CN107075579B - 生物化学激活的电子装置 - Google Patents

生物化学激活的电子装置 Download PDF

Info

Publication number
CN107075579B
CN107075579B CN201580049367.5A CN201580049367A CN107075579B CN 107075579 B CN107075579 B CN 107075579B CN 201580049367 A CN201580049367 A CN 201580049367A CN 107075579 B CN107075579 B CN 107075579B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polymerase
charge
nucleotide
charge sensor
polymerases
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580049367.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107075579A (zh
Inventor
B.博亚诺夫
J.G.曼德尔
J.白
K.L.冈德森
C.陈
M.珀博斯特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Illumina Inc
Original Assignee
Illumina Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Illumina Inc filed Critical Illumina Inc
Priority to CN202111054232.1A priority Critical patent/CN113913505A/zh
Publication of CN107075579A publication Critical patent/CN107075579A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107075579B publication Critical patent/CN107075579B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS
    • G01N27/4145—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00653—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to electrodes embedded in or on the solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Microelectronics & Electronic Packaging (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)

Abstract

一种核酸测序方法。该方法可以包括以下步骤：(a)提供拴系到固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)提供一个或多个核苷酸，由此可以通过电荷传感器检测核苷酸的存在；以及(c)检测核苷酸掺入与模板核酸互补的新生链。

Description

生物化学激活的电子装置
本申请基于2015年6月5日提交的美国临时申请号62/171,523，2015年5月14日提交的美国临时申请号62/161,709；2014年10月27日提交的美国临时申请号62/069,198；和2014年7月15日提交的美国临时申请号62/024,856，并且要求它们的权益，每个申请通过引用并入本文。
发明背景
本公开一般涉及基于生物传感器的检测，更具体地涉及可用于核酸测序的生物传感器。
目前可用的用于测序DNA的商业平台相对昂贵。这些平台中的大多数使用所谓的“合成测序”方法，这是因为在检测每个单体(即核苷酸)添加到生长的聚合酶结构的情况下合成DNA聚合物。因为模板DNA链严格指导新DNA聚合物的合成，所以可以从在合成期间添加到生长链的一系列核苷酸单体中推断模板DNA的序列。监测反应使用相对昂贵的硬件，如激光，检测光学和复杂的流体递送系统。迄今为止最成功的商业平台也需要昂贵的试剂和硬件以在可以甚至开始合成测序前扩增DNA模板。这些平台的复杂性和费用阻碍了它们在某些临床和研究环境中的使用，其中显然需要DNA测序技术。
因此，存在对核酸测序平台的改进的需要，以使它们更具成本效益，快速和方便。本公开解决了这种需要并且还提供了其它优点。
发明概述
本公开提供了第一种核酸测序方法。该方法可以包括以下步骤：(a)提供拴系到固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)提供一种或多种经标记的核苷酸，由此当标记物接近(in proximity to)电荷传感器(charge sensor)时，电荷传感器可以检测标记物的存在；并且(c)检测经标记的核苷酸对与模板核酸互补的新生链的掺入。
