JP4706074B2

JP4706074B2 - 生体分子固定化用の三脚型機能性界面分子とこれを用いた遺伝子検出デバイス

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Publication number: JP4706074B2
Application number: JP2005093399A
Authority: JP
Inventors: 純夫丸山; 利弥坂田; 英典大塚; 裕二宮原
Original assignee: National Institute for Materials Science
Current assignee: National Institute for Materials Science
Priority date: 2005-03-29
Filing date: 2005-03-29
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2025-03-29
Also published as: WO2006104035A1; WO2006104035A8; WO2006104035A9; JP2006275670A

Description

本発明は、遺伝子診断、遺伝子発現解析、あるいは遺伝子多型解析など、バイオテクノロジーの分野、特に遺伝子検査の分野において有用な、核酸を基板上に配向させて固定化することのできる新しい手段としての分子構成体と、これを用いた、複数の異なる核酸を高精度に並列的に解析することのできる遺伝子検出デバイスに関するものである。

ヒトゲノムの全塩基配列解読が終了し、他の生物のゲノム塩基配列解読が急速に進展する中、膨大な塩基配列情報が蓄積されつつある。これらのゲノム塩基配列情報をもとに、生体中における遺伝子の機能を明らかにすることにより、各種疾病の診断、医薬品の開発、農作物の品種改良など広範囲な分野で遺伝子関連技術の開発が飛躍的に進むものと期待されている。これらの新規な技術分野発展の基礎となるのが、塩基配列の情報に加えて、遺伝子の発現及び機能に関する情報である。このような遺伝子の機能及び発現解析を大規模に行い、遺伝子検査へ発展させる技術として、ＤＮＡチップあるいはＤＮＡマイクロアレイ（以下、両者を総称してＤＮＡマイクロアレイという）がAffymetrix社やNanogen社
などで開発されている。

これらのチップやマイクロアレイの技術において、ガラスなどの基板上への核酸の固定化方法には、ポリリジン、アミノシラン、チオールなどを用いる方法が開発されている。ポリリジンは水溶液中で正に帯電するので、ガラス基板にコーティングするとＤＮＡの負電荷と静電的に引き合い、ＤＮＡがガラス基板上に固定化される。ただ、ＤＮＡは基板に静電的に吸着するので、密度や配向性の制御は困難である。アミノシランを用いる生体分子の固定化方法では、ガラス表面のシラノール基にアミノシラン剤を反応させてアミノ基を導入し、グルタルアルデヒドなどの二官能性試薬を作用させてアルデヒド基に置換し、末端をアミノ基で修飾したオリゴヌクレオチドを反応させて、オリゴヌクレオチドプローブを基板表面に固定化する。この方法では、オリゴヌクレオチドプローブには末端のアミノ基のほかに塩基にアミノ基が存在するため、必ずしも末端のアミノ基とのみアルデヒド基が反応するとは限らず、やはりオリゴヌクレオチドの配向性の制御は困難である。一方、チオールを用いる固定化方法は、チオールと金の親和性を利用する方法である。そのため基板表面に金の薄膜を形成する場合が多い。オリゴヌクレオチドプローブの末端をチオール基で修飾し、金表面に導入するとチオールと金の親和性によりオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化される。原理的にこの方法ではオリゴヌクレオチドは金表面と末端のチオール基を介して固定化される。しかし、オリゴヌクレオチドはチオール基の固定化点のまわりに回転することができ、配向性よく固定化することは困難である。チオールの自己組織化により、基板上で密に配列される場合には一定角度の配向性を持って固定化される。しかし、温度やｐＨに対する安定性が悪く、核酸プローブが金表面から離脱しやすかった。また自己組織化により最密に固定化されるので、隣同士の核酸プローブの立体障害によりハイブリダイゼーション効率が低下する。

このように、金とチオールとの親和性を利用する現状のＤＮＡプローブの固定化方法は密度と配向性の制御が困難であり、再現性の良好な結果を得るためには密度と配向性の制御が可能な固定化方法の開発が望まれている。

また、現在開発されているＤＮＡマイクロアレイは、ハイブリダイゼーションに基づく二本鎖ＤＮＡの検出を基本原理としているので、反応の選択性があまり高くなく、精度向上が課題である。特に医療の分野では、テーラーメイド医療の実現には一塩基多型（ＳＮ
Ｐ）を高精度にかつ簡便に検出する必要がある。したがって簡便性と高精度化の両方を満足させる技術が求められる。これらの問題を解決する方法として、酸化・還元標識と組み合わせた電流検出方式のＤＮＡマイクロアレイがいくつか報告されている。たとえば、分子ワイヤーと称する分子の一端を金属電極上に固定化し、他端に核酸プローブを結合させ、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーションに基づく酸化・還元標識と金属電極の電子の授受を電流変化として検出し、ターゲット遺伝子を検出する方式が開発されている（非特許文献１）。また、電気化学的活性のある標識剤としてFerrocenylnaphthalene Diimideを用い、金属電極における酸化・還元電流を計測することにより、ハイブリダイゼー
ションを検出する方式も開発されている（非特許文献２）。電流検出方式ＤＮＡチップを用いて、Ｃ型肝炎の薬効検査を行うシステムも開発されている（非特許文献３）。この方式では高価なレーザや複雑な光学系を必要としないため、簡単で小型のシステムを構築することができる。しかしながら、金属電極上での酸化・還元反応を検出の基本原理としているため、試料中に酸化物質あるいは還元物質（例えばアスコルビン酸）が存在すると、酸化又は還元に基づく電流が流れ、遺伝子検出の妨害となり検出精度が劣化する。また、電流計測に伴い、金属電極上で電極反応が進行する。電極反応は不可逆で非平衡反応であるため電極の腐食、ガスの生成などが生じ、固定化した核酸の剥離や電流測定の安定性が損なわれたりするので、特に繰返し測定する場合に検出精度が劣化する。

