨基烯丙基-dUTP(aa-dUTP)和氨基己基丙烯酰胺-dCTP(aha-dCTP)，以允许胺反应性部分如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)的共价附接。在本公开内容的寡核苷酸中，标准DNA碱基对或RNA碱基对的替代物可提供更高的密度(每立方毫米的比特数)、更高的安全性(耐受天然毒素的意外或有目的的合成)、更容易在光编程的聚合酶中区分，或更少的二级结构。与用于从头合成和/或扩增合成的天然和突变聚合酶兼容的替代碱基对在Betz K,Malyshev D A,Lavergne T,Welte W,Diederichs K,Dwyer T J,Ordoukhanian P,Romesberg F E,Marx A(2012)中描述。
如本文所用，术语“核苷酸”通常是指用作核酸分子如脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子的单体或亚单位的有机分子。在一些实施方案中，核苷酸还可以是肽核酸(PNA)核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸或双脱氧核苷酸。
如本文所用，术语“引物”通常是指用作核酸合成如聚合酶链反应(PCR)的起始点的核酸链。在一个示例中，在DNA样品的复制期间，催化复制的酶在引物与DNA样品连接的3’端开始复制，并复制相对的链。
如本文所用，术语“聚合化酶”通常是指能够催化聚合反应的任何酶。聚合酶的示例包括但不限于核酸聚合酶。聚合酶可以是天然存在的或合成的。示例聚合酶为Φ29聚合酶或其衍生物。聚合酶可为聚合作用酶(polymerization enzyme)。在一些情况下，使用转录酶或连接酶(即，催化键的形成的酶)。聚合酶的示例包括DNA聚合酶和RNA聚合酶、热稳定聚合酶、野生型聚合酶、修饰的聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶、噬菌体T4 DNA聚合酶Φ29(phi29)DNA聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pwo聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、Ex-Taq聚合酶、LA-Taw聚合酶、Sso聚合酶Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tca聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、具有3’至5’核酸外切酶活性的Klenow片段聚合酶，或其变体、修饰产物和衍生物。在一些实施方案中，该聚合酶为单亚单位聚合酶。该聚合酶可具有高持续性，即，聚合酶持续将核苷酸掺入核酸模板中而不释放核酸模板的能力。
如本文所用，术语“可检测标记”通常是指与待检测分子偶联的任何可检测部分。可检测标记的非限制性示例可包括静电部分、荧光部分、化学发光部分、放射性部分、比色部分或其任何组合。可检测标记可以可逆地或不可逆地偶联至待检测的分子。这样的部分可以是标记。静电部分的示例包括电荷标记。可检测标记可以在C5或C7位置偶联至核碱基。例如，可逆静电部分可以偶联至掺入核酸分子中的核苷酸。
可检测标记可以通过接头偶联至核碱基。接头可以在C5或C7位置偶联至核碱基。接头可以是非核苷酸分子。接头可以是酸不稳定的、光不稳定的或含有二硫键。接头可将可检测标记保持在距核苷酸足够的距离处，以便不干扰核苷酸与酶之间的任何相互作用。在一些示例中，可检测接头距离核苷酸的距离为至少约1纳米(nm)、2nm、3nm、4nm、5nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm或更大。图17示出了具有通过接头偶联至核苷酸的可检测标记的经修饰核苷酸的示例。在该示例中，由于可检测标记可能影响核苷酸周围的电荷分布，因此可检测标记也可称为效应分子。
如本文所用，术语“静电部分”通常是指包含净正电荷或负电荷的可检测标记，或指附接于化学或生物单元以使该化学或生物单元可检测的部分。例如，静电部分可以包括带电荷的官能团、具有电荷的官能团的一部分，电荷标记或作为可检测标记的带电荷的分子。静电部分可以是单价的(例如，具有+1或-1电荷)或多价的(例如，具有+2，+3，+4，+5，+6等或-1，-2，-3，-4，-5，-6等电荷)。静电部分可以具有净正电荷或负电荷。静电部分可以具有一个或多个阴离子或阳离子电荷基团。在一个示例中，静电部分具有阴离子电荷基团和阳离子电荷基团二者以及净正或负电荷。在另一个示例中，静电部分不是两性离子。静电部分可以具有恒定的净电荷或可以改变电荷。在一个示例中，静电部分根据溶液条件(例如，pH、温度等)来转换或改变电荷。
如本文所用，术语“克隆”通常是指至少一些、基本上全部或全部传感器区域的群体具有相同的核酸序列。可能有两个与单个样品核酸片段相关的群体，可用于“配对”、“配对端”或其他类似的方法；该群体可在传感器区域内以大致相似的数量存在，并且可在传感器区域上随机分布。
如本文所用，术语“相位误差”通常是指给定多核苷酸序列(例如，第二或第三单链核酸分子)与衍生出该给定多核苷酸序列的模板核酸分子之间的误差或差异。给定多核苷酸序列可以是克隆群的一部分，并且给定核苷酸序列可以具有比克隆群的共有状态(例如，参考序列)更长或更短的序列。相位误差可以是超前或滞后的相位误差。超前相位误差可以包括共有(例如，参考)序列中不存在的另外的核苷酸碱基。相对于共有(例如，参考)序列，滞后相位误差可以包括更少的核苷酸碱基。相位误差可能是由聚合化酶误掺入核苷酸碱基或核苷酸碱基掺入不足的产物。相位误差可能会限制测序系统的读取长度。
如本文所用，术语“侧翼”通常是指在单链核酸分子的一部分与另一单链核酸分子杂交或缔合的情况下，该单链核酸分子的不与该另一单链核酸分子杂交或缔合的部分。侧翼的长度可以是至少约1、2、3、4、5、6、8、10、12、15、20、30、40、50或更多个核苷酸碱基。
每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或多个数值中的第一个数值之前时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等同于大于或等于1、大于或等于2或大于或等于3。
每当术语“不超过”、“小于”或“小于或等于”在一系列两个或多个数值中的第一个数值之前时，术语“不超过”、“小于”或“小于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等同于小于或等于3、小于或等于2或小于或等于1。
用于核酸测序的方法
在一方面，本公开内容提供了用于核酸测序的方法。该方法可以包括提供与传感器阵列相邻的多个双链核酸分子。给定的或个体的双链核酸分子可以与传感器阵列的给定的或个体的传感器相邻放置。双链核酸分子可以包含第一单链核酸分子和第二单链核酸分子。第一和第二单链核酸分子可以彼此具有序列互补性。传感器可以电偶联至双链核酸分子的电荷双层(例如，在德拜长度内)。可以从第一单链核酸分子释放第二单链核酸分子的一部分以提供第一单链核酸分子的不与第二单链核酸分子杂交的区段。可以使该区段与个体核苷酸接触。可以使个体核苷酸经历生成第三单链核酸分子的核酸掺入反应。第三单链核酸分子可以与第一单链核酸分子具有序列互补性。在核酸掺入反应期间，传感器可用于检测指示个体核苷酸掺入第三单链核酸分子的信号，从而确定非杂交区段的序列或长度。
在另一方面，本公开内容可以提供用于检测核酸分子的方法。该方法可以包括提供与传感器阵列相邻的多个单链核酸分子，使第一单链核酸分子与个体核苷酸接触，以使第一单链核酸分子经历从个体核苷酸生成第二单链核酸分子的核酸掺入反应，以及在进行核酸掺入反应的同时或之后，使用给定传感器检测来自可检测标记的信号，该信号指示个体核苷酸掺入第二单链核酸分子，从而确定第一单链核酸分子的序列和/或长度。多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子可以与传感器阵列中的给定传感器相邻放置。给定传感器可以电偶联至第一单链核酸分子的电荷双层(例如，在德拜长度内)。第二单链核酸分子可以与第一单链核酸分子具有序列互补性。个体核苷酸的至少一个子集可包含可检测标记。
在另一方面，本公开内容可以提供用于核酸测序的方法。该方法可以包括提供与传感器阵列相邻的多个单链核酸分子，使第一单链核酸分子经历核酸掺入反应以生成作为与第一单链核酸分子互补的生长链的第二单链核酸分子，以及在进行核酸掺入反应的同时或之后，使用给定传感器检测来自可检测标记的信号，该信号指示第一多个核苷酸中的个体核苷酸掺入第二单链核酸分子，从而确定第一单链核酸分子的序列或长度。多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子可以与传感器阵列中的给定传感器相邻放置。核酸掺入反应可包括交替且按顺序地(i)掺入包含可检测标记的第一多个核苷酸中的个体核苷酸，和(ii)掺入不包含可检测标记的第二多个核苷酸中的个体核苷酸。
本文所述的系统和方法可用于检测生物分子和反应。例如，所述的系统和方法可以用于检测结合事件、反应和反应产物和/或生物分子的存在或不存在。在一个示例中，该系统和方法可以用于确定核酸分子的序列。在另一个示例中，该系统和方法可以用于确定核酸分子的长度(例如，核苷酸的数目)。在一个示例中，该系统和方法可用于确定靶核酸分子的序列和长度。该系统和方法可以用于检测核酸多态性，诸如但不限于误掺入的核苷酸、片段大小的改变、重复的核苷酸序列和/或删除的核苷酸序列。确定核酸分子的长度可具有用于医疗保健的应用，诸如用于诊断学(例如，癌症检测)。例如，该系统和方法可以通过检测片段长度的增加来检测微卫星不稳定性。
测序或确定核酸分子的长度可以利用在溶液中游离的或与支持物偶联的核酸模板。支持物可包括珠子、平坦表面、孔或能够与核酸分子偶联的任何其他结构。支持物可以定位在传感器阵列的传感器附近。替代地或附加地，支持物可以是传感器阵列中的传感器的一部分(例如，电极、钝化层、介电层等)。偶联至支持物的核酸模板可以是非结构化的(例如，从支持物表面线性延伸)或可以是结构化的(例如，形成环、发夹和/或其他二级结构)。图1示出了偶联至珠子的非结构化模板核酸的示例。珠子可以与单个核酸模板或多个核酸模板偶联。非结构化模板可以不在珠子的表面周围彼此相互作用。替代地或附加地，非结构化核酸模板可以在珠子的表面周围彼此相互作用。不相互作用的核酸模板可在测序过程中产生单调信号(例如，所掺入的每个核苷酸均生成恒定信号)。图2示出了偶联至珠子的结构化模板核酸的示例。核酸模板可以与其自身相互作用以形成环、发夹和/或其他二级结构。珠子可以具有偶联至其上的单个核酸模板或多个核酸模板。在一个示例中，珠子与多个核酸模板偶联，并且核酸模板可以彼此相互作用。彼此相互作用的核酸模板可以在测序过程中生成非单调信号(例如，所掺入的每个核苷酸生成不同的非线性信号)。
在测序以生成单调信号之前，结构化核酸模板可以是非结构化的或松弛的。模板结构可以在核苷酸掺入(例如，引物延伸反应)之前或在读取或检测掺入事件之前是松弛的。图3示出了用于松弛模板测序的示例方法。结构化模板可以包括无规卷曲、二级结构和/或发夹。在一个示例中，模板包括自引发环。自引发环可以是发夹结构，其允许单链核酸结构延伸而无需单独的引物序列。在结构化状态下，可以通过环介导的扩增(LAMP)来布置自引发环以促进引物延伸反应。自引发环可促进核苷酸掺入核酸模板的3’端。替代地或附加地，自引发环可将核苷酸掺入核酸模板的5’端。掺入核苷酸后，核酸模板的结构可以是松弛的。可以通过改变溶液条件来松弛模板结构，包括但不限于施加热量、改变pH、改变离子强度和/或将一种或多种有机溶剂(例如，甲酰胺或尿素)引入溶液中。然后可以读取松弛核酸模板以检测核苷酸掺入。检测到的信号可以是线性或单调的信号。
使用双链测序可以增加信号线性度。双链测序可包括在溶液中游离的或与支持物偶联的双链核酸模板。双链核酸模板可以具有二级结构，诸如双螺旋结构。双螺旋结构可以减少或防止偶联至相同支持物的双链核酸模板之间的相互作用。减少或防止双链核酸模板之间的相互作用可以增加测序期间检测到的信号的线性度。此外，将双链测序与包含可检测标记的核苷酸结合可以既增加线性度又增加信噪比。图4A-图4D示出了双链测序方法的示例和使用标记的和未标记的核苷酸的测序结果的示例；图4A示出了单链401和双链测序结果402之间的示例比较。单链测序401的示例示出的信号相对于图的y轴既有正也有负，并且非单调地变化。双链测序402的示例示出的信号相对于图的y轴为正，并且随着所掺入核苷酸的数目单调地变化。图4B示出了使用聚阴离子静电部分的双链测序的示例测序结果。聚阴离子静电部分可包括磷酸根、膦酸根、硫酸根、磺酸根、硼酸根或羧酸根基团中的一种或多种。在该示例中，检测到的信号相对于y轴是正的并且是单调的。此外，检测到的信号可以在可检测信号噪声之外(例如，具有高信噪比)。图4C示出了使用聚阳离子静电部分的双链测序的示例测序结果。聚阳离子静电部分可包括吡啶鎓、咪唑鎓、胍鎓、亚胺鎓、伯胺、仲胺、叔胺或季铵中的一种或多种。与聚阴离子静电部分一样，聚阳离子静电部分可生成在可检测信号噪声之外的信号。但是，聚阳离子静电部分可生成负信号或与聚阴离子静电部分生成的信号相反的信号。图4D示出了使用聚阴离子静电部分和聚阳离子静电部分二者的双链测序的示例测序结果。聚阴离子静电部分和聚阳离子静电部分可生成在可检测信号噪声之外并且既有正也有负(例如，彼此有相反的信号方向)的可检测信号。
聚阳离子静电部分可用于诸如在测序期间改善信号噪声比。可检测标记，诸如聚阳离子或聚阴离子静电部分，可用于生成单调信号，即与来自未修饰的核苷酸的信号相比为线性信号。线性信号可能是由于由可检测标记引起的核酸分子的结构转变。该结构转变可导致核酸分子周围离子分布的变化，从而产生与单核苷酸掺入所生成的信号具有相同幅度的信号。
