JP3980030B2 - Dnaマイクロアレイを用いた核酸検出方法及び核酸検出装置 - Google Patents
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Description
また、現在開発されているDNAマイクロアレイは、試料中の遺伝子の有無を検出するものである。これに対して、試料中の遺伝子を定量できるDNAマイクロアレイは僅かである。
そこで、本発明は、上述したような実状を鑑み、試料中に含まれる核酸を高精度に定量できるDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法及び核酸検出装置、並びにDNAマイクロアレイを提供することを目的とする。
(1)所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるDNAマイクロアレイに、核酸を含む試料を作用させる工程と、
上記複数の核酸プローブ部それぞれについて核酸プローブと所定の核酸とのハイブリダイズに基づく出力をモニターし、上記複数の核酸プローブ部それぞれについて当該出力が所定の値を超えた時間の度数分布をとる工程と、
上記工程で得られた度数分布から求められる平均値に基づいて、試料中に含まれる上記所定の核酸を定量する工程
を含むことを特徴とするDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
(2)上記DNAマイクロアレイは、ゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して核酸プローブを固定化してなり、上記複数の核酸プローブ部に対応した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを備え、当該絶縁ゲート電界効果トランジスタからの出力をモニターすることを特徴とする請求の範囲1記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
(3)上記核酸を含む試料を作用させる工程の際には、上記DNAマイクロアレイ上で当該核酸を鋳型とした核酸増幅を行うことを特徴とする請求の範囲1記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
(4)上記核酸増幅は恒温増幅法により行うことを特徴とする請求の範囲3記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
(5)所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるDNAマイクロアレイを取り付ける測定部と、
上記測定部に取り付けたDNAマイクロアレイの各核酸プローブ部からの出力を検出する検出部と、
上記複数の核酸プローブ部について、上記検出部で検出した出力が所定の値を超えた時間の度数分布をとり、当該度数分布から求められる平均値に基づいて、試料中に含まれる上記所定の核酸を定量する演算部と
を備えることを特徴とする核酸検出装置。
(6)上記DNAマイクロアレイは、ゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して核酸プローブを固定化してなり、上記複数の核酸プローブ部に対応した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを備え、
上記検出部は、当該絶縁ゲート電界効果トランジスタからの出力をモニターすることを特徴とする請求の範囲5記載の核酸検出装置。
(7)上記DNAマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記所定の核酸と上記核酸プローブとのハイブリダイズ時間がそれぞれの区画で異なることを特徴とする特許請求の範囲5記載の核酸検出装置。
(8)所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるDNAマイクロアレイ
(9)上記複数の核酸プローブ部に対応して配設され、所定の核酸と核酸プローブとのハイブリダイズを検出する検出部を有することを特徴とする特許請求の範囲8記載のDNAマイクロアレイ。
(10)上記検出部は、絶縁ゲート電界効果トランジスタであることを特徴とする特許請求の範囲9記載のDNAマイクロアレイ。
(11)上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記所定の核酸と上記核酸プローブとのハイブリダイズ時間が異なることを特徴とする特許請求の範囲8記載のDNAマイクロアレイ。
(12)上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブ部における核酸プローブの密度が異なることを特徴とする特許請求の範囲8記載のDNAマイクロアレイ。
(13)上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブ部の面積が異なることを特徴とする特許請求の範囲8記載のDNAマイクロアレイ。
(14)上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記複数の区画では、上記核酸プローブの長さが異なることを特徴とする特許請求の範囲8記載のDNAマイクロアレイ。
図2は、DNAマイクロアレイの要部断面図である。
図3は、本発明を適用した核酸検出装置を模式的に示す構成図である。
図4は、フローセルの要部断面図である。
図5は、フローセルを分解して示す要部断面図である。
図6は、複数の核酸プローブ部からの出力を示す特性図である。
図7は、複数の核酸プローブ部からの出力に基づいて、信号処理回路での処理を行った結果を示す特性図である。
図8は、参照用電界効果トランジスタを用いて、複数の核酸プローブ部からの出力を測定する場合の回路構成図である。
図9は、本発明を適用したDNAマイクロアレイの他の例を模式的に示す斜視図である。
図10は、DNAマイクロアレイ上で行う核酸増幅の各工程を模式的に示すDNAマイクロアレイの要部断面図である。
