JP6081071B2 - 核酸検出用デバイス - Google Patents

Description

本発明の実施形態は、核酸の増幅から検出までを同一デバイス内で行うための核酸検出用デバイスに関する。

近年の遺伝子工学の発展に伴い、医療分野では、遺伝子による病気の診断或いは予防が可能となりつつある。これは遺伝子診断と呼ばれ、病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥、変化を検出することで病気の発症前もしくは極めて初期段階での病気の診断や予測をすることが出来る。また、ヒトゲノムの解読とともに、遺伝子型と疫病との関連に関する研究が進み、各個人の遺伝子型に合わせた治療（テーラーメイド医療）も現実化しつつある。従って、遺伝子の検出並びに遺伝子型の決定を簡便に行うことは非常に重要となっている。

核酸検出を行うデバイスの１つとして、ＤＮＡチップが挙げられる。ＤＮＡチップとは、基板上に複数の核酸プローブが固定化されているデバイスであり、一度に多数の核酸配列を検出できることを特徴とする。

核酸プローブの固定化領域には様々な形態があるが、電極などのセンサ上に核酸プローブを固定化し、当該センサからの検出信号を配線によって引き出し、外部から検出する方法がある。

このような形態の場合、センサ部分や外部との接触部分以外の領域は保護膜（パシベーション膜）と呼ばれる膜によって覆われている。これは半導体技術を応用したものであり、保護膜は、得られる検出信号を配線部分等からのノイズや、汚染等から保護する。

一方、１つのデバイス内において、複数の試薬が関わる複数の反応を順次行うことのできるμ−ＴＡＳと呼ばれるデバイスが盛んに研究開発されている。このようなデバイスは、試薬保持領域、反応領域、センサ領域などから成り、それらをつなぐ流路を備える。これを応用し、核酸を検出するための検出装置も開発されている。核酸検出を行う場合、複数の試薬を使用し、複数の反応を行う必要がある。複数の反応は、核酸抽出反応、核酸精製反応、核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション反応、ハイブリダイゼーションの有無検出などである。これらの反応のうち、核酸増幅反応はＰＣＲ法やＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などがあるが、いずれも増幅温度や試薬の組成に大きな影響を受けるだけでなく、不純物が混入した場合、増幅阻害が起こりやすいという特徴を持つため、反応容器の材質や清浄性が非常に重要となる。

上記ＤＮＡチップのような核酸検出デバイスは様々な構成のものがあるが、前述のように複数の反応を別々な反応容器で行う場合、試薬や検査時間のロスが大きい。そこで、核酸増幅反応と核酸ハイブリダイゼーション反応を同一反応容器内で行うことができる核酸検出デバイスが開発されている。

特許第４１２７６７９号公報 特開２００８−２６３９５９号公報

しかしながら、上述のとおり、核酸増幅反応は不純物の混入により増幅阻害が発生する。核酸検出用デバイスの保護膜からの溶出成分が核酸増幅を強く阻害し、感度の低下を招いていることが明らかとなっている。そのため、核酸検出用デバイスは、保護膜からの不純物の溶出量を低減させ、感度を向上させることが求められている。

本発明の目的は、核酸増幅反応の阻害を低減させる核酸検出用デバイスを提供することにある。

実施例によれば、核酸検出デバイスは、基板と、核酸サンプルを流通させるための流路型反応部を前記基板上に定める部材と、前記流路型反応部内の前記基板上に形成された複数のセンサ部であって、その夫々に標的となる核酸を検出するための各種核酸プローブが固定化されているセンサ部と、前記基板上に形成され、前記センサ部と接続された配線と、前記基板上に形成された保護膜と、を備え、
前記流路型反応部内で核酸増幅反応を行った後に、前記センサ部上の核酸プローブによって核酸増幅産物の検出を行う核酸検出用デバイスにおいて、前記保護膜は、前記基板上における前記核酸サンプルの接液領域において、前記基板の一部及び前記センサ部を露出させる１以上の開口を備える。

