CN102686746A - 微阵列的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种客观地判定每个微阵列的性能退化或清洗不充分等以及杂交失败的方法，具体而言，涉及一种使用微阵列检测探针多核苷酸和靶多核苷酸的杂交的方法，包含1)使具有分别添加多种探针多核苷酸的多个固定的检测用点、及一处以上的固定有两种以上固定于检测用点上的探针多核苷酸的基准点的微阵列与荧光标记的靶多核苷酸接触的工序，2)通过清洗微阵列除去未反应的靶多核苷酸的工序，3)测定基准点上的荧光，若满足规定值则判断为可测定的工序，及4)若判断为可测定，则测定固定有探针多核苷酸的各检测用点上的荧光的工序。

Description

微阵列的检测方法

技术领域

本发明涉及使用微阵列检测探针多核苷酸和靶多核苷酸的杂交的方法。

背景技术

不仅明确多种多样的生物的基因构造，而且在尝试用基因组序列阐明其基因功能的同时，也在快速进行用于高效解析基因功能的技术开发。微阵列是在载玻片等载体上使多数多核苷酸排列固定在每个规定的区域上的高密度阵列，其对于基因的碱基序列的确定，以及基因的表达、变异、多态性等的同时解析非常有用。使用该微阵列的基因信息的解析对新药研究，疾病的诊断或预防的研发等极其有用。

在使用微阵列的检测中，首先用放射性同位素或荧光色素标记后的靶多核苷酸与在载体表面高密度排列的探针多核苷酸杂交。此时，具有与探针多核苷酸互补的碱基序列的靶多核苷酸与探针多核苷酸互补性地杂交，未杂交的多核苷酸通过清洗除去。

在使用微阵列的杂交的检测中，有时由于微阵列的性能退化或清洗不充分等而引起误判。但是，判断是否为误判被委托于使用微阵列的用户，这非常不可靠。在这样的状况下，不能用组合检测器和反应装置的自动装置处理多个试样。

专利文献1中记载有为了消除在点的亮度为检测器的检测下限以下的情况及为检测上限以上的情况下产生的判定误差，使用点化有改变浓度的探针DNA的微阵列，仅用具有特定范围的亮度的点判定结果的方法。但是，在该方法中，不能判定每个微阵列的性能退化或清洗不充分等。

在专利文献2记载有使探针阵列共价结合标志物质(マ一カ一物質)，基于该标志物质的位置，迅速且正确地进行各探针的点的位置的鉴定的方法。但是，在该方法中，即使能够判定每个探针阵列的性能退化或清洗不充分等，也不能判定在杂交或PCR上是否具有缺陷等。

现有技术文献

专利文献1：专利第0880361号

专利文献2：专利第4261661号

发明内容

发明要解决的问题

本发明的问题是提供一种客观地判定每个微阵列的性能退化或清洗不充分等及靶多核苷酸杂交不良的方法，以及点的定位方法。

用于解决问题的手段

本发明人发现具有分别添加多种探针多核苷酸的多个固定的检测用点上，及一处以上的固定有两种以上固定于检测用点上的探针多核苷酸的基准点的微阵列，使其接触荧光标记的靶多核苷酸并进行杂交反应，首先通过测定基准点的荧光，能够定位检测用点，同时能够判定每个微阵列的可靠性以及杂交反应的可靠性，至此完成了本发明。

即，本发明包含以下方面。

(1)一种方法，其使用微阵列检测探针多核苷酸和靶多核苷酸的杂交，包含：

1)使具有分别添加多种探针多核苷酸的多个固定的检测用点，及一处以上的固定有两种以上固定于检测用点上的探针多核苷酸的基准点的微阵列与荧光标记的靶多核苷酸接触的工序，

2)通过清洗微阵列，除去未反应的靶多核苷酸的工序，

3)测定基准点上的荧光，若满足规定值则判断为可测定的工序，及

4)若判断为可测定，则测定固定有探针多核苷酸的各检测用点上的荧光的工序。

(2)如(1)所述的方法，在基准点上固定有各类固定于检测用点上的探针多核苷酸。

(3)如(1)或(2)所述的方法，与微阵列接触的靶多核苷酸必须包含与固定于基准点上的探针多核苷酸杂交的多核苷酸。

(4)如(1)～(3)中任一方面所述的方法，在微阵列中，排列配置有检测用点和基准点，基准点至少存在两处，将连结任意两处的基准点的线作为基准线，基于距基准点的距离和与基准线的角度检测检测用点的位置。

(5)如(4)所述的方法，检测用点和基准点配置成外周为四角形的格子形状，在四角形的不同的顶点上存在基准点。

(6)如(1)～(5)中任一方面所述的方法，在微阵列中，检测用点和基准点排列配置成外周为正方形或长方形的格子状，在其对角线上的顶点上存在两处基准点，

检测穿过各基准点的两条直线垂直相交的交点，

检测连结所述交点和各基准点的两条结线的长度，

由所述结线的长度和点数检测结线上的各检测用点位置。

(7)如(1)～(6)中任一方面所述的方法，标志多核苷酸(マ一カ一ポリヌクレオチドが)与固定于检测用点上的探针多核苷酸中任意种和互补的多核苷酸具有95％以上的同源性。

(8)一种试剂盒，其用于检测探针多核苷酸和靶多核苷酸的杂交，包含：

具有分别添加多种探针多核苷酸的多个固定的检测用点，及一处以上的固定有两种以上固定于检测用点上的探针多核苷酸的基准点的微阵列，以及与固定于检测用点上的探针多核苷酸中的任意种杂交的荧光标记的标志多核苷酸。