さらにまた、電界効果デバイスを用いＤＮＡのハイブリダイゼーションを検出する試みも報告されている（非特許文献４）。これはＤＮＡ分子が溶液中で負電荷を有していることを利用し、電界効果を利用してハイブリダイゼーションによる電荷変化を検出するものである。しかしながら、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism，ＳＮＰ）のように２つの遺伝子のわずかの違い（一塩基の違い）を検出するには感度、精度（選択性）共に悪く、また高価なデバイスを使い捨てにするため低価格化が課題である。
Nature Biotechnology，vol.16，(1998) p27，p40 Analytical Chemistry，72，(2000)1334 Intervirology，43(2000)124-127 J. Phys. Chem. B 101，(1997)2980-2985

そこで、本発明は、以上のような背景から、従来の核酸の固定化方法、そして従来のＤＮＡチップの問題点を解消し、高感度・高精度に遺伝子測定が可能で、かつ低価格システムを実現することのできる新しい核酸固定化のための技術手段とこれを用いた遺伝子検出デバイスを提供することを課題としている。

高感度・高精度に遺伝子を検出するためには、核酸プローブを基板上に配向させて固定化することが重要である。そこで本発明では、基板と３点で結合する分子を介して核酸を固定化する。すなわち、炭素原子の正四面体構造の４つの頂点のうちの３つにチオール基を結合配置し、他のひとつにオリゴヌクレオチド結合性基を結合配置し、チオール基３点で金基板表面に固定化され、残りのオリゴヌクレオチド結合性基を利用してオリゴヌクレオチドを固定化することを可能としている。炭素原子の正四面体構造の骨格を利用しているため、オリゴヌクレオチドは基板表面に垂直に配向して固定化することができる。また、１個のオリゴヌクレオチドプローブに対してチオール基３点で基板表面に固定化されるので、１点での固定化より基板との結合力が強く、安定性に優れたオリゴヌクレオチドプローブを提供することができる。

このようにチオール基３点で固定化される本発明の三脚型界面分子においては、たとえばガラス基板にアレイ状に形成された金電極の表面にチオール基をもって結合される。そ
して、オリゴヌクレオチド結合性基をもってオリゴヌクレオチドを結合することで複合体を形成することができる。

オリゴヌクレオチド結合性基は、カルボキシル基またはアミノ基とすることができる。これに対応して、オリゴヌクレオチド結合性基がカルボキシル基の場合にはオリゴヌクレオチド末端に修飾されたアミノ基、あるいはアルデヒド基を用いてオリゴヌクレオチドを結合して固定化することができる。このようにして形成されるＤＮＡマイクロアレイは蛍光検出のほか電流検出方式にも使用することができる。さらに電界効果トランジスタのゲート絶縁膜表面に金ゲート電極の形成し、その表面に上記３点固定化三脚型界面分子複合体を形成することにより、遺伝子検出用電界効果トランジスタを製作することもできる。

また、本発明の遺伝子検出デバイスは、絶縁ゲート型電界効果トランジスタのゲート絶縁膜上にチャネル部に沿ってチャネル部を囲うように金属電極を形成し、上記３点で結合する三脚型機能性界面分子を介して核酸を該金属電極表面及び側面に固定化することができる。これによってターゲット遺伝子と金属表面及び側面でハイブリダイゼーションを行わせ、さらに酵素を用いたＤＮＡの伸長反応やインターカレーター分子との反応など分子生物学的反応工程を金属表面及び側面上で行わせる。そしてその際に生ずる表面電荷密度の変化を電界効果トランジスタを利用して電気信号の変化として検出する。表面電荷密度の変化を大きくして高感度測定を実現するために、ターゲットＤＮＡ自身が持っている負電荷に加えて、核酸の伸長反応による負電荷の増大とインターカレータとの反応による正電荷の導入などにより、大きな信号／雑音比で遺伝子を検出できることが本発明の大きな特徴である。さらに本発明の遺伝子検出デバイスでは絶縁ゲート型電界効果トランジスタのゲート絶縁膜上にチャネル部に沿ってチャネル部を囲うように金属電極を形成し、３点で結合する三脚型機能性界面分子を介して核酸を該金属電極表面及び側面に配向性をそろえて固定化することができるので、金属電極の側面に固定化された核酸プローブは、伸長反応によりゲート絶縁膜表面に沿って横方向に相補鎖合成が行われる。したがって、横方向伸長反応によりチャネル部の表面近傍の電荷密度を大きく変化させることができ、高感度の測定を行うことができる。