図11は、核酸プローブから一重鎖核酸が伸長した状態を模式的に示すDNAマイクロアレイの要部断面図である。
図12は、核酸プローブから伸長した一重鎖核酸がとる高次構造を模式的に示すDNAマイクロアレイの要部断面図である。
図13は、2種類のプローブを用いてDNAマイクロアレイ上で検出する際の各工程を模式的に示すDNAマイクロアレイの要部断面図である。
図14は、インターカレータを作用させた状態を示すDNAマイクロアレイの要部断面図である。
図1は、本方法に用いられるDNAマイクロアレイ1の概略斜視図であり、図2は、当該DNAマイクロアレイ1の要部断面図である。DNAマイクロアレイ1は、図1に示すように、マトリックス上に配された複数の核酸プローブ部2と、これら複数の核酸プローブ部2に対応して配された絶縁ゲート電界効果トランジスタ3とを備えている。本例のDNAマイクロアレイ1においては、複数の核酸プローブ部2が二分されており(それぞれ第1の領域3a及び第2の領域3bとする)、第1の領域3aでターゲット遺伝子における一方の多型(以下、「第1の多型」という場合もある)を検出し、第2の領域3bでターゲット遺伝子における他方の多型(以下、「第2の多型」という場合もある)を検出する。
核酸プローブ部2は、絶縁ゲート電界効果トランジスタ4のゲート絶縁物5の表面に核酸プローブ6を固定化した構造である。絶縁ゲート電界効果トランジスタ4は、例えば、p形シリコン基板7上に配置したキャリアの供給源となるソース8及びキャリアを取り出すドレイン9と、これらp形シリコン基板7、ソース8及びドレイン9上に配置したゲート絶縁物5とを備えている。
核酸プローブ6は、検出対象のターゲット遺伝子とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド又はcDNA又は途中で枝分かれしたDNAの断片からなる。核酸プローブ6は、通常300個以下の塩基から構成されており、適切な反応条件の下で検出対象のターゲット遺伝子とハイブリダイズでき、オリゴヌクレオチドの場合は80個以下の塩基長の核酸断片であることが望ましい。
本例のDNAマイクロアレイ1においては、第1の領域3aにおける核酸プローブ6は、第1の多型であるターゲット遺伝子とハイブリダイズし、第2の多型であるターゲット遺伝子とはハイブリダイズしないような配列を有している。一方、第2の領域3bにおける核酸プローブ6は、第2の多型であるターゲット遺伝子とハイブリダイズし、第1の多型であるターゲット遺伝子とはハイブリダイズしないような配列を有している。
ゲート絶縁物5は、酸化シリコン(SiO2)、窒化シリコン(SiN)、酸化アルミニウム(Al2O3)、酸化タンタル(Ta2O5)などの材料を単独又は組み合わせて用い、通常はトランジスタ動作を良好に保つため、酸化シリコン(SiO2)の上に窒化シリコン(SiN)、酸化アルミニウム(Al2O3)、酸化タンタル(Ta2O5)を積層する二層構造とすることが好ましい。
核酸プローブ6をゲート絶縁物5表面に固定化するためには、核酸プローブ6の一端をアミノ基(NH2基)、チオール基(SH基)、ビオチンなどで化学修飾してもよい。アミノ基で化学修飾した核酸プローブ6を用いる場合は、ゲート絶縁物5の表面をアミノプロピルエトキシシラン、ポリリジンなどで化学修飾して絶縁膜表面にアミノ基を導入し、グルタルアルデヒドやフェニレンジイソシアネート(PDC)と反応させてアミノ基で化学修飾した核酸プローブ6をゲート絶縁物5表面に固定化する。チオール基で化学修飾した核酸プローブ6をゲート絶縁物5表面に固定化する場合は、ゲート絶縁物5上に金薄膜を形成し、チオール基と金との親和性を利用して核酸プローブ6を固定化する。また、ビオチンで化学修飾した核酸プローブ6を固定化する場合には、ゲート絶縁物5表面にストレプトアビジンを導入し、ビオチンとストレプトアビジンの親和性を利用して、核酸プローブ6をゲート絶縁物5表面に固定化する。実際の固定化に際しては、核酸プローブ6を含む溶液を、ゲート絶縁物5表面における所定の領域のみに滴下又はスポットし、ゲート絶縁物5における所望の領域上にのみ核酸プローブ6を固定化する。
一方、ゲート絶縁物5表面に固定化担体を形成し、核酸プローブ6を該固定化担体の表面又は内部に間接的に固定化してもよい。固定化担体の材料としては、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート(pHEMA)などを用いることができ、固定化担体をアミノ基やストレプトアビジンなどで化学修飾し、上記したように、それぞれグルタルアルデヒドやPDC、又はアビジンとの親和性を利用して核酸プローブを固定化担体に固定化することができる。このように固定化担体を介して間接的に絶縁ゲート電界効果トランジスタ4のゲート絶縁物5上に核酸プローブ6を固定することもできる。
以上のように構成されたDNAマイクロアレイ1では、検査対象の試料を作用させることによって、当該試料中に含まれるターゲット遺伝子と核酸プローブ6とが適切な反応条件のもとでハイブリダイズする。すなわち、試料中に含まれるターゲット遺伝子の多型に応じて、第1の領域3a及び第2の領域3bのいずれか一方の核酸プローブ6とターゲット遺伝子とで複合体を形成するか、第1の領域3a及び第2の領域3bの両方において核酸プローブ6とターゲット遺伝子とで複合体を形成する。
検査対象の試料を作用させる際に用いるバッファ溶液のpHの適切な条件下では、核酸は負に帯電している。したがって、核酸プローブ6とターゲット遺伝子と複合体形成により、絶縁ゲート電界効果トランジスタ4のゲート絶縁物5近傍で電荷密度が変化し、ゲート絶縁物5の表面電位が変化する。この変化が一般的な絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート電圧変化と同等の作用となり、チャネルの導電率を変化させる。したがって、ソース8及びドレイン9の間を流れるドレイン電流変化として、個々の核酸プローブ部2における複合体の形成を検出することができる。
