WO2006025180A1 - Ｄｎａセンサー - Google Patents

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WO2006025180A1
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dna sensor
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Hiroshi Kawarada
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Japan Science And Technology Agency
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS
    • G01N27/4145—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors

Definitions

  • the present invention relates to a biosensor, and more particularly to a DNA (deoxyribonucleic acid) sensor (DNA chip) having a p-channel field effect transistor.
  • This charge detection method is based on silicon ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transistor).
  • silicon ISFETs are insensitive to detecting charge doubling due to DNA hybridization.
  • This transistor is a p-channel field-effect transistor that uses a liquid electrolyte as a gate, oxidizes the hydrogen-terminated surface by ozone treatment, and uses a diamond surface mixed with hydrogen-terminated and oxygen-terminated channels as a channel (see Patent Document 1 below) ].
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-109020
  • the present invention further develops the charge detection method (charge detection type DNA chip) described in (2) above.
  • P channel with a diamond surface consisting of a liquid electrolyte gate, a hydrogen-terminated surface, an oxygen-terminated surface, and a surface terminated with amino groups or amino-terminated molecules as amino terminations
  • An object of the present invention is to provide a DNA sensor capable of improving the detection sensitivity of hybridization by directly immobilizing DNA on the diamond surface of a field effect transistor and identifying unknown DNA.
  • the present invention provides
  • the target DNA When the target DNA is in a complementary relationship with the probe DNA, the target DNA is generated by hybridization of the probe DNA with the single-stranded DNA force and the target DNA 2 The negative charge of the phosphate group of the double-stranded DNA is doubled and holes are induced, and the threshold voltage of the p-channel field effect transistor is increased. By detecting that the threshold voltage is shifted in the positive direction and detecting the shift in the positive direction of the threshold voltage, it is determined whether the target DNA is in a complementary relationship with the probe DNA. And
  • the linker is a divalent to trivalent aldehyde.
  • the density of the probe D NA is 10 1Q cm 2 or more
  • the concentration of the target DNA is 10 12 characterized in that the M is 10- 6 M.
  • the threshold voltage It is characterized in that the shift difference in the positive direction is detected as a change in gate voltage under a constant drain current condition.
  • the shift difference in the positive direction of the threshold voltage is defined as a drain current change under a constant gate voltage condition. It is characterized by detection.
  • the shift difference in the positive direction of the threshold voltage is defined as a drain current change under a constant drain voltage condition. It is characterized by detection.
  • the buffer solution has a NaCl concentration of 0.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of an SGFET that is useful for the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a channel part showing a state of generation of negative charges by single-stranded DNA showing an example of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a channel portion showing a negative charge generation state by double-stranded DNA showing an example of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing a change (No. 1) in SGFET characteristics according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing a change (No. 2) in SGFET characteristics according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the time change of the gate voltage of the SGFET due to DNA hybridization showing an example of the present invention.
  • FIG. 7 is a characteristic diagram of a threshold voltage (gate voltage) when the amount of target DNA is changed according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram showing a denomination distance obtained by an experiment for optimizing a buffer solution concentration according to an example of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing a change in the amount of shift of the gate potential by adjusting the temperature of the buffer solution according to the example of the present invention.
  • the channel is a diamond surface where a gate composed of a liquid electrolyte (buffer solution) and at least a hydrogen-terminated surface and a surface terminated with an amino group or amino molecule as an amino terminus are mixed.
  • a gate composed of a liquid electrolyte (buffer solution) and at least a hydrogen-terminated surface and a surface terminated with an amino group or amino molecule as an amino terminus are mixed.
  • a channel field-effect transistor (SGFET: electrolyte-gated diamond field-effect transistor), a probe DNA consisting of a single-stranded DNA whose base sequence is directly fixed to the amino terminus of the diamond surface by a linker,
  • SGFET electrolyte-gated diamond field-effect transistor
  • a probe DNA consisting of a single-stranded DNA whose base sequence is directly fixed to the amino terminus of the diamond surface by a linker
  • DNA has a negative charge derived from a phosphate group. By carrying out hybridization, the negative charge is approximately doubled. In the present invention, a significant change in the negative charge is detected by detecting the degree to which the number of holes excited on the channel surface increases by immobilizing DNA on the surface of the diamond channel of SGFE T. enable. [0024] Hereinafter, the DNA sensor of the present invention will be described.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of an SGFET according to the present invention
  • Fig. 2 is a schematic diagram of a channel portion showing a negative charge generation state by a single-stranded DNA, showing an embodiment of the present invention
  • Fig. 3 is a diagram of the present invention.
  • Fig. 4 is a diagram showing the change in SGFET characteristics (part 1)
  • Fig. 5 is a change in SGFET characteristics (part 2).
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of an SGFET according to the present invention
  • Fig. 2 is a schematic diagram of a channel portion showing a negative charge generation state by a single-stranded DNA, showing an embodiment of the present invention
  • Fig. 3 is a diagram of the present invention.
  • Fig. 4 is a diagram showing the change in SGFET characteristics (part 1)
  • Fig. 5 is a change in SGFET characteristics (part 2).
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of an SGFET according to
  • the undoped polycrystalline diamond layer 1 is sandwiched between the source electrode 3 and the drain electrode 4 on the diamond surface 2 in which hydrogen termination, oxygen termination, and amino termination are mixed. Then, a p-channel 5 made of the diamond surface 2 is formed, and insulating films 6 and 7 made of polyimide resin are formed on the source electrode 3 and the drain electrode 4 respectively. On this p-channel 5, a gate 8 that also has a liquid electrolyte force is formed.