(9)如(8)所述的试剂盒，在基准点上固定有各类固定于检测用点上的探针多核苷酸。

本说明书是包含日本专利申请2010-000251号的说明书及/或附图所述的内容，该申请是本申请的优先权的基础。

根据本发明，能够判定每个微阵列的可靠性，使用具有可靠性的微阵列能够实施测定。另外，能够判定杂交反应的可靠性。因此，能够抑制误判。另外，通过与自动反应装置等组合，能够以高的可靠性自动实施微阵列的测定。另外，在试样中不添加额外的试剂等就能够检测基准点这一点也是有利的。

附图说明

图1表示微阵列中的探针DNA(检测用点)及探针DNA混合物(基准点)的点配置的一方式；

图2表示用于微阵列的荧光检测的检测器的一方式；

图3表示在微阵列中实施杂交反应后，测定荧光的图像；

图4表示在微阵列中实施杂交反应后，测定荧光强度的结果；

图5表示微阵列中的探针DNA(检测用点)及探针DNA混合物(基准点)的点配置的一方式；

图6表示使两种微阵列(传统方法及本发明)与源自试样的靶DNA杂交测定荧光的结果；

图7表示将在从试样中提取的核酸中不加入引物下进行PCR得到的PCR产物滴加在微阵列上得到的荧光图像；

图8表示微阵列中的探针DNA(检测用点)及探针DNA混合物(基准点)的点配置的一方式。点1～17为检测用点，点A为基准点；

图9表示使微阵列与源自试样的靶DNA杂交测定荧光的结果。

具体实施方式

本发明涉及一种用微阵列检测探针多核苷酸和靶多核苷酸的杂交的方法。

在本发明中，多核苷酸包含寡核苷酸，包含含有DNA及RNA的核酸。DNA包含单链DNA及双链DNA。另外，核酸中也包含修饰磷酸二酯部位的人工核酸、修饰呋喃部位的糖基键及羟基的人工核酸、修饰核酸碱基部位的人工核酸、及利用糖、磷酸骨架以外的构造的人工核酸等，更具体而言，包含以硫原子取代磷酸部位的氧原子的硫代磷酸酯型、二硫代磷酸酯型、磷二酰胺型、甲基磷酸酯型或甲基硫代磷酸酯型的人工核酸；呋喃环上的取代基修饰型、增加一个碳糖环骨架的吡喃型、或多环式糖骨架型的人工核酸；嘧啶C-5位修饰碱基型、嘌呤C-7位修饰碱基型、或环扩大修饰碱基型的人工核酸等。

在本发明中，探针多核苷酸具有在该技术领域通用的含义，是指用于检测目的基因的多核苷酸，即是指专门与对应于目的基因的多核苷酸或其片段杂交的多核苷酸。作为探针多核苷酸，通常使用变性的多核苷酸(例如，从双链变性为单链的那些)，可使用合成寡核苷酸、cDNA及基因组DNA以及它们的片段等。探针多核苷酸通常具有3～5000个碱基，优选具有10～1000个碱基，进一步优选15～70个碱基。固定于微阵列上的探针多核苷酸的浓度通常为0.2μM～50μM的范围。

在本发明中，靶多核苷酸具有在该技术领域通用的含义，是指检测对象即多核苷酸。靶有时称为目标。通常，使用源自被检试样的多核苷酸及以其为基础利用酶合成/扩增的多核苷酸，具体而言，使用变性的多核苷酸、mRNA、cDNA、aRNA、它们的片段、等。

杂交(ハイブリダイズ)、杂交反应(ハイブリダイズ反応)或杂交(ハイブリダイゼ一シヨン)具有在该技术领域通用的含义，是指具有互补的序列的多核苷酸之间，例如，单链的DNA之间、单链的RNA之间、或单链的DNA和单链的RNA在适当的条件下形成双链。在本发明中，杂交优选在严格的条件下实施。

在本发明中，使用荧光标记的靶多核苷酸。标记方法及标记的种类只要是能够检测探针多核苷酸和靶多核苷酸的杂交的物质就没有特别限制，在该技术领域是公知的。例如，通过在合成或扩增靶多核苷酸时导入共价结合荧光标记的底物(主要是UTP)，能够得到荧光标记的靶多核苷酸。作为荧光标记，可列举：Cy3以及Cy5等CyDye、FITC、RITC、若丹明、德克萨斯红、TET、TAMRA、FAM、HEX、ROX等。

在本发明中，作为微阵列，使用具有添加探针多核苷酸的多个固定的检测用点及一处以上固定有两种以上固定于检测用点上的探针多核苷酸的基准点的微阵列，探针多核苷酸优选全部种类，基准点优选至少两处，更优选2～4处，进一步优选两处。固定于基准点上的探针多核苷酸的浓度合计通常为0.2μM～100μM的范围。固定于基准点上的探针多核苷酸的浓度优选为分别相同的浓度，合计为上述浓度。

在本发明中，固定于微阵列的检测用点上的探针多核苷酸的种类为两种以上，通常为256种以下，优选为64种以下。在本发明中，在基准点上，优选以相同的浓度使两种以上固定于检测用点上的探针多核苷酸固定，探针多核苷酸优选全部种类，因此，若探针多核苷酸的种类过多，则基准点上的每一种探针多核苷酸的浓度变低，基准点上的荧光变弱。

