WO2005075638A1 - 遺伝子検出電界効果デバイスおよびこれを用いた遺伝子多型解析方法 - Google Patents

遺伝子検出電界効果デバイスおよびこれを用いた遺伝子多型解析方法 Download PDF

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WO2005075638A1
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nucleic acid
gene
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acid probe
effect device
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PCT/JP2005/001987
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Yuji Miyahara
Toshiya Sakata
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National Institute For Materials Science
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Publication date
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention of this application relates to a gene detection field effect device and a method for analyzing a gene polymorphism using the device. More specifically, the invention of this application provides a new method that enables high-sensitivity and high-accuracy gene detection and analysis, and enables a gene polymorphism analysis system to be smaller and less costly than before.
  • the present invention relates to a gene detection field effect device and a method for analyzing a gene polymorphism using the device. Background art
  • nucleotide sequence information With the decoding of the entire nucleotide sequence of the human genome being completed and the sequencing of the genome nucleotide sequences of other organisms progressing rapidly, vast amounts of nucleotide sequence information are being accumulated. By elucidating the functions of genes in living organisms based on these genomic base sequence information, the development of gene-related technologies in a wide range of fields, such as diagnosis of various diseases, development of pharmaceuticals, and breeding of agricultural crops, has jumped. It is thought that it progresses. The basis for the development of these new fields is gene expression and function information in addition to nucleotide sequence information.
  • a DNA chip or a DNA microarray (both collectively referred to as a DNA microarray) has been developed as a technology for analyzing gene functions and gene expression on a large scale and developing it into genetic testing.
  • a DNA microarray uses fluorescence detection as a basic principle, and therefore require a laser and a complicated optical system, and have a problem that the system is large and expensive.
  • most DNA microarrays currently being developed are based on the detection of double-stranded DNA based on hybridization, and the selectivity of the reaction is not very high, so there was a problem with the accuracy of gene polymorphism analysis. .
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 are examples of Non-Patent Documents.
  • Non-Patent Document 3 a method for detecting a hybridization reaction by measuring oxidation / reduction current at a metal electrode using Ferrocenylnaphthalene Diimide as an electrochemically active labeling agent.
  • Non-Patent Document 4 a drug efficacy test system for hepatitis C has been developed using a current detection type DNA chip. This method does not require expensive lasers or complicated optical systems, so a simple and compact system can be constructed.
  • the oxidation / reduction reaction on the metal electrode is used as the basic principle of detection, so that an oxidized substance or a reduced substance (for example, ascorbic acid) exists in the sample. Then, a current based on oxidation or reduction flows, and there is a problem that the detection accuracy is deteriorated because it interferes with gene detection.
  • the electrode reaction proceeds on the metal electrode with the current measurement. Electrode reactions are irreversible and non-equilibrium reactions that can cause electrode corrosion, gas generation, etc., which can lead to detachment of immobilized nucleic acids or impair the stability of current measurement. There was a problem that accuracy deteriorated.
  • Non-patent Document 5 discloses an attempt to detect hybridization of DNA using a field effect device. This utilizes the fact that DM molecules have a negative charge in a solution, and uses the electric field effect to detect a change in charge due to hybridization. However, since the DNA probe formed on the substrate originally has a negative charge, the hybridization of the target gene The change in charge due to the application was small and could not be distinguished from non-specific adsorption. In addition, single nucleotide polymorphism
  • Non-patent document 1 Nature Biotechnology, vol. 16, p27-31, 1998
  • Non-patent document 2 Nature Biotechnology, vol. 16, ⁇ 40-44, 1998
  • Non-patent document 3 Anal. CheE, 72, pl334-1341, 2000
  • Non-patent document 4 Intervirology, 43, pl24-127, 2000
  • Non-patent document 5 J. Phys. Cem. B., 101, p2980-2985, 1997 Disclosure of the invention
  • the invention of this application was made in view of the circumstances described above, and it is possible to detect and analyze a gene with high sensitivity and high accuracy, and furthermore, a gene polymorphism analysis system. It is an object of the present invention to provide a new gene detection field-effect device capable of reducing the size and cost of the device, and a method for analyzing a gene polymorphism using the device.
  • the invention of this application provides the following inventions (1) to (9) as means for solving the above problems.
  • a gene detection field effect device provided with an insulating film body, a semiconductor substrate, and a reference electrode, comprising:
  • the insulating film body has a nucleic acid probe immobilized on one side thereof and is in contact with a sample solution containing at least one kind of target gene;
  • a gene detection field effect device comprising: (2) At least two or more of the gene detection field effect devices described in (1) above are provided, and the nucleotide sequence of the gene of interest is complementary to the base sequence of the target gene on the insulating film of each of the gene detection field effect devices.
  • a gene detection field-effect device wherein at least two types of nucleic acid probes are immobilized, including a lobe and a mutant nucleic acid probe having a base sequence not complementary to the base sequence of the target gene;
  • the base at the non-immobilized end where the nucleic acid probe is not immobilized on the insulating film is different from the base at the non-immobilized end of the wild-type nucleic acid probe.
  • the nucleic acid probe is at least one selected from the group consisting of an oligonucleotide, a complementary DNA (cDNA) and a peptide nucleic acid (PNA).
  • the gene detection electric field according to any one of (1) to (3) Effect device;
  • the metal electrode is at least one selected from the group consisting of platinum, gold, silver, palladium, titanium and chromium;
  • Taq DNA polymerase which is an enzyme in the extension reaction, and deoxyadenosine triphosphate (dATP), which is a substrate
  • dGTP ciguanosine triphosphate
  • dCTP deoxycytidine triphosphate
  • dTTP deoxythymidine triphosphate
  • step (9) The measurement of the output value in step (e) is based on the first gene detection field-effect device on which the wild-type nucleic acid probe is immobilized and the third on which the nucleic acid probe is not immobilized on the insulating film.
  • the differential output value VI from the gene detection field effect device is measured, and the difference between the second gene detection field effect device on which the mutant nucleic acid probe is immobilized and the third gene detection field effect device is measured.
  • Measure the differential output value V2 pattern where VI is greater than V2 (V1> V2), pattern where VI and V2 are comparable
  • V1 V2
  • VKV2 V2
  • FIG. 1 is a cross-sectional view schematically illustrating one embodiment of the gene detection field effect device of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph schematically illustrating the detection principle of the gene detection field effect device of FIG.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view schematically showing one example of a gene detection field effect transistor using the gene detection field effect device of the invention of this application.
  • FIG. 4 is a graph schematically illustrating the detection principle of the gene detection field effect transistor of FIG.
  • FIG. 5 shows a nucleic acid probe having a single nucleotide difference immobilized in a gene detection field effect transistor comprising the gene detection field effect device according to the invention of the present application.
  • FIG. 2A is a cross-sectional view schematically illustrating a state in which the gene detection field-effect transistor has a wild-type nucleic acid probe fixed thereto, and
  • FIG. 3 shows an effect transistor.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view schematically illustrating each of the elongation reactions in the gene detection field-effect transistor of FIG. 5, and (A) shows a gene detection field-effect transistor having a wild-type nucleic acid probe immobilized thereon. (B) shows a gene detection field-effect transistor to which the mutant nucleic acid probe is immobilized.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view schematically illustrating a state in which a nucleic acid probe is immobilized via a metal electrode in a gene detection field effect device including the gene detection field effect device of the invention of the present application.
  • () Shows a gene-detecting field-effect transistor having a wild-type nucleic acid probe immobilized thereon, and
  • (B) shows a gene-detecting field-effect transistor having a mutant nucleic acid probe immobilized thereon.
  • FIG. 8 is a cut-away view schematically illustrating a state in which an intensifier is reacted with a nucleic acid probe in FIG. 7, and (A) is a gene detection field effect in which a wild-type nucleic acid probe is immobilized. Transistors, and ( ⁇ ) indicate a gene detection field-effect transistor to which a mutant nucleic acid probe is immobilized.
  • FIG. 9 is a cross-sectional view schematically illustrating a state in which a heater and a temperature sensor are integrated in a gene detection field-effect transistor including the gene detection field-effect device according to the invention of the present application. is there.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view schematically illustrating an embodiment in which gene detection field-effect transistors comprising the gene detection field-effect device of the invention of the present application are arrayed.
  • FIG. 11 is a schematic diagram schematically illustrating the overall configuration of a measurement system using the gene detection field effect device of the invention of the present application.
  • FIG. 12 is a cross-sectional view schematically illustrating a flow cell on which the gene detection field effect device of the invention of the present application is mounted.
  • FIG. 13 is an explanatory diagram schematically illustrating a measurement protocol using the gene detection field effect device of the invention of the present application.
  • symbol in a figure has shown the following.
  • Insulating film 2 0 Thermally conductive material
  • the feature of the invention of this application is that the gene detection field-effect device of the invention of this application is combined with a molecular biological reaction to form a monosalt between two genes. Detect and analyze differences in groups, ie, gene polymorphism or single nucleotide polymorphism
  • SNP Single Nucleotide Polymorphism
  • FIG. 1 is a cross-sectional view schematically illustrating one embodiment of the gene detection field effect device of the present invention.
  • the gene detection field-effect device (1A) of the invention of this application includes at least a rising film (2), a semiconductor substrate (3), and a reference electrode (4).
  • a nucleic acid probe (5) is immobilized and is in contact with a sample solution (6) containing at least the target gene.
  • This nucleic acid probe (5) has a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the target gene, which can bind to and hybridize with the target gene (described below) to be detected and analyzed.
  • the semiconductor device has a structure characterized in that a semiconductor substrate (3) is provided on the other surface side of the insulating film body (2).
  • the material of the semiconductor substrate (3) is not particularly limited as long as it has the function, and for example, P-Si4 (silicon), germanium, or the like can be used.
  • a reference electrode (4) is provided in a sample solution (6), and is electrically connected to a semiconductor substrate (3).
  • a gate electrode (7) may be provided to apply a voltage.
  • the form and length of the nucleic acid probe (5) is not particularly limited as long as it can bind to the target gene to be detected and analyzed and can be detected and analyzed. It is preferable to use natural oligonucleotides, artificial oligonucleotides, cDM fragments, peptide nucleic acids and the like. As for the length, it is usually preferable that it is composed of not more than 300 bases, When an artificial oligonucleotide is used, it is more preferably a nucleic acid fragment consisting of 80 or less bases.
  • the insulating film material (2) is silicon dioxide (Si0 2), silicon nitride (SiN or Si 3 N 4), aluminum oxide (A1 2 0 3), tantalum oxide (Ta 2 0 5) a material such as single, or, it that can be used in combination, because usually with good keeping the electrical characteristics of the semiconductor substrate (3) front surface, on the silicon oxide (Si0 2), silicon nitride (SiN), acid ⁇ aluminum ( A1 2 0 3), it is preferable that the tantalum oxide (Ta 2 0 5) two layers by laminating or the like structure.
  • one end of the nucleic acid probe (5) is connected to an amino group (NH 2 group), a thiol group (SH group), Chemical modification with biotin, etc.
  • an amino group NH 2 group
  • a thiol group SH group
  • Chemical modification with biotin etc.
  • the surface of the insulating film (2) is chemically modified with aminopropylethoxysilane, polylysine, or the like, and the surface of the insulating film (2) is modified.
  • An amino group is introduced and reacted with dalaldehyde or phenylenediisocyanate (PDC), and the nucleic acid probe (5) chemically modified with the above amino group is immobilized on the surface of the insulating film (2).
  • PDC dalaldehyde or phenylenediisocyanate
  • nucleic acid probe (5) chemically modified with a thiol group When a nucleic acid probe (5) chemically modified with a thiol group is immobilized on the surface of the insulating film (2), a gold thin film is formed on the insulating film (2), and the affinity between the thiol group and gold is The nucleic acid probe (5) can also be immobilized by using the method. Furthermore, when immobilizing a nucleic acid probe chemically modified with biotin (5), streptavidin is introduced into the surface of the insulating membrane (2), and the affinity of biotin and streptavidin is used to immobilize the nucleic acid. The probe (5) is immobilized on the surface of the insulating film (2).
  • a solution containing the nucleic acid probe (5) is dropped or spotted only on the surface of the insulating film (2), and the functional groups on the insulating film (2) are removed. And immobilize the nucleic acid probe (5).
  • the nucleic acid probe (5) may be immobilized via a metal electrode.
