KR20070031957A - 나노크기 전자 검출 시스템 및 그의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

마이크로어레이 상의 특이적 프로브에 혼성화된 게놈 유전자의 직접 검출을 위한 신규의 극도로 민감하고 신속한 전자적 검출 방법이 제안되어 있다. 이 방법은 마이크로전극 어레이에서 특정 전극 부위에 DNA 표적물의 신속한 전자적 축적, 표적 DAN 상에 올리고뉴클레오티드 표지된 금속 (나노)입자의 순차적 전자적 혼성화 및 전극 부위에서의 전기화학적 AC 임피던스 변화 모니터하기로 이루어진다. 이 방법은 금속화 주형으로서 사용되는 DNA 표적물 위 및 신속 전기도금을 위한 시드를 제공하는 입자 위에 전기도금함으로써 증진된다. DNA 표적물 위에 전기도금하는 동안 어레이 전극 부위 사이에서 AC 임피던스 변화를 모니터한다. 표적 DNA의 부재 및 존재 하에서의 신호는 어레이 전극 사이의 "단선"과 "단락"의 차이이다.

나노크기 전자 검출 시스템, 마이크로어레이, 표적 DNA, 혼성화, 금속 입자, 전기도금

Description

나노크기 전자 검출 시스템 및 그의 제조 방법 {NANOSCALE ELECTRONIC DETECTION SYSTEM AND METHODS FOR THEIR MANUFACTURE}

관련 출원

본원은 2004년 5월 28일자로 출원된 미국 가출원 60/575,445(발명의 명칭: 나노크기 전자 검출 시스템)을 우선권 주장의 기초로 하는 것이고, 이 출원은 그의 전내용을 본원에 나타내는 것처럼 참고로 본원에 포함한다.

본 발명은 마이크로크기 및 나노크기 전자 시스템 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 더 상세하게 말하자면, 본 발명의 장치 및 방법은 검출기, 특히 단일 서열 검출 시스템에 관한 것이다.

사람 게놈의 서열화는 DNA 구조, 유전자 기능, 표적 치료제의 효능 뿐만 아니라 다양한 유전 및 감염 질환의 발병 및 발달 사이의 상관관계를 이해하는 데 있어서 새로운 지식을 유발하였다. DNA에 기반을 둔 분자 진단학은 몇 가지 예를 들면, 암, HIV, 낭포성 섬유증, 심장 및 폐 질환, 신종 감염 질환(emerging infectious disease)을 포함해서 많은 위험한 질환의 기전 및 전진을 밝혀냈다. 예를 들어 감염 질환 및 생물학적 약제 검출을 비롯해서 신속하고 민감한 DNA 분석을 필요로 하는 몇 가지 예가 있긴 하지만, 더 신속하고 더 민감한 DNA 검출 방법 은 인류 건강에 관한 모든 분야에 도움이 될 것이다. 최근의 생물테러 공격 위협 뿐만 아니라 신종 감염 질환의 출현은 다양한 의학적 또는 환경적 시료에서 병원균을 검출 및 동정하기 위한 더 민감하고 간단하고 신속한 새로운 POU(point-of-use) 또는 현장검사(point-of-care) 장비에 대한 절박한 개발을 촉구하였다. 현재로서는, 응급실에서 또는 진료실에서 신속한 스크리닝을 제공하는, 흔한 폐 감염과 신종 감염성 병원균을 구분하기 위한 플랫폼(platform)이 존재하지 않는다. DNA 마이크로어레이 플랫폼은 많은 수의 특징적 유전자에 대한 고도로 다중화된 인식을 허용한다.

그러나, 제한된 시료 부피에서 적은 수의 병원균 또는 암 세포를 검출함에 있어서는 민감도가 만족스럽지 않은 경우가 종종 있다. DNA 기반 기술은 DNA 농도를 증가시키기 위해 여전히 PCR(중합효소 연쇄 반응) 증폭 또는 유사한 증폭 기술에 의존하고 있다. 이 기술들은 시간 소모적이어서, 만족스러운 증폭을 달성하는 데 통상 30 분 내지 2 시간을 필요로 한다. 오랜 분자 증폭을 필요로 하지 않고, 특이적 DNA 서열을 직접 검출할 수 있는 새로운 DNA 기술이 절박하게 요구된다. 천연 DNA 혼성화 방법은 이러한 특이성을 제공한다; 하지만, 대부분의 표준 DNA 마이크로어레이 기술들은 마이크로어레이 칩 상의 프로브에 표적 DNA의 수동적 확산 및 혼성화에 의존하며, 이것을 달성하는 데는 통상 수 시간이 걸린다. 전자구동 마이크로어레이 기술(참조: 참고문헌(들) 1 - 8)(예를 들어, www.nanogen.com)은 칩 상의 특이적 위치에 DNA 서열을 신속하게(1분 미만) 수송하는 것을 제공한다. 검출은 형광체 리포터 및 레이저 기반 형광 검출(참조: 참고문헌(들) 9 - 14)로 달 성한다. 이 기술은 표적 시료로 PCR 증폭 또는 가닥 치환 증폭(SDA)에 의해 증폭된 DNA를 사용하는데, 이것은 시간을 소모하므로, 이 방법은 바람직한 총 분석시간이 20분 미만인 비상 상황에 사용하기에는 부적합하다.

DNA 마이크로어레이 기술은 많은 어레이 반점에 대한 그의 고유한 다중화 검출 가능성 때문에 사람 동정용 또는 바이러스 및 병원균 검출용 짧은 연속반복서열(STR)인 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)에 대한 DNA 기반 분석을 위해 다른 방법들에 비해 결정적으로 중요한 이점을 갖는다. 최근, 많은 병원균 또는 바이러스 검출 방법이 개발되었지만(참조: 참고문헌(들) 15 - 19), 그것을 현장에서 실제 휴대용 시스템으로 사용함에 있어서 주요한 불리한 점은 그것이 고도의 다중 검출에 대한 요건을 만족시키지 않는다는 것이다. 종종, 검출 한계, 중량 한계 또는 정확도, 또는 그 기기를 조작하는 숙련자가 필요하다는 점 때문에 이 기기는 요망되는 명세에 비순응적이 된다. DNA 기반 분자 진단학을 위한 휴대용 병원용 또는 임상용 실험 기기는 0.5 내지 1 시간 미만의 분석 시간 및 매우 적은 카피(copy) 수의 DNA 또는 10 ~ 100 cfu/㎖에 근접하는 검출 한계로 특정 SNP 또는 병원균(20 내지 100개의 특징적 유전자를 갖는 패널이 바람직함)에 대해 특징적인 일련의 유전자를 특이적으로 검출할 수 있어야 하고 경량(약 20 - 30 lbs 미만)이어야 한다.

최근 10년 내에, 마이크로어레이의 발달은 단백질 및 DNA 분석에 대한 분석 능력을 크게 확대시켰다(참조: 참고문헌(들) 20). 현재의 많은 신기술은 우리가 마이크로리터 부피 중의 수 천 개의 DNA 서열을 피코몰 수준의 민감도로 동시 분석할 수 있게 한다. 예로는 애피메트릭스(Affymetrix)의 젠칩(GeneChip™)(참조: 참 고문헌(들) 21 - 23), 나노스피어(Nanophere)(참조: 참고문헌(들) 24)의 금 나노입자 기술 및 나노젠(Nanogen)의 전자적 활성 나노칩(등록상표)(Nanochip^®)(참조: 참고문헌(들) 25) 기술을 포함한다. 유전자 발현 분석(참조: 참고문헌(들) 26), 포렌식(forensics)(참조: 참고문헌(들) 27), SNP(참조: 참고 문헌(들) 28) 분석 및 많은 다른 새로운 검정 포멧을 위한 검정이 개발되었다.

오늘날에는 주로 생물 무기 또는 병원균의 검출과 같은 비상 응용을 위해 경쟁 DNA 기반 휴대용 시스템을 개발한다. 이들은 이다호 테크놀로지(Idaho Technology)의 견뢰성이 있는 진보된 병원균 동정 장치(Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (R.A.P.I.D System) 및 신속 순환기 시스템(Rapid Cycler System)(참조: 참고문헌(들) 29), LLNL에서 개발한 자동 병원균 검출 시스템(Autonomous Pathogen Detection System; APDS)(참조: 참고문헌 30 - 31), 및 미생물의 칩 상에서의 용해, 그의 특징적 DNA의 중합효소 연쇄 반응에 의한 증폭 및 DNA의 형광 검출을 통합할 수 있는 세페이드(Cepheid)의 스마트 순환기 시스템(Smart Cycler System)(참조: 참고문헌(들) 32-34)을 포함한다. 이들 시스템 중 많은 것들이 소량의 검사물질 검출에 대한 정교한 해결책을 제공하긴 하지만, 많은 양의 검사물질 또는 유전자를 검출할 필요가 있을 때는, 설치된 광학 채널의 수가 그들의 응용을 제한한다. 이러한 기술들과 비교해 볼 때, 마이크로어레이 플랫폼은 실용상 많은 병원균의 다중 검출 뿐만 아니라 다수 유전자에 의한 그들의 특성화에 제한을 두지 않는다. 현재로서는, 휴대용 현장검사 마이크로어레이에 기반을 둔 DNA 분석 시스템이 상업용으로 개발되어 있지 않다.