第１の実施形態に係る核酸検出用デバイスの作成手順を示す図。 第１の実施形態に係る核酸検出用デバイスの概略構成を示す断面図。 第１の実施形態に係る核酸検出用デバイスの概略構成を示す図。 第１の実施形態に係る核酸検出用デバイスの表面における反応領域近傍の拡大図。 第1の実施形態に係る核酸検出用デバイス内蔵カセットの概略構成を示す図。 第1の実施形態に係る核酸検出用デバイスと反応部規定用部材の対向配置を示す図。 第２の実施形態に係る核酸検出用デバイスの表面における反応領域近傍の拡大図。 第３の実施形態に係る核酸検出用デバイスの表面における反応領域近傍の拡大図。 第４の実施形態に係る核酸検出用デバイスの表面における反応領域近傍の拡大図。 実施例１に係る核酸増幅反応の結果を示すグラフ。 実施例２に係る核酸検出用デバイスの表面における反応領域近傍の拡大図。 実施例２に係る各電極から得られた結果を示すグラフ。 実施例３に係る核酸検出用デバイスの表面における反応領域近傍の拡大図。 実施例３に係る各電極から得られた結果を示すグラフ。

以下に、図面を参照しながら、種々の実施形態について説明する。なお、実施形態を通して共通の構成には同一の符号を付すものとし、重複する説明は省略する。また、各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際の装置と異なる個所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。

（第１の実施形態）
図１は、第１の実施形態に係る核酸検出用デバイス（ＤＮＡチップ）１００の１例となる作成手順を示す図である。核酸検出用デバイス１００は、図１の（ａ）〜（ｅ）の順で各構成要素を積層することで構成される。図２は、第１の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００の１例となる概略構成を示す積層方向の断面図である。図３は、第１の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００の１例となる概略構成を示す図である。

核酸検出用デバイス１００は、基板１０、センサ部１１、パッド１２、配線１３．保護膜１４を備える。基板１０は、図２（ａ）に示すように、薄い板状部材である。基板１０は、ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリイミド、ＡＢＳ、金属などで構成されるが、特に限定されない。

センサ部１１は、図２（ｂ）に示すように、基板１０の表面上に形成されている。センサ部１１は、導電性部材で構成された電極である。センサ部１１は、基板１０の一端側に複数設けられている。センサ部１１は、標的となる核酸を検出するための各種核酸プローブがそれぞれ固定化され、標的となる核酸を検出する。なお、１つのセンサ部１１は、１以上のセンサで構成されている。

パッド部１２は、図１（ｃ）に示すように、基板１０の表面上に形成されている。パッド部１２は、導電性部材で構成されている。パッド部１２は、基板１０の他端側に複数設けられている。パッド部１２は、後述する配線１３を介してセンサ部１１の検出信号を検出装置（図示せず）に伝達するためのものである。
配線１３は、図１（ｄ）に示すように、基板１０の表面上に形成されている。配線１３は、導電性部材で構成されている。配線１３は、センサ部１１とパッド部１２とを接続する。配線１３はスルーホールなどを利用した多層構造により立体配線となっている場合もある。配線１３は、各センサ部１１による検出信号を取り出し、パッド部１２に送るためのものである。保護膜１４は、図１（ｅ）に示すように、基板１０の表面上に形成されている。

保護膜１４は、有機系材料で構成された保護膜である。保護膜１４は、例えば、疎水性が高い材料で構成されている。一般的に保護膜は、有機系の保護膜と無機系の保護膜に分類される。無機系の保護膜は、不純物の溶出が少ないことが知られているが、高コストである。そのため、第１の実施形態で使用されている保護膜１４は、有機系の保護膜である。基板１０の表面上における保護膜１４の形状については、後述する。保護膜１４は、配線１３等からの検出信号へのノイズの混入や他配線への信号のリークを防ぎ、核酸検出用デバイス１００の汚染等からも保護するために用いられる。上述の手順により、核酸検出用デバイス１００は、図２に示すように、各構成要素を積層されて構成される。第１の実施形態に係る核酸検出デバイス１００は、センサ部１１と核酸サンプルが反応するための後述する流路型反応部（チャンバ）２０１内で核酸増幅反応を行った後に、センサ部１１によって核酸増幅産物の検出を行うために用いられる。なお、第１の実施形態では、核酸検出用デバイス１００の積層方向における保護膜１４側の最外面を核酸検出用デバイス１００の表面というものとする。