  • Reference numeral 9 is a reference electrode disposed on the liquid electrolyte 8 as a gate.
  • the substrate may be a single crystal diamond layer, not limited to a polycrystalline diamond layer.
  • a p-channel field effect transistor having a gate 8 made of a liquid electrolyte and a p-channel 5 made of a diamond surface 2 in which hydrogen termination, oxygen termination, and amino termination are mixed is prepared.
  • pH measures the proton concentration (H + concentration).
  • NH amino group
  • NH amino group
  • the charge change due to proton adsorption due to pH change enables measurement of a wide range of proton concentrations (H + concentration), and the high sensitivity and pH sensitivity of the field effect transistor.
  • a probe DNA 11 having a known single-stranded DNA force at the amino end on the p-channel 5 of the diamond surface 2 is linked to a linker [ For example, it is directly fixed covalently by a crosslinking action via a divalent to trivalent carboxylic acid (succinic acid, phthalic acid) or a divalent to trivalent aldehyde (glutaraldehyde)].
  • a linker For example, it is directly fixed covalently by a crosslinking action via a divalent to trivalent carboxylic acid (succinic acid, phthalic acid) or a divalent to trivalent aldehyde (glutaraldehyde)].
  • the probe DNA11 is immobilized at a high density of 10 1Q cm 2 or more.
  • amino terminal means that an amino group is directly attached to the diamond surface 2 and only on the diamond surface, and an amino group is attached to the end of the molecule. Also included if you are. In that sense, it can be rephrased as a surface terminated with a molecule having an amino group or an amino group.
  • linker for example, a force using an acid or an acid compound, a divalent to trivalent carboxylic acid (having a COOH group), or a divalent to trivalent aldehyde (COH group) is preferable.
  • the base sequence in the p-channel 5 of fixing the probe DNA11 drips unknown target DNA (concentration 10- 12 M ⁇ 10- 6 M).
  • the probe DNA 11 and the dropped target DNA are in a complementary relationship, the probe DNA 11 becomes a double-stranded DNA 12 as shown in FIG. 3 by hybridization.
  • the negative charge is also doubled. This induces holes and shifts the threshold voltage of SGFET in the positive direction.
  • the difference in the threshold voltage of the SGFET is expressed as the gate voltage (gate) under the constant drain current (drain-source current) I condition (referenced to the horizontal axis in FIG. 4) shown in FIG. 'Source-to-source
  • V change shift in the positive direction
  • constant gate voltage V condition based on the vertical axis in Figure 4
  • Fig. 4 is the SGFET characteristic diagram (part 1) (here, V (V) [drain voltage]
  • curve a shows the SGFET V (V) [gate] when only the probe DNA11 consisting of this single-stranded DNA is immobilized on the diamond surface 2.
  • Figure 5 shows the SGFET characteristics (part 2) (here V (V) [gate voltage] is set to 0.7.
  • the curve c shows the SGFET V (V) (drain voltage) and I when the probe DNA1 1 consisting of single-stranded DNA is immobilized on the diamond surface 2.
  • curve b is shifted in the positive direction compared to curve a.
  • curve b is more negative than curve a.
  • FIG. 6 is a diagram showing the time change of the gate voltage of the SGFET due to the DNA noise hybridization according to the embodiment of the present invention.
  • V (V) (drain voltage) of SGFET is-0.
  • I ( ⁇ ⁇ ) [drain current] is 1 10 A.
  • FIG. 7 is a characteristic diagram of the threshold voltage (gate voltage) when the amount of target DNA is varied, showing an example of the present invention.
  • Figure 7 shows the time variation of the gate voltage when a constant drain current is maintained when a single-stranded DNA complementary to the probe DNA is used as the target DNA and the force is applied (60 seconds). The amount of shift in the positive direction of the gate voltage caused by hybridization
  • a G (V) When the amount of target DNA dropped is 1 ⁇ , 100 ⁇ , and ⁇ , they are shifted in the positive direction by 38 mV, 25 mV, and 4 mV, respectively.
  • a p-channel field effect transistor is prepared using a liquid electrolyte (buffer solution) as a gate and a polycrystalline or single-crystal diamond surface with a mixture of hydrogen termination, oxygen termination and amino termination, nucleotide sequence via the DAL glutaraldehyde (divalent aldehyde) known probe DNA at 10 1Q cm _ 2 or more densities, and fixed directly by cross-linking to the diamond surface.
  • DAL glutaraldehyde divalent aldehyde
  • the target DNA concentration ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ is 4 mV at the target DNA concentration, 25 mV at ⁇ , and 38 mV at 1 ⁇ ⁇ ⁇ .
  • Each was able to observe a shift in the positive direction. With non-complementary target DNA, these shifts were completely undetectable.
  • the DNA sensor of the present invention is suitable for real-time detection of DNA, and is expected as a device capable of realizing clinical application by utilizing the biocompatibility of the diamond channel surface.
  • FIG. 8 is a diagram showing a Debye distance (Debye shielding distance) by an experiment for optimizing the buffer solution concentration according to the embodiment of the present invention.
  • the horizontal axis shows the distance from the diamond surface and the vertical axis shows the diamond surface potential.
  • Hybridization efficiency and phosphoric acid (DNA) negative charge detection efficiency are in a trade-off relationship.
  • the hybridization efficiency increases as the concentration of the noffer (NaCl) solution increases, and the repulsion between negative charges can be shielded.
  • the negative charge detection efficiency of phosphoric acid (DNA) is larger as the Debye distance is smaller and the Debye distance is longer, and the negative charge detection efficiency is higher.
