JP6616937B2 - 塩基配列検出チップ - Google Patents

Description

本発明の実施形態は、塩基配列検出チップに関する。

電流検出型ＤＮＡ配列検出チップが知られている。この電流検出型ＤＮＡ配列検出チップは、基板上に設けられた複数の電極上に既知の塩基配列を有するＤＮＡプローブが少なくとも１個配置された構成を有している。異なる電極上には異なる塩基配列のＤＮＡプローブが配置される。

ＤＮＡ配列の検出は、ＤＮＡ配列検出チップの電極上に形成される検出流路に挿入剤を含む試薬を流すことにより行われる。この試薬を流したときに、電極上に気泡が存在すると、正確な電流検出を行うことができず、ＤＮＡ配列を正確に検出することが難しい。

特許第４７２９０３０号公報

本実施形態は、電極上の流路に気泡が送られることを抑制することのできる塩基配列検出チップを提供する。

本実施形態による塩基配列検出チップは、基板上に互いに離間して配列された複数の電極群であって、各電極群は離間して配置された複数の第１電極を有する、複数の電極群と、各第１電極に対応して設けられ、対応する第１電極に固定され、塩基配列を有するプローブと、前記複数の電極群の配列方向に沿って前記複数の電極群を覆うように前記基板上に設けられ、前記基板とともに流路を形成するカバー部材であって、試薬が流入する入口と、前記流路を通過した前記試薬が流出する出口と、を有するカバー部材と、を備え、前記入口に最近接した第１電極は前記入口から前記流路の幅の２．０倍以上離れた位置に設けられている。

図１（ａ）乃至（ｃ）は、ＤＮＡプローブと検査するＤＮＡが相補的であることを説明する図。 図２（ａ）乃至２（ｄ）は塩基配列検出チップを説明する図。 図３（ａ）、３（ｂ）は塩基配列検出チップから検出される酸化電流の測定結果の一例を示す波形図。 三電極法を用いて電流検出を行う塩基配列検出チップの断面図。 塩基配列検出チップの電流検出系の一例を示す図。 第１実施形態による塩基配列検出チップを示す平面図。 気泡ができる要因を説明する図。 流路幅と気泡の到達位置との関係を示す図。 流路が形成された第１実施形態の塩基配列検出チップを示す平面図。 塩基配列検出装置の外形を示す斜視図。 塩基配列検出装置の構成を示す斜視図。 塩基配列検出装置の上面図。 バルブＮＯＶの断面図。 図１４（ａ）、１４（ｂ）はバルブＮＣＶの構成を説明する図。 塩基配列検出装置の流路モデルを示す図。 塩基配列検出装置の増幅流路を示す図。 図１７（ａ）乃至１７（ｅ）は、塩基配列検出装置の動作を説明する図。

以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。

（基本原理）
本実施形態の塩基配列検出チップについて説明する前に、塩基配列検出チップの基本原理について説明する。

この塩基配列検出チップは、塩基配列、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列を検出するものである。ＤＮＡは、Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）の４つの塩基から構成され、２本鎖状になっている。２本鎖状では、塩基Ａと塩基Ｔ、および塩基Ｇと塩基Ｃという特定の組み合わせで結合する。ＲＮＡは、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）の４つの塩基から構成される。以下の説明では、ＤＮＡの検出を例にとって説明するが、ＲＮＡでも同様にして検出することができる。

ＤＮＡの断片は簡単に合成できるので、塩基配列検出チップでは、配列がわかっているＤＮＡを合成して１本鎖にしたＤＮＡをプローブとして基板上に固定する。検査するＤＮＡも一本鎖にし、基板上に固定されたＤＮＡプローブと反応させる。検体の検査するＤＮＡの配列がＤＮＡプローブの配列と相補的であれば、結合して２本鎖になる。例えば、図１（ａ）に示すようにＤＮＡプローブがＴＡＧＡＣの順序で配列されているときに、検査するＤＮＡがＡＴＣＴＧの順序で配列されていれば（図１（ｂ））、配列は互いに相補的である。図１（ｃ）に示すこれらの一本鎖のＤＮＡが結合して２本鎖になることをハイブリダイゼーションという。

図２（ａ）に示すように、塩基配列検出チップ５００は、例えばガラスまたはシリコンからなる基板５１０上に複数の電極５２０を離間して設け、各電極５２０上に異なる配列のＤＮＡプローブ５３０を固定した構成を有する。この塩基配列検出チップ５００上に、検査するＤＮＡの配列を含む試薬を流す。検査するＤＮＡの配列と相補的な配列を有するＤＮＡプローブ５３０が塩基配列検出チップ５００上に存在すれば、検査するＤＮＡ５４０は、この検査するＤＮＡ５４０の配列と相補的な配列を有するＤＮＡプローブ５３０と反応してハイブリダイゼーションを生じる（図２（ｂ）、２（ｃ））。しかし、検査するＤＮＡの配列と相補的な配列を有するＤＮＡプローブを塩基配列検出チップ５００が有していない場合は、ハイブリダイゼーションは生じない。上記試薬を塩基配列検出チップ５００上に流した後洗浄する。その後、挿入剤５５０を含む試薬（溶液）を塩基配列検出チップ５００上に流す。すると、ハイブリダイゼーションが生じた２本鎖のＤＮＡプローブ５３０に挿入剤５５０が結合する。この状態で塩基配列検出チップ５００に電圧を印加すると、ハイブリダイゼーションが生じた２本鎖のＤＮＡプローブ５３０が固定された電極５２０に、挿入剤５５０の酸化電流が流れる（図２（ｄ））。

