CN1287146C - 利用电生物芯片微阵列的分子检测和分析 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过杂交，抗原-抗体反应和受体-配体结合来检测核酸靶，分子或配体的存在。本发明报道了通过策略性地定位附着在导电体的小颗粒的第一探针和第二探针，该导电体紧邻一电路，由此报道结果。该技术有许多潜在应用包括通过杂交鉴定和检测小量的核酸，通过抗原-抗体反应检测诸如毒素及致癌剂的分子，以及通过受体-配体相互作用检测其它分子。本发明的方法还可适用于利用竞争性结合的原理分析特定物质的量。

Description

利用电生物芯片微阵列的分子检测和分析

发明领域

本发明可广泛应用于制药，民生和国防工业，环境监控及科学研究。本发明涉及藉由与其它合成或天然分子特异性结合及其检测的分子检测和分析。

发明背景

核酸杂交，抗原-抗体反应和受体-配体结合是分子相互作用的实例，由于相互作用的特异性，这些相互作用的实例对鉴定或检测这些物质有很大的价值。一实施例通过特异性抗体进行食物和水中的生物制剂和毒素的检测，以及利用杂交技术进行特异于某种微生物的核酸序列的检测。在有或没有扩增技术(可应用于核酸)之下，特异性地检测这些物质的能力可以进行推定试剂或物质的鉴定。

发明概述

本文公开了一种检测和鉴定痕量的分子靶之方法，其是通过在靶和两个分子探针间的特异性相互作用来进行的，该方法包括：

将所述分子探针之一附着在导电珠粒(conductive bead)上，

将该探针中的另一探针固定于两电极间的间隙中，对该电极应用一电压(electric potential)，以及

通过所述特异性相互作用在所述导电珠粒被拉入该间隙发生时，监测从一个电极到另一个电极的电流增加量。

一般而言，探针之一是物理性地(physically)结合至电极间的“井(well)”中。如果存在靶，在合适的条件下它就会同该探针结合。携带所述导电珠粒的另一探针接着与该靶的另一部分结合。

优选地，导电珠粒为铁珠粒。

优选地，导电珠粒在附着于该分子探针之一前先被去磁。

优选地，所述去磁是通过屏蔽地球和其它磁场作用的环境下加热进行的。

电极间铁珠粒的物理定位作用导致电路开通(close)。

探针与靶之间的特异性反应是检测的基础。

此外，该方法可被设计用于检测微处理器(microprocessor)控制的微阵列中的多种作用物/分子或用于分析特定物质的浓度。

本文进一步公开了一种检测痕量的分子靶之方法，其是通过在靶和两个分子探针间的特异性相互作用来进行的，其包括下述步骤：

(a)通过将气体或固体加入溶液中制备样品或制备要鉴定的试剂，

(b)将样品引入具有两个紧接地放置的电极之检测装置中，在其间隙中结合有探针，并容许结合/杂交发生，

(c)在步骤(b)进行前，进行期间或进行之后，加入与导电性珠粒结合的第二探针(超过靶的量)，并允许特异性结合/杂交的发生，和

(e)通过检测电极间任何电流的变化来测定导电性珠粒结合至该间隙是否已发生。

优选地，步骤(c)中应用的环境不使铁珠粒生锈，例如载体流(carrierfluid)的先脱氧(prior de-oxygenation)。

优选地，在步骤(e)前：

(d)调整溶液化学性质和/或温度以优化反应条件。

优选地，步骤(e)中使用微处理器。

优选地，步骤(a)包括物理和/或化学地缩小(reducing)(破碎(breaking))细胞以释放出供检测的成分。

该方法可被设计成二或三维空间的微阵列(micro-array)并用来检测具有不同化学性质的多种不同分子，包括但并不限于核酸，蛋白质，碳水化合物，脂质和无机分子。

该方法可包括内装的(built-in)二重复(duplications)或三重复(triplications)以供质量控制。

该方法也可包括与阴性对照一起进行的电子自我检查(electronicself-check)和/或预分析试验(pre-analytic test)。

如果该试验结果阴性的，该方法还包括与阳性对照一起进行的后分析试验(post-analytic test)。

在本说明书中还进一步公开了一种用于分析溶液中给定物质的浓度的方法，包括：

提供单个芯片(chip)的阵列，每个包括一开通的电路，包括界于一对电极间的探针结合分析物和导电珠粒，其中所述芯片在电极间的间隙的大小和结合分析物的数量不同，并由此所述珠粒的数量不同，

将含未知浓度的分析物的样品引入微阵列，

其中该分析物竞争地取代芯片中珠粒结合探针，所述芯片含有给定量的或少于结合分析物，而不是含有大量的结合分析物，具有珠粒被充分取代的芯片将被转化为断开的电路。

优选地，利用已知浓度的标准先进行校准，容许进行样品中分析物的浓度的分析。

本发明还公开了一种分析物质浓度的方法，其是通过提供比分析物少的“井”-结合探针，所述分析物数量超过珠粒结合探针，并且允许反应在数千个无先前结合珠粒(关)芯片的微阵列中进行。可利用加入分析物后开启(turn on)的芯片积分比例来计算分析物的浓度。当分析物无法或太贵而不能纯化或制造以供用于电生物芯片时，该表现方法具有优于现有方法的优点。

