JP4523001B2 - Dnaセンサーおよびそれを用いた測定方法 - Google Patents
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Description
(1)蛍光検出方式
この蛍光検出方式とは、塩基配列がわかった1本鎖DNA(プローブDNA)をガラス基板、シリコン、ダイヤモンド等に固定し、未知の1本鎖DNA(ターゲットDNA)とのハイブリダイゼーション(互いに相補的な1本鎖DNA同士が結合して2本鎖DNAになる現象)を、ターゲットDNAに固定した蛍光物質で検出するものである。しかしながらこの方式では、蛍光の有無によりハイブリダイゼーションを検出するため、装置が大規模になるという問題があった。また、観測手段が蛍光顕微鏡であるため高密度化には限界がある。
この電荷検出方式とは、シリコンのISFET(イオン感応性電界効果トランジスタ)を基本とする。しかしながら、DNAのハイブリダイゼーションによる電荷の倍増を検知するには、シリコンISFETは感度が低い。
(3)本願発明者が提案した、オゾン処理による高い閾値電圧を有する特性の良好なpチャネル電界効果トランジスタ
このトランジスタは、液体電解質をゲートとして使用し、オゾン処理により水素終端表面を酸化し、水素終端と酸素終端が混在したダイヤモンド表面をチャネルとしてなるpチャネル電界効果トランジスタである〔下記特許文献1参照〕。
〔1〕DNAセンサーにおいて、液体電解質からなるゲートと、少なくとも水素終端表面およびアミノ終端としてのアミノ基またはアミノ基のある分子で終端された表面が混在するダイヤモンド表面をチャネルとするpチャネル電界効果トランジスタと、前記ダイヤモンド表面のアミノ終端にリンカーによって直接固定される塩基配列が既知の1本鎖DNAからなるプローブDNAと、前記ダイヤモンド表面に滴下され、セットされる未知の1本鎖DNAとかなるターゲットDNAと、前記ターゲットDNAが前記プローブDNAと相補的な関係にある場合に、前記1本鎖DNAからなるプローブDNA及びターゲットDNAのハイブリダイゼーションにより生成される2本鎖DNAに起因して、前記pチャネル電界効果トランジスタの閾値電圧の正方向へのシフトを検出することにより、前記ターゲットDNAが前記プローブDNAと相補的な関係にあるか否かを同定する手段を具備することを特徴とする。
〔3〕上記〔1〕又は〔2〕記載のDNAセンサーにおいて、前記リンカーが2乃至3価のカルボン酸であることを特徴とする。
〔4〕上記〔1〕又は〔2〕記載のDNAセンサーにおいて、前記リンカーが2乃至3価のアルデヒドであることを特徴とする。
〔6〕上記〔1〕、〔2〕、〔3〕又は〔4〕記載のDNAセンサーにおいて、前記閾値電圧の正方向へのシフト差を一定ドレイン電流条件下でのゲート電圧変化として検出することを特徴とする。
〔8〕上記〔1〕、〔2〕、〔3〕又は〔4〕記載のDNAセンサーにおいて、前記閾値電圧の正方向へのシフト差を一定ドレイン電圧条件下でのドレイン電流変化として検出することを特徴とする。
(1)DNAセンサーにおいて、ハイブリダイゼーションの検出感度を向上させ、未知のDNAの同定を行うことができる。
(2)迅速、かつ的確なDNAのリアルタイム検出が可能である。
より詳細には、本発明は、ダイヤモンドにおいて可能となりつつある高感度DNA固定化技術およびSGFETの微細化により、従来型の半導体バイオセンサーや蛍光標識による光検出型バイオセンサーよりも高感度検出が期待されるものである。このDNAセンサーを用いることで、測定試料の微量化が可能なことから、臨床検査室における日常検査ならびに緊急検査に使用することができる。さらに他の機能も含めた集積化ナノデバイスシステムに適した電荷・電位検出型デバイスを実現可能である。
