JP2001520383A - タンパク質コロイド金属アミノデキストラン被覆粒子および製造方法および使用 - Google Patents

タンパク質コロイド金属アミノデキストラン被覆粒子および製造方法および使用

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Abstract

(57)【要約】 安定コロイド粒子は、その上にアミン反応性官能基を有するコロイドサイズ化コア支持体を包含し、その周囲表面上のアミノデキストランコーティング、アミノデキストランコーティングに上塗りするコロイドサイズ化金属固体の層を伴う。金属固体に結合されるリンカーは、タンパク質が遊離アミノ基との共有結合により結合される遊離アミノ基を有する。このような新規の粒子は、フローサイトメトリーに有用であり、特に白血球の亜集団の同時分析に有用である。このような粒子の製造方法、ならびに使用方法が提供される。このような複合体は、複合タンパク質の結合親和性を基礎にした、白血球の少なくとも２つの異なる相互排除的サブセットの同時分析を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （産業上の利用分野） 本発明は、一般に、新規のフローサイトメトリー、ならびに細胞分離、試薬、
より詳細には、タンパク質がコロイド金属被覆、アミノデキストラン被覆支持体
に複合した新規の粒子に、ならびにその製造方法および使用に関する。
【０００２】 （発明の背景） フローサイトメトリーの技術は、種々の種類の細胞を分離する、例えば、白血
球を３つの主な群、即ちリンパ球、単球および顆粒球に分類するために用いられ
得る細胞の物理的パラメーターに関するデータを研究者に提供する。その他の技
術は、別の白血球集団、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、細胞傷害性細胞およびサプレッ
サー細胞、好中球、好酸球および好塩基球を同定するために記載されている（例
えば、「Flow Cytometry and Sorting」、p.371; Melamed、MullaneyおよびMend
elsohn編、1979, John Wiley & Sons, N.Y., N.Y.;米国特許第5,125,737 号；米
国特許第5,492,833 号；米国特許第5,223,398 号；米国特許第5,231,005 号参照
）。
【０００３】 全血中の特定の白血球亜集団を標的にするために抗体被覆ポリスチレンラテッ
クスビーズを用いた、それゆえ、標的化細胞容積、直流または低周波数電流（Ｄ
Ｃ）あるいは高周波数（ＲＦ）導電率および光散乱（Ｓ）の変化（シフト）を生
じるサブクラスが列挙されている〔例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ92/09682、1992年6
月11日公開；Hudson他「Cytometry 」22:150（1995）、米国特許第5,639,620 号
および国際特許出願ＷＯ95/24631（1995年9 月14日公開）参照〕。実際、これら
の後者の変化は、市販の血液学計器、例えばＶＣＳ技術を装備したCOULTER(登録
商標) STKS（商標) 計器で検出され得る。このような計器は、白血球の全集団中
のシフト化細胞集団のパーセンテージを算出し得る。
【０００４】 前記のビーズ誘導性シフト法は全て、一度にリンパ球の亜集団を列挙するため
に抗体に複合された単一種類のポリスチレンビーズを使用する。シフトを延長す
るための無機物質から成るビーズの使用は、最近記載されるようになったに過ぎ
ない（例えば、米国特許第5,466,609 号；国際特許出願ＷＯ9524631 ；および米
国特許第5,552,086 号参照）。特に、金／銀コロイド被覆ポリスチレン−アミノ
デキストランビーズ、それらの調製および特性化が記載されている（例えば、米
国特許第5,248,772 号および米国特許第5,552,086 号参照）。
【０００５】 リンパ球鑑別の現在通用している方法には、蛍光マーカーの使用、ならびに前
方光散乱、側方光散乱および蛍光強度またはビーズ上抗体の使用、ならびに正中
角光散乱、ＤＣおよびＲＦの測定が含まれる。従来、ビーズ上の抗体の使用は、
リンパ球の単一亜集団に関して分析するために任意の時点で抗体に被覆された単
一種類のみのビーズを包含した（P.K. HoranおよびL.L. Wheeless 「Jr., Scien
ce」198:149-157 （1977）; および英国特許第1561042 号（1980年2 月13日公開
）も参照）。他方、蛍光マーカーを用いる従来実施されていたフローサイトメト
リーは、多数の蛍光標識化抗体（２〜６）を同時に用いて、白血球の種々の亜集
団に関して分析する。 目下、リンパ球の亜集団が同時に列挙されるように、ビーズ上の抗体法を用い
て血液標本の分析を可能にする方法はない。したがって、血液またはその他の多
細胞流体物質のより有効な分析を可能にする組成物および方法に対する必要性が
当業界には存在する。
【０００６】 （発明の要約） 一局面において、本発明は、以下の： （ａ）その上にアミン反応性官能基を有するコロイドサイズ化コア支持体、 （ｂ）前記支持体の周囲表面のアミノデキストランコーティング、 （ｃ）前記のアミノデキストランコーティングに上塗りするコロイドサイズ化
金属固体の層であって、前記の金属固体のための金属が前記のコアのアミノデキ
ストランコーティングによりイオン状態から金属（０）状態に還元できる金属か
ら成る群から選択される層、 （ｄ）前記の金属固体に結合されるリンカーであって、遊離アミノ基を有する
リンカー、ならびに （ｅ）前記の遊離アミノ基との共有結合により前記のリンカーに結合されるタ
ンパク質を包含する安定コロイド粒子を提供する。
【０００７】 別の局面では、本発明は、前記の粒子の製造方法であって、タンパク質の被覆
化粒子との複合を可能にするためのアミノトリチオールリンカーを用いる方法を
含めた方法を提供する。 さらに別の局面では、本発明は、前記の粒子を用いて生物学的溶液または懸濁
液中の、例えば全血中の２以上の亜集団の同時定量的測定を実施する方法を提供
する。 本発明のその他の局面および利点を、添付の図面を参照しながら、その好まし
い実施態様について以下の詳細な説明でさらに説明する。
【０００８】 （本発明の詳細な説明） 本発明は、タンパク質、好ましくは抗体がコロイド金属被覆化、アミノデキス
トラン被覆化支持体に複合した新規の安定コロイド粒子を提供することにより、
当業界での要求を満たす。この粒子は、生物物質における異なる種類の細胞の有
効な分析および分離を可能にするフローサイトメトリーで用い得るが、但し異な
る種類の細胞は各々、少なくとも１つの独自の非重複抗原エピトープを有する。
【０００９】 Ｉ．定義 以下の用語は、本明細書中で用いられる場合、そして特許請求の範囲において
は、以下のように定義することができる。 「ヒストグラム」とは、Ｘ軸上にプロットされる変数およびＹ軸上にプロット
される「番号（＃）」で呼ばれる頻度による二次元線グラフとして図示される単
一変数に関する頻度分布のグラフである。ヒストグラムは、コンピューターまた
はその他のあるフォームの電気回路内で表されるようなグラフの理論的数作表で
もある。
【００１０】 「マトリックス」とは、Ｘ軸上にプロットされるある変数とＹ軸上にプロット
される第二の変数、そして等計数輪郭として示される頻度または計数による三次
元輪郭グラフとして示される２つの別々の変数に関する頻度分布のグラフである
。明瞭にするために、ある等計数輪郭のみが示して集団外形を説明する。マトリ
ックスは、コンピューターまたはその他のフォームの電気回路内に表されるよう
なグラフの抽象的な数で示す作表とも定義される。マトリックスを説明する場合
、本明細書中では、Ｘ軸変数が最初に記入され、その後Ｙ軸変数が記入される。 「パラメーター」とは、別々の変数と同義語であり、フローサイトメトリーで
分析中の粒子または細胞から得られる任意の同時的な、独立した測定値を指す。
２つ以上のパラメーターの組合せは、いくつかの数学的関数により、別のパラメ
ーターを生じると定義される。
【００１１】 「ゲーティング」とは、多パラメーターデータから、あるパラメーターのヒス
トグラムを構築する一方、１つ以上のその他のパラメーターを応答させる（inte
rrogate ）場合に利用される濾過工程である。流動細胞を通る単一血球の通過お
よびパラメーター変換器による細胞測定値の発生といった、各事象に関しては、
ゲーティングに関して利用される各パラメーターに対応する値または測定値は、
１つまたは２つの参照値、あるいは閾値と比較され、そして閾値より低いのもの
、閾値より高いもの、または２つの閾値の間のものに関して「検定」される。こ
の検定は、考えられる全てのゲーティングパラメーターに関して真の結果を生じ
る場合には、その事象はヒストグラムに含まれる。ゲーティングは、マトリック
スを構築するために利用し得る。したがって、ゲーティングを用いることにより
、多パラメーターデータの分析およびグラフ表現を簡素化できる。
【００１２】 「ＤＣ」および「ＲＦ」は、開口部インピーダンス細胞検知のCoulter の原理
を示す電気的検知パラメーターである。「ＤＣ」は、細胞膜が貫通されないよう
、そして電流が細胞を通過しないように、直流または低周波電流の適用から得ら
れるパルスピーク情報である。ＤＣパルスのピーク振幅は、細胞容積の関数であ
る。「ＲＦ」は、細胞膜が短絡され、電流が細胞を流れるよう、高周波電流を適
用することにより得られる測定値に由来するパルスピーク情報である。ＲＦは細
胞容積および内部導電率の関数である。
【００１３】 「ＬＭＡＬＳ」とは、下方正中角光散乱であって、これは入射光線の軸から１
０°〜２０°の範囲で、またはその範囲を通して、散乱された光検出アッセンブ
リで受容される光である。 「ＵＭＡＬＳ」とは、上方正中角光散乱であって、これは入射光線の軸から２
０°〜６５°の範囲で、またはその範囲を通して、散乱された光検出アッセンブ
リで受容される光である。 「ＳＡＬＳ」または「９０°ＬＳ」とは、側方角光散乱であって、これは入射
光線の軸から９０°＋／−２０°およその角度範囲に位置する光検出アッセンブ
リで受容される光である。
【００１４】 「粒子」という用語は、とりわけ、ミクロスフェア、ビーズおよび球体も含み
、このような用語は交換可能である。 「抗体」とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの種類の任意の
本来の供給源からのポリクローナル抗体、ならびに元のまたは組換え体モノクロ
ーナル抗体、ハイブリッド誘導体、ヒト化またはキメラ抗体、ならびに抗体の断
片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2 を含むよう定義される。
【００１５】 ＩＩ．本発明の組成物 本発明は、以下の： （ａ）その上にアミン反応性官能基を有するコロイドサイズ化コア支持体、 （ｂ）前記支持体の周囲表面のアミノデキストランコーティング、 （ｃ）前記のアミノデキストランコーティングに上塗りするコロイドサイズ化
金属固体の層であって、前記の金属固体のための金属が前記のコアのアミノデキ
ストランコーティングによりイオン状態から金属（０）状態に還元できる金属か
ら成る群から選択される層、 （ｄ）前記の金属固体に結合されるリンカーであって、遊離アミノ基を有する
リンカー、ならびに （ｅ）前記の遊離アミノ基との共有結合により前記のリンカーに結合されるタ
ンパク質を包含する新規の安定コロイド粒子を提供する。
【００１６】 好ましい実施態様では、本発明の粒子は、アミノデキストラン被覆化ポリスチ
レン粒子を包含し、この粒子は架橋剤が結合される結合剤を有するコロイド金属
でも被覆される。タンパク質、好ましくは抗体は、リンカーのアミノ基に対する
架橋剤を介して被覆化粒子に結合される。これらの複合体は、それらが白血球の
少なくとも２つの異なるサブセット、例えば、白血球を含有する生物物質中のＴ
リンパ球の２つのサブセットの同時分析を可能にするという点で、特に有益であ
る。
【００１７】 Ａ．コロイド金属−アミノデキストラン被覆化支持体 前記の被覆化支持体は、好ましくは、ポリスチレンビーズであるコア支持体（
ａ）を有する。好ましくは、ポリスチレンビーズは、直径約０．２〜約５．０μ
のサイズの範囲（即ち、コロイドサイズ化）である。アルデヒドおよび／または
スルフェート官能基を含有するこのようなポリスチレンコア支持体は、例えばIn
terfacial Dynamics Corporation（オレゴン州ポートランド）から市販されてい
る。もちろん、当業者は、他の供給元からその他の同様の粒子を選択し得る。
【００１８】 このコア支持体は、その周囲表面にアミノデキストランコーティングを有する
。好ましくは、アミノデキストランコーティング（ｂ）は、アミノデキストラン
の遊離アミノ基とポリスチレン支持体のアミン反応性官能基との間の共有結合に
より、そしてさらにグルタルアルデヒドのような作用物質との架橋によって、コ
ア支持体（ａ）に共有結合される。コーティング（ｂ）を形成するアミノデキス
トランは、一般に、１／２．５という最大理論値と比較して、１／４０〜１／３
５（１Ｘ−アミノデキストラン）の範囲のある程度のジアミン置換を有すること
を特徴とし得る。さらに好ましくは、アミノデキストランコーティング（ｂ）に
おけるジアミン置換は、約１／７〜１／８（５Ｘ−アミノデキストラン）である
。
【００１９】 この被覆化支持体の代替物は、米国特許第5,639,620 号に記載されているよう
なＥＤＡＣカップリングによりアミノデキストランで被覆されるコア支持体とし
てカルボキシ官能化ポリスチレン粒子を用いる。 被覆化支持体は、このアミノデキストランコーティングを上塗りするコロイド
サイズ化金属固体（ｃ）の層も含有する。好ましくは、この層は、アミノデキス
トラン層の分散化表面に均一に分散される。被覆化支持体を形成するのに有用な
コロイド金属は、一般的に、アミノデキストランコーティングによりイオン状態
から金属（０）状態に還元できる金属、あるいは約＋０．７ボルト以上の還元電
位を有する金属イオンまたは金属イオン錯体を生成する金属として記載される。
このような金属イオンとしては以下のもの：Ａｇ（Ｉ）、Ａｕ（ＩＩＩ）、Ｐｄ
（ＩＩ）、Ｐｔ（ＩＩ）、Ｒｈ（ＩＩＩ）、Ｉｒ（ＩＩＩ）、Ｒｕ（ＩＩ）、Ｏ
ｓ（ＩＩ）が挙げられるが、このような用途に好ましい金属イオンはコロイド金
（ＩＩＩ）およびコロイド銀（Ｉ）である。
【００２０】 Ｂ．リンカー 本発明は、選択されたタンパク質、例えば抗体の前記のコロイド金属−アミノ
デキストラン被覆化支持体との複合を可能にするリンカーも提供する。リンカー
は一般に、タンパク質との複合のために活性化され得る遊離アミノ基を有する。
【００２１】 ｉ．アミノデキストランリンカー コロイド金属−アミノデキストラン被覆化支持体を上塗りするために導入され
る好ましいリンカーの１つは、アミノデキストランリンカー、好ましくは、１Ｘ
−アミノデキストランのような１／２．５の最大理論値と比較して、ジアミン置
換の程度が約１／４０〜約１／３５の範囲であるアミノデキストランである。あ
るいは、アミノデキストランリンカー中のジアミン置換は、５Ｘ−アミノデキス
トランのように約１／７〜１／８であり得る。好ましくは、コロイド金属が銀で
ある場合、５Ｘ−アミノデキストランリンカーが用いられる。
【００２２】 アミノデキストランは、それらを銀コロイド被覆化ポリスチレン粒子の既存の
粒子表面に架橋するのに、ならびにそれらをタンパク質、例えば抗体と共有的に
連結するのに十分なアミノ基を含有する。架橋化アミノデキストランコーティン
グは、銀コロイドが、粒子を活性化するのに必要なその後の化学反応においてポ
リスチレン粒子から落ちるのを防止し、それらをモノクローナル抗体に複合し、
そして化学的反応性官能基をブロックする。
【００２３】 ｉｉｉ．アミノトリチオールリンカー コロイド金属が金である場合に特に有用な別の好ましいリンカーは、アミノト
リチオレートリンカーである。特に有用なアミノトリチオレートリンカーは、ト
リス（３−メルカプトプロピル）−Ｎ−グリシルアミノメタン、式Ｃ12Ｈ26Ｎ2 ＯＳ3 （J.K. WhitesellおよびH.K. Chang「Science 」216:73-76 （1993））、
および構造式：
【化１】 を有するクモ様組成物である。
【００２４】 この化合物は、最初は、荒加工金フィルム表面に層を形成して、アラニンＮ−
カルボキシ無水物の重合のためのＮＨ2 開始部位を提供して、表面に垂直に均一
にそれ自体整列されるポリアラニン螺旋を形成すると記載されていた。ポリアラ
ニン螺旋は、金表面に結合されたままで、１８０℃で１週間加熱後でさえ、その
形状を保持するということが示された。
【００２５】 このリンカーの好ましい形態は、新たな脱保護化形態であり、これは、好まし
くは、下記の実施例４Ａに詳述されるように調製される。実施例４は、ポリスチ
レン粒子上に沈着した金粒子とモノクローナル抗体との間の配位子として、アミ
ノトリチオールが良好に機能することを実証する。その３つの硫黄原子を介して
コロイド金属上の金または銀原子と強力に配位結合することにより、そしてその
アミノ基を介しての抗体の活性化および複合により、アミノトリチオールリンカ
ーは新規の二官能性リンカー剤としても役立つ。低電気陰性度を有する軟塩基で
ある、高極性化可能硫黄原子は、軟酸、金または銀原子と配位結合する方を選ぶ
。
【００２６】 しかしながら、以下の実施例５Ｂで考察するように、アミノトリチオールリン
カーは、ポリスチレン粒子上の沈着銀コロイドの表面の結合部位に関してアミノ