この酸化電流、すなわちハイブリダイゼーションが生じた電極からの信号の一例を図３（ａ）に示し、ハイブリダイゼーションが生じない電極からの信号の一例を図３（ｂ）に示す。図３（ａ）からわかるように、塩基配列検出チップ５００に印加する電圧を増加していくと、５００ｍＶ程度の電圧で酸化電流が急に大きく上昇している。これに対して、ハイブリダイゼーションが生じない電極からの信号値は、塩基配列検出チップ５００に印加する電圧が５００ｍＶ程度になると若干上昇するが、図３（ａ）に示す場合に比べて上昇度は小さい。このように、どの電極から電流が検出されたかを判別することにより、検査するＤＮＡの配列を知ることができる。

（電流検出）
次に、塩基配列検出チップ５００の電流検出の一例について図４および図５を参照して説明する。この電流検出は、例えば三電極法を用いて行う。この三電極法が用いられる塩基配列検出チップ５００においては、例えば図４に示すように、基板５１０上に、作用電極５２０と、カウンタ電極５２２と、参照電極５２４とが設けられている。作用電極５２０、カウンタ電極５２２、および参照電極５２４は互いに離間して設けられる。作用電極５２０には同一の配列を有するＤＮＡプローブ５３０が少なくとも１個（図４では３個）固定され、基板５１０上に設けられた端子Ｗと接続される。なお、説明を簡単にするために、作用電極５２０は１個しか示していないが、一般に複数個設けられる。カウンタ電極５２２は基板５１０上に設けられた端子Ｃに接続され、参照電極５２４は基板５１０上に設けられた端子Ｒに接続される。

このように構成された塩基配列検出チップ５００の電流検出系の一例を図５に示す。図５に示す電流検出系６００は、カウンタ電極５２２の入力に対して参照電極５２４の電圧をフィードバックさせることにより、基板５１０内の電極および溶液などの各種条件の変動によらずに溶液中に所望の電圧を印加するポテンショスタットである。

このポテンショスタット６００は、作用電極５２０に対する参照電極の電圧がある所定の特性に設定されるようにカウンタ電極５２２の電圧を変化させ、挿入剤による酸化電流を電気化学的に測定する。

作用電極５２０は、ＤＮＡプローブ５３０が固定された電極で、塩基配列検出チップ内の反応電流を検出する電極である。カウンタ電極５２２は、作用電極５２０との間に所定の電圧を印加して塩基配列検出チップ内に電流を供給する電極である。参照電極５２４は、参照電極５２４と作用電極５２０との間の電圧を所定の電圧特性となるように制御するべく、この参照電極５２４の電圧をカウンタ電極５２２にフィードバックさせる電極である。これにより、カウンタ電極５２２による電圧が制御され、塩基配列検出チップ内の各種検出条件に左右されない精度の高い酸化電流の検出を行うことができる。

電極間を流れる電流を検出するための電圧パターンを発生する電圧パターン発生回路６１０が配線６１２ｂを介して参照電極５２４の参照電圧制御用の反転増幅器６１２の反転入力端子に接続される。

この電圧パターン発生回路６１０は、図示しない塩基配列検出制御装置の制御機構から入力されるデジタル信号をアナログ信号に変換して電圧パターンを発生させる回路であり、ＤＡ変換器を備えている。

配線６１２ｂには抵抗Ｒ_ｓが接続されている。反転増幅器６１２は、非反転入力端子が接地され、出力端子が配線６０２ａに接続されている。反転増幅器６１２の反転入力端子側の配線６１２ｂと出力端子側の配線６０２ａは配線６１２ａで接続されている。この配線６１２ａには、フィードバック抵抗Ｒ_ｆ’およびスイッチＳＷ_ｆからなる保護回路６２０が設けられている。

配線６０２ａは端子Ｃに接続されている。端子Ｃは、塩基配列検出チップ５００上のカウンタ電極５２２に接続されている。カウンタ電極５２２が複数設けられている場合には、それぞれに対して並列に端子Ｃが接続される。これにより、１つの電圧パターンにより複数のカウンタ電極に同時に電圧を印加することができる。配線６０２ａには、端子Ｃへの電圧印加のオンオフ制御を行うスイッチＳＷ_０が設けられる。

反転増幅器６１２に設けられた保護回路６２０により、カウンタ電極５２２に過剰な電圧が印加されない構成となっている。したがって、電流検出時に過剰な電圧がカウンタ電極に５２２に印加され、溶液が電気分解されてしまうことにより、所望の挿入剤の酸化電流の検出に影響を及ぼすことが無く、安定した測定を行うことが可能となる。

