CN1481441A - 根据瞬时电信号表征样品中分子间相互作用和运动的方法和设备 - Google Patents

根据瞬时电信号表征样品中分子间相互作用和运动的方法和设备 Download PDF

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N·普曼德
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Abstract

提供了检测样品中瞬时电信号的装置。还提供了含有本装置的系统。本装置和系统可用于各种应用，特别是用于表征样品，更特别适于表征样品中存在的分子。

Description

根据瞬时电信号表征样品中分子间相互作用和运动的方法和设备
相关申请的交叉参考
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2000年10月20日申请的系列号为60/242,047的美国临时申请的优先权，以及2001年4月20日申请的系列号为60/285,578的美国临时申请的优先权；这两篇申请并入本文作为参考。
背景技术
有许多应用是希望检测和/或表征样品中分子运动和/或相互作用，如在两个或多个分子间是否存在结合作用(共价或非共价)。这样的应用用于不同领域内，包括研究和医疗，如诊断领域。例如，许多研究和临床诊断方案是以检测样品中的分析物为基础，使用能够检测和/或表征一种或多种分析物的存在和/或数量的机理，所述分析物是根据其与互补结合对成员的结合而被检测出。
由于这种应用对于广泛的科目均有重要意义，已经发展出大量的不同方案和方法来实行这种应用。许多方案和方法使用可检测的标记，所述标记可以反过来修饰目的分子的特征。其它方法使用间接的化学或物理测量手段来分析样品，但是通常在这些方法中，要使用昂贵的复杂检测设备，或者灵敏度非常有限。
因此，仍需要发展一种新的方法来表征样品中的分子运动和/或相互作用。
发明内容
本发明提供了根据瞬时电信号来表征样品中第一分子和第二固定化(immobilized)分子的方法和设备。在本方法中，样品中第一分子相对于第二固定化分子的单向运动产生了瞬时电信号，检测这个电信号并将其与样品中第一和第二分子的至少一个特性相联系，如总电量，运动，速度，数量，结构，或结合作用，其中在许多具体实施方式中，将由第二分子(结合位点)附近的第一分子的过量电荷所产生的瞬时电信号与样品中的第一和第二分子之间发生的相互作用相联系。本方法和设备可用于各种应用，包括但不限于：(1)检测和/或表征聚合酶催化的模板依赖性引物延伸反应，如，核酸测序，SNP检测，基因表达图谱，实时PCR等；(2)分析检测应用，如检测样品中的蛋白和/或核酸分析物；和(3)表征分子运动，如测量分子和/或离子的扩散长度。
附图说明
图1.1和1.2显示了产生本发明所利用的瞬时电信号的机理示意图。
图1.3(即1.3.a和1.3.b)；1.4(即1.4.a和1.4.b)和1.5(即1.5.a和1.5.b)提供了代表瞬时电信号的一些实例。
图2.1显示本发明的一种具体实施方式的系统(即代表性的平面传感器系统)。
图2.2和2.3显示使用本发明实施方式中的二重电极进行的DNA聚合结果。
图2.4提供根据本发明解释瞬时电信号如何获得关于样品中A和B的定性/定量的信息的实例。
图3显示本发明在测序应用中的示意图。
图4∶1到4∶3显示根据本发明的SNP检测方法示意图。
图5显示可选择的SNP检测方法示意图，其中含有目的SNP序列的PCR产物被检测。
图6显示根据本发明的另一SNP检测方法示意图。
图7显示根据本发明的实时PCR应用示意图。
图8显示根据本发明的微生物病原检测方法示意图。
图9显示根据本发明的抗体-抗原检测应用示意图。
图10显示根据本发明的蛋白质-蛋白质相互作用试验示意图。
图11显示根据本发明的配体-受体试验示意图。
图12显示根据本发明的杂交试验示意图。
图13显示根据本发明的代表性电极检测部件示意图。
图14显示本发明集成硅片装置的放大图。
图15显示适于检测模板依赖性引物延伸反应的装置。
图16显示适于高处理量蛋白筛选的阵列(array)装置。
图17A和17B显示下面实验部分中实施方式1中所用的样机设备
图18A至18E和图21显示在下面实验部分所记载的测序试验的结果。
图19A和19B显示根据本发明的基因表达阵列分析试验的示意图。
图20显示本发明的试验系统的噪音成份读数。
图22显示本发明另一具有代表性的CMOS装置示意图。
名词定义
本文所用的术语“核酸”指由核苷酸如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的大分子。
本文所用的术语“核糖核酸”和“RNA”指由核糖核苷酸构成的大分子。
本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”指由脱氧核糖核苷酸构成的大分子。
本文所用的术语“寡核苷酸”指长度约为10-100个核苷酸的单链核苷酸多体
本文所用的术语“多核苷酸”指单链或双链大分子，由核苷酸单体构成，这些单体长度通常为大于100到约8000或更多个核苷酸。多核苷酸包括单链或多链构型，其中的一条链或多条链可能或不可能彼此完全匹配。
“核苷酸”指核酸的亚单位，包括磷酸基团，一个5碳糖和含氮碱基，以及这种亚单位的类似物。
本文所用术语“多肽”指在一个氨基酸的羧基基团与另一氨基酸的氨基基团之间形成酰胺键而生成的化合物。
本文所用的术语“寡肽”指具有少于约10个至20个残基即氨基酸单体单元的肽。
本文所用的术语“多肽”指具有大于约10个至20个残基的肽。
本文所用术语“蛋白”指具有大于约50个残基的特定序列的多肽。
本文所用术语“阵列”指具有多个瞬时电信号检测部件的基质，该部件稳定地连接在基质的表面，其结合物质(binding agent)可以多种不同模式空间地定位在基质表面，通常彼此之间是流体分离的。
术语“结合物质”指任何特异性结合对的成员的物质，其中该物质可包括：肽，如蛋白或其片段；核酸，如寡核苷酸，多核苷酸；以及诸如此类。
术语“生物大分子”包括肽或多核苷酸，以及由氨基酸或核苷酸类似物或非核苷酸基团构成的化合物，或含有氨基酸或核苷酸类似物或非核苷酸基团的化合物。这样，该术语包括那些常规多核苷酸骨架被非天然存在的或合成的骨架所取代的化合物，以及那些一个或多个常规碱基被合成的能够参与形成Watson-Crick型氢键的碱基所取代的核酸。
具体实施方式
提供根据瞬时电信号表征样品中第一分子和第二固定化分子的方法和装置。在本方法中，检测样品中由于第一分子相对第二固定化分子的单向运动所产生(即引起)的瞬时电信号，并将该瞬时电信号与样品中第一分子和第二分子的至少一种特征相联系，如总电荷，运动，速度，数量，结构或结合作用，在许多具体实施方式中，将瞬时电信号与样品中第一和第二分子间的相互作用相联系，所述瞬时电信号是由临近第二分子(结合位点)的第一分子的过量电荷所产生。本方法和装置可用于各种应用，包括但不限于：(1)检测和/或表征聚合酶催化的模板依赖性引物延伸反应，如用于核酸测序，SNP检测，基因表达图谱，实时PCR等；(2)分析检测应用，如样品中的蛋白检测和/或核酸分析；以及(3)分析分子运动，如测量分子和/或离子的扩散长度。
在进一步详述本发明之前，应该明白：本发明不限于下面所述的特定具体实施方式，因为可对特定具体实施方式进行各种改变，但是仍然属于本发明所要求的范围。还应知道所用的术语是为了描述特定具体实施方式，并非限制本发明的范围。本发明的范围由权利要求书界定。
在说明书和权利要求书中，除非另有清楚的说明，单数形式的“一种”“一个”“该”均包括复数参照。除非另有说明，所用的所有技术性和科学性术语与本发明所属技术领域的普通技术人员所知的含义相同。
当给定了数值范围时，应该理解，除非另有清楚的说明，在该范围的上限和下限之间的相对于下限单位的十分之一间隔的每个居间值，以及任何其它已述的或在该范围之内的居间值，均落入本发明的范围。这些小范围的上限和下限可独立地包括在这些小范围之内，也可经过在规定范围内特定地排除极限后，包括在本发明中。在所述范围包括一个或二个端值时，排除了该一个或二个端值的范围也包括在本发明中。
除非另有说明，本文所用的所有技术性和科学性术语与本发明所属技术领域的普通技术人员所知的含义相同。尽管任何类似或等同于本文所述的方法，装置和材料可在实践中使用或试验本发明，但现在要描述的是优选的方法，装置和材料。
本文所提及的所有出版物均并入本文作为参考，用于描述及公开本发明的主要组成，这些组成在这些出版物中均有描述，所述组成可与本发明结合使用。
为进一步描述本发明，首先，既科普地又以大量代表性应用的术语形式来详细描述本方法。然后，再详细地说明实施本方法的装置和系统。
方法
如上所总结，本发明提供用于表征样品中第一分子和第二固定化分子的方法。为实施本方法，用第一分子(典型地是多个相同的第一分子)相对于固定化第二分子(典型地是多个相同的固定化第二分子)在介质中的运动所产生的瞬时电信号来表征分子。“相对于”是指“朝向或背离”，这样，本发明提供了基于检测到的瞬时电信号基础上的方法，所述电信号是由第一分子朝向或背离固定化的第二分子运动而产生。产生本表征方法所用的被检测瞬时电信号的运动是单向的。而该运动可以线性形式，曲线或其它行进途径通过介质，但运动绝不会向后。这样，产生被检测瞬时电信号的运动是第一分子朝向或背离固定化第二分子的单向运动。
