JP4857820B2

JP4857820B2 - Ｄｎａセンシング方法

Info

Publication number: JP4857820B2
Application number: JP2006057706A
Authority: JP
Inventors: 哲彌逢坂; 大介丹羽; 紀和本橋
Original assignee: Waseda University
Current assignee: Waseda University
Priority date: 2006-03-03
Filing date: 2006-03-03
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2026-03-03
Also published as: US20070207471A1; US20100221841A1; JP2007232683A

Description

本発明は、電界効果型トランジスタを用いた半導体ＤＮＡセンシングデバイス及びＤＮＡセンシング方法に関する。

バイオセンシングデバイスは医療・環境・創薬分野において広く利用されている。特に、昨今のゲノム分野の発展に伴い、遺伝子治療・テーラーメード医療等を目的としたＤＮＡセンシングデバイスの開発が望まれている。

従来、ＤＮＡセンシングにおいては、レーザースキャナーなどを用いた蛍光・発光によるセンシングが主流であり、最近では電気化学反応を用いた電流・電位検出も試みられるようになってきている。また、半導体検出においては、従来のシリコン窒化膜／シリコン酸化膜／シリコン構造を有するイオン感応性電界効果型トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）をベースとしているものが挙げられる。

しかしながら、これらの方法において、ＤＮＡの検出・測定は、電極部の実行表面積の増加や反応物質の固定化量の増加、増感ラベル剤・インターカレーター分子の導入といった量的な効果によるものがほとんどであり、デバイス自体の改良例は非常に乏しい。また、レーザースキャナーを用いた検出や電気化学検出は、集積化・微細化によって応答感度（強度、応答速度など）が減少する傾向があり、問題点を抱えている。

一方で、ＩＳＦＥＴをベースとした半導体センシングにおいては、測定のための参照電極は別途ガラス電極などが用いられているため、オンチップ化、微小化には困難な側面がある。また、参照電極として擬似参照電極を用いる場合があり得るが、こちらも精度・感度の面で問題がある。更に、デバイスの感応膜である、シリコン窒化膜はその膜厚が１００〜２００ｎｍ程度と厚いため、感度の低下が懸念されている。

このように、従来技術では、オンチップ化、微小化、集積化といった要求を満たす上で難点があり、ＤＮＡセンシングにおいて、特に、一塩基多型などの検出において最大限の効果を引き出すには抜本的な改良が必要となってくると考えられる。

なお、本発明に関連する先行文献としては次のものが挙げられる。

特開２００４−４００７号公報特開２００５−９１０１４号公報特開２００５−２１８３１０号公報ＤａｉｓｕｋｅＮｉｗａ，ＴａｋａｙｕｋｉＨｏｍｍａ，ＴｅｔｓｕｙａＯｓａｋａ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１Ａ／Ｂ，２００４，ｐｐ．Ｌ１０５−Ｌ１０７

本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、有機単分子膜を一体化させた有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を有する半導体デバイスによる簡便かつ高精度なＤＮＡのセンシングを可能にする半導体ＤＮＡセンシングデバイス、特に、塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡを利用した、該プローブＤＮＡの完全相補配列を有するＤＮＡ又は一塩基多型等の上記完全相補配列に対して１〜３個の塩基が異なるミスマッチ配列を有するＤＮＡの検出が可能な半導体ＤＮＡセンシングデバイス及びＤＮＡセンシング方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、プローブＤＮＡ／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として有する半導体デバイスにより、塩基数３〜３５の短鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション検出、ミスマッチ（例えば、一塩基多型）検出が、簡便かつ高精度に可能であり、また、上記半導体デバイスに、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部として設けることにより、有効にオンチップでのＤＮＡセンシングが可能となることを見出し、本発明をなすに至った。

即ち、本発明は、以下の半導体ＤＮＡセンシングデバイス及びＤＮＡセンシング方法を提供する。
［１］半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物を含む厚さ１０〜５０ｎｍの第１の絶縁層が形成された電界効果型トランジスタの上記第１の絶縁層の上に、アミノ系官能基、カルボキシル系官能基又はメルカプト系官能基を有する炭素数３〜２０の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランで構成された厚さ３ｎｍ以下の第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜に塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡを上記反応性官能基を介して、直接又は架橋分子を介して結合させ、上記プローブＤＮＡに対し、該プローブＤＮＡの完全相補配列を有するＤＮＡ、該完全相補配列に対して１個の塩基が異なるミスマッチ配列を有するＤＮＡ、該完全相補配列に対して２個の塩基が異なるミスマッチ配列を有するＤＮＡ又は該完全相補配列に対して３個の塩基が異なるミスマッチ配列を有するＤＮＡであるターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーション反応させて、該反応によるプローブＤＮＡの負電荷の変化により生じる絶縁層の表面電位変化を検出することを特徴とするＤＮＡセンシング方法。