デキストランと非常によく競合して、銀−アミノデキストラン−ポリスチレン粒
子の表面から多量の銀コロイドを置換する。したがって、アミノトリチオールは
、ポリスチレン粒子上の銀コロイドとの架橋剤として十分に作用しない。
【００２７】 Ｃ．架橋剤 前記のような架橋剤は、コロイド金属−アミノデキストラン被覆化支持体また
はアミノデキストラン−金属−アミノデキストラン被覆化支持体に共有的に結合
される。粒子上のリンカーの活性化のために、ヘテロ二官能性架橋剤、例えばス
ルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート（「スルホ−ＳＭＣＣ」）が用いられる。スルホ−ＳＭＣＣは、反
応性アミノ基を有するリンカーと共有結合する。種々のその他の適切な架橋剤お
よび方法は、例えば、「The Pierce Handbook 」および「Chemistry Of Protein
Conjugation And Cross-Linking」S.S. Wong, CRC Press, Inc., Boca Raton,
FL（1991）のようなテキスト中に引用されている。
【００２８】 Ｄ．タンパク質 その後、架橋剤を介してコロイド金属−アミノデキストラン被覆化支持体に結
合されて本発明の新規の安定コロイド粒子を形成する、選択される活性化タンパ
ク質は、好ましくは抗体である。特に、タンパク質（ｅ）は、活性化タンパク質
上のスルフヒドリル基またはアミノ基を有するヘテロ二官能性架橋剤を介してリ
ンカー上の遊離アミノ基の共有結合によりリンカー−コロイド金属−アミノデキ
ストラン被覆化支持体に共有結合される。
【００２９】 任意のタンパク質をこの方法で支持体に結合し得るが、しかし、好ましくはタ
ンパク質はモノクローナルまたはポリクローナル抗体、あるいは種々の組換え体
抗体構築物のいずれかである。抗体は、望ましくは、細胞上のエピトープに向け
られるが、このエピトープは、細胞の種類に独特であり、それにより細胞分離検
定での粒子の使用を可能にする。ポリクローナル抗体は、慣用的手段により生成
することができる。即ち、選択された抗原に曝露された動物またはヒトの血清か
ら得られる。例えば、ポリクローナル抗体は、慣用的に、選択された動物または
ヒトの免疫系を選択された抗原で刺激して、免疫系にそれに対する天然抗体を産
生させて、動物またはヒトの血液、あるいはその他の生物学的流体からこれらの
抗体を収集することにより、生成される。
【００３０】 モノクローナル抗体は、慣用のハイブリドーマ法により得られ、硫酸アンモニ
ウム（４５％）沈澱、遠心分離およびプロテインＡを用いたアフィニティークロ
マトグラフィーにより腹水液から精製される。モノクローナル抗体の製造方法は
、G.KohlerおよびC. Milstein 「Nature」256:495-497 （1975）に記載されてお
り、多数の既知のその変法が含まれる（その教示内容は、参照により本明細書中
に含まれる）。同様に、望ましい高力価抗体は、既知の組換え技法をこれらの抗
原に対して発現されるモノクローナルまたはポリクローナル抗体に適用すること
により生成される〔例えば、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＧＢ85/00392；英国特許出
願ＧＢ2188638 Ａ；Amit他「Sceince 」 233:747-753（1986）; Queen 他「Proc
. Natl. Acad. Sci. USA」86:10029-10033（1989）；ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／Ｗ
Ｏ9007861 ；およびRiechmann 他「Nature」 332:323-32 （1988）；Huse他「Sc
ience 」 246:1275-1281（1988）ａ参照〕。
【００３１】 当業者は、動物またはヒト抗体の相補性決定領域を操作することにより、既知
の技術に頼って、本発明のタンパク質として用いるためのキメラヒト化または完
全ヒト抗体を生成し得る〔例えば、E. Mark およびPadlin『Humanization of Mo
noclonal Antibodies 』Chapter 4,「The Handbook of Experimental Pharmacol
ogy 」Vol. 113, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verl
ag（６月, 1994）参照〕。 もちろん、特定の製造方法および抗体の種類は、このような技術に限定されず
、このような抗体の任意の製造技術は本発明の実行の範囲内であるとみなされる
。好ましい実施態様では、タンパク質は、Ｔリンパ球上のＣＤ３、ＣＤ４または
ＣＤ８に対するモノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体の例
を以下に示す：モノクローナル抗体（ＭＡｂ）「Ｔ３」（Coulter Corporation,
Miami, Florida から市販されている）は、マウスＰ３／ＮＳ１／１−ＡＧ４−
１骨髄腫細胞とヒト胎児胸腺細胞およびセザール細胞白血病患者からの末梢血リ
ンパ球で免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓細胞とのハイブリダイゼ
ーションから得られる、ＩｇＧ１サブクラスの抗ＣＤ３抗体である。
【００３２】 ＭＡｂ「Ｔ４」（Coulter Corporation ）は、マウスＮＳ／１−ＡＧ４細胞と
ヒト末梢血Ｔリンパ球で免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃＪマウスからの脾臓細胞と
のハイブリダイゼーションから得られる抗ＣＤ４抗体である。ＭＡｂ「Ｔ８」は
、Ｔ４に関して記載したのと同様に、しかしヒト胸腺細胞（Coulter Corporatio
n ）で免疫感作されて得られる抗ＣＤ８抗体である。ＭＡｂ Ｔ４およびＴ８は
、高密度のそれらの抗原受容体（１０4 〜１０5 の受容体／標的細胞）およびそ
れらの標的化細胞の相互排除に関して、以下の実施例で用いるために選択される
。 しかしながら、新規の粒子のタンパク質部分として、部位／細胞が約１０3 よ
り大きく、そしてこのような部位の各々が多数の標的化細胞集団中の細胞集団の
１つに対して排他的である限り、細胞上の任意の標的受容体部位に対して向けら
れる任意の抗体を用い得る。
【００３３】 Ｅ．本発明の粒子の実施態様 本発明の安定粒子の例示的実施態様は、その周囲表面に１Ｘ−アミノデキスト
ランコーティングおよびアミノデキストランコーティングを上塗りするコロイド
サイズ化金の層を有するコロイドサイズ化ポリスチレン極微粒子から成る粒子で
ある。遊離アミノ基を有するアミノトリチオールリンカーは金と共有結合し、抗
ＣＤ４抗体はヘテロ二官能性架橋剤を介してリンカーに結合される。この粒子は
、Ｔ４−アミノトリチオレート−金−１Ｘ−アミノデキストラン−ポリスチレン
粒子と呼ばれる。
【００３４】 別の例示的粒子は、その周囲表面に１Ｘ−アミノデキストランコーティングを
有し、アミノデキストランコーティングを上塗りするコロイドサイズ化銀の層を
伴うコロイドサイズ化ポリスチレン粒子から作られる。遊離アミノ基を有する５
Ｘ−アミノデキストランリンカーは、銀−アミノデキストラン−ＰＳ粒子周囲に
架橋され、抗ＣＤ４抗体は、スルホ−ＳＭＣＣのようなヘテロ二官能性架橋剤を
介して遊離アミノ基と共有結合することにより、前記のリンカーに結合される。
この粒子は、Ｔ４−５Ｘ−アミノデキストラン−銀−１Ｘ−アミノデキストラン
−ポリスチレン粒子と呼ばれる。
【００３５】 本発明の粒子の別の実施態様は、その周囲表面に１Ｘ−アミノデキストランコ
ーティングを有し、アミノデキストランコーティングを上塗りするコロイドサイ
ズ化金の層を伴うコロイドサイズ化ポリスチレン粒子を包含する。遊離アミノ基
を有するアミノトリチオールリンカーは金と共有結合し、抗ＣＤ８抗体タンパク
質はヘテロ二官能性架橋剤を介してリンカーの遊離アミノ基に共有結合される。
この粒子は、Ｔ８−アミノトリチオレート−金−１Ｘ−アミノデキストラン−ポ
リスチレン粒子と呼ばれる。
【００３６】 本発明の粒子のさらに別の実施態様は、その周囲表面に１Ｘ−アミノデキスト
ランコーティングを有し、アミノデキストランコーティングを上塗りするコロイ
ドサイズ化銀の層を伴うコロイドサイズ化ポリスチレン粒子を包含する。遊離ア
ミノ基を有する５Ｘ−アミノデキストランリンカーは、銀−アミノデキストラン
−ＰＳ粒子周囲に架橋され、抗ＣＤ８抗体は、スルホ−ＳＭＣＣのようなヘテロ
二官能性架橋剤を介して遊離アミノ基と共有結合することにより、前記のリンカ
ーに結合される。この粒子は、Ｔ８−５Ｘ−アミノデキストラン−銀−１Ｘ−ア
ミノデキストラン−ポリスチレン粒子と呼ばれる。 本発明のこれらの例示的安定粒子は、リンパ球の少なくとも２つの異なる相互
排除的サブセットに関して生物流体、例えば全血を同時分析する方法に用いるた
めの試薬として特に望ましい。
【００３７】 ＩＩＩ．本発明の粒子の製造方法 本発明はさらに、本明細書に記載した新規の安定コロイド粒子の製造方法を提
供する。一般的に、本発明の粒子は、アミノデキストラン被覆化ポリスチレン粒
子を金属塩と反応させて、それにリンカーを結合させ、そしてタンパク質、例え
ば抗体を、リンカーを介して被覆化タンパク質に結合させることにより調製され
る。
【００３８】 特に、このような粒子の製造方法は、市販のアルデヒド官能化ポリスチレン粒
子を前記のようなアミノデキストランと反応させる第一工程を包含する。コロイ
ドサイズ化ポリスチレンコア支持体の表面に吸着し、そしてそれと共有結合する
アミノデキストランもある。さらに別のアミノデキストランは、グルタルアルデ
ヒドとの架橋によりビーズと共有結合する。その結果生じた反応混合物を還元剤
で処理して、安定被覆化ビーズを得る。この還元剤は、任意の従来の還元剤、例
えばホウ水素化ナトリウムであり得る。その結果生じた架橋アミノデキストラン
被覆化ポリスチレン粒子は、その後、水で、好ましくは蒸留水で洗浄される。ア
ミノデキストランは一般に、金属イオンまたは金属イオン錯体を金属（０）状態
に還元し、即ち金（ＩＩＩ）を金（０）に、または銀（Ｉ）を銀（０）に還元し
得る。
【００３９】 これらのアミノデキストラン被覆化ポリスチレン粒子を、次に、アミノデキス
トランコーティングにより還元し得る金属イオンまたは金属イオン錯体を含有す
る金属塩の水性溶液と反応させる。前記のように、金属塩は、好ましくは金（Ｉ
ＩＩ）または銀（Ｉ）塩である。簡単に説明すると、被覆化粒子の水性懸濁液を
、主にポリスチレン粒子の表面のコロイド金属として、余分量の金属イオンを金
属（０）状態に還元する予定量の二次還元剤の存在下で、温度を上げて余分量の
金属の水性溶液と混合する。高温範囲は、望ましくは、約８０〜約１００℃の範
囲である。さらに別の還元剤はクエン酸ナトリウムであって、これはコロイド金
属の迅速生成に用いられる。
【００４０】 その結果生じるコロイド金属−アミノデキストラン被覆化粒子は、例えば水性
クエン酸ナトリウム溶液および蒸留水を用いて洗浄することにより精製される。 本発明の新規の粒子の調製に関与するさらなる工程は、遊離アミノ基を有する
リンカーまたはリンキング剤をコロイド金属−アミノデキストラン被覆化粒子に
結合することを含む。リンカーは、金属コロイド被覆化粒子の表面とのタンパク
質の複合を可能にする。好ましくは、銀被覆化粒子またはビーズに関しては、リ
ンカーはアミノデキストランであり、最も好ましくは５Ｘ−アミノデキストラン
である。金被覆化ビーズに関しては、リンカーは、好ましくは、前記のアミノト
リチオレートリンカーである。
【００４１】 リンキング剤がアミノデキストランである場合、それは、吸着および二官能性
架橋剤、例えばグルタルアルデヒドによる架橋により、被覆化粒子に結合するこ
とができる。アミノデキストランリンカー上の遊離アミノ基は、次に、コロイド
金属粒子をタンパク質に連結する適切なヘテロ二官能性架橋剤、例えばスルホス
クシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（スルホ−ＳＭＣＣ）または前記のような当業界で既知のその他のもので
活性化される。
【００４２】 アミノトリチオールリンカーは、チオレート基のコロイド金表面との反応によ
り結合することができる。特に、アミノトリチオールリンカーの使用方法は、水
性メタノール中に保護化アミノトリチオール配位子を溶解し、その結果生じる溶
液に濃塩酸を加え、混合物を還流する工程を包含する。一態様では、還流のため
の好ましい時間は、約５時間である。混合物の構成成分は、例えば、BioGel P2(
登録商標）ゲル上でのサイズ排除クロマトグラフィーおよび２８０ｎｍで吸収す
る第一バンド（脱保護化アミノトリチオール配位子を表す）の分画を収集する。
次に、脱保護化アミノトリチオール配位子を、前記の金コロイド−アミノデキス
トラン被覆化ポリスチレンビーズと混合する。したがって、金コロイド表面を有
するリンカー上の硫黄基間に、強共有結合が形成される。その後、リンカーの遊
離アミノ基がスルホ−ＳＭＣＣにより活性化される。
【００４３】 架橋剤が一旦粒子に結合されると、コロイド粒子に結合されることが望ましい
選択されたタンパク質が次に、従来の方法により、例えば、スルフヒドリル基を
提供するアミノ結合試薬でタンパク質を活性化することにより、被覆化粒子上の
活性化リンカーのアミノ基に複合される。適切なアミノ結合／活性化試薬は、２
−イミノチオランである。抗体を粒子に複合するための抗体の２−イミノチオラ
ン活性化および被覆化粒子上のアミノ基のマレイミド（スルホ−ＳＭＣＣ）活性
化の従来の方法は、「Chemistry Of Protein Conjugation And Cross-Linking」
S.S. Wong, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1991に記載されている。さらに
その他のアミノ反応性スルフヒドリル誘導性試薬は、利用可能なテキストから当
業者が容易に選択し得る（例えばPierce Handbook も参照）。
【００４４】 最後に、ともに従来の手段により、活性化コロイド金属被覆化リンカー被覆化
粒子が精製され、活性化タンパク質が精製される。水性懸濁液中の精製粒子は、
次に、活性化粒子上の反応性基を飽和するのに十分な量の活性化タンパク質の水
性溶液と混合される。この混合は、好ましくは、室温で、そしてタンパク質と粒
子との間の複合を可能にするのに十分な時間の間起こり、その結果安定コロイド
粒子が生じる。活性化タンパク質溶液の量および混合時間の選択は、タンパク質
と複合される粒子の量に依存して、明らかに当業界の技術内であり、これらのパ
ラメーターがこの方法を限定する。
【００４５】 好ましくは、使用前に、結果的に生じた安定コロイド粒子上の未反応官能基は
、適切なブロック剤、例えばＬ−システインおよびヨードアセトアミドによりブ
ロックされる。生物検定で用いるために、本発明の粒子の例、例えば抗体複合金
−または銀−被覆化ポリスチレン粒子は、適切な緩衝液、例えばウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）緩衝液中に懸濁させることができる。
【００４６】 ＩＶ．使用方法−同時分析 本発明の前記のコロイド粒子は、望ましくは、細胞の少なくとも２つの異なる
サブセットの同時定量確定法に用いられる。例えば、本発明の粒子を用いる方法
の一例は、それぞれ赤血球および白血球の両方を含有する生物溶液／懸濁液中の
白血球の２以上の亜集団の同時定量的確定を実証する。好ましくは、細胞のサブ
セットは、相互排除性且つ非重複性である何らかの抗原部位を有することを特徴
とする。
【００４７】 したがって、本発明の方法は、生物溶液または懸濁液、例えば全血を、少なく
とも２つの前記のような異なる安定コロイドと混合する工程を包含する。異なる
粒子は各々、それに複合される異なるタンパク質、例えば異なる抗体を含有し、
タンパク質は各々、亜集団の白血球上の異なるエピトープと結合する。粒子およ
び生物学的物質は、各亜集団の細胞との粒子の結合を可能にするのに十分な時間
混合される。
【００４８】 その後、前記の生物溶液／懸濁液中の赤血球が溶解され、消滅される。この混
合物は、異なるコロイド粒子の各々に結合された白血球の亜集団間を識別する計
器中で分析され、それにより、白血球の少なくとも２つの亜集団を定量的に列挙
する。好ましくは、計器は混合物を同時に分析し、ＶＣＳ（即ち容積、導電率お
よび光散乱）技法での標的化細胞の光散乱をシフトすることにより、細胞間を識
別する。好ましい態様では、検出計器は、少なくとも２つのレーザーを装備する
。このような使用のための特に望ましい計器１つは、米国特許第5,125,737 号お
よび第5,492,833 号（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）
に記載されている改変型Coulter VCS 計器である。
【００４９】 このような方法により、白血球の亜集団、例えばＣＤ４+ Ｔリンパ球（「Ｔ４
細胞」）、ＣＤ８+ Ｔリンパ球（「Ｔ８細胞」）、Ｂリンパ球、顆粒球、好塩基
球および単球等を定量的に検出し得る。 以下の実施例８で説明されるように、本発明の方法はさらに、３つの異なるコ
ロイド粒子を用いて、全血中のＴ４およびＴ８細胞集団の同時分析を提供する。
ある粒子は市販のポリスチレンビーズであり、他の粒子は本発明の粒子、即ちＴ