個々の核酸プローブ部2における複合体の形成を検出する際には、例えば、図3に示すような検出装置10を用いることができる。検出装置10は、DNAマイクロアレイ1を載置するフローセル12と、フローセル12に各種溶液を供給するための流路13と、流路13の起端部に接続されたハイブリダイゼーション液14及び洗浄液15と、ハイブリダイゼーション液14及び洗浄液15とフローセル12との間における流路13上に配設され、流路13に供給するハイブリダイゼーション液14及び洗浄液15の切り替えを行うバルブ16と、フローセル12に対する溶液の供給を制御するポンプ17と、試料及びインターカレータ等をバルブ16を介して流路13に供給するための分注器18と、流路13の終端部に接続された廃液ボトル19と、フローセル12に載置したDNAマイクロアレイ1からの出力を処理/演算する信号処理回路20とを備えている。
フローセル12は、図4に示すように、内部流路21が形成されている筐体22と、信号線となるワイヤー24を介してDNAマイクロアレイ1と電気的に接続されたプリント基板25と、プリント基板25と信号処理回路20とを電気的に接続するピン26と、内部流路21からワイヤー23を隔離する保護キャップ27と、内部流路21と流路13とを連結するためのボルト28とを備えている。なお、フローセル12の分解断面図を図5に示す。
筐体22における内部流路21は、例えば直径1mmの穴として筐体22内部に穿設されてなり、筐体22の略中央部においてDNAマイクロアレイ1と接している。なお、内部流路21は、DNAマイクロアレイ1における少なくとも第1の領域3a及び第2の領域3bと接している。また、内部流路21は、内部に流路13を配設したボルト28を筐体22のボルト取付部29に取り付けることにより流路13と接続されている。筐体22のボルト取付部29は、ボルト28を取り付けるために、ボルト28に応じてねじ切りが形成されている。
流路13における内部流路21と接する端面には、平坦化処理が施されている。流路13における内部流路21と接する端面が平坦化されることによって、ボルト28を取り付けた状態で流路13と内部流路21とを密着させることができ、液漏れを防止できる。
プリント基板25は、複数の核酸プローブ部2に対応した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタ3それぞれの出力を、ワイヤー24を介して検出することができる。
保護キャップ26は、例えば、アクリル、ポリプロピレン又はポリカーボネイト等からなり、筐体22とプリント基板25との間に配設される。保護キャップ26は、筐体22とプリント基板25との間に配設されることによって、内部流路21内へのワイヤー24の露出を防止する。
以上のように構成された検出装置10においては、フローセル12に載置したDNAマイクロアレイを用いて、検査対象の試料中に含まれるターゲット遺伝子の多型を同定することができる。具体的には、先ず、流路13にハイブリダイゼーション液14のみを供給できるようにバルブ16を切り替えるとともに、ポンプ17を駆動する。同時に、分注器18によりバルブ16を介して流路13に対して試料を供給する。これにより、流路13及びフローセル12の内部流路21に、試料を含有するハイブリダイゼーション液14を供給することができ、DNAマイクロアレイ1における第1の領域3a及び第2の領域3bに対して試料を作用させることができる。
これにより、第1の領域3a又は第2の領域3b、若しくは、第1の領域3a及び第2の領域3bにおいて、試料に含まれるターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を有する核酸プローブ6がハイブリダイズ反応する。言い換えると、試料中に含まれるターゲット遺伝子は、第1の領域3a及び第2の領域3bに含まれる核酸プローブ6のうち、相補的な塩基配列を有する核酸プローブ6とのみハイブリダイズする。なお、反応後、流路13及び内部流路21に供給された溶液はポンプ17により廃液ボトル19に送られる。
検出装置10では、核酸プローブ6とターゲット遺伝子とがハイブリダイズ(複合体形成)すると、絶縁ゲート電界効果トランジスタ3においてドレイン電流変化として現れる。検出装置10では、絶縁ゲート電界効果トランジスタ3におけるドレイン電流変化をプリント基板にて検出し、信号処理回路20に対して信号を出力することができる。特に、検出装置10では、複数の核酸プローブ部2を備えるため、複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタ3それぞれからの複数の信号を信号処理回路20に対して出力する。
このとき、複数の核酸プローブ部2では、核酸プローブ6とターゲット遺伝子とのハイブリダイズに時間差が生じる。したがって、複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタ4からの信号出力にも時間差が生じることとなる。例えば、3つの絶縁ゲート電界効果トランジスタ4からの信号は、図6に示すように、それぞれ時間差をもって出力されることとなる。
信号処理回路20では、このように時間差をもった複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタ4からの複数の信号について、スレッシュホールド値を超えた時間を測定し、時間を横軸とし、スレッシュホールド値を超える出力が測定された核酸プローブ部2の個数を縦軸として度数分布をとる。そして、信号処理回路20では、得られた度数分布における平均値を、複数の核酸プローブ部2における出力時間とする。
測定時間を横軸とし、スレッシュホールド値を超える出力が測定された核酸プローブ部2の個数を縦軸として度数分布をとると、例えば、図7に示すように、正規分布をとることとなる。この場合、信号処理回路20は、度数分布の平均値(この場合は正規分布の最大値)として、T3を出力時間とする。したがって、信号処理回路20によれば、第1の領域3aに含まれる複数の核酸プローブ部2から得られる出力時間と、第2の領域3bに含まれる複数の核酸プローブ部2から得られる出力時間とを得ることができる。