本発明においては、電界効果型トランジスタのゲート部に形成された有機単分子膜／絶縁層／半導体構造のシリコン酸化物又は無機酸化物を含む絶縁層を、通常の半導体デバイスレベルに薄膜化し、更に、厚さが３ｎｍ以下の超薄膜である有機単分子膜によって表面特性を劇的に変化させる。この有機単分子膜上においては、プローブとなるＤＮＡ分子を直接又は架橋分子を介して理想的に配列させることが可能である。また、電界効果デバイスの利用により、ラベル分子を用いる必要がないので、簡便性の観点でも優位性がある。更に、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造が参照デバイスとしても適用可能であるので、完全オンチップの形態でのＤＮＡセンシングデバイスを提供することも可能である。

本発明の半導体ＤＮＡセンシングデバイスは、オンチップでの高感度マイクロマルチＤＮＡセンシングデバイスとして非常に効果的な半導体デバイスであり、これを用いた集積化デバイスは、一塩基多型等のミスマッチ配列のＤＮＡ解析を高精度に可能とするセンシング特性を有するものである。更には、参照デバイスとの併用により、オンチップでの簡便かつ高感度なＤＮＡセンシングを可能とするものであり、高度な医療の提供・テーラーメード医療に有効である。

以下、本発明について更に詳しく説明する。
本発明の半導体ＤＮＡセンシングデバイスは、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果型トランジスタの上記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機分子で構成された第１の有機単分子膜を形成し、第１の有機単分子膜に塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡを上記反応性官能基を介して、直接又は架橋分子を介して結合させてなる、プローブＤＮＡ／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである。

本発明の半導体ＤＮＡセンシングデバイスは、プローブＤＮＡ／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造（架橋分子を介している場合は、架橋分子が結合したプローブＤＮＡ／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造）を検出部として備えるが、このうち、絶縁層／半導体構造部分は、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む絶縁層が形成された電界効果型トランジスタを利用することができ、その構成は、従来公知のものを利用することができる。この電界効果型トランジスタとしては、例えば、図１（Ａ）に示されるようなものが例示される。なお、図１中、１はシリコン基板、２はシリコン酸化物又は無機酸化物（ガラス、アルミナなど）を含む絶縁層、４はゲート電極、５はソース電極、６はドレイン電極、７はチャンネル領域を示す。

そして、図１（Ｂ）に示されるように、絶縁層２上に有機単分子膜３が形成される。ここで、本発明においては、基本原理として、絶縁層表面上のＤＮＡハイブリダイゼーション反応に伴う表面電位変化を電気信号として検出する構成とする。なお、上記絶縁層は１０〜１００ｎｍ、特に１０〜５０ｎｍの厚さに形成することができる。

有機単分子膜は、絶縁層上に直接形成される。この有機単分子膜は、有機分子を絶縁層上に気相化学反応もしくは液相反応によって形成し、その最適化、例えば、有機分子の自己集積化機能によって有機単分子が細密パッキングされた膜が形成される。

この場合、有機単分子膜としては、例えば、反応性官能基、特にアミノ系の官能基（−ＮＨ₂、−ＮＨ−、Ｃ₅Ｈ₅Ｎ−、Ｃ₄Ｈ₄Ｎ−等）、カルボキシル系の官能基（−ＣＯＯＨ等）又はメルカプト系の官能基（−ＳＨ等）を少なくとも１個含有する炭素数３〜２０の直鎖状炭化水素基（アルキル基等）を有するアルコキシシランを用いることが好適である。これらのアルコキシシランは、特に、絶縁層としてシリコン酸化物が形成されたものを用いた場合、シリコン酸化物と結合させることができるため好適である。

また、アミノ系の官能基、カルボキシル系の官能基、メルカプト系の官能基等の反応性官能基に置換可能な基、例えば−Ｂｒ、−ＣＮ等のアミノ誘導基を有するアルコキシシランを用いて単分子膜を形成後、これらアミノ誘導基をアミノ基に置換する方法で導入することもできる。