  • the metal electrode for example, platinum, gold, silver, palladium, titanium, chromium and the like can be used.
  • the sample solution (6) contains many genes including the target gene to be detected and analyzed. Then, as described above, the nucleic acid probe (5) having a complementary nucleotide sequence to the nucleotide sequence of the target gene is used as a gene detection field effect device.
  • the double strand is formed by binding. Can be.
  • reagents eg, TaQ polymerase dATP, dGTP, dCTP, dTTP, etc.
  • the gene detection field effect device (1A) is introduced.
  • a temperature control such as a heating operation and / or a cooling operation
  • only a double-stranded sample formed by hybridizing the target gene and the nucleic acid probe (5) can be efficiently subjected to an extension reaction.
  • a gene that is not the target gene contained in the sample solution (6) cannot be double-stranded with the immobilized nucleic acid probe (5) to form a double strand. Is not promoted.
  • the temperature control means in the above-described gene detection field effect device (1A) for example, as illustrated in FIG. 9 described later, by integrating a heater (15) and a temperature sensor (16), hybridization is performed. And the reaction temperature of the extension reaction can be controlled to the optimum value, and the hybridization and extension reaction of the gene detection field effect device (1 A) on the insulating film (2) can be performed with high accuracy. Can be.
  • the nucleic acid is negatively charged. Therefore, as described above, the elongation reaction is promoted by the formation of a double strand, so that the negative charge on the surface of the insulating film body (2) increases, and as a result, the semiconductor substrate made of silicon or the like is formed by electrostatic interaction. (3) Carriers on the surface, that is, electrons (8) Density changes. By detecting the electrical signal associated with the change in electron (8) density, SNP analysis can be performed with high sensitivity and high accuracy.
  • the output value of the gene detection field-effect device (1A) of the invention of the present application depends on the pH of this buffer, and a significant difference is observed particularly when the pH is 7 or less.
  • the pH is preferably set to 4 or less.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram showing an example in which a gear density change on the surface of a semiconductor substrate is detected as a change in capacitance of a gene detection field effect device.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating a state of change in capacitance-voltage characteristic when superimposed and applied.
  • V G a change in V G, a depletion layer capacitance of the semiconductor substrate surface changes, the total capacitance one C c to be measured, the depletion layer capacitance of the capacitor and the semiconductor substrate surface of the insulating film material Since this is a sum, the characteristic shown by reference symbol A in the figure is obtained.
  • the voltage at which the energy band in the silicon of the semiconductor substrate becomes flat is called a flat band voltage, and is an index for characterizing the capacitance-voltage characteristic.
  • V F1 be the flat band voltage of the capacitance-sound voltage characteristic indicated by reference symbol A.
  • the shift amount of the flat band voltage V F V F3 -V F1 (arrow E) becomes an index of the change in the charge density due to the elongation reaction, and when only the hybridization is performed. Since the shift amount is larger than the shift amount, high-sensitivity measurement becomes possible.
  • Figure 3 shows the source and drain near the surface of p-type silicon (P-Si), which is the semiconductor substrate (3), in the gene detection field-effect device (1A) illustrated in Figure 1.
  • a gene detection field effect device (1A) which comprises a gene detection field effect transistor (1B) by providing a source n-type region (9) and a drain n-type region (10), is schematically illustrated. It is sectional drawing.
  • the gene detection field effect transistor (1B) is sometimes simply referred to as the gene detection field effect device (1A).
  • the current ID between the drain n-type region (10) is measured by the drain ammeter (12).
  • the nucleic acid probe (5) has the surface of the insulating film (2) between the source n-type region (9) and the drain n-type region (10) (hereinafter, this region is referred to as “gate insulating film region (201)”). Sometimes fixed).
  • negative charges on the surface of the gate insulating film region (201) increase due to the formation of a double strand by hybridization, and as a result, the electrostatic interaction causes a reduction in the surface of the semiconductor substrate surface.
  • the density of electrons (8) changes, and the resulting electrical signal is detected.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram showing an example of detecting a change in carrier density on the surface of a semiconductor substrate as a change in a gate voltage v G -drain current ID characteristic of a gene detection field effect device.
  • Source while applying a constant voltage V D to drain, by electrostatic interaction when a negative voltage is applied to the gate voltage, a few career from the p-type semiconductor substrate surface electron is eliminated, majority carriers Certain holes accumulate.
  • the gate voltage V G When applying the gate voltage V G of sufficient magnitude sources, n-type region of the drain is connected to a layer of the induced electrons on the surface of a semiconductor substrate, and the drain current I D flows out indicates conductivity has high Become.
  • the gate voltage V G at which the drain current I D starts to be flow called the threshold voltage V T, V G - serves as an index characterizing the I D characteristics.
  • the gate voltage V G in the positive direction the electron density of the semiconductor substrate surface is increased, the drain current I D increases. Therefore, the characteristic shown by the symbol A 'in Fig. 4 is obtained, and the threshold voltage at this time is set to V.
  • the shift amount of the threshold value voltage AV T V T2 - V T1 ( arrow D ') is dependent on the charge density change of the gate insulating film material region surface, by measuring .DELTA..nu tau,
  • the length of the double strand becomes longer and the negative charge on the surface further increases. Therefore, one ID characteristic further shifts in the positive direction, and the code C ′ in FIG.
  • FIG. 5 shows a gene detection field-effect device (1B) consisting of the gene detection field-effect device (1A) of the invention of the present application.
  • different nucleic acid probes (5) are immobilized on each of the gene detection field effect devices (1B), and are hybridized with the target gene (601).
  • FIG. 2 is a cross-sectional view illustrating an example, in which (A) is a state in which a nucleic acid probe (wild type) having a nucleotide sequence completely complementary to the nucleotide sequence of the target gene is immobilized, and (B) is a nucleotide sequence of the target gene.
  • A is a state in which a nucleic acid probe (wild type) having a nucleotide sequence completely complementary to the nucleotide sequence of the target gene is immobilized
  • (B) is a nucleotide sequence of the target gene.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view schematically showing a state in which the extension reaction is promoted in the example of FIG. 5, (A) is a state in which the target gene and the nucleic acid probe are extended, (B) shows a state in which the extension reaction between the target gene and the nucleic acid probe is stopped.
  • the basic configuration in FIGS. 5 and 6 is substantially the same as the example in FIG. As shown in FIGS.
  • the invention of this application includes at least two or more gene detecting field effect transistors (1B) as described above, and each of the gene detecting field effect transistors (1B)
  • each of the gene detecting field effect transistors (1B) By using a gene-detection field-effect transistor (1B) in which at least two types of nucleic acid probes (5) are immobilized on an insulating film (2), SNP analysis can be performed with high sensitivity and high sensitivity. Can be performed with precision.
  • the at least two types of nucleic acid probes (5) include a wild-type (normal type) nucleic acid probe (501) having a base sequence complementary to the base sequence of the target gene (601) to be analyzed;
  • the nucleotide sequence of the target gene (601) means a mutant nucleic acid probe (502) having a non-complementary nucleotide sequence.
  • the end opposite to the immobilized end (503), which is the end where the nucleic acid probe (5) is immobilized on the insulating film (2) The base at the non-immobilized end (504) where the nucleic acid probe (5) is not immobilized is different from the base at the non-immobilized end (504) of the wild-type nucleic acid probe (501).
  • the base at the non-immobilized end (504) of the mutant nucleic acid probe (502) is “G”, and the base of the target gene corresponding to this position is “T”. Therefore, the bond stops halfway and cannot form a double strand.
  • the base at the non-immobilized end (504) of the wild-type nucleic acid probe (501) is “ ⁇ ”, which has a close relationship with the base “ ⁇ ” of the target gene corresponding to this position. Can combine to form a double strand.
  • the sample solution (6) containing the nucleotide sequence of the target gene (601) is introduced onto the insulating film (2) of the field effect device (1B) composed of the gene detection field effect device (1A), After hybridization, unreacted target gene (601) is washed with a buffer solution or the like.
  • the increase in negative charge due to the nucleic acid elongation reaction and the resulting signal can detect the phenomenon of hybridization with a large signal-to-noise ratio (SN ratio).
  • SN ratio signal-to-noise ratio
  • the genotype (ie, SNP) of the target gene (601) to be analyzed can be analyzed by comparing the outputs of the respective gene detection field effect devices (1A).
  • the selectivity of hybridization is improved.
  • Tm dissociation temperature
  • the specificity of the reaction can be further increased, and more precise SNP analysis can be performed. This is because the hybridization with the mismatched mutant nucleic acid probe (502) having the mutation at the end is not sufficiently bound due to the low affinity between bases, resulting in an extension reaction. Because it does not happen.
  • the wild type nucleic acid probe of Furumatsu (501) the bases at the non-immobilized ends surely form double strands by hydrogen bonding, so that an elongation reaction occurs and the negative charge increases.
  • the electron (8) density on the semiconductor surface changes due to the electrostatic interaction, and the SNP can be analyzed with high accuracy by measuring the change in the electrical characteristics accompanying the change.
  • the method of analyzing a gene polymorphism in the invention of this application uses the first gene-detecting field-effect transistor (1B) (1B) to which the wild-type nucleic acid probe (501) is immobilized.
  • the differential output value V2 with the transistor is measured.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view schematically illustrating a state in which the nucleic acid probe (5) is fixed to the insulating film body (2) via the metal electrode (13) in the invention of this application.
  • the metal electrode (13) can use platinum, gold, silver, palladium, titanium, chromium, etc., and thereby, the electrical characteristics accompanying the density change of the electrons (8) Can be detected with higher accuracy.
  • FIG. 8 is a cutaway view schematically illustrating a state in which the intercalator (14) is reacted in the invention of this application.
  • the intercalator (14) reacts only with double-stranded nucleic acids and ionizes in solution, and becomes positively charged.
  • the wild-type nucleic acid probe (501) which has been elongated by the extension reaction, reacts more with the double-stranded nucleic acid of the immobilized gene detection field-effect transistor (1B).
  • a signal change is obtained. This signal change is detected.
  • the intercalator (14) for example, Hoechst 33258 ethidium bromide, cyber green, pico green, etc. can be used.
  • FIG. 9 is a perspective view schematically illustrating another embodiment of the invention of this application.
  • the basic configuration and the like are substantially the same as the examples shown in FIG. 3, FIG. 5, or FIG.
  • a heater is formed as an n-type region for the heater as a temperature control means for accelerating the elongation reaction of the nucleic acid.
  • Gene-detection field-effect transistor (1B) has a wild-type nucleic acid probe on the gate insulating film region (201).
  • the heater (15) and the temperature sensor (16) were operated to set and control the sample temperature near the semiconductor substrate (3) to 45 during the hybridization and 62 during the extension reaction. In this way, by integrating the heater (15) and the temperature sensor (16) as temperature control means in the gene detection field-effect transistor (1B), the temperature during hybridization and extension reaction can be optimized. It can be set to a value, and more accurate measurement can be performed.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view schematically illustrating a configuration in which the embodiment of FIG. 9 is formed into an array and a plurality of SNP analyzes can be performed.
  • each semiconductor substrate (3) on which the gene detection field-effect transistor (1B) is formed is made to correspond to the dissociation temperature of the nucleic acid probe (5). It is installed on one surface of the insulating film (19) so that heat can be set at an appropriate temperature, and heat is efficiently dissipated through the insulating film (19). Furthermore, in order to reduce the temperature crosstalk between each semiconductor substrate (3) and to enable independent temperature control, each gene detection field is made of a thermally conductive substance (20) such as silicon or polysilicon. It has a structure surrounding the effect transistor (1B) (silicon substrate (18)), and dissipates heat efficiently through the heat conductive material (20).
  • an opening (21) is provided in the insulating film body (19), and the insulating film body of the gene detecting field effect transistor (1B) is provided. Align so that (19) matches opening (21). Furthermore, by providing a Peltier element (23) bonded to the copper plate (22) on the back surface of the copper plate (22), the accuracy of temperature control can be improved and the time for cooling can be reduced.
  • a gene detection field-effect transistor array (1C) having such a structure, high-precision analysis can be performed in parallel even for multiple SNPs, and a high-throughput analysis system can be constructed. Can be.
  • FIG. 11 is a conceptual diagram schematically showing an example of a measurement system using the gene effect field effect device (1A) in the invention of this application.