최근, 나노칩(등록상표)(Nanochip^®) 마이크로어레이 기술이 어드레싱된 DNA 표적물의 검출에 형광 기반 검출을 사용하고 400개의 부위가 있는 전극 어레이를 수용하는 휴대용 전자 마이크로어레이 시스템을 개발하였다. 인자 II 및 V, 미토콘드리아 DNA에 기반을 둔 사람 동정용 SNP에 대한 검정 뿐만 아니라 신종 감염 질환 및 생물무기 병원균에 대한 검정이 개발되었다.

상기 모든 기술은 시료 중의 DNA 표적물을 증폭하기 위해 PCR 또는 유사한 분자 증폭 기술을 이용한다. 이 제안은 시료의 DNA 농도를 증폭하는 데에 PCR 또는 다른 장기간 증폭 방법을 필요로 하지 않는 새로운 직접 전자적 DNA 검출 기술의 개발을 개시한다. 이 방법은 고도로 민감하고 특정 세트의 표적 유전자에 대해 특이적인 극도로 신속한 DNA 분석을 위한 새로운 마이크로어레이 기반 플랫폼을 제공할 것이다. 전자적 기반 검출 기술은 손에 들고 다닐 가능성이 높은 소형 휴대용 마이크로어레이 기기의 설계를 허용할 것이고, 민감성 레이저, 렌즈 및 다른 광학 성분으로 이루어진 좀더 복잡하고 필드 민감성(field-sensitive) 광학 검출 시스템을 필요로 하지 않을 것이다.

나(bare) DNA의 고유 전도도는 너무 낮아서 그것을 분자 전선으로 사용하는 것이 허용될 수 없고 또한 두 전극 센서 사이에서 간단한 전도도 측정을 통해 그의 존재를 직접 측정할 수 없다.(참조: 참고문헌(들) 35-36). 전극 사이에 또는 기질 상의 원하는 위치에 극소수 표적 DNA 분자의 모임 및 결합은 이 단계가 느린 확산 과정에 의해 제어되기 때문에 지나치게 느리다. 분석물의 농도가 극소수의 DNA 분자인 경우, 수동적 DNA 포획 방법은 매우 낮은 통계적 확률을 갖는다. 제안된 기술은 전극 어레이 부위를 향한 DNA 표적물의 지향적 신속 전기영동적 수송에 의해 이러한 문제들을 쉽게 극복한다.

은(참조: 참고문헌(들) 38), 팔라듐(참조: 참고문헌(들) 39), 및 백금(참조: 참고문헌(들) 40)을 포함해서 다양한 금속을 이용하는 몇 가지 상이한 DNA 금속화 기술이 보고되었다(참조: 참고문헌(들) 37). 일반적으로, 이들 방법은 통상 두 단계로 이루어지는 무전해 도금 방법에 기반을 둔다. 먼저, DNA 상에 금속 클러스터를 형성한 다음, 이것을 DNA 분자의 연속 금속화가 얻어질 때까지 후속 금속 환원 과정에서 선택적 금속 침착을 위한 핵생성 자리로 사용한다. 금속 핵생성 중심의 형성은 금속 이온 또는 착물의 DNA와의 결합 및 금속 클러스터를 형성하는 그들의 후속 환원에 의존하거나, 또는 작은 금속 입자들의 DNA와의 결합에 의존한다. 이러한 금속화 기술은 몇 가지 결점을 가지고 있다. 첫째, 이들 금속화 방법은 매우 느리고, 특히 입자의 DNA와의 결합에 기반을 둔 경우에 그러하다. 이들은 전체 DNA 지지대에 걸쳐서 균일하고, 따라서 비특이적이고, 뿐만 아니라 기질 상의 DNA가 존재하지 않는 위치에 금속 이온 또는 금속 입자를 고도로 비특이적으로 침착시킴으로써 높은 수준의 오탐(false positive) 신호를 유발한다. 더 중요한 것은, 무전해 금속화 방법은 DNA의 인식 성질들을 파괴하고, 따라서 혼성화를 통한 어떠한 후속 리포터 결합 단계도 막는다. 금속화 방법으로부터 DNA 분자의 특이적 서열을 어느 정도 수준으로 보호하는 것을 제공하는 분자 리소그래피에 기반을 둔 방 법이 최근에 개발되었다(참조: 참고문헌(들) 41). 이 방법은 DNA에 대해 국소 환원제로 작용하는 글루타르알데히드를 이용한 서열 특이적 유도체화에 의한 DNA 분자 금속화를 포함한다. 이어서, 알데히드로 유도체화된 영역의 DNA 결합 알데히드기에 의해 은 이온이 특이적으로 환원되고, 그 결과, DNA를 따라서 은 클러스터 사슬이 형성된다. 이어서, 은 클러스터로 촉매되는 무전해 금 침착 방법(참조: 참고문헌(들) 42)을 이용해서 연속적인 DNA 주형 금 금속화를 일으킨다. 이 방법은 즉시 제조해야 하는 몇 가지 시약을 필요로 하는 많은 귀찮은 단계로 이루어진다.

제이. 왕(J. Wang)(참조: 참고문헌(들) 43)의 최근 검토 논문에서는 DNA 주형 금속화를 위한 검출 기술을 요약하였다. 그의 그룹은 침착된 은 이온을 환원한 후 용해하는 전기화학적 기반을 둔 기술을 개발하였다. 이어서, 양극 벗김 전압전류법(anodic stripping voltammetry; ASV)을 이용해서 은 이온 농도를 결정한다. 이 기술은 은 이온 결정에 대해 높은 민감도를 갖고 있긴 하지만, DNA 분자에 흡착된 것이 아니라 기질에 흡착된 단일 은 입자가 높은 은 이온 ASV 신호를 생성할 것이기 때문에 높은 오탐 결과를 발생하기 쉽다. 머킨(Mirkin)의 그룹은 나노입자- DNA 어셈블리를 나노가공(nanofabrication) 및 센서 응용에 적용함에 있어서 혁신을 주도한 그룹들 중의 하나이다(참조: 참고문헌(들) 44-47). 이들은 올리고뉴클레오티드 관능화된 금 나노입자 및 근접 엇물린 마이크로전극(close-spaced interdigitated microelectrode)을 이용한 전기적 DNA 검출 방법을 개발하였다(참조: 참고문헌(들) 48). 올리고뉴클레오티드 프로브를 두 마이크로전극 사이의 갭에 고정한다. 금 나노입자가 올리고뉴클레오티드 프로브 상의 DNA 표적물에 부착 한다. 이 방법은 측정가능 전도도 신호를 발생하는 후속 은 침착과 연관있다. 이 방법은 0.5 pM 검출 한계를 갖는 높은 민감도를 보여준다. 이 프로젝트에서 제안된 방법은 이 기술과는 DNA 표적물 및 올리고뉴클레오티드 표지된 금속 입자의 제어되고 유도된(directed) 전기영동적 축적이라는 점이 상이할 뿐만 아니라, 주형 DNA 상에 금속 입자의 클러스터 형성에 의한 신호의 전기영동적 증폭을 도입한다. 이것은 금속 입자 태그가 증폭된 신호를 생성하는 반복 및(또는) 주기적 전기영동 방법을 통해 금속화 DNA 상에 클러스터를 형성한 금속 입자에 대한 높은 신호-대-노이즈 AC 임피던스 신호 측정을 보장한다. 제안된 방법은 입체적 비특이적 무전해 도금과는 반대로 표적 DNA 주형의 신속한 유도된 전기도금을 이용한다. 제안된 검출 방법의 기술적 원리는 하기 별도의 섹션에서 요약한다.

나노젠의 마이크로어레이 기술(http://www.nanogen.com)은 DNA 분석물 및(또는) 어레이에 있는 프로브 분자의 전기영동 구동 활동성 수송을 이용하기 때문에 DNA 마이크로어레이 중에서도 독특하다. 어레이 위로의 수송은 전극인 어레이 부위들을 전극으로서 연결함으로써 전자적으로 제어한다. 이와 같은 어레이에 생체분자의 전자적 어드레싱은 마이크로칩 상의 분자 결합을 종래의 수동적 방법에 비해 1000배까지 가속할 수 있다. 예를 들면, 수동적 마이크로어레이 상에서의 혼성화는 수 시간까지 걸릴 수 있고, 이것은 저농도의 DNA 표적물을 결정할 필요가 있을 때 결정적으로 중요하다. 나노칩(등록상표)의 가장 최근 버전은 각각 칩 내부에 설계된 회로에 의해 독립적으로 제어 및 모니터되는 직경 50 ㎛의 백금 전극 400개로 이루어진 어레이이다. 공중합된 스트렙타비딘을 함유하는 얇은 히드로겔 침투층이 마이크로어레이 전극의 표면을 덮는다. 히드로겔 매트릭스의 주기능은 비오틴 표지된 DNA 프로브에게 결합 부위를 제공하는 것이다; 하지만, 그것은 또한 DNA를 전극 표면의 거친 전기화학적 환경으로부터 보호한다. 본 발명자들은 전자적 혼성화를 수행하기 위해 양극에서 발생한 H⁺를 이용하였고, 이것은 히스티딘과 같은 쯔비터이온 완충액에서 효율적 DNA 혼성화를 위한 조건을 조장한다. 나노젠의 시판 기기(나노칩(등록상표) 시스템)은 정밀하고 정확한 엄중 제어를 위해 응용에 따라 전자적, 열적 또는 화학적 기술을 이용할 수 있다. 이것은 여러 유형의 다중 분석, 예를 들어 한 시료 중의 다수 유전자, 한 유전자를 갖는 다수 시료 또는 다수 유전자를 갖는 다수 시료에 대한 결정을 허용하는 검정 설계에 극도로 유연성있는 플랫폼을 제공한다. 개별 시험 부위를 제어할 수 있는 능력은 생화학적으로 무관한 분자들을 동일 마이크로칩 상에서 동시에 사용할 수 있게 한다. 반대로, 종래의 DNA 어레이 상의 부위는 따로따로 제어할 수 없고, 모든 과정 단계는 전체 어레이에 대해 수행하여야 한다. 시판 시스템은 형광체 표지 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 리포터를 사용한 형광 기반 검출을 이용한다.