由本发明表征的分子是存在于样品介质中。在许多具体实施方式中，该介质是流体，气体或凝胶状导电介质，其中的分子具有有限的非零迁移率(mobility)，如流动的水介质，由水流体组份和一种或多种聚合增稠剂构成的凝胶介质等。
第一和第二分子可以是各种不同类型的分子，包括小分子分析物如半抗原、毒素、激素等，单体如氨基酸和核苷酸，大分子如多肽(如蛋白和其片段、配体、受体)，多糖，核酸如脱氧核糖核酸、核糖核酸，包括寡核苷酸，多核苷酸等。尽管不是所有的具体实施方式，但在许多具体实施方式中，该第一和第二分子是同类型的分子，如可以都为核酸或都为蛋白。在一些具体实施方式中，第二分子是大分子而第一分子可以是也可以不是大分子。特定的第二或固定化目的分子包括但不限于：核酸，如DNA或RNA寡-或多核苷酸，以及成分相同的双链结构；蛋白，如抗体或其结合片段；受体等。在许多实例中，第一和第二分子是离子，或至少包括离子化的部分，尽管介质的总电荷为零，但该部分携带局部电荷。
如上所述，本发明是表征样品中第一和第二分子的方法。表征意味着测定与至少一种表征样品中第一和第二分子的特征相关的信息，如分子的总电荷，分子的运动，分子的速度，分子的数量，分子的结构，在分子间的结合作用，分子的解离等。在许多实施方式中，本方法是表征分子间相互作用的方法，即，分子间的结合作用(如分子间的共价或非共价结合)或解离作用。
本发明的一个特点是通过以下所述来测定样品中第一和第二分子的至少一种特征：(a)首先检测所述第一分子在所述导电介质样品内相对于第二分子的运动所产生(即由之引起，因之而得)的瞬时电信号；然后(b)将检测到的瞬时电信号与样品中第一和第二分子的至少一种特征相联系，如分子之间发生的结合作用，样品中第一和第二分子的解离。瞬时电信号意味着非永久性的、可检测的、由第一分子相对于第二分子在导电介质中的运动所产生的电参数。由于目的电信号是瞬时的，只是在有限时期内存在。在许多实施方式中，这个时期通常约为1分钟到1微秒，通常约5秒到约10毫秒。另外，该目的瞬时电信号并不是稳定状态的信号，而是随时间改变。换言之，如上所详述的用于检测和/或表征第一分子相对于第二分子在导电介质中的运动的、被检测并利用的信号参数，是一种差动信号或参数，如上所述，该信号或参数在检测期间可被指定作为瞬时电标记，所述的瞬时电标记是由第一分子相对于第二分子在导电介质中的运动而产生或导致。各种不同的可检测瞬时电信号/参数都可用于本方法。非限制性地例举这种信号，可包括但不限于：电压，电荷，电流，电阻等。如上所述，该信号是瞬时地测量并在测量期间内随时间改变。
本发明方法利用了瞬时电信号，该信号是由第一分子在样品介质中相对于第二固定化分子的单向运动而产生，参照图1.1到图1.5进一步说明。图1.1和1.2分别显示：当第二分子可移动而第一分子固定时，在流体导电介质中的第二分子A(实际上是多个第二分子A)和第一分子B(实际上是多个第一分子B)。J是B的净电流强度(net current density)。当A和B之间发生结合时，如果A和B在溶液中都是游离的，进行净运动(net movement)，所以J为0。(参见图1.1)相反，当A是固定的，由于B被A的结合位点捕获而使得B本身也被固定，所以就产生B朝向A的扩散梯度，这样就获得了非零J。(参见图1.2)如果B有电荷(如B为dNTP离子)，J在介质中产生瞬时电势和瞬时电荷，这就产生了可检测的“信号/参数”。这些可检测的信号/参数是瞬时的，因为抗衡离子最终会朝固定的电荷运动来屏蔽它，使体系回复平衡。图1.3到1.5显示这种现象所产生的一些电压的实例。
通常，目的瞬时电信号或参数是通过监测目的样品介质中的瞬时电信号来检测的。目的样品介质通常具有指定的体积，含有第一分子和固定化第二分子。指定的体积可以不相同，但典型地约为5纳升到2ml，通常约为5μl到0.1ml，更常用约10μl到0.05ml。特别地，如上所述，监测含有第一和第二分子的指定体积的介质内的目的瞬时电信号。
为实施本方法，可监测指定体积的介质，以使用任何瞬时电信号检测部件来检测目的瞬时电信号，在许多实施方式中所用的检测部件为电极检测部件，该电极检测部件包括至少一种工作电极。该工作电极表面上固定有第二分子。该电极可由任何常规材料制造，所述材料包括金属、导电大分子、碳、硅、多聚硅等等。该电极上还可涂覆薄层绝缘体，如玻璃、石英等。任何方便的表面附着技术都可用于将第二分子固定在工作电极表面，根据表面和第二分子的特性，可采用不同的特定表面附着化学，其中具有代表性的表面附着技术包括共价附着，有时可通过连接基团、非共价附着，如磁力(如在磁化工作电极上的顺磁珠)等。在许多实施方式中，除了工作电极外，电极检测还包括参比电极，其中参比电极可由各种不同材料制造，并以各种不同构型存在。在一些实施方式中，电极检测部件包括多个不同电极。电极检测部件的电极可彼此相对构型成各种拓扑结构，只要它们能够监测样品中由可移动分子在样品介质中相对于固定分子的运动所产生的瞬时电信号。电极检测部件包括工作和参比电极，还有其它电极，这些电极可以或可以不具有相同实质，如果不同，则与样品接触的表面积要相同。每个电极的表面积可以不同，典型地约为10cm2到1μm2，通常约4mm2到约0.01mm2。关于两个电极具有实质相同的表面积，如果二者的表面积之间相差低于10％，通常低于2％，则认为这两个电极的表面积实质相同。
在许多实施方式中，在电极拓扑学和传感器中都使用噪音减小部件，其中电极阵列能够从被检测的瞬时电信号中去除不期望的噪音成分，来获得去除了噪音的信号，如同下面更详细的说明，然后该信号可用于表征步骤。例如，在许多实施方式中，使用了差异放大器，如差异电压或电流放大器，其从工作和参比电极接收输入信号，并提供相对而言或实质上去除了噪音的输出信号。一个详细的代表性的本发明系统的实施方式如图2.1所示。在图2.1中，显示的系统包括导电介质样品17的体积。在导电介质溶液中存在着第一分子，其相对于，例如朝向固定化第二分子A运动。还显示了电极检测部件16，其由第一工作电极16a和第二参比电极16b构成，其中固定化第二分子B是固定在第一电极16a的表面上。
在图2.2到2.3中，显示了图2.1平面拓扑的两个电极系统的实际结果。在图2.2中，分子A(0.1pmol ssDNA)是未激活的(无引物)，这样在酶的存在下，加入分子B(dNTP)不产生多聚化信号，但在图2.3中，分子A是激活的(通过加入引物)，这就产生结合位点，从而产生可检测瞬时电信号。
如图2.1所示的系统及其电极检测部件仅仅是本发明设备和系统的一个代表性实施方式。在本方法中所使用的电极检测部件可选用各种不同形式，其中其它具有代表性的形式在下面详细描述。
但是在许多实施方式中，实施本方法所用的装置和仪器是这样的装置：含有至少一个第一工作电极，该电极上固定有第二分子；一个驱动器(如差异放大器，在与介质接触的工作和参比电极间产生电荷差异)，用于驱动工作电极(以及任何该驱动器上存在的其它电极)；以及一个信号处理器，用于评价来自工作电极的反应并在其基础上产生瞬时电信号。在许多实施方式中，该装置还进一步包括至少一个参比电极，信号处理过程可以评价来自工作和参比电极的反应，并将其进行比较来产生瞬时电信号。在许多实施方式中，该设备还进一步包括一个容纳介质的工具，在该工具中一个或多个电极可与介质容纳工具中的介质相接触。
在操作中，瞬时电信号的检测部件可以是“被动的”或“主动的”。被动的检测部件是仅仅被动观察或检测介质中瞬时电信号的部件，并不向介质和/或检测部件组分施加任何刺激。而主动的检测部件则向在检测瞬时电信号过程中被检测的介质和/或检测部件施加刺激。这种用于主动检测部件的目的刺激的实例包括，但不限于：注入电流，电压干扰，电化学干扰等。无论检测部件是主动的还是被动的，都可以检测由第一分子在介质中相对于第二固定化分子的运动所产生的瞬时电信号/参数。
在本方法中，如上所述检测目的瞬时电信号之后，然后将被检测的信号与表征样品中第一和第二分子的至少一种特征相联系，如上所述。换言之，评价被检测的瞬时电信号以测定样品中第一和第二分子的特性，如它们是否相互作用，如它们之间的结合或解离。这种测定可以是定性或者定量的，在一些实施方式中，被检测的瞬时电信号数值与第一分子的数量或数目成比例，所述第一分子与样品中的第二或固定分子相互作用。图2.4显示一些分析瞬时信号的实例。例如，图2.4a显示相互作用分子的数量如何影响观察到的瞬时电信号。如此，可利用观察到的瞬时电信号来确定相互作用分子的数量。图2.4b显示相互作用的动力学如何影响观察到的信号。这样，可利用观察到的信号来确定相互作用的动力学。图2.5c显示分子的运动和扩散如何影响被观察的信号。这样，可利用观察到的信号来确定样品中分子的运动和扩散。可分析被检测信号或传感器检测到的波形的时间和/或频率。这个相关步骤提供关于被测样品中第一和第二分子的至少一种特征的信息。
所获的样品中第一和第二分子的至少一种特征的信息可在大量不同应用中以不同方式利用。例如，根据被测到的、由第一分子相对于第二分子的运动所产生的瞬时电信号而被检测出的第一和第二分子的相互作用可用于确定在介质中是否存在目的分析物，所述确定可以是定性或定量的，由于在许多实施方式中被测信号的强度与样品中分析物的数量成比例，所述分析物的运动产生了被检测的瞬时电信号。(参见如图2.4)在一些实施方式中，被检测的运动与结合作用，即，第一分子和第二固定分子之间的结合作用的发生相关。在其它实施方式中，被检测的运动可用于获得发生模板依赖性聚合反应的信息，或更具体表征该反应，如聚合酶介导的模板依赖性引物延伸反应，其中固定化第二分子是模板/引物核酸复合体，而第一分子是核苷酸。在下面详述这些代表性的本方法类别和发现可用的代表性应用/方案。检测/表征模板依赖性引物延伸反应
