CN101313220A - 肝细胞癌的分子标志物及其应用 - Google Patents

肝细胞癌的分子标志物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN101313220A
CN101313220A CNA2006800434979A CN200680043497A CN101313220A CN 101313220 A CN101313220 A CN 101313220A CN A2006800434979 A CNA2006800434979 A CN A2006800434979A CN 200680043497 A CN200680043497 A CN 200680043497A CN 101313220 A CN101313220 A CN 101313220A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
sdh
nslt
smp30
pgm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006800434979A
Other languages
English (en)
Inventor
费尔南多·科拉莱斯伊斯基耶多
伊瑞克·圣玛丽亚马丁奈茨
哈维尔·慕纳兹佩拉塔
赫苏斯·普列托巴尔图埃纳
马蒂亚斯·阿维拉萨拉戈萨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Original Assignee
Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Proyecto de Biomedicina CIMA SL filed Critical Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Publication of CN101313220A publication Critical patent/CN101313220A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Abstract

通过蛋白质组学方法，已经在敲除小鼠(MAT1A－/－)的肝脏中鉴别出MAT1A基因(在S－腺苷甲硫氨酸的合成中缺乏)的肝细胞癌(HCC)的标志物。在至少50％所分析的肿瘤中，已经检测出27种蛋白的表达改变。其中，13种蛋白已在不同病因的HCC患者的活组织检查中被证实，并且7种已在肝硬化(HCC发展之前的阶段)患者的活组织检查中被证实，这使得能够区分所述疾病的前期阶段甚至不同的病因(病毒性和酒精性)。能得到一组标志物可以更准确地定义与HCC的发展相关的变化从而促进所述疾病的预后和诊断。

Description

肝细胞癌的分子标志物及其应用
技术领域
本发明大体上涉及分析来自肝细胞癌(HCC)患者的肝脏肿瘤组织中的基因和蛋白表达改变。具体地，本发明涉及一组人类基因和蛋白，与健康肝脏组织中的相同基因和蛋白的表达相比，所述基因和蛋白在患HCC的个体的癌性肝脏组织中差异表达。因此，所述基因和蛋白用作HCC的分子标志物或生物标志物。
发明背景
肝细胞癌(HCC)，也称为恶性肝细胞瘤，是发病率第五高的肿瘤疾病，并是癌症死亡的第三大原因，每年诊断出超过500,000新的病例。尽管HCC的主因众所周知，其中包括乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)引起的感染、食用受黄曲霉毒素污染的食品或过量摄入酒精，但是由于损伤的侵害性和缺乏有效治疗，HCC患者的预后不好。
由于其显示出的症状的非特异性，所述症状包括食欲降低和体重减轻、发烧、疲惫和虚弱，HCC在早期难以检测。目前可得到的用于HCC早期检测的仅有工具是甲胎蛋白(AFP)的血清水平检测和肝脏超声波检查。然而，AFP水平的灵敏度和特异性低，因此它作为生物标志物的应用很有限。另一方面，超声波检查依赖于操作者并且在试图区分HCC与再生瘤时效果有限。其它诊断方法包括非放射性成像诊断方法(X-射线，血管造影，CT扫描，MRI等)，使用放射性材料的肝脏扫描仪或肝脏活组织检查。由于检测进行得太晚，HCC的治疗通常效果很差。治疗方法包括单独使用或组合使用手术、化疗和放疗。
因此，提高关于HCC分子发病机理和鉴别允许早期诊断的生物标志物的认识有很大的重要性，并且代表了临床肝脏病学的主要优先考虑事项之一。
最近的技术发展如基因组学和蛋白质组学(允许同时分析数千种基因和蛋白的技术)导致出现了一系列HCC生物标志物(Lok AS，Marrero J.Newer Markers for Hepatocellular Carcinoma(肝细胞癌的较新标志物).Gastroenterology 2004；127：S113-S119；Chen Li，Ye-XiongTan，Hu Zhou等人.Proteomic Analysis of Hepatitis B Virus AssociatedHepatocellular Carcinoma：Identification of Potential Tumor Markers(与肝细胞癌相关的乙型肝炎病毒的蛋白质组学分析：潜在肿瘤标志物的鉴别).Proteomics 2005；5：1125-1139；Beretta L，Chignard N.Proteomicsfor Hepatocellular Carcinoma Marker Discovery(肝细胞癌标志物发现的蛋白质组学).Gastroenterology 2004；127：S120-S 125；Schwegler EE，Cazares L等人.SELDI-TOF MS Profiling of Serum for Detection of theProgression of Chronic Hepatitis C to Hepatocellular Carcinoma(用于检测慢性丙型肝炎向肝细胞癌进展的血清SELDI-TOF质谱图).Hepatology 2005；41：634-42；Yokoyama Y，Kuramitsu Y等人.Proteomic Profiling of Proteins Decreased in Hepatocellular Carcinomafrom Patients Infected with Hepatitis C Virus(感染丙型肝炎病毒患者的肝细胞癌中蛋白减少的蛋白质组图谱).Proteomics 2004；4：2111-6；Thorgeirsson S等人.Genome-Scale Profiling of Gene Expression inHepatocellular Carcinoma：Classification，Survival Prediction andIdentification of Therapeutic Targets(肝细胞癌中基因表达的基因组尺度谱：分类、存活预测和治疗目标的鉴别).Gastroenterology 2004；127：851-855；Maria W.Smith，Zhaoxia N等人.Identification of NovelTumors Markers in Hepatitis C Virus-Associated HepatocellularCarcinoma(与丙型肝炎病毒相关的肝细胞癌中新肿瘤标志物的鉴别).Cancer Research 2003；63：859-864；Xin Chen，Siu Tim Cheung等人.Gene Expression Patterns in Human Liver Cancers(人类肝癌中的基因表达模式).Molecular Biology of the Cell 2002；13：1929-1939).
用差异蛋白质组学，已经得到表达模式特异地改变的蛋白谱，所述表达模式被提议为HCC生物标志物，并且有时候已被确定为在所述疾病发展中具有重要作用。然而，在不同的研究中鉴别出的不同蛋白库共同点很少；由于这个原因，作为HCC生物标志物它们仅有相对的价值。在不同的实验室所做的研究之间的差异可能源自所用方法学的差异或所分析样品的性质或类型的差异。
在不同的临床前研究中鉴别出的HCC生物标志物中，能够找到如下所列的HCC生物标志物(翻译自Lok AS，Marrero J.Newer Markersfor Hepatocellular Carcinoma(肝细胞癌的较新标志物).Gastroenterology 2004；127：S113-S119)。
I期标志物   生物材料   灵敏度(％)   特异性(％)
 磷脂酰肌醇聚糖-3   组织FERUM     7253     100
 73高尔基蛋白(73 GolgiProtein)   FERUM     76     69
 p16甲基化   FERUM     81
 人类肝细胞生长因子   FERUM     100     64
 细胞角蛋白19   FERUM     47
 90K-Mac-2BP糖蛋白   FERUM     46     61
 TGFβ1   FERUM     69     66
 脂蛋白(a)   FERUM     44
 红细胞结合多胺   FERUM     43     92
 组织特异性多肽抗原   FERUM     73     71
 C-反应蛋白   FERUM     48     58
 抗p53抗体   FERUM     41
 基因CD24   组织     66
 端粒酶活性   组织     100     50
 α-前胸腺素   组织     82
 DNA微卫星分析   组织     100     80
 肝细胞癌相关基因1   组织     89
 血肿特异性γ-谷氨酰转移酶   组织     85     97
 假尿嘧啶核苷分泌   尿液     70
 表皮生长因子受体(EGFR)   尿液     62
尽管为了试图理解所述疾病的临床病理特征并改进HCC患者的治疗而进行了许多研究，但是常规临床病理参数的预测能力非常有限。因此，仍然需要鉴别与HCC相关的分子生物标志物。所述分子生物标志物的鉴别和它们的机能效果研究能够有助于预防和/或治疗HCC以及寻找和开发在HCC的预防性和/或治疗性治疗中有用的药物。
发明概述
已经用蛋白质组学方法来鉴别敲除小鼠(MAT1A-/-)的肝脏中MAT1A基因(在S-腺苷甲硫氨酸的合成中缺乏)的肝癌发生的标志物。在至少50％所分析的肿瘤中，已经检测出27种蛋白的表达有改变。其中，13种蛋白已在不同病因的HCC患者的活组织检查中被证实，并且7种已在肝硬化(HCC发展之前的阶段)患者的活组织检查中被证实。该研究使得能够区分所述疾病的前期阶段甚至不同的病因(病毒性和酒精性)；因此，能得到一组标志物可以更准确地定义与HCC的发展相关的改变，从而促进所述疾病的预后和诊断。
为了鉴别所述生物标志物，已将所述MAT1A-/-小鼠用作分析人类样品之前的筛选系统。所述实验模型使得能够从肿瘤发生前的阶段进行纵向研究并鉴别与肝癌发生过程相关的蛋白；因此，该实验模型在HCC标志物的鉴别中有效。与迄今为止描述的那些基于生物标志物以及组织学标准和临床标准的系统相比，本发明中产生的蛋白表达模式提供所述疾病更准确的预后系统。
现在已经发现，与没有肝脏疾病的健康个体(对照)的肝脏组织样品中相同基因和蛋白的表达水平相比，HCC患者肝脏组织样品中的某些基因(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT)和蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT)的表达水平减少。还发现，与来自健康个体(对照)的肝脏组织样品中相同基因和蛋白的表达水平相比，肝硬化(HCC发展之前的阶段)患者的肝脏组织样品中的某些基因(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM)和蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM)的表达水平减少。
因此，本发明大体上涉及基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT，和/或相应的蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT)作为HCC生物标志物的用途。本发明也涉及基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM，和/或相应的蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM)作为HCC发展之前的阶段的生物标志物的用途。另外，本发明涉及用来实施本发明的方法和试剂盒。
在一方面，本发明涉及诊断个体HCC、确定个体所述疾病的阶段或严重性或监测给予患所述疾病的个体的治疗的效果的体外方法，所述方法包括把所述基因(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT)和/或蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT)用作HCC生物标志物。
在另一方面，本发明涉及鉴别个体HCC发展之前的阶段的体外方法，所述方法包括把所述基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM，和/或蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM)用作HCC发展之前的阶段的生物标志物。
权利要求含有与本发明有关的其它方面。
附图简述
图1是不同小鼠肝脏的一组照片，显示用蛋白质组学技术分析的肿瘤结节。A)18个月大的WT肝脏。B)MAT1A-/-肝脏，其中能够观察到约5mm大小的2个肿瘤结节。C)MAT1A-/-肝脏，其中能够观察到10mm大小的肿瘤结节。
图2显示肿瘤蛋白质组的异质性。A)示出所分析的肿瘤结节的蛋白质组可变性的二维凝胶图。B)示出来自不同MAT1A-/-小鼠的肿瘤结节之间可变性增加的图。可变性百分数定义为所观察到的与所分析条带总数相比的差异百分数。各组进行了至少3个独立的实验。
图3显示分子量(Mw)和基于所鉴别的蛋白的序列推导出的等电点(pi)与基于所述2D凝胶计算出的相应条带的相对迁移率(Rf)之间的线性相关性。
图4显示在所述肿瘤结节中差异性表达的所述蛋白的全面分析。将151种鉴别的所述蛋白进行分类：A)基于其中包括它们在内的生物学过程和B)基于它们的亚细胞位置。柱条表示在6个WT与肿瘤的比较中每个都有改变的蛋白(差异性表达的蛋白或表达有改变的蛋白)。其表达减少或增加的那些蛋白分别用绿色和红色表示。
图5显示所述MAT1A-/-小鼠的肝脏中表达减少的HCC相关蛋白。
图6显示HCC相关蛋白。A)所述MAT1A-/-小鼠的肝脏中表达增加的HCC相关蛋白。B)表现出反常电泳行为的HCC相关蛋白。
图7显示本发明中鉴别出的潜在HCC生物标志物。已经用Mann-Whitney U统计学检验比较了对照个体和患不同肝脏疾病的患者的mRNA水平。星号的数目与所达到的显著水平有关(*表示p＜0.05；**表示p＜0.01；***表示p＜0.001)。
发明详述
定义
为了帮助理解在本专利申请中描述的本发明，对本发明上下文中某些术语和措辞的含义解释如下：
术语“个体(subject)”是指哺乳类动物成员，包括但不限于家畜、灵长类和人类；所述个体优选为任何年龄或种族的男性或女性的人类。或者，术语“个体(individual)”有时也在本说明书中使用以指代人类。
术语“HCC”是指肝细胞癌或恶性肝细胞瘤。
术语“蛋白”是指由共价键或非共价键连接的氨基酸分子链。该术语包括所有翻译后修饰的形式，例如糖基化、磷酸化或乙酰化。
术语“抗体”是指能够与“抗原”特异性结合的蛋白。术语“抗体”包括完整的重组抗体、单克隆抗体或多克隆抗体或其保留与抗原结合能力的片段、组合抗体(combibodies)等，可以是人类或人源化和非人类来源。
在本发明中使用的术语“引物寡核苷酸”是指核苷酸序列，所述序列与选定的基因的核苷酸序列互补。各引物寡核苷酸与其目标核苷酸序列杂交并作为DNA聚合的起始点。
HCC的分子生物标志物及其应用
很多生物功能伴随着通过转录调控(例如通过启动、RNA前体、RNA处理的调控)和/或翻译调控改变多种基因的表达。作为说明，某些基本生物学过程，如细胞周期、细胞分化和细胞死亡，以基因组表达水平的改变为特征。
类似地，基因表达的改变与多种病理的发生(发病机理)相关；例如，抑制功能性肿瘤的基因没有充分表达和/或致癌基因/原癌基因过度表达可能导致肿瘤发生或增生细胞生长。因此，某些基因(例如致癌基因或肿瘤抑制剂)表达的改变可以用于评价多种病理的存在和进展。
基因表达改变的监测也可以在药物的筛选和开发期间提供某些优势。
发明者使用蛋白质组学方法鉴别敲除小鼠(MAT1A-/-)的肝脏中MAT1A基因的肝癌发生的标志物，在至少50％所分析的肿瘤中，已经检测出27种表达有变化的蛋白。其中，13种蛋白已在不同病因的HCC患者的活组织检查中被证实，并且7种已在肝硬化(HCC发展之前的阶段)患者的活组织检查中被证实，这使得能够区分所述疾病的前期阶段甚至不同的病因(病毒性和酒精性)；因此，这可以有助于更准确地定义与HCC的发展相关的变化，从而促进所述疾病的预后和诊断。
本发明提供了被设计成用来检测可以根据细胞状态(例如非癌性与癌性)差异性表达的那些基因和蛋白的表达水平的组合物和方法。除了别的应用以外，这些表达谱提供了有用的分子工具用于诊断所述疾病(HCC)，或评价个体发展所述疾病的素因或发展所述疾病的风险，监测所述疾病，鉴别用于治疗所述疾病的潜在有用的药物，以及所述药物的毒性和代谢。与对照样品中所述基因和/或蛋白的基线表达(基础表达水平)(参考值、正常值或对照值)相比，所述基因和/或蛋白的表达谱的改变可以用作这样的作用的标志。本领域技术人员可以使用被设计成用于评价本发明中鉴别出的一种或多种基因和/或其片段和/或蛋白的表达水平的多种已知技术的任意技术来观察感兴趣的组织或样品中表达谱的改变。