나노가공에 마이크로어레이를 사용하는 것과 관련있는 종전의 특허는 다음 특허를 포함하고, 본원에서는 이 특허의 전내용을 본원에 나타내는 것처럼 참고로 포함한다: 미국 특허 제6,652,808호(발명의 명칭: 장치의 전자적 조립 및 제작을 위한 방법, 미국 특허 제6,569,382호(발명의 명칭: 장치의 전자적 균질 조립 및 제작을 위한 방법 및 미국 특허 제6,706,473호(발명의 명칭: 올리고뉴클레오티드의 광전기영동적 수송 및 혼성화를 위한 시스템 및 장치.

발명의 개요

마이크로어레이 상의 특이적 프로브에 대한 혼성화 게놈 표적물의 직접 검출을 위한 극도로 민감하고 신속한 신규 전자적 검출 방법이 제안된다. 이 방법은 마이크로전극 어레이의 특정 전극 부위에 DNA 표적물의 신속한 전자적 축적, 표적 DNA 상에 올리고뉴클레오티드 표지된 금속 (나노)입자의 순차적인 전자적 혼성화 및 전극 부위에서의 전기화학적 AC 임피던스 변화 모니터하기로 이루어진다. 이 방법은 금속화 주형으로서 사용되는 DNA 표적물 위에 및 신속 전기도금을 위한 시드(seed)를 제공하는 입자 위에의 전기도금에 의해 향상된다. AC 임피던스 변화는 DNA 표적물 위에 전기도금하는 동안 어레이 전극 부위 사이에서 모니터한다. 표적 DNA의 부재 및 존재시의 신호는 어레이 전극 사이의 "단선"과 "단락" 사이의 차이다. 이것은 의외의 신호-대-노이즈 비를 보장한다. 이 방법은 전례가 없는 민감도를 제공하고, 이론적으로는 전극 부위에 부착된 단일 또는 극소수 DNA 분자를 다룬다. 마이크로어레이에 DNA 표적물 및 표지된 나노입자의 신속한 전자적 어드레싱은 이러한 수준의 민감도에서의 검출을 불과 수 분 이내에 달성하는 것을 보장한다.

전자 검출 시스템에 사용된 혁신적 기술의 적용은 적어도 다음에 기재한 것들을 포함한다: 전기활성 마이크로어레이 상에 표적 DNA의 전자적 포획 및 DNA 주형 전기도금을 위한 시드인 표지된 입자의 전자적 정렬, AC 임피던스 신호 증폭 - 주기적 전기영동적 AC 신호 증폭을 위한 태그로서 DNA 표적물 상에 표지된 입자의 순차적 또는 주기적 전기영동적 축적, 및 전기활성 마이크로 어레이 상의 DNA 주형 전기도금 - 전기영동 이온, 예를 들어 Ag, Au, Pd 존재 하에 직접 및(또는) 표지된 금속 입자 위에 전기활성 어레이 부위 사이에서 표적 DNA의 전기도금.

분자 진단학을 위한 휴대용 DNA 분석 시스템은 단일 플랫폼 상에서 시료 제조 및 검출 단계를 통합한 것이다. 본 발명은 자성 입자에 기반을 둔 것들을 포함해서 다양한 시료 제조 방법들과 쉽게 통합할 수 있는 마이크로어레이 기술을 위한 전자적 검출 기술을 포함한다.

마이크로어레이 검출 신호로서 전극 어레이 부위 사이의 전기화학적 임피던스 분광분석을 이용하는 표적 DNA 주형 전기도금 검출 시스템은 DNA 감지에 대한 혁신적인 접근법을 제시한다. 그러나, 이 검출 기술은 금속 이온과 DNA 사이의 전하 상호작용 및 부착된 금속 이온의 후속 환원을 이용하는 DNA 금속화를 위한 유사한 확립되고 입증된 무전해 기술 바탕 위에 구축된다. 다른 이러한 기술은 DNA 구조에의 마이크로입자 또는 나노입자 부착을 이용하여 금속 입자층을 얻고, 이어서 상이한 세트의 금속 입자를 이용하여 수동적 코팅을 행한다. 이 기술은 DNA 도금 과정을 이행하는 데 수 시간이 걸리는 경우가 종종 있고, 부위 특이적이 아니다. 제안된 검출 시스템의 탁월한 이점은 DNA 표적물 뿐만 아니라 금속 입자 태그가 전기활성 마이크로어레이에 매우 신속하고 특이적으로 어드레싱되어, 그들이 특정 어레이 부위에 쉽게 축적할 수 있고, 입자 태그의 주기적 전기영동적 축적시 AC 신호를 증진시킬 수 있다는 점이다. 표적 DNA 상에 금속 입자 클러스터의 전기적 정렬 및 전자적 형성에 의한 이처럼 독특하고 신속한 신호 증진은 전극 부위에 쉽게 측 정가능한 전기화학적 임피던스 변화를 보장한다. 게다가, 전자적으로 정렬된 입자들은 DNA 주형의 신속한 시딩(seeding) 뿐만 아니라 극도로 정확한 DNA 전기영동을 가능하게 한다. 느린 무전해 도금 기술 대신에 DNA의 직접적이고 서열 특이적 전기도금의 사용은 본원에서 최초로 제안된 것이다.

전기활성 수송은 각 주기가 불과 수 초 내에 일어나는 주기적 증폭가능 방식으로 DNA 상에 금속 태그의 부착을 허용한다. 기초적인 전자 마이크로어레이 기술은 DNA 신호의 신속한 증진을 위해 이 새로운 "전기영동적 증폭" 기술의 개발 및 무제한적 실시를 허용할 것이다. 유사한 증폭기술을 형광 기반 검출에 이용할 수 있는데, 여기에서는 DNA 및 형광체 부착 태그가 축적되고 이것을 전기활성 수송을 이용하여 증폭한다. 이 프로젝트는 본 발명자들의 전자 마이크로어레이 기술과 고도로 상용성이 있는 신호의 AC 임피던스 기반 검출에 촛점을 둘 것이다.

도 1은 DNA 표적물의 특이적 고민감도 검출을 위한 제안된 전자 검출 시스템의 개략도.

도 2는 마이크로어레이에서 AC 신호 모니터링이 어떻게 수행되는지를 보여주는 도면.

도 3은 몇 가지 유형의 금속 입자 태그의 사용을 보여주는 도면.

도 4는 다섯 가지 HPV 유형 모두를 동시 검출한 것을 보여주는 도면.

도 5는 단일 시료 중의 10개 이하의 상이한 유전자를 동시에 칩 상에서 SDA 증폭할 수 있음을 입증하는 도면.

도 6a 및 6b는 히스티딘 지지 전해질 농도의 함수로서 칩 기준 전극에 대해 적용된 두 작동전극 퍼텐셜에서 두 전극 어레이 부위(위치1,1 및 1,10이 도시됨; 첫번째 숫자는 마이크로어레이에서의 행을 표시하고, 두번째 숫자는 열을 표시함) 사이에서 일어나는 용량성 성분과 저항성 성분의 변화를 보여주는 AC 임피던스 스펙트럼.

도 7은 전기활성 마이크로어레이 및 광학 검출기를 갖는 나노젠의 휴대용 프로토타입 기기. 이 기기는 랩톱(좌측)으로 조작함. 이 기기의 성분들로는 카트리지 투입구, 시약 저장기, 연동식 펌프, 전자적 제어기, 및 CCD 카메라(우측)가 있는 광학 검출 시스템을 포함함.

도 8은 400-부위 CMOS ACV400-칩 카트리지 및 어레이의 사진. 2 개는 가로로 배치되고 2 개는 세로로 배치된 4 개의 상대전극이 활성 작동전극 어레이를 둘러쌈.

DNA 주형 전기도금의 검출을 위한 AC 임피던스 시스템

도 1은 DNA 표적물의 특이적 고민감도 검출을 위한 제안된 전자 검출 시스템의 개략도를 나타낸다. 검출은 다음 단계로 이루어진다.

표적 DNA의 전자적 어드레싱이 제일 먼저 일어난다. 이 단계는 나노젠에서 개발한 기술에 따라서 일어나고, 전기영동에 의해 용액으로부터 전극 어레이 부위에 저농도 DNA 표적물의 축적을 수반한다. 전자 마이크로어레이가 스트렙타비딘 분자를 함유하는 히드로겔 침투층(약 7 - 10 마이크론의 두께)으로 덮인다. 제안된 시스템은 표적 DNA 상의 관심 특정 유전자 영역에 상보적인 미리 로딩된 비오티닐화된 프로브의 사용을 가정한다. 표적 DNA가 매우 신속하게 1 분 미만 내에 용액으로부터 축적되어 특정 어레이 부위에서 전자적으로 혼성화될 수 있어서, 검출 과정의 국소화를 제공한다.