本公开还提供了用于将反应组分附着到电荷传感器的方法。该方法可以包括以下步骤：(a)提供包括多个电荷传感器的固体支持物，其中每个电荷传感器具有附着多个反应组分的能力；(b)提供含有特定类型的多个反应组分的流体；和(c)在下述条件下使固体支持物与流体接触，其中(i)特定类型的多个反应组分与多个电荷传感器流体连通，(ii)特定类型的反应组分的数目在流体中大于在固体支持物上的电荷传感器的数目；并且(iii)来自流体的特定类型的反应组分在导致固体支持的条件下附着到电荷传感器，其中将每个电荷传感器附着到反应组分中的单一一种(where each of the charge sensors isattached to a single one of the reaction components)。
在一些实施方案中，用于将反应组分附着到电荷传感器的方法可以包括以下步骤：(a)提供包括多个电荷传感器的固体支持物，其中每个电荷传感器具有附着多个反应组分的能力；(b)提供含有特定类型的多个反应组分的流体，其中特定类型的每个反应组分与排斥部分结合；和(c)在下述条件下使固体支持物与流体接触，其中(i)特定类型的多个反应组分与多个电荷传感器流体连通，(ii)特定类型的反应组分的数目在流体中大于在固体支持物上的电荷传感器的数目；(iii)来自流体的反应组分附着到电荷传感器，和(iv)结合到每个反应组分的排斥部分防止多个反应组分中的多于一个的反应组分附着到每个电荷传感器。
用于将反应组分附着到电荷传感器的方法可以包括以下步骤：(a)提供包括多个电荷传感器的固体支持物，其中每个电荷传感器具有附着多个反应组分的能力；(b)提供含有特定类型的多个反应组分的流体；(c)在下述条件下使固体支持物与流体接触，其中(i)特定类型的多个反应组分与多个电荷传感器流体连通，(ii)特定类型的反应组分的数目在流体中大于在固体支持物上的电荷传感器的数目；和(iii)来自流体的特定类型的反应组分附着到电荷传感器，从而形成附着到来自流体的特定类型的多个反应组分的经修饰的电荷传感器；并且(d)从每个经修饰的电荷传感器中除去特定类型的一种或多种反应组分，以留下附着到每个经修饰的电荷传感器的特定类型的反应组分的单一一种。
本公开提供了检测核苷酸的方法。该方法可以包括以下步骤：(a)提供栓系于固体支持物电荷传感器的核苷酸结合蛋白(例如聚合酶)；(b)提供一种或多种经标记的核苷酸，由此当标记物接近电荷传感器时，电荷传感器可以检测标记物的存在；并且(c)使用电荷传感器检测经标记的核苷酸与蛋白质的结合。
在具体实施方案中，核酸测序的方法可以通过(a)提供拴系到固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)提供一种或多种经标记的核苷酸，由此当标记物接近电荷传感器时，电荷传感器可以检测标记物的存在；并且(c)使用电荷传感器检测经标记的核苷酸对与模板核酸互补的新生链的掺入。
由本公开提供的核酸测序的方法可以包括以下步骤：(a)提供拴系到固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)提供一种或多种经标记的核苷酸，由此当标记物接近电荷传感器时，电荷传感器可以检测标记物的存在，其中一种或多种经标记的核苷酸具有可逆的终止剂部分；(c)使用电荷传感器检测一个或多个经标记的核苷酸对与模板核酸互补的新生链的掺入，从而形成可逆终止的新生链；(d)修饰可逆终止的新生链，以使所述新生链能够进一步掺入核苷酸；并且(e)重复(b)至(d)以获得模板核酸的序列。
还提供了核酸测序的方法，其包括以下步骤：(a)提供拴系到固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)在下述条件下使聚合酶与模板核酸和一种或多种不同核苷酸类型接触，其中聚合酶催化添加一种或多种核苷酸类型以形成核酸模板的核酸互补物并且其中添加一种或多种不同的核苷酸类型产生来自由电荷传感器检测的聚合酶的构象信号变化；(c)使用所述电荷传感器检测来自所述聚合酶的信号的变化；并且(d)确定用于添加一种或多种不同核苷酸类型的信号变化的速率，极性，幅度或时间持续，从而确定模板核酸的核苷酸序列。
附图简述
图1显示了通过系链附着到电荷传感器的聚合酶。
图2显示了经由核酸系链附着到电荷传感器并结合到核苷酸的聚合酶，所述核苷酸可以基于电荷或与传感器的接近性区分。
图3显示了经由核酸系链附着到电荷传感器并结合核苷酸的聚合酶，所述核苷酸可基于电荷区分。
图4显示了栓系到电荷传感器的聚合酶，其中电荷传感器也附着到能够结合核苷酸上的标记物的多个寡核苷酸。
图5显示了在标记物的寡核苷酸部分的末端具有两个带负电荷的氧的核苷酸标记物。
图6显示了可以使用电荷传感器检测的电荷标签。
图7显示了Klenow片段(PolIxxo)和Bsu-LF(Bsuxxx1)的比对序列，其中Klenow片段的O螺旋指结构域的位置和Bsu-LF中的比对位置是框示的。在右边的插图中还显示了模型，其显示了与纳米管模型并置的Klenow片段O-螺旋指的几个残基的三维位置。
图8显示了具有夹紧区(pinched region)的电荷传感器和在夹紧区处栓系到电荷传感器的聚合物。聚合酶与核酸的模板链和新生链复合。
图9显示了使用局部氧化将夹点(pinch)引入硅中的方法的示意图。
图10显示了通过具有核酸序列(通常表示为10Ns的序列)的系链附着到聚合酶(Pol)的电荷传感器。聚合酶与靶核酸复合，并且指示与四种不同核苷酸(分别为ATP，GTP，CTP和TTP)相关的标记的结合位点。
图11显示通过具有核酸序列(通常表示为10Ns的序列)的系链附着到聚合酶(Pol)的电荷传感器。聚合酶与靶核酸和标记的CTP类似物复合。CTP类似物上的标记物包括具有肌苷(I)的核酸区和与系链(ABC)上的互补区杂交的特异性区(A’B’C’)。
图12显示了由于四种不同核苷酸类似物的结合而相对于电荷传感器处于四种不同位置状态的拴系的聚合酶。每个核苷酸类似物具有与其它3个核苷酸类似物相同长度的寡核苷酸部分，但每个核苷酸类似物具有与其它核苷酸类似物结合的区域相比结合到该系链的不同区域的特异性结合序列。