端子Ｒは配線６０３ａにより電圧フォロア増幅器６１３の非反転入力端子に接続される。この電圧フォロア増幅器６１３の反転入力端子は、電圧フォロア増幅器６１３の出力端子に接続された配線６１３ｂと、配線６１３ａにより短絡している。配線６１３ｂには抵抗Ｒ_ｆが設けられており、この抵抗Ｒ_ｆは一端が配線５１３ｂに接続され、他端が抵抗Ｒ_ｓと、配線６１２ａと配線６１２ｂとの交点との間に接続される。これにより、電圧パターン発生回路６１０により生成される電圧パターンに、参照電極５２４の電圧をフィードバックさせた電圧反転増幅器６１２に入力させ、このような電圧を反転増幅した出力に基づきカウンタ電極５２２の電圧を制御する。

端子Ｗは配線６０１ａによりトランス・インピーダンス増幅器６１１の反転入力端子に接続される。このトランス・インピーダンス増幅器６１１は、非反転入力端子が接地され、出力端子が配線６１１ｂに接続されるとともに配線６１１ａを介して反転入力端子に接続される。配線６１１ａには抵抗Ｒ_ｗが設けられている。このトランス・インピーダンス増幅器６１１の出力側の端子Ｏの電圧をＶ_ｗ、電流をＩ_ｗとすると、Ｖ_ｗ＝Ｉ_ｗ×Ｒ_ｗとなる。この端子Ｏから得られる電気化学信号は、図示しない塩基配列検出制御装置の制御機構に出力される。

作用電極５２０は、複数個あるため、端子Ｗおよび端子Ｏは作用電極５２０のそれぞれに対応して複数個設けられる。複数の端子Ｏからの出力は後述する信号切換部により切り換えられ、ＡＤ変換されることにより、各作用電極からの電気化学信号をデジタル値として取得することができる。なお、端子Ｗおよび端子Ｏの間のトランス・インピーダンス増幅器６１１等の回路は、複数の作用電極で共有してもよい。この場合、配線６０１ａに複数の端子Ｗからの配線を切り換えるための信号切換部を備えればよい。

このような構成のポテンショスタット６００を用いて、塩基配列検出チップの電流測定は、以下のように行われる。
１．まず、ポテンショスタット６００を用いて作用電極５２０の電位を参照電極５２４の電位に対して一定にする。
２．作用電極５２０は、この電極５２０上で挿入剤を電気分解する。
３．作用電極５２０で電気分解を維持するために必要な電流は、カウンタ電極５２２から流れる電流Ｉｃである。
４．このとき、ポテンショスタット６００は作用電極５２０とカウンタ電極５２２との間に流れる電流を正確に測定する。すなわち、参照電極５２４には電流はほとんど流れない。

（第１実施形態）
次に、第１実施形態による塩基配列検出チップ５００を図６に示す。この実施形態の塩基配列検出チップ５００は、固相基板５１０上に４０組の作用電極群５２０_１〜５２０_４０と、カウンタ電極５２２ａ、５２２ｂと、参照電極５２４とを備えている。カウンタ電極５２２ａ、５２２ｂはそれぞれ図面上でＣＥと表示され、参照電極５２４はＲＥと表示されている。固相基板５１０は、例えば、ガラス基板またはシリコン基板から形成される。

４０組の作用電極群５２０_１〜５２０_４０は、第１乃至第４の部分に分けられて配列される。第１の部分は１０組の作用電極群５２０_１〜５２０_１０からなり、図面上で左から右に向かって配列される。第２の部分は、１０組の作用電極群５２０_１１〜５２０_２０からなり、図面上で第１の部分の下方に配置されるとともに図面上で右から左に向かって配列される。第３の部分は、１０組の作用電極群５２０_２１〜５２０_３０からなり、図面上で第２の部分の下方に配置されるとともに図面上で左から右に向かって配列される。第４の部分は、１０組の作用電極群５２０_３１〜５２０_４０からなり、図面上で第３の部分の下方に配置されるとともに図面上で右から左に向かって配列される。

各作用電極群５２０_ｉ（ｉ＝１，・・・,４０）には、離間して設けられた３つの作用電極を備えており、それぞれ番号３ｉ−２、３ｉ−１、３ｉが付けられている。例えば、作用電極群５２０_１は、１、２、３の番号が付けられた作用電極を備え、作用電極群５２０_１０は、２８、２９、３０の番号が付けられた作用電極を備えている。各作用電極群５２０_ｉ（ｉ＝１，・・・,４０）の３個の作用電極には、同一のＤＮＡ配列を有するＤＮＡプローブが固定される。各作用電極は例えば金から形成される。

カウンタ電極５２２ａはＵ字形状を有しており、このＵ字形状の一端が第１の部分の作用電極群５２０_１０に近接して配置され、Ｕ字形状の他端が第２の部分の作用電極群５２０_１１に近接して配置される。カウンタ電極５２２ｂはＵ字形状を有しており、このＵ字形状の一端が第３の部分の作用電極群５２０_３０に近接して配置され、Ｕ字形状の他端が第４の部分の作用電極群５２０_３１に近接して配置される。