４−アミノトリチオレート−金−１Ｘ−アミノデキストラン−ポリスチレン粒子
およびＴ８−５Ｘ−アミノデキストラン−銀−１Ｘ−アミノデキストラン−ポリ
スチレン粒子である。
【００５０】 本発明を説明するために以下の実施例を提示する。特に、実施例１〜４は、本
発明の粒子の調製を説明する。実施例５は、粒子の分析評価を提供する。実施例
６および７は細胞集団の別個の分析を提供し、そして実施例８は、本発明を用い
た細胞の同時分析の例を提供する。これらの実施例は本発明を説明するためだけ
のものであり、本発明の範囲を限定するものではない。さらに、以下の実施例に
は特定の試薬および条件が略記されているが、しかし、本発明の精神および範囲
に包含されることを意味する修正は成すことができる。
【００５１】 実施例１−１Ｘ−アミノデキストランまたは５Ｘ−アミノデキストランによる
ポリスチレンアルデヒド／スルフェート粒子のコーティング Ａ．ポリスチレン極微粒子 原料ポリスチレンアルデヒド／スルフェートラテックス粒子は、Interfacial
Dynamics Corporation（IDC ）（オレゴン州ポートランド）から入手した。Ｔ４
−５Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳおよびＴ４−Ａｇ−５Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の初
期試験は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により測定した場合に平均直径２．１５
μｍ、ＣＶ＝５．５％のIDC ロット番号２−３００−３６粒子を用いて実施した
。ＴＥＭにより確定した場合に平均直径２．２００μｍ、ＣＶ＝５．４％と報告
され、COULTER(登録商標）N4MD（商標）サブミクロン粒子分析器で準弾性光散乱
（ＱＥＬＳ）により測定した場合に平均直径２．０２１μｍ、ＣＶ＝１．０％で
あることが判明したIDC ロット番号４９６粒子は、Ｔ４、Ｔ８−ＰＳ粒子を調製
する場合に後に用いられた。後者の金または銀被覆化ＰＳ粒子は全て、ＴＥＭで
平均直径２．１３０μｍ、ＣＶ＝２．７％、ＱＥＬＳで平均直径２．００７μｍ
、ＣＶ＝１．１％のIDC ロット番号５４０粒子から調製された。
【００５２】 Ｂ．アミノデキストランによるコーティング これらのコロイド粒子は、実質的には米国特許第5,639,620 号（この記載内容
は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されたような方法で調製した。要
するに、これらの粒子の４．１％ｗ／ｖ固体３６．６ｍＬを２５０ｍＬポリプロ
ピレン遠心管中にピペット分取した。これらの粒子を、以下のようにコーティン
グした。前記の懸濁液に、５０ｍＬ熱蒸留水中に溶解した１Ｘ−または５Ｘ−ア
ミノデキストラン３．０ｇを加え、２５０ｍＬの０．２μｍフィルターパックに
通して濾過した。米国特許第5,466,609 号に記載された手法により、１Ｘまたは
５Ｘ−アミノデキストランを調製した。次に蒸留水を混合物に加えて全量を１５
０ｍＬにし、４５％ｗ／ｗ水酸化カリウム溶液１８．３μＬを加えて、水酸化カ
リウム中に混合物１ｍＭとした。試験管および内容物を１６〜２４時間ロール混
合した。
【００５３】 Ｃ．架橋 アミノデキストランの架橋は、粒子懸濁液と１時間反応させた３ｍｇ／ｍＬま
たは１．８ｍＬの２５％グルタルアルデヒドを用いて達成された。混合期間終了
時に、粒子混合物中に淡黄色が認められた。ホウ水素化ナトリウム固体１０ｍｇ
／ｍＬまたは１．５３１ｇを反応試験管に加え、次にこれをさらに３時間ロール
混合した。余分量の１．８３４ｍＬの４５ｗ／ｗ水酸化カリウム溶液も試験管に
加えて、水素ガスの発生を低減した。反応混合物の黄色は、グルタルアルデヒド
との反応で生成されたシッフ塩基によるもので、ホウ水素化ナトリウムと約１５
分間混合後は、無色白色粒子懸濁液に変化した。３時間の混合期間中、気体を２
〜３回放出した。
【００５４】 次に、ベックマンＪ６−Ｂ遠心分離機中で、３４００ｇで約１５分間の遠心分
離により粒子を分離し、透明上清を廃棄し、残渣を１５０ｍＬの蒸留水で２回洗
浄した。激しくかき混ぜることにより残渣を毎回再懸濁し、２〜３分間音波処理
して、粒子を再分散した。 その結果生じたアミノデキストラン被覆化ポリスチレン粒子を１Ｘ−Ａｍｄｅ
ｘ−ＰＳおよび５Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳと呼ぶ。
【００５５】 実施例２−コロイド金属による１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳおよび５Ｘ−Ａｍｄｅ
ｘ−ＰＳ極微粒子のコーティング Ａ．銀による粒子のコーティング 実質的には米国特許第5,552,086 号に記載されたように、銀コロイドを用いて
実施例１の粒子を被覆した。要するに、０．５８９Ｍの硝酸銀溶液３．１２ｍＬ
を、１Ｌ三首丸底フラスコ中の５４０ｍＬの蒸留水に加えた。溶液を頭上ガラス
棒スリーブ攪拌器で攪拌し、上部および底部の加熱マントル（Glas-Col）で、約
９０℃に加熱した。実施例１の１％ｗ／ｖ固体１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ３０ｍＬ
を無色熱硝酸銀溶液に加え、その結果生じた混合物を加熱しながら約１〜２分間
攪拌した。次に１．３６Ｍのクエン酸ナトリウム溶液４８ｍＬを熱攪拌反応混合
物に加えた。
【００５６】 粒子上にコロイド銀を形成するための反応過程は、懸濁液の色から、種々の時
間に書き留めた。約２分、淡黄色；約４分、暗褐色；約７分、黒色；約１０分、
暗灰色；約１５分、暗灰色。１５分後、フラスコの内容物を１Ｌビーカーに注ぎ
入れることにより、反応を中断し、粒子懸濁液を室温に冷却させた。暗灰色粒子
は約４０分後に沈澱し、この時点で上清をデカントして、約５０ｍＬの残渣を０
．０１Ｍのクエン酸ナトリウム溶液に再懸濁して、全容量を１００ｍｌとした。
粒子を分離し、遠心分離で５００ｇで約５分間洗浄し、最後に０．０１Ｍのクエ
ン酸ナトリウム溶液中に分散して、全容量を３０ｍＬとした。
【００５７】 Ｂ．スケールアップ調製 ５倍スケールアップ調製は、前記のパートＡに記載したのと同様であるが、し
かし２６００ｍＬ蒸留水中の０．５８９Ｍの硝酸銀溶液１５．６ｍＬ、１％ｗ／
ｖの固体１Ｘ−または５Ｘ−アミノデキストラン−ポリスチレン粒子１５０ｍＬ
、および１．３６Ｍのクエン酸ナトリウム溶液２４０ｍＬを要する。頭上式攪拌
、ならびに上部および底加熱マントルを備えた５Ｌ三首丸底フラスコ中の反応体
に関して、約１５分の反応時間および約９０℃の反応温度を用いた。反応期間終
了時に、５Ｌフラスコおよび内容物をマントルから取り出して、約１０分間冷却
し、この時点で粒子は全てフラスコの底に黒色固体として沈澱していた。次にほ
とんど全ての上清をデカント法により廃棄して、粒子の暗灰色懸濁液を残し、こ
れを０．０１Ｍクエン酸ナトリウム溶液に再懸濁して全容量を１２５ｍＬとした
。 粒子を分離し、遠心分離で５００ｇで約５分間、０．０１Ｍクエン酸ナトリウ
ム溶液を用いて２回洗浄し、最後に０．０１Ｍのクエン酸ナトリウム溶液中に再
分散して、全容量を１５０ｍＬとした。
【００５８】 Ｃ．銀−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳおよび銀−５Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の分析 ０．０１クエン酸ナトリウム溶液中のパートＡの１０倍希釈粒子の倍率１００
０倍での顕微鏡検査は、多くは単一一次粒子と小集合体（２〜３の一次粒子）を
示し、大型集合体は非常に少なかった。金属被覆化１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳおよ
び金属被覆化５Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子のコロイド懸濁液中の一重項（単一主
要粒子）、二重項（２つの一次粒子が一緒に粘着）、高等級多重項（３またはそ
れ以上の一次粒子が一緒に粘着）、および非被覆化または軽度被覆化ＰＳ粒子の
相対集団を、フローサイトメトリー〔銀−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子に関しては４８
８ｎｍ Ａｒイオンレーザー励起を用いたCOULTER(登録商標）Profile II（商標
）；ならびに金−および銀−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子に関しては６３３ｎｍ Ｈｅ
／Ｎｅレーザー励起を用いたCOULTER(登録商標）Elite(商標）〕で測定した。
【００５９】 異なるサイズおよび形状を有するこれらの一次および集合化粒子の集団は、一
次粒子が単分散で、金または銀コーティングが均一である場合、それらの光散乱
能力で十分に定義される。粒子濃縮物の連続希釈は、最終懸濁液中の粒子の容量
分画が約１．３ｘ１０-5となるように、２回濾過１ｍＭ水酸化カリウム溶液を用
いて作られた。フローサイトメーターは、任意に、COULTER(登録商標）DNA-CHEC
K(商標）粒子を整列させて、ヒストグラム中のＦＳおよびＳＳ、ならびにＦ１１
およびＦ１２パラメーターに関してＨＰＣＶ２．０％を得て、標準−ブライト（
Brite ）粒子で較正した。
【００６０】 操作パラメーターを以下のように選択した：標本吸引容量 ５０μＬ；標本流
量 １０μＬ／分。全標本試験実行時間が１０，０００事象と一致するように；
ＦＳのようなヒストグラムパラメーターＹ軸およびＳＳのようなＸ軸；線状増量
の中間でのＦＳに関する増幅器増量対平均チャンネル（Ｙ軸）領域；線状電圧の
中間でのＳＳに関するＲＭＴ電圧対平均チャンネル（Ｘ軸）領域；ヒストグラム
１（加入領域）および２（ビットマップ１でゲート化）。６４ｘ６４タイプ。Ｆ
Ｓ−ＳＳ。ボックス１中に単一粒子を、ボックス２中に二重項、ボックス３中に
全ての高等級集合体を包含するビットマップ１を有する。しかし増幅器ノイズは
出たままにする。；ヒストグラム１および２に関する適切なスケーリング因子；
１０，０００事象を計数するためのビットマップ１およびヒストグラム２；ヒス
トグラム２。ビットマップ１でゲート化。分析ボックスを設置。ヒストグラム１
と同様に、同一位置での単一粒子に関しては１、二重項に関しては２、そして多
重項に関しては３。各粒子状態の集団％を、ヒストグラム２の延長プリントアウ
トから読み取った。ヒストグラム１上の分析ボックスは、それらが電気ノイズお
よびヒストグラム１のビットマップ１の外側の任意の小粒子を含むために、粒子
の真のパーセンテージ比を反映しない。
【００６１】 フローサイトメトリー（前方対側方散乱）ヒストグラムは、６５％一重項、３
２％多重項および３％非被覆化ポリスチレン粒子を示した。 パートＢのスケールアップ調製の１０倍希釈懸濁液の顕微鏡検査は、大抵の黒
色一重項、多数の二重項およびやや大きいクラスターを示した。表示直径２μｍ
のポリスチレン粒子は全て、５０〜２００ｎｍの範囲の直径の黒色銀粒子で一様
に且つ高密度に被覆された。フローサイトメトリーは、７４％一重項、２２％多
重項および４％非被覆化ポリスチレン粒子、ならびに１５．５（１．６）のポリ
スチレン粒子と比較した場合の側方散乱軸上の４０．１（３．３）の４８８ｎｍ
レーザー励起による銀−ポリスチレン粒子の平均シフトを示した。
【００６２】 Ｄ．金による粒子のコーティング 実質的には米国特許第5,552,086 号に記載されたように、実施例１のコロイド
金被覆化１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳおよび５Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の調製を実
施した。要するに、０．７４０ｇの水素テトラクロロアウレート（ＩＩＩ）、Ｈ
ＡｕＣｌ4 ・３Ｈ2 Ｏを、１Ｌ三首丸底フラスコ中の２７０ｍＬの蒸留水に溶解
し、上部および底部の加熱マントルで、約８０℃に加熱し、頭上攪拌した。実施
例１の１％ｗ／ｖ固体１Ｘ−または５Ｘ−アミノデキストラン−ポリスチレン粒
子３０ｍＬを熱攪拌溶液に加え、約５分間混合させた。次に、１．３６Ｍのクエ
ン酸ナトリウム溶液１．５ｍＬを攪拌熱混合物中にピペット分取した。
【００６３】 ５秒以内に、反応混合物の色は淡黄色から無色に変わり、２５秒で褐色に変わ
った。１分反応後、加熱、攪拌を中止して、フラスコ内容物を１Ｌビーカーに移
し、そこで粒子懸濁液を約１〜２分間音波処理して、室温に冷却させた。次に、
褐色粒子を５００ｇで約５分間遠心分離して分離し、上清を廃棄して、残渣を０
．０１Ｍクエン酸ナトリウム溶液で２回洗浄し、最後に０．０１Ｍのクエン酸ナ
トリウム溶液中に再懸濁して、全容量を３０ｍＬとした。
【００６４】 Ｅ．スケールアップ調製 ５倍スケールアップ調製は、パートＢに記載したのと同様であるが、しかし２
８００ｍＬ蒸留水中の３．５８ｇの水素テトラクロロアウレート（ＩＩＩ）およ
び１％ｗ／ｖの固体１Ｘ−または５Ｘ−アミノデキストラン−ポリスチレン粒子
１５０ｍＬを、頭上式攪拌、ならびに上部および底加熱マントルを備えた５Ｌ三
首丸底フラスコ中で約８０℃で５６分間混合した。次に、１．３６Ｍクエン酸ナ
トリウム溶液７．５ｍＬを混合物に加えた。１０秒で、反応混合物は淡黄色から
無色に変わり、次に３０秒で紫色に、５５秒で褐色に変わった。反応を約８０℃
でさらに約９分間継続した。反応期間の終了時に、加熱および攪拌を中止し、５
Ｌフラスコおよび内容物をマントルから取り出して、室温まで冷却した。約１時
間後、淡紫色上清をデカントし、約１５０ｍＬの濃褐色懸濁液を、５００ｇで５
分間の遠心分離により分離した。上清を廃棄し、残渣を０．０１Ｍクエン酸ナト
リウム溶液で２回洗浄し、最後に０．０１Ｍのクエン酸ナトリウム溶液中に再懸
濁して、全容量を１５０ｍＬとした。
【００６５】 各金属イオンの金属（０）への還元が１００％であると仮定して、生成し得る
金属金の容量がパートＢで形成された金属銀の容量と等価であるように、１％ｗ
／ｖ粒子１ｍＬ当たり用いられる金塩の量を選択した。パートＢの大規模銀コー
ティング手法では、生成することができた銀金属の容量は、１５．６ｍＬ／（１
０００ｍＬ／Ｌ）ｘ０．５８９Ｍ ＡｇＮＯ3 ｘ１０７．８７ｇ Ａｇ／ｍｏｌ
÷１０．４９ｇ／ｃｍ3 ＝０．０９４５ｃｍ3 Ａｇである。したがって、大規
模金コーティング手法に必要な金塩ＨＡｕＣｌ4 ・３Ｈ2 Ｏの質量は、１％ｗ／
ｖ粒子１５０ｍＬ当たり０．０９４５ｃｍ3 Ａｕｘ１９．３２ｇ／ｃｍ3 ｘ３
９３．８８ｇ ＨＡｕＣｌ4 ・３Ｈ2 Ｏ／１９６．９７ｇ Ａｕ＝３．６５ｇで
ある。ポリスチレン粒子０．０５％ｗ／ｖ固体上に被覆される銀または金の容量
分画は、反応混合物中で３ｘ１０-6であったが、しかしポリスチレン粒子の最終
懸濁液中では６ｘ１０-5に濃縮された。粒子懸濁液のアリコートを蒸留水で５ま
たは６回、徹底的に洗浄し、洗浄標本を凍結乾燥して、標本を計量することによ
り測定した場合、加えた金属は、元の１％ｗ／ｖ固体粒子懸濁液を約２．２％ｗ
／ｖ固体金−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子に、そして約１．７％ｗ／ｖ固体銀−Ａｍｄ
ｅｘ−ＰＳ粒子に変える。
【００６６】 Ｆ．金−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳおよび金−５Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の分析 パートＤの１０倍希釈粒子の顕微鏡検査は、一重項、小集合体、および非常に
少ない大型集合体を示した。銀被覆化粒子に関して前記したように実施したフロ
ーサイトメトリー（前方対側方散乱）ヒストグラムは、１６．０（２．５）のポ
リスチレン粒子と比較した場合の側方散乱軸上の４２．０（４．７）の６３３ｎ
ｍレーザー励起による金−ポリスチレン粒子の平均シフトを示した。金−Ａｍｄ
ｅｘ−ポリスチレン一重項は４３％、集合体５３％、そして非被覆化ポリスチレ
ン粒子４％であった。 パートＥのスケールアップ調製で実施したフローサイトメトリーは、一重項の
パーセンテージが５３％；多重項２６％；そして軽度被覆化ポリスチレン粒子１
６％であることを示した。
【００６７】 実施例３−コロイド銀−アミノデキストラン−ポリスチレン粒子の架橋および
連結 Ａ．５Ｘ−アミノデキストラン架橋化銀−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の調製 実施例２Ａに記載したように１％ｗ／ｖ固体ポリスチレン粒子から調製され、
０．０１Ｍクエン酸ナトリウム溶液中に懸濁された銀−アミノデキストラン−ポ
リスチレン粒子２５ｍＬを、５００ｇで５分間の遠心分離により分離し、上清を
廃棄して、残渣を元の容量で２％ｗ／ｖの５Ｘ−アミノデキストラン溶液中に再
懸濁した。混合物を一夜１６〜２４時間ロール混合し、５００ｇで約５分間遠心
分離して、残渣を分離し、上清を廃棄した。最終残渣を再懸濁して、１ｍＭ水酸
化カリウム溶液で最終濃度２５ｍＬとした。
【００６８】 その後、２５％ｗ／ｖのグルタルアルデヒド０．１０ｍＬを粒子懸濁液に加え
て、１ｍｇグルタルアルデヒド／ｍＬ粒子懸濁液とし、これを約５０分間ロール
混合した。次に、等モル量０．６０１ｍｇのエチレンジアミン／ｍＬまたは１６
．９μＬを反応混合物に加え、これをさらに約３０分間ロール混合して、アルデ
ヒド基をブロックした。１ｍＭの水酸化カリウム溶液３ｍＬ中のホウ水素化ナト