聚阳离子静电部分可包含胺基或氨基酸残基，诸如赖氨酸、组氨酸、精氨酸或其任何组合。聚阳离子静电部分可以从核酸分子附近置换或排斥其他聚阳离子，如镁离子(Mg2 +)。对其他聚阳离子的置换可导致较低的传导电流，该传导电流可被传感器检测为负信号。诸如羧酸基团等聚阴离子静电部分可在核酸分子周围吸引或浓缩聚阳离子，如Mg2+。可检测标记可以包含电荷基团。可检测标记可以是单价的(例如，具有单个正或负电荷，诸如，举例而言，+1或-1)或多价的(例如，具有多个正或负电荷，诸如，举例而言，+2或-2)。可检测标记，诸如聚阳离子或聚阴离子可检测标记，可具有约一至约五十个或更多个正或负电荷。在一些情况下，可检测标记可具有大于或等于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或更多个电荷基团。可检测标记可包括约1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、1至12、1至15、1至20、1至25、1至30、1至40或1至50个电荷基团。在一个示例中，可检测标记可以是包含三个赖氨酸残基、六个赖氨酸残基或多于六个赖氨酸残基的聚阳离子静电部分。在另一个示例中，可检测标记可以是包含三个羧酸基团、六个羧酸基团或多于六个羧酸基团的聚阴离子静电部分。较高浓度的聚阳离子静电部分可导致较高的传导电流，其可被传感器检测为正信号。可检测标记中的聚阳离子或聚阴离子的数量可以与传感器检测到的信号强度相关。例如，与具有三个赖氨酸基团的可检测标记(即，K3标记)相比，具有六个赖氨酸残基的可检测标记(例如，K6标记)可产生更强的负信号。类似地，在可检测标记中，与三个羧酸基团相比，六个羧酸基团可产生更强的正信号。可检测标记的较高电荷状态可导致与诸如玻璃器皿等表面的更强非特异性结合。例如，K6标记可以比K3标记具有更高的电荷状态，因此，与K3标记相比，K6标记可以具有更强的非特异性结合。具有赖氨酸残基的聚阳离子静电部分的示例在图18A中示出。具有羧酸基团的聚阴离子静电部分的示例在图18B中示出。
可检测标记可以在带电荷的状态与中性状态之间或在一个带电荷的状态与另一个带电荷的状态之间转换(例如，正电荷至负电荷或负电荷至正电荷)。可检测标记可以响应于溶液条件(诸如缓冲液条件，例如，诸如缓冲液的pH或离子强度)来转换电荷状态。可转换的可检测标记在核酸掺入反应期间(例如，在信号检测期间)可以处于带电荷的状态，并且在其余时间可以处于中性状态。在一个示例中，在掺入事件期间检测核苷酸掺入，并且可检测标记在掺入期间可以是带电荷的。在另一个示例中，可以在核苷酸掺入之后检测核苷酸掺入，并且可检测标记在掺入期间可以是不带电荷的，但是可以转换使得可检测标记在检测期间是带电荷的。在另一个示例中，可检测标记在掺入期间具有一种电荷(例如，正、负或中性)，并且在检测期间转换成具有另一种电荷(例如，负或正)。与在整个过程中保持带电荷状态的可检测标记(例如K6标记)相比，转换标记可用于减少非特异性结合。组氨酸转换标记的示例在图18C中示出。如图18C所示，转换标记可包含可响应于缓冲液的pH在中性状态与正电荷状态之间转换的组氨酸咪唑残基。示例转换标记可包括具有大于或等于1、2、3、4、5、6、8、10、12或更多个组氨酸基团的可检测标记。在一个示例中，可检测标记具有三个组氨酸基团(例如，H3)，六个组氨酸基团(例如，H6)或六个以上的组氨酸基团。当pH等于或大于7时，转换标记可处于中性状态。当pH等于或小于5时，转换标记可处于正电荷状态。当转换标记处于中性状态时，与处于正电荷状态的该标记相比，该标记无法非特异性地结合至表面，并且可能具有更大的迁移率。转换标记可以在通过传感器进行信号检测期间保持在正电荷状态，以便固定标记。当核苷酸被引导至靠近和/或远离靶核酸分子时(例如，当核苷酸在系统内可移动时)，转换标记可以保持在中性状态。
通过改变反应条件可以减少可检测标记的非特异性结合。例如，可以将K6标记与高浓度的低亲和力肽(诸如K3标记)一起使用。在这种情况下，由于来自低亲和力肽对结合表面的竞争，K6标记可能表现出减少的非特异性结合。在一些情况下，通过使用高离子强度的缓冲液可以减少非特异性结合。例如，具有200mM氯化钾(KCl)的缓冲液可以减少K6标记的非特异性结合，进而使K6标记可移动以将K6标记保持在溶液中。
在与转换标记和/或与包含可检测标记的核苷酸一起使用的改变的反应条件下，聚合化酶可以具有动力学活性。在一些情况下，可以基于动力学活性和/或与可检测标记的相容性来选择聚合化酶。例如，具有较大结合口袋的B型聚合酶(诸如9° N、RB69、KOD聚合酶)可与大的可检测标记一起使用。在一些情况下，可耐受高离子强度的缓冲液的聚合化酶(诸如B型聚合酶、Therminator IX、Bst 3.0、Φ29、Taq聚合酶)可以与高盐缓冲液和聚阳离子静电部分(诸如K6标记)一起使用。聚合化酶的耐受性可通过添加体积排阻剂(诸如，举例而言，聚乙二醇(PEG)、葡聚糖或类似化合物)来改善。如图19所示，在PEG存在下的核酸掺入反应过程中，聚合化酶可表现出改善的耐盐性。模板可偶联至珠子。引物可以与模板链的3’端互补。引物可用6-FAM荧光团进行荧光标记，并通过个体核苷酸的掺入而延伸。引物延伸反应可以通过传感器检测。
引物延伸反应可以通过聚合化酶(诸如，举例而言，热稳定的聚合化酶)来促进。可以用于延伸反应的聚合酶的示例包括但不限于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8、奥飞氏栖热菌(Thermus oshimai)突变体、水管致黑栖热菌(Thermus scotoductus)；嗜热栖热菌1B21、嗜热栖热菌GK24、水生栖热菌的聚合酶(
FS或Taq(G46D、F667Y)、Taq(G46D、F667Y、E6811)和Taq(G46D、F667Y、T664N、R660G)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)聚合酶、蛇发女怪热球菌(Thermococcus gorgonarius)聚合酶、火球菌种GB-D聚合酶、热球菌属(9°N-7菌株)聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)聚合酶(Bst)、热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)DNA聚合酶(Bca)Tsp聚合酶、ThermalAceTM聚合酶(Invitrogen)、黄色栖热菌(Thermus flavus)聚合酶、Thermus litoralis聚合酶、栖热菌Z05聚合酶、δZ05聚合酶(例如δZ05 Gold DNA聚合酶)、硫化叶菌(Sulfolobus)DNA聚合酶IV或其突变体、变体或衍生物。可用于引物延伸反应的聚合酶的其他示例是非热稳定聚合酶，包括但不限于DNA聚合酶I、DNA聚合酶I突变体，包括但不限于Klenow片段和Klenow片段(无3’至5’核酸外切酶活性)、T4 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶突变体、T7 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶突变体、phi29 DNA聚合酶和phi29 DNA聚合酶突变体。
在一些示例中，引物延伸反应可以在各种盐浓度下进行，诸如三种盐浓度(约0mM、100mM和200mM)以及在存在或不存在PEG的情况下。例如，一组实验可以用PEG进行，另一组实验可以不用PEG进行。图19示出了在各种盐和PEG浓度下用不同类型的聚合化酶进行的引物延伸反应的示例结果。当缓冲液缺少KCl(例如，具有0mM KCl)时，无论PEG存在(例如，+PEG)或不存在(例如，-PEG)，Bst2.0聚合酶均可以掺入核苷酸，如在+PEG和-PEG的情况下均存在的峰所示。当缓冲液缺乏KCl(例如，具有0mM KCl)时，无论PEG存在或不存在，TIX聚合酶都无法掺入核苷酸，如在+PEG和-PEG的情况下均不存在峰所示。当缓冲液包含100mM KCl时，无论PEG存在或不存在，两种聚合化酶都可以掺入核苷酸，如在+PEG和-PEG的情况下均存在的峰所示。当缓冲液包含200mM KCl时，在PEG存在下两种聚合化酶都可以掺入核苷酸，如在+PEG中的峰所示，但在PEG不存在下无法掺入核苷酸。
在一些情况下，可通过包含可改善由聚阳离子(例如Mg2+，Ca2+，Zn2+)产生的传导电流的分子来改善信噪比。这样的分子可以与可导致传导电流增加的聚阳离子缔合。可以改善传导电流的分子的非限制性示例包括但不限于核酸分子(例如，dT3、dT6、dT12等)的磷酸二酯主链、羧基谷氨酸Gla(例如，γ-羧基谷氨酸Gla3、Gla6、Gla12等)、特定的肽(例如，具有序列DIETDIET、FDGDFDGD和/或STLPLPP的肽)或小分子(例如，吡啶、NTA、IDA或膦烷)。
可以对靶核酸分子进行测序并且/或者可以确定靶核酸分子的长度。靶核酸分子可以是片段化的核酸分子或可以是非片段化的核酸分子。靶核酸分子可以在检测之前扩增。靶核酸分子可以在溶液中和/或在支持物上扩增。在扩增之前，可以将在支持物上扩增的靶核酸分子固定在支持物上。可通过桥式扩增、野火(wild fire)扩增、重组酶聚合酶扩增、等温扩增或使用任何其他扩增技术来扩增靶核酸分子。测序或确定靶核酸分子的长度可以包括提供与传感器阵列相邻的多个双链核酸分子。给定的或单个的双链核酸分子可以与传感器阵列的给定的或单个的传感器相邻放置。双链核酸分子可以包含第一单链核酸分子和第二单链核酸分子。第一和第二单链核酸分子可以彼此具有序列互补性。传感器可以电偶联至双链核酸分子的电荷双层(例如，在德拜长度内)。可以从第一单链核酸分子释放第二单链核酸分子的一部分以提供第一单链核酸分子的不与第二单链核酸分子杂交的区段。可以使该区段与个体核苷酸接触。可以使个体核苷酸经历生成第三单链核酸分子的核酸掺入反应。第三单链核酸分子可以与第一单链核酸分子具有序列互补性。在核酸掺入反应期间，传感器可用于检测指示个体核苷酸掺入第三单链核酸分子的信号，从而确定非杂交区段的序列。
双链核酸分子可以偶联至支持物。支持物可以是珠子或传感器阵列的一个或多个表面。多个双链核酸分子可以偶联至多个珠子或传感器阵列的表面上的多个位置。多个珠子中的每个珠子可以与给定传感器相邻放置。电荷双层(例如，德拜长度)可以与珠子的表面相邻。替代地或附加地，多个双链核酸分子可以偶联至传感器阵列的一个或多个表面。给定双链核酸分子可以偶联至给定传感器的表面。电荷双层(例如，德拜长度)可以与给定传感器的表面相邻。偶联至支持物的双链核酸分子可在测序之前被克隆扩增，以使支持物表面偶联至双链核酸分子的克隆群。
给定传感器可以包含至少一个、至少两个、至少三个或至少四个电极或者更多个电极。在一个示例中，给定传感器包含至少两个电极。在另一个示例中，给定传感器包含两个电极。电极可暴露于发生引物延伸反应的溶液。替代地或附加地，电极可以埋在传感器阵列内，并且因此可以不暴露于发生引物延伸反应的溶液。给定传感器的电极可以检测指示个体核苷酸掺入双链核酸分子中的信号。指示掺入事件的信号可以包括电子双层中的阻抗、电导或电荷的变化。在一个示例中，指示个体核苷酸的掺入的信号是由电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。指示个体核苷酸的掺入的信号可以是稳态信号、瞬时信号或稳态信号与瞬时信号的组合。信号可瞬时检测或在稳态条件下检测。在瞬时信号检测模式中，检测发生在核苷酸掺入期间或紧随其后。在稳态检测中，传感器的读取可在掺入事件完成之后发生。信号的稳态变化可以是恒定的，直至向传感器周围的环境引入变化。
图5示出了用于双链测序的示例方法。双链核酸模板可以具有均匀结构，该结构对由于核苷酸掺入引起的电荷变化产生线性、基本线性或半线性的响应。双链核酸可包含与第一单链核酸(例如，待测序的核酸模板)的3’端相邻的引发位点。引物503可以与第一单链核酸分子的3’端具有互补性，并且可以与第一单链核酸分子的3’端杂交。替代地或附加地，第二双链核酸可以被切口以提供引物和待置换的链(例如，置换链)。第二单链核酸可以包含尿嘧啶核苷酸。第二单链核酸分子可以在尿嘧啶核苷酸处被切口。第二单链核酸分子可以被能够切割尿嘧啶的任何酶(例如，尿嘧啶DNA糖苷酶)切口。聚合化酶502可结合至双链核酸并促进引物延伸反应。在一个示例中，聚合化酶502是聚合酶，诸如Bst DNA聚合酶。引物延伸反应可以置换第二单链核酸的末端并产生单链侧翼505和第一单链核酸分子的不与第二单链核酸分子杂交的区段。区段可以是第一单链核酸分子的不与第二或第三单链核酸分子杂交的部分。该区段可以不包含整个第一单链核酸分子。该区段的长度可以是单个核苷酸，或者可以是多个核苷酸。侧翼505可以是偶联至第二单链核酸分子但不与第一单链核酸分子杂交的核苷酸。侧翼505可诱导聚合化酶502打滑(stutter)并导致测序期间的定相(phasing)。侧翼505可以被侧翼核酸内切酶(FEN)501识别并切割。FEN 501可以是热稳定的或嗜中温的。在切割侧翼505之后和随后的核酸掺入反应期间，热稳定FEN可以保持与核酸缔合。嗜中温FEN可以在引物延伸反应期间灭活，并且可以在每个掺入和检测循环后补充到系统中。在检测指示核苷酸504掺入的信号之后并且在随后的核苷酸掺入之前，可以切割该侧翼。核苷酸504的掺入可以产生双链核酸分子的负电荷的增加。切割侧翼505可以产生双链核酸的负电荷的损失。因此，核苷酸的掺入与随后侧翼的切割可以产生电荷的净中性变化，导致很少有或没有可检测信号。
双链核酸的第二单链核酸可以包含亚单位。图6示出了使用核酸亚单位601进行双链测序的示例方法。核酸亚单位601可以选自核酸亚单位601的文库。核酸亚单位的文库可以包含随机序列。核酸亚单位601可以包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个核苷酸。在一个示例中，核酸亚单位601包含至少5个核苷酸。在一个示例中，核酸亚单位601包含至少6个核苷酸。核酸亚单位601可以全部具有相同的长度或可以具有不同的长度。核酸亚单位的文库可以包含DNA亚单位、肽核酸(PNA)亚单位、RNA亚单位或锁核酸(LNA)亚单位。核酸亚单位601与第一单链核酸(例如，核酸模板分子)之间的缔合可以生成双链核酸分子并使核酸模板线性化。核苷酸504掺入(例如，通过引物延伸反应)可以置换亚单位并提供非杂交单链核酸模板的区段。在一个示例中，核酸亚单位是不带电荷的，因此，核酸亚单位601的置换不会改变双链核酸分子的电荷状态。在一个示例中，核酸亚单位是带电荷的并且亚单位601的置换改变双链核酸分子的电荷状态。核酸亚单位的使用可以有利于不使用FEN的双链测序。
个体核苷酸可以包含可逆终止子。可逆终止子可以防止随后的核苷酸添加到第三单链核酸分子中。备选地或附加地，可逆终止子可阻止另外的核苷酸与第一单链核酸分子稳定杂交。可逆终止子可在掺入循环中减少均聚物的形成和/或一个以上核苷酸的掺入。可逆终止子可以偶联至核苷酸戊糖的3’羟基基团的氧原子(例如，3’-O-封闭的可逆终止子)。替代地或附加地，可逆终止子可以偶联至核苷酸的核碱基(例如，3’-无封闭的可逆终止子)。可逆终止子可包含可检测标记。可逆终止子可包含烯丙基、羟胺、乙酸、苯甲酸、磷酸、叠氮甲基或酰胺基团。可逆终止子可通过用还原剂、酸或碱、有机溶剂、离子表面活性剂、光子(光解)或其任何组合处理来移除。移除3’-O-封闭的可逆终止子的可逆终止子可以使羟基基团返回核苷酸的戊糖，并允许随后的核苷酸掺入第三单链核酸分子中。