上述のように構成された核酸検出用デバイス１００の表面は、図３に示すように、主として、センサ領域２０、配線領域２１、パッド領域２２、反応領域２３に大別できる。
センサ領域２０は、センサ部１１が形成されている領域である。配線領域２１は、配線１３が形成されている領域である。パッド領域２２は、パッド部１２が形成されている領域である。反応領域２３は、核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション反応などが行なわれる領域である。

ここで、反応領域２３について説明する。核酸検出用デバイス１００は、図２（ｂ）に示すように、核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション反応などに用いられる際、保護膜１４上に後述する反応部規定用部材２００が対向するように配置される。センサ部１１及びセンサ部１１近傍は、反応部規定用部材２００に設けられた後述する流路型反応部２０１と対向する。第１の実施形態では、反応領域２３とは、核酸検出用デバイス１００の表面において、流路型反応部２０１と対向する領域をいう。したがって、反応領域２３は、センサ領域２０を包含している。また、反応領域２３は、センサ部１１近傍の配線１３を含んでいる。なお、反応領域２３は、基板１０上における核酸増幅反応を行うための反応溶液（核酸サンプル）が接液する接液領域でもある。核酸検出用デバイス１００の表面における反応領域２３は、流路型反応部２０１の形状によって規定されている。

次に、核酸検出用デバイス１００の表面における保護膜１４の形状について説明する。保護膜１４は、図２に示すように、配線領域２１では、配線１３が露出しないように配線１３を覆う。保護膜１４は、図２に示すように、パッド領域２２では、各パッド部１２が検出装置（図示せず）と接触するように、各パッド部１２の少なくとも一部が露出するように、基板１０上に設けられている。つまり、保護膜１４は、反応領域２３以外の領域では、各パッド部１２の少なくとも一部分を除いて、核酸検出用デバイス１００の表面を覆う。

次に、反応領域２３における保護膜１４の形状について説明する。図４は、第１の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００の表面における反応領域２３近傍の拡大図である。保護膜１４は、反応領域２３において、配線１３が露出しないように配線１３を覆う。一方、保護膜１４は、反応領域２３において、センサ部１１には設けられていない。保護膜１４は、反応領域２３において、少なくとも配線１３以外の部分では基板１０またはセンサ部１１を露出させる１以上の開口を備える。保護膜１４は、反応領域２３において、必要最低限の部分以外には設けられていない。なお、保護膜１４は、基板１０上であっても、配線１３と基板１０との境界部分近傍に設けられていても良い。

上述のように、第1の実施形態に係る保護膜１４は、反応領域２３において、基板１０の一部を含む下層部（基板１０またはセンサ部１１）を露出させる１以上の開口を備える。なお、保護膜１４は、１以上の開口を備える１枚の膜で核酸検出用デバイス１００の表面を覆うように構成されていても良い。また、保護膜１４は、複数枚の膜で核酸検出用デバイス１００の表面を覆うように構成され、複数枚の膜の組み合わせによって形成された１以上の開口を備える構成であっても良い。上述のような反応領域２３における保護膜１４の構成は、反応領域２３内で増幅反応が行われた際に、保護膜１４から溶出する不純物に起因する増幅阻害の影響を大幅に低減することができる。通常、核酸の検出は、核酸抽出反応、核酸精製反応、核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション反応、ハイブリダイゼーションの有無検出などから成るが、第１の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００は、核酸ハイブリダイゼーション反応だけでなく核酸増幅反応も、同一反応領域２３内で行うことが可能である。なお、反応領域２３であっても保護膜１４が配線１３を覆うのは、上述のように、配線１３が保護膜１４で覆われていないと、配線１３からノイズが混入するためである。