リウム３０ｍｇの溶液を調製し、この溶液２．０ｍＬを粒子懸濁液中にピペット
分取して、これをさらに３０分間ロール混合した。
【００６９】 反応が約１〜２分で鎮静後、ガスが放出された。反応期間終了時に、５００ｇ
で５分間の遠心分離により粒子を分離し、上清を廃棄して、残渣を１ｘＰＢＳで
４回洗浄した。１ｘＰＢＳは、１．６Ｌの蒸留水中にＫ2 ＨＰＯ4 ５３．８ｇを
溶解し、ＫＨ2 ＰＯ4 １２．８ｇを加えて、溶解するまで攪拌することにより、
調製した。次に、ＮａＣｌ ３４０ｇを溶液中に溶解させた。塩が全て溶解した
後、蒸留水を加えて容量を２Ｌとし、０．２μｍフィルターを通して濾過した。
その結果生じた溶液は、２０ｘＰＢＳである。１ｘＰＢＳは、１部の２０ｘＰＢ
Ｓを１９部の蒸留水で希釈することにより調製する。１ｘＰＢＳ溶液は、７．１
〜７．３の範囲の、典型的には７．２のｐＨを、そして１３，５００〜１５，５
００μＭｈｏ−ｃｍ-1の導電率を有し、ＮａＣｌ中で０．１５Ｍである。最終残
渣を、１ｘＰＢＳ中に再懸濁して、全容量を２５ｍＬとした。
【００７０】 Ｂ．架橋化５Ｘ−アミノデキストラン被覆化銀−アミノデキストラン−ポリスチ
レン粒子とのＴ４／Ｔ８抗体の複合 １０ｍｇ／ｍＬのスルホ−ＳＭＣＣ／ｍＬ１％ｗ／ｖ固体粒子４．５μＬ、ま
たはスルホ−ＳＭＣＣ溶液７２．０μＬを５０ｍＬポリプロピレン遠心分離管中
の架橋化５Ｘ−アミノデキストラン−銀−ポリスチレン粒子１６ｍＬに加えた。
前記のように、試験管および内容物を約１時間ロール混合し、その後、５００ｇ
で約５分間の遠心分離により粒子を分離して、上清を廃棄し、残渣を１ｘＰＢＳ
で４回洗浄した。最終残渣を１ｘＰＢＳ中に再懸濁して最終容量を１６ｍＬとし
た。
【００７１】 ０．６６７ｍＬの１ｘＰＢＳ中の各々１０ｍｇのＴ４（０．２２５ｍＬ）およ
びＴ８（０．２６６ｍＬ）濃縮物を、２−イミノチオラン（ＩＴ）を用いて、２
ｍｇ／ｍＬのＩＴ溶液６５μＬを用いて、１５：１＝ＩＴ：抗体のモル比で別々
に活性化した。１５ｍＬポリスチレン遠心分離管中の反応混合物を１時間ロール
混合し、次に１ｘＰＢＳで平衡化した５０ｍＬＧ−５０セファデックスカラムの
上部に適用した。カラムを１ｘＰＢＳで溶離し、ＩＴ−Ｔ４またはＩＴ−Ｔ８抗
体を含有する一次Ａ280 −吸収帯の分画をプールして、２．３５１ｍｇ／ｍＬの
ＩＴ−Ｔ４抗体２．６ｍＬおよび２．７０９ｍｇ／ｍＬのＩＴ−Ｔ８抗体３．０
ｍＬを生じた。
【００７２】 １．１９１ｍＬのＩＴ−Ｔ４／１．１８１ｍＬのＩＴ−Ｔ８溶液を加えて４ｍ
Ｌのスルホ−ＳＭＣＣ活性化粒子懸濁液の標本が２倍にするように、０．７ｍｇ
のＩＴ−Ｔ４および０．８ｍｇのＩＴ−Ｔ８／ｍＬ １％ｗ／ｖ固体粒子で、複
合化を実施し、混合物を約２時間ロール混合した。複合化期間終了時に、各々１
ｍＬの複合反応混合物をピペット分取して、０．２μｍの低タンパク質結合フィ
ルター円盤を通して濾過した。上清のＡ280 を測定して、０．５０４ｍｇ／ｍＬ
のＩＴ−Ｔ４／０．５３４ｍｇ／ｍＬのＩＴ−Ｔ８濃度を生じた。特定の表面積
２．７０８ｍ2 ／ｇの平滑球面２μｍ直径粒子と仮定して、差によって、ＩＴ−
Ｔ４の表面濃度は、０．１０７（０．０８４）ｍｇ／ｍＬまたは５．１（４．０
）ｍｇ Ｔ４抗体／粒子表面積１ｍ2 であり、そしてＩＴ−Ｔ８の表面濃度は０
．３９１（０．３８６）ｍｇ／ｍＬまたは１８．７（１８．５）ｍｇ Ｔ８抗体
／粒子表面積１ｍ2 であった。
【００７３】 Ｔ４−およびＴ８−複合粒子をともに、一方はブロックせず、他方はＬ−シス
テインおよびヨードアセトアミドでブロックされる、２つの４．２ｍＬ標本に分
けた。ブロックされる標本は１ｘＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍＬのＬシステイン溶液０
．５０３ｍＬでブロックし（約１５分間）、次に１ｘＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｍＬ
のヨードアセトアミド溶液０．５６３ｍＬ、および０．１０５ｍＬの１Ｍホウ酸
塩緩衝溶液、ｐＨ９．８でブロックした（３０分間）。ブロック反応終了時に、
４つの標本を全て、５００ｇで約５分間の遠心分離により分離して、上清を廃棄
し、残渣をＢＳＡ緩衝液、１ｘＰＢＳ溶液中の１％ＢＳＡ／０．１％アジ化ナト
リウムで２回洗浄して、ＢＳＡ緩衝液中に再懸濁し、約１時間ロール混合して、
約５℃で１６〜２４時間、冷蔵庫中で保存した。次に標本をＢＳＡ緩衝液でさら
に２回洗浄し、各標本の全容量を３．２ｍＬに調整して、非被覆化ラテックス粒
子を基礎にした１％ｗ／ｖ固体懸濁液を得た。
【００７４】 実施例４−コロイド金−アミノデキストラン−ポリスチレン粒子の架橋および
連結 Ａ．アミノトリチオールリンカーの調製 実質的には、Whitesell & Chang[Science 261,73（1993）] に記載されている
ようにして、架橋剤Ｃ12Ｈ26Ｎ2 ＯＳ3 を調製し、保護化配位子Ｎ−ｔｅｒｔ−
ブトキシカルボニルスパイダートリアセテートとして保存した。
【００７５】 使用前に、１０ｍｇの保護化配位子を５ｍＬの無水メタノールに溶解させて、
無色溶液を得た。次に、２．５ｍＬの濃塩酸（３６．５〜３８．０％）を保護化
スパイダーの溶液に加えた。混合物を５０ｍＬ丸底フラスコ中で約５時間還流し
て、遊離スルフヒドリル基の臭いを有する黄色溶液を得た。 スパイダー配位子の酸触媒化加水分解混合物（最終容量３．０ｍＬ）をBio-Ge
l P-2 カラム１．１ｃｍｘ３０ｃｍの上部に適用し、蒸留水で溶離した。２８０
ｎｍで吸収する第一帯の分画を収集し、リン酸緩衝液ブランクに対してエルマン
試薬５，５’−ジチオ−ビス−［２−ニトロ安息香酸］（Pierce Chemical Co.
）を用いて遊離スルフヒドリル基に関して試験した。
【００７６】 試薬は遊離スルフヒドリル基と反応して、４１２ｎｍで吸光度を有して、高度
着色発色団を生成した〔J.C. Ellman 「Clin. Chem. Acta」28:234-241（1962）
〕。エルマン試薬による発色は、約１５分で成された。スルフヒドリル基の定量
的確定のために、Ｌ−システインに関して標準曲線を引いて、錯体に関する洗浄
反応範囲を確定した。全量５６ｍＬの１２の脱保護化配位子分画は、Ａ４１２読
み取り値が０．５４９、またはスルフヒドリル濃度０．４５８ｍＭを示し、収率
は４４％であった。
【００７７】 Ｂ．アミノトリチオール架橋化金−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の調製 エタノール溶液中の０．３３Ｍのアミノトリチオールリンカー４．９５０ｍＬ
を前記と同様に調製し、５０ｍＬポリプロピレン管中の蒸留水中の１％ｗ／ｖ固
体金−１Ｘ−アミノデキストラン−ポリスチレン粒子懸濁液１５ｍＬに加えた。
試験管および内容物を１６〜２４時間ロール混合し、その時点で、２００ｇで約
１０分間の遠心分離により粒子を分離し、上清を廃棄して、残渣を１ｘＰＢＳで
４回洗浄した。最終残渣を１ｘＰＢＳに懸濁して、全容量を１５ｍＬとした。
【００７８】 Ｃ．架橋化アミノトリチオレート被覆化金−アミノデキストラン−ポリスチレン
粒子とのＴ４／Ｔ８抗体の複合 １％ｗ／ｖ固体粒子１ｍＬ当たり１ｘＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍＬのスルホ−Ｓ
ＭＣＣ溶液１．５０μＬ、または粒子懸濁液の１５ｍＬ試験に対して２２．５μ
Ｌを、５０ｍＬポリプロピレン遠心分離管中の粒子に加え、約１時間ロール混合
した。反応期間終了時に、２００ｇで約１０分間の遠心分離により粒子を分離し
て、上清を廃棄し、残渣を１ｘＰＢＳで４回洗浄した。最終残渣を１ｘＰＢＳ中
に再懸濁して最終容量を１５ｍＬとし、各試験用に各７．５ｍＬ部分に分けた。
【００７９】 前記の実施例３と同様の方法で、各抗体、Ｔ４およびＴ８の各々１０ｍｇを、
ＩＴを用いて活性化し、ＩＴ−Ｔ４およびＩＴ−Ｔ８誘導体を精製した。別々の
試験で、０．７ｍｇのＩＴ−Ｔ４／ｍＬ１％粒子および０．８ｍｇのＩＴ−Ｔ８
／ｍＬ１％粒子を用いて、同様の方法で複合化を実施した。各試験の１ｍＬをピ
ペット分取して、上清中のＩＴ−Ａｂを分析した結果、２．７０８２ｍ2 ／ｇの
特定表面積を有する平滑球面２μｍ直径粒子と仮定して、６．７ｍｇのＴ４抗体
／ｍ2 および９．５ｍｇのＴ８抗体／ｍ2 であった。ブロックしない場合と、Ｌ
−システインおよびヨードアセトアミドでブロックする場合とのために、標本を
さらに等しく分けた。次に、２００ｇで約１５分間の遠心分離により、粒子を分
離し、上清を廃棄して、残渣を１ｘＰＢＳ中の１％ＢＳＡ／０．１％アジ化ナト
リウムで２回洗浄し、ＢＳＡ緩衝液中に再懸濁して、約１時間ロール混合し、約
５℃で１６〜２４時間冷蔵庫に保存した。 Ｔ４−およびＴ８−複合粒子を、ＢＳＡ緩衝液でさらに２回洗浄し、各標本の
全容量を３．４ｍＬとして、非被覆化ラテックス粒子を基礎にした１％ｗ／ｖ固
体懸濁液を得た。
【００８０】 Ｄ．多角度ドップラー電気泳動光散乱分析（ＤＥＬＳＡ） 実施例４Ｂの金−１Ｘ−アミノデキストラン−ポリスチレン（「１Ｘ−Ａｍｄ
ｅｘ−ＰＳ」）粒子の表面に結合されるアミノトリチオレートリンカーの存在を
、多角度ドップラー電気泳動光散乱（ＤＥＬＳＡ）測定［Laser Doppler Spectr
oscopy:Applications To Cell And Particle Electrophoresis, E.E.Uzgris「Ad
v. Colloid Interface Sci. 」14:75-171 （1981）］を用いて、粒子の各懸濁液
のｐＨの関数として、これらの粒子およびそれらの親粒子の全て、原料ＰＳアル
デヒド／スルフェート、１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ（実施例１）、ならびに金−１
Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ（実施例２Ｄ）粒子の移動度を得ることにより、実証した
。
【００８１】 アミノトリチオレート−金−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子（実施例４Ｂ）なら
びにそれらのＴ４−およびＴ８−抗体複合粒子（実施例４Ｃ）の懸濁液のＤＥＬ
ＳＡ測定を、COULTER(登録商標）ＤＥＬＳＡ（商標）４４０で実施した。これら
の測定値を用いて、原料粒子上の一層ずつの被覆化粒子の同一性およびｐＨ安定
性範囲を確定した。
【００８２】 移動度は、水性懸濁液中の粒子の表面電荷に直接関連し、陽性または陰性の電
荷が大きいほど、移動度は高い。移動度のこのｐＨ依存性は、被覆化粒子の全て
の段階に関して、図１に示されている。電気泳動測定前に、原料ＰＳおよび１Ｘ
−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子を蒸留水中に；金−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子を０．
０１Ｍクエン酸ナトリウム中に；アミノトリチオレート金−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−
ＰＳ粒子を１ｘＰＢＳ中に；そしてＴ４−およびＴ８−アミノトリチオレート金
−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子を１ｘＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナ
トリウム中に懸濁した。測定のために、全粒子を、０．０１Ｍ水性硝酸カリウム
溶液を用いて、４または１％ｗ／ｖ固体から４ｘ１０-4パーセンテージｗ／ｖ固
体に希釈した。希釈粒子懸濁液のｐＨは、０．１Ｍ水性水酸化カリウムまたは０
．１Ｍ水性硝酸溶液で調整した。
【００８３】 高さ１．００ｍｍの長方形標本チャンネルをチャンネルの上部近くの固定層（
０．１６ｍｍ）に配置することにより、ＤＥＬＳＡ測定を実施した。電気泳動標
準COULTER EMPSL7を用いて、標本小室の配置の最終調整を実施した。van Gilsプ
ロット（Ｈ−ｈ）2 ／Ｈ2 対移動度（ここで、ｈは、チャンネル上部からの深さ
（ｍｍ）（０〜１．００）であり、そしてＨ＝０．５０ｍｍ、ＥＭＰＳＬ７標準
の移動度は、チャンネルの深さのほとんどを通して直線であり、チャンネルの中
心軸とほぼ対称であった）。多少の偏差は、チャンネルの底近く、０．９５ｍｍ
大きいｈまたは０．８より大きい（Ｈ−ｈ）2 ／Ｈ2 で生じた。これは、ＤＥＬ
ＳＡ標本小室中の標準粒子の放物、電気浸透性流プロフィールの完全発現を示し
た。その他のＤＥＬＳＡ計器パラメーターは以下のように選択された：周波数範
囲、５００Ｈｚ；周波数シフト、２５０Ｈｚ；電流は、別記しない限り０．７ｍ
Ａ；オンタイム、２．０ｓ；オフタイム、０．５ｓ。
【００８４】 粒子懸濁液の導電率は、１．３〜１．６ｍＳ／ｃｍの範囲であった。図１に示
すように、アミノデキストラン（１Ｘ−Ａｍｄｅｘ）被覆化ポリスチレンアルデ
ヒド／スルフェートラテックス粒子は、ｐＨ７〜１０の範囲の測定値で、約−１
ｃｍ2 ／Ｖ−ｓというほぼ一定の移動度を示し、これは、ラテックス粒子の表面
の先在する負に荷電したスルフェート基を計数するためにいくつかの中性アルデ
ヒド基を置換した陽性荷電プロトン化アミノ基の存在を反映する。 原料ポリスチレンアルデヒド／スルフェートラテックス粒子は、元々陰性荷電
され、図１に示すように、ｐＨ７〜１０の範囲で−６〜−７ｃｍ2 ／Ｖ−ｓとい
う非常に高い負の移動度を有する。金コロイドを１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子上
に導入後、その結果生じた粒子の移動度の約＋２から−４ｃｍ2 ／Ｖ−ｓへの急
下降は、水性硝酸ナトリウム溶液による粒子の希釈後でさえ、金−１Ｘ−Ａｍｄ
ｅｘ−ＰＳ粒子上の吸着クエン酸塩の存在を示した。２０℃で３．１４、４．７
７および６．３９という段階的ｐＫa 値に反映されるようなクエン酸の酸解離定
数は、移動度の大落下と同じｐＨ範囲で生じる。
【００８５】 アミノトリチオレート−金−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の電気泳動移動度プ
ロフィールは、−０．６〜−３．５ｃｍ2 ／Ｖ−ｓの範囲のこれらの粒子の移動
度、ならびにｐＨ４〜１０の範囲を通しての約＋０．３ｘ１０-4ｃｍ2 ／Ｖ−ｓ
での人工物の存在を示した。この人工物は、特に細胞中に１ｍＡ未満の低電流（
適用電場）での、１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳおよび金−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒
子の移動度プロフィールにおける同一位置にも存在した。８．６°の最低散乱角
度に対してドップラー周波数シフトが＋／−１０Ｈｚより大きいように、後者の
粒子懸濁液の電気泳動図を得るためには、１〜２．５ｍＡという高い電流が必要
であった。粒子移動度のvan Gilsプロットでのその定位置、ならびに強度の出力
範囲での全４つの散乱角度でのほぼ０．０Ｈｚのその定位置対ドップラー周波数
シフトにより、人工物を同定した。
【００８６】 アミノトリチオレート被覆化金１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の移動度は、ｐＨ
５．８より上では、親金−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の移動度をわずかに越え
たが、しかし、５．８未満のｐＨでは、親粒子の場合より低下した。これは、三
陰性トリチオレート基アミノトリチオレート基として金属粒子表面の三陰性荷電
クエン酸塩を置換することによりリンカーが獲得できるより低い負の電荷を反映
する。末端アミノ基は、ｐＨ４〜１０領域でのプロトン化のために、陽性電荷を
依然として保持する。さらに、５．８〜４．２の低ｐＨ範囲での−３．３ｃｍ2 ／Ｖ−ｓから−０．６ｃｍ2 ／Ｖ−ｓへの移動度の急上昇の出現は、チオレート
基の部分的プロトン化であり得る。スルフヒドリル基は、典型的には、７〜９の
範囲のｐＫa 値を示す。移動度測定値に示されるように、表面金または銀原子に
結合されるチオレート基の単一硫黄原子は非常に強い結合を形成するが、コロイ
ド金または銀上のクエン酸塩の３つのカルボキシレート基のカルボキシレート酸
素原子のいずれかと同じように容易にプロトン化されるわけではない。 アミノトリチオレート−金−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の電気泳動図におけ
る特徴は、ｐＨ１０への塩基付加とその後のｐＨ４への酸付加の数サイクルを通
して可逆的である。
【００８７】 Ｔ４−およびＴ８−抗体複合化アミノトリチオレート−金−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ
−ＰＳ粒子は、親粒子より狭くそしてより陽性の＋１．２〜−２．３ｃｍ2 ／Ｖ
−ｓ範囲の移動度を有するそれぞれの抗体被覆化粒子を示す。さらに、ｐＨ４〜
１０範囲を通しての親粒子の陰性電荷は抗体により平衡されるがしかし優勢では
なく、したがって、抗体複合化粒子のゼロ電荷の点（「ｐ．ｚ．ｃ．」）は、従
来のゲル電気泳動によりそれぞれの抗体に関する主帯から確定した場合のＴ４抗
体に関しては５．４〜５．８そしてＴ８抗体に関してはｐＨ６．７〜７．３であ
るモノクローナル抗体のｐＩ範囲の代わりに、ｐＨ４．５〜５．０にある。０．