发明详述
一般而言，本公开的实施方案涉及用于单核分子检测的装置，组合物和方法，其可用于诸如在核酸测序程序中检测的核苷酸掺入事件等的应用中。需要改进的检测系统，其以高通量方式提供长测序读段。本文所阐述的本发明的实施方案满足这种需要并且还提供其它优点。
基于互补金属氧化物半导体(Complementary metal–oxide–semiconductor,CMOS)的感测方案已经用于核酸测序。当前基于CMOS的感测方案利用在SBS反应中发生的DNA聚合的副产物(例如质子或焦磷酸盐)的电化学检测。这些方法提供了无光和无标记物的优点。无光，反应不需要用于检测的昂贵的光学仪器。当使用无标记物的试剂时，制备试剂的成本和复杂性通常降低。然而，当前基于CMOS的感测方案的缺点是要检测的反应副产物是移动的，并且具有从反应区扩散出来的自然趋势，这可导致当试图执行多重测序反应时在相邻位点之间的串扰。鉴于大多数基因组的大尺寸和典型测序反应的有限读段长度，多重化(multiplexing)对于实现测序技术的研究和临床应用的期望覆盖水平是非常重要的。
一般而言，本公开提供了可以用于核酸测序和用于检测核酸和其它分析物的独特检测模式。在图1中显示示例性实施方案。简言之，用系链3在硅纳米线(nanowire)场效应晶体管(field-effect transistor,FET)2的门极(gate)5上固定聚合酶1。任选地，纳米线可以由除硅之外的材料制成，或者纳米线可以用纳米管替代。任选地，系链3可以是导电聚合物链(conductive polymer strand)，如由在聚合酶近端的系链末端的正电荷6和在聚合酶远端并且附着到门极5的系链末端的负电荷7指示。在与核苷酸和其它反应物一起被引入溶液中之后，ssDNA 4被附着到聚合酶1。当合成自由链时，产生在FET2附近的电荷分布的干扰，或是作为聚合酶1的构象变化的结果，或者由于核苷酸的扩散，可能在FET 2附近用电活性标签修饰。电荷分布的那些修饰由纳米线-FET 2感测并且检测为FET跨导电流中的调制(modulation)。
本文阐述的基于FET的装置和方法的一些优点是：(1)可以利用适当缩放的FET实现单分子灵敏度；(2)促进高度并行化(parallelization)(也称为“多路复用性(multiplexability)”)，因为检测到的电荷干扰定位在聚合酶附近，从而避免相邻FET位点之间的串扰；(3)传导系链的任选使用有助于将电荷扰动传输到门极，并使从生物溶液中筛选的不期望的影响最小化，以及(4)硅纳米线FET可以使用与半导体制造设施兼容的工艺方便地制造。
本文使用的术语将被理解为采取它们的普通含义，除非另有规定。本文使用的几个术语的实例及其定义如下所述。
如本文所使用的，术语“阵列”是指附着到一个或多个固相基底的电荷传感器或分子的群体，使得电荷传感器或分子可以根据它们的相对位置彼此区分。阵列可以包括不同的分子，它们各自位于固相基底上的不同的可寻址位置(例如，在不同的电荷传感器处)。或者，阵列可以包括各自携带不同分子的单独的固相基底，其中可以根据附着固相基底的表面上固相基底的位置或根据固相基底在诸如流体流的液体中的位置鉴定。阵列的分子可以是核酸引物，核酸探针，核酸模板或核酸酶，如聚合酶和外切核酸酶。
如本文所使用的，术语“附着”是指两个物体彼此连接，紧固，粘附，联接或结合的状态。例如，反应组分，如聚合酶，可以通过共价或非共价键附着到固相组分，如电荷传感器。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及电子对的共享的化学键，并且可以包括例如氢键，离子键，范德华力，亲水相互作用和疏水相互作用。
如本文所使用的，术语“电荷传感器”旨在表示将其表面或其周围电场处的扰动转化为电信号的检测装置。例如，电荷传感器可以将反应组分的到达或离开转化为电信号。电荷传感器还可以将两个反应组分之间的相互作用或单个反应组分中的构象变化转化为电信号。示例性电荷传感器是场效应晶体管(FET)，诸如碳纳米管(CNT)，基于单壁碳纳米管(SWNT)的FET，硅纳米线(SiNW)FET，石墨烯纳米带FET(graphene nanoribbon FET)(以及由2D材料如MoS 2，硅化物等制作的相关纳米带FET)，隧道FET(tunnel FET,TFET)和陡峭的亚阈值斜率装置(steep subthreshold slope device)(参见例如Swaminathan等人,Proceedings of the 51st Annual Design Automation Conference on DesignAutomation Conference,pg 1-6,ISBN:978-1-4503-2730-5(2014)以及Ionescu等人,Nature 479,329–337(2011))。可以在本公开的方法和装置中使用的FET和SWNT传感器的实例在美国专利申请公开号2013/0078622A1中列出，其通过引用并入本文。
如本文所使用的，术语“可切割的系链”意指具有可通过化学或物理处理选择性断裂的键的化学接头。通常，键断裂就化学或物理处理而言是选择性的，所述处理对存在的其它反应组分没有实质性的不利影响。可裂解的系链可以对用作用剂，如但不限于光，碱，酸，热，酶和化学试剂的选择性键断裂易感。电场和物理搅拌也可用于切割系链。在优选的实施方案中，接头是核苷酸接头。在一些情况下，接头包含由序列特异性限制性内切核酸酶切割的位点。然而，序列特异性切割位点不需要存在于根据本文列出的方法使用的一些接头中。
如本文所使用的，术语“连环体重复”意指单个核酸分子中特定核苷酸序列的连续重复串。连环体重复可以例如通过滚环扩增(RCA)产生，其中重复的核苷酸序列是由RCA复制的模板的互补物。