在许多实施方式中，使用本方法获得的至少一种特征是测定由聚合酶介导的、第一个核苷酸分子和第二固定化模板/引物核酸复合体分子之间的模板依赖性引物延伸反应。聚合酶介导的模板依赖性引物延伸反应指聚合反应，其中核苷酸在聚合酶催化的反应中共价地连接到引物3’末端，所述引物含有与模板核酸杂交的核酸，其中与引物核酸末端共价地连接的特定核苷酸互补于模板核酸中相应碱基，如A与T，C与G等。模板依赖性引物延伸反应是本领域公知技术，具有代表性的实施方式包括USP4,683,202；4,683,195；4,800159；4,965,188和5,512,462中公开的实施方式，将这些文献并入本文作为参考。正如本领域公知的，模板和引物核酸可以是RNA或DNA，核苷酸可以是核糖-或脱氧核糖核苷酸，聚合酶可选自大量不同的聚合酶，包括DNA聚合酶，RNA聚合酶和逆转录酶，其中具体成分的特定选择标准是本领域技术人员公知的。
在一些实施方式中，第一分子是核苷酸，而固定化第二分子实际上是由杂交了引物的模板核酸构成的复合体，所述引物含有核酸，如引物，或含有由于预先加入一种或多种核苷酸而至少部分地被延伸了的核酸的引物。在引物延伸反应中，聚合酶，如聚合酶或逆转录酶，催化核苷酸连接到固定化复合体核酸分子的引物核酸上。核苷酸在介质中朝向固定化复合体的运动产生可检测的瞬时电信号，该信号是由积累的局部电荷所导致并与相互作用相关，即，与模板依赖性引物延伸反应中核苷酸与引物的共价连接相关。如此，介质中观察到的瞬时电信号可指示在第一和第二分子之间是否发生相互作用，即，在介质中是否发生了引物延伸反应。换句话说，通过监测介质中的瞬时电信号并收集模板附近的瞬时局部电荷，我们可以了解在介质中，特别是在与介质接触的固定化模板/引物复合体上，是否发生了模板依赖性引物延伸反应。另外，根据特定的应用方案，可以用特定序列来表征模板依赖性引物延伸反应，其中不同的核苷酸被加入到引物核酸的3’末端。反应速度根据不同的核苷酸而有所差异，即，反应是核苷酸依赖性的，这样不同核苷酸分子朝向模板的运动就要依赖于核苷酸朝模板方向的掺入，该特征可在观察到的瞬时信号中检测出来。
在一些实施方式中，在介质中观察到的瞬时电信号可用于确定在模板依赖性引物延伸反应中是否有单个核苷酸加入到引物核酸的3’末端。在一些实施方式中，提供了一种系统，该系统由介质、电极检测系统和固定化的模板核酸/引物核酸复合体构成，在许多实施方式中该复合体固定在电极检测部件的电极表面上。例如，在图2.1所示的代表性系统中，在电极检测部件16的电极16a表面上具有模板/引物复合体，该复合体表示为B。该固定化的模板/引物复合体可使用任何常规技术固定在电极的表面，如通过共价或非共价连接，使用磁珠作为连接子通过磁力连接等等。使用任何常规技术将电极16a例如加入或接触到含有适当核苷酸的介质17，或将适当的核苷酸加入到已经与电极16a相接触的介质中，系统的介质可容纳核苷酸。如果核苷酸是如模板指令加入到引物核酸3’末端的正确核苷酸，在介质中就产生了瞬时电信号和局部电荷。相反地，如果核苷酸不是正确的核苷酸，介质中则不产生瞬时电信号。如此，检测瞬时电信号可指示在加入的核苷酸和固定化引物/模板复合体的引物之间发生了引物延伸反应。
上述检测单个核苷酸加入到模板依赖性引物延伸反应的方法可用于各种不同应用。特定的代表性目的应用包括核苷酸测序，单核苷酸多态性(SNP)检测，微生物学如病原学检测等。为进一步说明，下面详细介绍这些代表性应用。
在核酸测序应用中，上述技术方案可用于测定向引物核酸以每次一个的方式掺入的核苷酸，并从而测定固定化模板/引物核酸复合体中模板核酸的序列。在这些实施方式中，具有待测序列模板的固定化模板/引物复合体与连续的介质相接触，该介质含有单独的核苷酸或dNTP(如dCTP，dTTP，dATP，dGTP)(每次接触之间都进行充分清洗，以去除未结合的核苷酸)，然后测定每次接触时产生的瞬时电信号，或没有产生瞬时电信号。根据观察到的瞬时电信号序列和对产生每个连续信号的连续介质中特定dNTP内容物的了解，可以测定固定复合体的模板序列。例如，当模板核酸具有AGTC的序列时，含有模板的固定复合体首先与仅含有T的介质相接触。如果出现瞬时电信号，则表明T共价地连接到引物的3’末端，从而得知模板5’末端的第一个碱基为A。另一方面，如果该复合体首先与仅含有A的介质相接触，则观察不到信号，就可得出结论：模板5’末端的第一个碱基不是T。通过在测序方法的每个步骤中与合适的核苷酸相接触，就可以根据观察有无瞬时电信号以及信号的形式轻易地测定出模板的序列。在模板核酸中两个相同碱基相互毗邻的那些实施方式中，其指示的两个互补核苷酸的掺入会产生不同的瞬时电信号，如在时间和数量上，与单个核苷酸掺入所产生的信号不同。如参见图2.4。所以，可以轻松地测出序列中相同碱基二核苷酸的部分。以类似的方式，可通过恰当地解释其产生的瞬时电信号来表明三个或更多相同碱基的序列。通过这种方式，可通过解释一系列序列瞬时电信号而轻松地测定指定核酸的序列，所述信号是将含有待侧序列模板核酸的复合体顺次地与每种含有单独dNTP的介质相接触而产生的。在这些实施方式中，本方法所用系统中，复合体的模板或引物可物理地连接到或固定到基质上，如电极表面。
在上述各种单核苷酸掺入技术方案中，在一些实施方式中，固定化复合体与含有所有四种可能dNTP的介质相接触，在该实施方式中，产生的瞬时电信号根据掺入的核苷酸的不同而各不相同，因为这种核苷酸的掺入其本身对观察到的瞬时电信号的作用独一无二，由于每种核苷酸的调节分子朝向模板运动的聚合作用速度各不相同。例如，掺入dATP对观察到的总信号产生了独特的作用，而就其它三种核苷酸而言，每种核苷酸的掺入也对观察到的总信号产生了类似的独特作用。这样，观察的信号就要依赖于核苷酸掺入的序列，所以可用于直接阅读模板链的序列，该链支配着核苷酸共价地连接到含有核酸的引物3’末端的顺序。(这种测序方法也称为“run-off”模式)。
本方法测定核酸序列的代表性测序方案图解如图3。在图3中，首先获得含有待测序核酸的样品。该核酸先变性，然后在将适当的引物—例如与通用序列杂交的引物，该引物在产生PCR产物过程中被导入PCR产物模板3’末端—与核酸杂交之前或之后，将核酸固定到本发明系统的电极上。在图3中，获得的复合体通过与基因特异性引物5’末端的共价连接而被固定到电极表面。然后如上所述，将所获的固定化复合体核酸与反应缓冲液，聚合酶以及一种或多种dNTP反应。然后将观察到的瞬时电信号用于测定模板PCR产物链的序列，所述瞬时电信号由一或多系列的瞬时电信号构成，这依赖于所用的特定测序方案(如，将单个核苷酸的连续反应缓冲液与复合体相接触(即，单个核苷酸方法)，或将带有全部四种核苷酸的反应缓冲液与固定化复合体相接触(即“run-off”方法))。除PCR产物外，待测序的靶核酸还可以是直接分离自原始样品的RNA。在一些实施方式中，分离自原始样品的RNA与固定在电极表面的特异性引物相接触。(例如参见图3)然后如上所述，所获的复合体与反应缓冲液、聚合酶和dNTP相接触。该方法还可改进为将原始RNA转换为cDNA，然后固定，与特异性引物相接触以产生引物/模板复合体，然后再如上所述，与反应缓冲液、聚合酶和dNTP相接触。
本发明还可应用于单核苷酸多态性(SNP)检测。在这些实施方式中，分析样品中是否存在SNP。该样品可以是任何常规样品，典型地是获自待测是否存在SNP的宿主—如哺乳动物宿主(包括但不限于：宠物，家畜，人等)—的流体样品，其中流体样品可以是生物流体，组织样品制备的流体，如细胞溶解液等，只要该样品含有目的SNP即可，如果其中真的存在的话。
图4.1到4.3提供三种代表性SNP检测方案的示意图。在图4.1的实施方式中，首先制备待测的合适样品。提取总RNA后，在如图4.1所示的实施方式中，提取的RNA与固定的引物相接触，该引物在SNP的特定可变核苷酸5’最末端位点与靶RNA杂交(即该引物是SNP特异性引物)。然后将获得的固定化SNP特异性RNA复合体与反应缓冲液、聚合酶和合适的dNTP相接触，如果存在SNP，该dNTP将连接到引物3’末端，从而提供瞬时电信号。图4.2提供了多种该方法。图4.2显示的方案不同于图4.1所显示的，提取的RNA首先处理成cDNA，如使用标准cDNA合成方法。将获得的cDNA固定到电极上再变性。然后将SNP特异性引物杂交到固定的cDNA链上，以获得固定的复合体，然后如上所述，将该复合体与反应缓冲液、聚合酶和dNTP相接触。图4.3显示用于高检测量应用的类似SNP检测技术。图5显示各种上述SNP检测技术，其中首先处理样品以产生含有目的SNP的PCR产物，如果原始样品中含有SNP的话。首先变性使用标准PCR技术和适当的引物所获得的该PCR产物，所述引物例如在含有目的SNP的原始核酸序列的侧面。然后将获得的PCR产物固定到电极表面。在固定前或固定后，将PCR产物与SNP特异性引物杂交。再将获得的固定化复合体与反应缓冲液、聚合酶和dNTP相接触，并将获得的任何瞬时电信号或不存在电信号的现象与样品中是否存在目的SNP相联系。