０１Ｍ硝酸カリウム溶液で希釈する前に１ｘＰＢＳ緩衝液中の１％ウシ血清アル
ブミン（「ＢＳＡ」）、０．１％アジ化ナトリウム中にＴ４−およびＴ８−複合
化粒子を保存すると、粒子表面へのＢＳＡの吸着により、ＢＳＡに関する約４．
９のｐＩと重複するｐ．ｚ．ｃ．範囲が生じる。
【００８８】 銀−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ（実施例２Ａ）粒子は、（−０．５７〜−１．６
ｃｍ2 ／Ｖ−ｓ）ｐＨ５〜１０のわずかに低減する陰性移動度を示したが、これ
は、親１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の移動度のわずかだけの陰性に非常によく似
ている。これを、水性クエン酸ナトリウムで洗浄したCarey Les 銀ゾル（約１０
ｎｍの平均直径の銀粒子）に関する移動境界法により得られた移動度データと比
較し、これは−８０＋／−５ｍＶのゼータ電位または−３．７ｃｍ2 ／Ｖ−ｓの
移動度で報告された〔G. Frens他「Kolloid Z.Z.Polym.」233;922 （1969）参照
〕。さらに、いくつかの銀ゾル、例えばホウ水素化ナトリウムを有する銀ゾル（
Ａｇ（ＮａＢＨ4 ）、ｐＨ８．１）、エチレンジアミン四酢酸を用いて調製した
銀ゾル（Ａｇ（ＥＤＴＡ）、ｐＨ１０．１）、Carey Lea 銀ゾル（Ａｇ（Carey
Lea ）、ｐＨ７．０）および水性硫酸銀溶液中に調製した銀ゾル（Ａｇ（水性Ａ
ｇＳＯ4 溶液）、60Ｃｏ照射、ｐＨ約５．７）を用いた顕微電気泳動実験は、−
４．２〜−５．０ｃｍ2 ／Ｖ−ｓの移動度を生じ、赤色クエン酸金ゾル（約２０
ｎｍの平均直径金粒子）を用いた場合は、約５．５のｐＨで−４．５ｃｍ2 ／Ｖ
−ｓの動電学的移動度を示した〔Heard 他「J. Colloid Interface Sci. 」93:5
45（1983）〕。
【００８９】 金−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子は約５．５のｐＨでクエン酸金ゾルの移動度
と同様の、ｐＨ６〜９の範囲で約−４．０ｃｍ2 ／Ｖ−ｓという移動度を示すが
、しかし銀−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の移動度（−０．６〜−１．６ｃｍ2 ／Ｖ−ｓ）は、クエン酸銀ゾルの移動度（−４．２〜−５．０ｃｍ2 ／Ｖ−ｓ）
と似ていず、このことは、銀−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子中の銀−クエン酸塩
結合が弱く、したがって動電気的測定のための０．０１Ｍ硝酸カリウム溶液中の
粒子懸濁液の希釈が、銀−１Ｘ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子上に元々吸着していた多
量のクエン酸塩を放出したことを示唆する。
【００９０】 実施例５−架橋化およびタンパク質被覆化コロイド金属−アミノデキストラン
被覆化粒子の分析 実施例３および４の金−または銀−被覆化ポリスチレン粒子を、固体支持体上
の乾燥粒子のＳＥＭ顕微鏡写真により、前方散乱（ＦＳ）対側方散乱（ＳＳ）の
フローサイトメトリーヒストグラムにより、そして抗体複合粒子に関しては、角
光散乱による全血中の標的化白血球亜集団に対する特異性、ならびにＤＣまたは
ＲＦ導電率マトリックスにより、特性化した。実施例４Ａのアミノトリチオール
リンカーと反応させた銀被覆粒子も調べた。
【００９１】 Ａ．架橋化金属−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子およびタンパク質連結粒子のフローサイ
トメトリー分析 実施例３Ａの粒子のフローサイトメトリーは、４１％一重項、５１％多重項お
よび５％非被覆化ポリスチレン粒子を示した。 実施例３Ｂのタンパク質連結粒子のフローサイトメトリーは、ブロックを伴わ
ないＴ４−Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子に関しては６４％一重項、
３３％多重項および１．４％非被覆化ポリスチレン粒子；ブロックＴ４−Ａｍｄ
ｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子に関しては５７％一重項、４１％多重項およ
び０．４％非被覆化ポリスチレン粒子；ブロックを伴わないＴ８−Ａｍｄｅｘ−
Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子に関しては６０％一重項、３８％多重項および０．
４％非被覆化ポリスチレン粒子；ブロックＴ８−Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ
−ＰＳ粒子に関しては５６％一重項、４２％多重項および０．３％非被覆化ポリ
スチレン粒子を示した。
【００９２】 しかしながら、実施例４Ｂに記載されたのと同様の方法でアミノトリチオレー
トリンカーを用いて架橋された銀被覆粒子に関してフローサイトメトリーにより
得られた前方対側方散乱ヒストグラムの側方散乱シフトは、配位子と反応させて
おいた銀−ＰＳ粒子に関する大きさと同様ではなく、ヒストグラム中の非被覆ポ
リスチレン粒子の位置を逆転する傾向があった。 実施例４Ｂの架橋化金−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子のフローサイトメトリーは、６
４％一重項、２３％多重項および８％弱被覆化ポリスチレン粒子を示した。
【００９３】 実施例４Ｃのタンパク質複合粒子のフローサイトメトリーは、ブロックＴ４−
アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子に関しては８２％一重項、８
％多重項および１０％弱被覆化ポリスチレン粒子；ブロックを伴わないＴ４−ア
ミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子に関しては７５％一重項、１２
％多重項および１３％弱被覆化ポリスチレン粒子；ブロックＴ８−アミノトリチ
オール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子に関しては８３％一重項、５％多重項およ
び１１％弱被覆化ポリスチレン粒子；ブロックを伴わないＴ８−アミノトリチオ
ール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子に関しては７３％一重項、１２％多重項およ
び１５％弱被覆化ポリスチレン粒子を示した。
【００９４】 Ｂ．ＳＥＭ分析 懸濁液の小滴の蒸発により金属切株上で乾燥させたＴ４−アミノトリチオール
−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を、図４Ａ〜４
Ｃに示す。これは、ポリスチレン粒子の表面に沈着した金の元の粒子の場合と同
様に、ポリスチレン粒子上の金コロイドの層を示すが、アミノトリチオールリン
カーの結合、スルホ−ＳＭＣＣによる活性化、抗体との複合、ブロックおよびＢ
ＳＡ緩衝液による洗浄による変化を受けない。
【００９５】 銀−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子をアミノトリチオールリンカーで被覆し、実施例４
の前記の金被覆粒子の場合と同様の方法で抗体と複合させた。しかしながら、ア
ミノトリチオールリンカーは、ポリスチレン粒子上の沈着銀コロイドの表面の結
合部位に関してアミノデキストランと非常によく競合し、銀−アミノデキストラ
ン−ポリスチレン粒子の表面から多量の銀コロイドを追い出した。これは、少量
の銀粒子を含有する粒子洗浄の上清の乳白光から分かった。図５Ａ〜５で柄に示
したＳＥＭ写真のいくつかの粒子上の大きいむき出しの斑点状部分、および小銀
粒子の大型集合体の存在を参照。明らかに、アミノトリチオレートリンカーは銀
粒子と非常に強力に結合するため、ＰＳ粒子周囲のアミノデキストランコーティ
ング中のそれらの包埋位置からそれらを除去する。
【００９６】 さらに、配位子との反応後に採取した標本のＳＥＭ顕微鏡写真は、小銀粒子の
大型集合体と多数のむき出しのスポットを有するポリスチレン粒子を示したが、
一方、同一粒子が、配位子との反応前には銀コロイドで均一に被覆された。した
がって、アミノトリチオールは、ポリスチレン粒子上の銀コロイドとの架橋剤と
しては十分に作用しない。
【００９７】 実施例６−ジアミノプロパン被覆化ポリスチレンアルデヒド／スルフェートラ
テックス粒子とのＴ４およびＴ８抗体の複合 本実施例は、本発明の方法および組成物の結果を立証するために、対照として
、ならびに同時実験での一対のビーズの一方として用いられる被覆化粒子を記載
する。 Ａ．粒子の調製 スケールアップ調製を除いて、１，３−ジアミノプロパン（ＤＡＰ）のポリス
チレンラテックス粒子との結合は、国際特許出願ＷＯ9524631 （1995年9 月14日
公開）にかつて記載された方法により実施した。 ２Ｌポリプロピレンボトル中の４％ｗ／ｖ固体ポリスチレンアルデヒド／スル
フェート粒子（Interfacial Dynamics Corp.、直径約２μｍ）１０００ｍＬに、
１６．８ｍｇの液体ＤＡＰ（比重０．８８８ｇ／粒子懸濁液１ｍＬ、または１９
．１ｍＬのＤＡＰ）を加えた。その結果生じた懸濁液をかき混ぜてよく混合し、
３０秒間音波処理して、２４〜７２時間ロール混合した。粒子表面のシッフ塩基
基および未反応アルデヒドを低減するために、ＤＡＰとロール混合した４％ｗ／
ｖ固体粒子１ｍＬ当たり１０ｍｇの固体ホウ水素化ナトリウム、または１０．４
ｇを粒子反応混合物に直接加えた。約１１．５のｐＨで余分量のＤＡＰの存在下
では、余分な泡起は起きなかった。反応混合物を時々３０秒間音波処理しながら
、約３時間ロール混合し、反応容器から水素ガスを放出させた。次に、約２６０
０ｇで約２５分間の遠心分離により、粒子を分離した。上清を廃棄し、粒子の残
渣を約１Ｌの蒸留水中に再懸濁した。
【００９８】 攪拌し、短時間音波処理して、粒子の再分散を達成した。遠心分離による洗浄
工程を４回反復し、最終粒子懸濁液を１ｘＰＢＳ溶液で調整して、全容量を１０
００ｍＬとした。 ＤＡＰ結合粒子の活性化は、スルホ−ＳＭＣＣを用いて達成した。概して、１
ｘＰＢＳ中の１４．２μＬの新たに調製した１０ｍｇ／ｍＬスルホ−ＳＭＣＣを
、４％ｗ／ｖ固体ＤＡＰ被覆ポリスチレン粒子懸濁液１ｍＬについて用いた。典
型的調製物では、１４．２ｍＬのスルホ−ＳＭＣＣ溶液を１０００ｍＬの４％ｗ
／ｖ固体粒子に加えた。次に混合物を２Ｌプラスチックボトル中で約１時間ロー
ル混合して、遠心分離により分離し、１ｘＰＢＳ溶液で複数回洗浄した。 前記の一連の工程から生じる官能化ＤＡＰ被覆化粒子は、マレイミド側基を有
し、種々の生物分子との複合化に適している。粒子と複合することが望ましい物
質が十分な活性スルフヒドリル基を有する場合、その物質の活性化は、必要でな
く、以下の工程を飛ばし得る。
【００９９】 抗体は、塩酸２−イミノチオラン（ＩＴ）を用いて活性化した。典型的実施で
は、０．１％アジ化ナトリウムを含有する１ｘＰＢＳ中のＴ４モノクローナル抗
体の４２．７７ｍｇ／ｍＬ濃縮物を調製した。カップリング中の１０００ｍｇの
Ｔ４（またはＴ８）抗体および１５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度のために、全反応容量
は６６．６７ｍＬであるべきである。１５：１：：ＩＴ：Ｔ４活性化比を用いて
、１ｘＰＢＳ中の９３．７５μｍｏｌ（１２．９ｍｇ）ＩＴ（６．４５ｍＬの２
ｍｇ／ｍＬ ＩＴ）が必要である。したがって、３６．８４ｍＬの１ｘＰＢＳ溶
液を２３．３８ｍＬのＴ４濃縮物に加え、その結果生じた溶液に、さらに６．４
５ｍＬの２ｍｇ／ｍＬ ＩＴを加えた。その結果生じた正味溶液を２５０ｍＬ遠
心分離管中で１時間ロール混合した。反応管中の内容物を次に、２０００ｍＬ
Ｇ−５０セファデックスカラムの上部に適用し、１ｘＰＢＳ溶液で平衡させ、そ
れで洗浄した。
【０１００】 誘導体化された抗体を、１ｘＰＢＳを用いて溶離し、複数の１５ｍＬ分画を、
ＵＶモニターの助けを借りて収集した。２８０ｎｍで吸収する帯の中間の分画を
プールし、Ａ280 値を用いてＩＴ−Ｔ４抗体濃度を確定した。典型的には、ＩＴ
−Ｔ４またはＩＴ−Ｔ８濃度は５〜６ｍｇ／ｍＬであった。 次にＩＴ−Ｔ４またはＩＴ−Ｔ８をスルホ誘導化粒子と複合した。実験室スケ
ールの複合化では、全容量１０００ｍＬで、粒子の濃度は６．６７％ｗ／ｖ固体
であり、ＩＴ−Ｔ４濃度は０．７ｍｇ／ｍＬであるかまたはＩＴ−Ｔ８濃度が０
．８ｍｇ／ｍＬであった。一標本では、精製ＩＴ−Ｔ４溶液濃度が６．２３６ｍ
ｇ／ｍＬである場合には、１ｘＰＢＳ中の１１２ｍＬのＩＴ−Ｔ４抗体溶液およ
び２８８ｍＬの１ｘＰＢＳ溶液を、４００ｍＬの上清の除去により予備濃縮して
おいた１０００ｍＬの４％ｗ／ｖ固体スルホ−ＳＭＣＣ活性化粒子に加えた。
【０１０１】 別の標本では、精製ＩＴ−Ｔ８抗体溶液濃度は５．８４６ｍｇ／ｍＬであり、
したがって１ｘＰＢＳ中の１３７ｍＬのＩＴ−Ｔ８抗体溶液および２６３ｍＬの
１ｘＰＢＳ溶液を、４００ｍＬの上清の除去により予備濃縮しておいた１０００
ｍＬの４％ｗ／ｖ固体スルホ−ＳＭＣＣ活性化粒子に加えた。ＩＴ−抗体溶液を
２５ｍＬ増分中の粒子に、攪拌および付加の間に超音波処理しながら、加えた。
その結果生じた混合物を次に、２Ｌボトル中で約２時間ロール混合した。 ブロック前に、複合化混合物の１ｍＬ標本をピペット分取し、０．２μ低タン
パク質結合フィルターを通して濾過し、２８０ｎｍで上清の吸光度を測定して、
抗体の表面濃度０．４４ｍｇ／ｍＬ Ｔ４および０．５３ｍｇ／ｍＬ Ｔ８、な
らびに表面密度４．２ｍｇ Ｔ４抗体／ｍ2 および５．１ｍｇ Ｔ８抗体／ｍ2 を得た。
【０１０２】 スルホ−ＳＭＣＣ活性化粒子上の未反応マレイミジル基を、抗体複合化後にＬ
−システインでブロックした。典型的には、１ｘＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−
システイン １２０ｍＬを前工程の複合化混合物に加え、その結果生じた懸濁液
を約１５分間ロール混合した。未反応スルフヒドリル基を、１ｘＰＢＳ中の２０
ｍｇ／ｍＬヨードアセトアミド １３４ｍＬの添加と、その後の１Ｍ、ｐＨ９．
８ホウ酸ナトリウム緩衝液２５ｍＬの添加によりブロックした。その結果生じた
懸濁液を約３０分間ロール混合し、ブロック複合化混合物を遠心分離により分離
して、粒子を、１ｘＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（Pentex分画Ｖ、プロテ
アーゼ無含有）および０．１％アジ化ナトリウムの溶液（ＢＳＡ緩衝溶液）で２
回洗浄した。洗浄後、粒子をＢＳＡ緩衝溶液中に再懸濁し、全量を１０００ｍＬ
（４％ｗ／ｖ固体）として、約１時間ロール混合し、約４℃で、２４〜７２時間
の範囲の時間保存し、遠心分離で分離して、ＢＳＡ緩衝溶液で３回洗浄した。
【０１０３】 Ｂ．粒子の分析 １ｍＭのＫＯＨ溶液中の粒子単独のフローサイトメトリーは、Ｔ４粒子に関し
ては８７．２％一重項、１１．６％二重項および０．６％多重項を、Ｔ８粒子に
関しては、９４．３％一重項、５．１％二重項および０．１％多重項をを示した
。
【０１０４】 Ｃ．ＤＥＬＳＡ分析 前記のようにジアミノプロパン（ＤＡＰ）被覆化ポリスチレンアルデヒド／ス
ルフェート粒子に複合されたＴ４−およびＴ８抗体も、それらの動電気学的特性
に関して調べた。ｐＨの関数としての移動度のＤＥＬＳＡ測定も、ＤＡＰ−ＰＳ
（１ｘＰＢＳ洗浄）、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＡＰ−ＰＳ（ｗ／ブロックおよび１
ｘＰＢＳ洗浄）、Ｔ４−ＤＡＰ−ＰＳ（１ｘＰＢＳ洗浄）およびＴ８−ＤＡＰ−
ＰＳ（１ｘＰＢＳ洗浄）粒子について実施した。各粒子誘導体上の電荷の予測に
よる特定の被覆化粒子の存在に関する証拠を提供するために、原料粒子、ＤＡＰ
−ＰＳ粒子、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＡＰ−ＰＳ粒子ならびにＴ４−およびＴ８−
ＤＡＰ−ＰＳ粒子の移動度対ｐＨプロフィールを、図２で比較する。図２の結果
は１ｘＰＢＳ洗浄粒子に関するものであり、図３の結果はＢＳＡ緩衝液および１
ｘＰＢＳ洗浄粒子に関するものである。 原料粒子を蒸留水中に懸濁する一方、他の誘導化粒子は全て、動電気学的測定
のために０．０１Ｍ硝酸カリウム溶液で希釈する前に１ｘＰＢＳで洗浄して、そ
の中に懸濁した。
【０１０５】 ＤＡＰ−ＰＳ粒子は、陽性荷電アミノ基の優れた表面被覆面積を示して、原料
粒子の高陰性電荷を補償し、ｐＨ１０〜５．５の範囲で−２．２〜＋４．９ｘ１
０-4ｃｍ2 ／Ｖ−ｓの移動度を、そしておよそｐＨ６．９５でｐ．ｚ．ｃ．を示
した。ＤＡＰ−ＰＳの陽性電荷は、抗体複合化のためにアミノ基を活性化するた
めにスルホ−ＳＭＣＣが用いられた場合には、多少低減され、ｐＨ１０〜４の範
囲で−３．６〜＋２．９ｘ１０-4ｃｍ2 ／Ｖ−ｓの移動度を、そしておよそｐＨ
５．８０でｐ．ｚ．ｃ．を示した。Ｔ４−およびＴ８−抗体複合ＤＡＰ−ＰＳ粒
子は、ＤＡＰ−ＰＳとスルホ−ＳＭＣＣ−ＤＡＰ−ＰＳ粒子の中間の動電気的特
性を有すると考えられ、ｐＨ５．９〜６．２でｐ．ｚ．ｃ．を示した。 最初にＢＳＡで、次に１ｘＰＢＳで洗浄された粒子は、移動度対ｐＨ依存性の
変更を示し（図３）、ｐＨ５．３〜５．６の範囲でｐ．ｚ．ｃ．を有し、４．９
でのＢＳＡのｐＩにより近かった。