  • the invention of this application mounts the gene detection field effect device (1A) (or the gene detection electric field ⁇ ! Transistor) having the above-mentioned features on the flow cell (24).
  • a buffer (28) and a washing liquid (29) are connected to the flow path (25) via a valve (30), and a pump (31) is driven to drive the buffer (28) and the washing liquid ( 29) can be introduced into the flow cell (24).
  • the sample (26) and the enzyme tack DNA polymerase (Tad DNA polymerase) for the extension reaction and the reagents (27) such as dATP, dGTP, dCTP, and dTTP serving as substrates are valved (30) with a dispenser (32).
  • the gene detection field-effect device (1A) (gene-effect field effect transistor).
  • the used liquid is sent to the waste liquid bottle (33) by the pump (31).
  • An Ag-AgCl electrode is used as the reference electrode (34), and a 3M KC1 solution (35) is passed through it and connected to the flow path (25) downstream of the flow cell (24), and the liquid-liquid bonding (36 ), And electrically connected to the gene detection field-effect device (1A) (field-effect transistor for gene detection). Then, the output of the gene detection field effect device (1A) (field effect transistor for gene detection) after the reaction is processed / calculated by the signal processing circuit (37).
  • FIG. 12 is a diagram schematically illustrating the structure of the flow cell (24) illustrated in FIG. Mount the field effect device (1A) for gene detection on the printed circuit board (38) in the flow cell (24), and connect it electrically to the printed circuit board (38) with the wire (39). Pins (40) are provided on the printed circuit board (38), and are connected to the signal processing circuit (37) illustrated in Fig. 11.
  • the sample solution is passed through the flow path (25) to the field effect device for gene detection ( 1A) (or a field effect transistor for gene detection) Protective cap (41) on the wire (39) so that the sample solution does not come into contact with the wire (39) that is the signal conducting wire.
  • the material of the protective cap (41) is not particularly limited as long as it has an insulating property, but, for example, acrylic, polypropylene, poly-polypropylene, etc. are suitable. Is preferred.
  • the measurement system using the field effect device for gene detection (1A) of this configuration is a flow-type measurement, it can automatically process a large number of samples automatically and continuously. Effective for measurement.
  • polymorphism for example, single nucleotide polymorphism (SNP), microsatellite polymorphism
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • microsatellite polymorphism microsatellite polymorphism
  • the Factor VII gene one of the blood coagulation genes, has multiple single nucleotide polymorphisms (SNPs). It is known that the wild-type (normal) SNP at the -122 site, one of them, is thymine (T) or mutant cantocin (C). In order to detect the SNP at the Factor VII gene-122 site, two types of nucleic acid probes each composed of 11 bases corresponding to the wild type and the mutant type were synthesized. Their base sequences are as follows: SEQ ID NO: 1 shows a wild-type nucleic acid probe, and SEQ ID NO: 2 shows a mutant-type nucleic acid probe.
  • Wild-type nucleic acid probe 5'-CGTCCTCTGAA-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • the nucleic acid probe was synthesized such that the base at the SP site was located at the 3 ′ end of the nucleic acid probe. That is, the base at the 3 ′ end is adenine (A) in the wild-type nucleic acid probe and guanine (G) in the mutant nucleic acid probe.
  • the other nucleotide sequences are the same for both the wild type and the mutant type, and can be hybridized to the Factor VII gene to be detected.
  • an amino group was modified on the 5 ′ end side of the above nucleic acid probe, and immobilized on the surface of the gate insulating film body region.
  • the gate insulating film of the gene detection field-effect transistor in this example is modified with silicon nitride, and the surface is chemically modified with aminopropyltriethoxysilane to form amino groups on the surface of the nitride semiconductor substrate. Introduced. By reacting the amino group of the nucleic acid probe and the amino group of the silicon nitride with a bifunctional reagent such as, for example, glutaraldehyde, a nucleic acid probe is formed to form a bond with a Schiff base, thereby converting the nucleic acid probe into a nitride semiconductor substrate. Immobilized on the surface.
  • a bifunctional reagent such as, for example, glutaraldehyde
  • the wild-type nucleic acid probe is immobilized on the surface of the gate insulating film of one gene detection field-effect transistor, and the mutant nucleic acid probe is The sample was immobilized on the surface of the gate insulating membrane region of the gene-detection field-effect transistor and amplified in advance by the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the sample extracts the human genome from leukocytes in blood, amplifies a 20-base long region containing the above SNP site, and introduces it into a gene-detection field-effect transistor on which a wild-type nucleic acid probe and a mutant nucleic acid probe are immobilized. Then, we performed high staff dilution at 45 for 8 hours. After hybridization, unreacted sample was removed by washing with a buffer.
  • the nucleotide sequence of the wild-type nucleic acid probe was completely complementary to the nucleotide sequence of the wild-type sample, it was completely complementary-strand-bonded, including the SNP site, to form double-stranded DNA.
  • the mutant nucleic acid probe since the base at the 3 'end is guanine (G), the base is not complementary to the base thymine (T) on the wild-type sample nucleic acid, so the 3' end is open. In this way, a double-stranded DM was formed. Therefore, the wild-type nucleic acid probe and the mutant nucleic acid Since the base sequences differ from each other, the dissociation temperatures (Ti) of the two differ, and by controlling the hybridization temperature, it was possible to increase the selectivity for duplex formation.
  • An extension reaction was performed.
  • the gene-detection field-effect transistor, in which the wild-type nucleic acid probe is immobilized
  • nucleic acid probes were designed so that the base at the 3 'end would be the SNP site, and the wild-type and mutant nucleic acid probes were respectively immobilized on the gate insulating film of the gene detection field-effect transistor. Then, the SNP of the gene in the sample solution can be detected by performing hybridization with the sample solution containing the target gene and then performing the extension reaction.
  • wild-type and mutant nucleic acid By comparing the magnitude of the change in the output of the gene-detected field-effect transistor with the immobilized gene, the homozygote of the wild type, the heterozygote of the wild type and the mutant type (lieterozygote), and the mutant type are compared. Thus, it was confirmed that the homozygote could be identified and the genotype could be detected.
  • Example 2 Detection of SNP in Factor VII gene
  • Example 1 a peptide nucleic acid (Peptide) was used as the nucleic acid probe immobilized on the gate insulating film body region of the gene detection field-effect transistor.
  • PNA Nucleotide Acid
  • the basic characteristics are almost the same as those in the case of the above-mentioned Example 1, but a peptide nucleic acid (PNA) was used as a nucleic acid probe.
  • PNA peptide nucleic acid
  • the output of the transistor immobilized with the wild-type PNA probe changed by 23 mV
  • the output of the transistor immobilized with the mutant-type PM probe changed by 4 mV. Met.
  • the output of the gene detection transistor with immobilized wild-type and mutant-type PNA probes is 15 mV and 13 mV, respectively. Both mutants could be detected.
  • the output of the gene-detection field-effect transistor on which the wild-type PNA probe was immobilized showed almost no change of 2 mV, whereas the mutant PNA probe immobilized it.
  • the output of the transformed gene-detection field-effect transistor was a 19 mV change.
  • a wild-type homozygote, a mixed heterozygous mixture of a wild-type and a mutant, and a mutant homozygote can be identified, and the genotype (genotype) of the target gene can be identified. ) Can be detected.
  • the completion of the reaction can be detected from the change in potential, and SNP detection and dienotyping can be performed efficiently.
  • the synthesis of bases associated with the extension reaction is detected as an increase in electric charge. Can be detected.
  • Example 3 Detection of SNP in alcohol dehydroginase-related gene It is known that alcohol nucleotide ligase has a single nucleotide polymorphism (SNP).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the nucleic acid probe was designed so that the SNP site would be the 3 'terminal base.
  • the base at the SNP site is thymine (T)
  • C cytosine
  • the nucleotide sequences of the corresponding nucleic acid probes are shown below.
  • the wild-type nucleic acid probe in this example is shown in SEQ ID NO: 3
  • the mutant nucleic acid probe is shown in SEQ ID NO: 4.
  • Wild-type nucleic acid probe 5'-CATACACTA-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Mutant nucleic acid probe 5 '-CATACACTG-3' (SEQ ID NO: 4)
  • the basic configuration and the experimental procedure are substantially the same as those of the first and second embodiments.
  • the wild-type nucleic acid probe shown in FIG. 7A was immobilized, and the mutant nucleic acid probe shown in FIG.
  • the obtained gene detection field effect transistor was used.
  • the nucleic acid probe is formed by forming a metal electrode on the gate insulating film body of the gene detection field effect transistor, modifying the 5 ′ end of the nucleic acid probe with a thiol group, and directly forming a bond with the metal electrode.
  • a structure in which gold was laminated on a chromium thin film was used as a metal electrode.
  • the sample is obtained by extracting the human genome from leukocytes in blood, amplifying a 100-base length region including the above SNP site, and introducing it into a gene detection field-effect transistor on which a wild-type or mutant nucleic acid probe is immobilized. We performed hybridization at 45 for 8 hours. After hybridization, unreacted sample was removed by washing with a buffer.
  • the sample used in this example was a sample containing only a wild-type target gene, a double strand was formed by perfect complementary strand binding with the wild-type nucleic acid probe.
  • the mutant nucleic acid probe did not bind to the complementary strand due to the presence of the SNP at the 3 'end, and formed a double strand with the 3' end open.
  • a mixture of (Taa DNA polymerase) and dATP, dGTP, dCTP, and dTTP as substrates was introduced into the sample, and the temperature was set at 62 to perform an extension reaction on the gate insulating film. Then, in the gene detection field-effect transistor on which the wild-type nucleic acid probe is immobilized, as described above, by introducing a sample containing only the wild-type target gene, a double strand of a completely complementary strand including the termini is formed. The extension reaction was accelerated, and the output showed a change of 28 mV. On the other hand, in the gene-detection field-effect transistor in which the mutant nucleic acid probe was immobilized, the elongation reaction did not occur and the output hardly changed (3 mV Change).
  • This embodiment is characterized in that an intercalator that reacts with a double-stranded nucleic acid is introduced after the extension reaction. Yuichi Intercurry says in a molecular biology experiment It is generally used as a photopigment. Many intercalated molecules ionize in solution and become positively charged.
  • the intercalation in the invention of the present application utilized the property of electric charge instead of the property of pigment.
  • Hoechst33258 was used as an intercalator.
  • each of the wild-type and mutant nucleic acid probes measures the output potential of the immobilized gene detection field-effect transistor, and Hoeclist33258 is placed on the gate insulating film. And reacted.
  • Hoeclist33258 which is an intercalator, reacts only with the double-stranded nucleic acid and reacts more with the double-stranded nucleic acid of the wild-type transistor that has been elongated by the extension reaction. Thus, a large signal change was obtained.
  • the output potential of the wild-type transistor changed by 27 mV, and the output potential of the mutant transistor was 6 mV.
  • SP detection and genotype discrimination of three types of samples that is, wild-type Z wild-type homozygous, mutant Z-mutant homozygous, and wild-type heterozygous heterozygous can be performed.
  • intercalation has a positive charge, so it can be used for hybridization and extension of negatively charged nucleic acids. This is the point of outputting a signal of the opposite polarity to the output change based on this. Since the intercalator reacts only with the double-stranded nucleic acid, it does not react nonspecifically with the single-stranded nucleic acid adsorbed on the gate insulating film, and the signal based on the hybridization / extension reaction and the non- By separating the signal of the single-stranded nucleic acid specifically adsorbed, it is possible to selectively detect only the signal based on the hybridization-extension reaction. This makes it possible to detect SNPs and genotypes with a high signal / noise ratio (S / ratio). Industrial applicability
  • the invention of this application enables high-sensitivity and high-accuracy gene detection and analysis, and makes it possible to reduce the cost of the gene polymorphism analysis system by making it smaller than before. it can.