在本发明中还进一步公开了一种分析给定物质浓度的方法。包括：

提供相同芯片的阵列，具有在两个电极间仅接收导电珠粒的小的间隙和井结合探针。

将含有未知量分析物的样品引入位于盒(cassette)内的微阵列中，所述盒含有比样品中分析物要少的已知量的加入的珠粒结合探针，由此

游离的分析物与分析物结合珠粒结合探针(在引入的分析物与珠粒结合探针于盒内反应后形成)于所述电生物芯片上竞争结合有限量的所述井结合探针。

优选地，该方法包括利用先前已知的珠粒结合探针的量计算样品中分析物的浓度，通过微处理器记录由“开”到“关”信号的比例和用分析物已知浓度的标准来预先校准。

本发明通过利用在靶和两个分子探针间的特异性相互作用还进一步公开了用于检测痕量的分子靶之装置，其包括：

具有两个电极相隔形成间隙的井并且所述探针之一附着在该井上，用于对所述电极施加电压的构件(means)，和

通过所述特异性相互作用在所述具有另一探针附着其上的导电珠粒被拉入该间隙发生时，监测从一个电极到另一个电极的电流增加量的构件。

优选地，该装置是与多个其它相同装置收容在微阵列中。

优选地，该微阵列是收容在盒中。

优选地，上述是位于构建有可容纳该盒的沟槽的可携带装置中。

优选地，该组合进一步包括微处理器，其读取来自设置于盒上的鉴别器的所述盒的内容。

定义

如本文所用，下面的术语意图具有下面的一般意义：

“核酸”是指DNA，RNA，单链的或双链的和任何它们的修饰形式。修饰包括但并不限于提供其它化学基团。

“配体”是指特异性的结合受体并由此在细胞中诱导信号的分子，例如激素是配体，当其与受体结合时会引发级联式的导致细胞生长的细胞反应或其它反应。

本文所用“杂交”指的是两条互补的DNA单链(DNA/DNA杂交)的融合，或者是互补的DNA和RNA链(DNA/RNA杂交)的融合。

“分析物”指的是存在于患者血中或体液中的物质。一般而言分析物的浓度随着代谢或病理状态而变化，且其为临床医生管理患者健康的信息。

“抗原”指的是具有分子表面结构的物质，该结构引发免疫反应，即产生抗体，和/或与(其)特异性抗体反应(抗原/抗体反应)。

“抗体”是作为抗原反应一部分识别并与抗原结合的蛋白质(免疫球蛋白)。

“分子探针”是指任何核酸，蛋白质分子或其它分子，具有与其它相同或不同类型的分子特异性结合的性质。一般而言，核酸特异性地与显现序列互补的核酸结合。因此，具有下述序列A-G-G-C-G-T-A(从5’到3’端)的探针(在此例中为一核酸分子)特异性的与另一条DNA链结合。该另一股DNA含有具有下述序列T-A-C-G-C-C-T(从5’到3’端)的区域，其中A，T，G和C分别代表腺嘌呤，胸腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶。抗原的抗体可用作相对应此抗原的的分子探针。

“表位”是指抗原分子中结合抗体的部分。抗原可以有许多不同的表位，其可与不同的抗体结合。

附图简述

本发明优选的形式通过参考附图的实施例方式来说明，其中：

图1为用于测试装置的电路之概要图，

图2显示两个分别含有附着的探针及附着的抗体之芯片的概要图，

图3描述结合铁珠粒的第二探针的添加，

图4描述一可能的微阵列的概要图，

图5描述一定量分析物方法背后的原理，

图6描述使用微阵列定量分析物之概要图，该微陈列含有与具有夹在探针间的靶预先结合的珠粒，

图7描述另一个分析物的定量方法原理的概要图，此方法利用竞争性结合，而非预先结合的珠粒，和

图8为描述第二种分析物的定量的方法的概要图，此方法是在过量分析物存在下利用微阵列，

图9为描述用于亨丁顿氏基因(Huntingtin gene)的重复区域的二探针的设计的概要图，

图10为描述另一组探针的概要图，此探针的重复组合数目比存在于给定患者中的重复的正确数目还少。该探针两端无连接作用(ligation)发生，

图11为描述另一组探针的概要图，此探针的重复组合数目比存在于给定患者中的重复的正确数目还多。造成突出探针(overhanging probe)和不能进行连接。

优选实施方案的描述

图1中，基本单元包含导线1，开关2，电池3，安培计，灯泡或微处理器4，及反应“井”5，该井中含有二个电极及该电极间的小间隙。电路是断开的，但当铁珠粒位于电极间时，接着打开开关2使电路开通并造成电流流动，此可通过安培计4检测。

图2中，芯片是反应“井”加上图1中所述的电极。在此芯片的中央是“井”，其可有凹陷，其壁上有共价结合的分子探针，该探针对待搜寻/分析的分子(靶)具有特异性。所述探针可为核酸(左面板)或抗体(右面板)。相对于“井”的任一壁的是二个电极。当在一微阵列中制造多个芯片时，该“井”不必一定要凹陷(见图4)。具有平面的“井”的优点为在反应终点时，易于通过应用磁场，去除未结合的过量的结合铁珠粒之探针(图3中描述)。