일단 표적 DNA 분자가 전극에서 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화되면, 올리고뉴클레오티드 표지된 금속 입자가 포획된 표적 DNA를 따라서 혼성화된다. 입자 상의 올리고 프로브의 서열은 DNA 주형의 크기 및 입자 직경에 좌우되어 변하고, 따라서 후속 금속화를 위해 DNA 상의 입자들 사이에 적절한 간격을 제공한다. 올리고 표지된 입자의 사용은 추가적 수준의 특이성을 제공하고, 따라서 비특이적 결합 및 그 결과로 일어나는 오탐(false positive) 발생을 최소치로 감소시킨다.

비포획 입자를 세척 제거하고, DNA 표적물(들)에 포획된 입자들을 전기영동에 의해 정렬시킴으로써, 연속 금속화를 위한 일련의 시딩 부위를 제공한다.

나노젠의 기술은 특정 마이크로어레이 부위에 DNA 표적물을 간격을 두고 정밀하게 포획하는 것을 가능케 하고, 게다가 이 특징은 국소화된 DNA 주형 전기도금을 위한 제안된 시스템에 이용된다. 전기도금은 먼저 얇은 침투층의 나노 기공(직경: 약 50 - 200 nm)을 통해 일어나고, DNA 표적물을 따라서 정렬된(혼성화된) 첫번째 금속 입자로 진행한 후 뒤이어 있는 금속 입자들로 진행한다. 입자들의 크기 및 수를 DNA 표적물에 관해서 최적화할 수 있기 때문에, 전기도금 과정을 불과 수 분 이내에 완성할 수 있다.

포획된 DNA 주형에 금속 입자 축적은 전극 부위에서의 AC 임피던스 신호의 변화를 통해서 추적할 수 있다. 도 2는 마이크로어레이에서 AC 신호 모니터링이 어떻게 수행되는지를 보여준다. DNA 표적물이 축적된 전극 상에 전기화학적 이중층이 형성되어, 히드로겔 침투층의 기공을 통해 연장된다. 금속 마이크로입자가 전기영동에 의해 DNA 표적 주형 상에 축적되기 때문에 이들은 두 전극 어레이 사이에서 용액을 통해 연장하는 전기력선을 차폐하고, 특히, 작동전극(DNA 표적물이 어드레싱되는 전극)의 임피던스의 용량성 및(또는) 저항성 성분들을 변화시킨다. 각 금속 입자는 그 자체의 전기화학적 이중층을 가진다. 전기화학적 이중층(EDL)의 두께는 대표적으로 10 nm 내지 100 nm의 범위이다(참조: 참고문헌(들) 49). 따라서, 각 입자는 입자 EDL의 그 자체의 용량성 성분을 통해 전극의 임피던스 신호를 추가로 교란시킬 수 있다. 추가로, 정렬된 금속 입자들은 두 전극 어레이 부위 사이에 삽입된 일련의 양극성 전극으로 작용할 수 있다.

이 과정들은 시드-입자 위의 전기도금 과정을 가속할 수 있을 뿐만 아니라 전극 EDL에 영향을 줄 수 있다. 심지어 전기도금 과정 없이도 입자가 축적하기 때문에 AC 임피던스 신호가 유의하게 변할 것이라고 기대된다. 그러나, 더 높은 신호 민감도를 위해, 정렬된 금속 입자를 전기도금한다. 이들은 전극 어레이 부위에 전자적으로 연결되고, 작동전극 표면적을 효율적으로 넓힌다. 나노입자의 사용은 작동전극의 전기화학적 표면적을 유의하게 변화시키고, 용이하게 측정가능한 AC 임피던스 신호 변화를 제공할 것이다. 제안된 검출 기술은 금속 입자들이 두 전극 어레이 부위 사이의 갭에 다리 놓을 때 신호 증폭이 훨씬 더 크게 일어날 것이라 기대된다. 다리 놓기는 전극에 상대적으로 긴 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써 촉진할 수 있을 뿐만 아니라 전극 간격을 최소화함으로써 촉진할 수 있다.

도 2는 특정 어레이 부위에 포획된 DNA 표적물을 따라서 전기영동에 의해 축적되고 정렬된 금속 입자들을 사용해서 표적 DNA 주형 전기도금 과정의 AC 임피던스를 모니터한 것을 보여준다. 두 가지 경우를 보여주는데, 한가지 경우는 금속 입자 태그의 클러스터 형성으로 인한 전극 임피던스 변화 및 그것이 전기력선(점선)에 미치는 영향을 나타내고(좌측), 다른 한가지 경우는 금속 입자들이 전극 부위 사이의 갭에 다리 놓을 때를 나타낸다(우측).

Poly -T 실시태양

매우 낮은 농도의 DNA 표적물의 검출이 필요한 경우에 사용될 수 있는 제안된 전자적 검출 기술의 일부인 다른 한 신호 증폭 기술이 있다. 도 3은 몇 가지 유형의 금속 입자 태크의 사용을 보여준다. 제 1 단계는 표적 DNA에 대해 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 폴리-T 테일과 같은 간단한 반복 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 둘 모두로 표지된 금속 입자를 전기영동에 의해 어드레싱하는 것을 포함한다. 다른 간단한 서열을 사용할 수도 있다. 제 2의 유형의 금속 입자 테일은 폴리 T에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드, 즉, 폴리 A 서열(또는 제 1 세트의 입자 태그 상의 서열에 대해 상보적인 유사한 간단한 서열)을 함유한다. 이 방법은 후속 어드레싱 단계에서 자기들간에 혼성화하는 금속 입자 태그의 반복적 전기영동적 어드레싱을 수반함으로써, DNA 표적물이 포획된 전극 부위에서 금속 입자들의 신속한 클러스터 형성을 촉진한다. 이것은 전극 면적의 높은 비율이 빨리 덮일 수 있기 때문에 AC 임피던스 신호의 극적인 변화를 야기할 것이다. 신호의 이 새로운 "전기영동적 증폭"은 몇 가지 별도 단계 또는 주기에서의 다수 입자 태그들의 신속한 전기영동적 어드레싱을 이용한다(입자 태그 첨가 사이에 세척 단계가 필요할 수 있음). 제 2 첨가 또는 제 2 주기가 이미 입자 태그 사이에 사슬형 혼성화를 제공하기 때문에, 높은 신호-대-노이즈 비를 얻는 데는 이러한 주기가 극소수 필요할 수 있을 것이라고 기대된다. 각 주기에서 전기영동적 어드레싱은 겨우 수 십 초 걸릴 것이고, 따라서 전체 주기적 증폭 과정은 3 - 5 분 이하일 것이다. 이 새로운 신호 증폭 기술은 극도로 신속한 고민감도 DNA 검출 시스템을 제조할 수 있게 한다.

주기적 전기영동적 어드레싱은 또한 반대 전하의 입자 태그의 어드레싱을 수반한다. 일부 금속 입자 태크를 음으로 하전되게 하거나(예: 카르복실화 입자) 또는 양으로 하전되게(예: 아민화 입자) 할 수 있다. 이들 입자 태그는 상기한 동일 유형의 올리고뉴클레오티드 표지자를 함유할 수 있다. 이 해결방법의 이점은 일단 DNA 주형이 전자적으로 혼성화되어 침투층에 앵커링(anchoring)되면, 두 전극(하나는 DNA 표적물을 함유하고 다른 하나는 상대전극임)의 극성을 반복적으로 역전시킴으로써 이들 금속 입자를 더 신속한 전기화학적 "교반" 모드로 어드레싱할 수 있다는 것이다. 제 2 또는 제 3 주기에서 태크가 동시에 첨가될 수 있고, 사슬형 혼성화 및 클러스터 형성이 극성 역전에 의해 유발될 수 있다.

도 3은 자기들간에 사슬형 혼성화를 할 수 있는 다양한 금속 입자 태그들의 주기적 전기영동적 혼성화를 통해 AC 임피던스 신호를 증진시키는 것을 나타낸다. 이것은 불과 수 회의 신속 주기 내에 일어날 수 있을 뿐만 아니라 반대 전하 입자를 이용하고 전극 부위에 적용된 전기장의 극성을 역전시킴으로써 일어날 수 있다.

실험

나노젠, 인크.는 마이크로어레이 기반 DNA 검출을 위한 소형화 통합 시스템을 이전에 설계 및 개발했었다(참조: 참고문헌(들) 50-52). 나노젠의 DNA 검출 기술(시판 나노칩(등록상표) 전자 마이크로어레이 시스템)은 단일 뉴클레오티드 다형 돌연변이에 대한 신속 정확한 결정을 가능하게 한다(참조: 참고문헌(들) 53). 나노젠은 많은 관상 및 혈색소증 질환(예: 인자 II, 인자 V, 인자 V/II 조합 검정, 낭성 섬유증, HFE, 카나반 질환 및 ApoE 유전자-만발성 알쯔하이머병)의 진단을 위한 시판 분석물 특이적 시약을 제공한다. 나노젠의 플랫폼은 소비자가 자기 자신의 어레이 및 검정을 만들어 낼 수 있도록 하는 독특하고 개방적인 플랫폼이다. 본 발명자들의 플랫폼을 사용한 SNP 결정에 기반을 둔 응용의 고객 목록은 관상동맥 질환, 심혈관계 질환, 고혈압, 심장 기능, 암 응용, 세균 식별, 다약물 내성, 혈우병, 탈라세미아 등을 포함한다.

