WO2011081012A1 - マイクロアレイの検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1)複数種のプローブポリヌクレオチドがそれぞれ固定化された複数の検出用スポットに加えて、検出用スポットに固定化されたプローブポリヌクレオチドの2種以上が固定化された基準スポットを一箇所以上有するマイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させる工程、
2)マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程、
3)基準スポットにおける蛍光を測定し、所定の値を満たせば測定可と判断する工程、および
4)測定可と判断されたら、プローブポリヌクレオチドが固定化された各検出用スポットにおける蛍光を測定する工程、
を含む、前記方法。
各基準スポット上を通る二つの直線が垂直に交わる交点を検出し、
前記交点と各基準スポットとを結ぶ二つの結線の長さを検出し、
前記結線の長さとスポット数から結線上の各検出用スポット位置が検出される、(1)~(5)のいずれかに記載の方法。
複数種のプローブポリヌクレオチドがそれぞれ固定化された複数の検出用スポットに加えて、検出用スポットに固定化されたプローブポリヌクレオチドの2種以上が固定化された基準スポットを一箇所以上有するマイクロアレイ、ならびに検出用スポットに固定化されたプローブポリヌクレオチドのいずれかにハイブリダイズする蛍光標識されたマーカーポリヌクレオチドを含む、前記キット。
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、および
すべてのスポットについて、または、バックグラウンド値を測定したすべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程。
複数のバックグラウンド値の平均値またはメディアン値をバックグラウンド代表値として算出する工程、
バックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には測定不可と判断する工程。
4種のABO式血液型判定用プローブDNA(プローブポリヌクレオチド)および4種の血液型判定用プローブDNAの混合物をそれぞれSol.6に溶解し、実施例1で作製した担体上に図1のような配置でスポット(日立ソフトウエアエンジニアリング製 SPBIO)した。すなわち、プローブDNAは検出用スポットに、プローブDNA混合物は基準スポットにスポットした。4種のプローブDNAは、それぞれが10μMの濃度となるように溶解して、それぞれスポットした。プローブDNA混合物は、4種のプローブDNAを等量混合し、合計で、2.5μM、5μM、10μM、20μM、または40μMの濃度となるように溶解してスポットした。例えば、プローブDNA混合物の40μMのスポットは、4種のプローブDNAをそれぞれ10μMずつ含む溶液をスポットしたことを示す。スポットピッチは、280μmとした。
O型プローブ:5'-TCCTCGTGGTACCCCTTGGC-3'(配列番号2)
AO型プローブ:5'-ACAAGTACCTGCTGCGCCAC-3'(配列番号3)
B型プローブ:5'-ACAAGTACCTACTGCGCCAC-3'(配列番号4)
O型プローブにハイブリダイズした核酸/AB型プローブにハイブリダイズした核酸の値(O型/AB型)に基づき、被検者の血液型がOO型、?O型または??型(?=AまたはB)であるかを判定できる。?O型は、AO型またはBO型を意味し、??型はAA型、AB型またはBB型を意味する。O型/AB型の値は、OO型>?O型>??型となる。従って、O型/AB型の値に閾値を設定することにより、OO型、?O型または??型のいずれであるかを判定できる。例えば、O型/AB型の値が3.0以上であればOO型と判定し、O型/AB型の値が1.0以上3.0未満であれば?O型と判定し、O型/AB型の値が1.0未満であれば??型と判定できる。
(1)AO型およびBO型の血液型を有する被検者の頬芽細胞を採取し、核酸抽出を行い(QIAamp、キアゲン社製)、上記プローブDNAとハイブリダイズする領域(ABOグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子)を以下のプライマーセットを用いてPCRで増幅した(GeneAmp9700、ABI社製)。
リバースプライマー1:5'-AGATGCTGCATGAATGACC-3'(配列番号6)
フォワードプライマー2:5'-GCCTGCCTTGCAGATACGTG-3'(配列番号7)
リバースプライマー2:5'-CAGAGTTTACCCGTTCTGCT-3'(配列番号8)
標識は、CyDye(Cy5)を用いて行った。PCR溶液の組成およびPCR条件は以下のとおりとした。
実施例2と同様の手順により、4種のABO式血液型判定用プローブDNA(プローブポリヌクレオチド)および4種類の血液型判定用プローブDNA混合物を実施例1で作製した担体上に図5のような配置でスポットし、マイクロアレイを作製した。また、図5の基準スポットに何もスポットしないマイクロアレイも、従来法のマイクロアレイとして作製した。