金属電極表面及び側面に固定化する核酸プローブの塩基配列設計に際しては、ミューテーション（変異）の位置をＤＮＡプローブ端に設定し、特定遺伝子のＳＮＰの野生株（normal型）と変異株（Mutant型）に対応する核酸プローブを別々に固定化して、同時にハイブリダイゼーションを行わせ、引き続き伸長反応を行わせることにより、一塩基多型（ＳＮＰ）を高精度に測定することができる。ハイブリダイゼーション後、タックポリメラーゼ、基質（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）をゲート絶縁膜上に導入して伸長反応を行わせることで反応の特異性を高めることができ高精度のＳＮＰ解析が可能となる。これはミューテーションの位置が端にあるミスマッチプローブとのハイブリダイゼーションでは塩基同士の親和性が低いため十分に結合せず伸長反応が起こらないためである。一方フルマッチのプローブでは端部の塩基同士は水素結合でしっかり二本鎖を形成するため、伸長反応が起こり負電荷が増大する。これにより静電的相互作用で半導体表面のキャリア密度が変化し、これに伴う電界効果トランジスタの電気的特性の変化を測定することにより高精度にＳＮＰを解析することができる。また、４つの異なる塩基を順次添加し、一塩基伸長反応を行わせて電界効果トランジスタの信号を測定することによりＤＮＡの塩基配列を解析することができる。ゲート絶縁膜表面に沿って横方向に伸長反応を行わせることにより、解析可能な塩基長を長くすることができる。

本発明の遺伝子検出デバイスは、高価なレーザや複雑な光学検出系を必要とせず、また電流検出（アンペロメトリック）方式と異なり、基板の腐食やガスの発生、酸化／還元物質の妨害などによる信号値の不安定性は問題とならず、安定性に優れた高精度の遺伝子検出が可能となる。さらに従来のようにハイブリダイゼーションのみ検出する方式と異なり
、伸長反応やインターカレーターとの反応など分子生物学的反応と組み合わせることにより、反応の選択性を高め一塩基の違いを精度よく測定することができる。さらに、３点固定化の三脚型機能性界面分子によりオリゴヌクレオチドプローブを固定化しているので、固定化強度が高いため繰り返し使用可能であり、低価格の解析が可能となる。

本発明では、３点で結合する三脚型機能性界面分子を介して核酸を基板に固定化するので、基板表面に垂直方向に核酸分子を立てて固定化することができる。このため、ターゲットとなる核酸分子と効率的にハイブリダイゼーションすることができる。また、従来の１点による固定化より固定化強度を向上させることができ、温度、ｐＨなどの変化に対しても核酸プローブを安定に使用することができる。したがって、核酸プローブの繰り返し使用が可能となり、アッセイ当たりのコストを低減し、遺伝子検査を低価格で行うことができる。

電界効果トランジスタのゲート表面において、チャネル近傍に形成された金属電極側面に核酸プローブを配向させて固定化することができるので、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーション後、酵素と基質を導入することによりゲート表面に沿って横方向に伸長反応を行わせることができるので、表面電荷密度の変化を大きくすることができ、高感度・高精度に遺伝子を検出することができる。本発明の遺伝子検出デバイスは高価なレーザや複雑な光学系を必要とせず、小型でかつ高精度の測定が可能な遺伝子多型検査システムを提供することができる。

本発明をより詳細に説述するために、添付の図面に従ってこれを説明する。以下の図において、同じ機能部分には同じ符号を付けて説明する。

次の一般式は本発明の生体分子固定化用の三脚型機能性界面分子の構造を示したものである。

式中のＡは、炭素原子の４個の結合手のうちの３個にチオール基を含む原子団を示し、Ｂはオリゴヌクレオチド結合性基を含む原子団を示している。原子団Ａを構成するＸ１，Ｘ２，Ｘ３は、同一または別異の有機基を示し、そして原子団Ｂを構成するＹは有機基を
示し、Ｚはオリゴヌクレオチオド結合性基を示している。

有機基Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３は、基板へのチオール基による結合を安定なものとするためには、一般的には同一のものであることが好ましいが、基板の種類や表面の状態、あるいは配列パターン等によっては、適宜に異なるものとしてもよい。このＸ１，Ｘ２，Ｘ３の有機基としては、脂肪族，脂環式，芳香族等の飽和または不飽和の炭化水素基やその許容される置換基を有するものとすることができる。たとえば、−（ＣＨ₂）_n−，−（ＣＨ₂）_m−シクロヘキシル−（ＣＨ₂）_l，−（ＣＨ₂）_m−フェニル−（ＣＨ₂）_l（ここで、ｎは１２以下、好ましくは３〜８，ｍおよびｌは、各々、０〜８，好ましくはｍが１〜５，ｌが０〜２の整数を示す）で表わされるものが好適なものとして例示される。

また、有機基Ｙとしては、上記と同様に脂肪族、脂環式、芳香族等の飽和または不飽和の炭化水素基やその許容される置換基を有するものとすることができる。たとえば、
−（ＣＨ₂）_P−，
−（ＣＨ₂）_K−フェニル−（ＣＨ₂）_R−，
−（ＣＨ₂）_K−フェニル−（ＣＨ₂）_S−フェニル−（ＣＨ₂）_R−，
−（ＣＨ₂）_K−フェニル−Ｕ−フェニル−（ＣＨ₂）_R−，
（ここで、Ｐは１２以下、好ましくは３〜８，Ｋ，Ｒ，Ｓは、各々、０〜８、Ｕは、−Ｃ＝Ｃ−または−Ｃ≡Ｃ−を示す）で表わされるものが好適なものとして例示される。