图7A和图7B示出了使用可逆终止子701进行双链测序的示例方法。图7A示出了使用可逆终止子和FEN 501进行双链测序的示例方法。双链核酸的第二单链核酸可以包含被尿嘧啶-DNA糖苷酶切口的尿嘧啶核苷酸。替代地或附加地，第二单链核酸分子可包含置换链和引物。聚合化酶502可以结合至引物503。聚合化酶可以是使掺入高效且保真的酶。聚合化酶可以是但不限于，Bst聚合酶、逆转录酶、A型聚合酶、B型聚合酶或C型聚合酶。聚合化酶可掺入包含可逆终止子701的个体核苷酸。核苷酸701的掺入可生成侧翼。可以检测掺入的核苷酸701，并且在检测之后，可以通过FEN 501切割侧翼。FEN 501可以是嗜中温的。在检测掺入的核苷酸后，可以使嗜中温FEN 501与侧翼接触，并可以在下一个掺入循环之前将其移除。FEN 501可以随每个核苷酸掺入循环进行补充。可逆终止子可以在侧翼切割期间或之后逆转。可逆终止子可通过将还原剂引入溶液中而逆转。在一个示例中，还原剂是二硫苏糖醇(DTT)。在可逆终止子逆转后，重复核苷酸掺入、检测、侧翼切割和终止子逆转的循环，直至对第一单链核酸的一部分或全部进行测序。
图7B示出了使用可逆终止子和核酸亚单位的双链测序的示例方法。第二单链核酸分子可以包含随机核酸亚单位。第二单链核酸分子可以另外包含引物503。聚合化酶502可以结合至引物，并将个体核苷酸701掺入第三单链核酸分子中。个体核苷酸可以置换一部分或全部核酸亚单位。掺入的核苷酸可以在掺入第三单链核酸分子后被检测。个体核苷酸可以包含可逆终止子。可逆终止子可以在检测掺入的核苷酸后逆转。可逆终止子可通过将还原剂引入溶液中而逆转。在一个示例中，还原剂是DTT。在可逆终止子逆转后，可以重复核苷酸掺入、检测和逆转终止子的循环，直至对第一单链核酸的一部分或全部进行测序。
双链核酸分子可以包含可检测标记。可检测标记可以是静电部分、荧光标记、比色标记、化学发光标记、放射性标记或其任何组合。可检测标记可以偶联至第二单链核酸分子、待掺入第三单链核酸中的核苷酸或其任何组合。可检测标记可以偶联至核苷酸的磷酸、核苷酸的核碱基或偶联至与核苷酸偶联的可逆终止子。在一个示例中，可检测标记偶联至核苷酸的核碱基。可检测标记可以可逆或不可逆地偶联至核苷酸。可检测标记可生成指示核苷酸掺入第三单链核酸分子或从第二单链核酸分子切割核苷酸的信号。来自可检测标记的信号可以由传感器阵列检测。
在一个示例中，每种不同类型的核苷酸可以偶联至不同的可检测标记。每种类型的可检测标记可指示其结合的核苷酸碱基。例如，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的每一种可具有彼此间可分辨的不同可检测标记。图8示出了各自具有不同的静电部分和可逆终止子801的示例核苷酸。静电部分可以是聚阴离子或聚阳离子静电部分。一个或多个个体核苷酸可以不具有静电部分。一个或多个个体核苷酸可以具有聚阳离子静电部分。聚阳离子静电部分可以具有不同程度的电荷。一个或多个个体核苷酸可以具有聚阴离子静电部分。聚阴离子静电部分可以具有不同程度的电荷。双链核酸分子上过量电荷的存在可降低聚合化酶的效率。聚合化酶可以是能够高效且保真地掺入具有可检测标记的核苷酸的酶。聚合化酶可以是但不限于，Bst聚合酶、逆转录酶、A型聚合酶、B型聚合酶或C型聚合酶。静电部分可以可逆或不可逆地偶联至核苷酸。核苷酸静电部分可以偶联至第二单链核酸分子或偶联至掺入第三单链核酸的中个体核苷酸。在一个示例中，静电部分偶联至掺入第三单链核酸分子中的个体核苷酸。可以引导个体核苷酸单独且按顺序接触双链核酸(例如，与A接触，然后与T接触，然后与C接触，再与G接触等等)，并且传感器可以检测每次添加之间的核苷酸掺入。替代地或附加地，可以引导核苷酸同时与双链核酸分子接触(例如，一次性接触包含所有G、A、T和C的溶液)，并且传感器可以检测核苷酸掺入后电荷的变化。偶联至不同类型的个体核苷酸的不同的静电部分可以允许掺入到第三单链核酸分子中的每种类型的个体核苷酸被检测并彼此区分。每个掺入循环可使用单次读取来解析个体核苷酸。在检测核苷酸掺入后，可将可检测标记从核苷酸上切割下来。切割反应可包括还原反应、酸或碱切割、在有机溶剂(例如甲酰胺或尿素)中切割、通过离子表面活性剂切割或其组合。
在一个示例中，每种不同类型的核苷酸可以具有相同的可检测标记。图9示出了各自具有相同的静电部分和不同的可逆偶联机制的示例核苷酸。可以通过还原反应、酸或碱切割、在有机溶剂中切割、通过离子表面活性剂切割或其组合来使偶联机制解偶联或切割。此外，静电部分可通过多种偶联机制偶联至个体核苷酸，该偶联机制包括但不限于共价键、缔合-解离相互作用、配体和结合对相互作用(例如，链霉亲和素-生物素相互作用)、杂交相互作用或其任何组合。可以引导个体核苷酸单独和按顺序接触双链核酸(例如，与A接触，然后与T接触，然后与C接触，再与T接触等等)，并且传感器可以检测每次添加之间的核苷酸掺入。替代地或附加地，可以引导核苷酸同时与双链核酸接触(例如，一次性接触具有所有A、T、C和G的溶液)，并且传感器可以检测核苷酸掺入后电荷的变化。电荷的变化可以用于确定核酸靶分子的长度。在一个示例中(参见图9)，核苷酸G、A和T均具有被条件一切割的相同的聚阴离子静电部分。核苷酸C可以不具有静电部分。A的静电部分可进一步包含在条件二下切割的第二偶联机制。T的静电部分最初在核苷酸掺入期间可能不存在，但是可以使用第三偶联机制(例如，链霉亲和素-生物素)偶联至核苷酸。双链核酸分子可以一次性与所有四种核苷酸接触。一个或多个核苷酸可以掺入与传感器阵列相邻的多个第三单链核酸分子中。掺入反应后，可以读取或检测核苷酸掺入。在该示例中，核苷酸G和A在初始读取(例如，检测循环)期间可以具有聚阴离子静电部分，并且G和A都可以生成可检测信号。核苷酸T和C最初可能不包含静电部分，也可能不生成可检测信号。可以通过使核苷酸与第二切割条件接触来移除A的静电部分，并且T可以通过引入包含第三偶联机制(例如，链霉亲和素基团)的静电部分来获得静电部分。可以执行第二次读取(例如，检测循环)，并且G和T都可以生成可检测信号，而A和C都可以不生成可检测信号。然后可以通过合并来自第一次和第二次读取的信号并将信号与相应的核苷酸相匹配来解析并区分掺入的核苷酸。在第一次和第二次读取之后，可以使用切割条件1来切割静电部分。
图10示出了使用静电部分和可逆终止子的测序的示例方法。待测序的核酸模板可以经历核酸掺入反应(例如，引物延伸反应)。掺入的核苷酸可以具有可切割的静电部分和可逆终止子。可逆终止子可以防止后续添加的核苷酸掺入延伸的引物中。掺入核苷酸后，可以读取或检测掺入的核苷酸。读取后，可以切割静电部分，并且可以移除可逆终止子。可以切割静电部分，并且可以使用相同的化学方法移除终止子。示例化学方法包括用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理。替代地或附加地，可以切割静电部分，并且可以使用不同的切割和移除化学方法移除终止子。
可检测标记可以偶联至在引物延伸反应过程中掺入的核苷酸，或者可以偶联至第二单链核酸分子的核苷酸。在一个示例中，第二单链核酸(例如，置换链)可包含一个或多个可检测标记。图11A和图11B示出了使用偶联至第二单链核酸分子的可检测标记的双链测序的示例方法。图11A示出了使用由侧翼核酸内切酶501切割的可检测标记的示例测序方法。双链核酸分子的第二单链核酸分子可以包含可检测标记。可检测标记可以是静电部分。第二单链核酸分子的每个核苷酸可以偶联至静电部分。第二单链核酸分子中的每种不同类型的核苷酸可以偶联至不同的静电部分或偶联至相同的静电部分。聚合化酶502可以结合至与置换链末端相邻的引物503。聚合化酶503可以将核苷酸504掺入第三单链核酸分子中。掺入的核苷酸可以或可以不具有静电部分。核苷酸的掺入可生成侧翼。侧翼可以通过FEN 501切割。FEN 501可以是热稳定的或嗜中温FEN。通过FEN 501进行的侧翼切割可从置换链上移除静电部分，从而改变双链核酸分子的电荷状态。电荷状态的变化可以由传感器阵列检测以生成第一单链核酸分子的序列。可以重复核苷酸掺入、侧翼切割以及电荷变化检测的循环，直至确定第一单链核酸分子的序列。
图11B示出了使用偶联至第二单链核酸分子的可检测标记和可逆终止子二者的示例双链测序方法。可检测标记可以是静电部分。第二单链核酸分子的每个核苷酸可以偶联至静电部分。第二单链核酸分子中的每种不同类型的核苷酸可以偶联至不同的静电部分或偶联至相同的静电部分。聚合化酶502可以结合至与置换链末端相邻的引物503。聚合化酶502可以将个体核苷酸701掺入第三单链核酸分子中。掺入的核苷酸可以或可以不具有静电部分和可逆终止子。侧翼可以通过FEN切割。FEN可以是热稳定的或嗜中温的。通过FEN进行的侧翼切割可从置换链上移除静电部分，从而改变双链核酸分子的电荷状态。可以检测电荷状态的变化以生成第一单链核酸分子的序列。在检测核苷酸掺入之后，新掺入的核苷酸可以经历切割反应以移除可逆终止子。移除可逆终止子可以允许随后的核苷酸掺入第三单链核酸分子中。可以重复核苷酸掺入、生成的侧翼的切割、电荷变化的检测以及可逆终止子的移除的循环，直至确定第一单链核酸分子的序列。该方法可以包括进行大于或等于1、2、3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或更多个核苷酸掺入和检测循环。核苷酸掺入和检测可以进行设定的循环次数，或者可以进行直至引物延伸反应完成。
可检测标记可以偶联至掺入第三单链核酸分子中的个体核苷酸。图12A示出了使用个体核苷酸偶联的静电部分1201和嗜中温FEN 501的双链测序的示例方法。聚合化酶可以结合至第二单链核酸分子的引物，以促进个体核苷酸1201的掺入。个体核苷酸1201可以包含结合至核苷酸的核碱基的静电部分。个体核苷酸的掺入可生成侧翼。侧翼可以通过FEN切割。FEN可以是嗜中温FEN，并且可以在每个掺入循环之后再生。在检测核苷酸掺入事件后可以切割侧翼。静电部分可以可逆地偶联至核苷酸。静电部分可以在切割侧翼的同时或之后切割。可以重复核苷酸掺入、核苷酸掺入的检测、生成的侧翼的切割和静电部分的切割的循环，直至确定第一单链核酸分子的至少一部分的序列。
图12B示出了使用静电部分和热稳定FEN的双链测序的示例方法。聚合化酶502可以结合至第二单链核酸分子的引物503，以促进个体核苷酸1201的掺入。个体核苷酸1201可以包含结合至核苷酸的核碱基的静电部分。个体核苷酸的掺入可生成侧翼。侧翼可以通过FEN 501切割。FEN 501可以是热稳定FEN，并且可以在切割侧翼后保持与双链核酸分子缔合。在每个掺入循环之后，热稳定FEN可以不再生。在检测核苷酸掺入事件之前可以割侧翼。静电部分可以可逆地偶联至核苷酸，并且可以在检测核苷酸掺入事件后被切割。可以重复核苷酸掺入、生成的侧翼的切割、核苷酸掺入的检测以及静电部分的移除的循环，直至确定第一单链核酸分子的至少一部分的序列。
个体核苷酸可同时包含可检测标记和可逆终止子。图13A示出了使用静电部分、可逆终止子和嗜中温FEN的双链测序的示例方法。聚合化酶502可以结合至第二单链核酸分子的引物503，以促进个体核苷酸1301的掺入。个体核苷酸1301可以包含结合至核苷酸的核碱基的静电部分和结合至戊糖的3’侧的可逆终止子。可逆终止子可以减少均聚物形成和/或每个循环多个核苷酸的掺入。个体核苷酸的掺入可生成侧翼。侧翼可以通过FEN 501切割。FEN 501可以是嗜中温FEN，并且可以在每个掺入循环之后再生。在检测到核苷酸掺入事件后可以切割侧翼。静电部分可以可逆地偶联至核苷酸。静电部分可以在切割侧翼的同时或之后切割。可逆终止子可以在切割静电部分之前、同时或之后逆转。在一个示例中，通过还原剂(诸如DTT或TCEP)切割静电部分和逆转可逆终止子。可以重复核苷酸掺入、核苷酸掺入的检测、生成的侧翼的切割、静电部分的切割和逆转可逆终止子的循环，直至确定第一单链核酸分子的至少一部分的序列。该方法可以包括进行大于或等于1、2、3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或更多个核苷酸掺入和检测的循环。核苷酸掺入和检测可以进行设定的循环次数，或者可以进行直到引物延伸反应完成。
图13B示出了使用静电部分、热稳定FEN和可逆终止子的双链测序的示例方法。聚合化酶502可以结合至第二单链核酸分子的引物503，以促进个体核苷酸1301的掺入。个体核苷酸1301可以包含结合至核苷酸的核碱基的静电部分和在3’侧的可逆终止子。可逆终止子可以减少均聚物形成和/或每个循环多个核苷酸的掺入。个体核苷酸的掺入可生成侧翼。侧翼可以通过FEN 501切割。FEN 501可以是热稳定FEN，可以在切割侧翼后保持与双链核酸分子缔合。在每个掺入循环之后，热稳定FEN可以不再生。在检测核苷酸掺入事件之前可以割侧翼。静电部分可以可逆地偶联，并且可以在检测核苷酸掺入事件后被切割。可逆终止子可以在切割静电部分的同时或在切割静电部分之后逆转。在一个示例中，通过还原剂(诸如DTT或TCEP)切割静电部分和逆转可逆终止子。可以重复核苷酸掺入、生成的侧翼的切割、核苷酸掺入的检测、静电部分的切割以及可逆终止子的移除的循环，直至确定第一单链核酸分子的至少一部分的序列。该方法可以包括进行大于或等于1、2、3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或更多个核苷酸掺入和检测的循环。核苷酸掺入和检测可以进行设定的循环次数，或者可以进行直到引物延伸反应完成。
图14A示出了使用可检测标记和核酸亚单位的双链测序的示例方法。可检测标记可以是静电部分。可检测标记可以可逆地偶联至个体核苷酸。第二单链核酸可以包含随机核酸亚单位和引物503。聚合化酶502可以结合至引物503。聚合化酶502可以将具有静电部分的个体核苷酸掺入第三单链核酸分子中。个体核苷酸1201的掺入可以置换一部分或全部随机核酸亚单位。传感器阵列可以在个体核苷酸掺入第三单链核酸分子中之后检测指示掺入事件的信号。在检测掺入事件之后，可以切割可逆静电部分。在一个示例中，用还原剂(诸如DTT或TCEP)切割可逆静电部分。可以重复核苷酸掺入、核酸亚单位置换、个体核苷酸检测和静电部分切割的循环，直至确定第一单链核酸分子的至少一部分的序列。该方法可以包括进行大于或等于1、2、3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或更多个核苷酸掺入和检测的循环。核苷酸掺入和检测可以进行设定的循环次数，或者可以进行直到引物延伸反应完成。