在本发明中，通常与微阵列接触的靶多核苷酸必须包含与固定于基准点上的探针多核苷酸杂交的多核苷酸。因此，若使微阵列接触荧光标记的靶多核苷酸，则微阵列不会退化，只要正常进行核酸扩增反应等检测步骤，就一定能在基准点上检测信号。而且，通过判定在基准点上有无信号，能够判定每个微阵列的可靠性，使用具有可靠性的微阵列能够实施测定。另外，也能够判定杂交反应的可靠性，能够抑制误判。另外，将基准点的位置作为基准，能够自动确定检测用点的位置，因此，通过与自动反应装置等组合，能够以高度的可靠性自动实施微阵列的测定。

固定于检测用点上的探针多核苷酸是指为了该微阵列检测对象的目的而实质上使用的探针多核苷酸。“固定有各类固定于检测用点上的探针多核苷酸全种类”是指固定有各类为了如上所述的微阵列检测对象的目的而实质上使用的探针多核苷酸。因此，在微阵列上，固定有为了检测对象而实质上未使用的多核苷酸，即使该多核苷酸不固定在基准点上，这样的方式也包含于固定有全部种类的方式。

靶多核苷酸必须包含与固定于微阵列的检测用点上的多个探针多核苷酸中的任意种杂交的多核苷酸，以检测与哪个检测用点杂交，在鉴定靶多核苷酸的情况下，优选使用固定有各类固定于检测用点上的探针多核苷酸的方式。换而言之，优选与微阵列接触的靶多核苷酸必须包含与固定于检测用点上的探针多核苷酸中的任意种杂交的多核苷酸的方式。原因是这样的靶多核苷酸一定与固定于基准点上的探针多核苷酸中的任意种杂交，因此，微阵列不会退化，只要正常进行核酸扩增反应等检测步骤，就一定能在基准点上检测信号。而且，通过在基准点上有无信号，能够判定每个微阵列的可靠性，使用具有可靠性的微阵列能够实施测定。另外，也能判定杂交反应的可靠性，能够抑制误判。另外，将基准点的位置作为基准，能够自动确定检测用点的位置，因此，通过与自动反应装置等组合，能够以高度的可靠性自动实施微阵列的测定。

作为这样的方式，可列举对于源自活体试样的靶核苷酸，使用固定有必须包含于该活体试样的核酸的探针多核苷酸的微阵列的情况。例如，源自必须包含于该活体试样的基因的核酸，在该基因具有多个基因组型(多态性或变异)的情况下，各类与该所有的基因组型的核酸对应的探针多核苷酸分别固定于微阵列的检测用点上。

更具体而言，可列举为了判定ABO血型，将所有的分别与ABO糖基转移酶基因的多态性(Yamamoto et al.，990，Nature345(17)：229-233)对应的探针多核苷酸分别固定于微阵列的检测用点上，使作为靶多核苷酸，源自从人的细胞、组织或血液等体液中提取的核酸的靶多核苷酸(例如，将该核酸设定为模板使ABO糖基转移酶基因扩增得到的靶多核苷酸)与其接触的情况等。另外可举出由基因多态性的判定进行的药物响应性检查、药效检查等。

本发明也包含靶多核苷酸不包含与固定于微阵列的检测用点上的多个探针多核苷酸中的任意种杂交的多核苷酸的情况。在这样的情况下，在基准点上也检测不出信号。因此，首先检测基准点的荧光，若不满足规定值则能够判断为不可测定。例如，在通过鉴定人可能感染的病毒(例如，BK病毒)中的基因(例如，VP1基因)的多态性判定人的出身地等的情况下，考虑使用固定有各类与该病毒基因的多态性对应的探针多核苷酸的微阵列。若试样感染了病毒，则在任一个检测用点中检测到荧光，同时在基准点上也检测到荧光，因此，首先，在测定基准点的荧光满足规定值的情况下，仅测定检测用点的荧光即可。假设，在基准点上检测不到荧光，则能够判定为由于微阵列退化、或核酸扩增反应的不良、或试样未感染该病毒等理由不可测定，因此，不需要测定检测用点的荧光。因此，本发明也能用于螨、霉菌的检查，食品及环境下的微生物检查，对人体的细菌、病毒感染的检查等，还有调查测定对象有无的情况等。

在本发明中，通过使上述微阵列与荧光标记的靶多核苷酸接触实施杂交反应，通过清洗除去未反应的靶多核苷酸后，首先，测定基准点上的荧光。在本发明中，另外，除了荧光标记的靶多核苷酸外，也可以使与固定于检测用点上的探针多核苷酸中的任意种杂交的荧光标记的标志多核苷酸与微阵列接触。该标志多核苷酸通常是指在严格的条件下与固定于检测用点上的探针多核苷酸中的任意种杂交的荧光标记的标志多核苷酸。

严格的条件是指形成特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件，虽然可举出低严格的条件及高严格的条件，但优选高严格的条件。低严格的条件为在杂交后的清洗中，例如以42℃、5×SSC、0.1％SDS进行清洗的条件，优选为以50℃、5×SSC、0.1％SDS进行清洗的条件。高严格的条件为在杂交后的清洗中，例如以65℃、0.1×SSC以及0.1％SDS进行清洗的条件。在如上所述的严格的条件下，由与同任意的探针多核苷酸互补的多核苷酸具有高的同源性(同源性为80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选98％以上)的碱基序列构成的多核苷酸是能够杂交的。