  • 21 is a diamond surface
  • 22 is DNA ( ⁇ 20 bases: ⁇ 6 nm)
  • buffer It is a NaCl solution
  • the Debye distance ⁇ _ 1 [nm] is
  • ⁇ _ 1 0. 304 / (NaCl)
  • the ionic species in the noffer solution is NaCl
  • Table 1 shows the DNA detectable distance according to the NaCl concentration.
  • the buffer solution of (2) is 2 ssc
  • the NaCl concentration is 0.3 M
  • the Debye distance is 0.56 nm
  • the optimization of the DNA hybridization is not possible.
  • the Debye distance is short.
  • the buffer solution (3) is suitable for real-time measurement because the Debye distance is slightly longer and the hybridization efficiency is still high.
  • Linker was shortened and dartalaldehyde (GA) was used. Short! ⁇ Linker One is advantageous to contain many phosphate groups of DNA within the device length. Hybridization is sensitive to buffer solution temperature, and 59 ° C is the optimum temperature. However, by setting the buffer solution temperature at 40 ° C and reducing the efficiency of hybridization, the 1-base and 3-base mismatch target DNA was separated and detected. Furthermore, by reducing the buffer solution temperature to 25 ° C, the 3-base mismatch and the 1-base mismatch are separated as shown in Figure 9. In FIG. 9, I (drain-source current) is 10 A, V (drain-source current).
  • Voltage is 0.4V
  • the target fixing time is 1 hour
  • the horizontal axis is the temperature [in]
  • the vertical axis is the ⁇ (shift potential) [mV] between the gate and the source.
  • the set temperature of the koffa solution is reduced to 59 ° C, which is optimal for hybridization, and to 40 ° C, and further to 25 ° C.
  • the hybridization efficiency 1-base and 3-base mismatches' incorrect (incomplete) hybridization of the target DNA was suppressed, and separation and detection of 1-base and 3-base mismatches were successful.
  • the conventional SilSFET system there is no measurement example with high sensitivity so far.
  • the present invention is expected to expand not only in the medical field but also in food inspection, environmental measurement, etc. as a mass-consumption sensor due to the low cost of the element due to mass production. Therefore, it has extremely high economic and social influence.
  • the present invention is more sensitive than conventional semiconductor biosensors and photodetection biosensors using fluorescent labels due to the high-sensitivity DNA fixation technology and SGFET miniaturization that are becoming possible in diamond. High sensitivity detection is expected.
  • this DNA sensor it is possible to use a minute amount of the measurement sample, so it can be used for daily and emergency tests in clinical laboratories.