なお、絶縁層としてシリコン酸化物が形成されたものを用いる場合、アルコキシシランとしては、密着性等の点でトリアルコキシシランが好ましく、またアルコキシ基としては炭素数１〜３のアルコキシ基（−ＯＲ：Ｒは一価炭化水素基を表す）、特にメトキシ基（−ＯＣＨ₃）、エトキシ基（−ＯＣ₂Ｈ₅）が好ましい。より具体的には、Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃Ｓｉ（ＯＣ₂Ｈ₅）₃等の反応性官能基を有するトリアルコキシシランが挙げられる。

そして、本発明の半導体ＤＮＡセンシングデバイスにおいては、有機単分子膜に塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）が直接又は架橋分子を介して結合されており、例えば、図１（Ｃ）に示されるように、有機単分子膜に塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡ１１が架橋分子１２を介して結合される。

プローブＤＮＡの官能基と、有機単分子膜を構成する有機分子の反応性官能基とが反応して結合し得る組合せの場合には、両者を直接反応させて結合し、固定化することができる。一方、プローブＤＮＡの官能基と、有機単分子膜を構成する有機分子の反応性官能基とを反応させて結合させることができない組合せの場合には、架橋分子を介してプローブＤＮＡを有機単分子膜を構成する有機分子と結合させることができる。この場合、例えば、反応性官能基としてアミノ基を有する有機分子の単分子膜を用いる場合、例えば、グルタルアルデヒド等の両末端にアルデヒド基を有する有機分子を用い、一方のアルデヒド基を有機単分子膜と、他方のアルデヒド基をプローブＤＮＡのアミノ基と反応させて結合し、固定化することができる。なお、プローブＤＮＡとしては、塩基鎖のみからなるＤＮＡの他に、アミノ基やメルカプト基などを修飾したＤＮＡを用いることも可能である。

なお、架橋分子は、架橋分子を含む溶液中に電界効果型トランジスタを浸漬し、絶縁層上に形成された有機単分子膜に架橋分子を接触させることで導入可能である。一方、プローブＤＮＡは、プローブＤＮＡが含まれる溶液に電界効果型トランジスタを必要に応じて架橋分子を導入した後に浸漬し、絶縁層上に形成された有機単分子膜に接触させる又は架橋分子に接触させることで導入可能である。

図２は本発明の半導体ＤＮＡセンシングデバイスを用いたハイブリダイゼーション反応に基づくＤＮＡ検出の概念を示すものである。このＤＮＡセンシングでは、有機単分子膜上に架橋分子を介して固定化されたプローブＤＮＡに対し、プローブＤＮＡと同等の長さを有する完全相補配列を有するＤＮＡ又は該完全相補配列に対して１〜３個の塩基が異なるミスマッチ配列を有するＤＮＡをターゲットＤＮＡとして反応させ、この反応によるプローブＤＮＡの負電荷の変化により生じる絶縁層の表面電位変化を電気信号として検出する。なお、図２中、１３はターゲットＤＮＡである。また、他の構成は、図１と同一の参照符号を付して、その説明を省略する。

ここで、ＤＮＡはリン酸基由来の負電荷が存在するため、完全相補ＤＮＡを反応させた場合、二重らせん化が円滑に生じ、ゲート電極上の表面電位は反応によって負に移行する。この場合、たとえばｐ型の電界効果型トランジスタを用いた場合、正方向に閾値電圧がシフトする。電流一定下においては電位シフトを、電圧一定下においては電流のシフトをシグナルとして検出することができる。なお、ｎ型の電界効果トランジスタを用いた場合、閾値電圧のシフトは正方向になり、ｐ型の電界効果トランジスタを用いた場合と逆になる。

一方、ミスマッチ分子をターゲットＤＮＡとして用いた場合、二重らせん化反応の進行、程度、二重らせん構造に違いが生じることから、完全相補ＤＮＡとの反応とは異なる閾値電圧でシフトし、この程度の差により、ＤＮＡ内の塩基ミスマッチを検出することができる。

本発明においては、上記電界効果型トランジスタの半導体上に、更に、参照ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第２の絶縁層を形成することができる。この第２の絶縁層の上には、上記プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡのいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜を形成し、この有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部とすることができる。なお、反応ゲート絶縁部と参照ゲート絶縁部とを、電位変化測定において互いに影響を与えない程度に離間させれば、反応ゲート絶縁部の第１の絶縁層と参照ゲート絶縁部の第２の絶縁層とを同一層内に設けることもできる。