【０１０６】 実施例７−リンパ球亜集団の個々の分析 全血の白血球集団中のＣＤ４またはＣＤ８陽性細胞の別個の決定を可能にする
ために、即ち種々のヒストグラムにおけるシフト化標的集団の位置を決定するた
めに、全血を単独で用いて各粒子を試験した。全血中のＴ４およびＴ８細胞集団
の個々の分析および同時分析の両方のために、使用した粒子は、金被覆化ＰＳ粒
子に、または銀被覆化ＰＳ粒子に、そしてジアミノプロパン（ＤＡＰ）被覆化Ｐ
Ｓアルデヒド／スルフェート粒子に複合されたＴ４およびＴ８抗体を含有した。
後者の粒子は、それらがより少ない集合体を形成するためビーズ対照として正確
であるために選択される。実施例７および実施例８の測定は全て、比較および対
照のためにＤＡＰ−ＰＳを用いて実施した。
【０１０７】 Ａ．（Ｔ４またはＴ８）−Ａｍｄｅｘ−銀−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の使用 ＣＤ４およびＣＤ８＋細胞のパーセンテージの別個の分析は、本発明のＴ４ま
たはＴ８複合銀被覆ポリスチレン粒子（実施例３Ｂ）、あるいは金属被覆を含有
しないＴ４またはＴ８複合ポリスチレン粒子を用いて、変法型Cooulter VCS計器
で実施した。血球の容量、導電率および光散乱特徴の測定を可能にするCooulter
VCS技法を、ＳＴＫＳ２Ｂ血液学的分析器で用いて、全血標本中のＣＤ４および
ＣＤ８細胞集団に関して検定した。分析器の毎日の較正は、COULTER LATRON（商
標）プライマーおよびLATRONコントロールで実施した。 ２〜４０μＬの１％ｗ／ｖ固体Ｔ４−Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒
子の力価を２００μＬの全血と約２分間混合した。混合物を変法型ＶＣＳ（商標
）計器で分析した。
【０１０８】 血液標本および種々の混合物に関するＤＣ対ＳＡＬＳ（ＰＭＴ１）マトリック
スを図６Ａ〜６Ｆに示す。より大きい力価の粒子を用いた場合の、標的化Ｔ４陽
性リンパ球のより高いＳＡＬＳ強度への漸増的シフトに留意。標準２０μＬ力価
は、Ｔ４−ＤＡＰ−ＰＳまたはＴ４−Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子
による非シフト化リンパ球からのシフト化を分解するのに十分であると思われた
。 標的化細胞集団に関する粒子対細胞比は、容易に算出され、理論値と比較され
得る。全血２００μＬ当たり、２．４〜６．８ｘ１０5 個のリンパ球からの平均
４５％のＣＤ４＋リンパ球に関しては、１．１〜１．３ｘ１０5 個のＣＤ４＋細
胞が存在する。４％ｗ／ｖ固体での直径２μｍ粒子に関しては、６．８３ｘ１０ 9 粒子／ｍＬが存在し、したがって、２００μＬの全血当たりの１％ｗ／ｖ固体
粒子２０μＬの標準力価は、３．４ｘ１０7 粒子を含有する。その場合、粒子対
細胞比の範囲は１１０〜３１０である。 したがって、図６Ａ〜６Ｆは、加える粒子の数が多いほど、得られるシフトは
大きいことを示す。それは、最小２０μＬの力価が、標的化細胞のシフト化から
非シフト化への良好な分離を得るためには必要である、ということも示す。
【０１０９】 リンパ球周囲の粒子の単分子層コーティングに関する理論的限界を、比較のた
めに概算し得る。直径８〜１２μｍの範囲のリンパ球に関しては、球形であると
仮定される表面積は、４πｒ2 または２０１〜４５２μｍ2 である。したがって
、正方形格子中の単一リンパ球周囲に充填され得る直径２μｍ粒子の最大数は、
５０〜１１３の範囲である。最も密に充填された格子では、粒子当たりの面積は
ｄ2 の代わりに√３ｄ2 ／２であり、したがって最大粒子対細胞比は５８〜１３
０の範囲である。後者の範囲は、Ｔ４−ＤＡＰ−ＰＳ粒子力価実行が１０μＬの
１％ｗ／ｖ固体粒子または５５〜１５５の粒子対細胞比の範囲がほとんど全ての
試験で十分であることを示した場合の実験によりほとんど化学量論的に支持され
たが、一方、５μＬは通常は十分でなかった。
【０１１０】 Ｔ８−ＰＳ粒子対細胞比に関して、同様の結果が得られた。平均２０％ＣＤ８
＋リンパ球に関しては、粒子対細胞比の範囲は、１０μＬ力価の１％−２μｍ直
径粒子に関して１２４〜３４９であり、したがって理論的に算出される値の約２
倍の粒子が必要である。 必要な粒子の力価は、非線状幾何学構造で配列される２個より多い粒子を含有
する粒子集合体の実質的数を補償するためには、全血と混合された銀被覆ＰＳ粒
子に関しては増大しなければならない。さらに、その他の因子、例えば固定化抗
体−細胞表面抗原親和性定数、標的細胞当たりの特異的抗原受容体の数、および
抗体を固定化するための細胞上の抗原受容体の接近し易さは、必要な粒子対細胞
比に影響を及ぼし得る。
【０１１１】 Ｔリンパ球の表面の抗原相手に対するＴ４およびＴ８抗体の親和性は非常に高
く、Ｔ４に関しては１０10〜１０12Ｍ-1そしてＴ８に関しては１０8 〜１０9 Ｍ -1 であって、したがって結合は限定因子ではない［Oonishi 他「J. Immunol. Me
thods 」 115:159（1988）; 米国特許出願第08/624,014号（Siiman等、1996年3
月27日提出）も参照］。さらに、受容体／細胞値はＣＤ４およびＣＤ８抗原に関
しては１０4 〜１０5 であり、これは考え得る免疫感作化抗体相手との優れた接
触を提供するために細胞の表面から十分に突出している［R.F. Vogt, Jr.他「Cy
tometry 」12:525（1991）; A.N. Barclay他「The Leukocyte Facts Book」Acad
emic Press, San Diego, CA,（1993）］。
【０１１２】 Ｔ４−Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳまたはＴ４−ＤＡＰ−ＰＳ粒子の
ためのリンパ球集団シフトの比較は、種々のパラメーター対に関して、ならびに
図７Ａ〜７Ｌおよび図８Ａ〜８Ｌに示したマトリックスにおける６３３ｎｍおよ
び７８０ｎｍの励起波長に関して成された。Ｔ４−ＤＡＰ−ＰＳシフト化リンパ
球からのＴ４−Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳシフト化リンパ球の最良分
離度を有するマトリックスは、ＳＡＬＳ（ＰＭＴ１）対ＬＭＡＬＳまたはＵＭＡ
ＬＳである。したがって、多抗体標識を用いた同時分析に関しては、使用するた
めの最良マトリックスはＳＡＬ（ＰＭＴ１）対ＬＭＡＬＳまたはＵＭＡＬＳであ
る。
【０１１３】 Ｂ．本発明のタンパク質複合粒子の使用 全血の白血球集団中のＣＤ４またはＣＤ８陽性細胞のパーセンテージの別個の
決定は、本発明のＴ４またはＴ８複合金および銀被覆ポリスチレン粒子、あるい
は金属被覆を含有しない（Ｔ４またはＴ８）複合ポリスチレン粒子を用いて、変
法型Cooulter VCS計器で実施した。
【０１１４】 ＣＤ４／ＣＤ８のパーセンテージ決定のために、４０μＬまたは６０μＬの１
％ｗ／ｖ固体粒子懸濁液を、４００μＬのＥＤＴＡ抗凝固化全血と、Coulter670
5473型単一速度ミキサー上の５ｍＬガラス管中で約２分間混合した。手動方式で
は、１５０μＬの全血−粒子混合物を、赤血球の自動酸溶解を実施する分析器中
に吸引して、混合完了直後、消滅させた。混合物を、種々のの光散乱（ＳＡＬＳ
、ＵＭＡＬＳ、ＬＭＡＬＳ）パラメーター、ならびに粒子標識化および非標識化
白血球のＤＣおよびＲＦ導電性に関して分析した。Ｔ４粒子に関する代表的マト
リックスを図９Ａ〜９Ｆ、１０Ａ〜１０Ｆおよび１１Ａ〜１１Ｆに示す。 Ｔ４（Ｔ８）−ＤＡＰ−ＰＳ粒子は、９０°ＬＳ対ＲＦ、ＵＭＡＬＳ、ＤＣま
たはＬＭＡＬＳおよびＵＭＡＬＳ対ＤＣマトリックスにおける標的化細胞集団の
最良の分離を示した。Ｔ４（Ｔ８）−複合金または銀被覆ポリスチレン粒子は９
０°ＬＳ対ＲＦ、ＵＭＡＬＳ、ＤＣまたはＬＭＡＬＳマトリックスにおいてのみ
、良好な分離を示した。
【０１１５】 ９０°ＬＳ対ＵＭＡＬＳマトリックスからのＣＤ４パーセンテージおよびＣＤ
８パーセンテージの定量は、Ｔ４（Ｔ８）−ＤＡＰ−ＰＳ粒子、４０μＬの１％
ｗ／ｖ固体、および４名の正常ドナーからの４００μＬの全血を用いて、３回検
査した。同一粒子および血液ドナーを用いて、COULTER STKS血液学的分析器で、
平行測定を実施した。各々のドナーに関して、適切な蛍光抗体マーカー；マウス
ＩｇＧ１−フィコエリトリン／マウスＩｇＧ１フルオレセインイソチオシアネー
ト（「ＭｓＩｇＧ１−ＰＥ／ＭｓＩｇＧ１−ＦＩＴＣ」）；または二蛍光マーカ
ーＴ３−ＦＩＴＣ／Ｔ４−ＰＥおよびＴ３−ＦＩＴＣ／Ｔ８−ＰＥ（全てCoulte
r Corporation から）を用いてリンパ球中のＣＤ４／ＣＤ８陽性細胞のパーセン
テージに関する比較結果を得るために、フローサイトメトリーも用いた。表Ｉは
、Ｔ４（Ｔ８）−ＤＡＰ−ＰＳを用いた４名のドナーに関する全血中のＣＤ４／
ＣＤ８陽性細胞のパーセンテージとして要約した結果を示す。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】 各血液ドナーに関する代表的９０°ＬＳ対ＵＭＡＬＳマトリックスを、Ｔ４−
ＤＡＰ−ＰＳ粒子−全血混合物に関して、図１２Ａ〜１２Ｄに示す。ドナー５３
９６０は、シフト化および非シフト化白血球集団間のマトリックスの底左手隅の
ゲートを境界とするより多くの細胞の存在を示す。非常に少数の粒子を有するＣ
Ｄ４陽性単球が、この領域で時々同定された。このドナーに関しては、ゲートを
より高い９０°ＬＳおよびより高いＵＭＡＬＳにわずかに動かすと、白血球中に
平均１２．２５％のＣＤ４細胞が、あるいはリンパ球中に４０．７１％のＣＤ４
細胞が示されたが、フローサイトメトリーで比較した場合に示された差は２．２
９％だけであった。
【０１１８】 さらに、粒子懸濁液の最適量を確定するために、１０〜８０μＬの範囲の力価
の１％ｗ／ｖ固体、Ｔ４（Ｔ８）−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−Ｐ
Ｓ粒子を、３名のドナーに関して４００μＬの全血を混合し、白血球集団中のＣ
Ｄ４（ＣＤ８）細胞パーセンテージに関して９０°ＬＳ対ＵＭＡＬＳマトリック
スで分析した。結果を表ＩＩに作表したが、これは３名のドナーに関する全血中
のＣＤ４／ＣＤ８陽性細胞のパーセンテージの粒子力価依存性を示す。力価マト
リックスは、Ｔ４−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子に関して
、図１３Ａ〜１３Ｅにおける代表的ドナー４９０７０に関して示している。
【０１１９】
【表２】
【０１２０】 ＣＤ４またはＣＤ８のパーセンテージは一般に、全血４００μＬ当たり１％ｗ
／ｖ固体粒子４０μＬの力価で一定値に達した。これは、同一サイズの１％ｗ／
ｖ固体Ｔ４（Ｔ８）−ＤＡＰ−ＰＳ粒子に関して以前に決定された最小力価の約
２倍であり、そのためには、２００μＬの全血当たり２０μＬが標準力価として
選択された。したがって、４００μＬの全血当たり１％ｗ／ｖ固体Ｔ４（Ｔ８）
−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子６０μＬがその後、標準力
価として選択された。各ドナーに関しては、COULTER STKS血液学的分析器で白血
球集団中のリンパ球のパーセンテージを得て、その後、それぞれ抗体−アミノト
リチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳおよび抗体−ＤＡＰ−ＰＳ粒子を用いて得
られた白血球中のＣＤ４のパーセンテージ／ＣＤ８のパーセンテージを、Ｌでの
パーセンテージに変換して、蛍光マーカーを用いたフローサイトメトリーデータ
およびＰＳ粒子を用いたＳＴＫＳデータと比較した。
【０１２１】 ドナー５０１８４および５３６０８は、白血球中のリンパ球パーセンテージが
低く、これは正常範囲の２０〜５５％の範囲外である。これらのドナーは、変法
ＶＣＳで測定されたＣＤ４／ＣＤ８のパーセンテージ対全血と混合されたＴ４／
Ｔ８粒子に関してＳＴＫＳ血液学的分析器で得られた、あるいは適切な蛍光マー
カーを用いてフローサイトメトリーにより得られた比較結果において最大偏差を
示した。
【０１２２】 この適用における最も有用なマトリックスは、（ｉ）ＳＡＬＳ対ＬＭＡＬＳま
たはＵＭＡＬＳ、（ｉｉ）ＵＭＡＬＳ対ＤＣ、（ｉｉｉ）ＳＡＬＳ対ＤＣ、およ
び（ｉｖ）ＳＡＬＳ対ＲＦであった。したがって、本発明の抗体複合ポリスチレ
ン粒子は、ポリスチレン粒子の表面に沈着した銀（λｅｘｃ＝４００〜５２０ｎ
ｍ）または金（λｅｘｃ＞５２０ｎｍ）またはその両方のコロイド（λｅｘｃ＝
５２０〜８００ｎｍ）のプラズモン共鳴を励起するための４５０〜８００ｎｍの
励起レーザー波長の賢明な選択、ならびにＳＡＬＳ対ＵＭＡＬＳ、ＤＣまたはＲ
ＦおよびＵＭＡＬＳ対ＤＣマトリックスの選択により、抗体複合銀または金ポリ
スチレン粒子から決定し得る。 波長依存性は、白血球の２つまたは３つのサブセット集団に関して同時に分析
するために、免疫感作銀または金コロイドを、ならびに相互排除的白血球サブセ
ットを標的にする異なる抗体を用いる場合と用いない場合の、二色または三色抗
体複合粒子を用いる方法を提供する。
【０１２３】 抗体被覆粒子により特異的に標的化される白血球を取り囲む直径２μｍの球形
ポリスチレン粒子の表面に包埋された直径５０〜２００ｎｍの金粒子の総光散乱
は、関与する３つの主な散乱：（１）細胞散乱、（２）ポリスチレン粒子散乱、
および（３）金粒子散乱の重ね合わせであるべきである。２μｍポリスチレン粒
子は一般に白血球より小さいため、細胞表面へのそれらの付着は、粒子−細胞複
合体の形状およびサイズに及ぼす粒子対細胞比および細胞周囲の粒子の幾何学的
配列の影響により元の細胞の光散乱を攪乱する。金粒子は、ポリスチレン粒子ま
たは白血球よりはるかに小さく、したがって、粒子−細胞複合体の形状およびサ
イズに及ぼすそれらの作用は無視できるほどである。しかしながら、可視−近赤
外領域でのそれらの特別な波長依存性吸光スペクトルのために、金粒子は、ポリ
スチレン粒子−細胞複合体には存在しなかった付加的散乱および吸光を示す。 さらに、粒子が互いに密接して隣同士が最も近くなる細胞の表面の金−ポリス
チレン粒子の濃度は、分離された金−ポリスチレン粒子の吸光特徴を攪乱し得る
。さらに、金粒子の吸光の吸光部分は、実質的効力を有し、いくつかの角散乱範
囲では、ポリスチレン粒子−細胞複合体からの散乱に対して散乱強度の損失を生
じる。
【０１２４】 リンパ球サブセットに結合される抗体−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅ
ｘ−ＰＳ粒子に関する付加的側方散乱シフトは、同一細胞に結合されるＰＳ粒子
に関するシフトに対して小さかった。しかしながら、ＳＡＬＳ対ＵＭＡＬＳマト
リックス中の標的化リンパ球の位置の変化は、抗体−アミノトリチオール−Ａｕ
−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子で被覆された細胞に関するＵＭＡＬＳにおける実質的低
減のために、抗体−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳおよびＰＳシ
フト化リンパ球集団間の明確な分離を可能にした。リンパ球に結合される抗体−
Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子は、前方散乱およびＵＭＡＬＳがＰＳ
粒子で標識されたリンパ球の散乱に対して低減されるという点で、抗体−アミノ
トリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子それ自体と同じ作用を有する。しか
しながら、抗体−Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子で標識された標的化
リンパ球の側方散乱は、抗体−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒
子で標識されたリンパ球の側方散乱の約２倍増強された。
【０１２５】 実施例８−リンパ球亜集団の同時分析 全血の白血球集団中のＣＤ４またはＣＤ８＋陽性細胞のパーセンテージの同時
測定は、本発明のＴ４またはＴ８複合ポリスチレン、ならびにＴ８またはＴ４−
複合金−または銀被覆ポリスチレン粒子を用いて、変法型Cooulter VCS計器で実
施した。 使用される粒子は、実施例７に記載した理由のために、金被覆ＰＳ粒子、また
は銀被覆ＰＳ粒子、ならびにジアミノプロパン（ＤＡＰ）被覆ＰＳアルデヒド／
スルフェート粒子に複合されたＴ４およびＴ８抗体を含有した。
【０１２６】 要するに、複合体を全血と混合し、その後、赤血球の酸溶解および消滅後に、
白血球を分析した。特に、４０μＬの１％ｗ／ｖ固体Ｔ４（Ｔ８）複合ポリスチ
レン粒子および４０〜６０μＬのＴ８（Ｔ４）複合金−または銀被覆ポリスチレ
ン粒子を４００μＬの全血と約２分間混合した。次に、実施例７と同様にして、
混合物を処理し、分析した。
【０１２７】 代表的マトリックスを図１４Ａ〜１４Ｆに示す。 ９０°ＬＳ対ＵＭＡＬＳマ
トリックスは、Ｔ４（Ｔ８）複合ポリスチレン粒子で標識された細胞の、Ｔ８（
Ｔ４）複合金または銀被覆ポリスチレン粒子で標識された細胞からの最良の分離
を示した。Ｔ４（Ｔ８）複合ポリスチレン粒子で標識された細胞だけが、ＵＭＡ
ＬＳ対ＤＣマトリックスにおいて決定され、Ｔ４（Ｔ８）−複合金または銀被覆
粒子で標識された細胞は、９０°ＬＳ対ＲＦ、ＤＣマトリックスにおいて時々決
定された。 白血球中のＣＤ４のパーセンテージ／ＣＤ８のパーセンテージは、３名のドナ