上述SNP检测技术在图6中说明。在图6中，首先制备固定的复合体，所述固定复合体包括有待检测是否含有SNP的模板DNA链和与模板杂交的SNP特异性引物(即与模板杂交的引物，加入到该引物3’的下一核苷酸互补于SNP，如果存在SNP的话)。接下来，将多聚酶和核酸外切酶抗性dNTP—如硫代磷酸盐修饰的核苷酸如2’-脱氧核苷5’α-[P-硫代](dNTsP)或boranophosphates(2’-脱氧核苷5’α-[P-borano]三磷酸酯)(dNbTP)等，其互补于目的SNP碱基—在引物延伸反应条件下与复合体相接触，这样，当存在SNP时，该核酸外切酶抗性dNTP就共价地连接到引物的3’末端。然后，将该系统与核酸外切酶接触，该外切酶能够从3’末端酶切，但不能切割核酸外切酶抗性dNTP。酶切导致核苷酸背离固定的复合体运动，并伴随着瞬时电信号。这样，如果未观察到瞬时电信号就等于存在目的靶SNP，而观察到瞬时电信号就等于不存在SNP。
在另一实施方式中，本方法可用于实施实时PCR，如图7所示。将两种引物中的一种固定到电极上，并将固定的引物与混合物中的模板、另一引物、酶和全部四种dNTP(即GTP，ATP，TTP和CTP)相接触，就可以定量多聚酶链式反应中被扩增的靶物质。当加入核苷酸并延伸时，每个循环中的静电反应就产生了独特的波形，该波形可用于评价/估测每个循环中分子的质量。
在另一实施方式中，本方法可用于检测样品中微生物核酸，如病原体微生物物种的核酸，从而检测出样品中的微生物。该方法如图8所示。在图8所示的方法中，第一个步骤是提供具有固定化引物的系统，该引物可与待测的每种微生物物种中所发现的核酸结合。然后制备待测试的样品，如来自宿主或疑似携带目的微生物物种患者的样品，并在合适的杂交条件下，如严谨条件下，与固定化引物接触，以产生带有目的微生物物种的复合体结构。然后，将一种或多种dNTP，包括将要被掺入到引物中的dNTP(如果复合体存在的话)，与固定化的引物相接触。如果样品中存在病原体，将会形成复合体，并发生多聚作用，产生可检测的瞬时电信号。但是，如果在测试的样品中不存在病原体，就不会产生复合体，也不能观察到瞬时电信号。
在基因表达图谱中的应用也属于本发明范围。在这些应用中，定性地或定量地，通常是定量地，测量样品中多元表达基因的存在，如根据mRNA转录产物或与其数量成比例的其合成衍生物的存在而测量出，以获得样品的表达图谱。多元意味着至少2个，通常至少5个，更通常至少10个，可被检测出表达的不同基因的数目还可以更大，如约100个，约200个，约300个，约500个，约1000个，约2000个或更多，这要视特定的技术方案而定。本发明在基因表达图谱方面的应用中，可直接检测样品中多元mRNA转录产物，或检测目的mRNA转录产物的衍生物，如RNA或cDNA衍生物，例如cRNA，cDNA等，并用于推导基因表达图谱。各种不同的表达图谱技术是本领域技术人员公知的，其中样品中2个或多个基因的表达图谱可通过直接察看mRNA转录产物，或来自原始mRNA转录产物的cRNA，cDNA，扩增DNA等进行测定。
在本方法中，将带有工作电极(该工作电极上带有靶mRNA(或其核酸衍生物)的特异性引物)的电极检测部件与待测图谱的样品相接触，其中样品的原始mRNA转录产物已如上所述经过处理，以产生其RNA或DNA衍生物。每个待测定表达的特定基因都使用不同的引物/电极部件。这样，通过测定待测样品中100个不同mRNA转录产物或其核酸衍生物的存在来确定样品中100个不同基因的表达时，就使用100个不同的电极检测部件，其中每个检测部件至少含有一个工作电极，该电极表面上具有至少一个目的核酸的特异性引物。使用单个的电极检测部件时，每个不同的部件可以连续地与样品接触，以产生固定的模板/引物结构。或者，使用单个部件的复合阵列时，如存在于一个阵列上或其它集成装置上，每个独立的检测部件都可以同时与样品接触。如果原始样品表达目的基因，在检测部件上就形成模板/引物复合体。然后，所获的固定模板/引物结构与反应缓冲液、聚合酶和dNTP(通常是全部四种dNTP)接触，监测样品中的瞬时电信号。以这种方法，可轻松地检测出样品中的多元基因。使用电极/引物结构阵列，可高处理量地轻松完成基因表达图谱。正如下面要详细介绍的，在那些使用检测部件阵列的实施方式中，通常每个检测部件与分离的流体样品接触。图19a和19b提供了两个如上所述的代表性的基因表达图谱技术示意图。除上述应用外，还可以例如将总RNA/cDNA与电极阵列上预先固定的基因特异性引物(探针)孵育。这些在目的碱基上与引物5’/3’特异性排序/延伸的探针在合适的杂交缓冲液中可与RNA/cDNA杂交。然后在逆转录酶/DNA聚合酶以及全部四种脱氧核苷酸的存在下，将所获的模板/引物片段用作引物延伸反应的底物。当掺入核苷酸并进行延长时，同一RNA/cDNA分子基团的静电反应产生独特的波形，根据该波形可以鉴定并评价基因表达图谱的分子质量。
在本方法实施过程中，采用标准的聚合酶介导模板依赖性引物延伸反应条件。如此，在本方法中，制备用于测定瞬时电信号的介质，使其包含所有进行所需反应必备的组分，该组分至少包括：(a)工作电极表面的引物/模板复合体；(b)dNTP(s)；(c)一定数量的反应缓冲液；以及(d)聚合酶。下述指导基于制备50μl F1总体积反应缓冲液。如此，当制备不同数量的总反应混合物时，下述特定数量可以成比例地改变，这些计算对于本领域技术人员是显而易见的。在制备反应混合物过程中，工作电极上复合体结构的数量典型地至少约为100个分子，通常至少约为107个分子，更通常为至少约109个分子或更多，但典型地不超过1011个分子，而通常也不超过1011个分子。反应缓冲液中聚合酶的数量可以改变，但典型地约为1-100U，通常约为5-30U。反应缓冲液中还含有一种或多种dNTP，如单一的dNTP，或dATP，dTTP，dCTP，dGTP每种各一定量。在许多实施方式中，反应缓冲液中含有的总dNTP数量范围约为1-500nmol，通常约30-50nmol，更常用约35-40nmol，每种特定类型dNTP的相对数量可相同或不同。反应混合物中还含有一定数量的反应缓冲液，本领域技术人员公知那些适当的反应缓冲液。用于制备目的反应混合物的反应缓冲液数量典型地为约1mM-10mM，通常约为2mM-5mM。如上所述，上述的数量适用于1ml反应，可以调整为任意的反应体积。这样的调整对于本领域技术人员而言是显而易见的。在准备反应混合物过程中，各种组分可以任何顺序进行结合。制备反应混合物之后，将反应混合物处于足以进行模板依赖性引物延伸反应的条件下。该条件的特征典型地是在持续恒温下维持反应混合物一段时间使得反应充分发生。本方法该过程中所维持的反应混合物的温度通常为约4-75℃，常用约为20-43℃，更常用25-37℃。本方法变性的步骤典型地从约1毫秒到约30分钟，常用约2毫秒-约2分钟，更常用约2毫秒-约3分钟。
严谨型(stringent)杂交条件的一个实例为50℃或更高温度杂交，0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)。另一严谨型杂交条件是在42℃溶液中过夜孵育，所述溶液为：50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20μg/ml变性的、剪切的鲑鱼精子DNA，然后在约65℃，用1×SSC在过滤器中清洗。严谨型杂交条件至少是和上述代表性条件同样严谨的杂交条件，其中条件应该与上述特定严谨型条件相比至少是80％严谨，典型地至少约为90％严谨。本领域公知的其它严谨型杂交条件也可用于鉴定本发明特定实施方式的核酸。
上述的反应条件仅仅是代表性的适用于实施本方法的条件，仅仅是说明性目的。如此，并不能限制本发明的范围。
上述根据本发明检测模板依赖性引物延伸反应的特定应用仅仅是本发明可应用的所有各种应用的代表。
分析物检测应用
除了检测/表征模板依赖性引物延伸反应，本方法还可用于分析物检测应用。在该应用中，第一分子是目的分析物，其特异性地结合固定化第二分子，该应用中是通过检测介质中的瞬时电信号来检测这两个分子间的结合作用，所述电信号由分析物第一分子朝向固定化第二分子进行的运动而产生。由于结合作用和瞬时电信号只有当目的分析物存在于被测样品中时才会产生，缺乏目的分析物时并不产生，所以检测介质中瞬时电信号可直接知晓被测样品中是否存在目的分析物。
在该应用中，即使不是定量地，至少可以定性地检测指定样品中特定的一种或几种分析物。在本发明的分析物检测应用中，将疑似含有目的分析物的样品与带有固定分子，如配体的电极接触，所述配体可特异性地结合该分析物，监测样品介质中的瞬时电信号。将样品维持在合适的温度，如约4-约30℃，通常约4-约25℃，并维持一定的时期，如约1min-约180min，这样如果分析物存在于样品中，那么将发生结合作用。如果目的分析物存在于样品中，其朝向其固定的配体运动以与其结合，并产生瞬时电信号。如果不存在分析物，不产生瞬时电信号。如此，通过监测样品中是否存在瞬时电信号，就可以轻松的确定样品中是否存在目的分析物。
可使用本方法检测各种不同分析物，其中代表性的目的分析物包括但不限于：多肽分析物，包括蛋白和其片段；核酸包括寡核苷酸和多核苷酸，DNA和RNA；多糖；激素；毒素等。引人注目的特定代表性分析物检测应用包括但不限于：抗体-抗原结合作用检测应用；蛋白-蛋白相互作用；配体-受体应用；以及核酸杂交应用。每个代表性应用均在下面更详细地介绍。
图9显示根据本发明进行抗原检测应用的示意图。在该代表性技术方案中，目的抗原的特异性抗体，或其结合片段被固定到电极表面。然后将固定的抗体与疑似含有目的抗原分析物的样品接触。检测的瞬时电信号就表明样品中目的抗原分析物的存在。
图10显示根据本发明进行的蛋白-蛋白相互作用试验示意图。在该应用中，已知蛋白“饵(bait)”被固定到电极表面。然后将该电极与含有已知和/或未知蛋白的样品接触，通过检测样品中的瞬时电信号就可检测出已知的固定饵蛋白与样品中已知或未知的被捕获蛋白之间的相互作用。