在图3中，例如铁珠粒10的某些导电珠粒是位于两电极6间，通过夹住的靶分子11的结合，该靶分子是附着于结合“井”的第一探针9以及结合铁珠粒的第二探针12。在左面板中，此探针为核酸分子，可识别靶核酸的不同部分。在右面板中，该探针为特异于分析物不同区(表位)的抗体，通常为蛋白质分子。

在图4中，该芯片是小型化的8，并且各自设计为检测不同于其它的特异分子。进口和出口可将试剂和样品引入芯片。此方法中微处理器有计算能力，多个试剂/分子可在一个便于携带的装置中，同时(多重)检测出来，承载微阵列的筒匣13是抛弃式的，且可更换成另一个或不同的以测定不同组分子。可内嵌二重复或三重复以保障质量。而且，与阴性对照一起进行的预试验及与阳性对照一起进行的后试验(若试验结果为阴性)，确保试验的正确性。

在图5中分析物11在试验“井”中，夹在二个探针之间，此探针中之一9是结合至“井”以及另一个12是结合至铁珠粒10，该铁珠粒是与电极6相连接(开通)，加入含足够浓度的分析物的试验样本，造成附着铁珠粒的第二探针的竞争性结合及取代，因此阻断了此电路(关闭)。

在图6中，电极间被夹住的分析物及铁珠粒的量，在一系列制定成阵列的芯片中逐渐改变，以允许如下述说检测未知浓度的分析物。

在图7中，利用未事先结合的珠粒。结合珠粒的探针存在量比分析物还少。此结果是结合分析物及结合粒子的探针15，与游离的分析物11竞争结合有限的结合“井”的探针9。电极间的间隙缩小至仅容纳一个珠粒。左面板显示完全被分析物占据的结合“井”的探针，而无附着的结合珠粒之探针(关闭(off))。右面板显示结合珠粒的探针，其结合附着于结合“井”的探针的分析物分子(开通(on))。

在图8中，具有数千个此种芯片的微阵列，记录“开通”信号的总数，作为结合分析物及结合粒子的探针(analyte-bound-bead-bound probes)与结合“井”的探针结合的结果。“井”结合探针被未附着结合珠粒的探针的游离分析物所占据的芯片，会记录“关闭”的信号。“开通”相对于“关闭”信号的比例取决于结合分析物及结合粒子的探针和游离分析物的相对浓度。筒匣13的放大图显示一些芯片是开通的，同时有些晶片是关闭的。事先已知结合珠粒的探针摩尔浓度可以计算分析物的浓度。

在图9中，说明测量亨丁顿氏疾病中CAG重复的数目的原理。在实施例9中可以找到此方法的的描述。结合珠粒的探针17是设计成在探针探测区具有以下的序列：CTGGAAGGA，以及结合“井”的探针18的探测区域具有以下序列：GGTGGCGGCTGTTGCTGCTGCTG。图中，上一条链19是存在于此种特定患者中的带有四组“CAG”重复的靶基因。只有该与探针互补的区域用实际核酸序列描述。其它的末端(5’20和3’21)用箭头表示。杂交的珠粒结合17和“井”结合探针18利用相同的方式描述。探针划底线的部分(图上方)标示出侧接重复区域的未重复部分。图中，该两探针具有与靶(正确为4)匹配的重复组合数目。因此，该两探针的5’端及3’端便集合到一起，并且可通过酶(DNA连接酶)连接。

在图10中，仅说明不同“井”结合探针22的序列，因为结合珠粒的探针是相同的。该“井”结合探针22置于同一微阵列的另一个电生物芯片中。所述的“井”结合探针22只有两个重复，在与靶杂交时会在该两探针间造成间隙。所述两探针不能被连接。

在图11中，另一个“井”结合探针23具有过多重复(5个)。因此，过量部分在杂交后会有“突出”24。同样也不能连接。

样本的取得

使含有推定靶的空气鼓泡通过合适的溶质。固体或液体可溶于溶液中。完整的细胞及组织需要被破裂打开或经制备释放出待测分子。

装置(电生物芯片)

在其最简单的设计中，电生物芯片(electrobiochip)(芯片)是由一个小的测试“井”所组成，该井内部含有二电线，在该二电线间有小的间隙。该间隙上结合了分子探针，该探针对推定靶有特异性。另一元件为第二特异性探针，其与电导体的小珠粒例如铁珠粒结合。

反应

将样品加入芯片，加入超过靶量的第二探针(在加入样本前，期间或之后)。使反应发生。反应后，未结合的探针及铁珠粒通过产生适当的磁场来吸走。最后，记录结果。

定量

二个电极之间的间隙宽度及结合“井”的探针的量，以及因此经夹住的结合“井”的探针/靶/结合珠粒的探针，在芯片的相反设计(记录“开通”信号而非记录“关闭”信号)阵列中可改变，以测量待测样本中靶存在的量(竞争)。含有靶的待测样本的添加只会造成结合珠粒的探针的竞争性结合及取代。只有含有多于特定量的被夹住的“井”结合探针/靶/珠粒结合探针的那些芯片保持“开通”。由于加入的分析物的竞争性结合和对珠粒结合探针的取代，其它芯片是“关闭”的。利用已知的标准品预先校正，使待测样品正确定量。