  • a charge / potential detection device suitable for an integrated nanodevice system including other functions can be realized. Industrial applicability
  • the DNA sensor of the present invention is suitable for real-time detection of DNA, and can be used as a device capable of clinical application using the biocompatibility of the diamond channel surface.
  • biocompatibility of carbon can be applied as an implantable sensor.

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Abstract

　ハイブリダイゼーションの検出感度を向上させ、未知のＤＮＡの同定を行うことができるＤＮＡセンサーを提供する。 　液体電解質からなるゲート８と、少なくとも水素終端表面およびアミノ基またはアミノ基のある分子で終端された表面が混在するダイヤモンド表面２をｐチャネル５とを有するｐチャネル電界効果トランジスタと、前記ダイヤモンド表面２にリンカーによって直接固定される塩基配列が既知の１本鎖ＤＮＡからなるプローブＤＮＡ１１と、前記ダイヤモンド表面２に滴下される未知の１本鎖ＤＮＡからなるターゲットＤＮＡとをセットし、前記ターゲットＤＮＡが前記プローブＤＮＡ１１と相補的な関係にある場合に、前記１本鎖ＤＮＡからなるプローブＤＮＡ１１及びターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生成される２本鎖ＤＮＡのリン酸基の負の電荷が２倍となり、正孔が誘起され、前記ｐチャネル電界効果トランジスタの閾値電圧の正方向へシフトすることを利用し、その閾値電圧の正方向へのシフトを検出することにより前記ターゲットＤＮＡが前記プローブＤＮＡ１１と相補的な関係にあるか否かを同定する。

Description

明 細 書
DNAセンサー
技術分野
[0001] 本発明は、バイオセンサーに係り、特に、 pチャネル電界効果トランジスタを有する DNA (デォキシリボ核酸)センサー（DNAチップ）に関するものである。
背景技術
[0002] 従来、このような分野の技術としては、以下のようなものがある。
[0003] (1)蛍光検出方式
この蛍光検出方式とは、塩基配列がわ力つた 1本鎖 DNA (プローブ DNA)をガラス 基板、シリコン、ダイヤモンド等に固定し、未知の 1本鎖 DNA (ターゲット DNA)との ハイブリダィゼーシヨン（互いに相補的な 1本鎖 DNA同士が結合して 2本鎖 DNAに なる現象）を、ターゲット DNAに固定した蛍光物質で検出するものである。し力しなが らこの方式では、蛍光の有無によりハイブリダィゼーシヨンを検出するため、装置が大 規模になるという問題があった。また、観測手段が蛍光顕微鏡であるため高密度化に は限界がある。
[0004] (2)電荷検出方式
この電荷検出方式とは、シリコンの ISFET (イオン感応性電界効果トランジスタ）を 基本とする。しかしながら、 DNAのノ、イブリダィゼーシヨンによる電荷の倍増を検知 するには、シリコン ISFETは感度が低い。
[0005] (3)本願発明者が提案した、オゾン処理による高い閾値電圧を有する特性の良好 な Pチャネル電界効果トランジスタ
このトランジスタは、液体電解質をゲートとして使用し、オゾン処理により水素終端表 面を酸化し、水素終端と酸素終端が混在したダイヤモンド表面をチャネルとしてなる p チャネル電界効果トランジスタである〔下記特許文献 1参照〕。
特許文献 1：特開 2004— 109020号公報
発明の開示
[0006] 本発明は、上記した（2)の電荷検出方式 (電荷検出型 DNAチップ)を更に発展さ せたものであり、液体電解質からなるゲートと、水素終端表面、酸素終端表面および ァミノ終端としてのアミノ基またはァミノ基のある分子で終端された表面が混在するダ ィャモンド表面をチャネルとする Pチャネル電界効果トランジスタのダイヤモンド表面 に、 DNAを直接固定することにより、ハイブリダィゼーシヨンの検出感度を向上させ、 未知の DNAの同定を行うことができる DNAセンサーを提供することを目的とする。
[0007] 本発明は、上記目的を達成するために、
〔1〕DNAセンサーにおいて、液体電解質からなるゲートと、少なくとも水素終端表 面およびアミノ終端としてのアミノ基またはァミノ基のある分子で終端された表面が混 在するダイヤモンド表面をチャネルとする Pチャネル電界効果トランジスタと、前記ダイ ャモンド表面のァミノ終端にリンカ一によつて直接固定される塩基配列が既知の 1本 鎖 DNAからなるプローブ DNAと、前記ダイヤモンド表面に滴下される未知の 1本鎖 DNAからなるターゲット DNAとをセットし、前記ターゲット DNAが前記プローブ DN Aと相補的な関係にある場合に、前記 1本鎖 DNA力 なるプローブ DNA及びター ゲット DNAのハイブリダィゼーシヨンにより生成される 2本鎖 DNAのリン酸基の負の 電荷が 2倍となり、正孔が誘起され、前記 pチャネル電界効果トランジスタの閾値電圧 が正方向へシフトすることを利用し、この閾値電圧の正方向へのシフトを検出すること により、前記ターゲット DNAが前記プローブ DNAと相補的な関係にある力否かを同 定することを特徴とする。
[0008] 〔2〕上記〔1〕記載の DNAセンサーにおいて、前記ダイヤモンド表面に酸素終端表 面を含むことを特徴とする。