オリゴヌクレオチオド結合性基：Ｚは、オリゴヌクレオチオドの末端アミノ基とアミド結合形成可能なカルボキシル基，あるいはオリゴヌクレオチオドの末端カルボキシル基やアルデヒド基と結合可能なアミノ基をその代表的な例として示すことができる。

そして、上記分子のチオール基は金との親和性が高く、金の表面に結合する。炭素原子の各結合手は正四面体構造を構成するので、３個のチオール基を金の平面上に配置すると、オリゴヌクレオチドは平面に垂直方向に配置されて固定化される。したがって、配向性の優れた固定化オリゴヌクレオチドを形成することができる。

なお、本発明の上記のような三脚型機能性界面分子については、非特許文献として、J.
Am. Chem. SO_C-，2002，124，532-533を参照することができる。

以上のような生体分子固定化用の三脚型機能性界面分子の具体的な例を次式に示すことができる。

この分子では、炭素原子１にベンゼン環を介してチオール基２を接続している。また、カルボキシル基は２個のベンゼン環を解して結合している。この機能性界面分子の合成スキームは、次の反応式として示すことができる。

この反応式に示したように、たとえば、より具体的には、４，４’−ジメチルベンゾフェノン（４，４’−dimethylbenzophenone）８のテトラヒドロフラン溶液にトーリーマグネシウムブロマイド（ｐ−tolylmagnesium bromide）を添加して反応させ、さらに1N塩酸を加えて加水分解させる。この有機相をクロロフォルムで抽出し、水洗、ろ過した後、再結晶させると化合物９が得られる。この化合物にアセチルクロライド（acetyl chloride
）を添加して反応させ、再結晶化させると化合物１０が得られる。該化合物１０にアニリン（aniline）を添加し、加熱して反応させ、さらに塩酸を添加すると生成物が得られる
。この生成物を洗浄して再結晶させると、化合物１１が得られる。該化合物１１に塩酸、テトラヒドロフラン及び水を添加し、氷冷しながら窒化ナトリウム水溶液を添加する。こ
の混合液を炭酸カリウム、ジエチルアミン、テトラヒドロフラン、及び水を含む混合液に移し、氷冷しながら反応させる。この混合溶液の有機相をクロロホルムで抽出し、乾燥、濃縮後、生成すると化合物１２が得られる。該化合物１２とヨウ素、ヨウ化メチルを混合し、８０℃で反応させる。ヨウ化メチルを除去した後、残渣物をクロロホルムで抽出し、有機相をろ過して乾燥させると化合物1３が得られる。該化合物１３とＮＢＳ、及びＡＩ
ＢＮを四塩化炭素中でリフラックスし、クロロホルムでろ過、濃縮する。得られた残渣物とカリウムチオアセテートをテトラヒドロフラン中でリフラックスし、減圧下で濃縮してクロロホルムに溶解する。この溶液を洗浄後、ろ過、濃縮すると化合物１４が得られる。一方、４−イオドベンゾネート（４−iodobenzoate）１５、Pd(PPh₃)₂Cl₂及びＣｕＩをテトラヒドロフラン及びトリエチルアミン（triethylamine）中で混合させる。この溶液に
トリメチルシリルアセチレン（trimethylsilylacetylene）を添加して反応させる。この
溶液を減圧下で、ろ過、濃縮し、ヘキサンに溶解して不溶化物を除去する。ろ液を濃縮し、精製すると化合物１６が得られる。該化合物１６とカリウムカーボネート（potassium carbonate）をジクロロメタンとメタノール中で混合し、ろ過、濃縮する。生成物をクロ
ロホルムに溶解してシリカゲル中を通過させると、化合物１７が得られる。化合物１４、化合物１７、Pd(PPh₃)₂Cl₂、及びＣｕＩをテトラヒドロフラン及びトリエチルアミン中で攪拌して混合する。この混合液をろ過して不溶化物を取り除き、濃縮する。得られた残渣物をクロロホルムで抽出し、sodium thiosulfateで飽和させる。有機層を乾燥し、ろ過、濃縮すると化合物１８が得られる。この化合物をテトラヒドロフランーエタノール混合液に溶解し、水酸化ナトリウムを添加する。この混合液に水を加え、さらに濃塩酸を加えてｐＨを１に調節する。得られた沈殿物をろ過して、乾燥すると目的化合物である三脚型機能性界面分子１９が得られる。

生成された三脚型機能性界面分子１９について、次の表１には、プロントＮＭＲでその構造を確認した。

この三脚型機能性界面分子１９の金電極表面への固定化強度を評価した結果を図１に示した。オリゴヌクレオチドの３’末端をアミノ基で修飾し、上記三脚型機能性界面分子１９のカルボキシル基と反応させアミド結合によりオリゴヌクレオチドを結合させた。一方上記オリゴヌクレオチドの５’末端には蛍光色素Ｃｙ５を修飾し、蛍光検出できるようにした。ガラス基板に金薄膜を蒸着し、その上に上記オリゴヌクレオチドと三脚機能性界面型分子１９との複合体を、３個のチオール基を介して固定化した。したがってオリゴヌク
レオチドは金薄膜と３点で結合することになる。一方、参照用の界面機能性化合物として、次式