如上所述，标志多核苷酸以与固定于基准点上的任意的探针多核苷酸杂交的方式进行设计，且具有荧光标记，因此，即使靶多核苷酸不与探针杂交在基准点上也应该能检测到荧光。未检测到荧光或荧光的值较低是指在基准点上探针多核苷酸从微阵列上消失，即，检测用点上的探针多核苷酸也同样消失。或者，是指在杂交反应中具有缺陷。因此，测定基准点上的荧光，判定是否满足规定值，从而，能够判断微阵列是否退化，换而言之，能够判断微阵列的可靠性。另外，能够判定杂交反应的可靠性。

虽然标志多核苷酸的荧光标记没有特别限制，但优选与靶多核苷酸的荧光标记相同的物质。通过使用相同的物质，使用相同的检测器能够整体测定双方的荧光标记，能够迅速且简便地实施测定。

在用于本发明的微阵列中，优选，探针多核苷酸的点(检测用点)和基准点排列，优选配置成格子形状。而且，优选至少存在两处基准点，将连结任意两处的基准点的线作为基准线，基于距基准点的距离及与基准线的角度检测各检测用点的位置(点的中心)。更具体而言，由距基准点的距离及与基准线的角度(连结各检测用点和基准点的线和基准线所成的角度)、以及期望的点间距等能够确定各点的中心位置。

另外，将检测用点和基准点排列配置成外周为正方形或长方形的格子形状，能够使基准点存在于两处其对角线上的相对的顶点上。在该情况下，检测穿过各个基准点的两条直线垂直相交的交点，检测连结该交点和两处的基准点的两条结线。而且，算出结线的长度，通过以预先确定的个数(四角形的外周上的点数-1)分割该距离，求出结线上的各点间隔，能够由该点间隔检测各点位置。例如，假设使用点为4行×4列的微阵列。此时，结线上的点数为四点。若结线的长度为900μm，则900÷(4-1)＝300，点间隔为300μm。使用上述微阵列，能够将在结线上从基准点移动300μm的位置设定为点的中心，另外，在结线上从该中心移动300μm的位置为下一点的中心。

构成基准线的两处基准点优选存在于在微阵列上排列的点群中较远的位置。检测用点和基准点配置成外周为四角形的格子形状，优选基准点存在于四角形的不同的顶点上。

作为用于测定检测用点和基准点上的荧光的检测器，使用例如激光荧光显微镜、冷却CCD相机及连结计算机的荧光扫描装置，能够自动测定微阵列上的荧光强度。代替CCD相机也可以使用共聚焦型或非聚焦型的激光器。由此，得到图像数据。由得到的数据能够相对于固定于微阵列上的探针多核苷酸鉴定具有互补性的靶多核苷酸，据此，可制成基因表达谱，确定多核苷酸的碱基序列。

用于本发明的微阵列在载体上固定有探针多核苷酸及探针多核苷酸混合物。作为载体的材料，能够使用在该技术领域公知物质，没有特别限制。例如，可列举：铂、铂黑、金、钯、铑、银、水银、钨及它们的化合物等贵金属，及石墨、碳纤维所代表的碳等导电材料；单晶硅、非晶硅、碳化硅、氧化硅、氮化硅等所代表的硅材料，SOI(绝缘体上硅)等所代表的这些硅材料的复合材料；玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、陶瓷、镁橄榄石、感光性玻璃等无机材料；聚乙烯、乙烯、聚丙烯、环状聚烯烃、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛树脂、脲醛树脂、环氧树脂、密胺树脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚苯醚及聚砜等有机材料等。虽然载体的形状也没有特别限制，但优选为平板状。

作为载体，优选使用在表面具有碳层和化学修饰基团的载体。在表面具有碳层和化学修饰基团的载体包含在基质的表面具有碳层和化学修饰基团的物质，及在由碳层构成的基质的表面上具有化学修饰基团的物质。作为基质的材料，能够使用在该技术领域公知的物质，没有特别限制，能够使用与作为上述的载体材料列举的物质一样的物质。

优选使用具有微细的平板状构造的载体。虽然形状不限于长方形、正方形及圆形等，但通常使用1～75mm四方的形状，优选使用1～10mm四方的形状，更优选使用3～5mm四方的形状。因为容易制造微细的平板状构造的载体，所以优选使用由硅材料或树脂材料构成的基质，特别优选在由单晶硅构成的基质的表面具有碳层及化学修饰基团的载体。在单晶硅中，也包含结晶轴的方向逐部分极小地变化的物质(也有时称为嵌镶晶体)及含有原子尺度的混乱(晶格缺陷)的物质。

作为基底上形成的碳层，虽然没有特别限制，但优选使用合成金刚石、高压合成金刚石、天然金刚石、软金刚石(例如，类金刚石碳)、无定形碳、碳系物质(例如，石墨、富勒烯、碳纳米管)中的任意种，或它们的混合物，或使它们层叠的物质。另外，也可以使用碳化铪、碳化铌、碳化硅、碳化钽、碳化钍、碳化钛、碳化铀、碳化钨、碳化锆、碳化钼、碳化铬、碳化钒等碳化物。在此，软金刚石统称为所谓的类金刚石碳(DLC：Diamond LikeCarbon)等，金刚石和碳的混合物即不完全金刚石构造体，其混合比例没有特别限定。

碳层的形成能够用公知的方法进行。例如，可列举：微波等离子体CVD(Chemical vapor deposit)法、ECRCVD(Electric cyclotron resonancechemical vapor deposit)法、ICP(Inductive coupled plasma)法、直流溅射法、ECR(Electric cyclotron resonance)溅射法、离子蒸气沉积法、电弧蒸镀法、激光蒸镀法、EB(Electron beam)蒸镀法、电阻加热蒸镀法等。