在一方面，本发明鉴别出在癌性(HCC)和非癌性肝脏组织中差异性表达的某些基因。特别地，本发明基于这样一种发现，即与没诊断出患有HCC或没有HCC临床病史的个体(对照个体)的肝脏组织样品中的相同基因和/或蛋白的水平相比，在诊断出患有HCC患者的癌性肝脏组织中基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT，和/或相应蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT)的表达水平减少。
所研究个体的肝脏组织样品和用作对照的肝脏组织样品之间所述基因和/或蛋白表达水平减少至少5％、有利地至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、甚至更优选至少25％提示已分析其样品的所述个体患有HCC或者有发展HCC的风险或有发展HCC的素因。
本领域技术人员可以选择一种或多种所述基因和/或蛋白来分析具体样品。作为说明，可以选择1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种所述基因或蛋白来研究个体的肝脏组织样品。在一个具体实施方案中，选择1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种所述基因或蛋白。在另一具体实施方案中，选择13种基因或蛋白来研究所研究个体的肝脏组织样品。所述13种基因(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT)的差异性表达(与对照相比减少)构成HCC的基因组印迹(指纹)。类似地，所述13种蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT)的差异性表达(与对照相比减少)构成HCC的蛋白质组印迹(指纹)。鉴别一组标志物而不使用个别标志物可能有助于进行更具特异性的病理学诊断。此外，可得到一组标志物使得能够及时评价它们的演化，并且以这样的方式把所述疾病的进展(或其演化阶段)与某些特征性标志物在给定时间的出现联系起来。
因此，评价并比较个体的肝脏组织样品中所述基因和/或它们相应蛋白的表达水平可以用于HCC诊断或预后的目的。作为说明，与对照个体(即没有HCC临床病史和/或没有患HCC的个体)的生物学样品中相同标志物的水平或正常参考值(一般而言，得自对照个体)相比，个体肝脏组织样品中的本发明鉴别出的一种或多种HCC标志物水平减少提示患有HCC，或个体有发展所述疾病的较高风险或素因。比较个体(无论诊断出患HCC与否)在给定时间的所述标志物水平与来自相同个体先前样品的所述标志物水平，可以提示所述疾病的演化和预后或者正在给予所述个体的治疗的效果(如果适用)。
因此，除了别的应用以外，本发明的教导可以用于诊断试验或测定或用于评价个体发展HCC的风险或素因的试验、预后试验、给予个体的治疗的效果的后续试验以分析该治疗的效果和所述疾病的演化，以及在HCC的治疗中潜在有用的化合物的筛选试验。
除了其它方面以外，本发明提供了被设计成用于检测和定量个体肝脏组织样品中基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达，和/或它们相应的蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT)的表达的方法。
因此，在一方面，本发明涉及诊断个体肝细胞癌(HCC)、评价个体发展HCC的素因、评价个体中该病理的进展或确定个体中所述疾病的阶段或严重性的体外方法，在下文中，本发明的方法包括：
a)定量所述个体肝脏组织样品中的基因表达水平，其中所述基因选自编码醇脱氢酶(ADH)的基因[ADH基因]、编码抗氧化蛋白2(AOP2)的基因[AOP 2基因]、编码钙调素(SMP30)的基因[SMP30基因]、编码甾醇载体蛋白2(NSLT)的基因[NSLT基因]、编码山梨醇脱氢酶(SDH)的基因[SDH基因]、编码白蛋白(SAP)的基因[SAP基因]、编码葡萄糖磷酸变位酶(PGM)的基因[PGM基因]、编码苯丙氨酸4-羟化酶(P4H)的基因[P4H基因]、编码载脂蛋白A1(APOA1)的基因[APOA1基因]、编码碳酸酐酶III(CAIII)的基因[CAIII基因]、编码2型醛脱氢酶(AdDHm)的基因[30AdDHm基因]、编码鸟氨酸转氨酶(OAT)的基因[OAT基因]、编码鸟氨酸氨甲酰转移酶(OCT)的基因[OCT基因]及其组合；和
b)将所述水平与对照样品的所述基因表达水平比较；
其中所述水平相对于对照样品的表达水平减少提示患有HCC；
或者，可选地，
a)定量所述个体的肝脏组织样品中的蛋白水平，其中所述蛋白选自醇脱氢酶(ADH)、抗氧化蛋白2(AOP2)、钙调素(SMP30)、甾醇载体蛋白2(NSLT)、山梨醇脱氢酶(SDH)、白蛋白(SAP)、葡萄糖磷酸变位酶(PGM)、苯丙氨酸4-羟化酶(P4H)、载脂蛋白A1(APOA1)、碳酸酐酶III(CAIII)、2型醛脱氢酶(AdDHm)、鸟氨酸转氨酶(OAT)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(OCT)及其组合；和
b)将所述水平与对照样品的所述蛋白表达水平比较；
其中所述水平相对于对照样品的水平减少提示患有HCC；
本发明提供的方法具有高灵敏度和特异性，并且基于这样一个事实，即与用作对照样品的没有肝脏疾病并且没有HCC临床病史的健康个体的肝脏组织样品中的所述基因和/或蛋白水平相比，诊断出患HCC个体的(癌性)肝脏组织中与基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT相应的mRNA水平低，和/或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的浓度减少。
为了实施本发明的方法，得到了来自待研究的个体的肝脏组织样品。所述样品可以通过任何常规方法得到，例如，通过由外科手术切除得到的肝脏组织活组织检查。该样品可以得自先前诊断出患有HCC的个体(患者)，或得自先前还没有诊断出患有HCC的个体，或得自正在治疗的诊断出患有HCC的患者，或得自先前还没有治疗的诊断出患有HCC的个体。
在一个具体实施方案中，本发明的方法包括定量选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT、OCT及其组合在个体的肝脏组织样品中的表达水平并将所述水平与对照肝脏组织样品的水平比较，其中所述表达水平相对于对照样品中相同基因的表达水平减少提示患有HCC。本发明的方法包括不仅定量仅仅一种所述基因的的表达水平的可能性，而且包括定量所述基因中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种基因的表达水平和甚至所述13种基因的表达水平的可能性。
基因表达水平可以通过定量所述基因转录产生的基因的信使RNA(mRNA)水平，或者定量与所述mRNA互补的DNA(cDNA)水平来定量。在这样的情况下，本发明的方法包括进行提取步骤以获得总RNA，所述步骤可以通过常规技术进行。实践上，任何常规方法都可以在本发明的范围内使用以便检测和定量基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT或它们相应的cDNA的mRNA水平。作为说明，但不限于，所述基因的mRNA水平可以用常规方法定量，例如包括扩增mRNA并定量所述mRNA的扩增产物的方法，其通过例如与适当的标记探针杂交并检测该信号，或者通过Northern blot并使用感兴趣的mRNA(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT或OCT)的特异性探针，使用S1核酸酶定位，RT-LCR，杂交，微阵列等。类似地，与基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的所述mRNA相应的cDNA的水平也可以用常规技术定量；在这样的情况下，本发明的方法包括cDNA合成步骤：反向转录(RT)相应mRNA，然后扩增并定量所述cDNA的扩增产物；在一个具体实施方案中，扩增定性或者定量地进行：使用特异扩增基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT或OCT的区域的引物寡核苷酸，通过PCR(例如，定量的PCR、使用适当标记的实时定量PCR等)。
在另一具体实施方案中，本发明的方法包括定量选自蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT、OCT及其组合的蛋白在个体的肝脏组织样品中的水平(浓度)并将该水平与对照肝脏组织样品的水平比较，其中该水平相对于对照样品中相同蛋白的水平减少提示患有HCC。本发明的方法包括不仅定量仅仅一种所述蛋白水平的可能性，而且包括定量所述蛋白中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种蛋白的水平和甚至所述1 3种蛋白的水平的可能性。
所述蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的水平(浓度)可以通过使得能够检测和定量个体样品中所述蛋白的任何常规方法定量。在这样的情况下，本发明的方法包括进行提取步骤以便获得包括所述蛋白的蛋白提取物，所述步骤可以用常规技术进行。
实践中可以在本发明范围内使用任何常规方法以便检测和定量ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的水平。作为说明，但不限于，所述蛋白的水平可以用常规方法定量，例如，使用能够与ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT或OCT结合(或与其包括抗原决定簇的片段结合)的抗体然后定量所形成的复合物。在这些测定中使用的抗体可以标记或不标记。可以使用的标记物的说明性实例包括放射性同位素、酶、荧光团、化学发光试剂、酶底物或辅因子、酶抑制剂、粒子、染色剂等。有很多使用未标记的抗体(初级抗体)和标记的抗体(次级抗体)的已知测定可以用在本发明中；这些技术包括Western-blot或Western转移(Westerntransfer)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、竞争性EIA(竞争性酶免疫测定)、DAS-ELISA(双抗体夹心ELISA)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、基于使用包括特异抗体的蛋白生物芯片或微阵列的技术或基于在诸如纤维素试纸的形式中的胶体沉淀的检测。检测和定量所述蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT或OCT的其它方法包括亲和色谱技术和配体结合测定等。
在一个具体实施方案中，ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT水平的定量通过使用能够与ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT或OCT(或其包括抗原决定簇的片段)结合的抗体然后定量所形成的复合物进行，例如，通过允许定量抗原-抗体结合物的免疫化学技术，例如Western blot、ELISA、蛋白生物芯片等；优选地，ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT水平的定量使用能够与所述蛋白结合的适当抗体通过蛋白生物芯片或Westernblot进行。所述抗体可商购或通过本领域技术人员已知的常规方法获得。
本发明的方法也包括该步骤，其中包括将在所研究个体的肝脏组织样品中测定的基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达水平，和/或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的水平，与用作对照的肝脏组织样品中所述基因和/或蛋白的水平相比较(即与通常得自没有肝脏疾病的健康个体的参考值比较)。基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达水平，以及蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的水平可以通过上述技术在肝脏组织样品中测定，所述样品优选来自没有肝脏疾病的健康个体。所研究个体的肝脏组织样品中基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达水平，或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的水平相对于对照肝脏组织样品中相应水平减少提示患有HCC。
在另一方面，本发明涉及鉴别和评价HCC治疗效果的体外方法。该方法涉及在处于所述疾病不同阶段或时期或治疗和未治疗期间的相同个体中定量蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的水平，和/或基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达水平，并与被视为正常的对照值比较或与相同个体先前的值比较。当治疗剂增加基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达，或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达时，该治疗剂即成为治疗HCC的候选药剂。
在一个具体实施方案中，本发明涉及用于评价给予患有HCC的个体的治疗的效果的体外方法，其包括：(i)定量来自所述个体的肝脏组织样品的基因表达水平，和/或蛋白水平，其中所述基因选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT、OCT及其组合，所述蛋白选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT、OCT及其组合；和(ii)将所述水平与给予该治疗之前相同个体肝脏组织样品中的水平比较。在这样的情况下，所述基因和/或蛋白的表达水平相对于给予该治疗之前水平的增加提示给予所述个体的治疗是有效的。所述基因和/或蛋白表达水平的定量和所述表达水平的比较可以通过常规方法进行，如先前涉及本发明的方法所描述的那样。
基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的核苷酸序列可以用于设计可用于扩增所述基因特定片段的引物寡核苷酸，以及获得在鉴别所述基因中潜在有用的探针；因此，所述基因的所述核苷酸序列，以及所述引物寡核苷酸和探针可以用于体外诊断个体HCC、评价个体发展HCC的素因、评价个体所述疾病的进展、确定个体所述疾病的阶段或严重性，或鉴别并评价HCC治疗的效果，例如，评价给予患所述疾病的个体的治疗的效果。
类似地，蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT，或其包括所述蛋白的一个或多个抗原决定簇(抗原表位)的片段可以用于生产抗所述蛋白的抗体。因此，所述蛋白及其片段以及能够与所述蛋白或其片段结合的所述抗体，可以用于体外诊断个体HCC、评价个体发展HCC的素因、评价个体所述疾病的进展、确定个体所述疾病的阶段或严重性，或鉴别并评价HCC治疗的效果，例如，评价给予患所述疾病的个体的治疗的效果。
在另一方面，本发明涉及抗体的用途，即体外诊断个体HCC、评价个体发展HCC的素因、评价个体所述疾病的进展、确定个体所述疾病的阶段或严重性，或鉴别并评价HCC治疗的效果，例如，评价给予患所述疾病个体的治疗的效果，其中所述抗体是能够与选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的蛋白或与其含有所述蛋白的抗原决定簇的片段结合的抗体。所述抗体可以是完整的重组抗体、单克隆抗体、多克隆抗体或保留与所述蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT或OCT)结合能力的其片段，例如Fab、scFv等片段，可以是人类、人源化或非人类抗体。
本发明鉴别出的生物分子标志物，如基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT，和/或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT，可以用于筛选、寻找、鉴别、开发治疗HCC的化合物以及评价所述化合物效果。
因此，在另一方面，本发明涉及筛选、寻找、鉴别、开发治疗HCC的化合物以及评价所述化合物效果的方法，其包括：(i)将基因表达水平减少的细胞系统与候选化合物接触，和(ii)评价所述基因的表达，这样，如果所述基因的表达增加，则候选化合物是治疗HCC的潜在有用化合物，其中所述基因选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT、OCT及其组合。所述细胞系统实践上可以是其中一种或多种所述标志物减少的任何细胞系统，例如这些标志物水平减少的转变的人细胞系，如HepG2、Huh7等细胞系。所述基因的表达可以通过任何常规方法评价，例如，通过定量所述基因的mRNA水平或它们相应的cDNA水平，或通过用与本发明方法有关的任何前述方法定量所述蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT或OCT。当化合物增加基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT中任意种类的表达水平，或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的水平(浓度)时，该化合物即成为治疗HCC的潜在有用的候选药剂。在另一方面，本发明涉及所述基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT，和/或所述蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT在筛选、寻找、鉴别、开发治疗HCC的化合物以及评价所述化合物效果的方法中的用途。