図３は有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部９及び参照部８に適用したオンチップデバイスのユニット構成例を示す。なお、図３中、１はシリコン基板、２は絶縁層、１０はテンプレート部である。このデバイスのユニット構成は図示した構成に限定されず、検出部と参照部とは必ずしも１対１の関係で配置する必要はなく、必要に応じて検出部及び参照部の数及び組合せを適宜変更して配置することができる。また、検出部及び参照部は各々数〜数１０μｍのサイズで形成可能である。

参照部の第２の絶縁層上には、プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡのいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜が形成されるが、この有機単分子膜としては、炭素数８〜２２の直鎖状アルキル基又はフッ化アルキル基を有するアルコキシシランの単分子膜が好ましい。

この場合の有機単分子膜としては、絶縁層上に均一な膜を形成させるため、自己集積化膜であることが望ましい。より具体的には、アルキルシラン：ＣＨ₃（ＣＨ₂）₁₇Ｓｉ（ＯＣＨ₃）₃、フッ素化アルキルシラン：ＣＦ₃（ＣＦ₂）₇（ＣＨ₂）₂Ｓｉ（ＯＣＨ₃）₃等が挙げられる。また、有機単分子膜としてアルコキシシランを用いる場合、絶縁層がシリコン酸化物で形成されたものが好適である。

なお、第１及び第２の有機単分子膜は、パターニングにより所望の位置に形成することができる。特に、オンチップでの集積化デバイスを形成するためには、有機単分子膜のパターニングが有効である。例えば、検出部の絶縁層表面には、ＤＮＡ固定化のために反応性官能基を有する有機分子で構成された第１の有機単分子膜を、一方で、参照部、更には非ゲート部（テンプレート部）においては、ＤＮＡの非特異的な吸着を避けるために、プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡのいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜をパターニングにより位置選択的に形成する。

パターニング手法としては、まず基板上の絶縁層全面にテンプレートとなるプローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡに対する活性をもたない有機分子の有機単分子膜を形成後、粒子線（紫外線、電子線、Ｘ線など）レジストを塗布し、粒子線によって検出部上方のレジスト部分を取り除くようにパターニングを行う。その後、レジストパターン開口部に露出した有機単分子膜を酸素プラズマエッチングなどの手法を用いて除去し、二次的に、検出部に反応性官能基を有する有機分子の有機単分子膜を形成すればよい。

なお、プローブＤＮＡの固定化については、緩衝溶液に溶解したプローブＤＮＡを用いることが好ましい。この際、緩衝溶液は中性から酸性であることがより望ましい。架橋分子を介してプローブＤＮＡを固定化する場合、架橋分子を有機単分子膜に反応させた後に、非特異的に吸着しているプローブＤＮＡを、緩衝液を用いて洗浄することが好ましい。

プローブＤＮＡの固定後、ターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーション反応させる際には、緩衝溶液、好ましくはプローブＤＮＡの固定化の際に用いたものと同等の緩衝溶液に溶解したターゲットＤＮＡを用いることができる。また、測定においてもターゲットＤＮＡの固定化に用いたものと同等の緩衝溶液を用いることが好ましい。なお、複数のプローブＤＮＡを固定化する場合や、ターゲットＤＮＡを複数の検出部を設けたデバイスに別々に反応させる場合はスポッティングなどの手法を用いることができる。

以下、実験例及び実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

なお、実施例において用いたデバイスは、プローブＤＮＡ／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部として備える半導体ＤＮＡセンシングデバイスである。なお、絶縁層としてはシリコン酸化物を用い、検出部の第１の有機単分子膜にはＨ₂Ｎ（ＣＨ₂）₃Ｓｉ（ＯＣ₂Ｈ₅）₃により形成したアミノ系単分子膜を、参照部の第２の有機単分子膜には、ＣＦ₃（ＣＦ₂）₇（ＣＨ₂）₂Ｓｉ（ＯＣＨ₃）₃により形成したフッ化アルキル単分子膜を用い、更に、検出部及び参照部（ゲート電極）以外の部分（テンプレート部）にもＣＦ₃（ＣＦ₂）₇（ＣＨ₂）₂Ｓｉ（ＯＣＨ₃）₃により形成したフッ化アルキル単分子膜が形成されたものを用いた。