そして、検出装置10では、第1の領域3a及び第2の領域3bからのそれぞれの出力時間に基づいて、ターゲット遺伝子における多型を判別することができる。すなわち、ターゲット遺伝子が第1の多型のみを有するホモ型である場合、第1の領域3aのみから出力時間を得ることができ、逆に、ターゲット遺伝子が第2の多型のみを有するホモ型である場合、第2の領域3bのみから出力時間を得ることができる。また、ターゲット遺伝子が第1の多型と第2の多型とを有するヘテロ型の場合、第1の領域3a及び第2の領域3b両方から出力時間を得ることができる。このように、検出装置10によれば、第1の領域3a及び第2の領域3bの出力時間からターゲット遺伝子の多型を判別することができる。
検出装置10によれば、単一の核酸プローブ部により多型を判別する場合と比較して、測定誤差を小さくすることができ、より正確な判別を行うことができる。
ところで、検出装置10では、上述したように、信号処理回路20にて出力時間を得ることによりターゲット遺伝子の多型を判別できるだけでなく、以下のようにしてターゲット遺伝子の多型を判別してもよい。すなわち、信号処理回路20は、所定時間経過後において信号を出力した絶縁ゲート電界効果トランジスタ4の割合を、第1の領域3a及び第2の領域3bについてそれぞれ算出し、比較する。その結果、第1の領域3aにおける割合が第2の領域3bにおける割合と比較して大である場合、ターゲット遺伝子は第1の多型のみを有するホモ型であると判別でき、逆に、第2の領域3bにおける割合が第1の領域3aにおける割合と比較して大である場合、ターゲット遺伝子は第2の多型のみを有するホモ型であると判別できる。また、第1の領域3aにおける割合と第2の領域3bにおける割合とが同等の場合、ターゲット遺伝子は第1の多型及び第2の多型を有するヘテロ型であると判別できる。
なお、例えば、第1の多型の存在を迅速に検出したい場合には、第1の領域3aに含まれる核酸プローブ部2のうちで、少なくとも1以上の核酸プローブ部2からの出力を得た時点で検出第1の多型の存在を判定しても良い。このように判定することによって、試料中に第1の多型が含まれるか否かを迅速に判定することができる。
一方、検出装置10は、図8に示すように、参照電極30及び参照用電界効果トランジスタ31と、絶縁ゲート電界効果トランジスタ4からの出力及び参照用電界効果トランジスタ31の出力の差動をとる差動測定回路32とを備えるものであっても良い。この場合、参照用電界効果トランジスタ31のゲート絶縁物表面には、ターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を含まない核酸33を固定化している。これにより、参照用電界効果トランジスタ31のゲート絶縁物表面に固定化された核酸は、ターゲット遺伝子とハイブリダイズしない。
参照電極30は、例えば、所定組成・濃度の内部溶液に銀/塩化銀電極又はかんこう電極を浸漬してなり、内部流路21に供給される溶液に摂食する位置に配設される。参照電極30は、例えば、フローセル21内部に配設することができる。
このように構成された検出装置10では、絶縁ゲート電界効果トランジスタ4におけるドレイン電流変化を表面電位として駆動回路34で検知し、参照用電界効果トランジスタ31におけるドレイン電流変化を表面電位として駆動回路35で検知する。差動測定回路32は、駆動回路34及び駆動回路35それぞれにおける表面電位の差動をとり、差分を絶縁ゲート電界効果トランジスタ4からの信号として信号処理回路20に出力する。
このような差動測定を行って絶縁ゲート電界効果トランジスタ4からの信号を出力することによって、各絶縁ゲート電界効果トランジスタ4の電気的特性の違いや、周囲の温度や光の変化による出力値の変化を補償することができ、また、試料中の荷電粒子がゲート絶縁物5上に非特異的に吸着することによる出力値の変化を相殺することができる。これにより、検出装置10では、ターゲット遺伝子と核酸プローブ6のハイブリダイゼーションによる出力変化のみを精度良く検出することができる。
また、参照用電界効果トランジスタ31は、絶縁ゲート電界効果トランジスタ4と同じ基板に集積することが好ましい。参照用電界効果トランジスタ31を絶縁ゲート電界効果トランジスタ4と同じ基板に集積することによって、絶縁ゲート電界効果トランジスタ4と参照用電界効果トランジスタ31とにおける電気的特性を揃えることができる。
さらに、検出装置10では、絶縁ゲート電界効果トランジスタ4と同数の参照用電界効果トランジスタ31を必要とせず、複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタ4からの出力を得るに際して、1つの参照用電界効果トランジスタ31を共通に使用することができるため、少なくとも1以上の参照用電界効果トランジスタ31を有していればよい。
さらに、参照用電極30は、電位測定の基準として使用することによって、参照用電界効果トランジスタ31と絶縁ゲート電界効果トランジスタ4との表面電位を安定に測定することができる。
ところで、上述した検出装置10では、試料中のターゲット遺伝子を定量することもできる。試料中のターゲット遺伝子を定量する場合には、予め濃度既知のターゲット遺伝子を含む複数のサンプルを用いて同様に測定し、これら複数のサンプルについて出力時間を求めておく。そして、測定対象の試料における出力時間と、複数のサンプルについての出力時間とを比較することによって、測定対象の試料に含まれるターゲット遺伝子を定量することができる。
この場合、特に、複数の核酸プローブ部2を用いて出力時間を測定することから、例えば、ターゲット遺伝子の非特異的なハイブリダイズに起因するノイズ成分による定量誤差を補正することができる。したがって、測定装置10によれば、測定対象の試料中に含まれるターゲット遺伝子を高精度に定量することができる。
また、検出装置10は、図9に示すように、第1の領域3a及び第2の領域3bからなる第1の区画と、第3の領域3c及び第4の領域3dからなる第2の区画と、第5の領域3e及び第6の領域3fからなる第3の区画と、第7の領域3g及び第8の領域3hからなる第4の区画とを備えるDNAマイクロアレイ1を用いても良い。これら第1の領域3a乃至第8の領域3hは、それぞれ複数の核酸プローブ部2を有している。第1の領域3a、第3の領域3c、第5の領域3e及び第7の領域3gは、ターゲット遺伝子における第1の多型とハイブリダイズする核酸プローブ6を固定化してなる。また、第2の領域3b、第4の領域3d、第6の領域3f及び第8の領域3hは、ターゲット遺伝子における第2の多型とハイブリダイズする核酸プローブ6を固定化してなる。