DNAはリン酸基に由来する負電荷を持っているが、ハイブリダイゼーションを行うことによりその負電荷は約2倍になる。本発明は、その負電荷の顕著な変化を、SGFETのダイヤモンドチャネル表面にDNAを固定することにより、チャネル表面に励起される正孔の数が増加する度合を検出して、DNAの同定を可能にする。
図1は本発明にかかるSGFETの断面図、図2は本発明の実施例を示す1本鎖DNAによる負電荷の発生状態を示すチャネル部の模式図、図3は本発明の実施例を示す2本鎖DNAによる負電荷の発生状態を示すチャネル部の模式図、図4はSGFET特性の変化(その1)を示す図、図5はそのSGFET特性の変化(その2)を示す図である。
(2)次に、図2に示すように、上記したダイヤモンド表面2のpチャネル5上のアミノ終端に、塩基配列が既知の1本鎖DNAからなるプローブDNA11を、リンカー〔例えば、2乃至3価のカルボン酸(コハク酸、フタル酸)や2乃至3価のアルデヒド(グルタルアルデヒド)〕を介して架橋作用により共有結合的に直接固定する。このとき、プローブDNA11は、1010cm-2以上の高密度で固定する。
また、上記したリンカーとしては、例えば、酸又は酸の化合物を用いるが、2乃至3価のカルボン酸(COOH基がある)や2乃至3価のアルデヒド(COH基)が好適である。
このようにして、pチャネル電界効果トランジスタの閾値電圧の正方向へのシフトの有無を検出することにより、ハイブリダイゼーションの有無、すなわち、未知のターゲットDNAが前記プローブDNAと相補的な関係にあるか否かが同定できる。
図6は本発明の実施例を示すDNAハイブリダイゼーションによるSGFETのゲート電圧の時間変化を示す図である。ここで、SGFETのVDS(V)〔ドレイン電圧〕は−0.4V、IDS(μA)〔ドレイン電流〕は−10μAである。
図7は、プローブDNAと相補的な関係にある1本鎖DNAをターゲットDNAとして、滴下した時点(60秒)から一定ドレイン電流を維持した場合のゲート電圧の時間変化を示しており、ハイブリダイゼーションによって生じるゲート電圧の正方向のシフト量をΔG(V)としている。滴下したターゲットDNAの量が1μM、100nM、10nMの場合、それぞれ正方向に38mV、25mV、4mVシフトしている。
液体電解質(バッファ液)をゲートとして使用し、水素終端およびアミノ終端が混在する多結晶または単結晶ダイヤモンド表面をチャネルとしたpチャネル電界効果トランジスタ(SGFET)を用意し、塩基配列が既知のプローブDNAを1010cm-2以上の密度でグルタルアルデヒド(2価のアルデヒド)を介して、ダイヤモンド表面に架橋結合により直接固定した。このプローブDNAに対して相補的なターゲットDNAおよび非相補的ターゲットDNAを10-12 Mから10-6Mの濃度でプローブDNAが固定された上記SGFET上に滴下した。ドレイン電流一定の条件で、ゲート電圧のハイブリダイゼーションによる実時間測定の結果、相補的なターゲットDNAにおいて、ターゲットDNA濃度10nMでゲート電圧4mV、100nMで25mV、1μMで38mV、それぞれ正方向へのシフトを観測できた。一方、非相補的ターゲットDNAではこれらのシフトは全く検出されなかった。
次に、バッファ(NaCl)溶液濃度の最適化について実験を行った。
図8は、本発明の実施例を示すバッファ溶液濃度の最適化を図るための実験によるデバイ距離(デバイの遮蔽距離)を示す図である。横軸はダイヤモンド表面からの距離、縦軸はダイヤモンド表面電位を示している。
κ-1=0.304/(√(NaCl)
ここで、バッファ溶液中のイオン種はNaClであり、NaCl濃度によるDNAの検出可能距離を表1に示す。
以上から、本発明と従来技術との性能比較をすると、バッファ溶液の設定温度をハイブリダイゼーションに最適な59℃から40℃、さらに25℃に下げ、ハイブリダイゼーション効率を下げることで、1塩基及び3塩基ミスマッチ・ターゲットDNAの誤った(不完全な)ハイブリダイゼーションを抑制し、1塩基及び3塩基ミスマッチの分離検出に成功した。従来のSiISFET系ではここまで高感度での測定例はない。