另一种定量的方法涉及在具有数千个芯片的微阵列中测量，先前“关闭”的芯片(不具有经夹住的靶(在二探针间)的预先结合的珠粒)的数量，其在超过结合珠粒的探针的未知浓度分析物的存在下，会被“开通”。

分子探针的制备

首先制造一对具有特异性的分子探针。核酸探针可通过已知靶的序列来构建。这些序列的信息通常可以在例如Entre-Genome(National Centerfor Biotechnology Information，National Library ofmedicine，National institutes of Health，USA)的资料库中找到。具有与靶的两个末端序列互补的探针可商业化合成。此外，探针可以以下述方式设计，在与靶进行杂交时，使探针的两末端具有物理近似性，以致于DNA接合酶(共价结合经集合的DNA链的酶)可以结合该两端，以加强铁珠粒及“井”之间的结合(bond)。

抗体可以由暴露于抗原下的实验室动物来制备。因为如此，抗原的来源是需要的。

单一的电生物芯片的的布局

核酸探针或抗体可以共价结合到不同物质上。第一探针沿着断开的电路的两端间的小间隙，共作结合在容器(container)的壁上(图1和2)。所述两个电极通过芯片上的导线连接至微处理器，该微处理器的形成和/或监测其余的电路。第二特异性探针通过相似的技术与小的游离铁珠粒结合。当靶存在及在合适条件下，该靶结合及夹在二探针间(图3)。第一探针的位置，与第二探针结合的该铁珠粒与电极接触并开通电路，使当电池提供电压时，通过电流。靶的浓度范围很广，从单一分子到如同结合珠粒的探针一般多，提供设计的健全性。然而，灵敏度不会降低。该设计理论上可检测单一分子的存在。此外，当用于检测特异核酸序列时，无需预先扩增。该方法是多用途的，并且可用于检测DNA，RNA，蛋白质和其它大分子。

微阵列的制造

多个单一芯片可以制造成微阵列(图4)。这些单独的芯片可制备成检测不同的分子。相同的芯片的二重复或三重复可制备在同一微阵列上，以达品质保证的目的。

具有经结合的铁珠粒的第二抗体置于含有微阵列的盒中。盒中设计成稍有真空(其具有可膨胀的一些的部分以供容纳更多的样本)，这为了吸入预定体积的样本。该盒的进/出口容许将样本引入盒中。

读取装置

一个可携带的装置构建成有一可容纳盒的沟槽。插入该盒，经由该读取装置的电子零件，连接多个位于盒底部(或旁边)的小电路(图4)到微处理器上，该微处理器处理盒中的内容，是由一个独特的鉴别器如盒底部的条码及其本身的程序，以供解释开通/关闭的信号并以“生物制剂”的方式显示结果或呈报分析物的浓度。

因此，为读取结果，该盒被插入此装置中。微阵列的电路接着与收容在读取装置中的微处理器的电子零件相接触。该微处理器使反应温度最适化，计时反应及控制微小电磁圈的阵列，该电磁圈产生一个变化的磁场来达到温和搅拌反应物的效果来促进反应。在反应终点，该微处理器产生一垂直(相对于电极的轴)的磁场，其可将未反应的结合铁珠粒的探针吸走以去除假信号。该电极应该以铜或其它导电性的金属制备，其不会被磁场所感应。该微处理器接着解释来自微阵列的个别芯片上记录的开通/关闭信号，及产生结果，以显示在液晶幕(LCD)上的文字，点字法(Braille)或合成的声音的方式。控制面板上的按钮，操作员操纵该指令单及依所需行使不同的功能。该结果也可以通过可以使无线电(radio)传送到远处或以预先构建的打印机打印出。

对于更复杂的的设计，复杂的电子学会描述微处理器应被构建成一次性的盒。或者，在每次使用之间冲洗冲洗检测室并重新填充(用珠粒结合探针，反应物和载体流)，可在规定的使用期重新使用后整个装置可被遗弃。

分子分析

体液中已知的生物分子通常需要浓度分析。一实施例为甲状腺中毒或甲状腺机能衰退中的甲状腺激素分析。

本发明的原理可以进行照顾点(point-of-care)分析，其是通过在床侧(bedside)或临床上，利用体液或血液的微小样本以适时方式进行，且不需使用占空间的复杂机械。芯片(基本单元)被设计成携带夹住分析物，其特异性地附着在“井”结合探针和铁珠粒结合的探针，其量足以开通二电极之间的间隙。此结构中，除非结合铁珠粒的探针被取代，否则电路总是“开通”。

当足够浓度的未结合分析物添加到芯片中时，铁珠粒结合探针可被取代。之所以如此是因为未结合分析物与结合的分析物，竞争该结合铁珠粒探针或“井”结合的探针，造成预先定位的电路的铁珠粒被取代。结果是电路断开(关闭)。