[0009] 〔3〕上記〔1〕又は〔2〕記載の DNAセンサーにおいて、前記リンカ一が 2乃至 3価の カルボン酸であることを特徴とする。
[0010] 〔4〕上記〔1〕又は〔2〕記載の DNAセンサーにおいて、前記リンカ一が 2乃至 3価の アルデヒドであることを特徴とする。
[0011] 〔5〕上記〔1〕、 〔2〕、 〔3〕又は〔4〕記載の DNAセンサーにおいて、前記プローブ D NAの密度が 101Qcm 2以上、前記ターゲット DNAの濃度が 10— 12Mから 10— 6Mである ことを特徴とする。
[0012] 〔6〕上記〔1〕、〔2〕、〔3〕又は〔4〕記載の DNAセンサーにおいて、前記閾値電圧の 正方向へのシフト差を一定ドレイン電流条件下でのゲート電圧変化として検出するこ とを特徴とする。
[0013] 〔7〕上記〔1〕、〔2〕、〔3〕又は〔4〕記載の DNAセンサーにおいて、前記閾値電圧の 正方向へのシフト差を一定ゲート電圧条件下でのドレイン電流変化として検出するこ とを特徴とする。
[0014] 〔8〕上記〔1〕、〔2〕、〔3〕又は〔4〕記載の DNAセンサーにおいて、前記閾値電圧の 正方向へのシフト差を一定ドレイン電圧条件下でのドレイン電流変化として検出する ことを特徴とする。
[0015] 〔9〕上記〔1〕記載の DNAセンサーにおいて、前記ノ、イブリダィゼーシヨンにおける 前記液体電解質からなるバッファ溶液温度を最適な温度である 59°Cにすることを特 徴とする。
[0016] 〔10〕上記〔2〕記載の DNAセンサーにおいて、前記ハイブリダィゼーシヨンにおけ る前記液体電解質からなるバッファ溶液温度を最適な温度である 59°Cにすることを 特徴とする。
[0017] 〔11〕上記〔1〕記載の DNAセンサーにおいて、前記バッファ溶液の NaCl濃度が 0
. 3M-0. 01M、デバイ距離が 0. 56nm- 3. 04nmであることを特徴とする。
[0018] 〔12〕上記〔2〕記載の DNAセンサーにおいて、前記バッファ溶液の NaCl濃度が 0
. 3M-0. 01M、デバイ距離が 0. 56nm- 3. 04nmであることを特徴とする。
[0019] 〔 13〕上記〔9〕又は〔10〕記載の DNAセンサーにおいて、前記バッファ溶液温度を
59°C力 40°C、さらに 25°Cに下げて、 1塩基及び 3塩基ミスマッチ 'ターゲット DNA の分離検出を可能にすることを特徴とする。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]本発明に力かる SGFETの断面図である。
[図 2]本発明の実施例を示す 1本鎖 DNAによる負電荷の発生状態を示すチャネル 部の模式図である。
[図 3]本発明の実施例を示す 2本鎖 DNAによる負電荷の発生状態を示すチャネル 部の模式図である。
[図 4]本発明の実施例を示す SGFET特性の変化 (その 1)を示す図である。 [図 5]本発明の実施例を示す SGFET特性の変化 (その 2)を示す図である。
[図 6]本発明の実施例を示す DNAハイブリダィゼーシヨンによる SGFETのゲート電 圧の時間変化を示す図である。
[図 7]本発明の実施例を示すターゲット DNAの量を変化させた場合の閾値電圧 (ゲ ート電圧)の特性図である。
[図 8]本発明の実施例を示すバッファ溶液濃度の最適化を図るための実験によるデ ノ ィ距離を示す図である。
[図 9]本発明の実施例を示すバッファ溶液の温度調節によるゲート電位のシフト量の 変化を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0021] DNAセンサーにおいて、液体電解質 (バッファ溶液)からなるゲートと、少なくとも 水素終端表面およびアミノ終端としてのアミノ基またはァミノ基のある分子で終端され た表面が混在するダイヤモンド表面をチャネルとする pチャネル電界効果トランジスタ (SGFET:電解質ゲートダイヤモンド電界効果トランジスタ）と、前記ダイヤモンド表 面のアミノ終端にリンカ一によつて直接固定される塩基配列が既知の 1本鎖 DNAか らなるプローブ DNAと、前記ダイヤモンド表面に未知の 1本鎖 DNAからなるターゲッ ト DNAとをセットし、前記ターゲット DNAが前記プローブ DNAと相補的な関係にあ る場合、前記 1本鎖 DNAからなるプローブ DNAとターゲット DNAのハイブリダィゼ ーシヨンにより生成される 2本鎖 DNAのリン酸基の電荷 (負）が 2倍となり、正孔が誘 起され、 pチャネル電界効果トランジスタの閾値電圧が正方向へシフトすることを利用 し、その閾値電圧の正方向へのシフトを検出することにより、前記ターゲット DNAが 前記プローブ DNAと相補的な関係にあるか否かを同定することを特徴とする。よって 、迅速、かつ的確な DNAの同定が可能である。
[0022] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
[0023] DNAはリン酸基に由来する負電荷を持っている力 ハイブリダィゼーシヨンを行うこ とによりその負電荷は約 2倍になる。本発明は、その負電荷の顕著な変化を、 SGFE Tのダイヤモンドチャネル表面に DNAを固定することにより、チャネル表面に励起さ れる正孔の数が増加する度合を検出して、 DNAの同定を可能にする。 [0024] 以下、本発明の DNAセンサーについて説明する。
[0025] 図 1は本発明に力かる SGFETの断面図、図 2は本発明の実施例を示す 1本鎖 DN Aによる負電荷の発生状態を示すチャネル部の模式図、図 3は本発明の実施例を示 す 2本鎖 DNAによる負電荷の発生状態を示すチャネル部の模式図、図 4は SGFET 特性の変化（その 1)を示す図、図 5はその SGFET特性の変化（その 2)を示す図で ある。