전자 마이크로어레이를 이용한 감염 질환 병원균의 선택적 검출

이 섹션은 전자 마이크로어레이 상에 PCR 및 SDA(가닥 치환) 증폭된 DNA 표적물의 효율적인 전자적 축적 및 현행 형광 기반 검출을 이용한 그의 검출을 입증하기 위해 나노젠에서 수행한 최근 연구를 요약한다. 타당성 조사는 5 가지 사람 파필로마바이러스 HPV 타입(HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33 및 HPV 45)을 이용해서 수행하였다. 증폭은 퍼킨-엘머 9700으로 25 μL 반응물에서 PCR (앰플리태크(등록상표) 골드(AmpliTaq^® Gold))을 이용해서 수행하였다. 검출은 100-부위 칩으로 수행하였다. 도 4는 5 가지 HPV 타입 모두의 동시 검출을 보여준다. 5 가지 타입 모두가 분명히 배경 신호보다 높은 유의한 신호를 나타낸다. 5 가지 HPV 타입 중 3 가지는 10개의 카피에만 존재하였다.

도 4는 PCR을 사용하여 증폭된 5 가지 HPV 타입의 검출을 위한 100-부위 전자 마이크로어레이로 얻은 형광 데이타를 보여준다. 각 HPV 타입의 10 카피 수 정도의 낮은 검출을 입증하였다.

바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis) 및 백시니아(vaccinia)에 대한 다중화 PCR-기반 검정을 개발해서 우리의 공동연구소 (Midwest Research Institute)가 독립적인 유효성 검증을 수행하였다. 시험은 백시니아에 대해서는 헤마글루티닌 유전자를 사용하고 탄저병에 대해서는 CapB 및 보호 PA 유전자를 사용한 스크리닝 검정(screening assay) 및 확증 검정(confirmation assay)에 대한 평가를 포함하였다. 검정의 특이성은 28 개의 탄저병 균주 및 가까운 이웃 종인 바실루스 안트라시스, 백시니아, 래빗폭스(rabbitpox), 라쿤폭스(raccoonpox), 및 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum) 및 에르위니아 헤르비콜라(Erwinia Herbicola)를 포함하는 많은 기타 다른 정선한 병원체로 이루어진 패널에 대해 평가하였다. 그 절차는 (i) 바실루스 안트라시스 균주(ATCC로부터 입수가능함), 백시니아 및 사용된 모든 경쟁 균주의 철야 배양; (ii) 비드 비팅(bead beating)을 이용한 그들의 DNA 추출, 원심분리 및 시판 키트(변형된 치아젠(Qiagen) 키트)에 따른 용리; (iii) DNA 정량화(피코그린 dsDNA 정량화 키트(PicoGreen dsDNA Quantitation kit), 몰리큘라 프로브즈(Molecular Probes)), 및 (iv) a) 스크리닝 검정; b) 확증, 경쟁 검정, 및 c) 특이성 검정의 수행을 포함하였다. 실험은 필요시에 BSL 3가지 안전성 조건 하에서 수행하였다. 검출 한계(LOD)는 정량화된 DNA의 연속 희석을 이용하여 백시니아에 대해서는 0.0015 내지 1,500 PFU의 범위 또는 바실루스 안트라시스 균주에 대해서는 0.17 내지 1,700 카피 수(PCR 반응 당)의 범위에 대해서 결정하였다. (50 마이크로리터의 PCR 반응은 PE 9600 열순환기로 수행하고, 검출은 나노젠의 100-부위 전자 마이크로어레이로 달성하였음). 바실루스 트라시스(발럼 균주(Vollum strain))데 대한 시험은 CapB 스크린 검정에 대해서는 1 pg 또는 170 카피 수의 검출 한계(20개의 복제물에 대해 100％ 양성 판정), 그리고 PA 유전자에 대해서는 10 pg 또는 1,700 카피 수의 검출 한계를 입증해주었다. CapB 유전자에 대한 확증 검정은 100 fg 또는 17 카피 수의 LOD(20 개의 복제물에 대해 100％ 양성 판정)를 보여주었다. 헤마(Hema) 검정을 이용한 백시니아(ATCC VR-2010)에 대한 시험은 15 PFU(플라크 형성 단위)의 LOD를 입증해주었다. 특이성 시험(상기 시험한 가까운 이웃 종 및 다른 정선한 병원체 목록 참조)은 표적 유전자 CapB, PA 또는 헤마가 시료에 존재할 때만 양성 판정 결과를 얻었고 다른 병원체는 양성 판정 결과를 억제하지 않았다는 것을 증명해 주었다. 반응 당 1 ng DNA(170,000 카피)를 특이성 시험에 사용하였다.

칩 상에서의 가닥 치환 증폭 - DNA 표적물의 고효율 축적 입증

본 발명자들은 DNA 표적물의 등온 가닥 치환 증폭(SDA, 벡트컨 디킨슨(Bectkon Dickinson)로부터 허가됨)을 이용하는 많은 검정을 개발하였는데(참조: 참고문헌(들) 54-55), 그 이유는 이 방법이 PCR 증폭을 위해 사용되는 열순환기에 비해 휴대용 기기에서의 열 제어에는 훨씬 더 간단한 장치를 필요로 하기 때문이다. SDA 증폭에서는, DNA 중합효소가 DNA의 닉(nick)이 있는 가닥을 인식해서 그 가닥의 재합성을 개시하여 원래의 가닥을 치환한다. 이어서, 방출된 증폭산물은 용해되거나 또는 앵커링된 상보 가닥을 위한 프라이머로 용액에서 이동한다. 범퍼 프라이머라고 불리는 닉킹(nicking) 부위가 없는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 방금 생성된 증폭산물을 플랭킹한 영역에서 합성되어, 가닥 치환 및 초기 주형 복제를 돕는다. SDA 증폭을 위한 대표적인 반응 혼합물은 다음 물질로 이루어진다: a) 센스 및 안티센스 프라이머 500 nM; b) 범퍼 프라이머 50 nM; c) dNTP 혼합물 각 1.4 mM; d) Bst 중합효소 9.6 U/rxn; e) Bbv 닉킹 효소 3.75 U/rxnMg(OAc); f) 10 mM pH 7.6 포스페이트 완충액, 25 mM. 일반적으로, 반응 부피는 10 - 50 ㎕이다. 이 변수들은 실험 변수의 실험 설계(Design of Experiment, DOE) 최적화를 통해 최적화한다. 본 발명자들은 내부 증폭 프라이머(범퍼 프라이머가 아님)가 비오티닐화되고, 그들이 히드로겔 침투층에 있는 스트렙타비딘에 결합하는 특이적 전자 마이크로어레이 부위로 어드레싱된다. 이 프라이머는 제조 단계에서 칩 상에 미리 로딩될 수 있다. 약 2 개월의 기간 내에 수행된 예비 안정성 실험은 미리 로딩된 프라이머의 양호한 안정성을 입증하였다. 이 단계는 검정을 가속하고 표적물 및 리포터만의 어드레싱을 수행하는 데에 있어서 중요할 것이다. 이어서, 표적 DNA를 그것이 앵커링된 프라이머에 전자적으로 혼성화되는 어레이 부위로 어드레싱된다. 마지막으로, 마이크로어레이를 효소, 범퍼 프라이머 및 dNTP들을 함유하는 반응 혼합물로 덮고, 30 분 내지 1 시간 동안 50 ℃로 가열해서 반응 생성물을 얻는다.

도 5는 10-플렉스 칩 상에서의 SDA 증폭을 보여준다. 증폭된 유전자의 패턴이 좌측에 나타나 있다. 우측에는 증폭 및 리포팅 후의 마이크로어레이의 형광 이미지가 나타나 있다.(Nature Biotechnology, 2000년 2월).