図５は、第１の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００を用いて、核酸増幅反応から核酸検出までを同一反応容器内で行うことができる核酸検出用デバイス内蔵カセット（送液カセット）１の一例となる概略構成を示す図である。なお、図５では、図の簡略化のため、基板１０に形成された配線１３及び保護膜１４の図示は省略している。図６は、反応部規定用部材（反応容器）２００が対向配置された核酸検出用デバイス１００を反応部規定用部材２００側から見た図である。なお、図６は、各センサ部１１が２つのセンサで構成されている例を示している。

核酸検出用デバイス内蔵カセット１は、図５に示すように、上述した核酸検出用デバイス１００、反応部規定用部材２００、第１のカセット３００、第２のカセット４００を備える。
反応部規定用部材２００は、図６に示すように、流路型反応部２０１を備える。流路型反応部２０１は、核酸検出用デバイス１００の表面と接する面に設けられた溝（流路）である。流路型反応部２０１は、核酸増幅反応から核酸検出までを同一反応容器内で行なうための各種溶液がサンプル注入口２０１ａから注入され、サンプル出口２０１ｂから排出される。流路型反応部２０１は、蛇行した流路形状で設けられているが、これに限定されない。流路型反応部２０１は、直線状で設けられていても、円形状で設けられていても、角型状で設けられていても良い。反応部規定用部材２００は、平板型であってもチューブ型であっても良い。

なお、核酸増幅用プライマーは、核酸サンプルと混合した後に流路型反応部２０１に注入させても良いし、流路型反応部２０１のいずれかの部位に予め保持させておいても良い。後者の場合、増幅対象毎に用意された複数のプライマセットは、流路型反応部２０１のそれぞれ別な場所に保持させておいても良いし、全て一箇所に保持させておいても良い。流路型反応部２０１における複数のプライマセットの保持方法は限定されない。例えば、複数のプライマセットは、熱や真空乾燥などの手法で乾燥保持させても良いし、液体の状態で保持させても良い。また、複数のプライマセットは、凍結させて保持させても良い。また、複数のプライマセットは、メンブレンなどの保持用担体に保持させても良い。

なお、流路型反応部２０１は、反応部規定用部材２０に形成されることで規定されているが、特に限定されない。流路型反応部２０１は、基板１０をエッチングするなどして形成されても良い。

第１のカセット３００、第２のカセット４００は、核酸検出用デバイス１００、反応部規定用部材２００を挟持する外枠である。第１のカセット３００、第２のカセット４００は、例えば硬質材料で構成される。なお、核酸検出用デバイス内蔵カセット１は、それぞれ別個の構成要素である核酸検出用デバイス１００、反応部規定用部材２００を第１のカセット３００、第２のカセット４００で挟み込むカセット構造であるが、特に限定されない。反応部規定用部材２００は、第２のカセット４００と一体で構成されていても良い。核酸検出用デバイス内蔵カセット１は、反応部規定用部材２００、第１のカセット３００、第２のカセット４００が一体で構成された容器型であって、これに核酸検出用デバイス１００を差し込むように構成されていても良い。

次に、比較例として、第１の実施形態と異なり、反応領域において、センサ部以外の部分（配線のみならず基板も含む）が有機系の保護膜で覆われた核酸検出用デバイスについて説明する。核酸ハイブリダイゼーション反応は、センサ部が形成されている反応領域内で行われる。そのため、通常、反応領域では、センサ部以外の部分は、保護膜で覆われている。しかしながら、保護膜は、僅かに溶出物（不純物）があることが一般的に知られている。通常、不純物は、核酸ハイブリダイゼーション反応には影響を与えることはない。しかし、核酸増幅反応は、非常に繊細な反応であり、不純物が含まれると容易に増幅阻害が起こってしまう。したがって、核酸増幅反応を核酸ハイブリダイゼーション反応と同一の反応領域で行う場合、反応領域に存在する保護膜からの溶出物のため、上述の増幅阻害が発生してしまうという問題が発生する。