如本文所使用的，术语“传导系链(conducting tether)”旨在表示可以传导电或可以传输电场的电效应的化学接头。传导系链可用于将反应组分化学连接到电荷传感器，并在反应组分和电荷传感器之间传导电。示例性传导系链包括但不限于具有掺杂聚噻吩、聚(3,4-亚乙基二氧噻吩)、聚乙炔、聚吡咯、聚苯胺、聚芴、聚苯撑、聚芘、聚薁、聚萘、聚咔唑、聚吲哚或聚氮杂卓结构的那些。可以用作传导系链的接头也在美国专利申请公开号2010/0073847A1中列出，其通过引用并入本文。
如本文所使用的，术语“构象信号变化”是指响应于分子部分的结构，形状或排列的变化，来自分子的可检测信号的出现，消失或改变。例如，信号变化可以是由于标记物与分子的第一部分的相互作用的变化，以与分子的第二部分相互作用。该术语当具体描述时意在区分源自分子的标记物的信号变化，由于标记物与特异性结合分子的反应物的相互作用的变化或者标记物与源自该分子的催化活性的产物的相互作用的变化。
如本文所使用的，术语“构象标记的”当用于指分子时，是指具有响应于分子结构变化，分子形状变化或分子的各部分的排列变化的至少一个标记物。分子可以是例如聚合酶，逆转录酶，外切核酸酶或其它核酸酶，如下文列出的那些。分子的部分可以是例如由于围绕在原子之间的分子结构中发生的一个或多个化学键的旋转而改变相对位置的原子。分子的部分可以是大分子的结构域，如相关领域中通常已知的那些。例如，聚合酶包括称为指，掌和拇指结构域的结构域。在蛋白质的情况下，所述部分可以是二级，三级或四级结构的区域。标记物可以例如通过共价连接附着到分子。然而，标记物不需要附着到分子，例如位于分子附近。在具体实施方案中，标记物不附着到分子的反应物或产物，如核苷酸或核酸。
如本文所使用的，术语“不同的”当用于指核酸时，是指核酸具有彼此不同的核苷酸序列。两种或更多种不同的核酸可以具有沿其整个长度不同的核苷酸序列。或者，两种或更多种不同的核酸可以具有沿其长度的实质性部分不同的核苷酸序列。例如，两种或更多种不同的核酸可以具有对于两种或更多种分子不同的靶核苷酸序列部分，同时还具有在两种或更多种分子上相同的通用序列部分。术语“不同的”可以类似地应用于其它分子，如聚合酶和核酸酶。
如本文所使用的，当用于指项集合时，术语“每个”旨在鉴定集合中的单个项，但不一定指的是集合中的每个项目。如果明确披露或上下文另有明确规定，则可发生异常。
如本文所使用的，术语“流体连通(fluidic communication)”当用于指流体中的分子和与流体接触的位点时，是指分子在流体中移动或通过流体接触或进入位点的能力。该术语还可以指分子从该位点分离或离开进入溶液的位点的能力。当没有阻止分子进入位点，与位点接触，从位点分离和/或离开位点的屏障时，可发生流体连通。然而，流体连通理解为存在，即使扩散被延迟，减少或改变，只要不是绝对防止存取(access)。
如本文所使用的，术语“标记物”当用于指反应组分时，意在表示可检测的反应组分或反应组分的可检测部分。有用的标记物是可以由电荷传感器检测的电荷标记物(也称为电荷标签)。标记物可以是待检测的反应组分(例如聚合酶的带电荷氨基酸)固有的或标记物可以是反应组分(例如氨基酸的非天然存在的修饰)外在的。在一些实施方案中，标记物可包括具有单独功能的多个部分。例如，标记物可以包括接头组分(如核酸)和电荷标签组分。
如本文所使用的，术语“非天然的”当用于指分子的部分时，意图指发现在其天然环境中或在未受人，技术干预干扰的生物系统中未与分子附着的部分。通常，非天然部分是分子的合成修饰，其使得分子在结构上或化学上不同于未修饰的分子或具有天然修饰的分子。如本文所使用的，术语“非天然的”当用于指用于方法的类似物时，意指在方法发生的天然环境中没有发现的类似物。通常，非天然类似物是在结构上或化学上不同于类似物所属类别中的其它分子类型的合成类似物。
如本文所使用的，术语“核酸”旨在与其在本领域中的用途一致，并且包括天然存在的核酸或其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作特定核苷酸序列复制的模板。天然存在的核酸通常具有含有磷酸二酯键的主链。类似结构可以具有替代的主链连接，包括本领域中已知的多种连接的任何一种，如肽核酸(PNA)或锁定核酸(LNA)。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如存在于脱氧核糖核酸(DNA)中)或核糖(例如存在于核糖核酸(RNA)中)。
核酸可以含有本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任何一种。核酸可以包括天然或非天然碱基。在这点上，天然脱氧核糖核酸可具有选自腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶或鸟嘌呤的一种或多种碱基，并且核糖核酸可具有选自尿嘧啶，腺嘌呤，胞嘧啶或鸟嘌呤的一个或多个碱基。可以包括在核酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。
如本文所使用的，术语“核苷酸”意图包括天然核苷酸，其类似物，核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，双脱氧核糖核苷酸和称为核苷酸的其它分子。该术语可以用于指存在于聚合物中的单体单元，例如以鉴定存在于DNA或RNA链中的亚基。该术语还可以用于指不一定存在于聚合物中的分子，例如能够通过聚合酶以模板依赖性方式掺入多核苷酸中的分子。该术语可以指在5’碳上具有例如0、1、2、3或更多个磷酸酯的核苷单元。例如，四磷酸核苷酸和五磷酸核苷酸可以是特别有用的。示例性天然核苷酸包括但不限于ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP、和dGMP。