参照電極５２４は、Ｕ字形状を有しており、Ｕ字形状の一端が第２の部分の作用電極群５２０_２０に近接して配置され、Ｕ字形状の他端が第３の部分の作用電極群５２０_２１に近接して配置される。

また、基板５１０には、各作用電極群５２０_ｉ（ｉ＝１，・・・,４０）の作用電極にそれぞれ電気的に接続される端子Ｗが設けられている。端子Ｗには、各作用電極群５２０_ｉ（ｉ＝１，・・・,４０）の作用電極に対応して番号３ｉ−２、３ｉ−１、３ｉが付けられている。例えば、番号１、２、３の端子Ｗはそれぞれ、作用電極群５２０_１の番号１、２、３の作用電極に電気的に接続し、番号１１８、１１９、１２０の端子Ｗはそれぞれ、作用電極群５２０_４０の番号１１８、１１９、１２０の作用電極に電気的に接続する。

また、基板５１０には、Ｃ端子５２３ａ、５２３ｂと、Ｒ端子５２５ａ、５２５ｂと、Ｘ端子５２６と、Ｙ端子５２８ａ、５２８ｂと、複数の導通検出端子５８が更に設けられている。Ｃ端子５２３ａはカウンタ電極５２２ａに電気的に接続され、Ｃ端子５２３ｂはカウンタ電極５２２ｂに電気的に接続される。Ｒ端子５２５ａ、５２５ｂはそれぞれ参照電極５２４に接続される。Ｘ端子５２６ａ、５２６ｂは塩基配列検出チップ５００の両端に設けられ、これらの端子５２６ａ、５２６ｂ間に電圧を印加し、塩基配列検出チップ５００が導通しているか否かを検出する端子である。また、同様にＹ端子５２８ａ、５２８ｂは塩基配列検出チップ５００の両端に設けられ、これらの端子５２８ａ、５２８ｂ間に電圧を印加し、塩基配列検出チップ５００が導通しているか否かを検出する端子である。複数の導通検出端子５８０は、作用電極群５２０_１〜５２０_４０の作用電極に対応して設けられ、各導通検出端子５８０は、対応する作用電極に接続され、対応する作用電極に電気的に接続される端子Ｗとの間に電圧を印加することにより、上記対応する作用電極と上記端子Ｗとの間が導通するか否かを検出する。上記端子は、図６に示すように、作用電極群５２０_ｉ（ｉ＝１，・・・,４０）を挟むように、図面上で上下の組みに分かれて設けられる。

塩基配列検出チップ５００は後述する塩基配列検出装置に装着される。装着された場合、作用電極群５２０_１から作用電極５２０_１０に向かって挿入剤を含む試薬が流れるように、第１の部分上に流路が形成される。また、カウンタ電極５２２ａ上にも、作用電極群５２０_１０から作用電極５２０_１１に向かって上記試薬が流れるように流路が形成される。作用電極群５２０_１１から作用電極５２０_２０に向かって上記試薬が流れるように、第２の部分上に流路が形成される。また、参照電極５２４上にも、作用電極群５２０_２０から作用電極５２０_２１に向かって上記試薬が流れるように流路が形成される。作用電極群５２０_２１から作用電極５２０_３０に向かって上記試薬が流れるように、第３の部分上に流路が形成される。また、カウンタ電極５２２ｂ上にも、作用電極群５２０_３０から作用電極５２０_３１に向かって上記試薬が流れるように流路が形成される。作用電極群５２０_３１から作用電極５２０_４０に向かって上記試薬が流れるように、第４の部分上に流路が形成される。これらの流路は、作用電極群の第１乃至第４部分、カウンタ電極、参照電極が形成された塩基配列検出チップ５００の領域と、これらの領域を覆う上蓋とによって形成される。上蓋としては、例えば、塩基配列検出装置のパッキンが用いられる。

挿入剤を含む試薬は、第１の部分上の流路、カウンタ電極５２２ａ上の流路、第２の部分上の流路、参照電極５２４上の流路、第３の部分上の流路、カウンタ電極５２２ｂ上の流路、および第４の部分上の流路をこの順序で通過する。なお、図６においては、各作用電極群５２０_ｉ（ｉ＝１，・・・，４０）の３個の作用電極は、上記試薬が流れる方向に沿って配列されている。

本発明者達は、上記上蓋によって形成された、塩基配列検出チップ５００の電極上の流路内に気泡が発生する要因について鋭意研究に努めた。その結果、以下のことが判明した。試薬が流入する塩基配列検出チップ５００の入口は、図７に示すように、塩基配列検出チップ５００に対してほぼ垂直に上蓋７７０に設けられた構成となっている。このため、試薬は、矢印７６５ａに示すように入口７６０ａから鉛直下方に塩基配列検出チップ５００に向かって流入する。このため、入口直下の流路７８０の領域には淀み７９０が生じ、この淀みによって気泡が発生し、この気泡が矢印７６５ｂに示すように、流路７８０を通って電極５２０上の領域に達する。