に示した直線型界面分子を合成した。この直線型界面分子の一端にチオール基を、他端にカルボキシル基を配し、このカルボキシル基とオリゴヌクレオチドの３’末端に修飾したアミノ基とでアミド結合を形成させて、オリゴヌクレオチドと結合させた。また金電極表面とは１個のチオール基を介して結合させた。上記金表面と三脚型分子で３点で結合したオリゴヌクレオチドと直線型分子で１点で結合したオリゴヌクレオチドをｐＨ７.０の緩
衝溶液中に６０℃で保存し、蛍光強度の経時変化を調べた結果を図１に示す。直線型分子による１点固定化オリゴヌクレオチドは緩衝溶液に浸漬すると、固定化されたオリゴヌクレオチドの一部が剥離し、蛍光強度が減少する。一方、三脚型分子による３点固定化オリゴヌクレオチドは蛍光強度の減少率が小さく、１点固定化オリゴヌクレオチドより約３倍固定化強度が大きいことがわかる。以上のように本発明三脚型機能性界面分子を用いてオリゴヌクレオチドを固定化することにより、従来の１点で固定化されたオリゴヌクレオチドより強固な固定化強度が得られることがわかる。

図２は、本発明による遺伝子検出デバイスの第一の例を説明する断面模式図である。ｐ型シリコン２０の表面近傍にｎ型領域２１，２２を設けてそれぞれソース、ドレインとし、電界効果トランジスタを構成した遺伝子検出デバイスである。上記電界効果トランジスタのゲート絶縁膜２３の表面において、チャネル部上に金属電極２４を設けた構造である。ゲート絶縁膜表面に電解質溶液２５を接触させて上記金属電極の表面及び側面に本発明の三脚型機能性界面分子１９を介して核酸プローブ２６を固定化する。電解質溶液の中には参照電極２７が設置されており、シリコンと電気的に接続され、必要に応じて電圧Ｖ_G
を印加する。核酸プローブはオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡの断片を用い、通常３００個以下の塩基から構成されており、オリゴヌクレオチドの場合は８０個以下の塩基長の核酸断片であることが望ましい。上記ゲート絶縁膜は二酸化シリコン（ＳｉＯ₂）、窒化
シリコン（ＳｉＮまたはＳｉ₃Ｎ₄）、酸化アルミニウム（Ａｌ₂Ｏ₃）、酸化タンタル（Ｔａ₂Ｏ₅）などの材料を単独または組み合わせて用い、通常はシリコン表面の電気的特性を良好に保つため、酸化シリコン（ＳｉＯ₂）の上に窒化シリコン（ＳｉＮ）、酸化アルミ
ニウム（Ａｌ₂Ｏ₃）、酸化タンタル（Ｔａ₂Ｏ₅）を積層する二層構造とする。

試料中に測定すべきターゲット遺伝子を含む多数の遺伝子が存在し、上記遺伝子検出デバイスの金属電極にターゲット遺伝子と相補的塩基配列を有する核酸プローブが固定化されていると、適切な反応条件のもとでターゲット遺伝子と核酸プローブがハイブリダイズして、ターゲット遺伝子と核酸プローブが二本鎖を形成する。反応に用いるバッファ溶液のｐＨの適切な条件下では、核酸は負に帯電している。したがって、ハイブリダイズによる二本鎖形成によりゲート絶縁膜表面の負電荷が増大し、その結果、静電的相互作用によりシリコン表面におけるキャリア密度が変化する。この静電的相互作用によるキャリア密度の変化は電界効果トランジスタのしきい値電圧Ｖ_Tの変化として検出することができる
。さらに、金属電極上でＤＮＡの伸長反応を行わせると、二本鎖の長さが長くなるため表面の負電荷がさらに増大し、しきい値電圧はさらに大きく変化する。したがって、しきい値電圧のシフト量ΔＶ_Tはを測定することにより、ゲート表面でのハイブリダイゼーショ
ン及び伸長反応を検出することができる。

ＳＮＰ解析を行うためには少なくとも２種類の核酸プローブと２つの遺伝子検出デバイスを用い、上記２種類の核酸プローブをそれぞれ別々の遺伝子検出デバイスの金属電極上に形成する。検出対象となる核酸が含まれる試料を上記遺伝子検出デバイスとハイブリダイゼーションを行わせ、引き続き伸長反応を行わせる。その結果、遺伝子検出デバイスの出力を比較することにより検出対象の核酸の遺伝子型（ＳＮＰ）を解析することができる。