ーに関して６０μＬのＴ４（Ｔ８）−ＰＳ／６０μＬのＴ８（Ｔ４）−Ａｕ−Ｐ
Ｓ粒子と４００μＬの全血との混合物に関する９０°ＬＳ対ＵＭＡＬＳマトリッ
クスの分析を３回実施して得られた。表３は、３名のドナーに関する全血中のＣ
Ｄ４／ＣＤ８陽性細胞のパーセンテージを示す。
【０１２８】
【表３】
【０１２９】 いくつかの実施に関しては、マトリックスの底部左手隅のゲートのより高い９
０°ＬＳおよびより高いＵＭＡＬＳへの調整は、変法型ＶＣＳ計器で得られるＣ
Ｄ４／ＣＤ８のパーセンテージとフローサイトメトリーにより得られる結果との
間の一致を改良し得る。例えば、ドナー４９０７０に関する調整後、Ｔ４−Ａｍ
ｄｅｘ−ＰＳ／Ｔ８−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子による
ＣＤ４のパーセンテージはＬ＝４５．６、ならびにＴ８−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ／Ｔ
４−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子によるＣＤ８のパーセン
テージはＬ＝２５．６。
【０１３０】 ドナー５３６０８に関しては、Ｔ４−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ／Ｔ８−アミノトリチ
オール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子によるＣＤ４のパーセンテージはＬ＝３５
．５、Ｔ８−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ／Ｔ４−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ
−ＰＳ粒子によるＣＤ４のパーセンテージはＬ＝４９．７、ならびにＴ８−Ａｍ
ｄｅｘ−ＰＳ／Ｔ４−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子による
ＣＤ８のパーセンテージはＬ＝３０．６。
【０１３１】 単一ドナーに関して表ＩＶに要約した同様の結果は、４０μＬのＴ４（Ｔ８）
−Ａｍｄｅｘ−ＰＳおよび６０μＬのＴ８（Ｔ４）−Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄ
ｅｘ−ＰＳ粒子を４００μＬの全血と混合し、６３３ｎｍＨｅ／Ｎｅレーザーラ
インで励起させて得られたが、但し流動比較測定器データに対する定量は、種々
のマトリックスにおける非標的化細胞領域を広くする多数のＴ４（Ｔ８）−Ａｍ
ｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子集合体の存在のために良好とならなかった
。表ＩＶは、４つの異なる粒子を用いた全血中のＣＤ４／ＣＤ８陽性細胞のパー
センテージを示す。
【０１３２】
【表４】
【０１３３】 いくつかのゲーティング戦略を用いて、白血球集団中の標的化細胞のパーセン
テージを算出した。そのうちの１つを、Ｔ４−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ／Ｔ８−アミノ
トリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子混合物に関して、１５Ａ〜１５Ｆに
示す。白血球中のリンパ球のパーセンテージは、COULTER STKS血液学的分析器で
測定した場合、このドナーに関しては１８．８であった。 本明細書中に引用した出版物は全て、本出願に関係がある当業者のレベルを表
しており、それらの記載内容は参照により本明細書中に含まれる。 特に好ましい実施態様を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の精神
を逸脱しない限り、修正することができると理解される。このような修正は、添
付の特許請求の範囲内であるよう意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 アミノデキストラン（Ａｍｄｅｘ）、金コロイド、アミノトリチオレートリン
カーおよび抗ＣＤ４（Ｔ４）抗体または抗ＣＤ８（Ｔ８）抗体により被覆されな
い場合または被覆された場合のアルデヒド／スルフェートポリスチレンラテック
スビーズ（ＰＳ）の懸濁液に関する電気泳動移動度対ｐＨデータをプロットした
グラフである。
【図２】 １．３−ジアミノプロパン（ＤＡＰ）、スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マ
レイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）
およびＴ４またはＴ８抗体により被覆されない場合または被覆された場合に、全
て１ｘリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）のみで洗浄された場合の、アルデヒド／スルフ
ェートＰＳの懸濁液に関する電気泳動移動度対ｐＨデータをプロットしたグラフ
である。
【図３】 スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＡＰおよびＴ４またはＴ８抗体により被覆されない場合
または被覆された場合に、全てウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）緩衝液および
１ｘＰＢＳで洗浄された場合の、アルデヒド／スルフェートＰＳの懸濁液に関す
る電気泳動移動度対ｐＨデータをプロットしたグラフである。
【図４Ａ】 アミノトリチオールリンカーを介して金包埋、アミノデキストラン被覆ＰＳ粒
子（Ｔ４−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ）に連接される本発明
の粒子の、倍率２万倍（ｘ２０，０００）の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真であ
る。
【図４Ｂ】 図４Ａの粒子の倍率がｘ４０，０００のＳＥＭ写真である。
【図４Ｃ】 図４Ａの粒子の倍率がｘ１０，０００のＳＥＭ写真である。
【図５Ａ】 図４Ａと同様の粒子のＳＥＭ写真であるが、但し、金属コロイドが銀（Ｔ４−
Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ）であり、倍率がｘ１８．５００である。
【図５Ｂ】 倍率がｘ１０，０００の図５Ａの粒子のＳＥＭ写真である。
【図５Ｃ】 倍率がｘ５０，０００の図５Ａの粒子のＳＥＭ写真である。
【図５Ｄ】 倍率がｘ１００，０００の図５Ａの粒子のＳＥＭ写真である。
【図６Ａ〜６Ｆ】 ６３３ｎｍ励起により得られた、粒子の力価の増大（それぞれ２、５、１０、
２０および４０μＬ）を伴う標的化Ｔ４＋リンパ球の漸増シフト化ＳＡＬＳを実
証する、全血、ならびに全血とＴ４−Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子
との種々の混合物に関する電子検知パラメーター（ＤＣ）対側方角光散乱（ＳＡ
ＬＳ）のマトリックスを示す。
【図７Ａ〜７Ｌ】 ６３３ｎｍ励起により得られた、各マトリックスにおける標的化Ｔ４＋リンパ
球のシフト化位置を示す、全血とＴ４−Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ（
７Ａ〜７Ｆ）または従来のＴ４−ＤＡＰ−ＰＳ（７Ｇ〜７Ｌ）粒子の混合物に関
するパラメーター対（それぞれＤＣ対ＬＭＡＬＳ；ＤＣ対ＵＭＡＬＳ；ＬＭＡＬ
Ｓ対ＰＭＴ１；ＵＭＡＬＳ対ＳＡＬＳ；ＤＣ対ＳＡＬＳ、ＲＦ対ＳＡＬＳ）のマ
トリックスを示す。
【図８Ａ〜８Ｌ】 ７８０ｎｍ励起により得られた、各マトリックスにおける標的化Ｔ４＋リンパ
球のシフト化位置を示す、全血とＴ４−Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳま
たはＴ４−ＤＡＰ−ＰＳ粒子の混合物に関する図７Ａ〜７Ｌと同一のパラメータ
ー対のマトリックスを示す。
【図９Ａ〜９Ｆ】 ６３３ｎｍ励起により得られた、Ｔ４＋リンパ球のシフト化位置を示す、全血
とＴ４−ＤＡＰ−ＰＳとの混合物に関する図面に示したような種々のパラメータ
ー対のマトリックスを示す。
【図１０Ａ〜１０Ｆ】 ６３３ｎｍ励起により得られた、Ｔ４＋リンパ球のシフト化位置を示す、全血
とＴ４−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子との混合物に関する
種々のパラメーター対のマトリックスを示す。
【図１１Ａ〜１１Ｆ】 ６３３ｎｍ励起により得られた、Ｔ４＋リンパ球のシフト化位置を示す、全血
とＴ４−Ａｍｄｅｘ−Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子との混合物に関する種々のパ
ラメーター対のマトリックスを示す。
【図１２Ａ〜１２Ｄ】 ６３３ｎｍ励起により得られた、Ｔ４＋リンパ球のシフト化位置Ｒ１を示す、
全血とＴ４−ＤＡＰ−ＰＳ粒子の４つの標本の混合物に関する９０°ＬＳ対ＵＭ
ＡＬＳマトリックスを示す。
【図１３Ａ〜１３Ｅ】 ６３３ｎｍ励起により得られた、Ｔ４＋リンパ球のシフト化位置Ｒ１を示す、
全血とＴ４−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子の５つの漸増力
価との混合物に関する９０°ＬＳ対ＵＭＡＬＳマトリックスを示す。
【図１４Ａ〜１４Ｆ】 ６３３ｎｍ励起により得られた、ＬＨＳでのＴ８＋（Ｒ１）およびＴ４＋（Ｒ
２）リンパ球、ならびにＲＨＳでのＴ４＋（Ｒ１）およびＴ８＋（Ｒ２）リンパ
球のシフト化位置を示す、全血と左手側Ｔ８−ＤＡＰ−ＰＳおよびＴ４−アミノ
トリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子懸濁液；ならびに右手側Ｔ４−ＤＡ
Ｐ−ＰＳおよびＴ８−アミノトリチオール−Ａｕ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子懸濁液
の３つの標本の混合物に関する９０°ＬＳ対ＵＭＡＬＳマトリックスを示す。
【図１５Ａ〜１５Ｆ】 ６３３ｎｍ励起により得られた、Ｔ４＋（Ｒ１）およびＴ８＋（Ｒ２）リンパ
球のシフト化位置を示す、全血とＴ４−ＤＡＰ−ＰＳおよびＴ８−Ａｍｄｅｘ−
Ａｇ−Ａｍｄｅｘ−ＰＳ粒子懸濁液との混合物に関する種々のパラメーター対の
マトリックスを示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年４月１０日（２０００．４．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロドリゲス，カルロス エム. アメリカ合衆国，フロリダ 33165，マイ アミ，サウス ウエスト 33 ストリート 10010 (72)発明者 バーシュティン，アレキサンダー アメリカ合衆国，フロリダ 33016，ハイ アリー，ウエスト 26 コート 6192 (72)発明者 メイプルス，ジョン エー. アメリカ合衆国，フロリダ 33138，マイ アミ ショアーズ，ノース イースト 91 テラス 958 (72)発明者 ホワイトセル，ジェイムス ケラー アメリカ合衆国，テキサス 78731，オー スティン，バルバーン サークル 5203 Ｆターム(参考） 2G045 AA03 BA14 BB01 BB10 BB14 BB46 BB48 BB51 CA01 CA11 CA18 CA19 CA21 CA25 FA14 FA16 FA29 FB03 FB05 FB12 FB15 GC15

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の： （ａ）その上にアミン反応性官能基を有するコロイドサイズ化コア支持体、 （ｂ）前記支持体の周囲表面上のアミノデキストランコーティング、 （ｃ）前記アミノデキストランコーティングに上塗りするコロイドサイズ化金
    属固体の層であって、前記金属固体のための金属を前記コアのアミノデキストラ
    ンコーティングによりイオン状態から金属（０）状態に還元できる金属から成る
    群から選択する層、 （ｄ）前記金属固体に結合されるリンカーであって、遊離アミノ基を有するリ
    ンカー、ならびに （ｅ）前記遊離アミノ基との共有結合により前記リンカーに結合されるタンパ
    ク質を包含する安定コロイド粒子。
  2. 【請求項２】 前記コア支持体（ａ）がポリスチレンである請求項１に記載
    の粒子。
  3. 【請求項３】 前記コア支持体（ａ）が直径約０．２〜約５．０μのサイズ
    範囲である請求項２に記載の粒子。
  4. 【請求項４】 前記アミノデキストランコーティング（ｂ）が前記アミノデ
    キストランの遊離アミノ基と前記支持体の前記アミン反応性官能基との間の共有
    結合により前記コア支持体（ａ）に共有結合される請求項１に記載の粒子。
  5. 【請求項５】 前記アミノデキストランコーティング（ｂ）が、前記アミノ
    デキストラン中のジアミン置換の程度が１／２．５の最大理論値と比較して１／
    ４０〜１／３５の範囲であるアミノデキストランからなる群から選択される請求
    項４に記載の粒子。
  6. 【請求項６】 前記アミノデキストランコーティング（ｂ）中の前記ジアミ
    ン置換が約１／７〜１／８である請求項５に記載の粒子。
  7. 【請求項７】 前記金属固体（ｃ）が＋０．７ボルト以上の還元電位を有す
    る金属イオンまたは金属イオン錯体を形成する金属からなる群から選択される請
    求項１に記載の粒子。
  8. 【請求項８】 前記金属固体が金である請求項７に記載の粒子。
  9. 【請求項９】 前記金属固体が銀である請求項７に記載の粒子。
  10. 【請求項１０】 前記金属固体（ｃ）および前記アミノデキストランコーテ
    ィング（ｂ）が前記ポリスチレンコア支持体の前記表面上に分散される請求項１
    に記載の粒子。
  11. 【請求項１１】 前記リンカー（ｄ）がアミノデキストランリンカーである
    請求項１に記載の粒子。
  12. 【請求項１２】 前記アミノデキストランリンカー（ｄ）が前記アミノデキ
    ストラン中のジアミン置換の程度が１／２．５の最大理論値と比較して１／４０
    〜１／３５の範囲であるアミノデキストランからなる群から選択される請求項１
    １に記載の粒子。
  13. 【請求項１３】 前記アミノデキストランリンカー中の前記ジアミン置換が
    約１／７〜１／８である請求項１２に記載の粒子。
  14. 【請求項１４】 アミノデキストランリンカーが５Ｘ−アミノデキストラン
    である請求項１１に記載の粒子。
  15. 【請求項１５】 前記アミノデキストラン（ｄ）がグルタルアルデヒドを用
    いてアミノ基を架橋することにより前記コロイド金属−アミノデキストラン被覆
    支持体に共有結合される請求項１１に記載の粒子。
  16. 【請求項１６】 前記リンカー（ｄ）がアミノトリチオレートリンカーであ
    る請求項１に記載の粒子。
  17. 【請求項１７】 前記リンカーがトリス（３−メルカプトプロピル）−Ｎ−
    グリシルアミノメタンである請求項１６に記載の粒子。
  18. 【請求項１８】 前記アミノトリチオレートリンカー（ｄ）が共有金属硫黄
    結合により前記コロイド金属−アミノデキストラン被覆支持体に共有結合される
    請求項１６に記載の粒子。
  19. 【請求項１９】 前記コロイド金属が金である請求項１８に記載の粒子。
  20. 【請求項２０】 前記タンパク質（ｅ）が抗体である請求項１に記載の粒子
    。
  21. 【請求項２１】 前記抗体が抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体からなる群か
    ら選択される請求項２０に記載の粒子。
  22. 【請求項２２】 前記タンパク質（ｅ）が、スルホ−ＳＭＣＣ中のマレイミ
    ドで活性化されるリンカー上の遊離アミノ基と２−イミノチオラン活性化タンパ
    ク質上のスルフヒドリル基との共有結合により前記リンカー−コロイド金属−ア
    ミノデキストラン被覆支持体に共有結合される請求項１に記載の粒子。
  23. 【請求項２３】 以下の： （ａ）コロイドサイズ化ポリスチレン微粒子、 （ｂ）前記ポリスチレン粒子の周囲表面上の１Ｘ−アミノデキストランコーテ
    ィング、 （ｃ）前記アミノデキストランコーティングに上塗りするコロイドサイズ化金
    の層、 （ｄ）遊離アミノ基を有するアミノトリチオレートリンカー、そして （ｅ）前記遊離アミノ基との共有結合により前記リンカーに結合される抗ＣＤ
    ４抗体を包含する請求項１に記載の粒子。
  24. 【請求項２４】 以下の： （ａ）コロイドサイズ化ポリスチレン粒子、 （ｂ）前記ポリスチレン粒子の周囲表面上の１Ｘ−アミノデキストランコーテ
    ィング、 （ｃ）前記アミノデキストランコーティングに上塗りするコロイドサイズ化銀
    の層、 （ｄ）遊離アミノ基を有する５Ｘ−アミノデキストランリンカー、そして （ｅ）前記遊離アミノ基との共有結合により前記リンカーに結合される抗ＣＤ
    ４抗体を包含する請求項１に記載の粒子。
  25. 【請求項２５】 以下の： （ａ）コロイドサイズ化ポリスチレン粒子、 （ｂ）前記ポリスチレン粒子の周囲表面上の１Ｘ−アミノデキストランコーテ
    ィング、 （ｃ）前記アミノデキストランコーティングに上塗りするコロイドサイズ化金