第１の実施形態によれば、反応領域２３において保護膜１４の占める面積を低減させることで、保護膜１４からの不純物の溶出量を大きく低減でき、核酸増幅反応の阻害を低減できる。その結果、核酸検出デバイス１００の感度は向上する。

（第２の実施形態）
第２の実施形態について図面を参照し、詳細に説明する。なお、第１の実施形態で説明した構成と同一の構成については、同符号を付して説明を省略する。図７は、第２の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００における反応領域２３近傍の拡大図である。第２の実施形態は、反応領域２３における保護膜１４の形状が第１の実施形態と異なる。

保護膜１４は、反応領域２３において、第１の実施形態と同様に、配線１３が露出しないように配線１３を覆う。さらに、保護膜１４は、反応領域２３において、センサ部１１の外周部分（センサ部１１と基板１０との境界部分）が露出しないようにセンサ部１１の外周部分を覆う。言い換えると、保護膜１４は、センサ部１１の略中央部分が露出するような開口を備える。つまり、保護膜１４は、反応領域２３において、少なくとも配線１３及びセンサ部１１の外周部分以外の部分では、基板１０またはセンサ部１１を露出させる１以上の開口を備える。なお、保護膜１４は、基板１０上であっても、配線１３と基板１０との境界部分近傍に設けられていても良い。
上述のように、第２の実施形態に係る保護膜１４は、反応領域２３において、基板１０の一部を含む下層部（基板１０またはセンサ部１１）を露出させる１以上の開口を備える。

保護膜１４をセンサ部１１の外周部分に設けるのは、次のような理由による。センサ部１１からの検出信号は、センサ部１１の露出面積（保護膜１４で覆われていない接液面積）に比例する。そのため、各センサ部１１の露出面積は、一定であることが望ましい。各センサ部１１の略中央部分と対向する部分に開口が設けられた保護膜１４を基板１０上に設けることで、各センサ部１１の面積は、厳密に一定に規定できる。

第２の実施形態によれば、第１の実施形態と同様の効果を得られる。さらに、第２の実施形態によれば、各センサ部１１の露出面積（各センサ部１１が複数個のセンサで構成されている場合は、複数個のセンサの露出した面積の合算）が一定に規定されるため、核酸検出デバイス１００の感度がより向上する。

（第３の実施形態）
第３の実施形態について図面を参照し、詳細に説明する。なお、第１の実施形態で説明した構成と同一の構成については、同符号を付して説明を省略する。図８は、第３の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００における反応領域２３近傍の拡大図である。第３の実施形態は、反応領域２３における保護膜１４の形状が第１の実施形態と異なる。

保護膜１４は、反応領域２３において、配線１３が露出しないように、配線１３を覆う。また、保護膜１４は、反応領域２３において、各センサ部１１間の境界領域で基板１０上を覆う区切り形状を備える。ここで、各センサ部１１間の境界領域とは、反応領域２３における各センサ部１１間の略中央部分である。各センサ部１１間の境界領域に設けられた保護膜１４は、反応領域２３において、センサ部１１近傍に設けられた開口（露出する基板１０）と、隣接する別のセンサ部１１近傍に設けられた開口（露出する基板１０）とを区切る（分断する）ように、基板１０上を覆う。なお、各センサ部１１間の境界領域で基板１０上を覆う保護膜１０の形状は、特に限定されない。一方、保護膜１４は、反応領域２３において、センサ部１１には設けられていない。つまり、保護膜１４は、反応領域２３において、少なくとも配線１３及び各センサ部１１間の境界理領域以外の部分では、基板１０またはセンサ部１１を露出させる１以上の開口を備える。なお、保護膜１４は、基板１０上であっても、配線１３と基板１０との境界部分近傍に設けられていても良い。なお、保護膜１４は、第２の実施形態と同様に、センサ部１１の外周部分を覆うように設けられていても良い。
上述のように、第３の実施形態に係る保護膜１４は、反応領域２３において、基板１０の一部を含む下層部（基板１０またはセンサ部１１）を露出させる１以上の開口を備える。