図３は、本発明による遺伝子検出デバイスの第２の例を説明する断面模式図である。第一の例と同様にｐ型シリコン２０、ｎ型のソース、ドレイン領域２１，２２、及びゲート絶縁膜２３からなる電界効果トランジスタにおいて、ゲート絶縁膜２３の表面において、チャネル部の境界に沿ってチャネル部の外側に金属電極２４を設けた構造である。金属電極材料としては金、白金、銀、塩化銀などを用いることができる。該金属電極表面に本発明の三脚型機能性界面分子１９を介してオリゴヌクレオチド２６を固定化した構造である。電界効果トランジスタではチャネル部表面近傍で起こる電荷密度変化を高感度に検出する。本構造の遺伝子検出デバイスにおいて、オリゴヌクレオチドは金属のすべての表面に固定化されるが、金属表面に固定化された核酸プローブのうち、金属電極側面に固定化され、チャネル部表面上に配向されて固定化された核酸プローブのみが、ハイブリダイゼーション及び伸長反応により、電界効果トランジスタの出力信号を変化させる。すなわち図３（ｂ）に示したようにゲート絶縁膜表面に平行に横方向に固定化されたオリゴヌクレオチドにより誘起された電荷密度変化が効果的にチャネル部の導電率を変化させ、遺伝子検出デバイスとして大きな信号が得られる。本発明の三脚型機能性界面分子を用いることにより金属電極の側面に垂直に、すなわちゲート絶縁膜表面に平行にオリゴヌクレオチドを配向させて固定化することができる。本発明の遺伝子検出デバイスは、オリゴヌクレオチドにより誘起される電荷を静電的相互作用により検出する。したがって、高感度検出のためにはオリゴヌクレオチドをゲート表面にできるだけ近づけて固定化することが望ましい。電界効果トランジスタを利用する従来のＤＮＡ検出方式では、オリゴヌクレオチドをゲート表面に直接に固定化していた。したがって、オリゴヌクレオチドはゲート表面に垂直に固定化されているので、塩基長が長くなるとゲート表面から電荷が遠ざかり、静電的相互作用が弱くなるためＤＮＡの検出ができなくなる。一方、本発明の遺伝子検出デバイスでは、オリゴヌクレオチドを横方向に固定化することにより、長い塩基長のターゲット遺伝子の検出でもゲート表面とターゲット遺伝子を常に一定の距離に維持しておくことができ、したがって遺伝子の電荷とシリコン中の電子との間で常に一定の静電的相互作用が働くので、ハイブリダイゼーション及び伸長反応の信号を高感度に検出することができる。特に従来のようにゲートに垂直にオリゴヌクレオチドを固定化する方式では、伸長反応により合成される塩基の長さが長くなると、検出ができなくなるという問題があった。本発明の遺伝子検出デバイスでは、ゲート表面に平行に伸長反応が進行し、一定の静電的相互
作用が維持されるため、検出可能な塩基長に制限がない。この点が本発明の大きな特長のひとつである。

図４はナノ構造ゲートを有する本発明の遺伝子検出デバイスの第３の例を説明する断面模式図である。電界効果デバイスのゲート絶縁膜表面２３に、それぞれ分離した島状の金属電極ドット２８を形成した構造である。該金属電極ドットの大きさは直径５０ｎｍから１０００ｎｍ、高さ１０ｎｍから１００ｎｍ程度に制御されることが望ましい。また、断面形状は円形の他、四角形、三角形などでもかまわない。このような金属電極ドットの表面及び側面にオリゴヌクレオチドプローブを三脚型機能性界面分子を用いて固定化する。特に上記金属電極ドット側面に固定化したオリゴヌクレオチドは図３の例よりも高密度に固定化することができるので、ハイブリダイゼーションや伸長反応の大きなシグナルが得られる。本構造においても、ナノ構造電極ドットの側面に固定化したオリゴヌクレオチドプローブでは、ゲート表面に平行に伸長反応が進行し、ＤＮＡの電荷とシリコン中のキャリアの電荷との間で常に一定の静電的相互作用が維持されるため、検出可能な塩基長に制限がない。従って、長い塩基長のＤＮＡの配列解析に有効である。さらに本構造では高密度にオリゴヌクレオチドプローブが固定化されるので、高感度測定に適している。

そこで以下に具体例についてさらに説明する。
（第１の実施例）
血液凝固遺伝子の一つであるFactor VII遺伝子には複数の一塩基多型が存在することが知られている。そのうちの一つである−１２２部位のＳＮＰは野生株（正常）がチミンT
、変異株がシトシンＣであることが知られている。このFactor VII遺伝子−１２２部位のＳＮＰを検出するために、野生株及び変異株それぞれに対応する１１塩基からなる２種類の核酸プローブを合成した。それらの塩基配列を下記に示す。

野生株核酸プローブ：５’−ＣＧＴＣＣＴＣＴＧＡＡ−３’
変異株核酸プローブ：５’−ＣＧＴＣＣＴＣＴＧＡＧ−３’
上記核酸プローブの３’末端側にちょうどＳＮＰ部位の塩基がくるように合成する。すなわち、野生株核酸プローブでは３’末端の塩基がアデニンＡであり、変異株核酸プローブではグアニンＧとなっている。その他の塩基配列は野生株、変異株ともすべて同じであり、検出対象のFactor VII遺伝子にハイブリダイゼーションすることができる。一方、上記核酸プローブの５’末端側には前記具体例〔化２〕としての図２に示した三脚型機能性界面分子を結合して、金属電極表面に固定化する。本実施例の電界効果トランジスタのゲート絶縁膜には窒化シリコンが用いられており、金属電極材料として金を用いた。三脚型機能性界面分子は金電極の表面及び側面に配向して固定化される。