图11显示根据本发明进行的配体-受体测定技术示意图。在图11所示的技术方案中，特异性结合目的受体的配体被固定到电极表面。然后将有待测定是否含有结合该配体的受体的样品与该固定配体接触。检测接触后获得的瞬时电信号，并将其与被测样品中的受体的存在相关联。
图12显示根据本发明进行的杂交试验示意图，其中通过测定样品中瞬时电信号来测定样品中核酸分析物的存在，所述电信号是由核酸探针朝向与探针杂交的固定化核酸靶物质的运动所产生。
在一些实施方式中，本发明的分析物检测方法是以高处理量的形式进行，其中可同时测定样品中的多个(如5，10，25，50，100，500，1000，10000或更多)分析物。在这些实施方式中使用检测部件阵列，每个部件均由特定分析物配体构成，所述配体固定在电极表面。在这些实施方式中，在足以使分析物结合到其相应的结合对成员配体上的条件下，使阵列与待测样品接触。通过监测样品中的瞬时电信号来检测阵列表面上结合复合体的形成。在许多该阵列的实施方式中，每个不同配体/电极结构具有其本身的分离样品，这样只有由分析物朝向单个电极的运动所产生的电信号才能被观察到。换言之，本发明阵列的每个独立工作电极与流体分离的样品接触。本发明代表性阵列装置在下面详述。然后可由检测到的瞬时电信号来推导样品中分析物的存在。
使用本发明实施方式中阵列装置的目的特定分析物检测应用包括杂交试验，其中使用了本发明的阵列核酸。在这些试验中，首先制备靶核酸样品，其制备可包括从原始来源中分离mRNA转录产物，还可包括制备这种转录产物的核酸衍生物以用作靶物质。制备样品后，在杂交条件下，将样品与阵列相接触，从而在与探针序列互补的靶核酸之间形成复合物，所述探针附着在阵列表面。然后可通过检测每个典型地流体分离的、与每个单个检测部件相接触的样品中的瞬时电信号，来检测是否存在杂交复合物。可使用本发明阵列的目的特异性杂交试验包括基因发现试验，差异基因表达分析试验；核酸测序试验等等。描述在各种应用中使用阵列的方法的专利及专利申请包括：5,143,854；5,288,644；5,324,633；5,432,049；5,470,710；5,492,806；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,547,839；5,580,732；5,661,028；5,800,992；将其并入本文作为参考。
当阵列为多肽结合物质阵列时，如蛋白阵列，特定的目的应用包括分析物检测/蛋白(proteomics)应用，包括4,591,570；5,171,695；5,436,170；5,486,452；5,532,128；6,197,599中所述的，将其并入本文作为参考；还有出版的PCT申请WO99/39210；WO00/04823；WO00/04389；WO00/04390；WO00/54046；WO00/63701；WO01/14425；和WO01/40803；将其美国优先权文件并入本文作为参考。
装置
本发明还提供用于实施上述方法的装置。该装置包括至少以下组分：(1)电极检测部件；和(2)输出信号处理部件。这些部件均在下面详细介绍。
本装置的电极检测部件包括至少一个其显示表面上固定有分子(即第二分子)的工作电极。在许多实施方式中，该电极检测部件包括两个电极，其中一个显示表面上固定有分子(如配体，模板/引物复合体等)。图13显示本发明简易的电极检测部件。在图13中，传感器装置20包括输出引线22和工作电极24a和参比电极24b。工作电极24a表面上具有固定化第二分子(未显示)。将传感器20浸入容器28中容纳的样品26后，使用电极传感器部件20测定样品中与工作电极24a上固定化第二分子特异性结合的分析物的运动，并产生输出信号，通过输出22将信号传出传感器，例如传到生产信号处理部件。如图所示，集成到传感器部件上的是差异放大器29。尽管图13显示的是单个传感器部件，但也可以采用这种电极传感部件的阵列，例如用于高处理量地测定大量单独的样品，如可在微量滴定板的各孔中找到结果，如96或384孔板，其中电极传感部件的阵列可包括单个传感部件的相应数目。
在另一实施方式中，电极传感部件是集成装置的一部分，该装置进一步包括样品容纳器具。在许多实施方式中，该集成的装置被制成芯片的形式(如“芯片实验室”)或阵列结构。图14给出了代表性集成装置的一部分，该装置具有芯片或构架。在图14中，显示了使用CMOS芯片的代表性集成装置。电极阵列是通过板和/或焊球(球格栅排列包装(ball grid array packaging)与CMOS芯片电子地相连。传感器、差异放大器和信号途径被嵌入CMOS芯片中，就可在板和或焊球上得到输出信号。该电极阵列本身可被置于石英、玻璃或二氧化硅覆盖的平板上。可使用任何商业出售的CMOS过程制备CMOS芯片，考虑必要的性能和每个传感器的面积，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。图22在下面的实验部分进一步介绍。
集成的阵列装置如图15。在图15中，装置40含有玻璃基质41，在其上存在着第一平面电极42，该电极上固定有引物/模板复合体43(即平面工作电极)，玻璃基质上还存在第二参比电极44。还显示电极输出引线46。图15中显示的由工作和参比电极构成的电极传感部件存在于阵列之上，该阵列具有多个这样的传感部件，其中每个传感部件之间在阵列中均为流体地彼此分离，如，通过低隔断或本领域公知的其它类型流体屏障。例如参见U.S.PatentNos.5,807,522和5,545,531，这些专利均公开了基质表面的流体屏障(将上述专利以及WO 93/17126并入本文作为参考)。在图15的电极传感部件中，工作和参比电极可用于观察由于工作电极表面上的聚合作用而产生的瞬时电压，该瞬时电压是用于检测模板依赖性引物延伸反应的瞬时电信号。
图16显示本发明阵列装置的另一实施方式。在图16的装置中，阵列包括6个分离的电极传感部件V1-V6，每个用于不同的受体。每个传感部件是在阵列表面流体地彼此分离。传感部件是位于硅基质上。在阵列表面配体和受体结合就产生瞬时电势，该信号可使用电极传感部件检测，并用于确定结合作用的发生。
还可有其它的装置构型，上述特定的装置实施方式仅为说明之用。如上所述，单个电极传感装置和多元复合体、集成装置如芯片和阵列装置均包括在本发明的范围之内。
除了上述电极传感部件之外，本装置典型地进一步含有信号处理部件，用于从观察到的瞬时电信号中推导样品中第一和第二分子的至少一个特征，即，用于将输出电信号与样品中第一和第二分子的至少一个特征相联系。该信号处理部件典型地含有软件部分和硬件部分，其中软件部分是由记录在计算机或处理器可读储存介质上的适当算法构成。储存介质上的算法是用于阅读观察到的、由装置的电极传感部件给出的输出瞬时电信号，并对其进行处理，以得到至少一个期望特征的信息。记录有算法的计算机或处理器可读储存介质可为任何常规介质，包括CD，DAT，软盘，RAM，ROM等，所述介质能够被装置的硬件部分阅读。
上述集成的装置可制成各种不同形式，所述形式包括自主式“芯片实验室”构造，除了样品介质容纳器具和上述的电极传感部件之外，该构造还含有各种流程、连接等，试剂端口、观察窗等，都容纳在显微流体(microfluidic)装置中。本领域技术人员公知很多不同的显微流体(microfluidic)装置，可对这些装置进行修饰来获得本发明的集成装置。公开各种显微流体(microfluidic)装置和结构的代表性美国专利包括但不限于：U.S.Patent Nos.6,300,141；6,287,850；6,271,021；6,251,343；6,235,175；6,213,151；6,171,850；6,123,819；6,103,199；6,054,277；和5,976,336，将上述专利并入本文作为参考。
系统
本发明还提供用于实施本方法的系统。该系统含有一个如上所述的装置，以及导电介质，如凝胶，气态或流态导电介质。另外，该系统还可包括实施本方法所需的任何试剂，如缓冲液，核苷酸，酶(如Klenow)等。
提供以下实施方式用作说明本发明，而非限制本发明。
                         实验
I.DNA测序应用
A.材料和方法
1.寡核苷酸的合成和纯化
合成寡核苷酸BMPUP(5’-BIOTIN-CGGCGATAAAGGCTATAACGG)(SEQ ID No.01)和MPBDOWN(5’-GTGGAACGCTTTGTCCGGGG)(SEQ IDNo.02)，并用MWG Biotech(High Points，NC，USA)进行HPLC纯化。
2.体外扩增和模板制备
使用BMPUP和MBPDOWN进行PCR反应，扩增pMBP载体的多克隆位点。生物素化的PCR产物被固定到抗生物素蛋白链菌素覆盖的超顺磁珠(Dynabeads M280 Streptavidin Dynal A.S.，Oslo，Norway)上。在0.10M NaOH中孵育固定化PCR产物3min，去除上清后得到单链DNA。在10mM三乙酸pH7.5，和20Mm乙酸镁中，测序引物与固定化的ss-DNA链杂交。
3.电极
实验中使用金覆盖的电极。一个电极由铁制成(一种磁性材料)，另一个由铜制成。
4.传感器介绍
测量固定化DNA离子的净静电荷的传感器是简易的差异电压放大器。该放大器使用截断器稳定的(chopper-stabilized)操作放大器TLC2652A(如果需要大量成品的话)，在负反馈构型下制造