那些增强基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达，或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的活性的化合物可以用于治疗HCC。所述化合物的非限制性的说明性实例包括所述基因表达或所述蛋白活性的正向调节剂。
在另一方面，本发明涉及包括治疗有效量的增强基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达或增强蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的活性的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物。在一个具体实施方案中，该药物组合物包括所述基因表达的正向调节剂或所述蛋白活性的正向调节剂。
所述赋形剂、载体和辅助物质必须是制药学和药理学上可耐受的并且必须能够与该制剂中的其它成分组合并且不对所治疗的个体产生任何副作用。该药物组合物可以以任何适当的给药形式提供，例如，以适合口服和肠胃外给药的药物形式(包括，例如静脉、皮下、皮内、肌肉、腹膜内和鞘内给药)。该制剂可以是单剂量的，并且应根据经典的草本制剂方法(galenic method)制备。对于用于给药的不同药物形式及其制备的综述可以参见书“Tratado de Farmacia Galénica”，C.FaulíiTrillo著，第10版，1993，Luzáan 5，S.A.de Ediciones.
在另一方面，本发明涉及一种化合物在制备治疗HCC的药物组合物中的用途，所述化合物增强基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达，或增强蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的活性。
在另一方面，本发明涉及在特异性扩增基因的mRNA或cDNA片段中有用的引物寡核苷酸对，其中所述基因选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT。在一个具体实施方案中，所述引物寡核苷酸对选自如下的寡核苷酸对：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，以及SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26。
在另一方面，本发明涉及用于鉴别选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的基因的探针。在一个具体实施方案中，本发明提供了用于鉴别所述13种基因的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种探针，所述探针固定到固体支持物如膜、塑料或玻璃上，任选进行处理以促进所述探针固定到所述支持物上。所述固体支持物可以通过阵列技术用于鉴别所述基因(或它们相应的cDNA)的转录产物并构成本发明的另一方面，所述固体支持物包括至少用于鉴别一种基因的一种探针，其中所述基因选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT。在一个具体实施方案中，所述固体支持物包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种所述探针。
在另一方面，本发明涉及能够与选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的蛋白结合的抗体。在一个具体实施方案中，本发明提供了用于鉴别13种所述蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种抗体，所述抗体固定到诸如膜、塑料或玻璃的固体支持物上，任选进行处理以促进所述抗体固定到所述支持物上。所述固体支持物可以通过阵列技术用于鉴别蛋白并构成本发明的另一方面，所述固体支持物包括能够与蛋白结合并鉴别所述蛋白的至少一种抗体，其中所述蛋白选自蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT。在一个具体实施方案中，所述固体支持物包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种所述抗体。
在另一方面，本发明涉及在实施在此描述的方法中有用的试剂盒。因此，所述试剂盒可以包括用于检测基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达水平，或检测蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的水平的所有或部分必需的试剂，所述试剂包括下述：
-用于特异性扩增基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的mRNA(或它们相应的cDNA)片段的一对或多对引物寡核苷酸；和/或
-用于鉴别一种或多种选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的基因的一种或多种探针；和/或
-能够与选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的蛋白结合或与其包括抗原决定簇的片段结合的一种或多种抗体。
所述试剂盒可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13对引物寡核苷酸，其中每一对均对一种所述基因具有特异性。能够包括在所述试剂盒中的引物寡核苷酸对的说明性而非限制性实例包括如下寡核苷酸对：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，和/或SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26。
可选地，所述试剂盒可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种探针，其中每一种均可特异性鉴别一种所述基因。在另一可选实施方案中，所述试剂盒可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种抗体，其中每一种均能够与一种所述蛋白结合。
所述试剂，尤其是所述探针和所述抗体，可以如前所述固定到固体支持物上。
所述试剂盒可以用于体外诊断个体HCC，或评价个体发展HCC的素因，或评价个体所述疾病的进展，或确定个体所述疾病的阶段或严重性，或鉴别并评价HCC治疗的效果，例如，评价给予患所述疾病的个体的治疗的效果。
HCC发展之前的阶段的标志物
如前提示的那样，本发明也鉴别了在肝脏硬化症的肝脏组织(即在HCC发展之前的阶段)和健康肝脏组织中差异性表达的某些基因；尤其是，也已经观察到肝脏硬化症(HCC发展之前的阶段)患者的肝脏组织样品中基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM，和/或相应的蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM)的表达水平与没有肝脏疾病的健康个体(对照个体)的肝脏组织样品中相同基因和/或蛋白的水平相比减少。所研究个体的肝脏组织样品和用作对照的肝脏组织样品之间所述基因和/或蛋白的表达水平减少至少5％，有利地，至少10％，优选地，至少15％，更优选地，至少20％，甚至更优选地，至少25％，提示所研究的个体患有最终可能演化成HCC的肝脏硬化症。
本领域技术人员可以选择一种或多种所述基因和/或蛋白以便检测具体样品。作为说明，可以选择1、2、3、4、5、6或7种所述基因或蛋白以便研究个体的肝脏组织样品。在一个具体实施方案中，选择1、2、3、4、5或6种所述基因或蛋白。在另一具体实施方案中，选择7种基因或蛋白以便研究所研究个体的肝脏组织样品。所述7种基因(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM)的差异性表达(与对照相比减少)构成了HCC发展之前的阶段(肝脏硬化症)的基因组印迹(指纹)。类似地，所述7种蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM)的差异性表达(与对照相比减少)构成了HCC发展之前的阶段(肝脏硬化症)的蛋白质组印迹(指纹)。
因此，评价并比较个体肝脏组织样品的所述基因和/或它们相应蛋白的表达水平，可以用于鉴别HCC发展之前的阶段并采取适当措施。
因此，在另一方面，本发明涉及鉴别个体肝细胞癌(HCC)发展之前的阶段的体外方法，其包括：
a)定量所述个体肝脏组织样品的基因表达水平，其中所述基因选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM及其组合；和
b)将所述水平与对照样品的水平相比较；
其中所述水平相对于对照样品的表达水平减少提示HCC发展之前的阶段；
或者，可选地，
a)定量所述个体肝脏组织样品的蛋白水平，其中所述蛋白选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM及其组合；和
b)将所述水平与对照样品的水平相比较；
其中所述水平相对于对照样品的水平减少提示HCC发展之前的阶段。
为了实施所述方法，通过例如活组织检查获得待研究个体的肝脏组织样品，如先前已经提到的关于本发明提供的被设计用来诊断HCC的体外方法。该样品可以得自患有肝脏硬化症的个体。
在一个具体实施方案中，前述方法包括定量个体的肝脏组织样品中选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM及其组合的基因的表达水平，并将所述表达水平与对照肝脏组织样品相比较，其中所述表达水平与对照样品中相同基因的表达水平相比减少提示HCC发展之前的阶段。实施所述方法不仅包括定量仅仅一种所述基因的表达水平的可能性，而且包括定量任意2、3、4、5或6种所述基因的表达水平、甚至所述7种基因的表达水平的可能性。所述基因的表达水平可以通过定量所述基因的mRNA水平，或者所述mRNA的cDNA水平来定量，如先前已经提到的关于本发明提供的被设计用来诊断HCC的体外方法。在一个具体实施方案中，通过Northern blot并使用感兴趣的mRNA(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP或PGM)的特异性探针来测定mRNA的表达水平，或使用特异性扩增基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP或PGM的区域的引物寡核苷酸通过定量PCR例如实时定量PCR来测定。
在另一具体实施方案中，前述方法包括定量个体肝脏组织样品中选自蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM及其组合的蛋白水平(浓度)，并将所述水平与对照肝脏组织样品的水平相比较，其中所述水平与对照样品中相同蛋白的水平相比减少提示HCC发展之前的阶段。实施所述方法不仅包括定量仅仅一种所述蛋白的水平的可能性，而且包括定量任意2、3、4、5或6种所述蛋白的水平甚至所述7种蛋白的水平的可能性。所述蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的水平可以用任何常规方法定量，如先前已经提到的关于本发明提供的被设计用来诊断HCC的体外方法。在一个具体实施方案中，通过使用能够与所述蛋白(或与其包括抗原决定簇的片段)结合的抗体然后定量所形成的复合物来定量ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的水平，例如通过允许定量抗原-抗体复合物的免疫化学技术，例如Western blot、ELISA、蛋白生物芯片等。
前述方法也包括将在所研究个体肝脏组织样品中测定的基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的表达水平，和/或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的水平与用作对照的肝脏组织样品中的所述基因和/或蛋白的水平相比较(即与通常得自没有肝脏疾病的健康个体的参考值比较)的步骤。所研究个体的肝脏组织样品中基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的表达水平，或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的水平与对照肝脏组织样品中相应水平相比减少提示HCC发展之前的阶段。
基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的核苷酸序列可以用来设计扩增所述基因特定片段的引物寡核苷酸以及获得在鉴别所述基因中潜在有用的探针；因此，所述基因的所述核苷酸序列以及所述引物寡核苷酸和探针可以用来体外鉴别个体HCC发展之前的阶段。
类似地，蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM，或其包括所述蛋白的一个或多个抗原决定簇(抗原表位)的片段可以用来制备抗所述蛋白的抗体。因此，所述蛋白及其片段以及能够与所述蛋白结合的所述抗体可以用来体外鉴别个体HCC发展之前的阶段。
在另一方面，本发明涉及抗体体外鉴别个体HCC发展之前的阶段的用途，其中所述抗体是能够与选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM的蛋白结合，或与其包括所述蛋白的抗原决定簇的片段结合的抗体。所述抗体可以是完整的重组抗体、单克隆抗体、多克隆抗体或其保留与所述蛋白(ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP或PGM)结合能力的片段，例如Fab、scFv等片段，可以是人类、人源化或非人类抗体。
所鉴别出的分子生物标志物，如基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM，和/或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM可以用于筛选、寻找、鉴别、开发治疗个体HCC发展之前的阶段的化合物以及评价所述化合物效果。
因此，在另一方面，本发明涉及用于筛选、寻找、鉴别、开发治疗个体HCC发展之前的阶段的化合物以及评价所述化合物效果的方法，所述方法包括：(i)将基因表达水平减少的细胞系统与候选化合物接触，和(ii)评价所述基因的表达，这样，如果所述基因的表达增加，则候选化合物是治疗HCC发展之前的阶段的潜在有用化合物，其中所述基因选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM及其组合。所述细胞系统实践上可以是其中一种或多种所述标志物减少的任何细胞系统，例如这些标志物水平减少的转变的人细胞系。所述基因的表达可以通过任何常规方法评价，例如，通过定量与所述基因有关的mRNA的水平或它们相应的cDNA的水平，或通过任何上述方法定量所述蛋白。当化合物增加ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的表达时，该化合物即成为治疗HCC发展之前的阶段的潜在有用的候选药剂。
因此，在另一方面，本发明涉及所述基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM，和/或所述蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM在用于筛选、寻找、鉴别、开发治疗个体HCC发展之前的阶段的化合物以及评价所述化合物效果的方法中的用途。
那些增强基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的表达，或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的活性的化合物可以用于治疗HCC发展之前的阶段。所述化合物的非限制性的说明性实例包括所述基因表达的正向调节剂或所述蛋白活性的正向调节剂。
在另一方面，本发明涉及包括治疗有效量的增强基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的表达或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的活性的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物。在一个具体实施方案中，该药物组合物包括所述基因表达的正向调节剂或所述蛋白活性的正向调节剂。
所述赋形剂、载体和辅助物质必须是制药学和药理学上可耐受的并且必须能够与该制剂中的其它成分组合并且不对所治疗的个体产生任何副作用。该药物组合物可以以任何适当的给药形式提供，例如，以适合口服和肠胃外给药的药物形式(包括，例如静脉、皮下、皮内、肌肉、腹膜内和鞘内给药)。该制剂可以是单剂量的，并且应根据经典的草本制剂方法制备。对于用于给药的不同药物形式及其制备的综述可以参见书“Tratado de Farmacia Galénica”，C.Faulíi Trillo著，第10版，1993，Luzán 5，S.A.de Ediciones.