可制造一微阵列，在该微阵列上为多个晶片，各自在二电极间的宽度，以及排列的经夹住的分析物/铁珠粒结合的探针的量上稍微改变。未知量的分析物的添加造成一些铁珠粒结合的探针被取代。虽然这不会影响具有较宽间隙及更多铁珠粒结合探针(保持开通)的芯片，但具有较小间隙及较小数目的铁珠粒结合探针将关闭。一系列“开通”芯片和一系列“关闭”芯片之间的位置，能给出试验材料中分析物的浓度正确评估。经取代的珠粒在读取之前由磁场吸走。要求利用具有已知浓度的标准样品预先校正。由于核酸靶在实验室容易合成，当测量核酸时，此方法是令人满意的。

在为了制备预先的电生物芯片却由于太困难或者太昂贵而不能提纯或合成分析物(例如蛋白质或其它大分子)时，仍可利用本发明来鉴定体液或血液中分析物的浓度。

制造含有数千个电生物芯片的微阵列，各芯片含有“井”结合探针。这些探针可能为抗体，但也可能为核酸(尤其是在分析病毒填充物(viralload)时)。制造结合至导电性珠粒的不同探针。在分析物存在下，使用较小量(摩尔对摩尔)的第二珠粒结合的探针。通过竞争数千个但数量相对上仍远不及(与游离的和珠粒结合探针结合的分析物相比较)的芯片。已知利用已知量的珠粒结合探针，分析物的浓度可以通过如微处理器测量的方式，由开通的晶片的比例来计算。在微阵列中必需有大量的电生物芯片以供获得精确结果。也可制造仅接受一导电性珠粒来增进精确性的芯片。为了不扰乱动力学平衡，未附着在“井”结合探针上的珠粒结合探针不会被磁场吸走。进行一系列测量并平均以得到最后结果。

实施例：

实施例1

结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(造成人结核病)的核糖体核糖核酸(rRNA)在AMPLIFIED^TM结核杆菌直接试验(Mycobacteriumtuberculosis Direct Test)中是检测的靶(参考文献1-10)。

虽然在上述试验中要求扩增(转录中介的扩增(TMA))本发明的方法仅需要破裂细胞壁来释放rRNA的简单方法。

利用我们电生物芯片，可检测到少至如一份拷贝细菌rRNA，不需要预先的扩增(amplification)。

实施例2

因为可设置治疗干预，急性心肌梗塞(心脏病)的适时实验室诊断具有潜在救命特性。此等干涉本身并非无危险性且指令精确试验。

直至目前，试验不是敏感度不够，就是非特异性。例如，最早的心肌梗塞指示剂是血浆肌红蛋白的上升，其可在梗塞后6小时检测(参考文献11-14)。然而，肌红蛋白也存在于骨骼肌中且其上升对于心肌伤害并非是特异性的，所以要求血浆肌红蛋白T的第二分析的确认(http：//demapooc.mah.roche.com/content/prroducts/c_read/c_read.htm)，它是比肌红蛋白上升晚的标记。

在急性心肌梗塞的最早阶段检测微量心脏肌钙蛋白T的能力要求同时具备特异性和敏感性。应用我们的电生物芯片使此要求变为可能。

在此应用中，利用的是如上述的“定量”部分中描述的竞争性结合的原理。分析物为心肌钙蛋白T并且两探针是升高以抗心脏肌钙蛋白T的抗体。抗体将倾向于结合至心脏肌钙蛋白T上的二个不相同的表位，且彼此不互相干扰(表位不会太接近以致于干扰二抗体的结合)。除了能检测先前无法检测的急性心肌梗塞发作早期循环心脏肌钙蛋白T量之外(其可能在急性心肌梗塞发作后，在远短于6小时的时间内即存在)，该应用还允许定量此蛋白质的血清的水平(通过已知浓度的心脏肌钙蛋白T的系列稀释液可容易地进行仪器校正)。

实施例3

在科学研究中，科学家经常需要研究基因表达。在多细胞有机体中，携带有相同组基因的细胞特定化以承担许多身体的功能，例如覆盖体表面(皮或皮肤)，吸收流体以及电解质(肠)，和外边世界的交互作用(神经系统)。结果，细胞需要在这些特定化细胞中表达的工具，所述特定化细胞在其它分化细胞中未表达。直至目前，通过荧光探针或其它手段来研究基因表达，个别地或应用最近常被讨论的微阵列来进行，该微阵列上经印刷或附着分子探针，该探针可与信使RNA杂交并产生存在或不存在的定性结果。不用说，这些微阵列不具有定量mRNA的能力，mRNA只是在低量下表达。低量表达亦很重要，因为我们不知道低量表达必需与产生少量蛋白质同义，因为细胞中蛋白质的浓度是动态的且代表着生产与破坏间的平衡。

利用本发明，mRNA和相应蛋白质的定量是简单的，如上述“定量”部分所述。

实施例4

突变检测是发现在生殖细胞(遗传的)中遗传的特定疾病的方法。通过以基于基因区域的扩增的常规方法，进行基因中单点突变(有时候非常大)会有大片段无法扩增的缺点，并因此限制经济地和系统地研究特定人基因的点突变的能力。