图14B示出了使用可检测标记、核酸亚单位和可逆终止子的双链测序的示例方法。可检测标记可以是静电部分。可检测标记可以可逆地偶联至个体核苷酸1301。个体核苷酸可以在3’侧包含可逆终止子。第二单链核酸可以包含随机核酸亚单位和引物503。聚合化酶502可以结合至引物503。聚合化酶502可以将具有静电部分和可逆终止子的个体核苷酸1301掺入第三单链核酸分子中。个体核苷酸的掺入可以置换一部分或全部随机核酸亚单位。传感器阵列可以在个体核苷酸掺入第三单链核酸分子中之后检测指示掺入事件的信号。在检测掺入事件之后，可以切割可逆静电部分。可逆终止子可以在切割静电部分的同时或之后移除。在一个示例中，用还原剂(诸如DTT或TCEP)同时切割可逆静电部分和可逆终止子。可以重复核苷酸掺入、核酸亚单位置换、个体核苷酸检测、静电部分切割以及可逆终止子移除的循环，直至确定第一单链核酸分子的至少一部分的序列。该方法可以包括进行大于或等于1、2、3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或更多个核苷酸掺入和检测的循环。核苷酸掺入和检测可以进行设定的循环次数，或者可以进行直至引物延伸反应完成。
可以对靶核酸分子进行测序并且/或者可以确定靶核酸分子的长度。靶核酸分子可以是片段化的核酸分子或可以是非片段化的核酸分子。靶核酸分子可以在检测之前扩增。靶核酸分子可以在溶液中和/或在支持物上扩增。在扩增之前，可以将在支持物上扩增的靶核酸分子固定在支持物上。可通过桥式扩增、野火扩增、重组酶聚合酶扩增、等温扩增或使用任何其他扩增技术来扩增靶核酸分子。测序或确定靶核酸分子的长度可以包括提供与传感器阵列相邻的多个单链核酸分子。多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子可以与传感器阵列中的给定传感器相邻放置。给定传感器可以电偶联至含有第一单链核酸分子的电荷双层(例如，在德拜长度内)。可以使第一单链核酸分子与个体核苷酸接触，以使第一单链核酸分子经历核酸掺入反应。核酸掺入反应(例如，引物延伸反应)可以从个体核苷酸生成第二单链核酸分子。第二单链核酸分子可以与第一单链核酸分子具有序列互补性。个体核苷酸的至少一个子集可包含可检测标记。传感器阵列中的给定传感器可以用于在进行核酸掺入反应期间或之后检测来自可检测标记的信号，该信号指示个体核苷酸的掺入。检测到的信号可以用于确定第一单链核酸分子的序列。
多个单链核酸分子可以偶联至多个支持物。多个支持物可以是传感器阵列上的多个珠子或多个表面。在一个示例中，多个单链核酸分子可以偶联至多个珠子，并且给定单链核酸分子可以偶联至给定珠子。电荷双层可以与给定珠子的表面相邻。单链核酸分子可以在珠子的表面上扩增。扩增产物可以偶联至珠子的表面。扩增产物可以在珠子的表面上形成单链核酸分子的克隆群落。可以对单链核酸分子的克隆群落进行测序。
在一个示例中，多个单链核酸分子可以偶联至传感器阵列上的多个表面，并且给定单链核酸分子偶联至给定传感器的表面。电荷双层可以与给定传感器的表面相邻。单链核酸分子可以在传感器的表面上扩增。扩增产物可以偶联至传感器的表面。扩增产物可以在传感器的表面上形成单链核酸分子的克隆群落。可以对单链核酸分子的克隆群落进行测序。
传感器阵列中的给定传感器可以包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或更多个电极。在一个示例中，给定传感器包含至少两个电极。在另一个示例中，给定传感器包含两个电极。电极可暴露于发生引物延伸反应的溶液。替代地或附加地，电极可以埋在传感器阵列内，并且因此可以不暴露于发生引物延伸反应的溶液。传感器可以检测指示核苷酸掺入事件的信号。传感器可以检测偶联至个体核苷酸的可检测标记。传感器可以在瞬时或稳态条件期间检测可检测标记。在稳态条件期间，可以每个掺入循环一次、两次、三次、四次或四次以上地检测核苷酸掺入。在一个示例中，在稳态条件期间，可以每个掺入循环至少两次检测核苷酸掺入。传感器阵列可以在瞬时或稳态条件期间检测电信号。电信号可以包括但不限于分子的电荷状态变化、周围溶液的电导率变化、阻抗信号或阻抗信号变化。传感器可以检测电荷和/或电导率的变化或阻抗的变化。传感器可以检测传感器、支持物或核酸分子(例如，样品)的电荷双层(例如，德拜长度)内的电荷和/或电导率或阻抗的变化。偶联至个体核苷酸的可检测标记可以改变单链核酸分子周围的电环境，并且给定传感器可以检测电变化。
第二单链核酸分子可以包含与第一单链核酸分子相邻的引发位点。引发位点可以是与第一单链核酸分子具有序列互补性的引物。第二单链核酸分子可以通过起始自引物的引物延伸反应生成。在一个示例中，引物是自引发环。在引物延伸反应期间，自引发环可以处于结构或环状构型中。掺入个体核苷酸后，自引发环的结构可以松弛以形成线性核酸分子。可以在松弛的非结构化状态期间检测个体核苷酸的掺入。可以通过提高反应温度、改变溶液pH、改变溶液离子强度、向溶液中引入甲酰胺或通过使核酸结构变性的任何其他方法来松弛自引发环。
可以使不同类型的个体核苷酸按顺序与单链核酸分子接触(例如，一次单个核苷酸)。在每种类型的个体核苷酸与单链核酸分子接触之后，可以检测指示核苷酸掺入的信号。在一个示例中，可使单链核酸分子与A核苷酸接触，随后检测指示核苷酸掺入的信号。然后可使单链核苷酸与T核苷酸接触，随后进行信号检测。然后可使单链核苷酸与G核苷酸接触，随后进行信号检测。可使单链核苷酸与C核苷酸接触，然后进行信号检测。该循环可以重复直至确定单链核酸分子的全部或部分序列。该方法可以包括进行大于或等于1、2、3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或更多个核苷酸掺入和检测的循环。
单链核酸分子可以同时与不同类型的核苷酸接触。例如，单链核酸分子可以一次性与所有A、T、C和G接触。替代地或附加地，单链核酸分子可以一次性与A、T、C和G的任何组合接触。例如，单链核酸分子可以一次性与A和T、C和G、A和C、A和G、T和C或T和G接触。在一个示例中，使单链核酸分子同时与所有A、T、C和G接触，随后进行信号检测以确定核酸分子的序列长度或序列。可以重复该循环，直至确定单链核酸分子的全部或部分序列。
个体核苷酸可以包含可检测标记。可检测标记可以可逆地或不可逆地偶联至个体核苷酸。可检测标记可以偶联至个体核苷酸的核碱基。个体核苷酸可以包含不同类型的核苷酸。在一个示例中，可检测标记可以是静电部分。每种不同类型的个体核苷酸可以偶联至相同或单一类型的可检测标记。每种不同类型的个体核苷酸可以通过不同的偶联机制偶联至相同类型的可检测标记。可将可检测标记选择性地偶联至个体核苷酸或从个体核苷酸切割。例如，当与单链核酸分子接触时，个体核苷酸可以包含可检测标记。掺入后，可以检测个体核苷酸的信号并生成正信号(例如，检测到信号)。可检测标记可以在给定的切割条件下被去除。移除可检测标记后，掺入的核苷酸可生成空信号(例如，未检测到信号)。在使用双重读取测序方法的示例中(参见图9)，个体核苷酸可以具有正信号/空信号，正信号/正信号，空信号/空信号或空信号/正信号。在一个示例中，单链核酸分子可以同时与四种不同类型的核苷酸接触，并且聚合化酶可以促进核苷酸掺入。每个核苷酸可以具有相同或不同的可检测标记。在一个示例中，每种类型的核苷酸具有不同的可检测标记，并且检测核酸分子的序列。在另一个示例中，每种类型的核苷酸具有相同的可检测标记，并且检测核酸分子的长度。在核苷酸掺入之后，可以测量指示核苷酸掺入的信号。掺入的核苷酸可以生成多种正信号和空信号。可以用切割和/或偶联条件处理单链核酸分子。用切割和/或偶联条件处理后，可再次测量指示核苷酸掺入的信号。掺入的核苷酸可以生成多种正信号和空信号。正信号和空信号的模式可用于确定哪种类型的核苷酸掺入第二单链核酸分子中。在第二检测循环之后，可以使用第二切割条件移除静电部分。
在一个示例中，每种不同的个体核苷酸可以偶联至不同的可检测标记。可检测标记可以是静电部分。静电部分可以包括聚阴离子、聚阳离子或中性静电部分。单链核酸分子可以按顺序或同时与不同的核苷酸接触。在一个示例中，单链核酸分子可以同时与不同的个体核苷酸接触，并且不同的个体核苷酸中的每个个体核苷酸可以偶联至不同的静电部分。聚合化酶可以促进个体核苷酸掺入第二单链核酸分子中。掺入个体核苷酸后，传感器阵列可以检测指示个体核苷酸掺入的信号。不同的个体核苷酸可以生成代表不同电荷基团的信号和代表与它们偶联至的静电部分相对应的不同电荷量级的信号。信号检测后，可以移除可检测标记。
个体核苷酸可包含可逆终止子、可检测标记以及可逆终止子和可检测标记两者。可逆终止子可以偶联至个体核苷酸的3’侧。可逆终止子可阻止另外的核苷酸与第一单链核酸分子稳定杂交。在检测指示核苷酸掺入的信号后，可以移除可逆终止子。移除可逆终止子可以允许随后的核苷酸掺入。在一个示例中，单链核酸分子可以与包含不同可检测部分和可逆终止子的不同个体核苷酸同时接触。聚合化酶可以促进单个个体核苷酸掺入第二单链核酸分子中。传感器可以检测指示核苷酸掺入的信号。在信号检测之后，可以同时或按顺序移除可检测标记和可逆终止子。可以重复该循环，直至确定第一单链核酸分子的全部或部分的序列。
可检测标记的切割可在切割后在个体核苷酸上留下疤痕。疤痕可包括可检测标记的在切割标记期间未被完全去移除的部分。在一个示例中，疤痕可降低聚合化酶的效率。在一个示例中，疤痕可抑制聚合化酶。焦磷酸解作用介导的终止子交换(PMTE)测序可减少测序期间积累的疤痕的量。
可以对靶核酸分子进行测序并且/或者可以确定靶核酸分子的长度。靶核酸分子可以是片段化的核酸分子或可以是非片段化的核酸分子。靶核酸分子可以在检测之前扩增。靶核酸分子可以在溶液中和/或在支持物上扩增。在扩增之前，可以将在支持物上扩增的靶核酸分子固定在支持物上。可通过桥式扩增、野火扩增、重组酶聚合酶扩增、等温扩增或使用任何其他扩增技术来扩增靶核酸分子。测序或确定靶核酸分子的长度可以包括提供与传感器阵列相邻的多个单链核酸分子。多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子可以与传感器阵列中的给定传感器相邻放置。可以使第一单链核酸分子经历核酸掺入反应以生成第二单链核酸分子。核酸掺入反应可以包括交替且按顺序地掺入包含可检测标记的第一多个核苷酸中的个体核苷酸，然后掺入不具有可检测标记的第二多个个体核苷酸。核酸掺入反应可以包括交替且按顺序地掺入包含可检测标记的第一多个核苷酸中的个体核苷酸，并且将第一多个个体核苷酸与不具有可检测标记的第二多个个体核苷酸中的个体核苷酸交换(例如，移除第一核苷酸)。第一多个核苷酸可以共价掺入到生长的核酸链中，或者可以瞬时结合(例如，不共价结合)至生长的核酸链。第二多个个体核苷酸可以不包含可检测标记。给定传感器可以在进行核酸掺入反应的同时或之后检测来自可检测标记的信号。检测到的信号可以从可检测标记生成，并且可以指示第一多个个体核苷酸掺入第二单链核酸分子，从而确定第一单链核酸分子的序列。
多个单链核酸分子可以偶联至多个支持物。多个支持物可以是多个珠子。在一个示例中，多个单链核酸分子可以偶联至多个珠子，并且给定单链核酸分子可以偶联至给定珠子。给定传感器可以电偶联至包含第一单链核酸分子的电荷双层。电荷双层可以与给定珠子的表面相邻。单链核酸分子可以在珠子的表面上扩增。扩增产物可以偶联至珠子的表面。扩增产物可以在珠子的表面上形成单链核酸分子的克隆群落。可以对单链核酸分子的克隆群落进行测序。
在一个示例中，多个单链核酸分子可以偶联至传感器阵列上的多个表面，并且给定单链核酸分子偶联至给定传感器的表面。给定传感器可以电偶联至包含第一单链核酸分子的电荷双层。电荷双层可以与给定传感器的表面相邻。单链核酸分子可以在传感器的表面上扩增。扩增产物可以偶联至传感器的表面。扩增产物可以在传感器的表面上形成单链核酸分子的克隆群落。可以对单链核酸分子的克隆群落进行测序并且/或者可以确定单链核酸的长度。
传感器阵列中的给定传感器可以包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或更多个电极。在一个示例中，给定传感器包含至少两个电极。在另一个示例中，给定传感器包含两个电极。电极可暴露于发生引物延伸反应的溶液。替代地或附加地，电极可以埋在传感器阵列内，并且因此可以不暴露于发生引物延伸反应的溶液。传感器可以检测指示核苷酸掺入事件的信号。传感器可以检测偶联至个体核苷酸的可检测标记。传感器可以在瞬时或稳态条件期间检测可检测标记。在稳态条件期间，可以每个掺入循环一次、两次、三次、四次或四次以上地检测核苷酸掺入。在一个示例中，在稳态条件期间，可以每个掺入循环至少两次检测核苷酸掺入。传感器阵列可以在瞬时或稳态条件期间检测电信号。电信号可以包括但不限于分子的电荷状态变化、周围溶液的电导率变化、阻抗信号或阻抗信号变化。传感器可以检测电荷和/或电导率的变化或阻抗的变化。传感器可以检测传感器、支持物或核酸分子(例如，样品)的电荷双层(例如，德拜长度)内的电荷和/或电导率或阻抗的变化。偶联至个体核苷酸的可检测标记可以改变单链核酸分子周围的电环境，并且给定传感器可以检测电变化。
第二单链核酸分子可以包含与第一单链核酸分子相邻的引发位点。引发位点可以是与第一单链核酸分子具有序列互补性的引物。第二单链核酸分子可以通过起始自引物的引物延伸反应生成。在一个示例中，引物是自引发环。在引物延伸反应期间，自引发环可以处于结构或环状构型中。掺入个体核苷酸后，自引发环的结构可以松弛以形成线性核酸分子。可以在松弛的非结构化状态期间检测个体核苷酸的掺入。可以通过提高反应温度、改变溶液pH、改变溶液离子强度、向溶液中引入甲酰胺或通过使核酸结构变性的任何其他方法来松弛自引发环。
第一多个核苷酸可包含阻止另外的核苷酸与第一单链核酸分子稳定杂交的终止子。终止子可以是可逆终止子或不可逆终止子。在一个示例中，终止子是不可逆终止子。终止子可以减少均聚物的出现和/或每个掺入循环中多个个体核苷酸的掺入。第一多个个体核苷酸可以包含双脱氧核苷酸(ddNTP)或3-氟脱氧核苷酸。ddNTP可以是链延长抑制剂。第一多个核苷酸可以包含可检测标记。在检测核苷酸掺入后可以不移除可检测标记。可检测标记可以是静电部分、荧光标记、化学发光标记、比色标记、放射性标记或任何其他可检测标记。在一个示例中，可检测标记是静电部分。可检测标记可以偶联至第一多个核苷酸的核碱基。
第一多个核苷酸可以包含不同类型的核苷酸。在一个示例中，不同类型的核苷酸可以偶联至不同类型的可检测标记。每种单个类型的核苷酸可以偶联至单个类型的可检测标记。第一单链核酸分子可以同时与所有不同类型的核苷酸接触。然后传感器阵列可以检测偶联至不同个体核苷酸的不同可检测静电部分。替代地或附加地，每种类型的核苷酸可以具有相同的可检测标记，并且传感器可以检测核苷酸的添加而无需解析不同的核苷酸(例如，确定序列长度)。在该示例中，每个掺入循环可以使用单次读取。在一个示例中，每种类型的个体核苷酸可以偶联至相同的可检测标记。可以使第一单链核酸分子按顺序与每种类型的核苷酸接触(例如，与一种类型的核苷酸接触，然后与另一种类型的核苷酸接触)。在掺入一种类型的核苷酸之后，传感器阵列可以检测指示核苷酸掺入的信号。然后可以使第一单链核酸分子与不同类型的核苷酸接触。可检测标记可以不从第一多个核苷酸切割(例如，可检测标记可以是不可逆的)。