そこで、本発明者達は、実験を行い、気泡は入口直下の領域から流路内をどのくらいの距離送られるかを調べた。その結果を図８に示す。図８からわかるように、流路幅が１ｍｍの場合は気泡の到達位置は流路幅の１．６倍であり、流路幅が１．２ｍｍの場合は、１．６４倍であった。以上のことから、気泡は、流路７８０の幅の２．０倍以上離れた領域には、送られないことが判明した。

この結果を踏まえて、第１実施形態の塩基配列検出チップ５００においては、試薬が流入する入口に最も近接する電極を、入口７６０ａから流路７８０の幅の２．０倍以上離して配置する。すなわち、入口７６０ａから最近接の電極までの距離Ｌｏｆは、流路７８０の幅の２．０倍以上とする。また、上記実験結果から、距離Ｌｏｆは流路７８０の幅の２〜３倍であることが好ましいことが分かった。

流路７８０が上蓋７７０によって形成された塩基配列検出チップ５００を図９に示す。試薬が流入する入口７６０ａから、この入口７６０ａに最も近接する、流路７８０内の作用電極５２０ａまで距離Ｌｏｆは、流路７８０の幅Ｌｗの２．０倍以上である。また、本実施形態においては、試薬が塩基配列検出チップ５００から流出する出口７６０ｂ側についても入口側と同様な配置とする。すなわち、出口７６０ｂに最も近接する作用電極５２０ｂは、出口７６０ｂから流路７８０の幅Ｌｗの２．０倍以上離して配置する。

以上説明したように、本実施形態によれば、電極上の流路に気泡が送られることを抑制することが可能な塩基配列検出チップを提供することができる。

（第１実施形態の塩基配列検出チップを搭載した塩基配列検出装置）
次に、第１実施形態の塩基配列検出チップを搭載して検体のＤＮＡ配列を検出する塩基配列検出装置の一例について説明する。塩基配列検出装置の外形図を図１０に示す。この塩基配列検出装置７００は、図１１に示すように、下プレート７１０と、パッキン７２０と、上プレート７３０と、カバー７４０と、キャップ７５０とを備えている。パッキン７２０は、下プレート７１０と、上プレート７３０との間に挿入される。カバー７４０は上プレート７３０に取り付けられる。キャップ７５０はヒンジによってカバー７４０に取り付けられる。下プレート７１０、上プレート７３０、カバー７４０、キャップ７５０は例えば透明なポリカーボネイト（ＰＣ）から形成され、パッキン７２０は例えば透明なエラストマーから形成される。

下プレート７１０は、周辺に沿って土手（bank）７１０ａが設けられ、この土手７１０ａの内側の表面は土手７１０ａより低くなっている。この土手７１０ａの内側に、開口７１０ｂが設けられている。この開口７１０ｂの周囲には、塩基配列検出チップ５００が載置され、支持するための支持部７１０ｂ１が設けられている。この支持部７１０ｂ１は、塩基配列検出チップ５００が支持部７１０ｂ１上に載置された場合に塩基配列検出チップ５００の上面が土手７１０ａの内側の表面より低くなるように、開口７１０ｂの底面側に設けられる。なお、パッキン７２０は、土手７１０ａの内側の領域を覆うように配置される。

塩基配列検出チップ５００が搭載されたときの塩基配列検出装置７００の上面図を図１２に示す。下プレート７１０の土手７１０ａの内側には、シリンジ部７１０ｃを形成する４つの窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２、７１０ｃ３、７１０ｃ４が設けられている。窪み７１０ｃ１は、後述するようにパッキン７２０の膨らみとともにタンクを形成し、このタンク内に例えば検体のＤＮＡを含む液、すなわちサンプルが保存される。窪み７１０ｃ２はパッキン７２０の膨らみとともにタンクを形成し、このタンク内に例えば洗浄液が保存される。窪み７１０ｃ３には例えば挿入剤を含む試薬が保存される。窪み７１０ｃ４はパッキン７２０の膨らみとともにタンクを形成し、このタンク内に例えば洗浄液が保存される。窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２、７１０ｃ３、７１０ｃ４のそれぞれの入口側には液を注入する注入部７１０ｄ１、７１０ｄ２、７１０ｄ３、７１０ｄ４が設けられ、これらの注入部７１０ｄ１、７１０ｄ２、７１０ｄ３、７１０ｄ４は、対応する窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２、７１０ｃ３、７１０ｃ４と、下プレート７１０に設けられた流路となる溝で接続される。

窪み７１０ｃ１の入口側に空気抜き口７１０ｅ１が設けられ、窪み７１０ｃ２の出口側に空気抜き口７１０ｅ２が設けられ、窪み７１０ｃ３の出口側に空気抜き口７１０ｅ３が設けられ、窪み７１０ｃ４の出口側に空気抜き口７１０ｅ４が設けられている。