5.电荷测序
首先，为固定DNA离子，将铁电极浸入待用的(primed)并固定化的PCR溶液中。将永磁铁置于铁电极顶部以产生磁场来吸引顺磁珠，该顺磁珠上携带着DNA离子(图17A)。一旦小珠吸附到电极表面(仅用几秒钟)，DNA离子就电子地相连到电极上。
然后，将铁电极从PCR溶液中取出并在室温下放入反应缓冲液中(0.1M三乙酸(pH7.75)，0.5mM EDTA，5mM乙酸镁，0.1％BSA，1MM dithrithreitol)。如果核苷酸被加入到反应缓冲液中，聚合酶将会向电极上固定化的DNA离子中掺入正确的核苷酸，这(部分地)导致固定化DNA离子的去离子作用。这就导致电极上的静电荷发生变化(也就是电荷测序信号)。这个电荷测序信号含有靶DNA的遗传密码信息。
但遗憾的是，与系统的各种噪音相比，电荷测序信号太小，从而不能轻松地被收集。因此，将第二电极(由金覆盖的铜制成)放入反应缓冲液。该第二电极用于收集系统中的一般模式噪音(即，缓冲液中电极的一般电压，背景噪音等)，然后从铁电极得到的信号中减去这个噪音，得到不含噪音的电荷测序信号，用于阅读遗传密码。参见图17B。
B.初步结果
1.背景噪音：当我们将各电极浸入缓冲液，可以从示波器上看到缓冲液的背景噪音加上放大器的噪音。应该注意，需要一段时间(约10秒)才能获得稳定的背景噪音信号(图20)。其原因是电极表面的DNA分子正在电离，该过程在铁电极表面产生一些净静电荷(net static charge)。
2.单个核苷酸掺入：在该情况下，只加入一种核苷酸(已知其会掺入到DNA)，并观察电脉冲。该信号(差异放大器输出)持续一段时间(3微秒)，当没有掺入位点时，该信号消失。
3.Run-off模式：在这里，我们向缓冲液中加入所有的四种核苷酸。正如预期的，产生了一系列电脉冲(图21)。所有的掺入在少于1秒的时间(400ms)内发生。这被理论证明，因为核苷酸掺入所需的时间为几微秒，而在此，我们使用的DNA分子约为300个碱基对。
II.300bp DNA片段的样品电荷-测序延伸标记。
在电荷检测方法中，等位基因-特异性引物/探针被固定到电极或导电表面，并与cDNA孵育以进行分析。仔细清洗后，将带有固定化ssDNA模板/引物的电极置于含有DNA聚合酶的溶液中。当掺入dNTP并进行延伸时，相同DNA分子的静电反应会产生独特的波形(标记)，从中可定量/评价DNA分子的数目。
这种化学作用相对较简单，因为溶液中只使用了一种酶，而且用于测量净电荷改变的传感器的概念也相对简单。该传感器还可用标准的CMOS技术制造，该技术使得平台格外适于设计半导体芯片上的传感器阵列，并可在最小投资下提高处理量，参照图22。在图22中，该传感器(差异放大器)可轻松地在硅上生产(CMOS技术)。用于固定的永磁体可造在芯片上的螺旋感应器之外。应用这个平台可以生产出单个的小硅芯片对多个样品进行测序。为使DNA朝正确的传感器运动，可使用可控水平电场来驱使DNA离子。或者，可将样品精确地置于正确位点上。
因为固定化DNA离子的电荷波动，该检测方法还可以是实时的，可用于阅读遗传密码，一旦电极被放入含有聚合酶和核苷酸的溶液中，几乎即刻就可发生。
该技术的其它优点是可用于电子工程的趋势改进，一是改进平台设计，该设计均为电子的，且为芯片级的，二是可以改进模式识别，模式识别是交流中常见问题。反应的速度与今天的数据获取系统(微秒，与毫微秒相比)相比相对较慢，有许多统计学信号处理方法可解释该信号，并提取出信息。本发明的样机建造于Stanford Center for Integrated Systems，并在StanfordGenome Technology Center进行了测试，显示由聚合作用所产生的信号已足够高，可通过商业出售的电子部件轻松地获取。该实验显示即使没有大量的最佳条件选配，本样机的灵敏度与任何应用中的光学检测系统相同。这意味着电荷测序平台是遗传水平样品的良好备选。
图18A-18E显示实际观察到的电荷测序表达标记实例。
III.基于电荷的检测系统各种代表性应用
A.样品制备
1.RNA抽提
使用商业出售的RNA分离试剂盒提取RNA，该试剂盒是被设计成简便、快速、可靠地从少量细胞中分离总RNA，如穿刺活检，分类的细胞，显微-全裂的组织，血液或可通过各种由Ambion，Qiagen，Promega等出售的总RNA分离试剂盒而获得的细胞系。这些系统结合了一个旋转柱和一步或二步RNA提取和结合方法。该方法通常可在1小时或更短时间内制备出待用的RNA。该试剂盒足以收集高质量的总RNA用于后续的基因表达分析。方法原理：通过向样品中加入RNA抽提缓冲液从细胞中提取RNA。离心管(spin column)纯化RNA，以小体积洗脱纯RNA，通常5-10μl，以方便后续的操作。细胞样品：仔细地离心(多数为2000rpm或约400g离心)5分钟并完全去除上清来收集细胞。向细胞沉淀中加入RNA抽提缓冲液。轻微涡旋来悬浮沉淀。组织样品：向组织样品中加入200μl RNA抽提缓冲液。使用匀浆器，如Polytron仪器的玻璃-特氟隆匀浆器，在RNA抽提缓冲液中研磨组织，在冰上孵育试管20分钟。约每10分钟轻微涡旋试管，向试管中加入1体积(200ml)95-100％的乙醇。简单混合。在冰上孵育10分钟。将混合物转移到离心管中，并将离心管置于2ml收集管中。微离心机中全速旋转离心管和收集管1分钟。加入200μl RNA抽提缓冲液，并重复如上所述的微离心机离心步骤。
将离心管转移到新的1.5ml试管中。直接向离心管的隔膜加入10-20μlRNA抽提缓冲液，等待2分钟。简短地离心洗脱RNA。被洗脱的RNA现在可直接使用或保藏在-70℃待用。
2.制备cDNA并固定
可在GeneBank( blast@nibi.nlm.nih.gov)中检索某些基因的序列。可根据出售商的指南(例如Ambion，Qiange，Promega等)从外周血、组织或细胞系制备总RNA。可使用SuperScriptTM预扩增系统(Life Technologies)合成DNA第一链。合成第一链使用的RNA/引物混合物含有：RNA和寡(dt)随机引物或基因特异性引物。这些cDNA与预合成基因特异性的、已被固定到电极上的引物孵育，在20mM Tris-HCl(pH7.5)，8mM MgCl2或任何其它杂交缓冲液中进行杂交，以用于后面的分析。
3.固定总RNA
将预合成的基因特异性引物(探针)通过不同的固定技术固定到电极上。抽提出的总RNA与这些探针孵育，在20mM Tris-HCl(pH7.5)，8mM MgCl2或任何其它杂交缓冲液中进行杂交，以进行后面的分析。
B.测序
单链DNA(ssDNA)与电极表面的预先固定的基因特异性引物(探针)孵育。这些探针是特异性排列/延伸引物，其3’端具有目的碱基或序列，用于在合适的杂交缓冲液中使DNA与ssDNA杂交。然后将所获的固定化模板/引物复合体作为引物延伸反应中的底物，将固定化复合体与DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸，即ATP，GTP，CTP和TTP接触。参见图3。当掺入核苷酸进行延伸时，相同DNA分子的静电反应就会产生独特的波形，波形对应着聚合酶催化的每个核苷酸的掺入，从该波形可以检定出每个掺入的dNTP模式。参见图18A-E和21。
C.利用总RNA进行SNP检测
总RNA与预先固定在两个相同电极上的基因特异性引物(探针)一起孵育。这些探针是特异性排列/延伸引物，其5’端具有目的碱基，用于在合适的杂交缓冲液中与RNA杂交。然后将所获的模板/引物核酸复合体或片段作为引物延伸反应的底物，该反应含有逆转录酶和特定脱氧核苷酸，如果模板是目的SNP，特定脱氧核苷酸就会共价地结合到引物核酸的3’末端。当掺入核苷酸进行延长时，相同RNA分子的静电反应可产生独特的波形，从该波形可以确定SNP模式。例如参见图4.1。
D.使用cDNA检测SNP
合成的cDNA与预先固定在两个相同电极表面上的基因特异性引物(探针)孵育。这些探针是特异性排列/延伸引物，其3’端具有目的碱基，用于在20mM Tris-HCl(pH7.5)，8mM MgCl2或任何其它杂交缓冲液中与单链cDNA杂交。然后将所获的模板/引物核酸复合体或片段作为引物延伸反应的底物，该反应含有逆转录酶和特定脱氧核苷酸，如果存在目的SNP，特定脱氧核苷酸就会掺入。当掺入核苷酸进行延长时，相同DNA分子的静电反应可产生独特的波形，从该波形可以确定SNP模式。例如参见图4.2。
E.使用等位基因特异性引物进行SNP检测
将等位基因特异性引物的可能组合与预先固定在相同电极上的等位基因特异性引物(探针)孵育。这些探针是特异性排列/延伸引物，其3’或5’端具有目的碱基，可在适当的杂交缓冲液中与目的DNA/RNA杂交。然后通过与酶和脱氧核苷酸相接触，将所获的模板/引物复合体核酸或片段作为引物延伸反应的底物。当掺入核苷酸进行延长时，相同DNA/RNA分子的静电反应可产生独特的波形，从该波形可以确定SNP模式。例如参见图4.3。
F.使用PCR产物检测SNP
预先生物素化的PCR被固定到抗生物素蛋白链菌素覆盖的超顺磁珠DynabeadsTM M280-Streptavidin(Dynal A.S.，Oslo，Norway)上。固定化PCR产物在95℃，水中孵育3min后收集上清，获得单链DNA片段。加入3’端具有目的碱基的特异性排列/延伸引物，使其在20mM Tris-HCl(pH7.5)，8mMMgCl2或任何其它杂交缓冲液中与单链DNA杂交。将这些与引物杂交的单链DNA分为两等份，并固定到两个不同的电极上。然后通过与聚合酶和特定脱氧核苷酸相接触，将所获的模板/引物复合体核酸或片段作为引物延伸反应的底物。当掺入核苷酸进行延长时，相同DNA分子的静电反应可产生独特的波形，从该波形可以确定SNP模式。例如参见图5。