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Abstract

絶縁膜体(2)、半導体基板(3)および参照電極(4)が備えられている遺伝子検出電界効果デバイスであって、以下の構成:(a)絶縁膜体(2)は、その一方の面側に核酸プローブ(5)が固定化されているとともに、少なくとも1種類の検出解析の目的遺伝子(601)が含まれる試料溶液(6)に接触されていること;(b)半導体基板(3)は、前記絶縁膜体(2)の他方の面側に当接設置されていること;および(c)参照電極(4)は、前記試料溶液(6)中に備えられていること;を含んでなることを特徴とする。

Description

明 細 書 遺伝子検出電界効果デパイスおよびこれを用いた遺伝子多型解析方法 技術分野
この出願の発明は、 遺伝子検出電界効果デバイスおよびこれを用いた遺伝子 多型解析方法に関するものである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 高感 度、 かつ、 高精度に遺伝子の検出解析が可能であり、 しかも、 遺伝子多型解析 システムを従来よりも小型でコストをも抑えることのできる、 新しい遺伝子検 出電界効果デバイスおよびこれを用いた遺伝子多型解析方法に関するものであ る。 背景技術
ヒトゲノムの全塩基配列解読が終了し、 他の生物のゲノム塩基配列解読が急 速に進展する中、 膨大な塩基配列情報が蓄積されつつある。 これらのゲノム塩 基配列情報をもとに、 生体中における遺伝子の機能を明らかにすることにより、 各種疾病の診断、 医薬品の開発、 農作物の品種改良など広範囲な分野で遺伝子 関連技術の開発が飛躍的に進むものと考えられる。 これらの新規分野発展の基 礎となるのが、 塩基配列情報に加えて、 遺伝子の発現および機能情報である。 遺伝子の機能および遺伝子の発現解析を大規模に行い、 遺伝子検査へ発展させ る技術として、 DNAチップあるいは DNAマイクロアレイ （以下、 両者を総称して DNAマイクロアレイとする） が開発されている。 しかし、 現状の DNAマイクロア レイの多くは、 蛍光検出を基本原理としているので、 レーザや複雑な光学系シ ステムが必要となり、 システムが大型化して高価であるという問題があった。 また、 現在開発されているほとんどの DNAマイクロアレイは、 ハイブリダィ ゼーションに基づく二本鎖 DNAの検出を基本原理としており、 反応の選択性が あまり高くないため、 遺伝子多型解析の精度に問題があった。 特に医療の分野 では、 テーラ一メイド医療の実現には、 遺伝子多型、 もしくは、 一塩基多型 (Single Nucleotide Polymorphism, S P；以下、 SNPと略記することがある） を高精度に、 かつ、 簡便に検出する必要がある。 したがって、 簡便性と高精度 化の両方を満足させる技術が求められている。
これらの問題を解決する方法として、 酸化 ·還元標識と組み合わせた電流検 出方式の DNAマイクロアレイがいくつか報告されている。 たとえば、 分子ワイ ヤーと称する分子の一端を金属電極上に固定化し、 他端に核酸プローブを結合 させ、 目的遺伝子とのハイブリダィゼーションに基づく酸化 ·還元標識と金属 電極の電子の授受を電流変化として検出して、 目的遺伝子を検出する方式が開 発されている （非特許文献 1および非特許文献 2 ) „
また、 電気化学的活性のある標識剤として、 Ferrocenylnaphthalene Diimide を用いて、 金属電極における酸化 ·還元電流を計測することにより、 ハイプリ ダイゼーシヨンを検出する方式が開発されている （非特許文献 3 ) 。 さらに、 電流検出方式 DNAチップを用いて、 C型肝炎の薬効検査システムが開発されてい る （非特許文献 4) 。 この方式では、 高価なレーザや複雑な光学系システム等 を必要としないため、 簡単で小型のシステムを構築することができる。
しかしながら、 これら非特許文献 1から 4の方式の場合は、 金属電極上での 酸化 ·還元反応を検出の基本原理としているため、 試料中に酸化物質あるいは 還元物質 （たとえば、 ァスコルビン酸等） が存在すると、 酸化、 または、 還元 に基づく電流が流れてしまい、 遺伝子検出の妨害となつて検出の精度が劣化す るという問題があった。 また、 電流計測に伴い、 金属電極上で電極反応が進行 する。 電極反応は、 不可逆で非平衡反応であるため電極の腐食、 ガスの生成等 が生じて、 固定化した核酸の剥離や電流測定の安定性が損なわれたりするので、 特に繰返し測定する場合に検出精度が劣化するという問題があった。
さらにまた、 電界効果デパイスを用いて、 DNAのハイブリダィゼーシヨンを検 出する試みも報告されている (非特許文献 5 )。 これは、 DM分子が溶液中で負電 荷を有していることを利用し、 電界効果を利用してハイプリダイゼーションに よる電荷変化を検出するものである。 しかしながら、 基板上に形成される DNA プローブはもともと負電荷を有しているため、 目的遺伝子のハイプリダイゼ一 ションによる電荷の変化分ば小さく、 非特異的な吸着との区別ができないなど 遺伝子検査のためには高感度化、 精度向上が課題であった。 また、 一塩基多型
(SNP) のように 2つの遺伝子間における、 わずかの違い （一塩基の違い） を検 出するには、 感度および精度 （選択性） が共に悪く、 困難であった。
非特許文献 1 ： Nature Biotechnology, vol. 16, p27-31, 1998 非特許文献 2 : Nature Biotechnology, vol. 16, ρ40-44, 1998 非特許文献 3 ： Anal. CheE , 72, pl334-1341, 2000
非特許文献 4： Intervirology, 43, pl24-127, 2000
非特許文献 5 ： J. Phys. C em. B.， 101, p2980-2985, 1997 発明の開示
そこで、 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであ つて、 高感度、 かつ、 高精度に遺伝子の検出、 解析が可能であり、 しかも、 遺 伝子多型解析システムを従来よりも小型でコストをも抑えることのできる、 新 しい遺伝子検出電界効果デバイスおよびこれを用いた遺伝子多型解析方法を提 供することを課題としている。
この出願の発明は、 上記の課題を解決する手段として、 以下の（1)から（9)の 発明を提供する。
(1) 絶縁膜体、 半導体基板および参照電極が備えられている遺伝子検出電界効 果デバイスであって、 以下の構成：
( a) 絶縁膜体は、 その一方の面側に核酸プローブが固定化されているととも に、 少なくとも 1種類の目的遺伝子が含まれる試料溶液に接触されているこ と；
( b ) 半導体基板は、 前記絶縁膜体の他方の面側に当接設置されていること； および
( c ) 参照電極は、 前記試料溶液中に備えられていること；
を含んでなることを特徴とする遺伝子検出電界効果デバイス； (2) 上記（1)記載の遺伝子検出電界効果デバイスが、 少なくとも 2つ以上備えら れており、 かつ、 これら遺伝子検出電界効果デバイスそれぞれの絶縁膜体上に は目的遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列を有する野生型 （正常型） 核酸プ
•ローブと、 目的遺伝子の塩基配列と非相補的な塩基配列を有する変異型核酸プ ローブの少なくとも 2種類以上の核酸プローブが固定化されてなることを特徴 とする遺伝子検出電界効果デバイス；
(3) 変異型核酸プローブは、 核酸プローブが絶縁膜体上に固定化されていない 端部である非固定化端部における塩基が、 野生型核酸プローブの非固定化端部 における塩基と異なっている（2)記載の遺伝子検出電界効果デバイス；
(4) 核酸プローブは、 オリゴヌクレオチド、 相補的 DNA (cDNA) およびペプチド 核酸 (PNA) からなる群より少なくとも 1種類以上が選択される（1)から（3)いず れか記載の遺伝子検出電界効果デバイス；
(5) 核酸プローブは、 金属電極を介して固定化されている（1)から（4)いずれか 記載の遺伝子検出電界効果デバイス；
(6) 金属電極は、 白金、 金、 銀、 パラジウム、 チタンおょぴクロムからなる群 より少なくとも 1種類以上が選択される（5)記載の遺伝子検出電界効果デバィ ス；
(7) ヒーターおよび温度センサが、 さらに集積化されている（1)から（6)いずれ か記載の遺伝子検出電界効果デバイス；
(8) 上記（1)から（7)いずれか記載の遺伝子検出電界効果デバイスを用いて、 遺 伝子多型を解析する方法であって、 以下のステップ：
( a ) 絶縁膜体に固定化されている核酸プローブと少なくとも目的遺伝子が含 まれている試料溶液とを接触させることにより、 絶縁膜体上で前記核酸プロ一 ブと前記目的遺伝子とをハイブリダィズさせるステップ；
( b ) 洗浄液を絶縁膜体上に導入して、 未反応の前記目的遺伝子を除去するス テツプ；
( c ) 伸長反応における酵素であるタック DNAポリメラーゼ （Tad DNA polymerase) および基質となるデォキシアデノシン三リン酸 （dATP) 、 デォキ シグアノシン三リン酸 (dGTP) 、 デォキシシチジン三リン酸 （dCTP) 、 デォキ シチミジン三リン酸 （dTTP) を絶縁膜体上に導入して伸長反応を行うステツ プ；
(d) 洗浄液を絶縁膜体上に導入して、 未反応の酵素および基質を除去するス テツプ；および
( e ) 緩衝液を絶縁膜体上に導入して、 遺伝子検出電界効果デバイスの出力値 を測定するステップ；
を含むことを特徵とする遺伝子多型解析方法；および
(9) ステップ （e ) の出力値の測定は、 野生型核酸プローブが固定化されてい る第 1の遺伝子検出電界効果デバィスと絶縁膜体上に核酸プローブが固定化さ れていない第 3の遺伝子検出電界効果デパイスとの差動出力値 VIを測定し、 ま た、 変異型核酸プローブが固定化されている第 2の遺伝子検出電界効果デパイ スと前記第 3の遺伝子検出電界効果デバィスとの差動出力値 V2を測定し、 VIが V2より大きいパターン （V1>V2) 、 VIと V2とが同程度であるパターン
(V1=V2) および VIが V2より小さいパターン （VKV2) の 3種類のパターンに 分類して表示する（8)記載の遺伝子多型解析方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスの一実施形態を模式 的に例示した断面図である。
図 2は、 図 1の遺伝子検出電界効果デバイスの検出原理を概略的に例示した グラフ図である。
図 3は、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスによる遺伝子検出電 界効果トランジスタの一例を模式的に示した断面図である。
図 4は、 図 3の遺伝子検出電界効果トランジスタの検出原理を概略的に例示 したグラフ図である。
図 5は、 この出願の発明による遺伝子検出電界効果デバイスからなる遺伝子 検出電界効果トランジス夕において、 一塩基異なる核酸プローブが固定化され ている状態を模式的に例示した断面図であり、 （A) は野生型核酸プローブが固 定された遺伝子検出電界効果トランジスタを、 （B) は変異型核酸プローブが固 定された遺伝子検出電界効果トランジスタを示している。
図 6は、 図 5の遺伝子検出電界効果トランジスタにおけるそれぞれの伸長反 応の状態を模式的に例示した断面図であり、 （A) は野生型核酸プローブが固定 された遺伝子検出電界効果トランジスタを、 （B) は変異型核酸プローブが固定 された遺伝子検出電界効果トランジスタを示している。
図 7は、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスからなる遺伝子検出 電界効果デバイスにおいて、 金属電極を介して核酸プローブを固定化させた状 態を模式的に例示した断面図であり、 （A) は野生型核酸プローブが固定された 遺伝子検出電界効果トランジスタを、 （B) は変異型核酸プローブが固定された 遺伝子検出電界効果卜ランジス夕を示している。
図 8は、 図 7において、 イン夕一力レーターを核酸プローブに反応させた状 態を模式的に例示した斬面図であり、 （A) は野生型核酸プローブが固定された 遺伝子検出電界効果トランジスタを、 （Β) は変異型核酸プローブが固定された 遺伝子検出電界効果トランジスタを示している。
図 9は、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスからなる遺伝子検出 電界効果デバイスからなる遺伝子検出電界効果トランジス夕にヒ一ターと温度 センサを集積化した状態を模式的に例示した断面図である。
図 1 0は、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスからなる遺伝子検 出電界効果トランジスタをアレイ化した実施形態を模式的に例示した断面図で ある。