可以将第一多个个体核苷酸交换为第二多个个体核苷酸。交换反应可以通过用过量的焦磷酸盐、三磷酸盐或四磷酸盐逆向驱动聚合作用反应来完成。第二多个个体核苷酸可以不包含可检测标记。将第一多个个体核苷酸交换为第二多个个体核苷酸可以减少疤痕形成。第二多个个体核苷酸可以包含可逆终止子。可逆终止子可通过与还原剂接触、通过改变溶液pH、通过改变溶液离子强度、通过与离子表面活性剂接触或通过任何其他终止子移除法来逆转。
图15示出了示例PMTE测序方法。第一单链核酸分子可以偶联至珠子。第一单链核酸分子可以具有引发位点。引发位点可以与第一单链核酸分子的一部分互补。可以使第一单链核酸分子与第一多个个体核苷酸1501接触。第一多个个体核苷酸1501可以包含单一类型的核苷酸。第一多个个体核苷酸1501可以包含不可逆终止子和不可逆可检测静电部分。对于每种不同类型的核苷酸，不可逆可检测静电部分可以相同。聚合化酶502可以促进第一个体核苷酸1501掺入第二单链核酸分子中。给定传感器可以通过可检测标记的存在或不存在来检测核苷酸掺入的存在或不存在。然后可以将第一多个个体核苷酸1501交换为第二多个个体核苷酸701。第二多个个体核苷酸701可以是与第一多个个体核苷酸1501相同类型的核苷酸。第二多个个体核苷酸701可以不具有可检测标记并且可以具有可逆终止子。在将第二多个个体核苷酸掺入第二单链核酸分子之后，可以移除或逆转可逆终止子。终止子可以被还原剂逆转。可以重复该循环，直至确定第一单链核酸分子的全部或部分的序列。该方法可以包括进行大于或等于1、2、3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或更多个核苷酸掺入和检测的循环。
在一个示例中(参见图15)，第一单链核酸分子可以偶联至珠子。第一单链核酸分子可以具有偶联至引物502的引发位点。引发位点可以与第一单链核酸分子的一部分互补。可以使第一单链核酸分子与第一多个个体核苷酸接触。第一多个个体核苷酸1501可以包含多种不同类型的核苷酸。第一多个个体核苷酸1501可以包含不可逆终止子和不可逆可检测静电部分。对于每种类型的个体核苷酸，不可逆可检测静电部分可以不同。聚合化酶502可以促进第一个体核苷酸1501掺入第二单链核酸分子中。给定传感器可以通过传感器上存在的可检测标记的类型来检测掺入第二单链核酸分子中的核苷酸的类型。然后可以将第一多个个体核苷酸1501交换为第二多个个体核苷酸701。第二多个个体核苷酸701可以包括与第一多个个体核苷酸相同类型的核苷酸。第二多个个体核苷酸701可以不具有可检测标记并且可以具有可逆终止子。在将第二多个个体核苷酸掺入第二单链核酸分子之后，可以移除或逆转可逆终止子。终止子可以被还原剂逆转。可以重复该循环，直至确定第一单链核酸分子的全部或部分的序列。
上述的PMTE测序方法可以与双链测序方法结合使用。例如，可以使包含第一和第二单链核酸分子的双链核酸分子与聚合化酶接触。聚合化酶可将包含不可逆终止子和可检测标记的个体核苷酸掺入第三单链核酸分子中。个体核苷酸的掺入可生成侧翼。在检测个体核苷酸掺入之前或之后可以切割侧翼。双链核酸分子可以同时或按顺序与不同类型的个体核苷酸接触。不同类型的个体核苷酸可以包含相同或不同的可检测标记。在掺入个体核苷酸后，掺入事件可由传感器阵列检测。在检测之后，可以将包含可检测标记和不可逆终止子的个体核苷酸交换为包含可逆终止子的个体核苷酸。然后可以将可逆终止子逆转以允许随后的个体核苷酸的掺入。
该方法可以进一步包括监测和/或校正相位误差。具有相位误差的核酸分子可以比该核酸分子是其成员的克隆群的共有状态(例如参考序列)或该核酸分子是其拷贝或代表性序列的模板核酸分子更多或更少地延伸。对于包括错误掺入的碱基的片段(例如，添加至生长链的额外的碱基或不正确的碱基)，可以认为该相位误差是超前的。对于相对于共有序列而言有碱基未掺入到生长链中的其他核酸分子，可以认为该多核苷酸是滞后的。由于聚合酶可能是不完善的，在具有长延伸反应的群落中可能会发生一些作为基于群落的测序过程的一部分的相位误差。相位误差可以限制商业克隆测序系统的读取长度。
相位误差可以导致超前测序掺入错误。超前测序错误可以是指由于核苷酸的不正确或过量(例如均聚物)添加而比主要序列长的序列。不正确或过量添加可能是由聚合酶错误引起的，尤其是在非竞争性反应中使用高浓度的dNTP时。替代地或附加地，超前测序掺入错误可能是由于dNTP的洗涤不充分或非特异性结合引起的，该dNTP随后可以释放并掺入。超前测序掺入错误可能是由于不具有有效3’终止子的核苷酸掺入导致的，从而使掺入事件多进行了一个循环。例如，超前测序掺入错误可能是由于在核酸掺入事件中存在痕量的未保护或未封闭的3’-OH核苷酸引起的。未保护的3’-OH核苷酸可以在制造过程中或可能在存储和试剂处理过程中产生。
相位误差可以导致滞后测序错误。滞后测序掺入错误可以是指由于正确核苷酸未添加而比主要序列短的序列。滞后测序错误可能因非最佳的反应条件、空间位阻、二级结构或聚合酶抑制的其他来源，而发生。可以引起滞后测序错误的过程的非限制性示例包括：可逆终止子、可检测标记、衍生自第二单链核酸分子的侧翼、修饰的核苷酸和/或接头的不完全去除。较长的循环时间可以使聚合酶有更多机会掺入错误的核苷酸。类似地，难以接近的核酸分子(例如，DNA)可以导致掺入正确核苷酸的机会不足。预期可以优化温度、步骤时间、聚合酶选择、核苷酸浓度、盐浓度和缓冲液选择以最小化掺入误差。
例如，核酸(例如，DNA)样品可以在与引物互补的区域之后的第一区域中具有TGTTC序列。流体循环可以首先引入三磷酸脱氧胞苷(dCTP)，第二引入三磷酸脱氧胸苷(dTTP)，第三引入三磷酸脱氧腺苷(dATP)，第四引入三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)，并穿插洗涤步骤。在流体循环的第一部分中，作为第一循环的一部分流入的dCTP分子可能没有被正确洗出并离开核酸模板。在流体循环的第二部分中，作为第二循环的一部分流入的dTTP分子可能没有被适当地洗出孔结构。在第一流体循环的第一部分和第二部分期间，dNTP可能无法掺入。在流体循环的第三部分期间，由于dATP与样品的第一碱基T互补，因此可以引入并掺入dATP。任何非特异性结合的dCTP分子也可以终止非特异性结合并在流体循环的该第三部分期间掺入。这些未结合的dCTP分子可在掺入dATP分子之后掺入。掺入dCTP分子后，可以再掺入两个dATP分子，这可以导致单克隆珠子的一些分子具有超前测序相位误差。因此，单克隆珠子的一些分子可能会变得异相。
可以通过比较来自克隆群的多个双链或单链分子的序列和/或通过与参考序列比较来检测相位误差。例如，可以分析序列中的误调(miscall)，例如置换型或插入缺失型误调。可以通过使用单链分子作为生成互补单链分子的模板在核酸掺入反应期间测量信号强度来检测误调。双链或单链分子可包含克隆群。在一个示例中，与其余克隆群相比，一部分克隆群可具有明显较低的可检测信号强度，诸如小于阈值。这可能表明，核苷酸掺入的位置可能少于所有可用位置，并可能导致插入缺失型误调。插入缺失型误调可以是由于单链分子的不完全延伸引起的，并且可以导致滞后测序错误。在另一个示例中，当与参考序列相比时，一部分克隆群可以具有置换的碱基。置换型误调可以是由在核酸掺入反应中掺入另外的核苷酸而导致的超前测序错误造成的。另外的核苷酸可以与参考序列中的核苷酸不同。
可以通过在竞争条件下进行核酸掺入反应来减少相位误差。例如，可以降低核苷酸的浓度以减轻超前测序错误。在另一个示例中，可以减少每次读取的循环时间和/或循环数，以避免核苷酸的错误掺入而导致超前测序错误。在一些情况下，可以通过使用基于核苷酸的聚合化酶来减少相位误差。例如，当掺入未修饰的核苷酸时，可以使用A型聚合酶，诸如Bst聚合酶，以减少相位误差。当掺入修饰的核苷酸时，可以使用B型聚合酶，诸如Therminator IXTM(NEB)，以减少相位误差。
在一方面，可以通过在核酸掺入反应中先后或同时掺入未修饰的核苷酸与修饰的核苷酸来减少相位误差。
核酸测序的方法可包括提供与传感器阵列相邻的多个双链或单链核酸分子。多个单链核酸分子中的第一双链或单链核酸分子可以与传感器阵列中的给定传感器相邻放置。
可以使第一单链核酸分子经历核酸掺入反应以生成第二单链核酸分子，作为与第一单链核酸分子互补的生长链。核酸掺入反应可包括交替且按顺序地(i)掺入包含可检测标记的第一多个核苷酸中的个体核苷酸，和(ii)掺入不包含可检测标记的第二多个核苷酸中的个体核苷酸。给定传感器可以用于检测来自可检测标记的信号，该信号可以指示第一多个核苷酸中的个体核苷酸掺入第二单链核酸分子中，从而确定第一单链核酸分子的序列。第一多个核苷酸可以与第二多个核苷酸交换。第二多个核苷酸的掺入可以校正相位误差。第二多个核苷酸的掺入可以通过沿着第一单链核酸分子在未掺入来自第一多个核苷酸的个体核苷酸的位置处掺入来自第二多个核苷酸的个体核苷酸可以校正相位误差。通过使用来自第一多个核苷酸的个体核苷酸可以继续核酸掺入反应。第二单链核酸分子可以与模板单链核酸分子具有序列同源性。
图20中示出了用于核酸测序以校正相位误差的方法的示例。多个单链核酸分子可以偶联至珠子。多个单链核酸分子可包含给定单链核酸分子的克隆群。第一单链核酸分子可以具有偶联至个体引物的引发位点。引发位点可以与第一单链分子的一部分互补。可以使第一单链分子与第一多个个体核苷酸接触。第一多个个体核苷酸可以包含多种不同类型的核苷酸。第一多个个体核苷酸可以包含单一类型的核苷酸。第一多个个体核苷酸可以是修饰的核苷酸。第一多个个体核苷酸可以包含不可逆终止子和不可逆可检测静电部分。对于每种类型的个体核苷酸，不可逆可检测静电部分可以不同。聚合化酶可以促进第一个体核苷酸掺入第二单链核酸分子中。给定传感器可以通过传感器上存在的可检测标记的类型来检测掺入第二单链核酸分子中的核苷酸的类型。然后可以将第一多个个体核苷酸交换为第二多个个体核苷酸。第二多个个体核苷酸可以包括与第一多个相同类型的核苷酸。第二多个个体核苷酸可以不具有可检测标记并且可以具有可逆终止子。第二多个核苷酸的添加可以通过沿着第一单链核酸分子在未掺入来自第一多个核苷酸的个体核苷酸的位置处掺入来自第二多个核苷酸的个体核苷酸而校正相位误差。
如图20所示，如读取1中的超前第二单链分子中额外的核苷酸(n+1)的添加所指示的，相位误差可以是超前测序错误。可以将来自第二多个核苷酸的个体核苷酸掺入滞后第二单链分子中，使得该滞后分子可以与超前分子同步，如在读取2之前的下一个循环中由“n+1”指示的。在将第二多个个体核苷酸掺入第二单链核酸分子之后，可以移除或逆转可逆终止子。终止子可以被还原剂逆转。一旦两个分子可以同步成具有为(n+1)的相同数目的掺入核苷酸，则可以使用来自第一多个核苷酸的个体核苷酸继续核酸掺入反应。在下一循环读取2中，可以切割第一多个核苷酸中的可检测标记，以由传感器检测。可以通过使用磷酸试剂诸如三(羟丙基)膦(THPP)切割可检测标记。可检测标记的切割可在切割后在个体核苷酸上留下疤痕。疤痕可包括可检测标记的在切割标记期间未被完全去移除的部分。可以向第一单链核酸分子交替提供第一多个个体核苷酸和第二多个个体核苷酸以生成第二单链核酸分子，直至确定第一单链核酸分子的全部或部分的序列。
图21和图22示出了使用该方法减少核酸测序期间的相位误差的示例结果。为了生成第二单链分子，可以使第一单链分子与具有可检测标记(诸如三个赖氨酸氨基酸残基)的第一多个核苷酸接触。第一多个核苷酸可以与第二多个核苷酸交换。第一多个核苷酸的掺入可以在读取1中的第二单链分子中引起超前相位误差(n+1)。可以通过将第二多个核苷酸掺入滞后分子以使得滞后分子可以与超前分子同步来校正相位误差。如图21所示，X轴表示与掺入的核苷酸数相对应的流数(flow number)，Y轴表示衍生自可检测标记的切割的信号。在读取1中，可检测标记可以偶联至第一多个核苷酸，这可导致Y轴上的负信号。负信号可能是由于可检测标记的赖氨酸残基置换了阳离子(诸如Mg2+)。在读取2中，可检测标记可从第一多个核苷酸切割，从而在Y轴上产生衍生自疤痕核苷酸的正信号。在移除包含赖氨酸残基的可检测标记后，正信号可以衍生自阳离子(诸如Mg2+)的浓度。在读取1和读取2中，第二多个个体核苷酸可以没有可检测标记，这可以导致Y轴上的信号接近零。测序过程中信号的变化如图22所示。在第一多个核苷酸中可检测标记(三个赖氨酸残基)的存在可以导致Y轴上的净负信号，如读取1中的ΔK3所示。未修饰的核苷酸的添加可以导致中性信号，如读取2中的ΔChase所示，在Y轴上接近零。THPP对可检测标记的切割可以导致净正信号激增，如读取3中的ΔTHPP所示。切割可检测标记后，由于未修饰的核苷酸而导致的中性信号可以转为正信号，如Δchase期间的箭头所示。正信号可以归因于核苷酸中的负磷酸基团转而可以浓缩Mg2+阳离子从而产生净正信号。
用于核酸测序的系统
本公开内容提供了可包含多个组件的用于核酸测序的系统。该系统可用于多种应用，如对来自活受试者的核酸样品进行测序。例如，可以使具有被珠子占据的位点或被包含克隆群的多个核酸模板直接占据的位点的传感器阵列与包含与克隆核酸杂交的引物的流体接触。然后可洗涤传感器阵列，并使其与包含一种或多种类型的核苷酸、聚合化酶和/或任何辅因子的流体在合适的缓冲液中接触。然后可洗涤阵列并且可检测掺入的核苷酸。可以重复掺入、洗涤、检测的循环，直至已经对结合至珠子或结合至传感器表面的样品核酸进行测序。
传感器阵列可合并到集成式测序平台中。集成式测序平台可包括核酸(例如，DNA)提取模块、文库构建模块、扩增模块、提取模块和测序模块中的一种或多种。在一些实施方案中，系统可以是单独的和/或是模块化形式的。在一些实施方案中，集成式测序平台可包括这些系统中的一个、两个、三个、四个或所有五个系统。在一些情况下，模块可集成在单一单元(例如，微流体装置)、单一阵列(例如，可重复使用的传感器阵列)甚至单一装置中。集成式测序平台的示例可见于PCT专利申请号PCT/US2011/054769、PCT专利申请号PCT/US2012/039880、PCT专利申请号PCT/US2012/067645、PCT专利申请号PCT/US2014/027544、PCT专利申请号PCT/US2014/069624和PCT专利申请号PCT/US2015/020130，这些申请各自通过引用整体并入本文。
在另一方面，本公开内容提供了用于核酸测序的系统。该系统可以包含传感器阵列，该传感器阵列包含多个单个传感器。在使用期间，可以将多个双链核酸分子中的给定双链核酸分子与传感器阵列中的给定传感器相邻放置。给定双链核酸分子可以包含第一单链核酸分子和第二单链核酸分子。给定传感器可以电偶联至给定双链核酸分子的电荷双层(例如，在德拜长度内的)。该系统可以进一步包含一个或多个可操作地耦合至传感器阵列的计算机处理器。可以对一个或多个计算机处理器进行编程，以使第一单链核酸分子的非杂交区段与个体核苷酸接触，以使该非杂交区段经历核酸掺入反应，从而生成个体核苷酸的第三单链核酸分子。第三单链核酸分子可以与第一单链核酸分子具有序列互补性。在核酸掺入反应期间或之后，给定传感器可检测指示个体核苷酸掺入第三单链核酸分子的信号，从而确定非杂交区段的序列。