また、第1の区画、第2の区画、第3の区画及び第4の区画においては、ターゲット遺伝子を含む核酸と核酸プローブ6とがハイブリダイズするまでの時間が、互いに異なるよう調節されている。具体的には、第1の区画における核酸プローブ6の固定化密度、第2の区画における核酸プローブ6の固定化密度、第3の区画における核酸プローブ6の固定化密度を及び第4の区画における核酸プローブ6の固定化密度をそれぞれ異なる密度とすることによって、各区画でハイブリダイズする時間が異なることとなる。また、第1の区画における核酸プローブ部2の面積、第2の区画における核酸プローブ部2の面積、第3の区画における核酸プローブ部2の面積及び第4の区画における核酸プローブ部2の面積を異なる面積とすることによって、各区画でハイブリダイズする時間が異なることとなる。さらに、第1の区画における核酸プローブ6の長さ(塩基長)、第2の区画における核酸プローブ6の長さ(塩基長)、第3の区画における核酸プローブ6の長さ(塩基長)及び第4の区画における核酸プローブ6の長さ(塩基長)を異なる長さ(塩基長)とすることによって、各区画でハイブリダイズする時間が異なることとなる。
図9に示したDNAマイクロアレイ1を用いた場合、第1の区画乃至第4の区画のそれぞれについて、信号処理回路20から出力時間を測定する。第1の区画乃至第4の区画においてハイブリダイズする時間が異なるため、測定した出力時間として最適な区画を選択することができる。言い換えれば、ターゲット遺伝子を含む核酸と核酸プローブ6とのハイブリダイズまでの時間が短すぎても長すぎても、定量に際しての誤差が大きくなる。したがって、最適な区画を選択し、選択した区画に含まれる核酸プローブ部2からの信号を用いて出力時間を測定することによって、高精度に定量を行うことができる。
なお、図9に示したDNAマイクロアレイ1を用いた場合でも、第1の多型の存在を迅速に検出したい場合には、第1の領域3a、第3の領域3c、第5の領域3e及び第7の領域3gのいずれかの領域に含まれる核酸プローブ部2のうちで、少なくとも1以上の核酸プローブ部2からの出力を得た時点で検出第1の多型の存在を判定しても良い。図9に示したDNAマイクロアレイ1を用いた場合には、試料中に第1の多型が含まれるか否かをより迅速に判定することができる。
実施例2では、DNAマイクロアレイ1として、検出対象のターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を少なくとも3’末端に有する核酸プローブ6の5’末端をゲート絶縁物2表面に固定化たものを使用する。
本例では、試料として組織断片や白血球から抽出したヒト染色体を含む溶液を使用することができる。特に、本例においては、固定化された核酸プローブ6をプライマーとし当該試料に含まれるヒト染色体を鋳型として、複数の核酸プローブ部2上で核酸増幅をそれぞれ行い、対応する複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタ4によって当該核酸増幅をモニターする。
具体的には、先ず、流路13に核酸増幅に必要な試薬を供給できるようにバルブ16を切り替えるとともに、ポンプ17を駆動する。同時に、分注器18によりバルブ16を介して流路13に対してヒト染色体を含む溶液を供給する。これにより、流路13及びフローセル12の内部流路21に、ヒト染色体を含む溶液及び核酸増幅に必要な試薬を供給することができる。
次に、核酸増幅をDNAマイクロアレイ1上で行う。具体的に図10(a)〜(d)に示すように、ヒト染色体を含む溶液に、ターゲット遺伝子を含むDNA断片38が含まれる場合に、核酸プローブ6をプライマーとした核酸増幅が行われる。すなわち、先ず図10(a)に示すように、ゲート絶縁物2を所定温度に制御することによって、核酸プローブ6とDNA断片38におけるターゲット遺伝子の一部とがハイブリダイズ(アニーリング)する。次に、図10(b)に示すように、ゲート絶縁物2を所定温度に制御すると、核酸増幅に必要な試薬に含まれる酵素(DNAポリメラーゼ等)によって、DNA断片38を鋳型として核酸プローブ6の3’末端から伸長反応が行われる。伸長反応の後にゲート絶縁物2を所定温度に制御すると熱変性してDNA断片38を乖離させることができる。そして、再び、ゲート絶縁物2を所定温度に制御することによって、図10(c)に示すように、異なる核酸プローブ6とDNA断片38におけるターゲット遺伝子の一部とがハイブリダイズ(アニーリング)する。次に、図10(d)に示すように、再びゲート絶縁物2を所定温度に制御すると、核酸増幅に必要な試薬に含まれる酵素(DNAポリメラーゼ等)によって、DNA断片38を鋳型として核酸プローブ6の3’末端から伸長反応が行われる。
このように、ゲート絶縁物2の温度制御によって、DNA断片38を鋳型として核酸プローブ6の3’末端からの伸長反応が順次行われる。測定対象の試料にターゲット遺伝子を含むDNA断片38が含まれる場合、核酸プローブ部2において伸長反応が進む結果、当該核酸プローブ部2に対応する絶縁ゲート電界効果トランジスタ4のゲート絶縁物5近傍で電荷密度が変化し、ゲート絶縁物5の表面電位が変化する。この変化が一般的な絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート電圧変化と同等の作用となり、チャネルの導電率を変化させる。したがって、検査装置10によれば、ソース8及びドレイン9の間を流れるドレイン電流変化として、個々の核酸プローブ部2における伸長反応の進行を検出することができる。
本例においても、単一の核酸プローブ部によりターゲット遺伝子を検出する場合と比較して、複数の核酸プローブ部2を用いているために誤差を小さくすることができ、試料中のターゲット遺伝子の量が少ない場合であっても正確に検出することができる。
ところで、上述した検出装置10では、試料中のターゲット遺伝子を定量することもできる。試料中のターゲット遺伝子を定量する場合には、予め濃度既知のターゲット遺伝子を含む複数のサンプルを用いて同様に測定し、これら複数のサンプルについて出力時間を求めておく。そして、測定対象の試料における出力時間と、複数のサンプルについての出力時間とを比較することによって、測定対象の試料に含まれるターゲット遺伝子を定量することができる。