[0026] (1)図 1に示すように、アンドープ多結晶ダイヤモンド層 1の、水素終端、酸素終端 およびァミノ終端が混在するダイヤモンド表面 2にソース電極 3とドレイン電極 4によつ て挟まれるようにダイヤモンド表面 2からなる pチャネル 5を形成し、ソース電極 3及び ドレイン電極 4上にはそれぞれポリイミド榭脂からなる絶縁膜 6, 7を形成する。この p チャネル 5上には液体電解質力もなるゲート 8を形成する。 9はゲートとしての液体電 解質 8に配置される参照電極である。なお、基板としては、多結晶ダイヤモンド層に 限定されるものではなぐ単結晶ダイヤモンド層を用いてもょ 、。
[0027] このように、液体電解質からなるゲート 8と、水素終端、酸素終端およびァミノ終端が 混在するダイヤモンド表面 2からなる pチャネル 5とを有する pチャネル電界効果トラン ジスタを用意する。ここで、 pHセンシングという観点力 すると、 pHはプロトン濃度 (H +濃度）を測定することになり、ァミノ終端では NH (ァミノ基)では pH9以下で水素終
2
端でのプロトンと結合し、 NHとなり、酸素終端では ΟΊま pH4. 5以下でプロトンと結
3
合し、 OHとなる。このように、 pH変化でのプロトン吸着による電荷の変化により、広い 範囲のプロトン濃度 (H+濃度）の測定が可能となるとともに、電界効果トランジスタの 高 、pH感性を得ることができる。
[0028] (2)次に、図 2に示すように、上記したダイヤモンド表面 2の pチャネル 5上のアミノ終 端に、塩基配列が既知の 1本鎖 DNA力もなるプローブ DNA11を、リンカ一〔例えば 、 2乃至 3価のカルボン酸（コハク酸、フタル酸）や 2乃至 3価のアルデヒド（グルタルァ ルデヒド)〕を介して架橋作用により共有結合的に直接固定する。このとき、プローブ DNA11は、 101Qcm 2以上の高密度で固定する。
[0029] なお、実施例においてァミノ終端という場合は、ダイヤモンド表面 2に直接アミノ基 がつ ヽて 、る場合のみでなぐダイヤモンド表面上にっ 、た分子の端にアミノ基がつ いている場合も含まれている。その意味で、アミノ基またはァミノ基のある分子で終端 された表面と言 ヽ換えることができる。
[0030] また、上記したリンカ一としては、例えば、酸又は酸の化合物を用いる力 2乃至 3 価のカルボン酸（COOH基がある）や 2乃至 3価のアルデヒド（COH基）が好適である
[0031] (3)次いで、プローブ DNA11を固定した pチャネル 5に塩基配列が未知のターゲッ ト DNA (濃度 10— 12M〜10— 6M)を滴下する。ここで、プローブ DNA11と滴下したター ゲット DNAが相補的な関係にある場合には、ハイブリダィゼーシヨンにより、プローブ DNA11は図 3に示すように、 2本鎖 DNA12となる。このとき、リン酸基の数が 2倍と なるためその負の電荷も 2倍となり、これにより正孔が誘起され、 SGFETの閾値電圧 が正方向にシフトする。
[0032] そこで、この SGFETの閾値電圧の差を、図 4に示す一定ドレイン電流（ドレイン'ソ ース間電流) I 条件（図 4の横軸を基準とする）下でのゲート電圧 (ゲート'ソース間電
DS
圧) V 変化 (正方向へのシフト）、あるいは一定ゲート電圧 V 条件（図 4の縦軸を基
GS GS
準とする）下でのドレイン電流 I 変化 (負方向へのシフト）、または図 5に示す一定ドレ
DS
イン電圧（ドレイン 'ソース間電圧) V 条件（図 5の縦軸を基準とする）下でのドレイン
DS
電流 I 変化 (負方向へのシフト）として検出することができる。
DS
[0033] 図 4はその SGFET特性図（その 1)である（ここでは、 V (V)〔ドレイン電圧〕を— 0
DS
. IVに設定している）。この図において、曲線 aは、この 1本鎖 DNAからなるプローブ DNA11のみがダイヤモンド表面 2に固定されている場合の SGFETの V (V)〔ゲー
GS
ト電圧〕と I A)〔ドレイン電流〕との特性を示しており、曲線 bはハイブリダィゼーシ
DS
ヨンが起こって 2本鎖 DNA12になった場合の SGFETの V (V)〔ゲート電圧〕と I (
GS DS
μ Α)〔ドレイン電流〕との特性を示している。ターゲット DNA (21塩基対)濃度が 0. 1 ηΜ、バルタ溶液の ρΗ = 7の場合である。
[0034] 図 5はその SGFET特性図（その 2)である（ここでは、 V (V)〔ゲート電圧〕を— 0. 7
GS
Vに設定している）。この図において、曲線 cは、 1本鎖 DNAからなるプローブ DNA1 1がダイヤモンド表面 2に固定されている場合の SGFETの V (V)〔ドレイン電圧〕と I
DS
( μ Α)〔ドレイン電流〕との特性を示しており、曲線 dはハイブリダィゼーシヨンが生じ て 2本鎖 DNA12になった場合の SGFETの V (V)〔ドレイン電圧〕と I A)〔ドレ
DS DS
イン電流〕との特性を示している。ターゲット DNA (21塩基対)濃度が 0. 1ηΜ、バル ク溶液の pH = 7の場合である。
[0035] これらの図より明らかなように、一定ドレイン電流 I に対してのゲート電圧 V の変化
DS GS
を見ると、曲線 aと比べて曲線 bが正方向へシフトしている。また、同様に、一定ゲート 電圧 V に対してのドレイン電流 I の変化を見ると、曲線 aと比べて曲線 bが負方向へ
GS DS
シフトしている。
[0036] このようにして、 pチャネル電界効果トランジスタの閾値電圧の正方向へのシフトの 有無を検出することにより、ノ、イブリダィゼーシヨンの有無、すなわち、未知のターゲッ ト DNAが前記プローブ DNAと相補的な関係にある力否かが同定できる。
[0037] なお、前記未知のターゲット DNAが前記プローブ DNA11と相補的な関係にない 場合には、ノ、イブリダィゼーシヨンがほとんど生じないため、 SGFETの閾値電圧の正 方向のシフトがないか、シフトがあっても相補的な場合に比べ少ない。
[0038] 図 6は本発明の実施例を示す DNAノヽイブリダィゼーシヨンによる SGFETのゲート 電圧の時間変化を示す図である。ここで、 SGFETの V (V)〔ドレイン電圧〕は— 0.