도 5는 단일 시료 중의 10 개 이하의 상이한 유전자들을 동시에 칩 상에서 SDA 증폭을 수행하는 것이 가능하다는 것을 입증한다. 이 실험은 전자 마이크로어레이 상의 감염 질환 및(또는) 생물 무기의 동정과 관련있는 5 개의 사람 유전자 및 5 개의 세균 유전자의 다중화를 보여준다. 본사의 소형화 프로토타입 마이크로어레이 검출 기기(도 7에 도시됨)를 사용한 감염 병원균 및(또는) 생물 무기의 검출을 위해 많은 칩 상에서의 SDA에 기반을 둔 검정을 개발하였다. 4 개의 생물 무기에 대해 다음 6 개의 유전자를 분석하였다: 바실루스 안트라시스(탄저병)(cap B 및 PA 유전자), 백시니아(헤마글루티닌 유전자), 황색포도상구균(sea 및 seb 유전자) 및 역병(예르시니아 페스티스)(플라스미노겐 활성인자, PLA 유전자). 앵커링된 증폭 이전에 일정 범위 농도의 각 DNA를 어드레싱하였다. 백시니아에 대해서는 흔히 85 카피 수의 DNA/㎕(검출 챔버 내에서) 정도의 낮은 농도를 검출할 수 있었다. B-리스트 CDC 유전자, 예를 들어 이. 콜리(E. Coli) 및 살모넬라 티피뮤리움(S. typhymurium)에 대해서는, 10 - 100 카피 수의 DNA(증폭 반응의 출발 부피에 대해서)의 범위의 재현성있는 앵커링된 SDA 데이타가 얻어진다. 최근에, 본 발명자들은 어레이 전극 당 5 카피 수 정도의 낮은 백시니아 DNA 표적 유전자가 1 분간의 전자적 어드레싱 기간 내에 효율적으로 축적될 수 있다(휴대용 기기를 이용해서 얻은 결과)는 것을 입증하였다. 칩 상에서 85 카피 수/㎕를 사용하여 18 개의 어드레싱된 전극에서 양성 결과를 얻었다(85/15, 약 5 카피 수/전극 생성함). 그 결과는 각 전극 어레이 부위 상에서의 DNA 농도의 SDA 증폭 후에 얻었다. 이것은 전자적 어드레싱이 시료 중에 존재하는 극소수의 DNA 분자들이 전극 어레이 부위에 효율적으로 포획될 수 있는 제안된 직접 무증폭 검출 기술에 사용할 수 있을 정도로 충분히 효율적임을 입증하였다. 이것은 제안된 검출 기술의 문제점들 중 한가지를 해결한다. 즉, 매우 짧은 기간 내에(1분 이내) 어레이 부위에 1개 또는 수 개의 DNA 표적 분자가 부착될 수 있음을 입증한다.

전자 마이크로어레이 상의 AC 임피던스 측정

본 발명자들은 전기영동적 DNA 축적이 촉진되는 조건에서 400-부위 마이크로어레이 상의 전극 어레이 부위 사이에서 초기 AC 임피던스 측정을 수행하였다. 도 6a 및 도 6b에 나타낸 AC 임피던스 스펙트럼은 히스티딘 지지 전해질 농도의 함수로서 칩 기준전극에 대해 적용된 두 작동전극 퍼텐셜에서 두 전극 어레이 부위(위치 1,1 및 1,10이 도시됨; 첫번째 숫자는 마이크로어레이에서의 행을 표시하고 두번째 숫자는 열을 표시함)에서 일어나는 용량성 및 저항성 성분의 변화를 입증한다. 스펙트럼은 대표적인 랜들즈(Randles) 대응회로 원 모양(도 6 참조)을 보여준다. 히스티딘 농도를 증가시키면, 반원이 더 작아지는데, 이것은 용액 중의 전기활성 종의 농도가 높아지기 때문에 전류가 높아진다는 것을 의미한다. 도 6에 나타낸 반원에 대해 최소자승법 적합도를 이용하여 모든 임피던스 스펙트럼에 대해 분극 저항 R_p 및 용액 저항 R_s을 계산하였다. 낮은 전도도에서, 즉, 낮은 전해질 농도에서, E_DC = 0.0 V에서의 R_P/R_S 비는 더 높은 전해질 농도에 비해 최대 100배(two orders of magnitude)까지 더 높다. 또한, 이 경향은, 비록 농도에 따른 R_P/R_s 비 감소가 더 작지만(즉, 최대 10 배까지 감소함), E_DC = 1.3V에서도 관찰할 수 있다. 이 결과는 낮은 전해질 농도에서는 전체 저항이 매우 높고 분극 저항에 의해 좌우된다는 것을 명확하게 입증한다. 결과적으로, 전극 어레이에서의 전체 전류는 매우 작고, 용액 임피던스가 전극의 기하학적 배열에 의해 영향받을 수 있다. 이러한 임피던스 특성은 전자 마이크로어레이를 이용한 본 발명자들의 검정의 적합한 조건을 엄밀하게 기술한다. 이 데이타는 어레이 부위 상의 전극/전해질 계면이 전극 상에 흡착 종 존재에 의해서 뿐만 아니라 전극 기하의 변화에 의해서 유의하게 영향받을 것이라는 점을 알려준다. 금속 나노입자 태그의 축적, 특히 DNA 표적물의 사슬형 전기도금에서 지수증폭이 전극의 전기화학적 표면적을 극적으로 증가시킬 수 있고, 어레이 부위에 축적된 DNA 농도에 의존하는 용이하게 측정가능한 임피던스 신호를 생성할 수 있다.

연구 설계 및 방법

제안된 연구의 전반적인 목적은 낮은 카피 수의 DNA 표적물의 전자적 어드레싱을 이용하는 새로운 마이크로어레이 검출 플랫폼 개발 및 어레이 부위에 부착된 DNA 표적 분자의 금속화 과정의 전기화학적 AC 임피던스 신호를 이용한 그의 검출의 타당성 면을 입증하는 것이다. DNA 주형 전기도금 동안의 AC 신호를 증진시키는 데 금속 입자 태그를 사용하고, 입자 태그의 주기적 전기영동적 어드레싱을 통해 신호를 증폭한다. 전자 검출 시스템은 카트리지 뿐만 아니라 기기를 소형화된 포맷에 패키징하는 것을 가능케 하고, 이것은 휴대용 기기의 개발을 허용한다. 제안된 연구는 휴대용 DNA 마이크로어레이 기기 및 필요한 유체공학(fluidics)을 포함하는 현존하는 프로토타입 소형화 플랫폼의 개발을 위한 본 발명자들의 이전의 노력에 지렛대(leverage) 역할을 하게 될 것이고; 제안된 검출 시스템의 유효성 검증에 전자 및 소프트웨어 성분들을 개조해서 사용할 것이다. 다음은 제안된 연구의 구체적 기술 목표이다.

금속 입자 태그 존재 하에서 DNA 금속화 과정의 AC 임피던스 검출.

제안된 검출 시스템에 적당한 전극 어레이 기하를 갖는 전자 마이크로어레이 및 카트리지의 설계 및 제작.

DNA 표적 분자의 무증폭 신속 민감 검출의 입증.

검출 시스템의 대표적 검정 및 유효성 검증을 위한 설계 및 시험

제안된 연구 및 개발 노력에서 계획된 실험들은 전부 나노젠의 시설에서 수행할 것이다. 마이크로어레이 칩 제작을 위한 마스크는 실리콘 미세가공기술 회사에 하청할 것이고, 어레이 및 카트리지 제작은 본사의 시판 기기에 확립된 방법 및 판매처를 이용해서 본사에서 제조할 것이다. 나노젠은 모든 필요한 장비, 미세가공 시설(청정실, 클래스 100 및 1000), 미생물학 및 분자생물학 실험실 뿐만 아니라 프로젝트의 모든 작업을 수행할 수 있는 인적 자원을 가지고 있다.

금속 입자 태그 존재 하에서의 DNA 금속화 과정의 AC 임피던스 검출

전기화학적 임피던스 분광분석(참조: 참고문헌(들) 56)은 전극/전해질 계면에서 용량성 및 저항성 성분을 결정하는 데에 있어서 작동전극에 일정 범위의 주파수(수 마이크로 Hz 내지 M Hz 범위)로 적용되는 작은 10 - 50 mV 사인형 퍼텐셜 신호를 이용한다. 이 방법은 전기화학적 이중층 구조(용량성 거동)의 기계론적 통찰을 가능케 하고, 전류 및 확산 제어 과정의 패러데이 또는 전기활성 성분을 판별할 뿐만 아니라 그것은 전극 상의 코팅 또는 흡착의 저항성 또는 용량성 거동을 제공한다. 임피던스는 보통 복소 함수(방정식 1 - 3 참조)로 표현되고, X 축에 실수 또는 저항성 성분을 나타내고 Y축에 허수 또는 용량성 성분을 나타내는(도 6 참조) 나이키스트 선도(Nyquist plot)을 이용해서 데이타를 나타낸다. 위상편이 및 임피던스의 절대값을 주파수의 함수로 검사하기 위해 보데 선도(Bode plot)을 사용한다. 통상적으로는, 실험 조건이 변하기 때문에 임피던스 신호의 지배적인 실수(저항성) 또는 허수(용량성) 성분의 이해를 돕고 계면의 모델을 제공하는 전자 대응회로를 확립한다.

E(t) - E₀ exp(jωt) (1)

I(t) - I₀ exp(jωt - jφ) (2)

상기 방정식에서, E는 적용된 사인형 퍼텐셜이고, I는 전류 응답이고, ω는 각속도이다. 그 다음, 임피던스는 복소수로 나타낼 수 있다.

Z = E/I = - Z₀ exp(j,φ) = Z₀ (cosφ + j sinφ) (3)

관능화된 전극에서 항체/항원 결합 효과를 검출하는 데에 최근에는 AC 임피던스를 사용하였다(참조: 참고문헌(들) 57). 이 결과는 특이적 항체로 관능화된 전극과 대조(비결합) 항체를 갖는 전극을 비교했을 때 AC 신호가 25％ 차이가 난다는 것을 보여주었다. 이 예 뿐만 아니라 본 발명자들의 예비 데이타 중 일부는 AC 임피던스 연구가 전극 표면 상에서 직접 일어나는 흡착 또는 탈착 과정을 모니터하는 데 적당하고, 따라서, 작동전극의 표면적의 최소 변화를 반영한다는 것을 입증한다. 입자 축적, 특히, DNA 표적 분자 상에서의 주기적 전기영동적 어드레싱에 의해 증진될 때의 입자 축적은 히드로겔층 나노기공을 통해 연장하는 전기화학적 이중층에 영향을 주어서, DNA 표적물 및 금속 입자 시드의 전기도금 동안에 실질적인 임피던스 변화를 발생시킬 것이다.