利用本发明，成对的探针(“井”结合和珠粒结合)可设计成具有已知序列的未突变基因(在公共资料库中发现的)。将成对探针设计成与所述序列的连续延伸(stretches)互补。依需要设计许多对以覆盖所研究基因的整个长度，并且不同的“井”结合探针附着至个别的电生物芯片，它们可探测的区域存储在盒中的独特的鉴定器中。以此方式及利用装置的特殊结构使得其可再使用，可进行基因突变的快速、经济且系统的研究。

实施例5

许多癌症是由一基因的部分的移位至另一基因或在另一基因内(嵌合基因)。实例太多以致无法列出并且包括甲状腺的滤泡样癌，特定急性骨髓白血病，许多软组织肉瘤，例如滑液肉瘤以及外骨骼粘液软骨肉瘤。

这些嵌合基因的mRNA转录物(嵌合转录物)的鉴定，通过用于扩增的常规聚合酶链式反应和基于所扩增产物的大小来鉴定的电泳，可容易地进行，然而此方法慢且费力。

利用本发明，可制备与嵌合转录物的两成分杂交的一对探针。一探针与井结合，另一探针与导电性珠粒结合。因此可获得阳性鉴定，即使是利用fine的针自肿瘤或血液(若肿瘤为白血病或在疾病的早期或晚期可容易进入血流的)取出的微量样品。许多不同癌症以此方式中可同时筛选出来。

实施例6

许多疾病具有病毒病因。一实例为HIV(由人类免疫缺陷病毒感染)。虽然该疾病可通过抗病毒试剂来控制，但这些药剂非常昂贵。由于病毒易于突变，在不同时期并不是所有的患者对相同的药物都有反应。监测病毒负荷(load)是测定药物效力及疾病状态的一种方法。

利用此方法，使病毒负荷研究高度精确，简单，快速以及便宜。

先前已描述过分析的原理。倘若基因序列已知，利用此方法可研究任何病毒。

实施例7

许多感染性疾病有具有类似的表征。例如炭疽病，流行性感冒，登革热，天花，一般感冒，玫瑰疹等，所具有的最初表征包含不适(一般感觉不舒服)，发烧，肌肉痛以及非特定性疹。为了使主治医生可精确地鉴定这些具有类似的表现但结果有极大不同的多数疾病，本发明可用在临床上以鉴定经济地且快速地进行感染试剂的整个面板的微量检测(因此在早期)。许多患者甚至不需要住院观察且可因病因的阳性鉴定结果而被送回家。同时节省金钱及避免对病人造成危害(若其需要在可能隐藏有害微生物的医院中被看护)。

实施例8

监测饮用水及食品(或动物饲料)的有害物质，例如疯牛病(mad-cowdisease)(牛海绵状脑病变(Bovine Songiform Encephalopathy，BSE))作用物(agent)受到实验的高成本及低灵敏度的阻碍(参考文献15-20)。例如，具有BSE的牛在脑液(脑脊髓液)中具有微量的作用物。敏感性试验不仅可早期检测疾病还可免于大量屠杀动物。因为食用此生病的牛的人类也可检测到。利用其它研究者所发现的特异性抗体，本发明可大幅度地降低成本和时间来鉴定致病作用物。

实施例9

许多遗传性疾病是由于携带有重复序列的特定区域过长所造成的。例如亨庭顿氏病(Huntington’s disease)，一种不变的致命疾病，是因为位于染色体4中的亨丁顿氏基因(Huntingtin gene)中存在的“CAG”重复超过36倍(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi？id＝143100)。

为了测量人亨丁顿氏基因中重复的数目，常规方法是应用PCR。

本发明简化重复数目的测量。因此探针是设计成侧接与邻近重复序列的基因不变部分相连http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝nucleotide&list_uids＝450395&dopt＝GenBank)。

除了与该重复侧接的不变(in-varying)序列外，“井”结合探针携带不同数目的重复。珠粒结合探针携带在重复的相对侧上的不变区域和一或二重复。具有特定数目的重复的人，例如5“CAG”重复，若井结合探针含有4重复并且珠粒结合探针含有1重复，在杂交时，将具有很好地末端对末端排列。其它测量超过4(例如5或以上)或小于4(例如3或以下)的含有“井”结合的探针的井，将杂交但将不会产生很好的末端排列。利用DNA连接酶(共价地与在互补链上排列的DNA两链连接并且末端紧密相连)，所述两探针可共价相连。具有组合数目超过5重复的探针将具有突出链，其无法与另一链结合并且具有低于5的组合重复的探针也是如此，因为在二探针间有大的间隙。在杂交及连接反应后，反应条件的改变造成探针与靶的分离(变性作用)，导致具有其它非4CAG重复的“井”结合探针的电生物芯片的“关闭”

结果是在人亨丁顿氏基因中，能快速且精确地测量CAG重复的数目。本发明的方法适用于任何种类的具有改变重复数目的遗传疾病。

                        参考文献

1.Behr，M.A.，S.A.Warren，H.Salamon，P.C.Hopewell，A.Poncede Leon，C.L.Daley，and P.M.Small.1999.Transmission ofMycobacterium tuberculosis from patients smear-negative foracid-fast bacilli.Lancet.353：444-449.