DS
4V、 I ( μ Α)〔ドレイン電流〕は一 10 Aである。
DS
[0039] この図により、ダイヤモンド表面のゲート電圧力 プローブ DNAに相補的なターゲ ット DNAを滴下した時に正方向へシフトしていることが確認できる。これは DNAのハ イブリダィゼーシヨンにより負電荷を持つリン酸基の数が 2倍となり、チャネルに誘起さ れる正孔密度が上昇したことが原因と考えられる。非相補的なターゲット DNAではこ のような閾値電圧の変化は観察されない。この方法は、従来の DNAチップでは困難 だったリアルタイムにおけるハイブリダィゼーシヨンのラベルフリー検出であり、ダイヤ モンドの生体適合性とあいまって広範な臨床応用が実現可能なセンサーとして期待 される。
[0040] 図 7は本発明の実施例を示すターゲット DNAの量を変化させた場合の閾値電圧 ( ゲート電圧)の特'性図である。
[0041] 図 7は、プローブ DNAと相補的な関係にある 1本鎖 DNAをターゲット DNAとして、 滴下した時点（60秒)力 一定ドレイン電流を維持した場合のゲート電圧の時間変化 を示しており、ハイブリダィゼーシヨンによって生じるゲート電圧の正方向のシフト量を
A G (V)としている。滴下したターゲット DNAの量が 1 Μ、 100ηΜ、 ΙΟηΜの場合 、それぞれ正方向に 38mV、 25mV、 4mVシフトしている。
[0042] 以下、具体的な実施例について説明する。
[0043] 液体電解質 (バッファ溶液)をゲートとして使用し、水素終端、酸素終端およびァミノ 終端が混在する多結晶または単結晶ダイヤモンド表面をチャネルとした pチャネル電 界効果トランジスタ（SGFET)を用意し、塩基配列が既知のプローブ DNAを 101Qcm _2以上の密度でダルタルアルデヒド（2価のアルデヒド）を介して、ダイヤモンド表面に 架橋結合により直接固定した。このプローブ DNAに対して相補的なターゲット DNA および非相補的ターゲット DNAを 10— 12Mから 10— 6Mの濃度でプローブ DNAが固定 された上記の SGFET上に滴下した。ドレイン電流一定の条件で、ゲート電圧のハイ ブリダィゼーシヨンによる実時間測定の結果、相補的なターゲット DNAにおいて、タ 一ゲット DNA濃度 ΙΟηΜでゲート電圧 4mV、 ΙΟΟηΜで 25mV、 1 μ Μで 38mV、そ れぞれ正方向へのシフトを観測できた。非相補的ターゲット DNAではこれらのシフト は全く検出されな力つた。
[0044] 上記したように、本発明の DNAセンサーは、 DNAのリアルタイム検出に好適であり 、ダイヤモンドチャネル表面の持つ生体適合性を利用して臨床応用が実現可能なデ バイスとして期待される。
[0045] 次に、バッファ (NaCl)溶液濃度の最適化について実験を行った。
図 8は、本発明の実施例を示すバッファ溶液濃度の最適化を図るための実験による デバイ距離 (デバイの遮蔽距離)を示す図である。横軸はダイヤモンド表面カゝらの距 離、縦軸はダイヤモンド表面電位を示している。
[0046] ハイブリダィゼーシヨン効率とリン酸 (DNA)の負電荷検出効率は二律背反（トレー ドオフ）の関係にある。つまり、ハイブリダィゼーシヨン効率は、ノ ッファ（NaCl)溶液 の濃度が濃い程負電荷同士の反発を遮蔽でき、効率が大となる。これに対して、リン 酸 (DNA)の負電荷検出効率は、ノ ッファ濃度が薄ぐデバイ距離が長い程大であり 、負電荷検出効率は大となる。
[0047] 図 8において、 21はダイヤモンド表面、 22は DNA(〜20塩基：〜 6nm)、バッファ 溶液な NaCl溶液であり、デバイ距離 κ _ 1〔nm〕は、
κ _ 1 = 0. 304/ (NaCl)
ここで、ノ ッファ溶液中のイオン種は NaClであり、 NaCl濃度による DNA検出可能 距離を表 1に示す。
[表 1]
Figure imgf000011_0001
[0048] ( 1)バッファ溶液が 20sscの場合、 NaCl濃度が 3M、デバイ距離は 0. 18nm、 (2) ノ ッファ溶液が 2ssc〔上記（1)のバッファ溶液の 1Z10〕の場合、 NaCl濃度が 0. 3M 、デバイ距離は 0. 56nm、（3)バッファ溶液が lssc〔上記（1)のバッファ溶液の 1/2 0〕の場合、 NaCl濃度が 0. 15M、デバイ距離は 0. 78nm、（4) 1 OmMの燐酸バッフ ァ溶液（phosphate buffer solution； PBS)の場合、 NaCl濃度が 0. 01M、デバ ィ距離は 3. 04nmとなる。
[0049] このことから明らかなように、上記（2)のバッファ溶液が 2sscの場合、 NaCl濃度が 0 . 3M、デバイ距離は 0. 56nmであり、 DNAノヽイブリダィゼーシヨンの最適化が図ら れているが、デバイ距離が短い。上記（3)のバッファ溶液の場合は、デバイ距離が少 し長くなり、ハイブリダィゼーシヨン効率は依然高いのでリアルタイム測定に適してい る。上記 (4)のバッファ溶液の場合は静特性 (FET特性)測定の場合に使用して!/、る
[0050] なお、ここでは、リンカ一を短くし、ダルタルアルデヒド（GA)を使用した。短! ヽリンカ 一は、デバィ長内に DNAのリン酸基を多く収めるのに有利である。また、ハイブリダ ィゼーシヨンはバッファ溶液温度に敏感であり、 59°Cが最適温度である。しかし、ここ ではバッファ溶液温度を 40°Cに設定し、ノ、イブリダィゼーシヨンの効率を下げること で、 1塩基及び 3塩基ミスマッチ 'ターゲット DNAを分離検出した。さらに、バッファ溶 液温度を 25°Cまで低下させることで、 3塩基ミスマッチと 1塩基ミスマッチは図 9に示 すように分離される。 なお、図 9において、 I (ドレイン一ソース間電流）は一 10 A、V (ドレイン一ソー
DS DS
ス間電圧）は 0. IV、ターゲット固定時間は 1時間であり、横軸は温度〔で〕、縦軸 はゲートとソース間の Δν (シフト電位）〔mV〕を示している。