非天然核苷酸在本文中也称为核苷酸类似物，包括不存在于天然生物系统中或在其天然环境中基本上不通过聚合酶掺入多核苷酸的那些，例如在表达聚合酶的非重组细胞中。特别有用的非天然核苷酸包括通过聚合酶以下述速率掺入多核苷酸链中的那些，所述速率比通过聚合酶将另一种核苷酸，如与相同Watson-Crick互补碱基碱基配对的天然核苷酸掺入链中的速率实质性更快或更慢。例如，当与天然核苷酸的掺入速率相比时，可以以至少2倍不同，5倍不同，10倍不同，25倍不同，50倍不同，100倍不同，1000倍不同，10000倍不同或更多掺入非天然核苷酸。非天然核苷酸在掺入多核苷酸后能够进一步延伸。实例包括具有3’羟基的核苷酸类似物或在3’位置具有可逆终止剂部分的核苷酸类似物，其可被除去以允许已经掺入核苷酸类似物中的多核苷酸进一步延伸。可以使用的可逆终止剂的实例描述于例如美国专利号7,427,673；7,414,116；和7,057,026及PCT公开WO 91/06678和WO 07/123744，每篇通过引用并入本文。应当理解，在一些实施方案中，可以在掺入核苷酸类似物的多核苷酸不进一步延伸的条件下使用具有3’终止剂部分或缺少3’羟基的核苷酸类似物(例如双脱氧核苷酸类似物)。在一些实施方案中，核苷酸不包括可逆的终止剂部分，或者核苷酸不包括非可逆的终止剂部分，或者核苷酸将不包括任何终止剂部分。在5’位置具有修饰的核苷酸类似物也是有用的。
如本文所使用的，术语“保护部分”旨在表示附着到反应组分以防止反应组分经历特定反应的化合物或其部分。例如，核酸分子可以与核酸酶结合，使得核酸分子通过否则会引起酶的降解或修饰的处理来防止核酸酶降解或修饰。抗体还可以用于结合反应组分以保护反应组分免于降解，失活或其它反应。
如本文所使用的，术语“反应组分”意指参与反应的分子。实例包括在反应中消耗的反应物，由反应创建的产物，促进反应的催化剂如酶，溶剂，盐，缓冲剂和其它分子。
如本文所使用的，术语“排斥部分”意指将占据空间以防止或抑制空间处另一分子占据或抑制空间附近另一分子并置的分子或其部分。排斥部分可以通过空间排除，电荷排斥，疏水-亲水排斥或其它力起作用。
如本文所使用的，术语“终止剂部分”当用于指核苷酸时，是指抑制或阻止核苷酸与第二核苷酸形成共价连接的核苷酸的一部分。例如，在具有戊糖部分的核苷酸的情况下，终止剂部分可以防止在核苷酸的3’氧和第二核苷酸的5’磷酸之间形成磷酸二酯键。终止剂部分可以是作为存在于核酸聚合物中的单体单元的核苷酸的一部分，或者终止剂部分可以是游离核苷酸(例如核苷酸三磷酸)的一部分。作为核苷酸的一部分的终止剂部分可以是可逆的，使得可以修饰终止剂部分以使核苷酸能够形成与第二核苷酸的共价连接。在具体的实施方案中，终止剂部分，如可逆终止剂部分，可以附着到核苷酸类似物的戊糖部分的3’位置或2’位置。
如本文所使用的，术语“固体支持物”是指不溶于水性液体的刚性基底。基底可以是无孔的或多孔的。基底可以任选地能够吸收液体(例如由于孔隙率(porosity))，但是通常将具有足够的刚性，使得当吸收液体时基底不会实质性膨胀，并且当通过干燥除去液体时基底不会实质性收缩。无孔固体支持物通常对液体或气体是不可渗透的。示例性的固体载体包括但不限于玻璃和改性或功能化玻璃，塑料(包括丙烯酸类(acrylics)，聚苯乙烯(polystyrene)和苯乙烯和其它材料的共聚物，聚丙烯，聚乙烯，聚丁烯，聚氨酯，TeflonTM，环烯烃，聚酰亚胺等)，尼龙，陶瓷，树脂，Zeonor，二氧化硅(silica)或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性硅，碳，金属，无机玻璃，光纤束和聚合物。对于一些实施方案，特别有用的固体支持物位于流动池装置内。下面进一步详细阐述示例性流动池。
如本文所使用的，术语“类型”(或“种类”)用于鉴定具有相同化学结构的分子。例如，核苷酸的混合物可以包括几个dCTP分子。dCTP分子将被理解为彼此相同的类型或种类。类似地，具有相同核苷酸序列的单个DNA分子是相同类型或种类。
可以根据上述定义来理解以下阐述的并且在权利要求书中记载的实施方案。
本公开提供了可用于在应用中的单分子检测的装置，组合物和方法，如在核酸测序程序中检测的核苷酸掺入事件。本文列出的装置，组合物和方法特别可用于例如单分子核酸测序反应，如合成测序。然而，应当理解，本文列出的装置，组合物和方法可用于任何其它合适的检测方案，包括但不限于单分子检测。
本公开提供了第一核酸测序方法。该方法可以包括以下步骤：(a)提供拴系到固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)提供一种或多种经标记的核苷酸，由此当标记物接近电荷传感器时，电荷传感器可以检测标记物的存在；和(c)检测经标记的核苷酸对与模板核酸互补的新生链中的掺入。
在第一核酸测序方法中使用的聚合酶可以用包含核酸的系链附着到固体支持物电荷传感器。例如，系链可以包括脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)或蛋白质核酸(PNA)。
在第一核酸测序方法的一些实施方案中，经标记的核苷酸在核苷酸的γ-磷酸位置标记。标记物可以包含寡核苷酸，并且任选地，寡核苷酸能够与固定的核酸杂交。
进一步任选地，在第一核酸测序方法中使用的固定化核酸是系链的一部分，该系链将聚合酶固定到固体支持物电荷传感器。
在第一核酸测序方法的一些配置(configuration)中，聚合酶保持在与电荷传感器小于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1nm的接近性中(polymerase is held in proximity ofless than 10,9,8,7,6,5,4,3,2,or 1nm to the charge sensor)。