また、下プレート７１０の土手７１０ａの内側には、窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２、７１０ｃ３、７１０ｃ４のそれぞれの出口側に設けられた常時閉のバルブＮＣＶと、サンプル内のＤＮＡを増幅する増幅流路７１０ｆと、増幅流路７１０ｆの入口部と出口部とに設けられ常時開のバルブＮＯＶと、廃液を塩基配列検出装置内に留めておくため廃液タンク７１１ｇ１、７１１ｇ２となる窪み７１０ｇ１、７１０ｇ２とが設けられている。廃液タンク７１１ｇ１、７１１ｇ２は、窪み７１０ｇ１、７１０ｇ２と、パッキン７２０と、上プレート７３０とによって形成される。

なお、バルブＮＣＶは下プレート７１０と、パッキン７２０と、カバー７４０とによって形成され、バルブＮＯＶは下プレート７１０とパッキン７２０とで形成される。バルブＮＣＶはシリンジ部７１０ｃに試薬等を保存するために用いられる。バルブＮＯＶは、ＤＮＡの増幅中に試薬等が移動しないように流路を閉鎖するために用いられる。

また、窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２の出口側に設けられたバルブＮＣＶは、増幅流路７１０ｆの入口側に設けられたバルブＮＯＶと、下プレート７１０に形成された流路で接続される。窪み７１０ｃ３、７１０ｃ４の出口側に設けられたバルブＮＣＶは、パッキン７２０とで形成される塩基配列検出チップ５００上の流路の入口と、下プレート７１０に形成された流路によって接続される。増幅流路７１０ｆの出口側に設けられたバルブＮＯＶは、パッキン７２０とで形成される塩基配列検出チップ５００上の流路の入口と、下プレート７１０に形成された流路によって接続される。パッキン７２０とで形成される塩基配列検出チップ５００上の流路の出口は窪み７１０ｇ１と、下プレート７１０に形成された流路によって接続される。

図１１に示すように、パッキン７２０には、窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２、７１０ｃ３、７１０ｃ４に対応する領域にそれぞれ、上プレート７３０に向かって凸のドーム状の膨らみが設けられ、この膨らみと対応する窪み７１０ｃ１、７１０ｃ２、７１０ｃ３、７１０ｃ４によって、シリンジ部７１０ｃのタンクが形成される。また、パッキン７２０は、バルブＮＣＶおよびバルブＮＯＶが形成される領域に、後述するように断面がチューブ構造を有し、このチューブ構造と下プレート７１０とによって流路を形成する。このチューブ構造に対応する下プレート７１０の領域は溝が形成されず、平坦となっている。また、下プレートに形成された流路用の溝を覆う、パッキン７２０の面は平坦となっている。パッキンの平坦な面と溝とにより流路が形成される。

また、パッキン７２０には、窪み７１０ｇ１，７１０ｇ２に対応する領域に開口が設けられるとともに、ＤＮＡチップ５００の端子（例えば図６に示す作用電極５２０に接続する端子Ｗ、カウンタ電極５２２に接続する端子Ｃ、参照電極５２４に接続する端子Ｒ等）が設けられている領域に対応して開口が設けられている。したがって、搭載される塩基配列検出チップ５００が図６に示すチップである場合には、開口は２個必要となる。

上プレート７３０には、パッキン７２０の膨らみに対応する領域に第１開口が設けられている。この第１開口を通して、図示しないＤＮＡ配列検出制御装置からロッドが延びてタンクの上面、すなわちパッキン７２０の膨らみの上面を押すことにより、タンクから液が流路に放出される。このとき、タンクの出口側に設けられているバルブＮＣＶは開状態にする。また、上プレート７３０には、塩基配列検出チップ５００の端子が設けられている領域に対応して第２開口が設けられている。第１開口が設けられている領域は、第２開口が設けられている領域に比べて上面の位置が低くなっている。この第１開口が設けられている領域にカバー７４０が取り付けられる。また、第１開口が設けられている領域には、バルブＮＣＶに対応する領域に開口が設けられている。

流路の延在する方向に直交する面で切断したバルブＮＯＶの断面を図１３に示す。図１３に示すように、バルブＮＯＶはチューブ構造７２０ａを有し、このチューブ構造７２０ａと下プレート７１０とによって常時開となるバルブとなる。バルブＮＯＶは、図示しないＤＮＡ配列検出制御装置からのロッド８１０により、パッキン７２０のチューブ構造を押しつぶすことにより流路を閉状態にする。なお、バルブＮＯＶが設けられている領域に対応する上プレート７３０の領域には、上記ロッド８１０が挿入される開口が設けられている。

図１４（ａ）に示すように、カバー７４０の裏面側には、バルブＮＣＶが設けられる位置に対応して、パッキン７２０のチューブ構造を押しつぶすためのロッド７４０ａが片持ち梁の先端に設けられており、このロッド７４０ａにより、バルブＮＣＶが常時閉状態となっている。このバルブＮＣＶは、図１４（ｂ）に示すように、塩基配列検出制御装置からのロッド８２０が上記片持ち梁を持ち上げることにより、バルブＮＣＶは開状態となり、パッキン７２０のチューブ構造からなる流路が開く。なお、なお、バルブＮＣＶが設けられている領域に対応する下プレート７１０の領域には、上記ロッド８２０が挿入される開口が設けられている。