G.使用核酸外切酶/降解酶检测SNP
首先将靶核酸与固定在电极上的短寡核苷酸-即探针-杂交，使得该探针的3’或5’末端在目的多态性核苷酸之前至少还有一个核苷酸才终止，可检测靶核酸序列中的多态性核苷酸的存在。然后，在合适的条件下进行延伸反应，核酸酶抗性核苷酸(Nuclease Resistant Mucleotide(NRN))，如三磷酸-修饰的核苷酸(2’-脱氧核苷-5’-α-[P-硫代]三磷酸)dNTPs或boranophosphatase(2’-脱氧核苷5’-α-[P-borano-]三磷酸)被掺入到探针的3’或5’末端，相应于靶核酸的聚合位点。延伸反应完成后，用核酸外切酶在合适的条件下消化杂交分子。在3’或5’端掺入了NRN的探针分子对于核酸酶的活性具有抗性，而3’或5’端未掺入NRN的分子则对核酸酶活性没有抗性，从而被消化。当发生消化时，相同DNA/RNA分子的静电反应可产生独特的波形，从该波形可以确定SNP模式。例如参见图6。
H.实时PCR
先将两种引物中的一种固定到电极上可以定量聚合酶链式反应(PCR)中扩增的靶核酸。所获的结构与模板、另一引物、酶和所有四种dNTP接触。当掺入核苷酸进行延长时，每一次循环中的静电反应可产生独特的波形，从该波形可以评价/估计每个循环中分子的质量。例如参见图7。
I.病原体分类
将待测病原体的总RNA/DNA或其扩增核酸与存在于电极阵列上的预固定的病原体特异性引物(探针)相接触。这些探针是特异性排列/延伸引物，其3’或5’端具有目的碱基，可在适当的杂交缓冲液中与病原体DNA/RNA杂交(如果存在病原体DNA/RNA的话)。然后通过与合适的聚合酶/逆转录酶和所有四种脱氧核苷酸相接触，将所获的模板/引物复合体核酸或片段作为引物延伸反应的底物。当掺入核苷酸进行延长时，相同DNA/RNA分子的静电反应可产生独特的波形，从该波形可以确定并评价病原体的存在。例如参见图8。
J.抗原-抗体检测
将一组单或多克隆抗体预先固定在相同电极的表面。这些抗体与特定抗原具有亲合性，然后在适当的缓冲液中，将抗体与不同抗原在流体环境中孵育。当抗原和抗体间发生特异性反应时，相同抗原/抗体分子的静电反应就会产生独特的波形，从该波形可确定抗原/抗体相互作用的模式。例如参见图9。
K.蛋白-蛋白相互作用
将一组标记的蛋白预先固定在相同电极的表面。这些标记的蛋白与特定蛋白具有亲合性，然后在适当的缓冲液中，将标记蛋白与不同蛋白在流体环境中孵育。当蛋白间发生特异性反应时，相同蛋白-蛋白分子的静电反应就会产生独特的波形，从该波形可确定蛋白-蛋白的相互作用模式。例如参见图10。
L.配体和受体检测
将一组标记的配体或受体预先固定在相同电极的表面。这些标记的配体或受体与特定的配体或受体具有亲合性，然后在适当的缓冲液中，将标记的配体或受体与不同的配体或受体在流体环境中孵育。当配体或受体间发生特异性反应时，相同配体和受体分子的静电反应就会产生独特的波形，从该波形可确定配体和受体的相互作用模式。例如参见图11。
M.杂交
将ssDNA固定到电极表面，使其接触一组短的寡核苷酸探针，反复试验。当发生特异性杂交时，结合作用会产生独特的波形，从中可确定互补探针。参见图12。
N.使用总RNA或cDNA进行基因表达图谱
将总RNA或cDNA与多个存在于电极表面上的预固定基因特异性引物(探针)阵列一起孵育。阵列中的每个电极上存在着不同的基因特异性引物。该基因特异性引物是特异性排列/延伸引物，其5’或3’端具有目的碱基。在适当的杂交缓冲液中，引物阵列与目的RNA杂交。然后通过与逆转录酶/DNA聚合酶和所有四种脱氧核苷酸相接触，将所获的模板/引物复合体核酸或片段作为引物延伸反应的底物。当掺入核苷酸进行延长时，相同RNA/cDNA分子的静电反应可产生独特的波形，从该波形可以确定并评价基因表达图谱的分子质量。例如参见图19A和19B。
O.使用不同的固定技术将修饰的模板或寡核苷酸固定到不同的表面(由Au，Ti，Pt或任何其它导电材料制成的平板，针状物或多孔板)，如抗生物素链菌素覆盖的顺磁珠，初级氨基基团，末端磷酸，巯基硅烷(mercapto-silane)，环氧硅烷衍生物，异硫氰酸盐，氨苯基或氨丙基衍生的聚赖氨酸，使用异双功能交联剂连接到硫修饰的DNA上，亲和素直接定位等等；均属本领域技术人员公知常识。
使用上述各种固定技术将预先合成的基因特异性引物(探针)固定到电极上。
将提取的总RNA，PCR产物，cDNA或基因组DNA在20mMTris-HCl(pH7.5)，8mM MgCl2或任何其它杂交缓冲液中与寡核苷酸孵育，使其杂交。然后在逆转录酶或DNA聚合酶存在下(根据所用的DNA或RNA和特定dNTP来决定使用何种酶)将杂交的模板/引物片段作为引物延伸反应的底物。当掺入核苷酸进行延长时，相同DNA/RNA分子的静电反应可产生独特的波形，从该波形可以确定本发明的表征中所用模式。例如参见图19A和19B。
以上结果和讨论说明了一种新的重要的方法来表征样品中存在的分子。本发明的方法可用于各种应用，包括检测/表征模板依赖性引物延伸反应和分析检测应用。本发明的优点包括过程快，装置简单，投资低，还适于高处理量的形式。因此，本发明具有显著的进步。
本文引用的所有的出版物和专利申请均并入本文作为参考。对于任何出版物的引用均由于其先于本申请的申请日公开，而不应解释为本发明无权先于这些现有发明的出版物被授权。
为清楚地理解本发明，用例图和实施方式详细说明了本方法，但是在本发明的教导下进行一些改变和修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的，这些修饰和改变仍属于本发明的精神和范围。

Claims (108)

1、表征导电介质样品中第一分子X和第二固定化分子Y的方法，所述方法包括：
(a)提供含有所述固定化第二分子Y、所述导电介质样品、以及所述第
   一分子X的系统；
(b)检测由所述第一分子X在所述导电介质样品内相对于所述固定化第
   二分子Y进行的单向运动所产生的瞬时电信号；以及
(c)将所述检测的瞬时电信号与样品中所述第一分子X和所述第二分子
   Y的至少一种特征相联系。
2、根据权利要求1的方法，其中所述至少一种特征为运动、速度、数量、结构、电荷或结合作用。
3、根据权利要求1的方法，其中所述运动是X朝向Y运动。
4、根据权利要求1的方法，其中所述运动是X背离Y运动。
5、根据权利要求1的方法，其中所述导电介质样品是流体介质。
6、根据权利要求1的方法，其中所述导电介质样品是凝胶或气态介质。
7、根据权利要求1的方法，其中所述固定化的分子Y是大分子。
8、根据权利要求7的方法，其中所述大分子是多肽。
9、根据权利要求7的方法，其中所述大分子是核酸。
10、根据权利要求1的方法，其中所述固定化第二分子Y是固定在第一工作电极的表面。
11、根据权利要求10的方法，其中所述瞬时电信号是使用所述第一工作电极和第二参比电极进行测量。
12、根据权利要求10的方法，其中所述瞬时电信号是使用多个电极进行测量，其中多个电极包括所述第一工作电极。
13、根据权利要求1的方法，其中所述瞬时电信号是电参数随时间的变化。
14、根据权利要求13的方法，其中所述电参数是电压。
15、根据权利要求13的方法，其中电参数是电流。
16、根据权利要求13的方法，其中所述电参数是积累的电荷。
17、根据权利要求13的方法，其中所述电参数是所述介质的阻抗。
18、根据权利要求1的方法，其中所述第二固定化分子Y是固定在工作电极表面上的大分子，所述导电介质样品是流体介质；所述瞬时电信号使用第一工作电极和第二参比电极进行测量；所述运动是X朝向Y运动；所述至少一种特征是X和Y之间的结合作用。
19、根据权利要求18的方法，其中所述固定化的大分子是多肽。
20、根据权利要求19的方法，其中所述第一分子X是多肽。
21、根据权利要求19的方法，其中X和Y是蛋白质。
22、根据权利要求21的方法，其中X和Y是受体-配体对。
23、根据权利要求21的方法，其中X和Y是抗体-抗原对。
24、根据权利要求18的方法，其中所述固定化的大分子是核酸。
25、根据权利要求24的方法，其中所述第一分子X是核酸。
26、根据权利要求24的方法，其中所述第一分子X是核苷酸。
27、根据权利要求27的方法，其中所述方法是通过聚合酶催化模板依赖性引物延伸反应，来检测核苷酸与含有核酸的引物3’末端共价结合的方法。
28、根据权利要求24的方法，其中所述方法是核酸测序方法。
29、根据权利要求24的方法，其中所述方法是检测样品中核酸分析物的方法。
30、根据权利要求29的方法，其中所述核酸分析物包括SNP。
31、根据权利要求29的方法，其中所述方法定量地确定出所述样品中所述核酸分析物的数量。
32、根据权利要求31的方法，其中所述方法是基因表达图谱方法。
33、根据权利要求26的方法，其中所述方法是PCR方法。
34、检测介质中发生聚合酶介导的模板依赖性引物延伸反应的方法，所述方法包括：
(a)提供一种系统，该系统包括固定化的由模板和引物核酸构成的模板
   引物双重核酸，该双重核酸与所述介质相接触，其中所述介质包括
   聚合酶以及至少一种核苷酸；