在第一核酸测序方法的一些实施方案中，在掺入后例如通过聚合酶从核苷酸切割标记物。
任选地，在第一核酸测序方法中，一个或多个经标记的核苷酸包含多个电荷标签。例如，一种或多种经标记的核苷酸可以包含四种类型核苷酸中的每一种的独特电荷标签。电荷标签可以是负电荷标签，例如，包括下列一种或多种：磷酸基团，DMT和/或FMOC。或者，电荷标签可以是正电荷标签，任选地包含伯胺。
第一核酸测序方法中的一个或多个经标记的核苷酸可以包括能够与多个固定的系链序列杂交的多个不同的寡核苷酸(即寡核苷酸部分)。或者或另外，多种不同的寡核苷酸可以能够与用于固定聚合酶的特定系链内的多个不同位置杂交。
在第一核酸测序方法的一些实施方案中，一个或多个经标记的核苷酸包含4个不同的电荷标签，并且每个所述经标记的核苷酸包含能够与相同的固定的系链序列杂交的寡核苷酸。
在第一核酸测序方法的一些实施方案中，聚合酶系链和标记核苷酸上的标记物包含彼此互补结合的脱氧核糖核苷酸，彼此互补结合的核糖核苷酸或与核糖核苷酸互补结合的脱氧核糖核苷酸。例如，聚合酶系链和经标记的核苷酸上的标记物可以形成DNA:DNA双链体，RNA:RNA双链体或DNA:RNA异双链体。脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸可以是增加或修饰双链体稳定性的核苷酸类似物。例如，可以使用2’-O-甲基(2’-O-Me)或2’-氟(2’-F)修饰的核糖核苷酸。已2’-O-me和2’-F RNA修饰使RNA:RNA双链体的解链温度每碱基对增加0.5℃至1℃，但是仅导致RNA:DNA稳定性的小变化(Majlessi等人,Nucleic Acids Res.26:2224-9(1998)，通过引用并入本文)。修饰的RNA:RNA碱基对的稳定性的增加可以用于沿着RNA系链精确定位标签，如下所讨论。
此外，电荷传感器可以用捕获寡核苷酸功能化，并且经标记的核苷酸可以包括在第一核酸测序方法中与一个或多个捕获寡核苷酸杂交的寡核苷酸标记物。
在第一核酸测序方法中使用的电荷传感器可以包括纳米线FET。任选地，电荷传感器包括碳纳米管。
第一核酸测序方法中的电荷传感器可以是电荷传感器阵列的一部分。
第一种核酸测序方法的检测步骤可以包括连续检测多个掺入事件。
本文所述的方法和装置可以提供长的核酸测序读段；快速读段；高通量测序能力；和可缩放(scalable)的测序平台。在一些实施方案中，由于本文所阐述的方法和装置提供并行执行的读段次数中的通量的能力，可以通过执行多个重叠读段来减轻单个读取精确性的任何损害。
在图1中显示示例性传感器。这里，聚合酶1创建反应位点，其中核苷酸可以被掺入引发的DNA模板4中。聚合酶1通过系链3附着到纳米线FET 2上。该装置提供单分子灵敏度。在反应位点的电荷分布的变化(例如聚合酶构象变化，核苷酸掺入，带电标签的到达或离开，聚合酶与电荷传感器的接近性的变化等)传递到门级并且可以被检测。
在具体的实施方案中，本发明的装置或方法使用深度缩放的FinFET晶体管作为单分子电荷传感器。FinFet传感器受益于前沿半导体制造商已经在开发的技术。此外，可以使用先前公开的组分，包括但不限于(1)用于在CNT上固定溶菌酶以实时观察酶持续合成能力(processivity)的那些，如Choi等，Science,335,319(2012)中描述，(2)用于将Pol1Klenow片段固定在CNT上并实时观察DNA持续合成能力的那些，如Olsen等人，J.Amer.Chem.Soc.,135,7885(2013)中描述，(3)用于阐明由于蛋白质变构运动而移动带电荷残基的转导机制的那些，如Chi等人，Nano Lett 13,625(2013)中所述。本方法还可以采用美国专利申请公开号2013/0078622A1中所述的装置，装置的部件和方法。每个上述参考文献通过引用并入本文。
美国专利申请公开号2013/0078622A1中列出的装置和方法在50-100mM NaCl中提供1-2nm的Debye筛选长度。在该装置中，变构运动必须接近聚合酶与晶体管的附着点。另外，变构运动必须是碱基依赖性的，以使得能够实时区分不同类型的核苷酸。以前尚未证明这种分辨率。
在图2中显示可以用于克服利用基于变构的检测的一些装置的限制的实施方案。这里，聚合酶可以固定到电荷传感器，如单壁碳纳米管，硅纳米线或FinFET。固定可以通过包括DNA，RNA，PNA或其类似物的系链。为了方便演示，该图显示了栓系到电荷传感器的四种聚合酶，每种聚合酶也结合不同的γ-磷酸经标记的核苷酸类型。如所示，核苷酸具有附着到γ-磷酸的寡核苷酸部分。与靶核酸的模板链正确匹配的β-或γ-磷酸经标记的核苷酸通过也与模板结合聚合酶保持就位(held in place)，所述模板足够长以使寡核苷酸部分暂时杂交到系链(例如经由Watson-Crick碱基互补性)。杂交使寡核苷酸部分干扰电荷传感器周围的场，所述电荷传感器由于通过电荷传感器的晶体管电流的变化，产生可检测的信号。该图显示了进入电荷传感器的1-2nm内的场的寡核苷酸部分。正确匹配的β-或γ-磷酸经标记的核苷酸将被掺入与模板核酸杂交的新生链。继而，这将断裂β磷酸和新掺入的核苷酸之间的键。结果，寡核苷酸部分(无论连接在核苷酸的β或γ位置)是自由的，以从系链中去杂交并且远离电荷传感器扩散开来，从而使传感器周围的场返回到其非扰动状态。当电荷传感器周围的场被干扰并分别返回到非扰动状态时，信号的出现和消失可以与核苷酸对靶核酸的新生链中的掺入相关。