各センサ部１１間の境界領域に保護膜１４を設けるのは、次のような理由による。各センサ部１１上には、標的となる核酸を検出するための各種核酸プローブがそれぞれ固定化される。製造時には、各核酸プローブを含む液体は、各センサ部１１上に滴下される。しかしながら、基板１０の親水性が高い場合、各センサ部１１間の境界領域に保護膜１４が設けられていないと、あるセンサ部１１に滴下された核酸プローブ溶液は、隣接するセンサ部１１に滴下された別の核酸プローブ溶液と接して混合する。一般的に有機系の保護膜は、親水性が低い。そのため、各センサ部１１間の境界領域に設けられた保護膜１４は、あるセンサ部１１に滴下された核酸プローブ溶液が隣接するセンサ部１１に滴下された別の核酸プローブ溶液と接することを防ぐことができる。

第３の実施形態によれば、第１の実施形態または第２の実施形態と同様の効果を得られる。さらに、第３の実施形態によれば、核酸検出用デバイス１００の製造時における各センサ部１４に対する核酸プローブの固定を正確かつ容易にすることができる。

（第４の実施形態）
第４の実施形態について図面を参照し、詳細に説明する。なお、第１の実施形態で説明した構成と同一の構成については、同符号を付して説明を省略する。図９は、第４の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００における反応領域２３近傍の拡大図である。第４の実施形態は、各センサ部１１間の境界領域における保護膜１４の形状が第３の実施形態と異なる。

保護膜１４は、反応領域２３において、配線１３が露出しないように配線１３を覆う。一方、保護膜１４は、反応領域２３において、センサ部１１には設けられていない。また、保護膜１４は、反応領域２３において、第3の実施形態と同様に、各センサ部１１間の境界領域で基板１０上を覆う区切り形状を備える。境界領域に設けられた保護膜１４は、反応領域２３において、センサ部１１近傍に設けられた開口（露出する基板１０）と、隣接する別のセンサ部１１近傍に設けられた開口（露出する基板１０）とを区切る（分断する）ように、基板１０上を覆う。

保護膜１４は、各センサ部１１間の境界領域において、センサ部１１の周囲を取り囲む形状で設けられている。一例として、保護膜１４は、センサ部１１近傍において、隣接する少なくとも一方のセンサ部１１側に対して、凸状の弧形状を備える開口を備える。したがって、センサ部１１近傍は基板１０が露出しているが、さらにその周囲は、保護膜１４で覆われている。

つまり、保護膜１４は、反応領域２３において、少なくとも配線１３及び境界理領域以外の部分では、基板１０またはセンサ部１１を露出させる１以上の開口を備える。なお、保護膜１４は、基板１０上であっても、配線１３と基板１０との境界部分近傍に設けられていても良い。なお、保護膜１４は、第２の実施形態と同様に、センサ部１１の外周部分を覆うように設けられていても良い。
上述のように、第４の実施形態に係る保護膜１４は、反応領域２３において、基板１０の一部を含む下層部（基板１０またはセンサ部１１）を露出させる１以上の開口を備える。

保護膜１４が各センサ部１１間の境界領域において、センサ部１１の周囲を取り囲む形状で設けられているのは、センサ部１１に滴下された核酸プローブを含む液体が必要以上に広がることを防ぐためである。

第４の実施形態によれば、第１の実施形態または第２の実施形態と同様の効果を得られる。さらに、第４の実施形態によれば、核酸検出用デバイス１００の製造時における各センサ部に対する核酸プローブの固定を正確かつ容易にすることができる。

（実施例１）
実施例１では、上記説明した第３の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００を実際に用いた核酸増幅反応について説明する。図１１は、第３の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００を用いた核酸増幅反応の結果と、比較例の核酸検出用デバイスを用いた核酸増幅反応の結果を比較して示す。なお、比較例の核酸検出用デバイスは、反応領域において、センサ１１以外の部分（配線のみならず基板も含む）が有機系の保護膜で覆われた構成である。図１１は、横軸に増幅時間、縦軸に増幅核酸量を示している。実施例１では、第３の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００と比較例の核酸検出用デバイスのそれぞれの反応領域に増幅反応試薬を注入し、注入後４０分、６０分の増幅を行った時点での増幅核酸量を定量した。比較例の核酸検出用デバイスでは、４０分では増幅量が低く、６０分でもまだ十分ではない。これに対して、第３の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００では、４０分の時点で十分量の増幅が得られている。この時点で増幅が飽和しているため、６０分での増幅核酸量は増加していない。