実施例3において、BO型検体から抽出した核酸に対し、プライマーを入れずにPCRを行って得られたPCR産物を、4種のABO式血液型判定用プローブDNA(プローブポリヌクレオチド)および4種類の血液型判定用プローブDNA混合物を実施例1で作製した担体上に図5のような配置でスポットして作成したマイクロアレイに滴下した。そして、その他は実施例3と同様の手順でハイブリダイゼーションおよび蛍光測定を実施した。得られた蛍光画像を図7に示す。
被検者に感染したBKウイルスのゲノム型(BKウイルスのVP1遺伝子のゲノム型)を判定するためのプローブDNA(17種)および該17種のプローブDNAの混合物をそれぞれSol.6に溶解し、実施例1で作製した担体上に図8のような配置でスポット(日立ソフトウエアエンジニアリング製 SPBIO)した。すなわち、プローブDNAは検出用スポット1~17に、プローブDNA混合物は基準スポットAにスポットした。17種のプローブDNAは、それぞれが5μMの濃度となるように溶解して、それぞれスポットした。プローブDNA混合物は、17種のプローブDNAを等量混合し、合計で、85μMの濃度となるように溶解してスポットした。スポットピッチは、280μmとした。
(1)3人のヒト被検者の尿から核酸抽出を行い(QIA、キアゲン社製)、上記プローブDNAとハイブリダイズする領域(BKウイルスのVP1遺伝子)を以下のプライマーセットを用いてPCRで増幅した(GeneAmp9700、ABI社製)。
リバースプライマー:5'-TGCATGAAGGTTAAGCATGC-3'(配列番号27)
標識は、CyDye(Cy5)を用いて行った。PCR溶液の組成およびPCR条件は以下のとおりとした。
Claims (9)
- マイクロアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法であって、
1)複数種のプローブポリヌクレオチドがそれぞれ固定化された複数の検出用スポットに加えて、検出用スポットに固定化されたプローブポリヌクレオチドの2種以上が固定化された基準スポットを一箇所以上有するマイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させる工程、
2)マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程、
3)基準スポットにおける蛍光を測定し、所定の値を満たせば測定可と判断する工程、および
4)測定可と判断されたら、プローブポリヌクレオチドが固定化された各検出用スポットにおける蛍光を測定する工程、
を含む、前記方法。 - 基準スポットに、検出用スポットに固定化されたプローブポリヌクレオチドの全種類が固定化されている、請求項1記載の方法。
- マイクロアレイに接触させるターゲットポリヌクレオチドが、基準スポットに固定化されたプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを必ず含むものである、請求項1または2記載の方法。
- マイクロアレイにおいて、検出用スポットと基準スポットが整列して配置されており、基準スポットが少なくとも二箇所存在し、いずれか二箇所の基準スポットを結ぶ線を基準線として、基準スポットからの距離と基準線からの角度に基づいて検出用スポットの位置が検出される、請求項1~3のいずれか1項記載の方法。
- 検出用スポットと基準スポットが、外周が四角形の格子状に配置されており、基準スポットが四角形の異なる頂点に存在する、請求項4記載の方法。
- マイクロアレイにおいて、検出用スポットと基準スポットが、外周が正方形または長方形の格子状に整列して配置されており、基準スポットがその対角線上の頂点に二箇所存在し、
各基準スポット上を通る二つの直線が垂直に交わる交点を検出し、
前記交点と各基準スポットとを結ぶ二つの結線の長さを検出し、
前記結線の長さとスポット数から結線上の各検出用スポット位置が検出される、請求項1~5のいずれか1項記載の方法。 - マーカーポリヌクレオチドが、検出用スポットに固定化されたプローブポリヌクレオチドのいずれかと相補的なポリヌクレオチドと95%以上の相同性を有する、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- プローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するためのキットであって、
複数種のプローブポリヌクレオチドがそれぞれ固定化された複数の検出用スポットに加えて、検出用スポットに固定化されたプローブポリヌクレオチドの2種以上が固定化された基準スポットを一箇所以上有するマイクロアレイ、ならびに検出用スポットに固定化されたプローブポリヌクレオチドのいずれかにハイブリダイズする蛍光標識されたマーカーポリヌクレオチドを含む、前記キット。 - 基準スポットに、検出用スポットに固定化されたプローブポリヌクレオチドの全種類が固定化されている、請求項8記載のキット。
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