この場合、特に、複数の核酸プローブ部2を用いて出力時間を測定することから、例えば、ターゲット遺伝子の非特異的なハイブリダイズに起因するノイズ成分による定量誤差を補正することができる。したがって、測定装置10によれば、測定対象の試料中に含まれるターゲット遺伝子を高精度に定量することができる。
具体例について以下に示す。
先ず第1の具体例としては、B型肝炎DNA(Hepatatis B Virus)の存在の有無を1種類のプローブで調べるために、5’末端をアミノ化修飾した以下の核酸プローブ6を絶縁ゲート電界効果トランジスタ4のゲート絶縁物5に固定化した。
HBVプローブ(i):5’−gcg gat ccg tgg agt tac tct cgt ttt tgc−3’
参照用電界効果トランジスタ31のゲート絶縁物にはHBVプローブ(i)と異なる配列を有する核酸33、例えばすべてAから構成される30塩基長の核酸33を固定化する。なお、この核酸33は、参照用電界効果トランジスタ31のゲート絶縁物に固定化せず、5’末端をアミノ基で修飾したものであってもよい。
試料は、キット(Qiagen Viral DNA Kit)を用いて、血清中からB型肝炎DNAを抽出したものを使用した。B型肝炎DNA、1×PCR Buffer(Mg2+plus)(TaKaRa社製),0.4μMのdNTP、5UのTaq Polymerase(TaKaRa)を含む試料溶液100μlを分注器18よりフローセル12に導入し、以下の(1)〜(3)の工程でゲート絶縁物5を加熱・冷却する。
(1)熱変性:94℃×3分
(2)熱変性:94℃×30秒、アニーリング:55℃×30秒及び伸長反応:72℃×30秒を1サイクルとして40サイクル
(3)伸長反応:72℃×10分
上記(1)〜(3)工程の終了後、ゲート絶縁物5の温度を上げるか、またはアルカリ性溶液を分注器18よりフローセル12に導入して二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させた。その後、洗浄液を分注器18よりフローセル12に導入して、基板に固定化されていない核酸、未反応の核酸及び各種成分をDNAマイクロアレイ1から除去した。次に、緩衝液を分注器18よりフローセル12に導入して、絶縁ゲート電界効果トランジスタ4の出力値を信号処理回路20により測定した。
第1の具体例では、信号処理回路20における出力値は、核酸増幅によりHBVプローブ(i)の3’末端から一重鎖核酸が伸張した結果の出力値であり、参照用電界効果トランジスタ31のゲート絶縁物に固定した核酸33と比較して塩基数が多いことにより検出が可能である。図11に、核酸プローブ6から一重鎖核酸が伸長した状態と、参照用電界効果トランジスタ31のゲート絶縁物に固定した核酸33とを模式的に示す。
第1の具体例では、B型肝炎DNAを含む試料を用いた場合、絶縁ゲート電界効果トランジスタ4と参照用電界効果トランジスタ31とにおける表面電位の差動出力は2.8mVであった。一方、B型肝炎DNAを含まない試料を用いた場合には、同様に測定した差動出力は0.4mVであった。この結果から、B型肝炎DNAを含む試料とB型肝炎DNAを含まない試料とで有意な差が得られた。
次に、第2の具体例としては、B型肝炎DNA(Hepatatis B Virus)の存在の有無を高感度に検出するため、試料中のターゲット遺伝子の存在により進行する増幅反応によって、高次構造をとるような核酸プローブ6を絶縁ゲート電界効果トランジスタ4のゲート絶縁物5に固定化した。第2の具体例で使用した核酸プローブ6は、B型肝炎DNAに相補的な塩基配列を有し、5’末端をアミノ化修飾した以下の核酸プローブ6を用いた。
HBVプローブ(ii):5’−cat agc agc agg atg aag agg aat atg ata gga tgt gtc tgc ggc gtt t−3’
なお、本例においても、参照用電界効果トランジスタ31のゲート絶縁物にはHBVプローブ(ii)と異なる配列を有する核酸33、例えばすべてAから構成される30塩基長の核酸33を固定化する。
第2の具体例においても、第1の具体例と同じ試薬及び反応条件で、上述した(1)〜(3)工程を行う。その後、同様に、基板に固定化されていない核酸、未反応の核酸及び各種成分をDNAマイクロアレイ1から除去するとともに信号処理回路20により出力値を測定した。
第2の具体例において、出力値は、核酸増幅によりHBVプローブ(ii)の3’末端から一重鎖核酸が伸張するとともに高次構造を形成した結果の出力値であり、参照用電界効果トランジスタ31のゲート絶縁物に固定した核酸33と比較して塩基数が多く、かつ高次構造が異なることにより検出が可能である。図12に、核酸プローブ6から一重鎖核酸が伸長した状態と、参照用電界効果トランジスタ31のゲート絶縁物に固定した核酸33とを模式的に示す。第2の具体例では、図12に示すように、試料中にB型肝炎DNAが含まれる場合、伸長反応が進行する結果、核酸プローブ6の3’末端が高次構造、この場合ステム構造及びループ構造を取ることとなる。このステム構造は、伸長反応によって合成された一本鎖核酸とHBVプローブ(ii)の5’末端から30塩基までとが相補的であるために形成される。また、ループ構造は、HBVプローブ(ii)の3’末端側から19塩基で形成される。
第2の具体例において、B型肝炎DNAを含む試料を用いた場合、絶縁ゲート電界効果トランジスタ4と参照用電界効果トランジスタ31とにおける表面電位の差動出力は4.8mVであった。一方、B型肝炎DNAを含まない試料を用いた場合には、同様に測定した差動出力は0.5mVであった。この結果から、B型肝炎DNAを含む試料とB型肝炎DNAを含まない試料とで有意な差が得られた。さらに、第1の具体例と比較して、第2の具体例では、核酸プローブ6が伸長反応の結果として高次構造と形成するため、より高感度に出力値が得られた。
次に、第3の具体例としては、B型肝炎DNA(Hepatatis B Virus)の存在の有無を2種類のプローブで検出するため、5’末端をアミノ化修飾した以下の核酸プローブ6を絶縁ゲート電界効果トランジスタ4のゲート絶縁物5に固定化した。