図１０に示す結果から、第３の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００の構成は、増幅阻害が大幅に低減されていることが明らかとなった。なお、第１、２、４の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００についても第３の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００と同様の構成を備えるため、上記同様の特性が得られる。

（実施例２）
実施例２では、上記説明した第３の実施形態に係る核酸検出用デバイス内蔵カセット１を実際に用いた核酸検出の使用例を具体的に説明する。図１１は、第３の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００における反応領域２３近傍の拡大図である。なお、実施例２では図１１に示す通り、センサ部１１は２個１組のセンサで構成される。核酸検出用デバイス１００は、センサ部１１毎（２個１組のセンサ毎）に異なる核酸を検出する。反応領域２３内の保護膜１４は、第３の実施形態で説明したように、配線１３を覆う部分と、各センサ部１１間の境界領域にのみ形成されている。反応領域２３内のその他の部分は、基板１０（実施例２ではガラスを使用）が露出している。

１．核酸検出用デバイス内蔵カセット１の準備
１−１．核酸検出用デバイス１００の準備
核酸検出用デバイス１００上の各電極（以降、各センサ部１１を構成するセンサに対応する）に、以下の表１に示す５種類の核酸プローブ（配列Ａ〜Ｅ）を固定化した。各核酸プローブを含む溶液を各電極組に滴下し、その後余分な核酸プローブを洗浄除去することによって固定化を行った。なお、下記１、２番電極組、３、４番電極組、５、６番電極組、７、８番電極組、９、１０番電極組は、それぞれ別のセンサ部１１を構成している。

１）ネガティブコントロール用・・・１、２番電極
２）遺伝子-Ａ検出用・・・３、４番電極
３）遺伝子-Ｂ検出用・・・５、６番電極
４）遺伝子-Ｃ検出用・・・７、８番電極
５）遺伝子-Ｄ検出用・・・９、１０番電極

１−２．核酸検出用デバイス内蔵カセット１の組立て
前記核酸検出用デバイス１００のセンサ部１１上に、反応領域２３を形成できる反応部規定用部材２００を取り付けた。反応部規定用部材２００にはサンプル注入口が形成されており、反応液が漏れ出さないよう核酸検出用デバイス１００に固定されている。反応部規定用部材２００内には、予め以下の表２に示すようなプライマセットを乾燥された状態で保持させた。増幅用プライマーは、ＬＡＭＰ法による増幅用に設計されたものである。

２．核酸の検出
２−１．鋳型溶液の準備
以下の表３に示すように遺伝子Ａ、Ｂ、Ｄの３種類の鋳型と、増幅用試薬を混合した鋳型溶液を準備した。

鋳型溶液には、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、リアクションミックスが含まれ、後述の鋳型溶液と合わせ総量が５０μＬとなるように蒸留水（即ち、ＤＷ）が添加されたものを使用した。プライマーＤＮＡ（セットＡ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ａと、プライマーＤＮＡ（セットＢ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ｂと、プライマーＤＮＡ（セットＤ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ｄ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ｄと、を含む。

鋳型Ａ、Ｂ、Ｄは、以下の表４に示す塩基配列を有する合成オリゴＤＮＡである。

２−２．鋳型溶液の添加
２−１にて準備した鋳型溶液を、反応領域に５０μＬ添加した。

２−３．核酸の反応
以下に示す条件にて、反応領域を加熱或いは冷却し、各種反応を行った。

核酸増幅反応：６４℃、６０分
ハイブリダイゼーション反応：５０℃、１０分
洗浄反応：３０℃、５分
電流検出用試薬（ヘキスト３３２５８）反応：２５℃、３分
２−４．核酸の検出
各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。上記一連の反応は、SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 266-270, 2008に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した。