2.Bermann，J.S.，G.Yuoh，G.Fish and G.L.Woods.1999.Clinical evaluation of the enhanced Gen-Probe AmplifiedMycobacterium Tuberculosis Direct Test for rapid diagnosis oftuberculosis in prison inmates.J.Clin.Microbiol.37：1419-1425.

3.Bermann，J.S.and G.L.Woods.1999.Enhanced mycobacteriumtuberculosis direct test for detection of M.tuberculosis complexin positive ESP II broth cultures of nonrespiratory specimens Diag.Microbiol.Infect.Dis.35：245-248.

4.Chedore，P.and F.B.Jamieson.1999.Routine use of theGen-Probe MTD2 amplification test for detection of Mycobacteriumtuberculosis in clinical specimens in a large public healthmycobacteriology laboratory.Diag.Microbiol.Infect.Dis.35：185-191.

5.Della-Latta，P.and S.Whittier.1998.Comprehensiveevaluation of performance，laboratory application，and clinicalusefulness of two direct amplification technologies for thedetection of Mycobacterium tuberculosis complex.Am.J.Clin.Pathol.110：301-310.

6.Della-Latta，P.and Vivian Jonas.1999.Inhibitory effect ofAlpha-Tec XPR-Plus Phosphate Buffer on the enhanced Gen-ProbeAmplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test.J.Clin.Microbiol.37：1234-1235.

7.Gamboa，F.，G.Fernandez，E.Padilla，J.M.Manterola，J.lonca，P.J.Cardona，L.Matas，and V.Ausina.1998.Comparative Evaluationof initial and new versions of the Gen-Probe Amplified MycobacteriumTuberculosis Direct Test for direct detection of Mycobacteriumtuberculosis in respiratory and nonrespiratory specimens.J.Clin.Microbiol.36：684-689.

8.Moore，D.F.and Curry，J.I.1999.Reduction in turnaroundtime for detection and identification of Mycobacterium tuberculosisfrom pulmonary specimens using nucleic acid amplification tests.Presented at the 99th General of the American Society of Microbiology.Chicago，Illinois.

9.Piersimoni，C.，A.Callegaro，c.Scarparo，V.Penati，D.Nista，S.Bornigia，C.Lacchini，M.Scagnelli，G.Santini，and G.De Sio.1998.Comparative evaluation of the new Gen-Probe Mycobacteriumtuberculosis Direct Test and the semiautomated Abbott LCxMycobacterium tuberculosis assay for direct detection ofMycobacterium tuberculosis complex in respiratory andextrapulmonary specimens.J.Clin.Microbiol.36：3601-3604.

10.Wang，S.X.and L.Tay.1999.Evaluation of three nucleic acidamplification methods for direct detection of Mycobacteriumtuberculosis complex in respiratory specimens.J.Clin.Microbiol.37：1932-1934.

11.Bakker AJ，Loelemey MJ，Gorgels JP，von Vlies B，Smits R，Tijssen JG，Haagen FD：Troponin T and myoglobin at admission：valueof early diagnosis of acute myocardial infarction.Eur Heart J 1994.

12.De Winter RJ，Koster RW，Sturk A，Sanders GT：Value ofmyoglobin，troponin T，and CK-MB Mass in ruling out an acutemyocardial infarction in the emergency room.Circulation.1995；92：3401-3407.

13.Hamm CW，Katus HA：New biochemical markers for myocardialcell injury.Current Opinion in Cardiology，1995；10：355-360.

14.Tucker JF，Collins RA，Anderson AJ，Hess M，Farley IM，Hagemann DA，Harkins HJ，Zwicke D：Value of serial myoglobin levelsin the early diagnosis of patients admitted for acute myocardialinfarction.Ann Emerg Med 1994；24：704-708.

15.P.Brown et al.，″Bovine spongiform encephalopathy andvariant Creutzfeldt-Jakob disease：background，evolution，andcurrent concerns，″Emerging Infectious Diseases，7[1]：6-16，January-February 2001.

16.J.Bieschke et al.，″Ultra-sensitive detection ofpathological prion protein aggregates by dualcolor scanning forintensely fluorescent targets，″Proceedings of the National Academyof Sciences(PNAS)，97：5468-73，2000.

17.M.R.Scott et al.，″Identification of a prion protein epitopemodulating transmission of bovine spongiform encephalopathy totransgenic mice，″PNAS，94：14279-84，1997.

18.″The Evaluation of Tests for the Diagnosis of TransmissibleSpongiform Encephalopathy in Bovines，″European Commission，Directorate General XXIV，Consumer Policy and Consumer HealthProtection，July 8，1999.

19.J.Safar et al.，″Eight prion strains have PrPSc moleculeswith different conformations，″Nature Medicine，4：1157-65，1998.

20.BSE Surveillance，U.S.Department of Agriculture，Animal andPlant Health Inspection Service.