在另一方面，本发明涉及化合物在制备用于治疗HCC发展之前的阶段的药物组合物中的用途，所述化合物增强基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的表达，或增强蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的活性。
在另一方面，本发明涉及用于特异性扩增基因的mRNA或cDNA片段的引物寡核苷酸对，其中所述基因选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM。在一个具体实施方案中，所述引物寡核苷酸对选自如下的寡核苷酸对：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQID NO：3和SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，以及SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14。
在另一方面，本发明涉及用于鉴别选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM的基因的探针。在一个具体实施方案中，本发明提供了用于鉴别所述7种基因的1、2、3、4、5、6或7种探针，所述探针固定到诸如膜、塑料或玻璃的固体支持物上，任选进行处理以促进所述探针固定到所述支持物上。所述固体支持物可以通过阵列技术用于鉴别所述基因(或它们相应的cDNA)的转录产物并构成本发明的另一方面，所述固体支持物包括用于鉴别一种基因的至少一种探针，其中所述基因选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM。在一个具体实施方案中，所述固体支持物包括1、2、3、4、5、6或7种所述探针。
在另一方面，本发明涉及能够与选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM的蛋白结合的抗体。在一个具体实施方案中，本发明提供了用于鉴别所述7种蛋白的1、2、3、4、5、6或7种抗体，所述抗体固定到诸如膜、塑料或玻璃的固体支持物上，任选进行处理以促进所述抗体固定到所述支持物上。所述固体支持物可以通过阵列技术用于鉴别蛋白并构成本发明的另一方面，所述固体支持物包括能够与蛋白结合并鉴别所述蛋白的至少一种抗体，其中所述蛋白选自蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM。在一个具体实施方案中，所述固体支持物包括1、2、3、4、5、6或7种所述抗体。
在另一方面，本发明涉及在实施前述被设计用来鉴别HCC发展之前的阶段的体外方法中有用的试剂盒。所述试剂盒可以包括用于检测基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的表达水平，或检测蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的表达水平的所有或部分必需的试剂，所述试剂包括：
-用于特异性扩增基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP或PGM的mRNA(或它们相应的cDNA)片段的一对或多对引物寡核苷酸；和/或
-用于鉴别一种或多种选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM的基因的一种或多种探针；和/或
-能够与选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM的蛋白结合或与其包括抗原决定簇的片段结合的一种或多种抗体。
所述试剂盒可以包括1、2、3、4、5、6或7对引物寡核苷酸，其中每一对均对一种所述基因具有特异性。能够包括在所述试剂盒中的引物寡核苷酸对的说明性而非限制性实例包括如下寡核苷酸对：SEQID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，和/或SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14。
可选地，所述试剂盒可以包括1、2、3、4、5、6或7种探针，其中每一种均可特异性鉴别一种所述基因。在另一实施方案中，所述试剂盒可以包括1、2、3、4、5、6或7种抗体，其中每一种均能够与一种所述蛋白或其包括抗原决定簇的片段结合。
所述试剂，尤其是所述探针和所述抗体，可以如前所述固定到固体支持物上。
下列实施例阐述本发明，但不应视为对其范围的限制。
实施例1
材料和方法
实验室动物
使用了在发明者自己的地区饲养并在发明者的实验室中培育的MAT1A-/-小鼠(Lu SC，Alvarez L，Huang ZZ，Chen L，An W，CorralesFJ，Avila MA，Kanel G，Mato JM.Methionine Adenosyltransferase 1AKnockout Mice Are Predisposed to Liver Injury and Exhibit IncreasedExpression of Genes Involved in Proliferation(蛋氨酸腺苷转移酶1A敲除小鼠被预处理成肝损伤并显示与增殖有关的基因表达增加).ProcNatl Acad Sci USA 2001；98：5560-65)。在处死野生型(WT)和MAT1A-/-小鼠并提取其肝脏之后，测量了MAT1A-/-肝脏中存在的肿瘤的大小。立即将该肝脏样品在液氮中冷冻并保持在-80℃。所有的实验操作根据纳瓦拉大学规定的关于实验室动物的使用与操作的机构指导方针进行。
患者
获得了几组肝脏样品：
a)来自对照个体的样品(n＝10)。对照组样品自患者获得，所述患者已经接受用于治疗无症状性胆石病的胆囊切除术并已经同意接受肝脏活组织检查。这些患者具有正常的肝脏组织学特点而且他们的肝脏功能正常。
b)来自酒精性肝硬化患者的样品(n＝5)。
c)病毒性肝硬化患者(n＝5)。
d)病因不同的HCC患者(n＝10)。
e)得自健康肝脏的HCC患者的非肿瘤区域的肝脏样品(n＝7)。
f)来自病因不同的HCC患者的非肿瘤区域的肝脏样品：3个来自丙型肝炎，5个来自病毒性肝硬化(n＝8)。
病理样品在手术期间或在肝脏移植时获得。
所有的组织立即在液氮中冷冻，以便随后进行RNA提取。该研究已经被纳瓦拉大学研究委员会批准。该研究按照1975年的赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)(1983年修订)中陈述的伦理标准进行。
蛋白质组学分析
肝脏蛋白质组学特征和与实验模型相关的改变通过将用二维电泳解析来自生物学样品的蛋白混合物和然后按照下列概述的蛋白质组学方法用质谱鉴别感兴趣的蛋白合并而进行。
A)预备阶段
蛋白的匀质化/溶解
等点聚焦(第1维)
还原/烷化
SDS-PAGE(第2维)
着色/退色
B)预备阶段
图像分析
差异带切除
酶解
用质谱(MS)鉴别
在20倍体积的裂解缓冲液中匀化来自WT小鼠和MAT1A-/-小鼠的50mg肝脏组织样品，所述缓冲液的组成为：7M尿素、2M硫脲、4％(v/v)3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基-铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、1％(v/v)二硫苏糖醇(DTT)和0.5％3-10两性电解质(BioRad)。在15℃于100,000xg转速下将该提取物离心1小时。用牛白蛋白作为标准品通过布拉德福德(Bradford)法(BioRad)测试所得到的上清液中的蛋白浓缩物。
第一维在等点聚焦源(BioRad的Protean IEF cell)中用pH范围不同的17cm凝胶(BioRad的ReadyStrips IPG strips)进行。通过在50V和20℃下活性再水合处理12小时进行上样(150-1,000μg)。再水合之后，用厂家推荐的方法对凝胶施加逐渐增加的电压，直至达到60,000Vx小时。所述条带用具有如下组成的缓冲液平衡：pH 7.5的50mMTris/HCl、6M尿素、30％(v/v)丙三醇、2％(v/v)十二烷基硫酸钠(SDS)、2％(v/v)DTT和痕量的溴酚蓝，然后在含2.5％碘乙酰胺不含DTT的相同缓冲液中温育。将该条带直接放在12.5％的聚丙烯酰胺凝胶(18cm×20cm×1mm)上并用1％的低熔点琼脂糖密封以固定它们的位置。所述SDS-PAGE凝胶(第二维)在90 V下跑14小时并用Coomassie SafeStain(Invitrogen)着色。可选地，使用银染料(Amersham Biosciences)和Sypro Ruby荧光染料(BioRad)。那些用Coomassie或银着色的凝胶在GS-800校准的比重计(Bio-Rad)中进行数字转换。那些用荧光着色的凝胶用分子成像FX比重计(Molecular Imager FX densitometer)(BioRad)扫描。获得的图像用BioRad的PDQuest 7.1软件分析。视为有效的唯一差别是表达水平的变化大于3倍并且在至少3个独立实验中被证实的那些。所有样品以双份进行处理。从凝胶中手动提取与差异性表达的蛋白相应的条带并在自控装置(Micromass的MassPrep station)中自动处理。那些用Coomassie或荧光着色的感兴趣条带用50mM碳酸氢铵和50％(v/v)乙腈退色，而那些用银染色的条带用15mM铁氰化钾和50mM硫代硫酸钠退色。在100mM碳酸氢钠中用10mM DTT还原所述蛋白并在相同缓冲液中用55mM碘乙酰胺将所述蛋白烷化。然后，在37℃于50mM碳酸氢铵中用6ng/μl的胰岛素分解5小时。可选地，使用Sigma开发的方法。所获得的水解肽用1％(v/v)的甲酸和2％(v/v)的乙腈提取。然后从每一分解液取1.2μl与1.2μl在0.1％三氟乙酸和50％(v/v)乙腈中的α-氰基-4-羟基-反式-氰酰胺酸饱和溶液混合。将该混合物放在与MALDI-TOF质谱仪相匹配的板上。用Waters的MALDI-TOF GL-REF质谱仪通过质谱分析所述分解液。所述肽的测序和表征用Waters的Q-TOF微光谱仪进行。纳米液相色谱(Nano-liquid-chromatography)用Waters的CapLCTM系统进行。用反相色谱分离胰蛋白酶分解液在Waters的3μm、75μm×10cm、NanoEaseTM的Atlantis C-18柱上进行。该柱在5％的乙腈和0.2％的甲酸中平衡。进样6μl以后，用相同的缓冲液清洗该柱5分钟，并以0.2μl/分钟的恒定流速用线性梯度的5-50％乙腈洗脱所述肽。将该柱用PicoTip纳米-电喷雾电离源(nano-electrospray ionisation source)(Waters)连接到质谱仪上。毛细管温度为80℃，电压为1.8-2.2Kv。获得的裂解数据使用设定程序自动收集。每一保留时间的3个最强烈的离子被诱导碰撞(CID)裂解，所述诱导碰撞具有2.5窗口(window)并且相对碰撞能量为35％。质谱数据用Masslynx4.0软件(Waters)处理。对于蛋白鉴别，使用Proteinlynx Global Server 2.0软件(Waters)。用于检索的数据库是SwissProt(Swiss-Prot Release 46.3，有176,469个条目)和Ensembl(Ensembl Mouse Release 29.33，有31,535个条目)。最后，所鉴别出的蛋白的分类和功能解释用GARBAN软件进行(Luis A，Martínez-Cruz，Angel Rubio，María L.Martínez-Chantar，AlbertoLabarga，Isabel Barrio，Adam Podhorski，Víctor Segura，JoséL.SevillaCampo，Matías A.和Jose M.Mato.GARBAN：A New Tool forGenomic Analysis and Rapid Biological Annotation of cDNA Microarrayand Proteomic Data(GARBAN：cDNA微阵列和蛋白质组学数据的基因组学分析及快速生物学解释的新工具).Bioinformatics 2003；19：2158-60)。
RNA分离、RT-PCR和实时PCR
为了提取人类样品中的RNA，使用Sigma的TRI试剂。在用M-MLV反转录酶(Invitrogen)在RNAse OUT(Invitrogen)的存在下反转录之前，用DNAse I(Invitrogen)处理所述RNA(2μg)。使用的所有引物寡核苷酸被设计用来区分基因组DNA扩增与cDNA扩增。对所有PCR产物进行测序以证实其特异性。实时PCR使用iCycler(Bio-Rad)和iQ SYBR Green Supermix mixture(Bio-Rad)与1/20的RT反应一起进行。使用如下的引物寡核苷酸：
醇脱氢酶(ADH)：5′-GATGCCTCTGATTGGTCTGG-3′(SEQ ID NO：1)和5′-CTTGGATGTCACAAACAGCTC-3′(SEQ ID NO：2)；
抗氧化蛋白2(AOP2)：5′-CAACTTTGAGGCCAATACCAC-3′(SEQID NO：3)和5′-TCCTTGCTCCAGGCAAGATG-3′(SEQ ID NO：4)；
衰老标记蛋白30(SMP30)：5′-TCAATGATGGGAAGGTGGATC-3′(SEQ ID NO：5)和  5′-AGGTCATAGTCAAAGGCATCC-3′(SEQ ID NO：6)；
非特异性脂质转移蛋白(Non-specific lipid transfer protein)(NSLT)：5′-TGGCTCTTGGGTTTGAGAAG-3′(SEQ ID NO：7)和5′-CATCTTGGAACTGGGAATACG-3′(SEQ ID NO：8)；
山梨糖脱氢酶(SDH)：5′-ATCTTCTTCTGTGCCACGCC-3′(SEQID NO：9)和5′-GCTCCCATTGCTTTGGCCAC-3′(SEQ ID NO：10)；
血清白蛋白(SAP)：5′-ATGCCTGCTGACTTGCCTTC-3′(SEQ IDNO：11)和5′-CTGAGGCTCTTCCACAAGAG-3′(SEQ ID NO：12)；
葡萄糖磷酸变位酶(PGM)：5′-AAGAAGATCCTCTGTGAAGAAC-3′(SEQ ID NO：13)和5′-GAATGCTGAAGATGTTGGCAG-3′(SEQ ID NO：14)；
苯丙氨酸4-羟化酶(P4H)：5′-GGTGCCACTGTCCATGAGC-3′(SEQ ID NO：15)和5′-GGCGGTAGTTGTAGGCAATG-3′(SEQ ID NO：16)；
载脂蛋白A1(APOA1)：5′-GACAGCGGCAGAGACTATG-3′(SEQ ID NO：17)和5′-CCACCTTCTGGCGGTAGAG-3′(SEQ ID NO：18)；
碳酸酐酶III(CAIII)：5′-TCCTGACCACTGGCATGAAC-3′(SEQID NO：19)和5′-TGCTCAGAGCCATGATCATC-3′(SEQ ID NO：20)；
线粒体醛脱氢酶(AdDHm)：5′-GAGCAGCAACCTCAAGAGAG-3′(SEQ ID NO：21)和5-CGAGGATCTTCTTAAACTGAG-3′(SEQ ID NO：22)；
鸟氨酸转氨酶(OAT)：5′-TGTGTCTGCAGTGCTGTGTG-3′(SEQID NO：23)和5′-AGACACACCTTCCAAGCATC-3′(SEQ ID NO：24)；
鸟氨酸氨甲酰转移酶(OCT)：5′-GGAACAATATCCTGCACTCC-3′(SEQ ID NO：25)和5′-CTGTAATTAATACATTGCCTCC-3′(SEQ IDNO：26)；
苹果酸脱氢酶：5′-GGAGCAGCTGGTCAAATTGC-3′(SEQ IDNO：27)和5′-TCCATGCCTTCCCTTCTTGG-3′(SEQ ID NO：28)；
甘氨酸N-转甲基酶：5′-GCTGGTGGAAGAGGGCTTC-3′(SEQ IDNO：29)和5′-CCTTTGCAGTCTGGCAAGTG-3′(SEQ ID NO：30)；
载脂蛋白E：5′-GTTGCTGGTCACATTCCTGG-3′(SEQ ID NO：31)和5′-TAGGCCTTCAACTCCTTCATG-3′(SEQ ID NO：32)；
谷胱甘肽S-转移酶P2：5′-AGTTCCAGGACGGAGACCTC-3′(SEQ ID NO：33)和5′-CAGGGTCTCAAAAGGCTTCAG-3′(SEQ ID NO：34)；
蛋氨酸腺苷转移酶I：5′-AGTCATCCCTGTGCGCATC-3′(SEQ IDNO：35)和5′-GGTCCACCTTGGTGTAGTC-3′(SEQ ID NO：36)；
二硫键异构酶蛋白：5′-TCTCCAAATACCAGCTCGAC-3′(SEQID NO：37)和5′-CAGGATCTTGCCCTTGAAGC-3′(SEQ ID NO：38)；
腺苷同半胱氨酸酶：5′-GTCCAGCTGCAACATCTTCTC-3′(SEQID NO：39)和5′-CAGTCGTGGTCTCCTCAGAG-3′(SEQ ID NO：40)；
71-kDa热休克蛋白：5′-GATGAAGGAAATTGCAGAAGC-3′(SEQ ID NO：41)和5-CAATAGTGAGGATTGACACATC-3′(SEQ IDNO：42)；
精氨酸酶1：5′-CAGGATTCTCCTGGGTGAC-3′(SEQ ID NO：43)和5′-GATGTAGAGACCTTCTCTG-3′(SEQ ID NO：44)；
硒结合蛋白：5′-CTTCAGCAACTGGCTTGCATG-3′(SEQ ID NO：45)和5′-GCTGAGCTGGATCATCTGAG-3′(SEQ ID NO：46)；