双链核酸分子可以偶联至支持物。支持物可以是珠子，或传感器阵列的表面。多个双链核酸分子可以偶联至多个珠子或传感器阵列的表面上的多个位置。多个珠子中的每个珠子可以与给定传感器相邻放置。多个珠子可以是磁性或非磁性珠子。珠子可以具有促进双链核酸分子偶联至珠子的表面涂层。电荷双层(例如，德拜长度)可以与珠子的表面相邻。替代地或附加地，多个双链核酸分子可以偶联至传感器阵列的一个或多个表面。给定双链核酸分子可以偶联至给定传感器的表面。电荷双层(例如，德拜长度)可以与给定传感器的表面相邻。在测序之前可以克隆扩增偶联至珠子或传感器阵列的表面的双链核酸分子，使得每个珠子均偶联至双链核酸分子的克隆群，或使得给定传感器的每个表面均偶联至双链核酸分子的克隆群。
给定传感器可以包含至少一个、至少两个、至少三个或至少四个电极。在一个示例中，给定传感器包含至少两个电极。给定传感器的电极可以检测指示个体核苷酸掺入双链核酸分子中的信号。指示掺入事件的信号可以包括电子双层中的阻抗、电导或电荷的变化。在一个示例中，指示个体核苷酸的掺入的信号是由电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。指示个体核苷酸的掺入的信号可以是稳态信号、瞬时信号或稳态信号与瞬时信号的组合。信号可瞬时检测或在稳态条件下检测。在瞬时信号检测模式中，检测发生在核苷酸掺入期间或紧随其后。在稳态检测中，传感器的读取可在掺入事件“完成”之后发生。信号的稳态变化可保持直到向传感器周围的环境引入变化。
可以将一个或多个计算机处理器编程为引导流体流过传感器阵列。在流体流动条件期间，双链核酸分子可以稳定偶联至一个或多个表面。双链核酸分子可以稳定偶联至多个珠子。珠子可以稳定地与传感器阵列相邻放置。珠子可以通过磁场或电场保持与传感器阵列相邻。流体流动不会破坏或移动珠子。被引导穿过传感器阵列的流体可包括核酸分子、引物、聚合化酶、个体核苷酸、用于核苷酸掺入反应(例如，引物延伸反应)的辅因子和/或缓冲液。该流体可以是包含缓冲液的洗涤流体。在一个示例中，可以将流体引导至传感器阵列并与传感器阵列一起温育。可以将流体与传感器阵列一起温育达核苷酸掺入反应的单次循环的持续时间。在温育循环之间，可以用洗涤流体洗涤传感器阵列。
在另一方面，本公开内容提供了用于核酸测序的系统。该系统可以包含传感器阵列，该传感器阵列包含多个传感器。在使用期间，可以将多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子与传感器阵列中的给定传感器相邻放置。给定传感器可以电偶联至第一单链核酸分子的电荷双层(例如，在德拜长度内的)。该系统可以包含一个或多个偶联至传感器阵列的计算机处理器。可以对一个或多个计算机处理器进行编程，以使第一单链核酸分子与个体核苷酸接触，以使第一单链核酸分子经历从个体核苷酸生成第二单链核酸分子的核酸掺入反应。第二单链核酸分子可以与第一单链核酸分子具有序列互补性。个体核苷酸的至少一个子集可以包含可检测标记。给定传感器可以在核酸掺入反应期间或之后检测来自可检测标记的信号。该信号可以指示个体核苷酸掺入第二单链核酸分子。该信号可以用于确定第一单链核酸分子的序列。
单链核酸分子可以偶联至支持物。支持物可以是珠子，或传感器阵列的表面。多个单链核酸分子可以偶联至多个珠子或传感器阵列的表面上的多个位置。多个珠子中的每个珠子可以与给定传感器相邻放置。多个珠子可以是磁性或非磁性珠子。珠子可以具有促进单链核酸分子偶联至珠子的表面涂层。电荷双层(例如，德拜长度)可以与珠子的表面相邻。替代地或附加地，多个双链核酸分子可以偶联至传感器阵列的一个或多个表面。给定单链核酸分子可以偶联至给定传感器的表面。电荷双层(例如，德拜长度)可以与给定传感器的表面相邻。在测序之前可以克隆扩增偶联至珠子或传感器阵列的表面的单链核酸分子，使得每个珠子均偶联至单链核酸分子的克隆群，或使得给定传感器的每个表面均偶联至单链核酸分子的克隆群。
给定传感器可以包含至少一个、至少两个、至少三个或至少四个电极。在一个示例中，给定传感器包含至少两个电极。在另一个示例中，给定传感器包含两个电极。电极可暴露于发生引物延伸反应的溶液。替代地或附加地，电极可以埋在传感器阵列内，并且因此可以不暴露于发生引物延伸反应的溶液。给定传感器的电极可以检测指示个体核苷酸掺入单链核酸分子中的信号。指示掺入事件的信号可以包括电子双层中的阻抗、电导或电荷的变化。在一个示例中，指示个体核苷酸的掺入的信号是由电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。指示个体核苷酸的掺入的信号可以是稳态信号、瞬时信号或稳态信号与瞬时信号的组合。信号可瞬时检测或在稳态条件下检测。在瞬时信号检测模式中，检测发生在核苷酸掺入期间或紧随其后。在稳态检测中，传感器的读取可在掺入事件完成之后发生。信号的稳态变化可保持直到向传感器周围的环境引入变化。传感器可以检测掺入事件(例如，计数掺入事件)或可以单独地解析掺入的核苷酸(例如，确定掺入了哪种核苷酸)。
可以将一个或多个计算机处理器编程为引导流体流过传感器阵列。在流体流动条件期间，单链核酸分子可以稳定偶联至一个或多个表面。单链核酸分子可以稳定偶联至多个珠子。珠子可以稳定地与传感器阵列相邻放置。珠子可以通过磁场或电场保持与传感器阵列相邻。流体流动不会破坏或移动珠子。被引导穿过传感器阵列的流体可包括核酸分子、引物、聚合化酶、个体核苷酸、用于核苷酸掺入反应(例如，引物延伸反应)的辅因子和/或缓冲液。流体可以是包含缓冲液的洗涤流体。在一个示例中，可以将流体引导至传感器阵列并与传感器阵列一起温育。可以将流体与传感器阵列一起温育达核苷酸掺入反应的单次循环的持续时间。在温育循环之间，可以用洗涤流体洗涤传感器阵列。
在另一方面，本公开内容提供了用于核酸测序的系统。该系统可以包含传感器阵列，该传感器阵列包含多个传感器。在使用期间，可以将多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子与传感器阵列中的给定传感器相邻放置。该系统可以包括一个或多个可操作地耦合至传感器阵列的计算机处理器。可以对一个或多个计算机处理器进行编程，以使第一单链核酸分子经历核酸掺入反应，该核酸掺入反应包括交替且按顺序地掺入包含可检测标记的第一多个核苷酸中的个体核苷酸以及将第一多个核苷酸中的个体核苷酸与不包含可检测标记的第二多个核苷酸中的个体核苷酸交换。给定传感器可以在核酸掺入反应期间或之后检测来自可检测标记的信号。该信号可以指示个体核苷酸掺入第二单链核酸分子。该信号可以用于确定第一单链核酸分子的序列。
多个单链核酸分子可以偶联至多个支持物。多个支持物可以是传感器阵列上的多个珠子或多个表面。在一个示例中，多个单链核酸分子可以偶联至多个珠子，并且给定单链核酸分子可以偶联至给定珠子。给定传感器可以电偶联至包含第一单链核酸分子的电荷双层。电荷双层可以与给定珠子的表面相邻或在给定传感器的表面上。单链核酸分子可以在支持物的表面上扩增。扩增产物可以偶联至支持物的表面。扩增产物可以在支持物的表面上形成单链核酸分子的克隆群落。可以对单链核酸分子的克隆群落进行测序。
传感器阵列中的给定传感器可以包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或更多个电极。在一个示例中，给定传感器包含至少两个电极。在另一个示例中，给定传感器包含两个电极。电极可暴露于发生引物延伸反应的溶液。替代地或附加地，电极可以埋在传感器阵列内，并且因此可以不暴露于发生引物延伸反应的溶液。传感器可以检测指示核苷酸掺入事件的信号。传感器可以检测偶联至个体核苷酸的可检测标记。传感器可以在瞬时或稳态条件期间检测可检测标记。在稳态条件期间，可以每个掺入循环一次、两次、三次、四次或四次以上地检测核苷酸掺入。在一个示例中，在稳态条件期间每个掺入循环可以至少两次检测核苷酸掺入。传感器阵列可以在瞬时或稳态条件期间检测电信号。电信号可以包括但不限于分子的电荷状态变化、周围溶液的电导率变化、阻抗信号或阻抗信号变化。传感器可以检测电荷和/或电导率的变化或阻抗的变化。传感器可以检测传感器、支持物或核酸分子(例如，样品)的电荷双层(例如，德拜长度)内的电荷和/或电导率或阻抗的变化。偶联至个体核苷酸的可检测标记可以改变单链核酸分子周围的电环境，并且给定传感器可以检测电变化。传感器可以检测掺入事件(例如，计数掺入事件)或可以单独地解析掺入的核苷酸(例如，确定掺入了哪种核苷酸)。
可以将一个或多个计算机处理器编程为引导流体流过传感器阵列。在流体流动条件期间，单链核酸分子可以稳定偶联至一个或多个表面。单链核酸分子可以稳定偶联至多个珠子。珠子可以稳定地与传感器阵列相邻放置。珠子可以通过磁场或电场保持与传感器阵列相邻。流体流动不会破坏或移动珠子。被引导穿过传感器阵列的流体可包括核酸分子、引物、聚合化酶、个体核苷酸、用于核苷酸掺入反应(例如，引物延伸反应)的辅因子和/或缓冲液。流体可以是包含缓冲液的洗涤流体。在一个示例中，可以将流体引导至传感器阵列并与传感器阵列一起温育。可以将流体与传感器阵列一起温育达核苷酸掺入反应的单次循环的持续时间。在温育循环之间，可以用洗涤流体洗涤传感器阵列。
计算机系统
本公开内容提供了被编程用于实现本公开内容的方法的计算机系统。图16示出了被编程或以其他方式配置为对核酸分子进行测序的计算机系统。计算机系统1601可以调节本公开内容的测序系统的各个方面，诸如，举例而言，控制核酸模板向传感器阵列的流动、控制个体核苷酸向传感器阵列的流动以及控制掺入反应条件。计算机系统1601可以是用户的电子装置或相对于该电子装置位于远程的计算机系统。电子装置可以是移动电子装置。
计算机系统1601包括中央处理器(CPU，本文也称为“处理器”和“计算机处理器”)1605，该中央处理器可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统1601还包括存储器或存储器位置1610(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1615(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1620(例如，网络适配器)以及外围装置1625，诸如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1610、存储单元1615、接口1620和外围装置1625通过诸如主板等通信总线(实线)而与CPU 1605通信。存储单元1615可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统1601可借助于通信接口1620而可操作地耦合到计算机网络(“网络”)1630。网络1630可以是因特网、互联网和/或外联网，或者是与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络1630是电信和/或数据网络。网络1630可包括一个或多个计算机服务器，这可以实现分布式计算，诸如云计算。在一些情况下，网络1630可借助于计算机系统1601实现对等网络，这可以使得耦合到计算机系统1601的装置能够起到客户端或服务器的作用。
CPU 1605可以执行一系列机器可读指令，这可以体现于程序或软件中。指令可存储在存储器位置，诸如存储器1610中。指令可以指向CPU 1605，其可以随后对CPU 1605进行编程或以其他方式配置CPU 1605以实现本公开内容的方法。由CPU 1605执行的操作的示例可以包括读取、解码、执行和回写。
CPU 1605可以是电路(如集成电路)的一部分。系统1601的一个或多个其他组件可以包括在电路中。在一些情况下，该电路是专用集成电路(ASIC)。
存储单元1615可存储文件，诸如驱动程序、文库和保存的程序。存储单元1615可存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1601可包括一个或多个附加的数据存储单元，该附加数据存储单元位于计算机系统1601的外部，诸如位于通过内联网或因特网而与计算机系统1601通信的远程服务器上。
计算机系统1601可通过网络1630而与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1601可与用户的远程计算机系统(例如，用户的笔记本电脑或蜂窝电话)通信。远程计算机系统的示例包括个人计算机(例如，便携式PC)、板状或平板计算机(例如，
iPad、
Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，
iPhone、支持Android的装置、
)或者个人数字助理。用户可经由网络1630访问计算机系统1601。
本文所述的方法可通过存储在计算机系统1601的电子存储位置上(例如，存储器1610或电子存储单元1615上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式来实现。该机器可执行或机器可读代码能够以软件的形式提供。在使用过程中，该代码可由处理器1605执行。在一些情况下，该代码可从存储单元1615检索并存储在存储器1610中以供处理器1605随时访问。在一些情况下，可排除电子存储单元1615，并且机器可执行指令存储在存储器1610上。
代码可被预编译并被配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可在运行时进行编译。代码能够以编程语言来提供，该编程语言可被选择用以使该代码能够以预编译或即时编译的方式执行。
本文提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统1601，可以体现在编程中。技术的各个方面可被认为是通常被携载或体现于某种类型的机器可读介质中的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式的“产品”或“制品”。机器可执行代码可存储在电子存储单元上，诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机的任何或所有的有形存储器、处理器等，或者其关联的模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以随时为软件编程提供非暂时性存储。全部的软件或其部分可以不时通过因特网或各种其他电信网络进行通信。这样的通信例如可实现软件从一个计算机或处理器向另一计算机或处理器的加载，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可承载软件元素的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨本地装置之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及在各种空中链路上使用的光波、电波和电磁波。携带这些波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等，也可被认为是承载软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时性的有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供用以执行的指令的任何介质。