Claims (27)

1.一种检测痕量分子靶的方法，其是通过利用在靶和两分子探针间的特异性相互作用来进行的，其包括：

将所述分子探针之一附着在导电珠粒上，

将该探针中的另一探针固定于两电极间的间隙中，

对所述电极施加一电压，和

监测从其中一个电极到另一个的电流增加，所述增加发生在所述导电珠粒被所述特异性相互作用拉入该间隙时。

2.权利要求1的方法，其中探针之一与电极之间的“井”物理性地结合。

3.权利要求1的方法，其中所述导电珠粒为铁珠粒。

4.权利要求1的方法，其中导电珠粒在与所述分子探针之一附着以前先被去磁。

5.权利要求4的方法，其中所述去磁是通过在屏蔽地球和其它磁场作用的环境中加热而进行的。

6.权利要求1的方法，其中通过去除载体流体中所有的氧以使所述导电珠粒免于生锈。

7.权利要求3的方法，其中所述电极间铁珠粒的物理定位作用造成电路开通。

8.权利要求1的方法，其中所述探针与所述靶之间的反应特异性是检测的基础。

9.权利要求1的方法，其用于检测微处理器控制的微阵列中的多种分子靶。

10.权利要求1的方法，其用于分析能发生杂交、抗原-抗体反应和受体-配体结合的分子的浓度，其中所述的分子为核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质和无机分子。

11.权利要求1的方法，其被设计成二或三维的微阵列，以检测能发生杂交、抗原-抗体反应和受体-配体结合的不同分子的存在和浓度，其中所述的分子为核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质和无机分子。

12.权利要求11的方法，还包括利用多重同样的所述微阵列以保证检测的正确性。

13.权利要求11的方法，其中包括与阴性对照一起进行的电子自我检查和/或预分析试验。

14.权利要求11的方法，其中包括在试验结果是阴性时，与阳性对照一起进行的后分析试验。

15.一种检测痕量分子靶的方法，其利用该靶与两种分子探针之间的特异性相互作用来进行的，其包括下述步骤：

(a)通过将气体或固体加入溶液中制备标本或制备待鉴定的试剂，

(b)将标本引入检测装置中，并容许结合/杂交发生，其中该装置在两电极之间有间隙，该间隙含有已结合的探针，

(c)在步骤(b)进行前，进行期间或进行之后，加入与导电性珠粒结合的第二探针，并允许特异性结合/杂交的发生，和

(e)通过检测电极间任何电流的变化来测定导电性珠粒是否已结合至该间隙。

16.权利要求15的方法，其中在步骤(e)前先进行如下步骤：

(d)调整溶液的化学性质和/或温度以优化反应条件。

17.权利要求15的方法，其中步骤(e)中使用微处理器。

18.权利要求15的方法，其中步骤(a)包括物理和/或化学地缩小细胞以释放出其成分供检测。

19.一种用于分析给定物质的浓度的方法，包括：

提供多个单独芯片的微阵列，每个芯片包括一开通的电路，包括界于一对电极之间的结合分析物和导电珠粒，其中所述芯片的电极间间隙的大小和结合分析物的数量不同，并由此所述珠粒的数量不同，

将含未知量的分析物的样品引入微阵列，

在微阵列上，分析物竞争地取代含有给定量的或少一些的结合分析物的芯片中珠粒结合探针，而不取代含有大量的结合分析物的芯片中珠粒结合探针，具有珠粒被充分取代的芯片将转化为断开的电路，并且

监测在所述的芯片中从一个电极到另一个的电流变化。

20.权利要求19的方法，其中先利用已知浓度的标准物进行校准，容许进行样品中分析物的浓度的分析。

21.一种分析给定物质的浓度的方法，包含下述步骤：

提供多个相同芯片的微阵列，它们各自在两个电极间有小的间隙，其仅能接受一个导电珠粒，并且有与井结合的探针，

将含有未知量分析物的样品引入位于盒内的微阵列中，所述盒含有比样品中分析物要少的已知量的加入的珠粒结合探针，由此，

在所述盒内，游离分析物与分析物结合珠粒的结合探针，其是在引入的分析物与珠粒结合探针于盒内反应后形成，竞争结合有限量的芯片上所述井结合探针，并且

监测在所述的芯片中从一个电极到另一个的电流变化。

22.权利要求21的方法，其包括利用先前已知的珠粒结合探针的量，微处理器记录“开通”对“关闭”信号的比例和用已知浓度的分析物标准品进行的预先校准，计算样品中分析物的浓度。

23.用于检测痕量的分子靶的装置，其利用所述靶和两分子探针间的特异性相互作用进行检测，包括：

具有两个电极相隔形成间隙的井，并且所述的两分子探针中的一种附着在该井上，

用于对所述电极施加电压的构件，和

用于监测从其中一个电极到另一个的电流增加的构件，所述增加发生在导电珠粒被所述特异性相互作用拉入该间隙时，其中所述导电珠粒附着有如上所述的两分子分子探针中的另一种。

24.权利要求23的装置，其与多个其它相同装置收容在微阵列中。

25.权利要求24的装置，其中微阵列是收容在盒中。

26.权利要求25的装置，其进一步与一可携带装置组合，该可携带装置构建有可容纳该盒的沟槽。

27.权利要求26的装置，其进一步包括微处理器，其读取所述盒的内容，该内容来自设置于盒上的鉴别器。

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