在基质的表面形成碳层的情况下，碳层的厚度通常为单分子层～100μm左右，若过薄则底层基质的表面可能会局部露出，相反若变厚则生产性变差，因此，优选2nm～1μm，更优选5nm～500nm。

通过在形成有碳层的基质的表面导入化学修饰基团，能够将寡核苷酸探针牢固地固定于载体上。只要是本领域的技术人员就能够适当选择导入的化学修饰基团，没有特别限制，例如，可列举：氨基、羧基、环氧基、甲酰基、羟基及活性酯基。

氨基的导入例如能够通过在氨气中对碳层照射紫外线或等离子体处理碳层来实施。或，在氯气中照射紫外线氯化碳层，进一步在氨气中通过紫外线照射进行实施。或，也能通过使亚甲基二氨、乙二胺等多元氨类气体与氯化的碳层反应实施。

羧基的导入例如能够通过如上所述使氨化的碳层与适当的化合物反应来实施。作为用于导入羧基的化合物，例如，可列举：由式：X-R¹-COOH(式中，X表示卤原子，R¹表示碳数10～12的二价的烃基)所表示的卤代羧酸，例如氯乙酸、氟乙酸、溴乙酸、碘乙酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸、3-氯丙烯酸、4-氯苯甲酸；由式：HOOC-R²-COOH(式中，R²表示单键或碳数1～12的二价的烃基)所表示的二羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸、聚丙烯酸；聚甲基丙烯酸、偏苯三酸、丁烷四羧酸等多元羧酸；由式：R³-CO-R⁴-COOH(式中，R³表示氢原子或碳数1～12的二价的烃基，R⁴表示碳数1～12的二价的烃基)所表示的酮酸或醛酸；由式：X-OC-R⁵-COOH(式中，X表示卤原子，R⁵表示单键或碳数1～12的二价的烃基。)所表示的二羧酸的一卤化物，例如一氯化丁二酸、一氯化丙二酸；邻苯二甲酸酐、丁二酸酐、草酸酐、马来酸酐、丁烷四羧酸酐等酸酐。

环氧基的导入例如能够通过如上所述使氨化的碳层与适当的多元环氧化合物反应来实施。或者，能够通过使碳层含有的碳碳双键与有机过酸反应得到。作为有机过酸，可列举：过氧乙酸、过氧苯甲酸、过氧邻苯二甲酸、过氧蚁酸、三氟过氧乙酸等。

甲酰基的导入例如能够通过如上所述使氨化的碳层与戊二醛反应来实施。

羟基的导入例如能够通过如上所述使氯化的碳层与水反应来实施。

活性酯基是指在酯基的醇侧具有酸度高的吸电子基团活化亲核反应的酯基，即反应活性高的酯基。该酯基在酯基的醇侧具有吸电子基团，比烷基酯活性更高。活性酯基具有相对于氨基、硫醇基、氢氧基等基团的反应性。更具体而言，苯酚酯类、苯硫酚酯类、N-羟基胺基酯类、氰基甲酯、杂环羟基化合物的酯类等以具有远高于烷基酯等的活性的活性酯基被熟知。更具体而言，作为活性酯基，例如，可举出：对硝基苯基、N-羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、邻苯二甲酰亚胺基、5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺基等，特别优选使用N-羟基琥珀酰亚胺基。

活性酯基的导入例如能够通过如上所述用氰胺或碳二亚胺(例如，1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺)等脱水缩合剂和N-羟基琥珀酰亚胺等化合物活性酯化导入的羧基来实施。通过该处理，经由酰胺键在烃基的末端能够形成N-羟基琥珀酰亚胺基等活性酯基键合的基团(日本特开2001-139532)。

将探针多核苷酸及探针多核苷酸混合物分别溶解在点化用缓冲剂中制备点化用溶液，将其分注到96孔或384孔的塑料板上，将分注的溶液通过点焊装置等点化在载体上，从而能够制造微阵列。或，也可以将点化溶液用微吸液管进行手动点化。

点化后，使探针多核苷酸及探针多核苷酸混合物结合在载体上进行反应，优选进行温育。温育通常在-20～100℃，优选0～90℃的温度下，通常用0.5～16小时，优选1～2小时进行。温育优选在高湿度的气氛，例如，湿度50～90％的条件下进行。温育后，为了除去未结合在载体上的DNA，因此，优选使用清洗液(例如，50mM TBS/0.05％Tween20、2×SSC/0.2％SDS溶液、超纯水等)进行清洗。

在本发明的一实施方式中，优选在通过清洗微阵列，除去未反应的靶多核苷酸的工序之后，在实际的测定，即测定固定有探针多核苷酸的各检测用点上的荧光之前，进一步实施以下的工序。下述工序可以在测定基准点上的荧光之前实施，也可以在之后实施。

包括：分别测定多个点的距点的中心有一定距离的位置的亮度，得到多个背景值的工序，

算出代表得到的多个背景值的背景代表值的工序，及

对于所有的点或对于测定背景值的所有的点，分别算出背景值和背景代表值的差，在存在具有规定值以上的差的点的情况下判断为不可测定的工序。

在此，点包含检测用点和基准点双方。作为得到背景值的多个点，优选测定排列配置于微阵列上的点中至少形成外周的所有的点的背景值。另外，虽然不需要对所有的点的背景值进行测定，但也可以对所有的点的背景值进行测定。测定背景值的多个点例如在检测用点和基准点配置成外周为四角形的格子形状的情况下，通常为四角形的至少两个顶点，优选四角形的至少四个顶点，更优选最外周的所有点。更具体而言，为16行×16列的点时的最外周的60点，或为16行×16列的点时的所有点即256点。