図 1 1は、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスを用いた測定シス テムの全体構成を模式的に例示した概略図である。
図 1 2は、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスを搭載するフロー セルを模式的に例示した断面図である。
図 1 3は、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスによる測定プロト コルの概略的に例示した説明図である。 なお、 図中の符号は次のものを示している。
1 A 遺伝子検出電界効果デバイス
1 B、 1 B ' 遺伝子検出電界効果トランジスタ
1 C 遺伝子検出電界効果卜ランジス夕アレイ
2 絶縁膜体
2 0 1 ゲー卜絶縁膜体領域
3 半導体基板
参照電極
5 核酸プローブ
5 0 1 野生型核酸プローブ
5 0 2 変異型核酸プローブ
5 0 3 固定化端部
5 0 4 非固定化端部
6 試料溶液
6 0 1 目的遺伝子
7 ゲ ト電極
8 電子
9 ソース 11型領域
1 0 ドレイン n型領域
1 1 ドレイン電極
1 2 ドレイン電流計
1 3 金属電極
1 4 インター力レ一ター
1 5 ヒーター
1 6 温度センサ
1 7 ゥエル
1 8 シリコン基板
1 9 絶縁膜体 2 0 熱伝導性物質
2 1 開口部
2 2 銅板
2 3 ペルチェ素子
2 4 フローセル
2 5 流路
2 6 Βϊζ料
2 7 試
2 8 緩衝液
2 9 洗浄液
3 0 バルブ
3 1 ポンプ
3 2 分注器
3 3 廃液ボトル
3 4 参照電極
3 5 3Μ KC1溶液
3 6 液-液接合
3 7 信号処理回路
3 8 プリント基板
3 9 ワイヤ一
4 0 ピン
4 1 保護キャップ 発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は上記のとおりの特徵をもつものであるが、 以下にその実施 の形態について詳しく説明する。
この出願の発明の特長は、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスと 分子生物学的反応とを組み合わせることにより、 2つの遺伝子間における一塩 基の違いを検出 ·解析、 すなわち、 遺伝子多型、 もしくは、 一塩基多型
(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) の検出 ·解析を高感度に、 しかも高 精度に行うことができることである。 以下に、 図 1から図 13に沿って、 この 出願の発明の遺伝子検出電界効果デバィスとこれを用いた高精度な SNP解析の 方法を説明する。
図 1は、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスにおける一実施形態 を模式的に例示した断面図である。
図 1に示したとおり、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイス （1 A) は、 少なくとも騰膜体 (2) 、 半導体基板 (3) 、 参照電極 (4) が備 えられている。
絶縁膜体 (2) の一方の表面側には、 核酸プローブ （5) が固定化されてい るとともに、 少なくとも前記目的遺伝子を含む試料溶液 (6) と接触されてい る。 この核酸プローブ （5) は、 検出'解析の対象である目的遺伝子 （後述） と結合 ひ、イブリダィズ） することのできる、 目的遺伝子の塩基配列と相補的 な塩基配列を有している。 また、 絶縁膜体 (2) の他方の表面側には、 半導体 基板 (3) が設置されていることを特徴とした構造を有している。 なお、 半導 体基板 (3) は、 その機能を有するものであれば材質は特に制限されるもので はなく、 たとえば、 P- Si4 (シリコン） 、 ゲルマニウム等を使用することができ る。
また、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイス （1A) では、 試料溶 液 （6) の中に参照電極 (4) が備えられており、 半導体基板 (3) と電気的 に接続されている。 そして、 必要に応じてゲート電極 (7) を設け、 電圧 を 印加することもできる。
核酸プローブ （5) については、 検出 ·解析の対象とする目的遺伝子と結合 し、 検出 '解析することができるのであれば、 その形態や長さ等は、 特に制限 されるものではないが、 たとえば、 天然オリゴヌクレオチド、 人工オリゴヌク レオチド、 cDM断片、 ペプチド核酸等を用いることが好ましい。 長さについて は、 通常 300個以下の塩基から構成されていることが好ましく、 特に天然また は人工ォリゴヌクレオチドを使用する場合は、 80個以下の塩基からなる核酸断 片であることがより好ましい。
上記絶縁膜体 (2) は、 二酸化シリコン （Si02) 、 窒化シリコン （SiNまたは Si3N4) 、 酸化アルミニウム （A1203) 、 酸化タンタル （Ta205) 等の材料を単独、 または、 これらを組み合わせて用いることができ、 通常は半導体基板 (3) 表 面の電気的特性を良好に保っため、 酸化シリコン （Si02) の上に、 窒化シリコン (SiN) 、 酸^アルミニウム （A1203) 、 酸化タンタル （Ta205) 等を積層して二層 構造とすることが好ましい。
上記絶縁膜体 （2) 表面に摔酸プローブ （5) を固定化するためには、 まず、 核酸プローブ （5) の一端をァミノ基 （NH2基） 、 チォ一ル基 （SH基） 、 ビォチ ン等で化学修飾する。 たとえば、 ァミノ基で化学修飾した核酸プローブ （5) を用いる場合は、 絶縁膜体 （2) の表面をァミノプロピルエトキシシラン、 ポ リリジン等で化学修飾して、 絶縁膜体 (2) 表面にアミノ基を導入し、 ダル夕 ルアルデヒドやフエ二レンジイソシァネート （PDC) と反応させ、 前記のァミノ 基で化学修飾した核酸プローブ （5) を絶縁膜体 (2) 表面に固定化する。
また、 チオール基で化学修飾した核酸プローブ （5) を絶縁膜体 （2) 表面 に固定化する場合は、 絶縁膜体 (2) 上に金薄膜を形成させ、 チオール基と金 との親和性を利用して、 核酸プローブ （5) を固定化することもできる。 さら にまた、 ピオチンで化学修飾した核酸プローブ （5) を固定化する場合は、 絶 縁膜体 （2) 表面にストレプトアビジンを導入し、 ピオチンとストレプトアビ ジンの親和性を利用して、 核酸プローブ （5) を絶縁膜体 （2) 表面に固定化 する。
実際の核酸プローブ （5) の固定化に際しては、 絶縁膜体 (2) 表面にのみ 核酸プロ一ブ （5) を含む溶液を滴下、 または、 スポットし、 絶縁膜体 (2) 上の官能基と化学反応を行わせて核酸プローブ （5) を固定化する。 なお、 核 酸プローブ （5) は、 金属電極を介して固定化されていてもよい。 金属電極と しては、 たとえば、 白金、 金、 銀、 パラジウム、 チタン、 クロム等を使用する ことができる。 試料溶液 （6) 中には、 検出 '解析の対象となる目的遺伝子を含む多数の遺 伝子が含まれている。 そして、 上記のとおり、 この目的遺伝子の塩基配列と相 補的塩基配列を有する核酸プローブ （5) が、 遺伝子検出電界効果デバイス
(1A) の絶縁膜体 (2) 上に固定化されていることにより、 適切な反応条件 の下で目的遺伝子と核酸プローブ （5) が結合 ひ、イブリダィズ） されて二本 鎖を形成させることができる。
そして、 さらに、 遺伝子の伸長反応を行うための試薬類 （TaQポリメラ一ゼゃ dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP等） を試料溶液 (6) に導入するとともに、 遺伝子検 出電界効果デバイス （1A) に加熱操作および/または冷却操作等の温度コン トロールを施すことにより、 前記目的遺伝子と核酸プローブ （5) とがハイプ リダイズして形成された二本鎖サンプルのみを効率よく伸長反応させることが できる。 つまり、 試料溶液 （6) 中に含まれる目的遺伝子ではない遺伝子とは、 固定化された核酸プローブ （5) とは八イブリダィズして二本鎖を形成するこ とができないため、 当然に伸長反応は促進されることはない。
上記の遺伝子検出電界効果デバイス （1A) における温度コントロール手段 としては、 たとえば、 後述の図 9の例示したとおり、 ヒーター （15) および 温度センサ （16) を集積化することで、 ハイブリダィゼーシヨンおよび伸長 反応の反応温度を最適値に制御することができ、 遺伝子検出電界効果デバィス (1 A) の絶縁膜体 (2) 上でのハイブリダィゼーシヨンおよび伸長反応を高 精度に行わせることができる。
そして、 反応に用いる緩衝溶液の pHの適切な条件下では、 核酸は負に帯電し ている。 したがって、 上記のとおり二本鎖形成して伸長反応が促進されること により、 絶縁膜体 (2) 表面の負電荷が増大し、 その結果、 静電的相互作用に よりシリコン等からなる半導体基板 (3) 表面におけるキャリア、 すなわち電 子 （8) 密度が変化する。 この電子 (8) 密度の変化に伴う電気的信号を検出 することで、 高感度で、 高精度に SNPの解析を行うことができる。
なお、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイス （1A) の出力値は、 この緩衝液の pHに依存しており、 特に pHが 7以下であるときには有意な差が 得られ、 また、 高い信号 Z雑音比 （S/N比） を得るためには、 この pHを 4以下 とすることが好ましい。
図 2は、 半導体基板表面のギヤリァ密度変化を遺伝子検出電界効果デバイス のキャパシタンス一の変化として検出する一例を示した概念図である。
この図 2は、 参照電極と半導体基板 （シリコン） の電気的端子をキャパシ夕 ンスメーターに接続し、 Vc電圧を掃引しながら数へルツから 1メガヘルツまで の周波数の微小 （50mV程度） 電圧を重畳させて印加時における、 キャパシタン ス一一電圧特' の変化の状態を例示している図である。
p型シリコンを用いる場合は、 VGの変化により、 半導体基板表面の空乏層容量 が変化し、 測定される全キャパシタンス一 Ccは、 絶縁膜体の容量と半導体基板 表面の空乏層容量との和となるため、 図中の符号 Aに示した特性となる。 半導 体基板のシリコン中のエネルギーバンドがフラットになる電圧をフラットバン ド電圧といい、 キャパシタンス一電圧特性を特徵付ける指標になる。 そして、 符号 Aで示しているキャパシ夕ンスー電圧特性のフラットバンド電圧を VF1とす る。 絶縁膜体表面で核酸プローブと目的遺伝子がハイブリダィズして二本鎖を 形成すると、 表面の負電荷密度が増大するので、 キャパシタンス一電圧特性は 電圧軸に沿って正方向にシフトし、 図中の符号 Bに示した特性となる。 この時 のフラットバンド電圧を とすると、 フラットパンド電圧のシフト量 AVF=VF2 -VF1 (矢印 D) は、 絶縁膜体表面の電荷密度変化に依存するので、 AVFを測定す ることにより、 ハイブリダィゼーシヨンを評価することができる。
さらに、 絶緣膜表面で、 DMの伸長反応を行わせると、 二本鎖の長さが長くな るため表面の負電荷がさらに増大する。 つまり、 キャパシタンス一電圧特性は さらに正方向にシフトし、 図中の符号 Cに示した特性になる。 そして、 この時 のフラットパンド電圧を とすると、 フラットパンド電圧のシフト量厶 VF=VF3 -VF1 (矢印 E) は、 伸長反応による電荷密度変化の指標になり、 ハイブリダィゼ —シヨンのみの時のシフト量よりも大きいため、 高感度測定が可能になる。 図 3は、 図 1に例示した遺伝子検出電界効果デバイス （1 A) において、 半 導体基板 ( 3 ) である p型シリコン （P- Si) の表面近傍にソース、 ドレインと して、 それぞれをソース n型領域 (9) 、 ドレイン n型領域 （10) を設けて、 遺伝子検出電界効果トランジスタ （1B) を構成した遺伝子検出電界効果デバ イス （1A) を模式的に例示した断面図である。 なお、 遺伝子検出電界効果ト ランジス夕 （1B) を単に遺伝子検出電界効果デバイス （1A) と表記するこ とがある。
図 3に示したとおり、 ソース n型領域 （9)、 ドレイン n型領域 （10) 間 に電圧 VDを印加するためのドレイン電極 （11) を設け、 その時に流れるソー ス n型領域 (9) 、 ドレイン n型領域 （10) 間の電流 IDをドレイン電流計 (12) で測定する。 核酸プローブ （5) は、 ソース n型領域 （9) 、 ドレイ ン n型領域 （10) 間の絶縁膜体 (2)表面 （以後、 この領域を 「ゲート絶縁 膜体領域 （201) 」 と記すことがある） に固定化する。 試料溶液 (6) 中に 検出解析すべき目的遺伝子が含まれ、 遺伝子検出電界効果トランジスタ （1 B) のゲート絶縁膜体領域 (201)上に目的遺伝子と相補的な塩基配列を有 する核酸プローブ (5) が固定化されていると、 目的遺伝子と核酸プローブ