HBVプローブ(i):5’−gcg gat ccg tgg agt tac tct cgt ttt tgc−3’
HBVプローブ(iii):5’−gca agc ttt cta aca aca gta gtt tcc gg−3’
なお、本例においても、参照用電界効果トランジスタ31のゲート絶縁物にはHBVプローブ(ii)と異なる配列を有する核酸33、例えばすべてAから構成される30塩基長の核酸33を固定化する。
第3の具体例においても、第1の具体例と同じ試薬及び反応条件で、上述した(1)〜(3)工程を行う。第3の具体例における核酸増幅を図13(a)〜(d)に示す。なお、図13(a)〜(d)では、HBVプローブ(i)を核酸プローブ6aとして表し、HBVプローブ(iii)を核酸プローブ6bとして表す。検査対象の試料にB型肝炎DNAを含む場合には、図13(a)に示すように、ゲート絶縁物2を所定温度に制御することによって、B型肝炎DNAを含むDNA断片38が核酸プローブ6aとハイブリダイズ(アニーリング)する。次に、図13(b)に示すように、ゲート絶縁物2を所定温度に制御すると、核酸増幅に必要な試薬に含まれる酵素(DNAポリメラーゼ等)によって、DNA断片38を鋳型として核酸プローブ6aの3’末端から伸長反応が行われる。次に、図13(c)に示すように、ゲート絶縁物2を所定温度に制御すると熱変性してDNA断片38を乖離させることができ、核酸プローブ6aの3’末端から伸長した領域の一部が核酸プローブ6bとハイブリダイズ(アニーリング)する。次に、図13(d)に示すように、再びゲート絶縁物2を所定温度に制御すると、核酸プローブ6aの3’末端から伸長した領域を鋳型として核酸プローブ6bの3’末端から伸長反応が進行し、最終的に核酸プローブ6aと核酸プローブ6bとの間で核酸二重鎖が形成される。
次に、分注器18によりバルブ16を介して流路13に対して緩衝液を導入し、DNAマイクロアレイ1上の未反応の試料等を除去する。その後、分注器18によりバルブ16を介して流路13に対してエチジウムブロマイドやヘキスト33258(Hoechst 33258)等のインターカレータ39を含む溶液を導入する。これにより、図14に示すように、核酸プローブ6aと核酸プローブ6bとの間で形成された核酸二重鎖に、インターカレータ39が挿入されることとなる。インターカレータ39は二本鎖の核酸とのみ反応して結合し、一本鎖の核酸には結合しない。核酸二重鎖にインターカレータ39を挿入した後、第1の具体例と同様にして信号処理回路20により出力値を測定した。
その結果、B型肝炎DNAを含む試料を用いた場合には、差動出力は5.6mVであった。B型肝炎DNAを含まない試料を用いた場合には、差動出力は0.4mVであった。このように、第3の具体例においても、B型肝炎DNAを含む試料とB型肝炎DNAを含まない試料とで有意な差が得られた。一方、インターカレータ39を使用せず、図13(d)に示した核酸二重鎖の状態で測定した場合には、差動出力は2.2mVであった。この結果から、インターカレータ39は電荷を有しているのでインターカレータ39を含む溶液を作用させることにより、約2倍の高感度化を図ることができた。
次に、第4の具体例としては、B型肝炎DNA(Hepatatis B Virus)の存在の有無を2種類のプローブ及び鎖置換型のDNA合成酵素を用いて検出するため、5’末端をアミノ化修飾した以下の核酸プローブ6を絶縁ゲート電界効果トランジスタ4のゲート絶縁物5に固定化した。
HBVプローブ(ii):5’−cat agc agc agg atg aag agg aat atg ata gga tgt gtc tgc ggc gtt t−3’
HBVプローブ(iv):5’−tcc tct aat tcc agg atc aac aac aac cag agg ttt tgc atg gtc ccg ta−3’
本例では、B型肝炎DNA、0.1mMのdNTP、0.5mMのMgCl2,32UのBst Polymerase(New England Biolab社製)を含む試料溶液100μlを分注器18よりフローセル12に導入し、65℃でゲート絶縁物5をインキュベートすることによって恒温増幅反応を行った。なお、この恒温増幅反応は、図10(a)〜(d)に示した場合と同様に進行する。また、本例においても、第3の具体例と同様にして核酸二重鎖にインターカレータ39を挿入した後に信号処理回路20により出力値を測定した。
その結果、B型肝炎DNAを含む試料を用いた場合には、差動出力は5.8mVであった。一方、B型肝炎DNAを含まない試料を用いた場合には、差動出力は0.3mVであった。このように、第4の具体例においても、B型肝炎DNAを含む試料とB型肝炎DNAを含まない試料とで有意な差が得られた。一方、インターカレータ39を使用しない状態で出力値を測定した場合には、差動出力は2.4mVの大きさであった。この結果から、インターカレータ39を含む溶液を作用させることにより、約2倍の高感度化を図ることができた。
Claims (19)
- 所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるDNAマイクロアレイに、核酸を含む試料を作用させる工程と、
上記複数の核酸プローブ部それぞれについて核酸プローブと所定の核酸とのハイブリダイズに基づく出力をモニターし、当該出力が所定の値を超えた核酸プローブ部の個数について時間毎に分布をとる工程と、
上記工程で得られた分布を正規化して求められる最大値に基づいて、試料中に含まれる上記所定の核酸を定量する工程
を含むことを特徴とするDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。 - 上記DNAマイクロアレイは、ゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して核酸プローブを固定化してなり、上記複数の核酸プローブ部に対応した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを備え、当該絶縁ゲート電界効果トランジスタからの出力をモニターすることを特徴とする請求項1記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