［実験例１］
プローブＤＮＡの固定が可能なアミノ系単分子膜３ｂと、ＤＮＡに対して非反応性のフッ化アルキル単分子膜３ａとがパターン形成された図４に示されるような基板を用いてＤＮＡの位置選択的な固定化の確認を行った。なお、図４中、１はシリコン基板、２は絶縁層である。

プローブＤＮＡにはチオールが修飾された２０塩基対のもの（5'-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号１））を用いた。また、アミノ系単分子膜と修飾表面とプローブＤＮＡとの間の架橋分子としてｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰを用いた。

プローブＤＮＡ固定化後の蛍光顕微鏡観察を行った結果、図５に示されるように、アミノ系単分子膜がパターンされた部分にのみ、プローブＤＮＡが固定化されることが明らかとなった。特に、フッ化アルキル単分子膜が存在する部分の蛍光強度は、基板のバックグラウンドの値と一致しており、ＤＮＡはフッ化アルキル単分子膜には非特異的な吸着も起こらないことが示された。

［実施例１］
実験例１における予備検討を踏まえ、上述のデバイスを用いて完全相補配列を有するＤＮＡのハイブリダイゼーションの検出を行った。

アミノ系単分子膜が修飾されている検出部のゲート電極にプローブＤＮＡの固定化を行った。まず、アミノ分子とプローブＤＮＡとを架橋するためのアルデヒド基を両末端に有するグルタルアルデヒドを反応させた。その後、アミノ修飾された２０塩基対からなるプローブＤＮＡ（3'-NH₂-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-5'（配列番号２））を含むリン酸緩衝液中で反応させることで、プローブＤＮＡを固定化した。基板洗浄後、ここで一旦、リン酸緩衝液中にてプローブＤＮＡ固定化デバイスの電流−電圧曲線を測定した。

続いて、相補的な２０塩基対からなるターゲットＤＮＡ（Ａ２０：5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'（配列番号３））を含むリン酸緩衝液中にてハイブリダイゼーションを行った。基板洗浄後、リン酸緩衝液中にてハイブリダイズ後の電流−電圧曲線を得、反応前後の電圧応答の差を測定した。

図６に反応前後の電流−電圧曲線を示す。ハイブリダイゼーションによって、応答曲線は正方向にシフトしていることが確認された。本実施例で用いた電界効果トランジスタはｐ型であることから、この結果はゲート表面電位が負に移行したことを示しており妥当性がある。この際のシフト量は約５０ｍＶ程度と非常に大きな差が得られた。

一方で、ターゲットＤＮＡとして、非相補的なターゲットＤＮＡ（Ｔ２０：5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号４））を用いた場合についても測定したが、ハイブリダイゼーション前後での電圧シフトはほとんど認められなかった（１ｍＶ程度）。

以上の結果より、本発明のデバイスを用いた短鎖ＤＮＡのセンシングが可能であることが示された。

また、非反応性のフッ化アルキル単分子膜を形成した参照部においては、プローブＤＮＡの固定前、プローブＤＮＡの固定後、ターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーション後のいずれにおいても電圧のシフトは確認されなかった。この結果より、非反応性のフッ化アルキル単分子膜を形成した有機単分子膜／絶縁層／半導体構造はＤＮＡセンシングにおける参照電極として機能することが示された。

［実施例２］
上述のデバイスを用いた混合塩基を含む完全相補配列を有するＤＮＡのハイブリダイゼーションの検出を行った。ターゲットＤＮＡには3’末端にアミノ基が修飾された3'-NH₂-ACGAACATAGCCCGCCTTAC-5'（配列番号５）を、プローブＤＮＡには完全相補の5'-TGCTGTTATCGGGCGGAATG-3'（配列番号６）を用い、実施例１と同様の方法で電圧応答の測定を実施したところ、混合塩基ＤＮＡの場合も約５０ｍＶ程度の正方向への電圧シフトが観測された。この結果は、混合塩基からなる実際のＤＮＡにおいても、本発明のデバイスによるセンシングが可能であることを示している。