[0051] 以上から、本発明と従来技術との性能比較をすると、ノ ッファ溶液の設定温度をノ、 イブリダィゼーシヨンに最適な 59°C力も 40°C、さらに 25°Cに下げ、ハイブリダィゼー シヨン効率を下げることで、 1塩基及び 3塩基ミスマッチ 'ターゲット DNAの誤った（不 完全な)ハイブリダィゼーシヨンを抑制し、 1塩基及び 3塩基ミスマッチの分離検出に 成功した。従来の SilSFET系ではここまで高感度での測定例はな 、。
[0052] また、本発明は、大量生産による素子の低価格ィ匕により、大量消費型センサーとし て、医療分野にとどまらず食品検査、環境計測等としての用途も広がると期待される 。したがって、経済的、社会的影響力の極めて高いものである。
[0053] なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなぐ本発明の趣旨に基づき種 々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
[0054] 本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
[0055] (l) DNAセンサーにおいて、ハイブリダィゼーシヨンの検出感度を向上させ、未知 の DNAの同定を行うことができる。
[0056] (2)迅速、かつ的確な DNAのリアルタイム検出が可能である。
[0057] より詳細には、本発明は、ダイヤモンドにおいて可能となりつつある高感度 DNA固 定化技術および SGFETの微細化により、従来型の半導体バイオセンサーや蛍光標 識による光検出型バイオセンサーよりも高感度検出が期待されるものである。この DN Aセンサーを用いることで、測定試料の微量ィ匕が可能なことから、臨床検査室におけ る日常検査ならびに緊急検査に使用することができる。さらに他の機能も含めた集積 化ナノデバイスシステムに適した電荷 ·電位検出型デバイスを実現可能である。 産業上の利用可能性
[0058] 本発明の DNAセンサーは、 DNAのリアルタイム検出に好適であり、ダイヤモンドチ ャネル表面の持つ生体適合性を利用して臨床応用が実現可能なデバイスとして利 用可能である。
[0059] また、大量生産による素子の低価格ィ匕により、大量消費型センサーとして、医療分 野にとどまらず食品検査、環境計測等としての用途も広がると期待される。したがって 、経済的、社会的影響力の極めて高いものである。
さらに、将来的には炭素の生体適合性から、体内埋め込みセンサーとしての応用も 可能である。

Claims

請求の範囲
[1] (a)液体電解質力 なるゲートと、少なくとも水素終端表面およびアミノ終端としての アミノ基またはァミノ基のある分子で終端された表面が混合されたダイヤモンド表面を チャネルとする pチャネル電界効果トランジスタと、
(b)前記ダイヤモンド表面のァミノ終端にリンカ一によつて直接固定される塩基配列 が既知の 1本鎖 DNAからなるプローブ DNAと、
(c)前記ダイヤモンド表面に滴下される未知の 1本鎖 DNAからなるターゲット DNAと をセットし、
(d)前記ターゲット DNAが前記プローブ DNAと相補的な関係にある場合に、前記 1 本鎖 DNAからなるプローブ DNA及びターゲット DNAのハイブリダィゼーシヨンによ り生成される 2本鎖 DNAのリン酸基の負の電荷が 2倍となり、正孔が誘起され、前記 pチャネル電界効果トランジスタの閾値電圧が正方向へシフトすることを利用し、該閾 値電圧の正方向へシフトを検出することにより、前記ターゲット DNAが前記プローブ DNAと相補的な関係にある力否かを同定することを特徴とする DNAセンサー。
[2] 請求項 1記載の DNAセンサーにおいて、前記ダイヤモンド表面に酸素終端表面を 含むことを特徴とする DNAセンサー。
[3] 請求項 1又は 2記載の DNAセンサーにおいて、前記リンカ一が 2乃至 3価のカルボ ン酸であることを特徴とする DNAセンサー。
[4] 請求項 1又は 2記載の DNAセンサーにおいて、前記リンカ一が 2乃至 3価のアルデ ヒドであることを特徴とする DNAセンサー。
[5] 請求項 1、 2、 3又は 4記載の DNAセンサーにおいて、前記プローブ DNAの密度 が 101Qcm 2以上、前記ターゲット DNAの濃度が 10— 12Mから 10— 6Mであることを特徴 とする DNAセンサー。
[6] 請求項 1、 2、 3又は 4記載の DNAセンサーにおいて、前記閾値電圧の正方向への シフト差を一定ドレイン電流条件下でのゲート電圧変化として検出することを特徴と する DNAセンサー。
[7] 請求項 1、 2、 3又は 4記載の DNAセンサーにおいて、前記閾値電圧の正方向への シフト差を一定ゲート電圧条件下でのドレイン電流変化として検出することを特徴と する DNAセンサー。
[8] 請求項 1、 2、 3又は 4記載の DNAセンサーにおいて、前記閾値電圧の正方向への シフト差を一定ドレイン電圧条件下でのドレイン電流変化として検出することを特徴と する DNAセンサー。
[9] 請求項 1記載の DNAセンサーにおいて、前記ノ、イブリダィゼーシヨンにおける前記 液体電解質力もなるノ ッファ溶液温度を最適な温度である 59°Cにすることを特徴と する DNAセンサー。
[10] 請求項 2記載の DNAセンサーにおいて、前記ノ、イブリダィゼーシヨンにおける前記 液体電解質力もなるノ ッファ溶液温度を最適な温度である 59°Cにすることを特徴と する DNAセンサー。
[11] 請求項 1記載の DNAセンサーにおいて、前記バッファ溶液の NaCl濃度が 0. 3M
-0. 01M、デバイ距離が 0. 56nm— 3. 04nmであることを特徴とする DNAセンサ
[12] 請求項 2記載の DNAセンサーにおいて、前記バッファ溶液の NaCl濃度が 0. 3M
-0. 01M、デバイ距離が 0. 56nm— 3. 04nmであることを特徴とする DNAセンサ
[13] 請求項 9又は 10記載の DNAセンサーにおいて、前記バッファ溶液温度を 59°Cか ら 40°C、さらに 25°Cに下げて、 1塩基及び 3塩基ミスマッチ 'ターゲット DNAの分離 検出を可能にすることを特徴とする DNAセンサー。
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