(5) が、 ハイブリダィズして二本鎖を形成する。
そして、 図 1および図 2の例と同様に、 ハイブリダィズによる二本鎖形成に よりゲート絶縁膜体領域 （201)表面の負電荷が増大し、 その結果、 静電的 相互作用により半導体基板表面における電子 (8) 密度が変化し、 これに伴う 電気的信号を検出する。
図 4は、 半導体基板表面のキャリア密度変化を遺伝子検出電界効果デバイス のゲート電圧 vG-ドレイン電流 ID特性変化として検出する一例を示した概念図 である。 ソース、 ドレイン間に一定の電圧 VDを印加した状態で、 ゲート電圧 に負の電圧を印加すると静電的相互作用により、 p型半導体基板表面から少数キ ャリアである電子がなくなり、 多数キャリアである正孔が蓄積する。 一方、 ソ ース、 ドレインま、 n型領域であるので、 ソース、 ドレイン間電圧 VDを印加す ると、 ソース、 ドレインのどちらかに必ず pn接合の逆方向電圧が印加されるた め、 ドレイン電流 IDは流れない （無視できるほど小さい） 。 そして、 徐々にゲート電圧 VGを増加していくと、 電子が表面に誘起されて表 面の電子密度が増加する。 十分な大きさのゲート電圧 VGを印加するとソース、 ドレインの n型領域は、 半導体基板表面に誘起された電子の層で接続され、 高 い導電性を示してドレイン電流 IDが流れ出すこととなる。 ドレイン電流 IDが流 れ出すときのゲート電圧 VGを閾値電圧 VTといい、 VG— ID特性を特徴づける指標 となる。 さらに、 ゲート電圧 VGを正の方向に印加していくと、 半導体基板表面 の電子密度が増加して、 ドレイン電流 IDは増加する。 したがって、 図 4中の符 号 A'に示した特性となり、 この時の閾値電圧を V„とする。 ゲート絶縁膜体表面 で、 核酸プローブと目的遺伝子が八イブリダィズして二本鎖を形成すると、 表 面の負電荷密度が増大するので、 VG— ID特性は電圧軸に沿って、 正方向にシフト し、 図 4中の符号 B'に示した特性となる。 この時の閾値電圧を VT2とすると、 閾 値電圧のシフト量 AVT=VT2— VT1 (矢印 D' ) は、 ゲート絶縁膜体領域表面の電荷 密度変化に依存するので、 Δντを測定することにより、 ハイブリダィゼーショ ンを評価することができる。 さらに、 ゲート絶縁膜体領域表面で DNAの伸長反 応を行わせると、 二本鎖の長さが長くなるため表面の負電荷がさらに増大する。 したがって、 一 ID特性はさらに正方向にシフトし、 図 4中の符号 C'に示した 特性になる。 この時の閾値電圧を VT3とすると、 閾値電圧のシフト量 AVT=VT3— VT1は伸長反応による電荷密度変化の指標になり、 ハイプリダイゼーションのみ の時のシフト量よりも大きいため、 高感度な測定、 すなわち検出が可能になる。 図 5は、 この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイス （1 A) からなる遺 伝子検出電界効果デバイス （1 B) を 2つ備え、 また、 遺伝子検出電界効果デ パイス （1 B) それぞれに異なる核酸プローブ （5 ) を固定化させて、 目的遺 伝子 （6 0 1 ) とハイブリダィズさせている状態を模式的に例示した断面図で あり、 （A) は目的遺伝子の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有する核酸プ ローブ （野生型） を固定化させた状態、 （B) は目的遺伝子の塩基配列とは一塩 基だけ異なる核酸プローブ （変異型） を固定化させた状態示している。
また、 図 6は、 図 5の例において、 伸長反応を促進させた状態を模式的に例 示した断面図であり、 （A) は目的遺伝子と核酸プローブが伸長している状態、 (B) は目的遺伝子と核酸プローブの伸長反応が停止している状態を示している。 なお、 この図 5および図 6における基本的な構成は、 図 3の例と略同様である。 図 5およぴ図 6に示したとおり、 この出願の発明は、 上記のとおりの遺伝子 検出電界効果トランジスタ （1B) を少なくとも 2つ以上備えて、 これら遺伝 子検出電界効果トランジスタ （1B) それぞれの絶縁膜体 (2) 上に、 少なく とも 2種類の核酸プローブ (5) が固定化されてなる遺伝子検出電界効果トラ ンジスタ （1B) を用いることにより、 SNPの解析を高感度に、 また、 高精度に 行うことができる。
上記の少なくとも 2種類の核酸プローブ （5) とは、 解析の対象となる目的 遺伝子 (601) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する野生型 （正常型） 核 酸プローブ （501) と、 前記目的遺伝子 (601) の塩基配列とは非相補的 な塩基配列を有する変異型核酸プローブ （502) を意味する。 この変異型核 酸プローブ （502) については、 核酸プローブ （5) が絶縁膜体 (2) 上に 固定化されている端部である固定化端部 （503) の反対側の端部、 つまり、 核酸プローブ （5)が固定化されていない端部である非固定化端部 （504) における塩基が、 野生型核酸プローブ （501) の非固定化端部 （504) に おける塩基と相異していることが好ましい。 図 5 (B)の例では、 変異型核酸プロ ーブ （502) の非固定化端部 （504) における塩基は 「G」 であり、 この箇 所に対応する目的遺伝子の塩基は 「T」 となっているため、 結合は途中で停止し、 二本鎖を形成することができない。 一方、 野生型核酸プローブ （501) の非 固定化端部 （504) における塩基は 「Α」 であり、 この箇所に対応する目的遺 伝子の塩基 「Τ」 とは相裙的な関係にあり、 結合して二本鎖を形成することがで さる。
そして、 目的遺伝子 (601) の塩基配列が含まれる試料溶液 (6) を上記 遺伝子検出電界効果デバイス （1A) からなる電界効果デバイス （1B) の絶 縁膜体 (2) 上に導入して、 ハイブリダィゼーシヨンを行わせ、 未反応の目的 遺伝子 （601) を緩衝溶液等で洗浄する。 次いで、 タック DMポリメラーゼ (Taa DNAポリメラーゼ） 等の DNA合成酵素とともに、 基質となるデォキシアデ ノシン三リン酸 （dMP) 、 デォキシグアノシン三リン酸 （dGTP) 、 デォキシシ チジン三リン酸 （dCTP) 、 デォキシチミジン三リン酸 （dTTP) を用いて、 DNAの 伸長反応、 あるい Iま、 イン夕一カレー夕一分子との反応等の分子生物学的反応 工程を絶縁膜体 (2) 表面上で引き続き行わせ、 未反応の酵素や基質を洗浄す る。 その結果、 DM伸長反応等で生ずる表面電荷密度の変化を電界効果を利用し て、 半導体基板 (3) 表面に静電的に誘起する電子 (8) 密度の変化を検出す る。
表面電荷密度の変化を大きくして、 高感度測定を実現するために、 目的遺伝 子 （601) 自身が持っている負電荷に加えて、 核酸の伸長反応による負電荷 の増大とその結果起こる信号のエンハンスメントやインタ一カレーターとの反 応による正電荷の導入等により、 ハイブリダィゼーションの現象を大きな信号 /雑音比 （S N比） で検出できる。 つまり、 それぞれの遺伝子検出電界効果デバ イス （1A) の出力を比較することにより解析の対象となる目的遺伝子 （60 1) の遺伝子型 （つまり、 SNP) を解析することができる。
また、 絶縁膜体 (2) 表面に固定化する核酸プローブ （5) の塩基配列設計 に際しては、 上記のとおり、 ミューテーシヨン （変異） の位置を絶縁膜体
(2) 表面への固定化端部 （503) とは反対側の端部である非固定化端部 (504) に設定する。 そして、 目的遺伝子 （601) の SNPにおける野生型 (正常型） に対応する野生型核酸プローブ （501) と変異型に対応する変異 型核酸プローブ （502) とを別々に固定化させて、 1種類の試料溶液 （6) に対して、 同時に八イブリダィゼーシヨンを行わせ、 伸長反応を行わせること により、 一塩基多型 (SNP) を高精度に測定することができる。
さらに、 ハイブリダィゼーシヨン時の温度を野生型核酸プローブ （501) 、 または、 変異型核酸プローブ （502) の解離温度 (Tm) に設定することによ り、 ハイブリダィゼ一シヨンの選択性を向上させることができ、 伸長反応を行 わせることで、 反応の特異性をさらに高めることができ、 より高精度の SNP解 祈が可能となる。 これは、 ミューテーションの位置が端にあるミスマッチの変異型核酸プロ一 ブ （5 0 2 ) とのハイブリダィゼーシヨンでは、 塩基同士の親和性が低いため 十分に結合されず、 伸長反応力起こらないためである。 一方、 フルマツチの野 生型核酸プローブ （5 0 1 ) では非固定化端部の塩基同士は水素結合で確実に 二本鎖を形成するため、 伸長反応が起こり、 負電荷が増大する。 これにより、 静電的相互作用で半導体表面の電子 ( 8 ) 密度が変化し、 これに伴う電気的特 性の変化を測定することにより高精度に SNPを解析することができる。
つまり、 この出願の発明における遺伝子多型解析方法は、 特に出力値の測定 については、 野生型核酸プローブ （5 0 1 ) が固定化されている第 1の遺伝子 検出電界効果トランジスタ （1 B) (遺伝子検出電界効果デバイス） と、 絶縁 膜体上にはいずれの核酸プローブが固定化されていない第 3の遺伝子検出電界 効果トランジスタ （図示せず） （遺伝子検出電界効果デバイス） との差動出力 値 VI、 また、 変異型核酸プロ一ブ （5 0 2 ) が固定化されている第 2の遺伝子 検出電界効果トランジスタ （1 B ' ) (遺伝子検出電界効果デバイス） および 前記第 3の遺伝子検出電界効果トランジスタ （遺伝子検出電界効果デバイス） との差動出力値 V2を測定し、 この測定結果に基づいて、 VIが V2より大きいパ ターン （V1>V2) 、 VIと V2と;^同程度であるパターン （V1=V2) 、 VIが V2よ り小さいパターン （VKV2) の 3種類のパターンに分類して表示することに基づ いている。
図 7は、 この出願の発明において、 金属電極 （1 3 ) を介して核酸プローブ ( 5 ) を絶縁膜体 ( 2 ) に固定化させた状態を模式的に例示した断面図である。 金属電極 ( 1 3 ) は、 前記のとおり、 白金、 金、 銀、 パラジウム、 チタン、 ク ロム等を使用することができ、 これにより、 前記の電子 ( 8 ) の密度変化に伴 う電気的特性の変化をより高精度に検出することができる。
さらに、 図 8は、 この出願の発明において、 インターカレ一ター （1 4 ) を 反応させた状態を模式的に例示した斬面図である。
インターカレーター （1 4 ) は、 二本鎖核酸とのみ反応し、 また溶液中では イオン化し、 正に帯電するため、 この性質を利用して、 インターカレ一夕一 (14) を導入して、 伸長反応により長く伸びた野生型核酸プロ一ブ （50 1) が固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタ （1 B) の二本鎖核酸と より多く反応し、 大きな信号変化が得られる。 この信号変化を検出する。 なお、 インターカレーター （14) としては、 たとえば、 Hoechst33258ゃェチジゥム ブロマイド、 サイバーグリーン、 ピコグリーン等を用いることができる。
図 9は、 この出願の発明の別の実施形態を模式的に例示した斬面図である。 なお、 基本的な構成等は、 図 3、 図 5または図 6に示した例と略同様である。 この図 9に例示したこの出願の発明においては、 図 3、 図 5または図 6に例 示した遺伝子検出電界効果トランジスタ （1B) が形成された半導体基板
(3) に、 核酸の伸長反応を促進させるための温度コントロール手段として、 ヒーター （15) をヒーター用 n型領域として形成させ、 また、 温度センサ
(16) は温度センサ用 pn接合として形成させている。 この時、 一つの半導体 基板 (3) に複数個の pゥエル （17) を形成させて、 前記ヒーター （15) および温度センサ （16) を集積化させている。 遺伝子検出電界効果トランジ ス夕 （1B) のゲート絶縁膜体領域 （201) 上には、 野生型核酸プローブ
(501) 、 変異型核酸プローブ （502) それぞれが固定化され、 試料溶液 (6) 中の目的遺伝子 （601) とハイブリダィゼーシヨンおよび伸長反応を 促進させて、 高精度な SNP解析を行うことができる。 その際、 ヒーター （1 5) および温度センサ （16) とを作動させて、 半導体基板 （3) 近傍の試料 温度を、 ハイブリダィゼーシヨン時には 45 、 伸長反応時には 62 に設定し制 御した。 このように遺伝子検出電界効果トランジスタ （1 B) に、 温度コント ロール手段として、 ヒーター （15) および温度センサ （16) を集積化する ことにより、 ハイブリダィゼーションおよび伸長反応時の温度を最適な値に設 定することができ、 より高精度の測定を行うことができる。