図１５に、塩基配列検出装置７００の流路モデルを示す。検体のＤＮＡを含む液は、注入口７１０ｄ１から注入されてタンク７１１ｄ１に保存され、洗浄液は注入口７１０ｄ２から注入されてタンク７１１ｄ２に保存される。また、挿入剤を含む試薬は注入口７１０ｄ３から注入されてタンク７１１ｄ３に保存され、洗浄液は注入口７１０ｄ４から注入されてタンク７１１ｄ４に保存される。タンク７１１ｄ１、７１１ｄ２、７１１ｄ３、７１１ｄ４に貯まる空気を抜くための空気口７１１ｅ１、７１１ｅ２、７１１ｅ３、７１１ｅ４が設けられている。タンク７１１ｄ３からの試薬またはタンク７１１ｄ３からの洗浄液は、流路を通って塩基配列検出チップ５００上に形成される流路７１２の入口に流入する。このとき、試薬または洗浄液がパッキン７２０から漏れ出さないように、流路７１２の入口近傍では流路は一旦上側に持ち上がって水平の状態になり、その後、下側に下がって流路７１２の入口に接続する。この理由は、流路が水平の状態になる領域では、図１１からわかるように、下プレートは平坦となっており、この領域では、パッキン７２０はチューブ構造を有している。なお、廃液タンク７１１ｇ１、７１１ｇ２は流路によって接続され、タンク７１１ｇ１が満杯に近くになると、廃液タンク７１１ｇ２に廃液は移動するように構成されている。

なお、増幅流路７１０ｆは、図１６に示すように、流路内において等間隔で液が一時的貯まるウェル７１０ｆ１が複数個設けられている。このような構造を増幅流路７１０ｆが備えることにより、異なる複数のＤＮＡを増幅することが可能なマルチ増幅を行うことができることを本願発明者達によって見出された。なお、隣接するウェル７１０ｆ間の間隔は流路に沿って４ｍｍ以上であることが好ましい。

次に、塩基配列検出装置の動作について図１７（ａ）乃至図１７（ｅ）を参照して説明する。図１７（ａ）乃至１７（ｅ）は、図１５に示す流路モデルの平面図である。

まず、塩基配列検出装置７００のタンク７１１ｄ１、７１１ｄ２、７１１ｄ３、および７１１ｄ４にそれぞれ、検体の抽出されたＤＮＡを含む液（サンプル）、第１洗浄液、挿入剤を含む試薬、および第２洗浄液を注入する。この塩基配列検出装置７００を図示しない塩基配列検出制御装置に搭載する（図１７（ａ））。

続いて、塩基配列検出制御装置の制御機構によって、塩基配列検出装置７００におけるサンプルを保持しているタンク７１１ｄ１の出口側のバルブＮＣＶを開状態にする。その後、サンプルを保持しているタンク７１１ｄ１を、塩基配列検出制御装置のロッドによって押しつぶすことによって、サンプルを増幅流路７１０ｆに送る。サンプルが増幅流路７１０ｆに送り込まれた後、増幅流路７１０ｆの出入り口のバルブＮＯＶを閉状態にするとともに、塩基配列検出制御装置の加熱機構（例えば、ヒータ）によって、増幅流路７１０ｆを加熱し、サンプル内のＤＮＡに増幅反応を起こす（図１７（ｂ））。

次に、塩基配列検出制御装置のロッドによって、第１洗浄液が保存されているタンク７１１ｄ２の出口側のバルブＮＣＶを開状態にするとともに増幅流路７１０ｆの出入り口のバルブＮＯＶを開状態にする。続いて、タンク７１１ｄ２を、塩基配列検出制御装置のロッドによって押しつぶすことによって、第１洗浄液を増幅流路７１０ｆに送る。すると、増幅反応が生じたＤＮＡを含むサンプルは第１洗浄液により押し出されて、塩基配列検出チップ上に形成される流路７１２に流入する。サンプルが塩基配列検出チップ上に送られた後は、増幅流路７１０ｆの出入り口のバルブＮＯＶを閉状態にする。ここで、塩基配列検出制御装置の加熱冷却機構（例えば、ペルチェ素子）によって、塩基配列検出チップを加熱する。塩基配列検出チップのＤＮＡプローブの配列と相補的なＤＮＡ配列を、サンプル内のＤＮＡが有している場合には、流路７１２内においてハイブリダイゼーション反応が生じる（図１７（ｃ））。

次に、塩基配列検出制御装置の制御機構によって、第２洗浄液が保存されているタンク７１１ｄ４の出口側のバルブＮＣＶを開状態にする。続いて、タンク７１１ｄ４を、塩基配列検出制御装置のロッドによって押しつぶすことによって、第２洗浄液を流路７１２に送る。このとき、塩基配列検出制御装置によって、塩基配列検出チップを加熱する。これにより、塩基配列検出チップのＤＮＡプローブに吸着している非特異物を洗い流す。洗い流された非特異物は廃液タンク７１１ｇ１に送られる（図１７（ｄ））。