测定距点的中心一定范围的每个位置的亮度并作为背景值时，距中心一定的范围基于点的大小和点间隔等适当设定。例如，能够设定在距点的中心一定距离以上，将点间隔长作为一边、将点的中心位置作为中心的四角形的范围内。例如，在距点中心70μm以上，一边为1000μm的四角形的范围内，优选在距点中心70μm以上，一边为380μm的四角形的范围内。另外，可以将测定的一定范围的位置的所有点或一部分点的亮度的平均值作为背景值，也可以仅测定一定范围的位置的一点的亮度并将其作为背景值。

点的中心的定位方法没有特别限制，例如，能够设定检测各点中具有规定荧光强度(例如，3000以上)的部分的中心。或者，也可以将连结两处的基准点的中心的线作为基准线，由距基准点的距离及与基准线的角度，以及点间距等确定各点的中心位置。

背景代表值虽然只要是代表测定的多个背景值的值就没有特别限制，但优选多个背景值的平均值或中间值。

分别算出对于所有的点或对于测定背景值的所有的点的背景值和背景代表值的差，在存在具有规定值以上的差的点的情况下，能够判定在点周围的背景值中偏差较大，因此，能够判定为由该微阵列清洗不充分、可靠性欠缺引起的不可测定。在此，规定值由于条件等而不同，例如，在图像的显示为16位灰度时能够设定为1000以上。图像的显示为例如8位灰度时，能够设定比50还小的值。

在本发明的另一实施方式中，优选在通过清洗微阵列除去未反应的靶多核苷酸的工序之后，在实际的测定，即测定固定有探针多核苷酸的各检测用点上的荧光之前，进一步实施以下的工序。下述工序可以在测定基准点上的荧光之前实施，也可以在之后实施。

包括：分别测定多个点的距点的中心一定距离的位置的亮度，得到多个背景值的工序，

计算多个背景值的平均值或中间值作为背景代表值的工序，

在背景代表值为规定值以上的情况下判断为不可测定的工序。

在此，点中包含检测用点和基准点双方。作为得到背景值的多个点，优选测定排列配置于微阵列上的点中至少形成外周的所有的点的背景值。另外，虽然不需要对所有的点的背景值进行测定，但也可以对所有的点的背景值进行测定。测定背景值的多个点例如在检测用点和基准点配置成外周为四角形的格子形状的情况下，通常为四角形的至少两个顶点，优选四角形的至少四个顶点，更优选最外周的所有点。更具体而言，为16行×16列的点时的最外周的60点，或为16行×16列的点时的所有点即256点。

关于距点的中心一定的距离，及中心的确定方法，如上所述。

在多个背景值的平均值或中间值即背景代表值为规定值以上的情况下，能够判定点周围的背景值整体较大，因此，能够判定为由该微阵列清洗不充分，可靠性欠缺引起的不可测定。在此，规定值由于条件等而不同，例如，在16位时能够设定为1000以上。

本发明另外涉及一种用于如上所述的探针多核苷酸和靶多核苷酸的杂交的检测的试剂盒。本发明的试剂盒包含具有分别添加多种探针多核苷酸的多个固定的检测用点，及一处以上的固定有两种以上固定于检测用点上的探针多核苷酸的基准点的微阵列，以及与固定于检测用点上的探针多核苷酸中的任意种杂交的荧光标记的标志多核苷酸。探针多核苷酸、靶多核苷酸、探针多核苷酸混合物、微阵列、及标志多核苷酸等如上所述。本发明的试剂盒还可以包含杂交缓冲液、清洗缓冲液、微孔板、尼龙膜等。

下面，虽然使用实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围不限于以下的实施例。

实施例

实施例1载体的制备

在3mm角的硅基质上使用离子蒸气沉积法，以下述条件制备两层膜的DLC层。

【表1】

在得到的表面具有DLC层的硅基质上，以下述条件使用氨等离子体，导入氨基。

【表2】

在包含140mM丁二酸酐及0.1M硼酸钠的1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中浸渍30分钟，导入羧基。在包含0.1M磷酸钾缓冲液、0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺、20mM N-羟基丁二酰亚胺的溶液中浸渍30分钟，进行活化，得到在硅基底表面上具有DLC层及作为化学修饰基的N-羟基丁二酰亚胺的载体。

实施例2微阵列的制作

将四种ABO血型判定用探针DNA(探针多核苷酸)及四种血型判定用探针DNA的混合物分别溶解在Sol.6中，在实施例1中制作的载体上以如图1的配置进行点化(日立软件公司制SPBIO)。即，探针DNA点在检测用点上，探针DNA混合物点在基准点上。四种探针DNA分别以设定为10μM的浓度的方式进行溶解，分别进行点化。探针DNA混合物等量混合四种探针DNA，以合计设定为2.5μM、5μM、10μM、20μM、或40μM的浓度的方式进行溶解并点化。例如，探针DNA混合物的40μM的点表示点化四种探针DNA中每种分别被包含10μM的溶液。点间距设定为280μm。

四种血型判定用探针DNA的序列如下所述。

AB型探针：5′-TCCTCGTGGTGACCCCTTGG-3′(序列号1)

O型探针：5′-TCCTCGTGGTACCCCTTGGC-3′(序列号2)

AO型探针：5′-ACAAGTACCTGCTGCGCCAC-3′(序列号3)