［実施例３］
ミスマッチ配列を含むターゲットＤＮＡを用いて、ミスマッチ検出を行った。プローブＤＮＡは実施例２と同じであるが、ターゲットＤＮＡとして１，３又は５個の塩基のミスマッチを含むもの（一塩基多型）を用い、１塩基ミスマッチＤＮＡとして5'-TGCTTGTATCGTGCGGAATG-3'（配列番号７）、３塩基ミスマッチＤＮＡとして5'-TGCTAGTATCGTGCGGAGTG-3'（配列番号８）、５塩基ミスマッチＤＮＡとして5'-AGCTAGTATCGTGCCGAGTG-3'（配列番号９）を用いた。

実施例１と同様の方法で電圧応答の測定を実施したところ、一般的に２０塩基ＤＮＡの場合、５塩基ミスマッチＤＮＡでは、殆どハイブリダイゼーションしないと言われているが、５塩基ミスマッチＤＮＡの電子シフトは数ｍＶ程度であり、この応答結果は妥当性があるといえる。一方、１塩基ミスマッチＤＮＡでは約２０ｍＶ、３塩基ミスマッチＤＮＡでは約８ｍＶの電位シフトが確認された。

また、１塩基ミスマッチＤＮＡの結果と、完全相補ＤＮＡの結果（実施例２）とを比較すると、３０ｍＶ程度の電圧シフト差が生じており、これは他の検出手法には類を見ない感度である。特に、蛍光検出や電気化学的な検出の場合は、インターカレーター分子や特異反応性酵素の導入、３本鎖反応による信号増幅によって検出がなされるが、本発明のデバイスを用いれば、ノンラベルでの検出が可能である。

本発明の半導体ＤＮＡセンシングデバイスを示す断面図であり、（Ａ）は電界効果型トランジスタ、（Ｂ）は電界効果型トランジスタのゲート電極の絶縁層上に有機単分子膜を形成した状態、（Ｃ）は有機単分子膜に架橋分子を介してプローブＤＮＡが固定化された状態を示す。本発明の半導体ＤＮＡセンシングデバイスを用いたハイブリダイゼーション反応に基づくＤＮＡ検出の概念図である。オンチップデバイスのユニット構成例を示し、（Ａ）は部分平面図、（Ｂ）はその拡大断面図である。実験例１で用いたプローブＤＮＡの固定が可能なアミノ系単分子膜と、ＤＮＡに対して非反応性のフッ化アルキル単分子膜がパターン形成された基板を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は部分断面図である。実験例１におけるプローブＤＮＡ固定化後の蛍光顕微鏡写真であり（Ｂ）は（Ａ）の部分拡大写真である。実施例１におけるハイブリダイゼーション反応前後の電流−電圧曲線を示すグラフである。

符号の説明

１シリコン基板
２絶縁層
３有機単分子膜
４ゲート電極
５ソース電極
６ドレイン電極
７チャンネル領域
８参照部
９検出部
１０テンプレート部
１１プローブＤＮＡ
１２架橋分子
１３ターゲットＤＮＡ

配列番号１：Designed oligonucleotide. 5'- end is terminated by SH group.
配列番号２：Designed oligonucleotide. 3'- end is terminated by NH2 group.
配列番号３：Designed oligonucleotide.
配列番号４：Designed oligonucleotide.
配列番号５：Designed oligonucleotide. 3'- end is terminated by NH2 group.
配列番号６：Designed oligonucleotide.
配列番号７：Designed oligonucleotide.
配列番号８：Designed oligonucleotide.
配列番号９：Designed oligonucleotide.

Claims

半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物を含む厚さ１０〜５０ｎｍの第１の絶縁層が形成された電界効果型トランジスタの上記第１の絶縁層の上に、アミノ系官能基、カルボキシル系官能基又はメルカプト系官能基を有する炭素数３〜２０の直鎖状炭化水素基を有するアルコキシシランで構成された厚さ３ｎｍ以下の第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜に塩基数３〜３５の短鎖プローブＤＮＡを上記反応性官能基を介して、直接又は架橋分子を介して結合させ、上記プローブＤＮＡに対し、該プローブＤＮＡの完全相補配列を有するＤＮＡ、該完全相補配列に対して１個の塩基が異なるミスマッチ配列を有するＤＮＡ、該完全相補配列に対して２個の塩基が異なるミスマッチ配列を有するＤＮＡ又は該完全相補配列に対して３個の塩基が異なるミスマッチ配列を有するＤＮＡであるターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーション反応させて、該反応によるプローブＤＮＡの負電荷の変化により生じる絶縁層の表面電位変化を検出することを特徴とするＤＮＡセンシング方法。