- 上記核酸を含む試料を作用させる工程の際には、上記DNAマイクロアレイ上で当該核酸を鋳型とした核酸増幅を行うことを特徴とする請求項1記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
- 上記核酸増幅は恒温増幅法により行うことを特徴とする請求項3記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
- 所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を備えるDNAマイクロアレイを取り付ける測定部と、
上記測定部に取り付けたDNAマイクロアレイの各核酸プローブ部からの出力を検出する検出部と、
上記複数の核酸プローブ部について、上記検出部で検出した出力が所定の値を超えた核酸プローブ部の個数について時間毎に分布をとり、正規化して求められる最大値に基づいて、試料中に含まれる上記所定の核酸を定量する演算部と
を備えることを特徴とする核酸検出装置。 - 上記DNAマイクロアレイは、ゲート絶縁物表面に直接又は担体を介して核酸プローブを固定化してなり、上記複数の核酸プローブ部に対応した複数の絶縁ゲート電界効果トランジスタを備え、
上記検出部は、当該絶縁ゲート電界効果トランジスタからの出力をモニターすることを特徴とする請求項5記載の核酸検出装置。 - 上記DNAマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、上記所定の核酸と上記核酸プローブとのハイブリダイズ時間がそれぞれの区画で異なることを特徴とする請求項5記載の核酸検出装置。
- 上記DNAマイクロアレイは、所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、
上記複数の区画では、上記所定の核酸と上記核酸プローブとのハイブリダイズ時間が異なることを特徴とする請求項1記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。 - 上記DNAマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部に対応して配設され、所定の核酸と核酸プローブとのハイブリダイズを検出する検出部を有することを特徴とする請求項8記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
- 上記検出部は、絶縁ゲート電界効果トランジスタであることを特徴とする請求項9記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
- 上記DNAマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、
上記複数の区画では、上記核酸プローブ部における核酸プローブの密度が異なることを特徴とする請求項8記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。 - 上記DNAマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、
上記複数の区画では、上記核酸プローブ部の面積が異なることを特徴とする請求項8記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。 - 上記DNAマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、
上記複数の区画では、上記核酸プローブの長さが異なることを特徴とする請求項8記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。 - 上記DNAマイクロアレイは、所定の核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを有する複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、
上記複数の区画では、上記核酸プローブ部の面積が異なることを特徴とする請求項1記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。 - 上記DNAマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部に対応して配設され、所定の核酸と核酸プローブとのハイブリダイズを検出する検出部を有することを特徴とする請求項14記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
- 上記検出部は、絶縁ゲート電界効果トランジスタであることを特徴とする請求項15記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
- 上記DNAマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、
上記複数の区画では、上記所定の核酸と上記核酸プローブとのハイブリダイズ時間が異なることを特徴とする請求項14記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。 - 上記DNAマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、
上記複数の区画では、上記核酸プローブ部における核酸プローブの密度が異なることを特徴とする請求項14記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。 - 上記DNAマイクロアレイは、上記複数の核酸プローブ部を有する複数の区画を備え、
上記複数の区画では、上記核酸プローブの長さが異なることを特徴とする請求項14記載のDNAマイクロアレイを用いた核酸検出方法。
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