B型探针：5′-ACAAGTACCTACTGCGCCAC-3′(序列号4)

基于与O型探针杂交的核酸/与AB型探针杂交的核酸的值(O型/AB型)，能够判定被检者的血型是否为OO型、？O型或？？型(？＝A或B)。？O型是指AO型或BO型，？？型是指AA型、AB型或BB型。O型/AB型的值设定为OO型＞？O型＞？？型。因此，通过在O型/AB型的值中设定阈值，能够判定是否为OO型、？O型或？？型中的任一种。例如，若O型/AB型的值为3.0以上则判定为OO型，若O型/AB型的值为1.0以上不足3.0则判定为？O型，若O型/AB型的值为不足1.0则判定为？？型。

基于与B型探针杂交的核酸/与AO型探针杂交的核酸的值(B型/AO型)，能够判定被检者的血型是否为BB型、B？型或？？型(？＝A或O)。B？型是指AB型或BO型，？？型是指AA型、AO型或OO型。B型/AO型的值设定为BB型＞B？型＞？？型。因此，通过在B型/AO型的值中设定阈值，能够判定是否为BB型、B？型或？？型中的任一种。例如，若B型/AO型的值为3.0以上则判定为BB型，若B型/AO型的值为1.0以上不足3.0则判定为B？型，若B型/AO型的值不足1.0则判定为？？型。

在以80℃实施烘烤1小时后，在2×SSC/0.2％SDS中，在室温下，搅拌15分钟，同时以70℃清洗5分钟，接着，用超纯水清洗，然后离心，干燥，从而，制成点化了探针DNA及探针DNA混合物的微阵列。

实施例3与靶DNA的杂交

(1)选取具有AO型及BO型的血型的被检者的颊粘膜成纤维细胞，进行核酸提取(QIAamp、QIAGEN公司制造)，使用下面的引物组用PCR扩增(GeneAmp9700、ABI公司制造)与上述探针DNA杂交的区域(ABO糖基转移酶基因)。

正向引物1：5′-AGCTCAGCTTGCTGTGTGTT-3′(序列号5)

反向引物1：5′-AGATGCTGCATGAATGACC-3′(序列号6)

正向引物2：5′-GCCTGCCTTGCAGATACGTG-3′(序列号7)

反向引物2：5′-CAGAGTTTACCCGTTCTGCT-3′(序列号8)

标记使用CyDye(Cy5)进行。PCR溶液的组成及PCR条件如下所述。

【表3】

PCR溶液的组成：

【表4】

(2)在1μL杂交缓冲液(3×SSC/0.3％SDS)中掺入2μL PCR产物，滴在实施例2中制作的微阵列上，以55℃进行杂交1小时。用2×SSC/0.2％SDS进行清洗(摇动10次)，接着，用2×SSC进行清洗(摇动10次)。

(4)荧光的测定使用如图2所示的检测器实施。用红色激光器将激发光照射在整个微阵列上(曝光时间15秒)。通过荧光过滤器，切断具有目标波长以外的波长的光。

在图3表示杂交后，测定荧光的图像。将以距点的中心

径内的像素数值的中间值作为代表值并算出的结果表示在下面的表5及图4中。

【表5】

由以上结果示出即使将包含所有的固定于检测用点上的探针DNA的混合探针点化成与检测用点相同的微阵列，在检测用点上也没有问题地检测出荧光信号，且在基准点上也检测出荧光信号。

实施例4

通过与实施例2同样的步骤，以如图5的配置将四种ABO血型判定用探针DNA(探针多核苷酸)及四种血型判定用探针DNA混合物点在实施例1中制作的载体上，制作微阵列。另外，在图5的基准点没有任何点化的微阵列也作为传统方法的微阵列制作。

通过与实施例3同样的步骤，使两种微阵列与源自AO型试样及BO型试样的靶DNA接触，测定荧光强度。将结果表示在图6。在使用传统方法的微阵列和使用本发明的微阵列的情况下，未发现各检测用点上的荧光强度的实质性差异。另外，用于判定由荧光强度算出的血型(O型探针的点上的荧光强度/AB型探针的点上的荧光强度)的值，及(B型探针的点上的荧光强度/AO型探针的点上的荧光强度)的值也几乎没有差异。

由以上内容示出即使将包含所有的固定于检测用点上的探针DNA的混合探针点在与检测用点相同的微阵列上，在检测用点上得到的荧光强度也不会受到影响。

实施例5

在实施例3中，对从BO型试样中提取的核酸而言，将不加入引物进行PCR得到的PCR产物滴在以如图5的配置将四种ABO血型判定用探针DNA(探针多核苷酸)及四种血型判定用探针DNA混合物点在实施例1中制作的载体上制成的微阵列上。而且，此外用与实施例3同样的步骤实施杂交及荧光测定。将得到的荧光图像表示在图7中。

由以上内容知道在不正常进行PCR的情况下，不仅检测用点，在固定有探针DNA混合物的基准点上也检测不出荧光，能够确认PCR不良。即，测定固定有探针混合物的基准点上的荧光，若检测出荧光则表明很好地进行了核酸扩增反应，即使未确认图像也能够在软件上自动判定能否测定。

实施例6微阵列的制作

将用于判定被检者感染的BK病毒的基因组型(BK病毒的VP1基因的基因组型)的探针DNA(17种)及该17种探针DNA的混合物分别溶解在Sol.6中，以如图8的配置点在实施例1中制作的载体上(日立软件公司制SPBIO)。即，探针DNA点在检测用点1～17上，探针DNA混合物点在基准点A上。17种探针DNA以分别设定为5μM的浓度的方式进行溶解，并分别点化。探针DNA混合物是等量混合17种探针DNA，以合计设定为85μM的浓度的方式进行溶解并点化。点间距设定为280μm。