３．結果
図１２は、各電極から得られた結果を示すグラフである。鋳型を添加した遺伝子Ａ、Ｂ、Ｄに対応するプローブＡ、Ｂ、Ｄを固定化した電極３、４、５、６、９、１０において、ネガティブコントロールよりも大きな電流値が得られた。一方、鋳型が添加されていない遺伝子Ｃに対応するプローブＣを固定化した電極７、８は、ネガティブコントロールと同程度の電流値となった。図１２に示す結果から、第３の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００を用いることで、鋳型を添加した遺伝子を確実に検出できたことが明らかとなった。

（実施例３）
実施例３では、上記説明した第４の実施形態に係る核酸検出用デバイス内蔵カセット１を実際に用いた核酸検出の使用例を具体的に説明する。図１３は、第４の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００における反応領域２３近傍の拡大図である。なお、実施例４では図１３に示す通り、センサ部１１は２個１組のセンサで構成される。核酸検出用デバイス１００は、センサ部１１毎（２個１組のセンサ毎）に異なる核酸を検出する。反応領域２３内の保護膜１４は、第４実施形態で説明したように、配線１３を覆う部分と、各センサ部１１間の境界領域と、各センサ部１１を構成する２個のセンサの外周部分にのみ形成されている。反応領域２３内のその他の部分は、基板１０（実施例２ではガラスを使用）が露出している。なお、核酸検出用デバイス１００を除く、検出に用いた材料および検出条件は、実施例２と同様である。なお、下記１、２番電極組、３、４番電極組、５、６番電極組、７、８番電極組、９、１０番電極組は、それぞれ別のセンサ部１１を構成している。

結果
図１４は、各電極から得られた結果を示すグラフである。鋳型を添加した遺伝子Ａ、Ｂ、Ｄに対応するプローブＡ、Ｂ、Ｄを固定化した電極３、４、５、６、９、１０において、ネガティブコントロールよりも大きな電流値が得られた。一方、鋳型が添加されていない遺伝子Ｃに対応するプローブCを固定化した電極７、８は、ネガティブコントロールと同程度の電流値となった。図１４に示す結果から、第４の実施形態に係る核酸検出用デバイス１００を用いることで、鋳型を添加した遺伝子を確実に検出できたことが明らかとなった。

本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。

１…核酸検出用デバイス内蔵カセット、１０…基板、１１…センサ部、１２…パッド、１３…配線．１４…保護膜、２０…センサ領域、２１…配線領域、２２…パッド領域、２３…反応領域、１００…核酸検出用デバイス、２００…反応部規定用部材、２０１…流路型反応部、３００…第１のカセット、４００…第２のカセット。

Claims (5)

1. 基板と、
   核酸サンプルを流通させるための流路型反応部を前記基板上に定める部材と、
   前記流路型反応部内の前記基板上に形成された複数のセンサ部であって、その夫々に標的となる核酸を検出するための各種核酸プローブが固定化されているセンサ部と、
   前記基板上に形成され、前記センサ部と接続された配線と、
   前記基板上に形成された保護膜と、
   を備え、
   前記流路型反応部内で核酸増幅反応を行った後に、前記センサ部上の核酸プローブによって核酸増幅産物の検出を行う核酸検出用デバイスにおいて、
   前記保護膜は、前記基板上における前記核酸サンプルの接液領域において、前記基板の一部及び前記センサ部を露出させる１以上の開口を備える、
   核酸検出用デバイス。
2. 前記センサ部は、電極である、請求項１記載の核酸検出用デバイス。
3. 前記保護膜は、前記接液領域において前記配線を覆う、請求項１記載の核酸検出用デバイス。
4. 前記保護膜は、前記センサ部の外周部分を覆う、請求項３記載の核酸検出用デバイス。
5. 前記保護膜は、前記接液領域において、前記センサ部近傍に設けられた開口と、前記センサ部と隣接する別のセンサ部近傍に設けられた開口とを区切るように前記基板を覆う、請求項１記載の核酸検出用デバイス。

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