谷氨酰胺合酶：5′-AGCCCAAGTGTGTGGAAGAG-3′(SEQ IDNO：47)和5′-TGCTGGTTGCTCACCATGTC-3′(SEQ ID NO：48)；
谷胱甘肽S-转移酶Mu1：5′-CCTGGAATACACAGACTCAAG-3′(SEQ ID NO：49)和5′-TCTTCTCCTCTTCTGTCTCC-3′(SEQ ID NO：50)。
PCR产物的特异性已经通过变性曲线和电泳进行分析。计算出转录物量并表示为相对于H3F3A组蛋白对照基因(2ΔCt，其中ΔCt代表目标基因与对照基因之间循环数的差异)的相对差异，如先前已经描述的那样(K.J.Livak，T.D.Schmittgen.Analysis of Relative Gene ExpressionData Using Real-Time Quantitative PCR and 2-ΔCt Method(使用实时定量PCR和2-ΔCt方法的相对基因表达数据分析).Methods 2001；25：402-408)。来自5个对照个体的RNA混合物用作该反应的阳性对照，milliQ水用作阴性对照。
生物统计学分析
为了比较对照个体和肝脏疾病患者之间的mRNA水平，所运用的统计学检验是显著值p＜0.05的Mann-Whitney U检验。
结果
1.1 MAT1A-/-小鼠肝脏中HCC的蛋白质组学概况
100％的MAT1A-/-小鼠在18个月大时患上HCC。转变的肝细胞的特征在于它们具有椭圆形的细胞核和突出的核仁。这些肝细胞形成由内皮细胞覆盖的横纹带(trabecular strands)。存在于不同MAT1A-/-小鼠中的肿瘤结节的肉眼分析揭示了其尺寸上的异质性(图1)。
在每一分析组中观察到的蛋白质组学同质性是差异蛋白质组学研究中的一个关键参数。在该研究中，测得WT小鼠之间的差异性(定义为差异条带关于所分析条带总数的百分数)是1％(p＜0.01)。然而，在比较相同MAT1A-/-肝脏的肿瘤结节时，大于10mm损伤中的蛋白质组可变性达到3％(p＜0.01)，而且在比较不同小鼠的结节时达到10％，与肿瘤的大小无关(p＜0.05)。这些数据表明肿瘤生长和个体特异因子可以导致伴随肿瘤转变的蛋白质组不稳定性(图2)。
为了定义与肝癌发生相关的肝脏蛋白质组的改变，用二维电泳和质谱分析18个月大的MAT1A-/-小鼠和WT小鼠的肝脏样品。所有的分析以双份进行，并且被视为有效的唯一差异是在双份样品中表达都相差至少3倍的那些蛋白。将不同小鼠的6个肿瘤结节与WT肝脏样品相比较。在肿瘤结节中检测的所有改变中，鉴别出151种蛋白。为了检验获得的鉴别结果，将根据蛋白序列计算出的理论Mw和pI相对于根据2D凝胶计算出的相应条带的实验Rf作图。如能够从图3观察到的那样，获得了理论和实验参数之间的良好相关性，实验Mw和pI中都有某些偏差，可能是由于翻译后的修饰或蛋白的可选加工。在某些肿瘤中观察到的异常电泳行为的某些实例为：醛脱氢酶(2型)、白蛋白和谷胱甘肽转移酶Mu1。为了证实正确鉴别了这些蛋白，用ESI/MS/MS质谱对它们进行了部分测序。
根据鉴别出的蛋白的亚细胞位置和与它们有关的生物学过程，按照基因本体论(Gene Ontology)(Ashburner M，Ball CA，Blake JA等人.Gene Ontology：Tool for the Unification of Biology(基因本体论：生物学统一的工具).The Gene Ontology Consortium(基因本体论联盟).NatGenet 2000；25：25-9)，使用GARBAN生物计算机程序对它们进行分类。获得的结果如图4所示，在该图中可以观察到鉴别出的蛋白位于线粒体(对于大部分而言)、细胞溶质、细胞骨架、内质网、细胞核及其它亚细胞位置。与鉴别出的蛋白有关的生物学过程包括：对外部刺激的反应、信号转导、细胞组织及生源、代谢(对于大部分而言)和运输。
在鉴别出的151种蛋白中，61.3％的改变与肿瘤中水平减少的蛋白对应，这可能是转变过程中肝细胞进行性去分化(progressivededifferentiation)的结果。虽然观察到了不同分析之间的不一致，但是信号转导、细胞组织、代谢和运输是普遍受影响的生物学功能。分析表明细胞骨架和内质网被损伤，但线粒体是聚集最大量改变的亚细胞器官。MAT1A-/-肝脏中发生的代谢改变的研究表明，如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中的情况，它们大部分与碳水化合物、脂质和氨基酸的代谢有关。此外，观察到了与嘌呤和嘧啶代谢有关的酶表达的增加。该观察结果可能反映出需要通过使细胞增殖合成遗传材料。
为了鉴别与人类HCC相关的蛋白，决定将研究仅集中在在至少50％分析的MAT1A-/-肿瘤中表达发生改变的27种蛋白(表1)。
表1
在至少50％分析的肿瘤结节中的HCC相关改变
蛋白   编码   登录号 功能 例数
蛋氨酸腺苷转移酶   MAT   Q91X83 S-腺苷蛋氨酸(Adomet)合成    6\6
碳酸酐酶III   CAIII   P16015 二氧化碳的可逆水合    6\6
1300018L09 Rik蛋白   Q9DBB8   Q9DBB8 多环碳水化合物分解代谢    5\6
谷氨酰胺合酶   GS   P15105 氮的自身稳定    5\6
硒结合蛋白2   SBP2   Q63836 与硒和醋氨酚结合    5\6
  腺苷同半胱氨酸酶  SAHH   P50247   调节S-腺苷同半胱氨酸的水平   5\6
  抗氧化蛋白2  AOP2   O08709   与细胞的氧化还原调节有关   5\6
  钙调素  SMP30   Q64374   钙的自身稳定   5\6
  载脂蛋白A1  APOA1   Q00623   胆固醇向肝脏的反向运输   4\6
  载脂蛋白E  APOE   P08226   脂蛋白的结合与内化   4\6
  白蛋白  SAP   P07724   调节血液渗透压   4\6
  山梨醇脱氢酶  SDH   Q64442   与多元醇通路有关   3\6
  苯丙氨酸4-羟化酶  P4H   P16331   苯丙氨酸分解代谢   3\6
  苹果酸脱氢酶  MDH   P14152   与Krebs循环有关   3\6
  精氨酸酶1  ARG   Q61176   精氨酸降解(尿素循环)   3\6
  葡萄糖磷酸变位酶  PGM   Q9D0F9   葡萄糖降解/合成   3\6
  鸟氨酸转氨酶  OAT   P29758   控制组织中L-鸟氨酸水平   3\6
  鸟氨酸氨甲酰转移酶  OCT   P00481   参与精氨酸的生物合成   3\6
  甾醇载体蛋白2  NSLT   P32020   运输酰基CoA组   3\6
  甘氨酸N-甲基转移酶  GNMT   Q91WN7   甘氨酸甲基化   3\6
  醇脱氢酶  ADH   Q9JII6   乙醇代谢   3\6
  2810435D12Rik蛋白  Q9CYW4   Q9CYW4   水解酶活性   3\6
  线粒体醛脱氢酶  AdDHm   P44738   与乙醇利用有关   3\6
  谷胱甘肽转移酶  GST Mu1   P10649   疏水性亲电体的解   3\6
  Mu1   毒
  谷胱甘肽转移酶P2   GST P2   P46425   疏水性亲电体的解毒   3\6
  71kDa热休克蛋白   HSC71   P63017   应力蛋白   3\6
  二硫键异构酶蛋白   PDI   P09103   伴侣蛋白，具有氧化还原活性的异构酶   3\6
在所述27种蛋白中，19种减少了它们在MAT1A-/-肝脏中的表达(蛋氨酸腺苷转移酶、碳酸酐酶III、1300018L09 Rik蛋白、谷氨酰胺合酶、硒结合蛋白2、腺苷同半胱氨酸酶、抗氧化蛋白2、钙调素、山梨醇脱氢酶、苯丙氨酸4-羟化酶、苹果酸脱氢酶、精氨酸酶1、葡萄糖磷酸变位酶、鸟氨酸转氨酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶、甾醇载体蛋白2、甘氨酸N-甲基转移酶、醇脱氢酶和2810435D12 Rik蛋白)(图5)。剩余的8种蛋白(谷胱甘肽转移酶P2、71kDa热休克蛋白、载脂蛋白A1和E、白蛋白、2型醛脱氢酶、谷胱甘肽转移酶Mu1和二硫键异构酶蛋白)在分析的肿瘤中增加。其中4种根据新出现的条带分析，所述条带由于观察到pI和Mw都有改变而显示异常电泳行为。由于这些异常异构体可能是因为翻译后修饰而产生，因此不能得出这些蛋白过度表达的结论(图6)。
1.2人类HCC基因表达的分析
为了研究先前在MAT1A-/-小鼠中观察到的改变是否能够视为潜在的人类HCC生物标志物，在各种病因的10个HCC中通过定量PCR技术分析了27种蛋白中23种的水平。蛋氨酸腺苷转移酶和甘氨酸N-转甲基酶的表达减少先前已经在发明者的实验室中证实(MA，Berasain C，Torres L，Martín-Duce A，Corrales FJ，Yang H，Prieto J，LuSC，Caballería J，Rodes J，Mato JM.Reduced ARNm Abundance of theMain Enzymes Involved in Methionine Metabolism in Human LiverCirrhosis and Hepatocellular Carcinoma(人类肝硬化和肝细胞癌中与蛋氨酸代谢有关的主要酶的ARNm丰度减少).J Hepatol 2000；33：907-914)。1300018L09和2810435D12 Rik蛋白没有包括在本研究中，因为它们在数据库中的分配归因于与其它蛋白的序列同源性，因此它们的功能有待实验证实。为了验证设计的引物寡核苷酸，对于人类肿瘤细胞系混合物进行23个RT-PCR反应，并证明它们所有的表达与对照肝脏相比都减少。转录物量表示为相对于H3F3A组蛋白对照基因的相对差异(2ΔCt，其中ΔCt代表目标基因与对照基因之间循环数的差异)。在所有进行的分析中，使用显著值p＜0.05的Mann-Whitney U统计学检验。通过RT-PCR进行的表达分析表明23种蛋白中的13种具有相对于对照组的显著改变。这些蛋白是：醇脱氢酶、抗氧化蛋白2、钙调素、甾醇载体蛋白2、山梨醇脱氢酶、白蛋白、葡萄糖磷酸变位酶、苯丙氨酸4-羟化酶、载脂蛋白A1、碳酸酐酶III、2型醛脱氢酶、鸟氨酸转氨酶和鸟氨酸氨甲酰转移酶。为了研究观察到的改变是否为HCC所独有或是否存在于肿瘤前的阶段如肝硬化中，在没有患肿瘤的酒精性病因(n＝5)和病毒性病因(n＝5)肝硬化患者样品中用RT-PCR分析13种改变的蛋白(表达模式改变的蛋白)的表达水平。表达分析表明13种蛋白中的7种(醇脱氢酶，抗氧化蛋白2，钙调素，甾醇载体蛋白2，山梨醇脱氢酶，白蛋白和葡萄糖磷酸变位酶)的表达在肝硬化患者中相对于对照组发生显著改变。在患病毒性肝硬化和HCC个体的肿瘤周围组织的5个样品中也检测到了这些改变。无论分析的组织是否与肿瘤相关，没有观察到显著差异；因此决定在以后的研究中将病毒性肝硬化患者分成一组(n＝10)。然后，在患HCC并且没有肝硬化的个体的肿瘤周围组织样品中分析13种蛋白的表达。为此，用RT-PCR测量肝炎患者(n＝3)的样品和在健康肝脏上患HCC的患者(n＝7)样品中的表达水平。醇脱氢酶是观察到与对照组(n＝6)有显著表达差异的唯一蛋白。
总之，MAT1A-/-小鼠中HCC的蛋白质组学分析使得能够在至少50％的研究病例中鉴别出27种改变的蛋白(表达模式改变的蛋白)。其中，13种通过定量PCR在人类肝细胞癌中检测到。最后，肿瘤周围硬化或与HCC无关的硬化中13种改变中的7种的鉴别表明这一组潜在生物标志物(图7)不仅在诊断中有用，而且在肿瘤前的阶段的早期检测中也有用。
讨论
WT肝脏蛋白质组和MAT1A-/-小鼠的肿瘤结节的比较使得能够鉴别提供HCC的蛋白质组印迹的151种差异蛋白，为表征肿瘤生物学的某些改变奠定了分子基础。鉴别出的差异蛋白组群中的可变性是肿瘤结节蛋白质组学异质性的反映。此外，观察到61.3％的改变与肿瘤中水平减少的蛋白有关，可能是转变过程中肝细胞的进行性去分化的结果。对于观察到的改变的功能分析表明，在转变肝细胞中有代谢活性的减少和应激反应相关蛋白的增加，这可以视为对AdoMet缺乏所施加的压力的适应。差异蛋白优选位于线粒体、细胞质、内质网和细胞骨架中。尽管在比较差异蛋白或基因时观察到水平的一致性较低，但是代谢和呼吸缺陷以及应激反应构成了使用基因组学或蛋白质组学方法的不同研究共有的HCC的功能概况(Xu XR，Huang J，Xu ZG，QianBZ等人.Insight into Hepatocellular Carcinogenesis at TranscriptomeLevel by Comparing Gene Expression Profiles of HepatocellularCarcinoma with Those of Corresponding Noncancerous Liver(通过比较肝细胞癌与相应非癌肝脏的基因表达谱在转录组水平研究肝细胞癌的发生).Proc Natl Acad Sci USA 2001；98：15089-94；Cynthia RM Yliang，Chon Kar Leow等人.Proteome Analysis of Human HepatocellularCarcinoma Tissues by Two-Dimensional Difference Gel Electrophoresisand Mass Spectrometry(用二维差异凝胶电泳和质谱进行人类肝细胞癌组织的蛋白质组分析).Proteomics 2005；5：2258-2271)，而且因此能够排除它们是在使用的实验性模型中特别生产的。有待解决的是，一旦建立损伤，这些改变简单地代表功能改变，还是它们实际上参与了人类HCC的发病。然而，肝脏代谢的改变和线粒体活性的降低(已被提议为与几类癌症发病机理有关的因素之一)在MAT1A-/-小鼠的肝脏中从出生起就产生，远在疾病的任何表现在组织水平被检测到之前，，这表明它们参与了HCC的发展。
在MAT1A-/-小鼠肝脏中151种改变的蛋白(表达模式改变的蛋白)中，在至少50％分析的肿瘤中检测出27种有差异，并因此被视为潜在的HCC标志物。值得强调的是因其高发生率而选择的该组改变再现了(reproduce)肿瘤的前述功能表现型：其改变代表碳水化合物代谢不足(葡萄糖磷酸变位酶)的代谢酶、氨基酸(精氨酸酶1、鸟氨酸氨甲酰转移酶)、甲基代谢酶(蛋氨酸腺苷转移酶、腺苷同半胱氨酸酶、甘氨酸N-转甲基酶)、脂质代谢和运输(甾醇载体蛋白2、载脂蛋白A1和E)，以及与解毒和应激反应有关的蛋白(71-kDA热休克蛋白、二硫键异构酶蛋白、谷胱甘肽转移酶Mu1和P2的同种异构体)的增加。此外，硒结合蛋白与纤维化和老化有关，因此其减少可能促进肿瘤的发展。山梨醇脱氢酶(SDH)活性的改变已经用作肝脏损伤的指示性参数。MAT1A-/-小鼠的肿瘤结节中SDH的减少与转变的细胞中代谢山梨醇能力的丧失相关。钙调素(也称为衰老标记蛋白)是在肝脏维持内环境稳定和细胞功能中起决定性作用的钙结合蛋白。最后，谷氨酰胺合酶和鸟氨酸转氨酶是与谷氨酸代谢有关的酶，并且其部分地通过Wnt/β-链接素(Wnt/β-catenine)路径的过度表达与肝癌发生相关。在啮齿动物中，已经证实谷氨酰胺合酶阳性表现型有利于肿瘤生长，尽管这一改变在所有的损伤中都没有出现。MAT1A-/-小鼠肿瘤中谷氨酰胺合酶水平的减少可能是肝脏中所述AdoMet缺乏的实验模型的典型特征。然而，本发明者获得的结果不允许排除潜在的翻译后修饰，所述修饰可能产生在所用的分析条件下无法检测的新种类。
具有基因组学和蛋白质组学研究，其中肿瘤周围组织被用作参考以便检测与HCC相关的表达的变化(Kim JW，Ye Q，Forgues M，ChenY等人.Cancer-Associated Molecular Signature in the Tissue Samples ofPatients with Cirrhosis(肝硬化患者组织样品中癌症相关分子标识).Hepatology 2004：39：518-27；Xu XR，Huang J，Xu ZG，Qian BZ等人.Insight into Hepatocellular Carcinogenesis at Transcriptome Level byComparing Gene Expression Profiles of Hepatocellular Carcinoma withThose of Corresponding Noncancerous Liver(通过比较肝细胞癌与相应非癌性肝脏的基因表达谱在转录组水平研究肝细胞癌的发生).ProcNatl Acad Sci USA 2001；98：15089-94；Lim SO，Park SJ，Kim W，ParkSG，Kim HJ等人.Proteome Analysis of Hepatocellular Carcinoma(肝细胞癌的蛋白质组分析).Biochem Biophys Res Commun 2002；291：1031-37；Kim J，Kim SH，Lee SU，Ha GH，Kang DG等人.ProteomeAnalysis of Human Liver Tumour Tissue by Two Dimensional GelElectrophoresis and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation MassSpectrometry for Identification of Disease-Related Proteins(通过用于鉴别疾病相关蛋白的二维凝胶电泳和介质辅助激光脱附/离子化质谱对人类肝脏肿瘤组织进行蛋白质组分析).Electrophoresis 2002；23：4142-4156；Kim W，Lim SO，Ryu YH，Byeon JY等人.Comparison ofProteome between Hepatitis B Virus and Hepatitis C Virus AssociatedHepatocellular Carcinoma(与乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒相关的肝细胞癌之间的蛋白质组比较).Clin Cancer Res 2003；9：5493-5500；Li C，Hong Y，Tan YX，Zhou H，Ai JH等人.Accurate Quality and QuantitativeProteomic Analysis of Clinical Hepatocellular Carcinoma Using LaserCapture Microdissection Coupled with Isotope-Coded Affinity Tag andTwo Dimensional Liquid Chromatography Mass Spectrometry(使用与同位素亲和标签和二维液相色谱质谱相结合的激光捕获显微切割对临床肝细胞癌的精确定性和定量蛋白质组学分析).Mol Cell Proteomics2004；3：399-409；Li C，Tan YX，Zhou H，Ding SJ，Li SJ等人.ProteomicAnalysis of Hepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma：Identification of Potential Tumour Markers(乙型肝炎病毒相关的肝细胞癌的蛋白质组学分析：潜在肿瘤标志物的鉴别).Proteomics 2005；5：1125-1135)。这一策略不会虑及检测非肿瘤部分和肿瘤共有的变化，防止鉴别在肝炎或肝硬化(HCC发展之前的阶段)中其表达最初发生改变的那些蛋白。