17种的探针DNA的序列如下所述。

【表6】

点位置	探针DNA序列	序列号
			1	5’-CCCAATTTAAATGAGGACC-3’	9
2	5’-CCCAATTTGAATGAGGACC-3’	10
			3	5’-CCCAACCTAAATGAGGACC-3’	11
4	5’-CCTAATTTGAATGAGGATC-3’	12
			5	5’-GCTGTAACTGTACAAACAGA-3’	13
6	5’-GCTGTAACAGTACAAACAGA-3’	14
			7	5’-GCTGTAACTGTAAAAACAGA-3’	15
8	5’-GCTGTGACTGTAAAAACAGA-3’	16
			9	5’-AACAGAGGTTATTGGAATAA-3’	17
10	5’-AACAGAGGTCATTGGAATAA-3’	18
			11	5’-AACAGAGGTTATGGGAATAA-3’	19
12	5’-CTGGGGTAGATGCTATTACA-3’	20
			13	5’-CTGGGGTAGATGCTATAACA-3’	21
14	5’-CTGGGCTAGATGCTATAACA-3’	22
			15	5’-ATGCTTCCTAAACCCAGAAA-3’	23
16	5’-ATGCTTTCTAAACCCAGAAA-3’	24
			17	5’-ATGCTTTCTAAATCCAGAAA-3’	25
A	探针DNA混合物	-

在以80℃实施烘烤1小时后，在2×SSC/0.2％SDS中，在室温下，搅拌15分钟，同时以70℃清洗5分钟，接着，用超纯水清洗，然后离心，干燥，从而，制成点化了探针DNA及探针DNA混合物的微阵列。

实施例7与靶DNA的杂交

(1)从三个被检者的尿中进行核酸提取(QIA、QIAGEN公司制造)，使用下面的引物组用PCR扩增(GeneAmp9700、ABI公司制造)与上述探针DNA杂交的区域(BK病毒的VP1基因)。

正向引物：5′-CAAGTGCCAAAACTACTAAT-3′(序列号26)

反向引物：5′-TGCATGAAGGTTAAGCATGC-3′(序列号27)

标记使用CyDye(Cy5)进行。PCR溶液的组成及PCR条件如下所述。

【表7】

PCR溶液的组成：

【表8】

(2)在杂交缓冲剂(3×SSC/0.3％SDS)中掺入2μL PCR产物，滴在实施例6中制作的微阵列上，以55℃进行杂交1小时。用2×SSC/0.2％SDS进行清洗(摇动10次)，接着，用2×SSC进行清洗(摇动10次)。

(4)荧光的测定用FLA8000(富士胶片公司制造)进行。图9表示杂交后测定的荧光的图像。其结果是能够分别对三个被检者的三种BK病毒的基因组型进行检测。另外，在基准点上也检测出荧光。

由以上内容示出即使在将17种探针DNA固定在微阵列的检测用点上，将17种探针DNA的混合物固定在基准点上的情况下，通过使源自试样的靶DNA杂交也能在基准点上检测荧光，能够判定能否测定，基于基准点的荧光可进行检测用点的定位。

将本说明书引用的所有的出版物、专利及专利申请照原样作为参考并引入本说明书。

Claims (9)

1.一种使用微阵列检测探针多核苷酸和靶多核苷酸的杂交的方法，包含：

1)使具有分别添加多种探针多核苷酸的多个固定的检测用点、及一处以上的固定有两种以上固定于检测用点上的探针多核苷酸的基准点的微阵列与荧光标记的靶多核苷酸接触的工序；

2)通过清洗微阵列除去未反应的靶多核苷酸的工序；

3)测定基准点上的荧光，若满足规定值则判断为可测定的工序；及

4)若判断为可测定，则测定固定有探针多核苷酸的各检测用点上的荧光的工序。

2.如权利要求1所述的方法，在基准点上固定有各类固定于检测用点上的探针多核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的方法，与微阵列接触的靶多核苷酸必须包含与固定于基准点上的探针多核苷酸杂交的多核苷酸。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，在微阵列中，排列配置有检测用点和基准点，基准点至少存在两处，将连结任意两处的基准点的线作为基准线，基于距基准点的距离和与基准线的角度检测检测用点的位置。

5.如权利要求4所述的方法，检测用点和基准点配置成外周为四角形的格子形状，在四角形的不同的顶点上存在基准点。

6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，在微阵列中，检测用点和基准点排列配置成外周为正方形或长方形的格子形状，在其对角线上的顶点上存在两处基准点，

检测穿过各基准点的两条直线垂直相交的交点，

检测连结所述交点和各基准点的两条结线的长度，

由所述结线的长度和点数检测结线上的各检测用点位置。

7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，标志多核苷酸与固定于检测用点上的探针多核苷酸中的任意种和互补的多核苷酸具有95％以上的同源性。

8.一种试剂盒，其用于检测探针多核苷酸和靶多核苷酸的杂交，包含：

具有分别添加多种探针多核苷酸的多个固定的检测用点，及一处以上的固定有两种以上固定于检测用点上的探针多核苷酸的基准点的微阵列，以及与固定于检测用点上的探针多核苷酸中的任意种杂交的荧光标记的标志多核苷酸。

9.如权利要求8所述的试剂盒，在基准点上固定有各类固定于检测用点上的探针多核苷酸。

Images