다음은 제안된 실험의 원리이다: 1. 많은 마이크로어레이 전극 부위 상에 포획 DNA 표적물의 존재 또는 부재 하에서의 AC 임피던스 스펙트럼들을 확립해서 비교하고, 신호의 재현성을 확립할 것이다; 2. 특정 전극 부위에서의 전기도금 과정에 대해 임피던스 변수의 기본적 변화를 조사할 것이다; 3. DNA 표적물에 어드레싱된 금속 입자의 존재 및 부재 하에서 DNA 주형 전기도금 과정에 대해 임피던스 신호를 결정할 것이다; 4. AC 신호의 가장 현저한 임피던스 성분의 의존성을 어레이 유체공학 챔버에 첨가된 DNA 농도의 함수로 조사할 것이다. DNA 표적물은 몇 가지 수준의 복잡성을 포함할 것이다: a) 서열이 알려진 PCR 증폭 및 정제된 DNA (크기: 200 - 1,000 bp(ATCC로부터 입수가능한 게놈 DNA; 많은 병원균, 예를 들어 예르시니아 페스티스, pla 유전자, 리스테리아 모노사이토젠(Lysteria monocytogene), hly 유전자, 폐렴연쇄구균, ply 유전자, 탄저병, 몇 가지 유전자 등)에 대해서 DNA 표적물 및 설계된 프라이머가 입수가능함)로 초기 최적화를 수행할 것이다; b) 일단 조건이 최적화되면, 게놈 DNA (5 - 6 Mbp)를 특징적 유전자 서열 표적에 대해 시험할 것이다; c) 작업 4에서 게놈 DNA를 이용하여 완전 검정을 시험할 것이다.

기본적 임피던스 연구는 오토랩 에코 케미(Autolab Eco Chemie) 정전압/주파수 응답 분석기, 모델 PGSTAT20을 이용해서 수행할 것이다(몇 가지는 나노젠에서 입수가능함). 임피던스 변수는 다음 범위에서 검사할 것이다: 10 - 50 mV 진폭에서의 사인형 AC 신호; 어레이 전극 사이의 주파수 범위 20 kHz - 5 Hz. DC 퍼텐셜(E_DC)는 전극 어레이를 둘러싸는 Ag/AgO QRE에 대해서 및(또는) 외부 표준 칼로멜 전극에 대해 조절할 것이다. 완충 전해질은 히스티딘(농도 10 - 100 mM), 저염 완충액(포스페이트 완충액) 및 고염 완충액(염화나트륨 이온을 갖는 포스페이트 완충액)을 포함하는 전자 마이크로어레이 DNA 분석 수행을 위한 본 발명자들의 표준 완충액을 포함할 것이다. 본 발명자들은 카트리지 및 칩과의 접촉을 제공할 수 있는 고정구를 개발하였다. 400-부위 어레이/카트리지(도 8 참조)를 수용하는 DUST 프로그램(도 7 참조)의 일부로서 개발된 400-부위 소형 프로토타입 시스템을 전자적 어드레싱 뿐만 아니라 추가의 임피던스 측정을 수행하는 데 사용할 것이다. 이 시스템은 DNA 표적물로의 입자의 혼성화(이 목적으로는 형광 표지된 입자가 사용될 것임) 뿐만 아니라 침투층의 올리고뉴클레오티드 프로브에의 DNA 부착에 대한 확인으로 사용될 붙박이 형광 검출 시스템을 갖는다. CMOS 칩은 16 x 25 (400-부위) 어레이를 가지고, 각 전극은 직경이 50 ㎛이고 중심간 거리가 150 ㎛이다. CMOS 칩은 세라믹 기판(0.015" 두께) 상에 플립-칩 결합되고, 이것은 추가로 카트리지 내에서 감압 접착제에 의해 기계화된 커버 플레이트(아크릴)와 결합된다(도 8 참조). DNA 길이가 약 0.34 nm/bp라고 가정할 때, DNA 다리 놓기 실험은 20 - 40,000 bp DNA 주형을 사용할 것이다. 따라서, 이들 DNA의 크기는 2 - 4 마이크론 범위이고, 이들은 새로 설계된 칩의 전극 거리에 다리를 놓을 수 있을 것이다.

도 7은 전기활성 마이크로어레이 및 광학 검출기를 갖는 나노젠의 휴대용 프로토타입 기기이다. 이 기기는 랩톱(좌측)에 의해 조작된다. 이 기기의 성분들은 카트리지 투입구, 시약 저장기, 연동식 펌프, 전자 제어기, 및 CCD 카메라(우측)가 있는 광학 검출 시스템을 포함한다.

도 8은 400-부위 CMOS ACV400-칩 카트리지 및 어레이의 사진이다. 2 개는 가로로, 2 개는 세로로 배치된 4 개의 상대전극이 활성 작동전극 어레이를 둘러싼다.

제안된 검출 시스템에 적합한 전극 어레이 기하를 갖는 전자 마이크로어레이 및 카트리지의 설계 및 제작

이 작업의 주 목표는 제안된 검출 기전을 위한 최고 AC 신호를 보장하는 전극 기하를 갖는 마이크로전자 어레이를 개발하는 것이다. 이것은 전극의 간격 및 직경을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 대략 유사한 간격을 갖는 3 - 5 마이크론 범위의 전극 직경은 더 높은 AC 신호를 제공할 것이고, 특히 그것은 두 전극 부위 사이에 다리 놓기를 달성할 수 있는 기회를 증가시킬 것으로 기대된다. 이 수준의 선 분해능은 현행 400-부위 어레이 생산에 사용되는 동일한 리소그래피 기술을 이용하여 달성할 수 있다(백금 침착을 위한 RF 스퍼터링 및 절연성 이산화규소 침착을 위한 플라즈마 증진 화학 증착(PECVD) 기술). 이 칩의 생산을 위한 모든 장비는 입수가능하고 방법들은 나노젠에 확립되어 있다. 마스크 제작 및 플립-칩 과정은 표준 판매처를 이용해서 수행할 것이다. 히드로겔 침투층은 자동화 마이크로몰딩 및 UV 경화 장비를 이용해서 본사에서 제작한다. 이 작업의 실험들은 이웃 전극 어레이 부위 사이의 갭(예: 1,000 - 10,000 염기쌍)에 다리 놓기 위한 더 큰 올리고뉴클레오티드 프로브 뿐만 아니라 주형 DNA에 대해 특이적인 서열을 갖는 프로브에 혼성화되는 더 작은 뉴클레오티드 프로브의 사용을 포함할 것이다.

DNA 표적 분자의 무증폭 신속 민감 검출의 입증

이 작업은 DNA 표적 금속화의 AC 임피던스 특성화를 최적화하기 위한 다른 중요 변수들을 정의 및 시험하는 것에 촛점을 둘 것이다. DNA 표적물은 PCR 증폭 DNA 시료를 모방한 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오티드일 것이다. 그의 길이는 수 십 내지 수 백 염기쌍의 범위일 것이다. 더 짧은 주형은 생산물의 PCR 증폭 및 정제를 이용해서 얻어질 것이다. 본 발명자들은 인자 II 또는 인자 V 서열과 같은 잘 조절된 DNA 시료로 사용되는 많은 DNA 주형을 가지고 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 DNA 주형에 대해 높은 특이성을 보장하기 위해 50 - 80 염기쌍의 범위일 것이다. 이 작업에서 계획된 실험들은 다음과 같은 점에 대해서 입자 태그를 최적화하는 것을 포함할 것이다: a) 입자 직경 - 범위: 10 nm 내지 1 ㎛의 직경; b) 입자의 전하: 양전하를 띤 카르복실화 입자 및 음전하를 띤 아민화 입자가 상기 설명한 바와 같이 AC 신호를 증진시키기 위해 전극 극성 역전을 이용한 주기적 전기영동 측정에 사용될 것임; c) 올리고뉴클레오티드 표지자: 한 세트의 입자 태그는 후속 전기영동적 어드레싱(증폭) 주기에서 다른 입자 태그에 리포팅 및 혼성화하기 위해 DNA 표적에 대해 상보적인 두 서열 뿐만 아니라 폴리-T(또는 유사한 반복 서열)로 표지될 것이고; 다른 입자 태그(첫번째 세트에 추가한 후속 태그)는 폴리-T에 상보적인 서열(또는 유사한 상보 서열)을 갖는 폴리-A 올리고 표지자를 함유할 것임; d) 입자 태그 상의 올리고뉴클레오티드 프로브 커버리지(coverage)의 농도 - DNA 주형 상에 입자 태그의 효율적 클러스터 형성을 달성한다는 점에서 입자 상의 올리고 프로브의 최적 농도가 있을 것으로 기대됨; e) DNA 표적 주형에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 갖는 입자 태그의 수 - 가장 신속한 시딩 및 가장 효율적인 금속화를 위한 조건을 달성하기 위해 DNA 표적의 크기 및 입자 크기에 관해서 DNA를 따라 정렬되는 상보적 태그의 수가 최적화될 것임.