已经证明MAT1A-/-小鼠用作人类样品分析之前的筛选系统在鉴别HCC标志物中有效。蛋白质组学复杂性降低到用MAT1A-/-小鼠进行的分析所推论的27种潜在的标志物，其中13种已经通过定量PCR研究在人类HCC中得以证实。仅在肿瘤中观察到鸟氨酸氨甲酰转移酶、鸟氨酸转氨酶、线粒体2型醛脱氢酶、碳酸酐酶III、载脂蛋白A1和苯丙氨酸4-羟化酶的减少，因此可以将它们视为肿瘤转变的标志物。然而，无论分析的组织是否与肿瘤相关，在硬化肝脏中检测到醇脱氢酶、抗氧化蛋白2、钙调素、甾醇载体蛋白2、山梨醇脱氢酶、白蛋白和葡萄糖磷酸变位酶以及蛋氨酸腺苷转移酶和甘氨酸N-甲基转移酶的改变。硬化被视为HCC发展的高危情形，因此，肿瘤中仍具有的这些改变可以代表允许定义肿瘤前期的早期标志物。在健康组织样品或来自HCC肝脏的丙型肝炎病毒或乙型肝炎病毒感染的组织中，这些标志物的分析为阴性，唯一的例外是醇脱氢酶，其先前已经与具有非常不同的病因的肝脏损伤过程相关。总之，本发明描述了潜在的HCC标志物库，一些是早期的，其它的是肿瘤特异性的，所述标志物库可能在监测风险人群和早期检测所述疾病中有极大的用处。
序列表
<110>西玛生物医学信息公司
<120>肝细胞癌的分子标记物及其应用
<130>P1672PC00
<150>ES P200502369
<151>2005-09-29
<160>50
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增醇脱氢酶基因的引物1
<400>1
gatgcctctg attggtctgg                                                            20
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增醇脱氢酶基因的引物2
<400>2
cttggatgtc acaaacagct c                                                          21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增抗氧化蛋白2基因的引物1
<400>3
caactttgag gccaatacca c                                                          21
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增抗氧化蛋白2基因的引物2
<400>4
tccttgctcc aggcaagatg                                                            20
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增衰老标记蛋白30基因的引物1
<400>5
tcaatgatgg gaaggtggat c                                                          21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增衰老标记蛋白30基因的引物2
<400>6
aggtcatagt caaaggcatc c                                                          21
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增非特异性脂质转移蛋白基因的引物1
<400>7
tggctcttgg gtttgagaag                                                            20
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增非特异性脂质转移蛋白基因的引物2
<400>8
catcttggaa ctgggaatac g                                                          21
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增山梨醇脱氢酶基因的引物1
<400>9
atcttcttct  gtgccacgcc                                                           20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增山梨醇脱氢酶基因的引物2
<400>10
gctcccattg ctttggccac                                                            20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增血清白蛋白基因的引物1
<400>11
atgcctgctg acttgccttc                                                            20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增血清白蛋白基因的引物2
<400>12
ctgaggctct tccacaagag                                                            20
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增葡萄糖磷酸变位酶基因的引物1
<400>13
aagaagatcc tctgtgaaga ac                                                         22
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增葡萄糖磷酸变位酶基因的引物2
<400>14
gaatgctgaa gatgttggca g                                                          21
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增苯丙氨酸-4-羟化酶基因的引物1
<400>15
ggtgccactg tccatgagc                                                             19
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增苯丙氨酸-4-羟化酶基因的引物2
<400>16
ggcggtagtt gtaggcaatg                                                            20
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增载脂蛋白A1基因的引物1
<400>17
gacagcggca gagactatg                                                             19
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增载脂蛋白A1基因的引物2
<400>18
ccaccttctg gcggtagag                                                             19
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增碳酸酐酶III基因的引物1
<400>19
tcctgaccac tggcatgaac                                                            20
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增碳酸酐酶III基因的引物2
<400>20
tgctcagagc catgatcatc                                                            20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增线粒体醛脱氢酶基因的引物1
<400>21
gagcagcaac ctcaagagag                                                            20
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增线粒体醛脱氢酶基因的引物2
<400>22
cgaggatctt cttaaactga g                                                          21
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增鸟氨酸转氨酶基因的引物1
<400>23
tgtgtctgca gtgctgtgtg                                                            20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增鸟氨酸转氨酶基因的引物2
<400>24
agacacacct tccaagcatc                                                            20
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增鸟氨酸氨甲酰转移酶基因的引物1
<400>25
ggaacaatat cctgcactcc                                                            20
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增鸟氨酸氨甲酰转移酶基因的引物2
<400>26
ctgtaattaa tacattgcct cc                                                         22
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增苹果酸脱氢酶基因的引物1
<400>27
ggagcagctg gtcaaattgc                                                            20
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增苹果酸脱氢酶基因的引物2
<400>28
tccatgcctt cccttcttgg                                                            20
<210>29
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增甘氨酸N-转甲基酶基因的引物1
<400>29
gctggtggaa gagggcttc                                                             19
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增甘氨酸N-转甲基酶基因的引物2
<400>30
cctttgcagt  ctggcaagtg                                                           20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增载脂蛋白E基因的引物1
<400>31
gttgctggtc acattcctgg                                                            20
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增载脂蛋白E基因的引物2
<400>32
taggccttca actccttcat g                                                          21
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增谷胱甘肽s-转移酶P2基因的引物1
<400>33
agttccagga cggagacctc                                                            20
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增谷胱甘肽s-转移酶P2基因的引物2
<400>34
cagggtctca aaaggcttca g                                                          21
<210>35
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增蛋氨酸腺苷转移酶I基因的引物1
<400>35
agtcatccct gtgcgcatc                                                             19
<210>36
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增蛋氨酸腺苷转移酶I基因的引物2
<400>36
ggtccacctt ggtgtagtc                                                             19
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增二硫键异构酶蛋白基因的引物1
<400>37
tctccaaata ccagctcgac                                                            20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增二硫键异构酶蛋白基因的引物2
<400>38
caggatcttg cccttgaagc                                                            20
<210>39
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增腺苷同半胱氨酸酶基因的引物1
<400>39
gtccagctgc aacatcttct c                                                          21
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增腺苷同半胱氨酸酶基因的引物2
<400>40
cagtcgtggt ctcctcagag                                                            20
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增71-kDa热休克蛋白基因的引物1