野生株核酸プローブを図３に示した第二の例の一つの電界効果トランジスタの金電極表面に固定化し、変異株核酸プローブを他の電界効果トランジスタの金電極表面に固定化して、あらかじめＰＣＲで増幅した試料を反応させた。試料は、血液中の白血球からヒトゲノムを抽出し、上記ＳＮＰ部位を含む２０塩基長の領域を増幅した後、野生株核酸プローブ、変異株核酸プローブが固定化された遺伝子検出デバイスに導入して、４５℃で８時間、ハイブリダイゼーションを行わせた。ハイブリダイゼーション後、緩衝液により洗浄して未反応の試料を除去した。野生株核酸プローブの塩基配列は野生株試料の塩基配列に完全に相補的であるので、ＳＮＰ部位も含めて完全に相補鎖結合して二本鎖ＤＮＡを形成する。一方、変異株核酸プローブの場合、３’末端の塩基がグアニンＧであるため、野生株試料核酸上の塩基チミンTとは相補鎖結合せず、３’末端が開いた形で二本鎖ＤＮＡを形
成する。野生株核酸プローブと変異株核酸プローブとで塩基配列が異なっているので、両者の解離温度Ｔｍが異なり、ハイブリダイゼーション温度を制御することにより、二本鎖形成の選択性を高めることができる。

次に酵素タックポリメラーゼ（Taq polymerase）、及び基質となるdATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合液を試料中に導入し、温度を６２℃に設定してゲート絶縁薄膜上で伸長反応を行わせた。野生株核酸プローブを固定化した電界効果トランジスタでは、野生株試料の導入により末端を含めて完全相補鎖の二本鎖を形成するので、伸長反応により二本鎖が合成される。この伸長反応により野生株を固定化した電界効果トランジスタの出力が１５ｍＶ変化した。一方、変異株核酸プローブを固定化した電界効果トランジスタでは、３’末端の塩基が結合せず開いた形のため、伸長反応が起こらない。したがって変異株を固定化した電界効果トランジスタの出力はほとんど変化せず１ｍＶの変化であった。逆に、変異株のみを含む試料を導入すると変異株核酸プローブを固定化した電界効果トランジスタのみで伸長反応がおき、その出力が１２ｍＶ変化した。この場合は、野生株を固定化した電界効果トランジスタの出力はほとんど変化せず０．５ｍＶの変化であった。野生株、変異株の両方を含む試料を導入した場合、両方の電界効果トランジスタの出力が変化し、野生株核酸プローブを固定化した電界効果トランジスタの出力は１１ｍＶ、変異株核酸プローブを固定化した電界効果トランジスタの出力は１０ｍＶ変化した。以上のように、３’末端の塩基がＳＮＰ部位となるように核酸プローブを設計し、野生株と変異株の核酸プローブをそれぞれ電界効果トランジスタのゲート絶縁薄膜上に固定化し、試料とハイブリダイゼーションを行わせ、引き続き伸長反応を行わせることにより、試料中の核酸のＳＮＰを検出することができる。さらに野生株と変異株の核酸プローブを固定化した電界効果トランジスタの出力の大きさを比較することにより、野生株のホモザイゴート（homozygote），野生株と変異株のヘテロザイゴート（heterozygote）、変異株のホモザイゴートを識別することができ、遺伝子型（genotype）を検出することができる。

本実施例のように電界効果トランジスタと伸長反応を利用するＳＮＰ検出及びジェノタイピング（genotyping）では、金電極上への試料導入、ハイブリダイゼーション、伸長反応の各プロセスの進行中、常時電位計測を行い反応の進行をモニタリングすることができる。したがって反応の完了を電位変化から検出することができ、効率的にＳＮＰ検出及びジェノタイピングを行うことができる。野生株を含む試料を野生株を固定化した電界効果トランジスタのゲート表面でハイブリダイゼーション反応させ、ＤＮＡポリメラーゼを導入して伸長反応を行わせた時の電界効果トランジスタの信号の時間変化を図４に示した。ＤＮＡポリメラーゼを導入後、電界効果トランジスタの信号が約１０ｍＶ変化しており、約３０秒で一定値になっている。これより、本発明の遺伝子検出デバイスを用いることにより迅速にジェノタイピング測定を行うことができることがわかる。また、本実施例では横方向伸長反応に伴う塩基の合成を電荷の増加量として検出するため、核酸プローブと試料核酸の塩基長および伸長合成される塩基長を最適化することにより高感度に核酸を検出することができる。
（第２の実施例）
本発明の遺伝子検出デバイスと一塩基伸長反応を組み合わせ、ＤＮＡポリメラーゼ及びアデニン、グアニン、シトシン、チミンの４種類の基質を順次添加し、電界効果トランジスタのしきい値電圧を順次測定することによりＤＮＡ塩基配列解析を行うことができる。遺伝性ヘモクロマトーシス遺伝子H63Dを用いて塩基配列解析を行った結果を図５に示した。図３に示した第二の例の電界効果トランジスタのゲート絶縁膜表面に下記の塩基配列を有する核酸プローブを三脚型機能性界面分子を介して固定化した。