입자와 올리고 프로브 사이의 몇 가지 결합 기술을 시험할 수 있지만; 상업적으로 입수가능한 입자들을 가능할 때 언제라도 사용할 것이다. DNA 올리고뉴클레오티드 프로브는 비드와 직접 공유결합되어 입자 당 불과 수 개의 프로브 내지 10⁵개 정도로 많은 수의 범위의 표면 커버리지를 얻는다. 올리고뉴클레오티드 입자 태그는 poly dT, poly dA, poly dC 또는 poly dG 서열로 이루어질 수 있다. 추가로, 특이적 포획 서열이 비드에 첨가될 수 있거나 또는 비드 혼합물이 사용될 수 있다. 별법으로, 비드를 스트렙타비딘과의 공유결합으로 개질시킨 후, 비오티닐화 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합하는 데 사용할 수 있다. 카르복실 및 아민 말단 입자, 및 아민 말단 양자 점은 폴리사이언시즈(Polysciences), 모사이(MoSci), 나노스피어(Nanosphere), 피어스(Pierce), 세라딘(Seradyn), 다이날(Dynal) 및 퀀텀 도트(Quantum Dot)를 포함해서 몇몇 판매처로부터 입수가능하다. 몇 가지 시약을 사용해서 스트렙타비딘 또는 DNA를 비드에 직접 공유결합시킬 수 있다. 양전하를 띤 아민화 비드인 경우에는 글루타르알데히드를 사용해서 비드를 활성화시킨 후, 비드 당 조절된 밀도의 프로브를 달성하는 정확한 농도로 5' 또는 3'-아미노 개질 DNA 서열을 첨가할 수 있다. 별법으로, 스트렙타비딘을 글루타르알데히드 활성화 비드에 첨가해서 스트렙타비딘 서브유닛 상의 말단 리신 잔기를 통해 공유결합시킬 수 있다. 이어서, 연결된 비드를 표면에 알짜 양전하를 유지하고 남은 알데히드 연결기와 반응하도록 모노에틸아민을 사용해서 부동태화시킨다.

음전하를 띤 카르복실화 비드의 경우에는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)를 사용해서 비드를 활성화시킨 후, 비드 당 조절된 밀도의 프로브를 달성하는 적절한 희석율로 5' 또는 3'-아미노 개질 DNA 서열을 첨가할 수 있다. 별법으로, 스트렙타비딘을 EDC 활성화 비드에 첨가해서 스트렙타비딘 서브유닛 상의 말단 리신 잔기를 통해 공유결합시킬 수 있다. 이어서, 연결된 비드를 표면에 알짜 음전하를 유지하고 남은 o-아실이소우레아 연결기와 반응하도록 글리신을 사용해서 부동태화시킨다.

DNA 주형/올리고뉴클레오티드 프로브 다리 놓기 실험에서의 확률 및 조건을 시험하는 데는 크기가 큰 DNA 주형을 사용할 것이다. 이들은 상업적으로 입수가능한 5 내지 20 kb 염기쌍의 크기 범위의 클로닝된 플라스미드를 포함할 수 있다 (예: 인비트로젠(Invitrogen)은 다양한 크기의 동결건조된 플라스미드를 제공하고, 예를 들어, 카탈로그 #V004-50인 에피좀 포유동물 발현 벡터 pREP4는 10.3 kb를 갖는다). 플라스미드를 원하는 길이로 절단하는 데 사용할 수 있는 일련의 제한효소를 제공한다(예: AatI는 pREP4 상에 단 1개의 절단부를 제공할 것임). 센서 응용을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브의 설계를 단순화시키는 서열이 알려진 플라스미드를 사용할 것이다. 이들 긴 프로브들은 이웃 전극에 부착해서 DNA 주형 및 연장된 입자 태그와 다리 놓기 위한 더 긴 아암(arm)을 제공할 것이다. 일단 금속화되면(상기한 바와 같음), 전류가 금속화 다리를 거쳐 흐르고, 두 전극 사이에 단락이 발생할 것이기 때문에 극히 높은 임피던스 신호-대-노이즈 비를 제공할 것이다. 주목해야 할 것은 두 전극 부위 사이에서의 다리 놓기는 몇 개의 단일가닥 DNA가 서로간에 말단에서 또는 금속 입자 태그를 통해서 부착되어 이루어질 것이라는 것이다.

검출 시스템의 대표적 검정 및 유효성 검증을 위한 설계 및 시험

제안된 검출 방법을 적절하게 유효성 검증하기 위해, 서열이 정확하게 알려진 DNA 표적 시료를 검정 설계에 사용할 것이다. 본 발명자들은 몇 가지 관련 플라스미드 구조체 뿐만 아니라 서열이 알려진 게놈 DNA, 예를 들어 우삼리드(USAMRIID)로부터 얻은 백시니아 플라스미드 또는 pla 플라스미드(역병)를 가지고 있다. 이 작업은 시료 제조 단계들과의 통합 잠재성을 포함해서 전체 검정을 수행하는 면들을 검사할 것이다. DUST 프로그램을 통해 개발된 휴대용 기기는 시료 제조 및 제안된 새로운 검출 시스템을 모두 수용할 수 있다. 항체 또는 올리고뉴클레오티드 표지된 자성 입자를 제안된 검출 기술에 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 이것은 항체 표지된 비드를 사용하여(DUST 프로그램을 통해 본 발명자들은 몇 가지 감염 질환 병원균, 예를 들어 이. 콜리, 살모넬라 티피뮤리움, 폐렴연쇄구균 등에 대해 특이적인 많은 항체 표지된 비드를 개발함) 시료로부터 병원균을 자성 분리하는 것으로 이루어지는 간단한 시료 제조 단계와의 통합을 가능케 할 것이다. 따라서, 병원균(또는 관심 세포)가 자성에 의해 제일 먼저 분리되고 용해된다(본 발명자들은 간단한 열적 용해 단계가 ㎖당 10 - 100 정도의 낮은 병원균 수준을 효율적으로 분리 및 확증하는 데 만족스럽다는 것을 발견함). 필요하면, 먼저, 방출된 게놈 DNA를 효소에 의해 절단하여 서열이 알려진 정확한 갯수의 절단물을 얻을 수 있다. DNA 표적물은 히드로겔 침투층 상의 비오티닐화 올리고뉴클레오티드 프로브에 전자적 어드레싱함으로써 마이크로어레이에 포획된다. 이어서, 올리고뉴클레오티드 표지된 금속 입자를 첨가하고, DNA 표적물 금속화에 대한 AC 임피던스 검출에 대해서 상기한 바와 같이 검정을 수행한다. 이 작업으로 검정 단계의 최적화를 얻게 되고, 제안된 전자적 검출 방법의 견뢰성 및 재현성 뿐만 아니라 민감도를 평가할 것이다. 유효성 검증은 관심 대상인 DNA 크기 200 - 1,000 bp의 PCR 증폭 서열에 대해서 뿐만 아니라 대표적인 게놈 DNA(4 - 6 Mbp, 시료 제조 과정에서 효소에 의해 또는 열 처리에 의해 조각으로 절단됨)에 대해서 수행한다.

본 발명의 정신 및 범위에서 벗어남이 없이 본 발명을 변경시킬 수 있다는 것이 당업계 숙련자에게는 명백하다. 따라서, 첨부된 특허청구의 범위에 비추어 필요할 수도 있을 때를 제외하고는 본 발명이 제한되지 않는다.

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55. "마이코박테리움 튜베르쿨로시스 및 다른 마이코박테리아로부터 DNA 서열의 다중 가닥 치환 증폭(SDA) 및 검출", 테렌스 워커(Terrance Walker), 제임스 내도(James Nadeau), 패트리샤 스피어즈(Patricia Spears), 제임스 쉬람(James Shram), 콜린 니츠(Colleen Nycz) 및 다릴 생크(Daryl Shank), 문헌[Nucleic Acids Research 22(13) 2670-2677(1994)].

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Claims (12)

1. 둘 이상의 마이크로어레이 위치와 결합된 특이적 프로브를 갖는 전자 마이크로어레이를 제공하는 단계,

   마이크로전극 어레이의 특정 전극 부위에 표적물을 전자적으로 축적하는 단계,

   표적물 상에 올리고뉴클레오티드로 표지된 전도성 입자를 순차적으로 전자적 혼성화하는 단계, 및

   전극 부위에서 전기화학적 AC 임피던스 변화를 모니터하는 단계

   를 포함하는 혼성화된 표적물의 전자적 검출 방법.
2. 제1항에 있어서, 표적물이 게놈 표적물인 방법.
3. 제2항에 있어서, 게놈 표적물이 핵산인 방법.
4. 제3항에 있어서, 핵산이 DNA인 방법.
5. 제3항에 있어서, 핵산이 RNA인 방법.
6. 제1항에 있어서, 입자가 나노입자인 방법.
7. 제1항에 있어서, DNA 표적물 위에 전기도금하는 단계를 더 포함하는 방법.
8. 제4항에 있어서, 표적물이 금속화 주형으로 사용되는 방법.
9. 제1항에 있어서, 전도성 입자가 금속 입자인 방법.
10. 제9항에 있어서, 금속 입자가 금인 방법.
11. 제9항에 있어서, 금속 입자가 은인 방법.
12. 제9항에 있어서, 금속 입자가 팔라듐인 방법.

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