具体实施方案可以利用γ-磷酸经标记的核苷酸与聚合酶和系链的协同结合。寡核苷酸部分:系链复合物的稳定性可以相对低，使得不形成复合物用于γ-磷酸盐经标记的核苷酸，其也不与聚合酶结合(即在溶液中游离的γ-磷酸盐经标记的核苷酸基本上不结合系链)。然而，核苷酸部分对聚合酶的亲和力和寡核苷酸部分对系链的亲和力的协同效应加起来总体上允许实质性的结合亲和力。在一些实施方案中，协同效应可以利用核苷酸标记物和系链之间的特异性结合亲和力以及由非特异性结合相互作用产生的弱亲和力的组合。例如，特异性结合可由标准Watson-Crick碱基配对产生，而非特异性结合相互作用可由混杂碱基(例如肌苷)与天然核苷酸的相互作用产生。因此，当γ-磷酸经标记的核苷酸在掺入期间结合到聚合酶时，发生协同结合，这极大地增加了寡核苷酸部分和系链之间的相互作用的稳定性。在酶切割γ磷酸之后，协同效应丧失，并且寡核苷酸部分将从系链解离。
在模板链的每个位置掺入新生链中的核苷酸的类型可以基于掺入每种类型的核苷酸的标记物的独特性质来确定。例如，四种类型的dNTP可以通过寡核苷酸部分与系链杂交的位置，寡核苷酸部分的长度和/或标记物上带电荷部分的存在来区分。图2提供了使用2个电荷标签(除了寡核苷酸部分的带负电荷的磷酸外)和两个系链杂交位置实现四种状态区分的实例。特别地，dCTP用带负电荷的外在部分独特标记，dTTP用带正电荷的外在部分独特标记，dATP和dGTP基于不存在任何外在电荷部分与其它两种核苷酸类型区别，并且dATP与dGTP区别，基于当它们与系链杂交时寡核苷酸部分与电荷传感器的差异接近性。
应当理解，可以基于正电荷部分，负电荷部分和/或系链杂交位置的多种组合中的任一种来区分不同的核苷酸类型。或者或另外，用于区分不同类型的核苷酸的电荷部分可以在电荷的强度方面不同，即使电荷具有相同的符号。另外，图3中显示的示例性配置提供了基于单一系链杂交位置和四个不同电荷部分的四态辨别。具体地，dGTP和dCTP都含有将它们与dATP和dTTP区分开的带负电荷的部分，并且dGTP可以由于可区别地高于dCTP上的电荷的电荷而与dCTP区分开。类似地，由于与dTTP部分相比dATP部分的更高的正电荷，dATP和dTTP可以彼此区分。
如本文中先前所述，可以通过使用具有核糖核苷酸的系链和具有2’-O-Me和2’F修饰的RNA碱基的核苷酸标记物增强沿着系链在特异性杂交位置处的标签放置精密度。替代配置可以使用含有2’-O-Me和2’F修饰的核糖核苷酸的系链及具有核糖核苷酸的标记物，或者系链和标记物两者都可以包含天然核糖核苷酸和2’-O-Me和2’F修饰的核糖核苷酸的混合物。尽管可以使用主要由RNA组成的系链和/或寡核苷酸部分，但可能期望使用基于DNA或基于PNA的系链和/或寡核苷酸以避免与RNA相关的核酸酶敏感性。例如，基于DNA或基于PNA的系链和/或寡核苷酸可包括天然核糖核苷酸或非天然核糖核苷酸类似物，以实现本文中列出的结合优势，同时降低不想要的核酸酶消化的风险。在进一步的实施方案中，系链可以包括与核苷酸标记物中的核糖核苷酸互补的一个或多个脱氧核糖核苷酸，或者备选系链可以包括与核苷酸标记物中的脱氧核糖核苷酸互补的核糖核苷酸。
将聚合酶附着到电荷传感器的系链可以具有不同核苷酸类似物的不同结合位置，如本文中的几个示例性实施方案中列出的。两个或更多个核苷酸类似物的结合位置可以重叠，或者它们可以是离散的，没有重叠。例如，如图10中所示，ATP和GTP类似物的结合位点在系链上重叠2个核苷酸(即在两个结合位点之间有1个核苷酸偏移)。为了说明的目的，将系链序列描绘为一系列通用的“N”核苷酸。可以根据互补性和期望的杂交强度和特异性的规则使用多种序列中的任一种。也如图10中所示，系链上的ATP和TTP的结合位点没有重叠，是离散的并且以1个核苷酸分开。根据系链的长度，结合位点的长度和寡核苷酸部分在核苷酸类似物上的长度，系链上的一些，全部或无连接位点可以重叠。
核苷酸类似物的寡核苷酸部分可以具有与系链上的互补序列特异性杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸部分还可以包括非特异性结合系链的混杂核苷酸位置。此类位置可以提供寡核苷酸部分和系链之间的弱相互作用，其促进特定杂合物结构的形成。例如，如图11中所示，寡核苷酸部分可以包括几个肌苷(I)，已知所述肌苷与DNA的所有四种天然核苷酸混杂地(尽管弱地)结合。寡核苷酸部分和系链可以通过寡核苷酸部分中的肌苷与系链中的天然核苷酸之间的相互作用形成弱复合物。这可以允许序列的特异性部分(例如，在图中指示为ABC及其互补物A’B’C’)比缺乏弱复合物的形成在扩散需要时它们会具有的情况更快地缔合。此外，一旦形成了特异性复合物，肌苷可提供进一步的稳定性。
图11中的示例性寡核苷酸部分包括在特定序列两侧侧翼的混杂核苷酸位置。然而，应当理解，一个或多个混杂核苷酸位置可以仅位于特定序列的5’或3’侧。混杂核苷酸位置的其它实例包括通过简并寡核苷酸合成形成的那些或与本领域已知与2种或更多种类型的核苷酸混杂杂交的其它核苷酸类似物形成的那些。
在图10和图11中显示的实例以及本文中列出的其它实例中，系链是与核苷酸类似物的寡核苷酸部分杂交的核酸。应当理解，其它结合配偶体可以用作系链和标记物部分而不是核酸。结合位点可以是离散的或重叠的，如上文针对核酸所举例说明的。此外，结合位点可以包括弱的、非特异性相互作用配偶体以及较强的、特异性相互作用配偶体的组合。