(b)检测所述介质中所述至少一种核苷酸与所述引物核酸末端的共价结
   合所产生的瞬时电信号；以及
(c)将所述检测到的瞬时电信号与所述样品中聚合酶介导的模板依赖性
   引物延伸反应的发生相联系。
35、根据权利要求34的方法，其中所述瞬时电信号是电参数随时间的变化。
36、根据权利要求35的方法，其中所述被检测的聚合酶介导的模板依赖性引物延伸反应是在所述引物核酸3’末端共价地连接至少一个核苷酸。
37、根据权利要求33的方法，其中所述双重核酸被固定在第一工作电极的表面。
38、根据权利要求37的方法，其中所述瞬时电信号是使用所述第一工作电极和第二参比电极进行测量。
39、根据权利要求37的方法，其中所述瞬时电信号是使用多个电极进行测量，所述多个电极包括所述第一工作电极。
40、根据权利要求33的方法，其中所述介质是水流体介质。
41、根据权利要求33的方法，其中所述介质仅含有一种类型的核苷酸。
42、根据权利要求33的方法，其中所述介质含有至少两种不同类型的核苷酸。
43、根据权利要求42的方法，其中所述介质含有ATP，GTP，CTP和TTP。
44、根据权利要求33的方法，其中所述方法是核酸测序方法。
45、根据权利要求33的方法，其中所述方法是检测核酸分析物的方法，所述方法还进一步包括将聚合酶介导的模板依赖性引物延伸反应的发生与所述介质中所述核酸分析物的存在相联系。
46、根据权利要求45的方法，其中所述核酸分析物是SNP。
47、根据权利要求45的方法，其中所述核酸分析物是来自病原体有机体的核酸。
48、根据权利要求33的方法，其中所述方法是基因表达图谱方法。
49、根据权利要求33的方法，其中所述方法是实时监测PCR反应的方法。
50、测定核酸序列的方法，该方法包括：
(a)提供含有固定化模板引物双重核酸的系统，该双重核酸由所述核酸
   与引物核酸杂交而成，其中所述固定化的模板引物双重核酸被固定
   在工作电极的表面，并与含有聚合酶和至少一种核苷酸的介质相接
   触；
(b)检测所述介质中由至少一个核苷酸与所述模板核酸的末端共价连接
   所产生的瞬时电信号；以及
(c)利用所述被检测到的瞬时电信号来确定所述核酸的所述序列。
51、根据权利要求50的方法，其中所述方法包括制备所述模板引物双重核酸，然后固定所述双重核酸。
52、根据权利要求50的方法，其中所述方法包括固定所述模板核酸，然后将固定的模板核酸与所述引物核酸杂交。
53、根据权利要求50的方法，其中所述方法包括固定所述引物核酸，然后将固定的引物核酸与所述模板核酸杂交。
54、根据权利要求50的方法，其中所述介质含有一种单一类型的核苷酸，并且所述方法包括两个或更多重复的所述步骤(a)和(b)，以产生多个瞬时电信号，从中可确定出所述核酸的所述序列。
55、根据权利要求50的方法，其中所述介质含有至少两种不同核苷酸。
56、根据权利要求55的方法，其中所述介质含有GTP，ATP，CTP和TTP，所述检测步骤包括从检测到的瞬时电信号中阅读所述序列。
57、检测介质中第一分子和固定化第二分子之间发生结合作用的方法，所述方法包括：
(a)提供含有所述固定在工作电极表面的固定化第二分子的体系，并使
   其与含有所述第一分子的介质相接触；
(b)检测介质中由所述第一分子和所述固定化第二分子之间的结合作用
   所产生的瞬时电信号；以及
(c)将所述检测到的瞬时电信号与所述第一和第二分子间发生的所述结
   合作用相关联。
58、根据权利要求57的方法，其中第一和第二分子是蛋白质。
59、根据权利要求57的方法，其中所述第一和第二分子是受体-配体对。
60、根据权利要求57的方法，其中所述第一和第二分子是抗体-抗原对。
61、根据权利要求57的方法，其中所述第一和第一分子是核酸。
62、一种仪器，包括：
(a)一个介质容纳器具，该器具容纳着带有第一分子的介质；
(b)一个工作电极，其表面上固定有第二分子，其中所述表面与所述介
   质相接触；
(c)一个驱动器，用于驱动所述工作电极；以及
(e)一个信号处理器，用于获得所述第一分子的响应并从中产生瞬时电
   信号。
63、根据权利要求62的仪器，其中所述仪器进一步包括一个与所述介质相接触的参比电极，并且所述信号处理器将所述工作电极和参比电极的响应进行比较以产生所述瞬时电信号。
64、根据权利要求63的仪器，其中所述驱动器含有差异放大器，以在介质中产生所述电极间的电荷差异。
65、根据权利要求63的仪器，其中所述工作电极和参比电极存在于半导体基质的平坦表面上。
66、用于实施权利要求1的方法的装置，所述装置包括：
(a)一个瞬时电信号检测部件，用于检测由于所述第一分子X在导电介
   质样品中相对于所述固定化第二分子Y运动而产生的瞬时电信号；
   以及
(b)计算机可读介质，该介质上记录着算法，该算法将所述由第一分子
   X相对于所述固定化第二分子Y运动而产生的瞬时电信号与样品中
   所述第一分子X和所述第二分子Y的至少一个特征相联系。
67、根据权利要求66的装置，其中所述至少一个特征是指运动，速度，数量，结构，电荷或结合作用。
68、根据权利要求66的装置，其中所述至少一个特征是指所述第一分子X和所述第二分子Y之间的结合作用。
69、根据权利要求66的装置，其中所述瞬时电信号检测部件含有至少一个工作电极。
70、根据权利要求69的装置，其中所述瞬时电信号检测部件含有至少一个工作电极和一个参比电极。
71、根据权利要求69的装置，其中所述瞬时电信号检测部件含有多个电极，其中一个是所述的至少一个工作电极。
72、根据权利要求66的装置，其中所述装置进一步含有一个差异放大器。
73、根据权利要求72的装置，其中所述差异放大器是差异电压放大器。
74、根据权利要求72的装置，其中所述差异放大器是差异电流放大器。
75、根据权利要求66的装置，其中所述装置进一步含有一个样品容纳器具。
76、根据权利要求75的装置，其中所述装置是集成的装置。
77、根据权利要求75的装置，其中所述装置含有至少两个分别的样品容纳器具，每个器具内都具有其本身的瞬时电信号检测部件。
78、根据权利要求77的装置，其中所述装置具有芯片构型。
79、根据权利要求77的装置，其中所述装置具有阵列构型。
80、根据权利要求66的装置，其中所述固定化第二分子Y是大分子。
81、根据权利要求80的装置，其中所述大分子被固定在所述瞬时电信号检测部件的工作电极部分的表面。
82、根据权利要求81的装置，其中所述大分子是多肽。
83、根据权利要求81的装置，其中所述大分子是核酸。
84、用于实施权利要求1的方法的系统，所述系统包括：
(a)一个瞬时电信号检测部件，用于检测由于第一分子X在导电介质样
   品中相对于固定化第二分子Y运动而产生的瞬时电信号；
(b)存在于计算机可读介质上的算法，该算法将所述由第一分子X相对
   于所述固定化第二分子Y运动而产生的所述瞬时电信号与样品中所
   述第一分子X和所述第二分子Y的至少一个特征相联系；以及
(c)导电介质样品，其中含有第一分子X，该第一分子X与所述固定化
   第二分子Y相接触。
85、根据权利要求84的系统，其中所述的至少一个特征是指运动，速度，数量，结构，电荷或结合作用。
86、根据权利要求84的系统，其中所述至少一个特征是指所述第一分子X和所述第二分子Y之间的结合作用。
87、根据权利要求84的系统，其中所述导电介质样品是流体介质。
88、根据权利要求84的系统，其中所述导电介质样品是凝胶或气态介质。
89、根据权利要求84的系统，其中所述瞬时电信号检测部件含有至少一个工作电极。
90、根据权利要求89的系统，其中所述瞬时电信号检测部件进一步含有一个参比电极。
91、根据权利要求89的系统，其中所述瞬时电信号检测部件含有多个电极，其中所述多个电极含有所述的至少一个工作电极。
92、根据权利要求84的系统，其中所述系统进一步含有一个差异放大器。
93、根据权利要求92的系统，其中所述差异放大器是差异电压放大器。
94、根据权利要求92的系统，其中所述差异放大器是差异电流放大器。
95、根据权利要求84的系统，其中所述固定化第二分子Y是大分子。
96、根据权利要求95的系统，其中所述大分子是多肽。
97、根据权利要求95的系统，其中所述大分子是核酸。
98、计算机可读介质，该介质上记录着算法，该算法用于将所述由第一分子X在导电介质中相对于固定化第二分子Y运动而产生的瞬时电信号与样品中所述第一分子X和所述第二分子Y的至少一个特征相联系。
99、根据权利要求98的计算机可读介质，其中所述至少一个特征是运动，速度，数量，结构，电荷或结合作用。
100、根据权利要求98的计算机可读介质，其中所述至少一个特征是所述第一分子X和所述第二分子Y之间的结合作用。
101、根据权利要求98的计算机可读介质，其中所述固定化第二分子Y是大分子。
102、根据权利要求101的计算机可读介质，其中所述大分子是多肽。
103、根据权利要求102的计算机可读介质，其中所述第一分子X是多肽。
104、根据权利要求101的计算机可读介质，其中所述大分子是核酸。
105、根据权利要求104的计算机可读介质，其中所述第一分子X是核酸。
106、根据权利要求104的计算机可读介质，其中所述第一分子X是核苷酸。
107、根据权利要求106的计算机可读介质，其中所述算法提供所述核苷酸的鉴别。
108、根据权利要求106的计算机可读介质，其中所述算法提供所述固定化核酸的序列。
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