<400>41
gatgaaggaa attgcagaag c                                                          21
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增71-kDa热休克蛋白基因的引物2
<400>42
caatagtgag gattgacaca tc                                                         20
<210>43
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增精氨酸酶1基因的引物1
<400>43
caggattctc ctgggtgac                                                             19
<210>44
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增精氨酸酶1基因的引物2
<400>44
gatgtagaga ccttctctg                                                             19
<210>45
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增硒结合蛋白基因的引物1
<400>45
cttcagcaac tggcttgcat g                                                          21
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增硒结合蛋白基因的引物2
<400>46
gctgagctgg atcatctgag                                                            20
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增谷氨酰胺合酶基因的引物1
<400>47
agcccaagtg tgtggaagag                                                            20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增谷氨酰胺合酶基因的引物2
<400>48
tgctggttgc tcaccatgtc                                                            20
<210>49
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增谷胱甘肽s-转移酶Mu1基因的引物1
<400>49
cctggaatac acagactcaa g                                                          21
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>合成DNA
<223>被设计用来扩增谷胱甘肽s-转移酶Mu1基因的引物2
<400>50
tcttctcctc  ttctgtctcc                                                           20

Claims (37)

1.诊断个体中肝细胞癌(HCC)、评价个体的发展HCC的素因、评价个体中所述疾病的进展或确定个体中所述疾病的阶段或严重性的体外方法，其包括：
a)定量所述个体肝脏组织样品中的基因表达水平，其中所述基因选自编码醇脱氢酶(ADH)的基因[ADH基因]、编码抗氧化蛋白2(AOP2)的基因[基因AOP2]、编码钙调素(SMP30)的基因[SMP30基因]、编码甾醇载体蛋白2(NSLT)的基因[NSLT基因]、编码山梨醇脱氢酶(SDH)的基因[SDH基因]、编码白蛋白(SAP)的基因[SAP基因]、编码葡萄糖磷酸变位酶(PGM)的基因[PGM基因]、编码苯丙氨酸-4-羟化酶(P4H)的基因[P4H基因]、编码载脂蛋白A1(APOA1)的基因[APOA1基因]、编码碳酸酐酶III(CAIII)的基因[CAIII基因]、编码2型醛脱氢酶(AdDHm)的基因[30AdDHm基因]、编码鸟氨酸转氨酶(OAT)的基因[OAT基因]、编码鸟氨酸氨甲酰转移酶(OCT)的基因[OCT基因]及上述的组合；和
b)将所述水平与对照样品的所述基因表达水平比较；
其中所述水平相对于对照样品的表达水平的减少提示患有HCC；或者，可选地，
a)定量所述个体的肝脏组织样品中的蛋白水平，其中所述蛋白选自醇脱氢酶(ADH)、抗氧化蛋白2(AOP2)、钙调素(SMP30)、甾醇载体蛋白2(NSLT)、山梨醇脱氢酶(SDH)、白蛋白(SAP)、葡萄糖磷酸变位酶(PGM)、苯丙氨酸-4-羟化酶(P4H)、载脂蛋白A1(APOA1)、碳酸酐酶III(CAIII)、2型醛脱氢酶(AdDHm)、鸟氨酸转氨酶(OAT)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(OCT)及上述的组合；和
b)将所述水平与对照样品的所述蛋白表达水平比较；其中所述水平相对于对照样品的水平的减少提示患有HCC。
2.如权利要求1所述的方法，其包括定量所述基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT中任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种基因的表达水平。
3.如权利要求1所述的方法，其包括定量所述13种基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的表达水平。
4.如权利要求1所述的方法，其包括定量所述蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT中任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种蛋白的水平。
5.如权利要求1所述的方法，其包括定量所述13种蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的表达水平。
6.鉴别和评价HCC治疗效果的体外方法，其包括在相同个体的所述疾病不同阶段或时期或在其治疗或未治疗期间定量蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的水平，和/或基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达水平，并将它们与被视为正常的对照值比较或与相同个体先前的值比较，其中，当治疗剂增加基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达水平，或者蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的水平时，所述治疗剂即成为治疗HCC的候选剂。
7.选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的基因核苷酸序列、用于扩增一种所述基因的特定片断的引物寡核苷酸对或用于鉴别一种所述基因的探针的用途，其用于体外诊断个体的HCC、评价个体的发展HCC的素因、评价个体中所述疾病的进展、确定个体中所述疾病的阶段或严重性或鉴别并评价HCC治疗的效果。
8.选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的蛋白的用途，其用于体外诊断个体的HCC、评价个体的发展HCC的素因、评价个体中所述疾病的进展、确定个体中所述疾病的阶段或严重性或鉴别并评价HCC治疗的效果。
9.能够与选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的蛋白结合的抗体的用途，其用于体外诊断个体的HCC、评价个体的发展HCC的素因、评价个体中所述疾病的进展、确定个体中所述疾病的阶段或严重性或鉴别并评价HCC治疗的效果。
10.选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT、OCT及其组合的基因和/或选自蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT、OCT及其组合的蛋白在筛选、寻找、鉴别、开发治疗HCC的化合物以及评价所述化合物治疗HCC效果中的用途。
11.用于筛选、寻找、鉴别、开发治疗HCC的化合物以及评价所述化合物治疗HCC效果的方法，其包括：(i)将基因表达水平减少的细胞系统与候选化合物接触，和(ii)评价所述基因的表达，这样，如果所述基因的表达增加，则候选化合物是治疗HCC的潜在有用化合物，其中所述基因选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT、OCT及其组合。
12.鉴别个体中肝细胞癌(HCC)发展之前的阶段的体外方法，其包括：
a)定量所述个体肝脏组织样品中的基因表达水平，其中所述基因选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM及其组合；和
b)将所述水平与对照样品的基因表达水平相比较；其中所述水平与对照样品表达水平相比减少提示HCC发展之前的阶段；
或者，可选地，
a)定量来自所述个体肝脏组织样品中的蛋白水平，其中所述蛋白选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM及其组合；和
b)将所述水平与对照样品的蛋白水平相比较；其中所述水平与对照样品水平相比减少提示HCC发展之前的阶段。
13.如权利要求12所述的方法，其包括定量所述基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM中任意1、2、3、4、5、6和7种基因的水平。
14.如权利要求12所述的方法，其包括定量所述7种基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM的水平。
15.如权利要求12所述的方法，其包括定量所述蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM中任意1、2、3、4、5、6或7种蛋白的水平。
16.如权利要求12所述的方法，其包括定量所述7种蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM的表达水平。
17.选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM的基因的核苷酸序列、用于扩增一种所述基因的特定片断的引物寡核苷酸对或用于鉴别一种所述基因的探针的用途，其用于体外鉴别HCC发展之前的阶段。
18.选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的蛋白的用途，其用于体外鉴别HCC发展之前的阶段。
19.能够与选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM的蛋白结合的抗体的用途，其用于体外鉴别HCC发展之前的阶段。
20.选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM及其组合的基因，和/或选自蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM及其组合的蛋白的用途，其用于筛选、寻找、鉴别、开发治疗HCC发展之前的阶段的化合物以及评价所述化合物的治疗效果。
21.用于筛选、寻找、鉴别、开发治疗HCC发展之前的阶段的化合物以及评价所述化合物的治疗效果的方法，其包括：(i)将基因表达水平减少的细胞系统与候选化合物接触，和(ii)评价所述基因的表达，这样，如果所述基因的表达增加，则所述候选化合物是治疗HCC发展之前的阶段的潜在有用化合物，其中所述基因选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM及其组合。
22.药物组合物，其选自包括治疗有效量的增强基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达或增强蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的活性的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物，以及包括治疗有效量的增强基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的表达或增强蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的活性的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物。
23.增强基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达或增加蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的活性的化合物在制备治疗HCC的药物组合物中的用途。
24.增强基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的表达或增加蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的活性的化合物在制备治疗HCC发展之前的阶段的药物组合物中的用途。
25.特异扩增基因的mRNA或cDNA片断的引物寡核苷酸对，其中所述基因选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT。
26.用于鉴别选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的一种或多种基因的探针。
27.能够与选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的蛋白结合的抗体。
28.固体支持物，其选自(i)包括一种或多种探针的固体支持物，所述探针用于鉴别选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的一种或多种基因，和(ii)包括一种或多种抗体的固体支持物，所述抗体能够与选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的蛋白结合。
29.试剂盒，其包括试剂，所述试剂用于检测基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达水平，或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和/或OCT的表达水平。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其包括：
-用于特异性扩增基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的mRNA或它们相应的cDNA片段的一对或多对引物寡核苷酸；和/或
-鉴别一种或多种选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的基因的一种或多种探针；和/或
-能够与选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的蛋白结合或与所述蛋白的包括抗原决定簇的片段结合的一种或多种抗体。
31.如权利要求29或30所述的试剂盒，其包括：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13对引物寡核苷酸，其中每一对引物对一种所述基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT或OCT具有特异性；或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种探针，其中每一种探针能够特异地鉴别一种所述基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT或OCT；或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种抗体，其中每一种抗体具有结合一种所述蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP、PGM、P4H、APOA1、CAIII、AdDHm、OAT和OCT的能力，或结合上述蛋白的包括抗原决定簇的片段的能力。
32.如权利要求29至31任意一项所述的试剂盒，其特征在于，其中所述探针和所述抗体固定到固体支持物上。
33.如权利要求29至32任意一项所述的试剂盒，其用于体外诊断个体的HCC、评价个体发展HCC的素因、评价个体的所述疾病的进展、确定个体的所述疾病的阶段或严重性或鉴别并评价HCC治疗的效果。
34.用于实施鉴别HCC发展之前的阶段的体外方法的试剂盒，其包括检测基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的表达水平或蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的表达水平的试剂。
35.如权利要求34所述的试剂盒，其包括：