因此，机器可读介质，诸如计算机可执行代码等，可采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如在任何计算机中的任何存储装置等，诸如可用于实现附图中所示数据库的存储装置等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴线缆；铜线和光纤，其包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的波。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔洞图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣、传送数据或指令的载波、传送这样的载波的线缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多介质可参与向处理器传送一个或多个指令的一个或多个序列以供执行。
计算机系统1601可以包括电子显示器1635或与之通信，该电子显示器包括用户界面(UI)1640，该用户界面用于提供例如系统的当前操作条件或测序结果。UI的示例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。
本公开内容的方法和系统可以通过一种或多种算法来实现。可以在中央处理单元1605执行时通过软件来实现算法。该算法可以例如将指示核苷酸掺入的信号转换成核酸序列。
尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员将会显而易见的是，这样的实施方案仅以示例的方式提供。本发明并不旨在限于说明书中提供的具体示例。尽管已经参考上述说明书描述了本发明，但本文实施方案的描述和说明并不意味着以限制性意义解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面并不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比例，而是取决于多种条件和变量。应当理解，在实践本发明的过程中可采用对本文所述发明的实施方案的各种替代方式。因此设想，本发明还应当涵盖任何此类替代、修改、变化或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并从而涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
Claims (108)
1.一种用于检测核酸分子的方法，其包括：
(a)提供与传感器阵列相邻的多个双链核酸分子，其中所述多个核酸分子中的给定双链核酸分子与所述传感器阵列中的给定传感器相邻放置，其中所述给定双链核酸分子包含第一单链核酸分子和与所述第一单链核酸分子具有序列互补性的第二单链核酸分子，并且其中所述给定传感器电偶联至包含所述给定双链核酸分子的电荷双层；
(b)使所述第二单链核酸分子的至少一部分经历从所述第一单链核酸分子的释放，以提供所述第一单链核酸分子的不与所述第二单链核酸分子杂交的区段；
(c)使所述区段与个体核苷酸接触，以使所述区段经历从所述个体核苷酸生成第三单链核酸分子的核酸掺入反应，其中所述第三单链核酸分子与所述第一单链核酸分子具有序列互补性；以及
(d)在进行所述核酸掺入反应期间或之后，使用所述给定传感器检测指示所述个体核苷酸掺入所述第三单链核酸分子的信号，从而确定所述区段的序列或长度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中释放所述第二单链核酸分子的所述至少一部分形成侧翼，并且其中从所述第二单链核酸分子切割所述侧翼。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在检测指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号后切割所述侧翼。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二单链核酸分子选自核酸亚单位文库。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸亚单位文库包含随机序列。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸亚单位文库中的给定核酸亚单位包含至少五个核苷酸。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸亚单位文库包含肽核酸或锁核酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述第二单链核酸分子包含一个或多个可检测标记。
9.根据权利要求8所述的方法，其中从所述第一单链核酸分子释放所述第二单链核酸分子或其部分生成指示所述个体核苷酸掺入所述第三单链核酸分子的所述信号。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述多个双链核酸分子偶联至多个珠子，其中所述给定双链核酸分子偶联至所述多个珠子中的给定珠子，并且其中所述电荷双层与所述给定珠子的表面相邻。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述多个双链核酸分子偶联至所述传感器阵列的一个或多个表面，其中所述给定双链核酸分子偶联至所述给定传感器的表面，并且其中所述电荷双层与所述表面相邻。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中(c)进一步包括提供与所述区段相邻的引发位点，并在引物从所述引发位点延伸时生成所述第三单链核酸分子。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述给定传感器包含至少两个电极。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述个体核苷酸的至少一个子集包含阻止另外的核苷酸与所述第一单链核酸分子稳定杂交的可逆终止子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在所述个体核苷酸掺入所述第三单链核酸分子之后并且在另一个个体核苷酸掺入所述第三单链核酸分子之前移除所述可逆终止子。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述个体核苷酸的至少一个子集包含可检测标记。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述可检测标记是静电部分。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述可检测标记偶联至所述个体核苷酸的所述至少一个子集的核碱基。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，每种不同类型的核苷酸可逆地偶联至单一类型的可检测标记。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，每种不同类型的核苷酸可逆地偶联至不同类型的可检测标记。
21.根据权利要求19和20中任一项所述的方法，其中所述可检测标记通过至少两种偶联机制可逆地偶联至所述不同类型的核苷酸。
22.根据权利要求19和20中任一项所述的方法，其中所述可检测标记通过单一偶联机制可逆地偶联至所述不同类型的核苷酸。
23.根据权利要求21和22中任一项所述的方法，进一步包括在检测指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号之后，移除所述可检测标记。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，并且其中使所述区段按顺序与所述不同类型的核苷酸接触。
25.根据权利要求24所述的方法，其中在所述核酸掺入反应期间的给定时间点，使所述区段与第一类型的个体核苷酸接触，并且在所述核酸掺入反应期间的随后时间点，使所述区段与第二类型的个体核苷酸接触，其中所述第一类型不同于所述第二类型。
26.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，并且其中使所述区段同时与所述不同类型的核苷酸接触。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是稳态信号。
28.根据权利要求27所述的方法，其中在个体核苷酸的掺入之后检测指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号一次。
29.根据权利要求27所述的方法，其中在个体核苷酸的掺入之后检测指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号至少两次。
30.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是瞬时信号。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是由所述电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述多个双链核酸分子是所述双链核酸分子的克隆群。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中重复(b)-(d)直到确定所述第一单链核酸分子的所述序列或长度。
34.一种用于检测核酸分子的方法，其包括：
(a)提供与传感器阵列相邻的多个单链核酸分子，其中所述多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子与所述传感器阵列中的给定传感器相邻放置，其中所述给定传感器电偶联至包含所述第一单链核酸分子的电荷双层；
(b)使所述第一单链核酸分子与个体核苷酸接触，以使所述第一单链核酸分子经历从所述个体核苷酸生成第二单链核酸分子的核酸掺入反应，其中所述第二单链核酸分子与所述第一单链核酸分子具有序列互补性，其中所述个体核苷酸的至少一个子集包含可检测标记；以及
(c)在进行所述核酸掺入反应期间或之后，使用所述给定传感器检测来自所述可检测标记的信号，所述信号指示所述个体核苷酸掺入所述第二单链核酸分子，从而确定所述第一单链核酸分子的序列或长度。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述多个单链核酸分子偶联至多个珠子，其中所述第一单链核酸分子偶联至所述多个珠子中的给定珠子，并且其中所述电荷双层与所述给定珠子的表面相邻。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述多个单链核酸分子偶联至所述传感器阵列的一个或多个表面，其中所述第一单链核酸分子偶联至所述给定传感器的表面，并且其中所述电荷双层与所述表面相邻。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中(b)进一步包括提供与所述第一单链核酸相邻的引发位点，并在引物从所述引发位点延伸时生成所述第二单链核酸分子。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述引发位点是自引发环。
39.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述给定传感器包含至少两个电极。
40.根据权利要求34-39中任一项所述的方法，其中所述个体核苷酸的至少另一个子集包含阻止另外的核苷酸与所述第一单链核酸分子稳定杂交的可逆终止子。
41.根据权利要求40所述的方法，其中在所述个体核苷酸掺入所述第二单链核酸分子之后并且在另一个个体核苷酸掺入所述第二单链核酸分子之前移除所述可逆终止子。
42.根据权利要求34-41中任一项所述的方法，其中所述可检测标记是静电部分。
43.根据权利要求34-42中任一项所述的方法，其中所述可检测标记偶联至所述个体核苷酸的所述至少一个子集的核碱基。
44.根据权利要求34-43中任一项所述的方法，其中所述个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，每种不同类型的核苷酸可逆地偶联至单一类型的可检测标记。
45.根据权利要求34-43中任一项所述的方法，其中所述个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，每种不同类型的核苷酸可逆地偶联至不同类型的可检测标记。
46.根据权利要求44和45中任一项所述的方法，其中所述可检测标记通过至少两种偶联机制可逆地偶联至所述不同类型的核苷酸。
47.根据权利要求44和45中任一项所述的方法，其中所述可检测标记通过单一偶联机制可逆地偶联至所述不同类型的核苷酸。
48.根据权利要求46和47中任一项所述的方法，其中在检测指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号后移除所述可检测标记。
49.根据权利要求34-48中任一项所述的方法，其中所述个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，并且其中使所述第一单链核酸分子按顺序与所述不同类型的核苷酸接触。
50.根据权利要求49所述的方法，其中在所述核酸掺入反应期间的给定时间点，使所述第一单链核酸分子与第一类型的个体核苷酸接触，并且在所述核酸掺入反应期间的随后时间点，使所述第一单链核酸分子与第二类型的个体核苷酸接触，其中所述第一类型不同于所述第二类型。