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
また、大量生産による素子の低価格化により、大量消費型センサーとして、医療分野にとどまらず食品検査、環境計測等としての用途も広がると期待される。したがって、経済的、社会的影響力の極めて高いものである。
Claims (9)
- (a)液体電解質からなるゲートと、少なくとも水素終端表面およびアミノ終端としてのアミノ基またはアミノ基のある分子で終端された表面が混在するダイヤモンド表面をチャネルとするpチャネル電界効果トランジスタと、
(b)前記ダイヤモンド表面のアミノ終端にリンカーによって直接固定される塩基配列が既知の1本鎖DNAからなるプローブDNAと、
(c)前記ダイヤモンド表面に滴下され、セットされる未知の1本鎖DNAとかなるターゲットDNAと、
(d)前記ターゲットDNAが前記プローブDNAと相補的な関係にある場合に、前記1本鎖DNAからなるプローブDNA及びターゲットDNAのハイブリダイゼーションにより生成される2本鎖DNAに起因して、前記pチャネル電界効果トランジスタの閾値電圧の正方向へのシフトを検出することにより、前記ターゲットDNAが前記プローブDNAと相補的な関係にあるか否かを同定する手段を具備することを特徴とするDNAセンサー。 - 請求項1記載のDNAセンサーにおいて、前記ダイヤモンド表面に酸素終端表面を含むことを特徴とするDNAセンサー。
- 請求項1又は2記載のDNAセンサーにおいて、前記リンカーが2乃至3価のカルボン酸であることを特徴とするDNAセンサー。
- 請求項1又は2記載のDNAセンサーにおいて、前記リンカーが2乃至3価のアルデヒドであることを特徴とするDNAセンサー。
- 請求項1、2、3又は4記載のDNAセンサーにおいて、前記プローブDNAの密度が1010cm-2以上、前記ターゲットDNAの濃度が10-12 Mから10-6Mであることを特徴とするDNAセンサー。
- 請求項1、2、3又は4記載のDNAセンサーにおいて、前記閾値電圧の正方向へのシフト差を一定ドレイン電流条件下でのゲート電圧変化として検出することを特徴とするDNAセンサー。
- 請求項1、2、3又は4記載のDNAセンサーにおいて、前記閾値電圧の正方向へのシフト差を一定ゲート電圧条件下でのドレイン電流変化として検出することを特徴とするDNAセンサー。
- 請求項1、2、3又は4記載のDNAセンサーにおいて、前記閾値電圧の正方向へのシフト差を一定ドレイン電圧条件下でのドレイン電流変化として検出することを特徴とするDNAセンサー。
- (a)液体電解質からなるゲートと、少なくとも水素終端表面およびアミノ終端としてのアミノ基またはアミノ基のある分子で終端された表面が混在するダイヤモンド表面をチャネルとするpチャネル電界効果トランジスタを用意し、
(b)前記ダイヤモンド表面のアミノ終端に塩基配列が既知の1本鎖DNAからなるプローブDNAをリンカーによって直接固定し、
(c)前記ダイヤモンド表面に滴下される未知の1本鎖DNAからなるターゲットDNAをセットし、
(d)前記ターゲットDNAが前記プローブDNAと相補的な関係にある場合に、前記1本鎖DNAからなるプローブDNA及びターゲットDNAのハイブリダイゼーションにより生成される2本鎖DNAに起因して、前記pチャネル電界効果トランジスタの閾値電圧の正方向へのシフトを検出することにより、前記ターゲットDNAが前記プローブDNAと相補的な関係にあるか否かを同定することを特徴とするDNAセンサーを用いた測定方法。
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