-用于特异性扩增基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的mRNA或它们相应的cDNA片段的一对或多对引物寡核苷酸；和/或
-用于鉴别一种或多种选自基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和/或PGM的基因的一种或多种探针；和/或
-能够与选自ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP和PGM的蛋白结合或与所述蛋白的包括抗原决定簇的片段结合的一种或多种抗体。
36.如权利要求34或35所述的试剂盒，其特征在于包括：1、2、3、4、5、6或7对引物寡核苷酸，其中每一对引物对一种所述基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP或PGM具有特异性；或1、2、3、4、5、6或7种探针，其中每一种探针能够特异性鉴别一种所述基因ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP或PGM；或1、2、3、4、5、6或7种抗体，其中每一种抗体具有结合一种所述蛋白ADH、AOP2、SMP30、NSLT、SDH、SAP或PGM的能力，或结合所述蛋白的包括抗原决定簇的片段的能力。
37.如权利要求34至36任意一项所述的试剂盒，其中所述探针和所述抗体固定到固体支持物上。
CNA2006800434979A 2005-09-29 2006-09-28 肝细胞癌的分子标志物及其应用 Pending CN101313220A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP200502369 2005-09-29
ES200502369A ES2324128A1 (es) 2005-09-29 2005-09-29 Metodo para el diagnostico de carcinoma hepatocelular mediante el empleo de marcadores moleculares.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101313220A true CN101313220A (zh) 2008-11-26

Family

ID=37744440

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800434979A Pending CN101313220A (zh) 2005-09-29 2006-09-28 肝细胞癌的分子标志物及其应用

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20090181379A1 (zh)
EP (1) EP1929307A2 (zh)
JP (1) JP2009509517A (zh)
CN (1) CN101313220A (zh)
AU (1) AU2006298765A1 (zh)
BR (1) BRPI0617560A2 (zh)
CA (1) CA2624026A1 (zh)
ES (1) ES2324128A1 (zh)
RU (1) RU2008115312A (zh)
WO (1) WO2007039550A2 (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559850A (zh) * 2010-12-16 2012-07-11 广州益善生物技术有限公司 一种apoA5基因突变检测特异性引物和液相芯片
CN104011543A (zh) * 2011-10-24 2014-08-27 通用医疗公司 癌症的生物标记
CN106337050A (zh) * 2015-07-09 2017-01-18 首都医科大学附属北京佑安医院 肝硬化microRNA分子标志物及其用途
CN107449922A (zh) * 2017-09-07 2017-12-08 中国科学院上海有机化学研究所 一种白蛋白作为实体肿瘤筛查指标的检测方法及应用
CN109735540A (zh) * 2019-01-22 2019-05-10 南京鼓楼医院 SH2D1A基因、sgRNA及其应用
CN110031625A (zh) * 2019-03-31 2019-07-19 苏州市立医院 包含葡萄糖磷酸变位酶5抗体的检测试剂及其应用
CN111742063A (zh) * 2018-07-27 2020-10-02 思勤有限公司 肝细胞癌筛查
US11142800B2 (en) 2010-10-07 2021-10-12 The General Hospital Corporation Biomarkers of cancer

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2281201B1 (en) 2008-05-14 2018-03-28 ETH Zurich Method for biomarker and drug-target discovery for prostate cancer diagnosis and treatment as well as biomarker assays determined therewith
WO2010127417A2 (en) * 2009-05-05 2010-11-11 Katholieke Universiteit Leuven Hepatocellular carcinoma
CN102741426B (zh) * 2009-09-11 2015-03-25 香港中文大学 用于评估肝病变的方法
WO2012100027A2 (en) * 2011-01-19 2012-07-26 University Of Florida Research Foundation, Inc. Epigenetic biomarkers for liver disease
CN102901829B (zh) * 2012-09-13 2014-07-16 首都医科大学附属北京佑安医院 检测调钙素水平的elisa试剂盒及方法
MX357018B (es) * 2013-12-18 2018-06-05 Instituto Nac De Medicina Genomica Método de diagnóstico temprano de carcinoma hepatocelular.
US10264976B2 (en) 2014-12-26 2019-04-23 The University Of Akron Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging
US20180002702A1 (en) 2014-12-26 2018-01-04 Nitto Denko Corporation Methods and compositions for treating malignant tumors associated with kras mutation
US10792299B2 (en) 2014-12-26 2020-10-06 Nitto Denko Corporation Methods and compositions for treating malignant tumors associated with kras mutation
KR101652721B1 (ko) * 2016-07-19 2016-08-31 부산대학교 산학협력단 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 조성물
CN107102147B (zh) * 2017-04-05 2019-09-13 北京蛋白质组研究中心 Thbs2蛋白检测物在制备肝细胞癌预后评估试剂盒中的应用
KR102424255B1 (ko) * 2020-10-30 2022-07-22 경북대학교 산학협력단 인간 유방암 및 동물 유선암의 진단 및 악성도 평가를 위한 바이오마커로서 smp30의 용도

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2284162T3 (es) * 1995-02-27 2007-11-01 Dsm Ip Assets B.V. D-sorbitol dehidrogenasa.
JP2002355046A (ja) * 2001-05-29 2002-12-10 Kikkoman Corp ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びソルビトールデヒドロゲナーゼの製造法
DE10136273A1 (de) * 2001-07-25 2003-02-13 Sabine Debuschewitz Molekulare Marker beim hepatozellulären Karzinom
WO2003033643A2 (en) * 2001-10-15 2003-04-24 Pfizer Products Inc. Three dimensional crystal structure of human sorbitol dehydrogenase and uses thereof
US20030228563A1 (en) * 2002-06-11 2003-12-11 Sang Henry W. System and method for creating and evaluating learning exercises
CN1268769C (zh) * 2004-04-21 2006-08-09 浙江大学 乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11142800B2 (en) 2010-10-07 2021-10-12 The General Hospital Corporation Biomarkers of cancer
CN102559850A (zh) * 2010-12-16 2012-07-11 广州益善生物技术有限公司 一种apoA5基因突变检测特异性引物和液相芯片
CN104011543A (zh) * 2011-10-24 2014-08-27 通用医疗公司 癌症的生物标记
CN104011543B (zh) * 2011-10-24 2016-06-15 通用医疗公司 癌症的生物标记
CN106337050A (zh) * 2015-07-09 2017-01-18 首都医科大学附属北京佑安医院 肝硬化microRNA分子标志物及其用途
CN107449922A (zh) * 2017-09-07 2017-12-08 中国科学院上海有机化学研究所 一种白蛋白作为实体肿瘤筛查指标的检测方法及应用
CN111742063A (zh) * 2018-07-27 2020-10-02 思勤有限公司 肝细胞癌筛查
CN109735540A (zh) * 2019-01-22 2019-05-10 南京鼓楼医院 SH2D1A基因、sgRNA及其应用
CN109735540B (zh) * 2019-01-22 2022-05-31 南京鼓楼医院 SH2D1A基因、sgRNA及其应用
CN110031625A (zh) * 2019-03-31 2019-07-19 苏州市立医院 包含葡萄糖磷酸变位酶5抗体的检测试剂及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0617560A2 (pt) 2011-07-26
WO2007039550A2 (en) 2007-04-12
WO2007039550A3 (en) 2007-08-09
EP1929307A2 (en) 2008-06-11
AU2006298765A1 (en) 2007-04-12
US20090181379A1 (en) 2009-07-16
JP2009509517A (ja) 2009-03-12
CA2624026A1 (en) 2007-04-12
ES2324128A1 (es) 2009-07-30
RU2008115312A (ru) 2009-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101313220A (zh) 肝细胞癌的分子标志物及其应用
Chen et al. A review: proteomics in nasopharyngeal carcinoma
Chen et al. Proteomic profiling of pancreatic cancer for biomarker discovery
Diamandis Cancer biomarkers: can we turn recent failures into success?
Sleno et al. Proteomic methods for drug target discovery
Hardesty et al. Protein signatures for survival and recurrence in metastatic melanoma
Shao et al. Comprehensive analysis of individual variation in the urinary proteome revealed significant gender differences*[S]
Wright et al. Mass spectrometry-based expression profiling of clinical prostate cancer
Reymond et al. Proteomics in cancer
Nie et al. Advanced mass spectrometry‐based multi‐omics technologies for exploring the pathogenesis of hepatocellular carcinoma
Drake et al. Serum, salivary and tissue proteomics for discovery of biomarkers for head and neck cancers
Xie et al. Novel proteomic strategy reveal combined α1 antitrypsin and cathepsin D as biomarkers for colorectal cancer early screening
BRPI0709374A2 (pt) técnica de obtenção de impressão digital de apolipoproteìna e métodos relacionados á mesma
Nair et al. Proteomic research: potential opportunities for clinical and physiological investigators
Uto et al. Clinical proteomics for liver disease: a promising approach for discovery of novel biomarkers
Duangkumpha et al. Discovery and qualification of serum protein biomarker candidates for cholangiocarcinoma diagnosis
Ramasamy et al. Proteomics in uveal melanoma
Diamond et al. HepatoProteomics: applying proteomic technologies to the study of liver function and disease
Baranova et al. The role of genomics and proteomics: technologies in studying non-alcoholic fatty liver disease
Downes et al. Application of proteomic strategies to the identification of urinary biomarkers for prostate cancer: a review
Kim et al. Recent advances in proteomic profiling of pancreatic ductal adenocarcinoma and the road ahead
Doustjalali et al. Two dimensional gel electrophoresis: An overview of proteomic technique in cancer research
Yokoo et al. Protein expression associated with early intrahepatic recurrence of hepatocellular carcinoma after curative surgery
Kondo et al. Application of 2D-DIGE in cancer proteomics toward personalized medicine
Alsaleh et al. Mapping of population disparities in the cholangiocarcinoma urinary metabolome

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20081126