51.根据权利要求34-48中任一项所述的方法，其中所述个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，并且其中使所述第一单链核酸分子同时与所述不同类型的核苷酸接触。
52.根据权利要求34-51中任一项所述的方法，其中指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是稳态信号。
53.根据权利要求52所述的方法，其中在个体核苷酸的掺入之后检测指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号一次。
54.根据权利要求52所述的方法，其中在个体核苷酸的掺入之后检测指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号至少两次。
55.根据权利要求34-51中任一项所述的方法，其中指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是瞬时信号。
56.根据权利要求34-55中任一项所述的方法，其中指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是由所述电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。
57.根据权利要求34-56中任一项所述的方法，其中所述多个单链核酸分子是所述第一单链核酸分子的克隆群。
58.根据权利要求34-57中任一项所述的方法，其中重复(b)-(c)直到确定所述第一单链核酸分子的所述序列或所述长度。
59.一种用于检测核酸分子的方法，其包括：
(a)提供与传感器阵列相邻的多个单链核酸分子，其中所述多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子与所述传感器阵列中的给定传感器相邻放置；
(b)使所述第一单链核酸分子经历核酸掺入反应以生成作为与所述第一单链核酸分子互补的生长链的第二单链核酸分子，其中所述核酸掺入反应包括交替且按顺序地(i)掺入包含可检测标记的第一多个核苷酸中的个体核苷酸，和(ii)掺入不包含可检测标记的第二多个核苷酸中的个体核苷酸；以及
(c)在进行所述核酸掺入反应的同时或之后，使用所述给定传感器从包含所述可检测标记的双层中检测指示电荷或电导率变化的信号，从而确定所述第一单链核酸分子的序列或长度。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述第一多个核苷酸包含阻止另外的核苷酸与所述第一单链核酸分子稳定杂交的终止子。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述第一多个核苷酸包括双脱氧核苷酸。
62.根据权利要求59-61中任一项所述的方法，其中所述第二多个核苷酸包含阻止另外的核苷酸与所述第一单链核酸稳定杂交的可逆终止子。
63.根据权利要求59所述的方法，其中将所述第一多个核苷酸与所述第二多个核苷酸交换。
64.根据权利要求59-63中任一项所述的方法，其中所述第二多个核苷酸的所述掺入通过沿着所述第一单链核酸分子在未掺入来自所述第一多个核苷酸的个体核苷酸的位置处掺入来自所述第二多个核苷酸的个体核苷酸来校正相位误差。
65.根据权利要求64所述的方法，进一步包括使用来自所述第一多个核苷酸中的所述个体核苷酸继续所述核酸掺入反应。
66.根据权利要求62所述的方法，其中在掺入所述第二多个核苷酸中的所述个体核苷酸之后，移除所述可逆终止子。
67.根据权利要求59-66中任一项所述的方法，其中所述可检测标记是不可移除的静电部分。
68.根据权利要求59-67中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸中的所述个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，每种不同类型的核苷酸偶联至单一类型的可检测标记。
69.根据权利要求59-67中任一项所述的方法，其中所述第一多个核苷酸中的所述个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，每种不同类型的核苷酸偶联至不同类型的可检测标记。
70.根据权利要求59-69中任一项所述的方法，其中所述给定传感器电偶联至包含所述第一单链核酸分子的电荷双层。
71.根据权利要求59所述的方法，其中所述多个单链核酸分子偶联至多个珠子，其中所述第一单链核酸分子偶联至所述多个珠子中的给定珠子，并且其中所述电荷双层与所述给定珠子的表面相邻。
72.根据权利要求59所述的方法，其中所述多个单链核酸分子偶联至所述传感器阵列的一个或多个表面，其中所述第一单链核酸分子偶联至所述给定传感器的表面，并且其中所述电荷双层与所述表面相邻。
73.根据权利要求59-72中任一项所述的方法，其中(b)进一步包括提供与所述第一单链核酸相邻的引发位点，并在引物从所述引发位点延伸时生成所述第二单链核酸分子。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述引发位点是自引发环。
75.根据权利要求59-74中任一项所述的方法，其中所述给定传感器包含至少两个电极。
76.根据权利要求59-75中任一项所述的方法，其中所述个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，并且其中使所述第一单链核酸分子按顺序与所述不同类型的核苷酸接触。
77.根据权利要求59所述的方法，其中在所述核酸掺入反应期间的给定时间点，使所述第一单链核酸分子与第一类型的个体核苷酸接触，并且在所述核酸掺入反应期间的随后时间点，使所述区段与第二类型的个体核苷酸接触，其中所述第一类型不同于所述第二类型。
78.根据权利要求59-77中任一项所述的方法，其中所述个体核苷酸包括不同类型的核苷酸，并且其中使所述第一单链核酸分子同时与所述不同类型的核苷酸接触。
79.根据权利要求59-78中任一项所述的方法，其中指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是稳态信号。
80.根据权利要求79所述的方法，其中在个体核苷酸的掺入之后检测指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号一次。
81.根据权利要求79所述的方法，其中在个体核苷酸的掺入之后检测指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号至少两次。
82.根据权利要求59-78中任一项所述的方法，其中指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是瞬时信号。
83.根据权利要求59-82中任一项所述的方法，其中所述信号是由所述电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。
84.根据权利要求59-83中任一项所述的方法，其中所述多个单链核酸分子是所述第一单链核酸分子的克隆群。
85.根据权利要求59-84中任一项所述的方法，其中重复(b)-(c)直到确定所述第一单链核酸分子的所述序列或所述长度。
86.根据权利要求59所述的方法，其中所述第一单链核酸分子是与所述给定传感器相邻的所述多个单链核酸分子的一部分，其中包括所述第一单链核酸分子在内的所述多个单链核酸分子中的个体单链核酸分子与模板单链核酸分子具有序列同源性。
87.一种用于检测核酸分子的系统，其包含：
包含多个传感器的传感器阵列，其中在使用过程中，多个双链核酸分子中的给定双链核酸分子与所述传感器阵列中的给定传感器相邻放置，其中所述给定双链核酸分子包含第一单链核酸分子和与所述第一单链核酸分子具有序列互补性的第二单链核酸分子，其中所述给定传感器电偶联至包含所述给定双链核酸分子的电荷双层；以及
可操作地耦合至所述传感器阵列的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同编程以(i)使所述第一单链核酸分子的未与所述第二单链核酸分子杂交的区段与个体核苷酸接触，以使所述区段经历从所述个体核苷酸生成所述第三单链核酸分子的核酸掺入反应，其中所述第三单链核酸分子与所述第一单链核酸分子具有序列互补性，并且(ii)在进行所述核酸掺入反应的同时或之后，使用所述给定传感器检测指示所述个体核苷酸掺入所述第三单链核酸分子的信号，从而确定所述区段的序列或长度。
88.根据权利要求87所述的系统，其中在使用过程中，所述多个双链核酸分子偶联至多个珠子，其中所述给定双链核酸分子偶联至所述多个珠子中的给定珠子，并且其中所述电荷双层与所述给定珠子的表面相邻。
89.根据权利要求87所述的系统，其中在使用过程中，所述多个双链核酸分子偶联至所述传感器阵列的一个或多个表面，其中所述给定双链核酸分子偶联至所述给定传感器的表面，并且其中所述电荷双层与所述表面相邻。
90.根据权利要求87-89中任一项所述的系统，其中所述给定传感器包含至少两个电极。
91.根据权利要求87-90中任一项所述的系统，其中在使用过程中，指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是稳态信号。
92.根据权利要求87-90中任一项所述的系统，其中在使用过程中，指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是瞬时信号。
93.根据权利要求87-92中任一项所述的系统，其中在使用过程中，指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是由所述电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。
94.一种用于检测核酸分子的系统，其包含：
包含多个传感器的传感器阵列，其中在使用过程中，多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子与所述传感器阵列中的给定传感器相邻放置，其中所述给定传感器电偶联至包含所述第一单链核酸分子的电荷双层；以及
可操作地耦合至所述传感器阵列的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同编程以(i)使所述第一单链核酸分子与个体核苷酸接触，以使所述第一单链核酸分子经历从所述个体核苷酸生成第二单链核酸分子的核酸掺入反应，其中所述第二单链核酸分子与所述第一单链核酸分子具有序列互补性，其中所述个体核苷酸的至少一个子集包含可检测标记，并且(ii)在进行所述核酸掺入反应的同时或之后，使用所述给定传感器检测来自所述可检测标记的信号，所述信号指示所述个体核苷酸掺入所述第二单链核酸分子，从而确定所述第一单链核酸分子的序列或长度。
95.根据权利要求94所述的系统，其中在使用过程中，所述多个单链核酸分子偶联至多个珠子，其中所述第一单链核酸分子偶联至所述多个珠子中的给定珠子，并且其中所述电荷双层与所述给定珠子的表面相邻。
96.根据权利要求94所述的系统，其中在使用过程中，所述多个单链核酸分子偶联至所述传感器阵列的一个或多个表面，其中在使用过程中，所述第一单链核酸分子偶联至所述给定传感器的表面，并且其中所述电荷双层与所述表面相邻。
97.根据权利要求94-96中任一项所述的系统，其中所述给定传感器包含至少两个电极。
98.根据权利要求94-97中任一项所述的系统，其中在使用过程中，指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是稳态信号。
99.根据权利要求94-97中任一项所述的系统，其中在使用过程中，指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是瞬时信号。
100.根据权利要求94-99中任一项所述的系统，其中在使用过程中，指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是由所述电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。
101.一种用于检测核酸分子的系统，其包含：
包含多个传感器的传感器阵列，其中在使用期间，多个单链核酸分子中的第一单链核酸分子与所述传感器阵列中的给定传感器相邻放置；以及
可操作地耦合至所述传感器阵列的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同编程以(i)使所述第一单链核酸分子与个体核苷酸接触，以使所述第一单链核酸分子经历核酸掺入反应以生成第二单链核酸分子，其中所述核酸掺入反应包括交替且按顺序地掺入包含可检测标记的第一多个核苷酸中的个体核苷酸以及将所述第一多个核苷酸中的所述个体核苷酸与不包含可检测标记的第二多个核苷酸中的个体核苷酸交换，并且(ii)在进行所述核酸掺入反应的同时或之后，使用所述给定传感器从包含所述可检测标记的双层中检测指示电荷或电导率变化的信号，从而确定所述第一单链核酸分子的序列或长度。
102.根据权利要求101所述的系统，其中在使用过程中，所述给定传感器电偶联至包含所述第一单链核酸分子的电荷双层。
103.根据权利要求102所述的系统，其中在使用过程中，所述多个单链核酸分子偶联至多个珠子，其中所述第一单链核酸分子偶联至所述多个珠子中的给定珠子，并且其中所述电荷双层与所述给定珠子的表面相邻。
104.根据权利要求102所述的系统，其中在使用过程中，所述多个单链核酸分子偶联至所述传感器阵列的一个或多个表面，其中在使用过程中，所述第一单链核酸分子偶联至所述给定传感器的表面，并且其中所述电荷双层与所述表面相邻。
105.根据权利要求101-104中任一项所述的系统，其中所述给定传感器包含至少两个电极。
106.根据权利要求101-105中任一项所述的系统，其中在使用过程中，指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是稳态信号。
107.根据权利要求101-105中任一项所述的系统，其中在使用过程中，指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是瞬时信号。
108.根据权利要求101-107中任一项所述的系统，其中在使用过程中，指示所述个体核苷酸的掺入的所述信号是由所述电荷双层中的阻抗或阻抗变化生成的电信号。
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