核酸プローブ：５’−GTTCTATGATC−３’
上記電界効果トランジスタ上に固定化された上記核酸プローブと２１塩基のターゲット遺伝子をハイブリダイズさせ、その後さらにＤＮＡポリメラーゼとdCTP，dATP，dGTP，dTTPを順次添加して一塩基伸長反応を行わせ、トランジスタのしきい値電圧を測定した。ＤＮＡポリメラーゼとdCTP，dATP，dGTP，dTTPの添加を繰り返しながらしきい値電圧を測定した結果を図５に示した。まずＤＮＡポリメラーゼとdCTPを添加すると、対応するターゲット遺伝子の塩基がチミン（Ｔ）であり相補的ではないため伸長反応は起こらない。した
がって、洗浄後、ｐＨ６.８６の緩衝溶液中で電界効果トランジスタのしきい値電圧を測
定しても変化しない。次にＤＮＡポリメラーゼとdATPを添加すると、この場合はアデニンとチミンが相補的であるため伸長反応が起こり、アデニンが二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。したがって、一塩基合成された分電荷が増加する。その結果、洗浄後しきい値電圧を測定すると図５に示すように約４ｍＶのしきい値電圧変化が得られる。次にＤＮＡポリメラーゼとdGTPを添加してしきい値電圧を測定するとほとんど変化しないため、ターゲット遺伝子の次の塩基はシトシンではないことがわかる。次に、ＤＮＡポリメラーゼとdTTPを添加してしきい値電圧を測定すると約３ｍＶのしきい値電圧変化が得られる。したがって、ターゲット遺伝子の次の塩基はアデニン（A）であることがわかる。さらに最初に戻りＤ
ＮＡポリメラーゼとdCTPを添加して、しきい値電圧を測定する。このように、ＤＮＡポリメラーゼとdCTP，dATP，dGTP，dTTPの添加を繰り返しながらしきい値電圧を測定し、しきい値電圧の変化と添加した塩基とからターゲット遺伝子の塩基配列を解析することができる。本発明の遺伝子解析デバイスでは三脚型機能性界面分子を用いてゲート絶縁膜に平行な横方向に一塩基伸長反応を繰り返しているので、伸長合成された塩基の電荷とシリコン表面の電子との静電的相互作用は塩基長に依存せず、常に一定である。そのため、塩基配列を読み取れる塩基の長さに制限がなく、長い塩基長の遺伝子の塩基配列を解析することができる。

本発明の三脚型機能性界面分子の金属電極表面への固定化強度の経時変化を示した図である。本発明の遺伝子検出用電界効果デバイスタの一例を説明する断面模式図である。（ａ）（ｂ）は本発明の横方向伸長反応を利用する遺伝子検出用デバイスの一例を説明する断面模式図である。（ａ）（ｂ）は本発明のナノ構造ゲート遺伝子検出用デバイスの一例を説明する断面模式図である。本発明の遺伝子検出デバイスを用いた伸長反応のモニタリングを示した図である。本発明の遺伝子検出デバイスを用いたＤＮＡシーケンシングの一例を説明する図である。

符号の説明

１炭素原子
２チオール基
３チオール基を含む原子団
４カルボキシル基
８４，４’-ジメチルベンゾフェノン
９中間化合物
１０中間化合物
１１中間化合物
１２中間化合物
１３中間化合物
１４中間化合物
１５中間化合物
１６中間化合物
１７中間化合物
１８中間化合物
１９三脚型機能性界面分子
２０シリコン基板
２１ソース
２２ドレイン
２３ゲート絶縁膜
２４金属電極
２５電解質溶液
２６オリゴヌクレオチド
２７参照電極
２８金属電極ドット

Claims

以下の構造式で表される三脚型機能性界面分子。
請求項１に記載の三脚型機能性界面分子と、
末端のアミノ基で前記三脚型機能性界面分子のカルボキシル基と結合しているオリゴヌクレオチドと、
を設けた三脚型機能性界面分子複合体。
請求項２に記載の三脚型機能性界面分子複合体と
金属電極を有する基板と、
を設けた遺伝子検出デバイス。
前記基板は電界効果トランジスタが設けられたシリコン基板である、請求項３に記載の遺伝子検出デバイス。
前記電界効果トランジスタのゲート絶縁膜表面上の、チャネル部の外側であって前記チャネル部に沿った位置に前記金属電極を設け、
３つのチオール基が前記金属電極の表面に結合配置された前記三脚型機能性界面分子複合体を設け、
前記チャネル部上で前記オリゴヌクレオチドを試料中の核酸と結合させる、
請求項４に記載の遺伝子検出デバイス。
前記金属電極は前記電界効果トランジスタのゲート絶縁膜表面に島状に分離した複数の金属電極であり、
３つのチオール基が前記金属電極の表面及び側面に結合配置された前記三脚型機能性界面分子複合体を設け、
前記チャネル部上で前記オリゴヌクレオチドを試料中の核酸と結合させる、
請求項４に記載の遺伝子検出デバイス。
前記金属電極は金、白金、銀、イリジウムなどの貴金属、またはこれらを組み合わせたものである、請求項３から６の何れかに記載の遺伝子検出デバイス。