また、 図 10は、 図 9の実施形態をアレイ化して、 複数の SNP解析を行うこ とができる構造としたものを模式的に例示した断面図である。
図 10に例示したとおり、 遺伝子検出電界効果トランジスタ （1B) が形成 された各半導体基板 (3) を核酸プローブ （5) の解離温度に対応させて、 最 適な温度に設定できるように、 絶縁膜体 （19) の一面に設置し、 この絶縁膜 体 （19) を介して熱を効率的に放散させるようにする。 さらに、 各半導体基 板 （3) 間の温度のクロストークを低減し、 独立に温度制御可能にするために シリコン、 ポリシリコン等のような熱伝導性物質 （20) で、 各遺伝子検出電 界効果トランジスタ （1B) (シリコン基板 （18) ) を囲う構造とし、 上記 熱伝導性物質 （20) を介して、 熱を効率的に放散させる。
目的遺伝子を含む試料溶液を遺伝子検出電界効果トランジスタ （1B) 上に 導入するために、 上記絶縁膜体 （19) に開口部 （21) を設け、 遺伝子検出 電界効果トランジスタ （1B) の絶縁膜体 (19) が開口部 （21) に一致す るようにァライメントする。 さらに、 銅板 （22) に接着したペルチェ素子 (23) を銅板 （22) の裏面に設けることにより、 温度制御の精度を向上し て、 また冷却時の時間を短縮することができる。 このような構造を有する遺伝 子検出電界効果トランジスタアレイ （1C) を用いることにより、 複数の SNP においても、 高精度な解析を並列的に行うことができ、 ハイスループットの解 析システムを構築することができる。
図 11は、 この出願の発明における遺伝子検出用電界効果デバイス （1A) を用いた測定システムの一例を模式的に示した概念図である。
すなわち、 この出願の発明は、 図 11に示したとおり、 上記のような特徵を 有する遺伝子検出電界効果デバイス （1A) (または、 遺伝子検出電界^！果ト ランジスタ） をフローセル （24) にマウントし、 流路 （25) に接続する。 流路 （25) には緩衝液 (2 8) および洗浄液 （29) がバルブ （30) を介 して接続されており、 ポンプ （31) を駆動して、 緩衝液 （28) および洗浄 液 （29) をフローセル （24) に導入することができる。 また、 試料 （2 6) および伸長反応のための酵素タック DNAポリメラーゼ （Tad DNA polymerase) および基質となる dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP等の試薬 （27) は分 注器 （32) によりバルブ （30) 中に分注し、 フローセル （24) に導入し て、 遺伝子検出電界効果デバイス （1A) (遺伝子検出用電界効果トランジス 夕） と反応させることができる。 反応後、 使用済みの液はポンプ （31) により廃液ボトル （33) に送られ る。 また、 参照電極 （34) には Ag-AgCl電極を用い、 3Mの KC1溶液 （35) を通過させて上記フローセル （24) の下流で流路 （25) に接続し、 液-液 接合 （36) を形成させて、 遺伝子検出電界効果デバイス （1A) (遺伝子検 出用電界効果トランジスタ） と電気的に接続する。 そして、 反応後の遺伝子検 出電界効果デバイス （1A) (遺伝子検出用電界効果トランジスタ） の出力は、 信号処理回路 （37) により処理/演算される。
図 12は、 図 11にて例示したフローセル （24) の構造を概略的に例示し た図である。 フローセル （24) の中のプリント基板 （38) に遺伝子検出用 電界効果デバイス （1A) をマウントし、 ワイヤー （39) で電気的にプリン ト基板 （38) と接続させる。 プリント基板 (38) には、 ピン （40) が設 けられ、 図 11に例示した信号処理回路 （37〉 と接続されている。 試料溶液 は流路 （25) により遺伝子検出用電界効果デバイス （1A) (または、 遺伝 子検出用電界効果トランジスタ） に導入される。 試料溶液が、 信号伝導線とな るワイヤ一 （39) に接触しないように、 ワイヤー （39) 部分を保護キヤッ プ （41) で保護する。 保護キャップ （41) の材料としては、 絶縁性を有し ているものであれば特に制限されるものではないが、 たとえば、 アクリル、 ポ リプロピレン、 ポリ力一ポネィト等が適しているため好ましい。
このような構成の遺伝子検出用電界効果デバイス （1A) を用いた測定シス テムは、 フロー方式の測定であるため、 多数の試料を連続に自動的に処理する ことができ、 髙スル一プットの測定に有効である。
以上の例に示したとおり、 この出願の発明を用いて、 遺伝子多型 (polymorphism：たとえば、 一塩基多型 （single nucleotide polymorphism, SNP) やマイクロサテライト多型 （microsatellite polymorphism) ) 等を解析す る際は、 たとえば、 図 13に例示したとおりの以下のステップで行われる。 す なわち：
(1) 洗浄液をフローセル中に導入；
(2) 緩衝液をフローセル中に導入 （洗浄液を置換） ； (3) 電界効果デバイスの温度を核酸プローブの最適温度に設定；
(4) 各遺伝子検出用電界効果デバイスの出力値を測定、 差の演算；
(5) 試料をバルブに分注して、 ハイブリダィゼーシヨン液でフローセルに導 入；
(6) フローセル中でハイブリダィゼーシヨン；
(7) 緩衝液をフローセルに導入して、 未反応の試料を除去；
(8) 各遺伝子検出用電界効果デバイスの出力値を測定、 差の演算；
(9) 酵素タックポリメラーゼ （Taa polymerase) 、 およぴ基質となる dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTPの混合液をフローセルに導入し伸長反応；
(10) 緩衝液を導入して未反応の酵素 ·基質を除去；
(11) 各遺伝子検出用電界効果デバイスの出力値を測定、 差の演算；
(12) フローセル中の試料温度を 95でに設定；
(13) 洗浄液を導入して、 フローセル中を洗浄；および
(14) (1) に戻る。
なお、 この図 13中の矢印は、 出力電位を読み取るタイミングを示している。 以下に実施例を示し、 さらに詳しく、 この出願の発明について説明する。 も ちろん、 以下の例によってこの出願の発明が限定されることはない。 実施例
実施例 1 ： FactorVII遺伝子における SNPの検出解析
血液凝固遺伝子の一つである FactorVII遺伝子には複数の一塩基多型 （SNP) が存在することが知られている。 そのうちの一つである- 122部位の SNPは、 野 生型 （正常） がチミン （T) 、 変異型カントシン （C) であることが知られてい る。 この FactorVII遺伝子- 122部位の SNPを検出するために、 野生型および変 異型それぞれに対応する 11塩基からなる 2種類の核酸プローブを合成した。 そ れらの塩基配列は以下のとおりであり、 配列番号 1は野生型核酸プローブを、 配列番号 2は変異型核酸プローブを示している。
野生型核酸プローブ： 5' -CGTCCTCTGAA-3' (配列番号 1 ) 変異型核酸プローブ： 5' -CGTCCTCTGAG-3' (配列番号 2 )
本実施例においては、 上記核酸プローブの 3'末端值?!に S P部位の塩基がくる ように合成した。 すなわち、 野生型核酸プローブでは 3'末端の塩基がアデニン (A) であり、 変異型核酸プローブではグァニン （G) となっている。 その他の 塩基配列は野生型、 変異型ともにすべて同じであり、 検出対象の FactorVII遺 伝子にハイブリダィゼ一シヨンさせることができる。 一方、 上記核酸プローブ の 5'末端側にはアミノ基を修飾して、 ゲート絶縁膜体領域表面に固定化した。 また、 本実施例における遺伝子検出電界効果トランジス夕のゲート絶緣膜に は、 窒化シリコンによる修飾処理されており、 その表面をァ一ァミノプロピル トリエトキシシランで化学修飾して窒化半導体基板表面にアミノ基を導入した。 そして、 核酸プローブのァミノ基と窒化シリコンのアミノ基を、 たとえば、 グ ル夕ルアルデヒド等のような 2官能性試薬と反応させ、 シッフ塩基による結合 を形成することにより、 核酸プローブを窒化半導体基板表面に固定化させた。 本実施例は、 たとえば、 前記図 5にも例示したとおり、 野生型核酸プロ一ブ を一つの遺伝子検出電界効果トランジス夕のゲート絶縁膜体領域表面に固定化 させ、 変異型核酸プローブを他の遺伝子検出電界効果トランジス夕のゲート絶 縁膜体領域表面に固定化させて、 あらかじめポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) で増 幅させた試料を反応させた。
試料は、 血液中の白血球からヒトゲノムを抽出し、 上記 SNP部位を含む 20塩 基長の領域を増幅した後、 野生型核酸プローブ、 変異型核酸プローブが固定化 された遺伝子検出電界効果トランジスタに導入して、 45 で 8時間、 ハイプリ ダイゼーシヨンを行なった。 ハイブリダィゼーシヨン後、 緩衝液により洗浄し て未反応の試料を除去した。
野生型核酸プローブの塩基配列は、 野生型試料の塩基配列に完全に相補的で あるので、 SNP部位も含めて完全に相補鎖結合して二本鎖 DNAを形成した。 一方、 変異型核酸プローブの場合は、 3'末端の塩基がグァニン （G) であるため、 野生 型試料核酸上の塩基チミン （T) とは相補鎖結合しな ゝため、 3'末端が開いた形 で二本鎖 DMを形成した。 このため、 野生型核酸プローブと変異型核酸プロ一 ブとで塩基配列が異なっているため、 両者の解離温度 (Ti) が異なり、 ハイブ リダイゼーション温度を制御することにより、 二本鎖形成の選択性を高めるこ とができた。
次に、 酵素タック DNAポリメラ一ゼ （Tad DNA polymerase) および基質とな る dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTPの混合液を試料中に導入して、 温度を 62 に設定し てゲート絶縁膜体上で伸長反応を行った。 前記図 6に例示したとおり、 野生型 核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果卜ランジス夕では、 野生型
(正常型） の目的遺伝子を含む試料の導入により末端を含めて完全相補鎖の二 本鎖を形成するため、 伸長反応により二本鎖が合成された。 この伸長反応によ り野生型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジス夕の出力 が 20mV変化した。 一方、 変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効 果トランジスタでは、 3' 末端の塩基が結合せず開いた形のため、 伸長反応が起 こらない。 したがって、 変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効 果トランジスタの出力は、 ほとんど変化しなかった （およそ、 lmVの変化） 。 一方、 変異型の目的遺伝子のみを含む試料を導入すると、 変異型核酸プロ一 ブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタのみで伸長反応がおき、 そ の出力が 18mV変化した。 この場合は、 野生型核酸プローブが固定化された遺伝 子検出電界効果トランジスタの出力は、 ほとんど変化せず、 0. 5mVの変化を示し た。 野生型、 変異型の両方の目的遺伝子を含む試料を導入した場合は、 両方の 遺伝子検出電界効果トランジスタの出力が変化し、 野生型核酸プローブが固定 化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は 12mVの変化を示し、 変異型 核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジス夕の出力は lOmVの 変化を示した。
以上のことから、 3' 末端の塩基が SNP部位となるように核酸プローブを設計 し、 野生型と変異型の核酸プローブがそれぞれ遺伝子検出電界効果トランジス タのゲ一ト絶縁膜体上に固定化され、 目的遺伝子を含む試料溶液とハイプリダ ィゼーシヨンを行わせ、 引き続き伸長反応を行わせることにより、 試料溶液中 の遺伝子の SNPを検出することができる。 さらに、 野生型と変異型の核酸プロ ーブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジス夕の出力変化の大きさを比 較することにより、 野生型のホモザィゴ一ト （homozygote) 、 野生型と変異型 のへテロザィゴート （lieterozygote) 、 変異型のホモザィゴートを識別するこ とができ、 遺伝子型 (genotype) を検出することができることが確認された。 実施例 2 ： FactorVII遺伝子における SNP検出において、 ぺプチド核酸