次に、塩基配列検出制御装置の制御機構によって、挿入剤を含む試薬が保存されているタンク７１１ｄ３の出口側のバルブＮＣＶを開状態にする。続いて、タンク７１１ｄ３を、塩基配列検出制御装置のロッドによって押しつぶすことによって、試薬を流路７１２に送る。このとき塩基配列検出チップおよび流路７１２は塩基配列検出制御装置の加熱冷却機構によって常温（例えば２５℃）に保持されている。

次に、塩基配列検出制御装置によって、塩基配列検出チップの端子（例えば図６に示す作用電極５２０に接続する端子Ｗ、カウンタ電極５２２に接続する端子Ｃ、参照電極５２４に接続する端子Ｒ等）に電圧を印加し、各作用電極からの電流を検出することにより、サンプル内のＤＮＡ配列の検出を行う。

以上説明したように、電極上の流路に気泡が送られることを抑制することが可能な塩基配列検出チップを提供することができる。また、検出可能な遺伝子数を多くすることができる。また、高価な試薬は、検出処理に必要な分だけタンクに保持するため、ＤＮＡ配列の検出を安価に行うことができる。

本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これらの実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これらの実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。

５００ 塩基配列検出チップ
５１０ 固相基板
５２０ 電極（作用電極）
５２０ａ 入口に最近接する作用電極
５２０ｂ 出口に最近接する作用電極
５２２ カウンタ電極
５２４ 参照電極
５３０ ＤＮＡプローブ
５４０ 検査されるＤＮＡ
５５０ 挿入剤
６００ ポテンショスタット
７６０ａ 流路入口
７６０ｂ 流路出口
７７０ 上蓋
７８０ 流路
Ｃ 端子
Ｒ 端子
Ｗ 端子

Claims (6)

1. 基板上に互いに離間して配列された複数の電極群であって、各電極群は離間して配置された複数の第１電極を有する、複数の電極群と、
   各第１電極に対応して設けられ、対応する第１電極に固定され、塩基配列を有するプローブと、
   前記複数の電極群の配列方向に沿って前記複数の電極群を覆うように前記基板上に設けられ、前記基板とともに流路を形成するカバー部材であって、試薬が流入する入口と、前記流路を通過した前記試薬が流出する出口とを有するカバー部材と、
   前記基板上に設けられた第２電極であって、前記第２電極と前記複数の第１電極との間に電圧が印加されることにより前記基板に電流を供給するための第２電極と、
   前記基板上に設けられた第３電極であって、前記第３電極と前記複数の第１電極との間の電圧が所定の電圧特性となるように制御するための第３電極と、
   を備え、
   前記入口に最近接した第１電極は前記入口から前記流路の幅の２．０倍以上離れた位置に設けられ、
   前記複数の電極群は、第１乃至第４部分に分割され、前記第２部分は前記第１部分と前記第４部分との間に配置され、前記第３部分は前記第２部分と前記第４部分との間に配置され、
   前記第２電極は２つの部分に分割され、
   前記第２電極の一方の部分はＵ字形状を有し、前記第２電極の前記一方の部分は一端が前記第１部分の一方の端部に近接して設けられ、他端が前記第１部分の前記一方の端部と同じ側にある前記第２部分の一方の端部に近接して設けられ、
   前記第２電極の他方の部分はＵ字形状を有し、前記第２電極の前記他方の部分は一端が前記第３部分の一方の端部に近接して設けられ、他端が前記第３部分の前記一方の端部と同じ側にある前記第４部分の一方の端部に近接して設けられ、
   前記第３電極はＵ字形状を有し、前記第３電極は一端が前記第２部分の他方の端部に近接して設けられ、他端が前記第３部分の他方の端部に近接して設けられ、
   前記上蓋は、前記第１乃至第４部分を覆うととともに更に前記第２および第３電極のそれぞれの形状に沿って前記第２および第３電極を覆うように設けられ、
   前記上蓋は、前記第１部分、前記第２電極の前記一方の部分、前記第２部分、前記第３電極、前記第３部分、前記第２電極の前記他方の部分、および前記第４部分に亘って連続している塩基配列検出チップ。
2. 前記入口に最近接した前記第１電極は前記入口から前記流路の幅の２〜３倍の距離に位置している請求項１記載の塩基配列検出チップ。
3. 前記出口は前記基板に対して前記試薬が略垂直に流出するように設けられ、前記出口に最近接した第１電極は前記出口から前記流路の幅の１．４倍以上離れた位置に設けられている請求項１または２記載の塩基配列検出チップ。
4. 各電極群内の前記複数の第１電極は、同じ塩基配列を有するプローブが固定される請求項１乃至３のいずれかに記載の塩基配列検出チップ。
5. 前記複数の第１電極は、前記電極群毎に異なる塩基配列を有するプローブが固定される請求項１乃至４のいずれかに記載の塩基配列検出チップ。
6. 前記基板上に設けられ、前記複数の電極群における前記複数の第１電極にそれぞれ接続される複数の第１端子と、
   前記基板上に設けられ、前記第２電極に接続される第２端子と、
   前記基板上に設けられ、前記第３電極に接続される第３端子と、
   を更に備えた請求項１乃至５のいずれかに記載の塩基配列検出チップ。

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