    の層、 （ｄ）遊離アミノ基を有するアミノトリチオレートリンカー、そして （ｅ）前記遊離アミノ基との共有結合により前記リンカーに結合される抗ＣＤ
    ８抗体を包含する請求項１に記載の粒子。
  26. 【請求項２６】 以下の： （ａ）コロイドサイズ化ポリスチレン粒子、 （ｂ）前記ポリスチレン粒子の周囲表面上の１Ｘ−アミノデキストランコーテ
    ィング、 （ｃ）前記アミノデキストランコーティングに上塗りするコロイドサイズ化銀
    の層、 （ｄ）遊離アミノ基を有する５Ｘ−アミノデキストランリンカー、そして （ｅ）前記遊離アミノ基との共有結合により前記リンカーに結合される抗ＣＤ
    ８抗体を包含する請求項１に記載の粒子。
  27. 【請求項２７】 赤血球と白血球の両方を含有する生物学的溶液／懸濁液中
    の白血球の２以上の亜集団の同時定量的測定方法であって、以下の： （ａ）前記生物学的溶液／懸濁液を請求項１の少なくとも２つの異なる安定コ
    ロイド粒子であって、その各々が前記白血球の亜集団上の異なるエピトープと結
    合する異なる前記タンパク質を含有する粒子と混合し、前記混合が各前記亜集団
    の細胞に前記粒子を結合させるのに十分な時間の間生じ、 （ｂ）前記生物学的溶液／懸濁液中の前記赤血球を溶解して、前記混合物（ａ
    ）中の前記細胞を消滅させ、 （ｃ）各前記異なるコロイド粒子により結合される白血球の亜集団間を識別す
    る計器中で工程（ｂ）の前記混合物を分析し、それにより前記白血球の少なくと
    も２つの相互排除的亜集団を同時的に定量的に列挙する 工程を包含する方法。
  28. 【請求項２８】 前記生物学的流体が全血である請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 亜集団がＴリンパ球、Ｂリンパ球、顆粒球および単球から
    成る群から選択される請求項２７に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記リンパ球がＣＤ４+ リンパ球およびＣＤ８+ リンパ球
    である請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 各前記タンパク質が抗体である請求項２７に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記計器が光散乱、導電率および容量により細胞間を識別
    する請求項２７に記載の方法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006513175A (ja) * 2002-11-28 2006-04-20 ザ・ユニバーシティ・オブ・リバプール ナノ粒子複合体及びその製造方法
WO2006104035A1 (ja) * 2005-03-29 2006-10-05 National Institute For Materials Science 生体分子固定化用の三脚型機能性界面分子とこれを用いた遺伝子検出デバイス
JP2006308572A (ja) * 2005-03-31 2006-11-09 Hitachi Maxell Ltd 貴金属コート磁性粒子を用いた被検物質の検出方法
WO2010007857A1 (ja) * 2008-07-14 2010-01-21 アルフレッサファーマ株式会社 反応性物質が結合した微小粒子の安定化方法および該微小粒子含有試薬
JP2011242387A (ja) * 2010-04-21 2011-12-01 Osaka Prefecture Univ 生物学的物質の捕獲又は分離用複合微粒子

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6344272B1 (en) * 1997-03-12 2002-02-05 Wm. Marsh Rice University Metal nanoshells
JP3620946B2 (ja) * 1997-03-17 2005-02-16 シスメックス株式会社 スキャッタグラムの表示方法および粒子計測装置
US6699724B1 (en) 1998-03-11 2004-03-02 Wm. Marsh Rice University Metal nanoshells for biosensing applications
US6428811B1 (en) 1998-03-11 2002-08-06 Wm. Marsh Rice University Temperature-sensitive polymer/nanoshell composites for photothermally modulated drug delivery
DE10027776A1 (de) 2000-06-07 2002-02-14 Roche Diagnostics Gmbh Neuartige core-shell Partikel
WO2002039083A2 (en) * 2000-11-08 2002-05-16 Science & Technology Corporation @ Unm Fluorescence and fret based assays for biomolecules on beads
JP3605039B2 (ja) * 2001-01-09 2004-12-22 株式会社日立製作所 核酸マイクロアレイ、その製造方法及びそれを用いた核酸検出方法
US6696243B2 (en) 2001-01-23 2004-02-24 Coulter International Corp. Method for the analysis of soluble analytes
AU2002317418A1 (en) * 2001-07-11 2003-01-29 National Health Laboratory Service Cell enumeration
JP2004538005A (ja) 2001-08-08 2004-12-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア シアル酸に結合するタンパク質を有するウイルスベクターの精製法
US9201067B2 (en) * 2003-03-05 2015-12-01 Posco Size-controlled macromolecule
DE10154016B4 (de) * 2001-10-26 2004-02-12 Berlin Heart Ag Magnetflüssigkeit und Verfahren zur ihrer Herstellung
US8030459B2 (en) * 2002-07-19 2011-10-04 The General Hospital Corporation Oxime conjugates and methods for their formation and use
US20040191778A1 (en) * 2003-03-28 2004-09-30 Seiji Inaoka Colloidal silver-biomolecule complexes
US7083936B2 (en) * 2003-08-01 2006-08-01 Beckman Coulter, Inc. Aminodextran compositions and conjugates and method of making and using them
US20050069958A1 (en) * 2003-09-26 2005-03-31 Mills Rhonda A. Method for simultaneous evaluation of a sample containing a cellular target and a soluble analyte
JP4849432B2 (ja) * 2004-03-30 2012-01-11 ブラザー工業株式会社 圧電膜の製造方法、基板と圧電膜との積層構造、圧電アクチュエータおよびその製造方法
US7351591B2 (en) * 2004-03-30 2008-04-01 Intel Corporation Surface modification of metals for biomolecule detection using surface enhanced Raman scattering (SERS)
US7771660B2 (en) 2004-05-04 2010-08-10 University Of North Carolina At Chapel Hill Electrophoretic interactive spectral methods and devices for the detection and/or characterization of biological particles
US8288302B2 (en) 2004-06-23 2012-10-16 Industry University Cooperation Foundation Sogang University Method of preparing substrates—molecular sieve layers complex using ultrasound and apparatuses used therein
US20060024744A1 (en) * 2004-07-28 2006-02-02 Mills Rhonda A Methods for substantially simultaneous evaluation of a sample containing a cellular target and a soluble analyte
JP5784868B2 (ja) * 2004-11-19 2015-09-24 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ 分子撮像用の超音波造影剤及び粒子の使用
US20070048795A1 (en) * 2005-08-26 2007-03-01 Xiangming Fang Immunoaffinity separation and analysis compositions and methods
WO2009131568A1 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Cythera, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US20090298178A1 (en) * 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
AU2009313870B2 (en) 2008-11-14 2013-07-11 Viacyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
KR20140049959A (ko) * 2010-10-13 2014-04-28 파마다이아그노스틱스 엔브이 나노 입자의 코팅 방법
WO2012112832A1 (en) 2011-02-17 2012-08-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for altering tissue specificity and improving aav9-mediated gene transfer
US11740232B2 (en) * 2016-03-30 2023-08-29 Macroarray Diagnostics Gmbh Antigen array
CN105758835B (zh) * 2016-05-04 2018-03-27 成都爱兴生物科技有限公司 一种均相免疫分析poct检测方法及使用该检测方法的系统
CN106501505A (zh) * 2016-10-03 2017-03-15 王贤俊 一种胶乳定向偶联技术检测脂蛋白（a）的方法
CN106501536A (zh) * 2016-10-03 2017-03-15 王贤俊 一种胶乳定向偶联技术检测脂蛋白（a）的试剂盒
CN108132351B (zh) * 2017-12-22 2020-05-15 扬州大学 一种拉曼增强蛋白质检测的纳米探针器件及其制备方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2632478A1 (de) * 1975-07-23 1977-02-24 Coulter Electronics Verfahren zur erfassung und trennung von antigenen und antikoerperchen im blut und in anderen proben
US5223398A (en) * 1987-03-13 1993-06-29 Coulter Corporation Method for screening cells or formed bodies for enumeration of populations expressing selected characteristics
US5231005A (en) * 1987-03-13 1993-07-27 Coulter Corporation Method and apparatus for screening cells or formed bodies with populations expressing selected characteristics
KR970007077B1 (ko) * 1987-03-13 1997-05-02 코울터 일렉트로닉스 인커퍼레이티드 광산란 기술을 이용한 다중-부분식별 분석 방법
US5466609A (en) * 1990-10-31 1995-11-14 Coulter Corporation Biodegradable gelatin-aminodextran particle coatings of and processes for making same
US5639620A (en) * 1990-10-31 1997-06-17 Coulter Corporation Polymeric particles having a biodegradable gelatin or aminodextran coating and process for making same
WO1992009682A1 (en) * 1990-11-23 1992-06-11 Coulter Corporation Method and apparatus for screening microscopic cells utilizing light scatter techniques
US5248772A (en) * 1992-01-29 1993-09-28 Coulter Corporation Formation of colloidal metal dispersions using aminodextrans as reductants and protective agents
ATE236397T1 (de) * 1993-05-14 2003-04-15 Coulter Int Corp Retikulozyt bestimmungsverfahren und geraet, das lichtstreuungstechniken verwendet
EP0702793B1 (en) * 1993-06-11 2003-08-27 Coulter International Corporation Anti-cd3 antibody-aminodextran conjugates for induction of t-cell activation and proliferation

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006513175A (ja) * 2002-11-28 2006-04-20 ザ・ユニバーシティ・オブ・リバプール ナノ粒子複合体及びその製造方法
WO2006104035A1 (ja) * 2005-03-29 2006-10-05 National Institute For Materials Science 生体分子固定化用の三脚型機能性界面分子とこれを用いた遺伝子検出デバイス
JP2006275670A (ja) * 2005-03-29 2006-10-12 National Institute For Materials Science 生体分子固定化用の三脚型機能性界面分子とこれを用いた遺伝子検出デバイス
JP4706074B2 (ja) * 2005-03-29 2011-06-22 独立行政法人物質・材料研究機構 生体分子固定化用の三脚型機能性界面分子とこれを用いた遺伝子検出デバイス
JP2006308572A (ja) * 2005-03-31 2006-11-09 Hitachi Maxell Ltd 貴金属コート磁性粒子を用いた被検物質の検出方法
WO2010007857A1 (ja) * 2008-07-14 2010-01-21 アルフレッサファーマ株式会社 反応性物質が結合した微小粒子の安定化方法および該微小粒子含有試薬
JP2011242387A (ja) * 2010-04-21 2011-12-01 Osaka Prefecture Univ 生物学的物質の捕獲又は分離用複合微粒子

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