(Pept ide Nucleot ide Acid, PNA) を用いた場合
上記の実施例 1において、 遺伝子検出電界効果トランジス夕のゲート絶縁膜 体領域上に固定化される核酸プローブとして、 ペプチド核酸 （Peptide
Nucleotide Acid, PNA) を用いると、 より安定性の高い二本鎖核酸が形成され る。
そこで、 本実施例では、 基本的な特徵は、 上記実輝例 1の場合と略同様であ るが、 核酸プローブとしてペプチド核酸 (PNA) を用いた。
その結果、 野生型ホモザィゴート （homozygote) を含む試料の場合、 野生型 PNAプローブを固定化したトランジスタの出力は 23mV変化したのに対して、 変 異型 PMプローブを固定化したトランジスタの出力は 4mVの変化であった。 ま た、 野生型と変異型のへテロザィゴート （heterozygote) 試料の場合、 野生型、 変異型 PNAプローブが固定化された遺伝子検出電界劾果トランジスタの出力は、 それぞれ 15mV、 13mVであり、 野生型、 変異型ともに検出することができた。
さらに、 変異型のホモザィゴ一ト試料の場合、 野生型 PNAプローブが固定化 された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は、 2mVとほとんど変化を示さな かったのに対して、 変異型 PNAプローブが固定化された遺伝子検出電界効果ト ランジス夕の出力は、 19mVの変化であった。
以上のとおり、 核酸プローブとして PNAを用いることにより、 野生型ホモザ ィゴー卜、 野生型と変異型との混合へテロザィゴー卜、 変異型ホモザィゴ一卜 を識別することができ、 目的遺伝子の遺伝子型 (genotype) を検出することが できることが確認された。
これは、 PNAは、 負電荷を有するオリゴヌクレオチドや cDNA等と異なり、 電 荷を有しておらず中性のため、 核酸プローブと目的遺伝子との間の静電反発が 無く、 ゲート絶縁膜体上で、 強固な二本鎖核酸を形成することができる。 また、 核酸プローブを形成した遺伝子検出用電界効果デパイスと核酸プローブを形成 しない参照用の遺伝子検出用電界効果デバィスを用いて差動測定を行う場合、 電荷が中性の PNAを用いると遺伝子検出用と参照用の電界効果デバイスの間で フラットバンド電圧や閾値電圧の変化が無く、 高精度の差動測定を行うことが でき、 特に電荷検出型の遺伝子検出用電界効果デパイスには有効であることを 意味する。
そして、 本実施例のように遺伝子検出電界効果トランジス夕と伸長反応を利 用する S P検出おょぴジエノタイピング （genotyping) では、 ゲート絶縁膜体 上への試料導入、 ハイブリダィゼーシヨン、 伸長反応の各プロセスの進行中、 常時電位計測を行い反応の進行をモニタリングすることができる。
したがって、 反応の完了を電位変化から検出することができ、 効率的に SNP 検出およびジエノタイピングを行うことができる。 また、 本実施河では伸長反 応に伴う塩基の合成を電荷の増加量として検出するため、 核酸プローブと試料 核酸の塩基長および伸長合成される塩基長を最適化することにより高感度に核 酸を検出することができる。
実施例 3 ：アルコ一ルデヒドロギナ一ゼ関連遺伝子の SNP検出アルコールデヒ ドロギナーゼ関連遺^?には、 一塩基多型 （SNP) が存在することが知
られている。 その SNP部位が、 3'末端の塩基となるように核酸プローブを設計 した。 野生型は SNP部位の塩基がチミン （T) 、 変異型はシトシン （C) であり、 それぞれに対応する核酸プローブの塩基配列を以下に示した。 なお、 本実施例 における野生型核酸プローブは配列番号 3に示し、 変異型核酸プローブ配列番 号 4に示した。
野生型核酸プローブ： 5' -CATACACTA-3' (配列番号 3 )
変異型核酸プローブ： 5' - CATACACTG-3' (配列番号 4)
なお、 本実施例は、 基本的な構成や実験手順は、 上記実施例 1および実施例 2と略同様である。 本実施例は、 たとえば、 前記の図 7に例示したとおり、 （A) に示した野生型 核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタおよび （B) に示 した変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果卜ランジスタを用 いた。 本実施例では、 遺伝子検出電界効果トランジスタのゲート絶縁膜体には 金属電極を形成させ、 上記核酸プローブの 5'末端をチオール基で修飾し、 直接 金属電極と結合を形成させることにより、 核酸プローブをゲート絶縁膜体領域 表面に固定化させた。 本実施例において、 金属電極として、 クロム薄膜の上に 金を積層した構造を用いた。
試料は、 血液中の白血球からヒトゲノムを抽出し、 上記 SNP部位を含む 100 塩基長の領域を増幅した後、 野生型または変異型核酸プローブが固定化された 遺伝子検出電界効果トランジスタに導入して、 45 で 8時間、 ハイブリダィゼ ーシヨンを行った。 ハイブリダィゼーシヨン後、 緩衝液で洗浄して未反応の試 料を除去した。
本実施例で用いた試料は、 野生型の目的遺伝子のみを含む試料であったため、 野生型核酸プローブと完全相補鎖結合により二本鎖が形成された。 一方、 変異 型核酸プローブは、 3'末端に SNPが存在するため相補鎖結合されず、 3'末端が 開いた形で二本鎖を形成された。
次に、 上記の実施例 1および実施例 2と同様に、 タック DNAポリメラーゼ
(Taa DNA polymerase) および基質となる dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTPの混合液を 試料中に導入し、 温度を 62 に設定してゲート絶縁膜体上で伸長反応を行った。 そして、 野生型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジス 夕では、 上記のとおり野生型目的遺伝子のみを含む試料の導入により、 末端を 含めて完全相補鎖の二本鎖を形成するので、 伸長反応が促進され、 出力が 28mV の変化を示した。 一方、 変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効 果トランジスタでは、 3'末端の塩基が結合されず開いた形のため、 伸長反応が 起こらず、 出力はほとんど変化しなかった （3mVの変化） 。
本実施例の特徵は、 伸長反応の後、 二本鎖の核酸と反応するインターカレー ターを導入した点である。 インターカレー夕一は、 分子生物学実験において蛍 光色素として一般に用いられている。 多くのインターカレー夕一分子は、 溶液 中でイオン化し、 正に帯電する。
つまり、 この出願の発明においてのインターカレー夕一は、 色素としての性質 ではなく、 電荷としての性質を利用した。 本実施例では、 インターカレ一ター として、 Hoechst33258を用いた。
すなわち、 ハイブリダィゼ一シヨン、 それに続く伸長反応の後、 野生型およ び変異型核酸プローブそれぞれが、 固定化された遺伝子検出電界効果トランジ ス夕の出力電位を測定し、 Hoeclist33258をゲート絶縁膜体上に導入して反応さ せた。
そして、 たとえば、 前記図 8に例示したように、 インターカレー夕一である Hoeclist33258は、 二本鎖核酸とのみ反応して、 伸長反応により長く伸びた野生 型トランジスタの二本鎖核酸とより多く反応し、 大きな信号変化が得られた。 本実施例の場合では、 Hoechst33258との反応後、 野生型トランジスタの出力 電位は 27mV変化し、 変異型トランジスタの出力電位は 6mVであった。 これによ り、 S P検出および野生型 Z野生型のホモ、 変異型 Z変異型のホモ、 野生型ノ変 異型のへテロの 3種類の試料を識別する遺伝子型の検出を行うことができる。
Hoeclist33258等のインターカレ一夕一を用いる方法の大きな特長は、 上記の とおり、 インターカレー夕一は正の電荷を有しているため、 負に帯電している 核酸のハイプリダイゼ一ションおよび伸長反応に基づく出力変化と反対の極性 の信号を出力する点である。 インタ一カレーターは二本鎖核酸とのみ反応する ので、 非特異的にゲート絶縁膜体上に吸着した一本鎖核酸とは反応せず、 ハイ ブリダィゼーション ·伸長反応に基づく信号と、 非特異的に吸着した一本鎖核 酸の信号を分離して、 ハイブリダィゼ一シヨン ·伸長反応に基づく信号のみを 選択的に検出できる。 これにより、 高い信号/雑音比 （S/ 比） で SNPおよび遺 伝子型を検出することができる。 産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 高感度、 かつ、 高精 度に遺伝子の検出解析が可能であり、 しかも、 遺伝子多型解析システムを従来 よりも小型でコス卜をも抑えることができる。

Claims

請求の範囲
1 . 絶縁膜体、 半導体基板および参照電極が備えられている遺伝子検出電界 効果デバイスであって、 以下の構成：
( a) 絶縁膜体は、 その一方の面側に核酸プローブが固定化されているととも に、 少なくとも 1種類の目的遺伝子が含まれる試料溶液に接触されているこ と；
( b ) 半導体基板は、 前記絶縁膜体の他方の面側に当接設置されていること； および
( c ) 参照電極は、 前記試料溶液中に備えられていること；
を含んでなることを特徵とする遺伝子検出電界効果デパイス。
2 . 請求項 1記載の遺伝子検出電界効果デバイスが、 少なくとも 2つ以上備 えられており、 かつ、 これら遺伝子検出電界効果デバイスそれぞれの絶縁膜体 上には目的遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列を有する野生型 （正常型） 核 酸プローブと、 目的遺伝子の塩基配列と非相補的な塩基配列を有する変異型核 酸プローブの少なくとも 2種類以上の核酸プローブが固定化されてなることを 特徵とする遺伝子検出電界効果デパイス。
3 . 変異型核酸プローブは、 核酸プローブが絶縁膜体上に固定化されていな い端部である非固定化端部における塩基が、 野生型核酸プローブの非固定化端 部における塩基と異なっている請求項 2記載の遺伝子検出電界効果デバイス。
4. 核酸プローブは、 オリゴヌクレオチド、 相補的 DNA (cDNA) およびべプチ ド核酸 (PNA) からなる群より少なくとも 1種類以上が選択される請求項 1から 3いずれか記載の遺伝子検出電界効果デバイス。
5 . 核酸プローブは、 金属電極を介して固定化されている請求項 1から 4い ずれか記載の遺伝子検出電界効果デバイス。
6 . 金属電極は、 白金、 金、 銀、 パラジウム、 チタンおよびクロムからなる 群より少なくとも 1種類以上が選択される請求項 5記載の遺伝子検出電界効果 デバイス。
7. ヒーターおよび温度センサが、 さらに集積化されている請求項 1から 6 いずれか記載の遺伝子検出電界効果デバイス。
8. 請求項 1から 7いずれか記載の遺伝子検出電界効果デパイスを用いて、 遺伝子多型を解析する方法であって、 以下のステップ：
( a) 絶縁膜体に固定化されている核酸プローブと少なくとも目的遺伝子が含 まれている試料溶液とを接触させることにより、 絶縁膜体上で前記核酸プロ一 ブと前記目的遺伝子とを八イブリダィズさせるステップ；
(b) 洗浄液を絶縁膜体上に導入して、 未反応の前記目的遺伝子を除去するス テツプ；
( c ) 伸長反応における酵素であるタック DMポリメラ一ゼ (Taa DNA polymerase) および基質となるデォキシアデノシン三リン酸 （dATP) 、 デォキ シグアノシン三リン酸 （dGTP) 、 デォキシシチジン三リン酸 （dCTP) 、 デォキ シチミジン三リン酸 （dTTP) を絶縁膜体上に導入して伸長反応を行うステツ プ；
( d ) 洗浄液を絶縁膜体上に導入して、 未反応の酵素および基質を除去するス テツプ；および
( e ) 緩衝液を絶縁膜体上に導入して、 遺伝子検出電界効果デバイスの出力値 を測定するステップ；
を含むことを特徴とする遺伝子多型解析方法。
9. ステップ （e ) の出力値の測定は、 野生型核酸プローブが固定化されて レ^第 1の遺伝子検出電界効果デバイスと絶縁膜体上に核酸プローブが固定化 されていない第 3の遺伝子検出電界効果デバイスとの差動出力値 VIを測定し、 また、 変異型核酸プローブが固定化されている第 2の遺伝子検出電界効果デパ ィスと前記第 3の遺伝子検出電界効果デパイスとの差動出力値 V2を測定し、 VI が V2より大きいパターン （V1>V2) 、 VIと V2とが同程度であるパターン
(V1=V2) および VIが V2より小さいパターン （VKV2) の 3種類のパターンに 分類して表示する請求項 8記載の遺伝子多型解析方法。
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