本文中列出的几个实施方案已经举例说明了具有不同长度的寡核苷酸部分的多种不同核苷酸类似物的用途。在此类实施方案中，可以基于寡核苷酸部分的不同长度区分不同的核苷酸类型。或者，不同的核苷酸类似物可以具有相同长度的寡核苷酸部分。然而，与其它核苷酸类似物结合的区域相比，每个核苷酸类似物可以具有结合系链的不同区域的特异性结合序列。示例性配置在图12中显示，其中聚合酶与不同核苷酸类似物的结合使聚合酶处于四种可区分的状态之一。用于ATP类似物的寡核苷酸部分结合系链上最靠近系链对聚合酶的附着点的位置，用于TTP类似物的寡核苷酸部分结合系链上距离系链对聚合物的附着点最远的位置，并且用于GTP和CTP类似物的寡核苷酸部分分别结合系链上距其它两种核苷酸类似物的结合位点的中间距离的位置。因此，不同核苷酸类似物与聚合酶的结合将使聚合酶位于离电荷传感器不同的距离(例如引起不同大小的环在系链中形成，如图中显示)。可以基于对聚合酶与传感器的不同距离产生的信号的差异来区分不同的核苷酸类型。在一个或多个核苷酸类似物包括电荷标签或其它可检测部分(例如在核苷酸部分远端的寡核苷酸部分末端附着)的实施方案中，寡核苷酸部分和系链之间的结合将使可检测部分位于距离电荷传感器的不同距离。在这种情况下，可以基于针对可检测部分与传感器的不同距离产生的信号的差异来区分不同的核苷酸类型。
如由图4中图示的实施方案证明，将聚合酶附着到电荷传感器的系链不需要能够与存在于核苷酸上的标签杂交。相反，可以将电荷传感器官能化以附着与检测的一种或多种核苷酸类型互补的一种或多种寡核苷酸。可以基于电荷的符号、电荷的强度、与表面附着的寡核苷酸杂交的寡核苷酸部分的长度或表面附着的寡核苷酸上寡核苷酸部分杂交的邻近/位置、或其组合来实现不同核苷酸的辨别。
上文列出的几种配置的优点包括例如通过以原子精确性将电荷置于门极的1-2nm内克服屏蔽问题(screening issue)、通过使用电荷标签实现更高水平的电流调制的能力，以及由于检测不需要碱基特异性变构运动而开放可用聚合酶的空间。
可以用于本文中列出的装置和方法的示例性电荷标签是磷酸酯部分，例如，位于核酸部分的5’端。此部分可以在可用的寡核苷酸合成方案期间容易地添加，并且将在寡核苷酸部分的末端产生两个带负电荷的氧，如图5中显示。通过使用2-[2-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)乙基磺酰基]乙基-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺(获自GlenResearch，Sterling VA，产品目录号CPR 10-1900)将DMT保护基转化为5’磷酸基团实现寡核苷酸合成期间的化学磷酸化。可以使用三-2,2,2-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(获自Glen Research,Sterling VA，产品目录号10-1922-xx)，1,3-双-[5-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基酰氨基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(获自Glen Research,SterlingVA，产品目录号10-1920-xx)，1-[5-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基酰氨基]-3-[5-芴甲氧基羰基氧基戊基酰氨基]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(获自Glen Research,Sterling VA，产品目录号10-1921-xx)，或oligonucleotide dendrimerswhich含有各种数目的DMT(4,4’-二甲氧基三苯甲基)或Fmoc(芴基甲氧基羰基)模块，诸如那些获自Glen Research或图6中显示的模块制备具有不同数目的负电荷的电荷标签系列。另一种有用的带正电荷的部分是在合适的pH将具有单一正电荷的5’伯胺。
表I提供了可用作本文中列出的装置或方法的标记物的有用的修饰和电荷的列表。
表I
Figure BDA0001245027480000171
Figure BDA0001245027480000181
本公开内容提供了用于将反应组分附着到电荷传感器的方法。方法可以包括以下步骤：(a)提供包含多个电荷传感器的固体支持物，其中每个电荷传感器具有附着多个反应组分的能力；(b)提供含有特定类型的多个反应组分的流体；并且(c)在下述条件下使固体支持物与流体接触，其中(i)特定类型的多个反应组分与多个电荷传感器流体连通，(ii)特定类型的反应组分的数目在流体中大于固体支持物上的电荷传感器的数目；和(iii)来自流体的特定类型的反应组分在导致固体支持物的条件下附着到电荷传感器，其中将每个电荷传感器附着到反应组分中的单一一种。
在一些实施方案中，用于将反应组分附着到电荷传感器的方法可以包括以下步骤：(a)提供包含多个电荷传感器的固体支持物，其中每个所述电荷传感器具有附着多个反应组分的能力；(b)提供含有特定类型的多个反应组分的流体，其中特定类型的每个反应组分与排斥部分结合；和(c)在下述条件下使所述固体支持物与所述流体接触，其中(i)特定类型的多个反应组分与所述多个电荷传感器流体连通，(ii)特定类型的反应组分的数目在流体中大于所述固体支持物上的电荷传感器的数目；(iii)来自流体的反应组分附着到电荷传感器，并且(iv)结合到每个反应组分的排斥部分防止多个反应组分中的多于一个反应组分附着到每个电荷传感器。
用于将反应组分附着到电荷传感器的方法可以包括以下步骤：(a)提供包括多个电荷传感器的固体支持物，其中每个电荷传感器具有附着多个反应组分的能力；(b)提供含有特定类型的多个反应组分的流体；(c)在下述条件下使固体支持物与流体接触，其中(i)特定类型的多个反应组分与多个电荷传感器流体连通，(ii)特定类型的反应组分的数目在流体中大于所述固体支持物上的电荷传感器的数目；和(iii)来自流体的特定类型的反应组分附着到电荷传感器，从而形成附着到来自流体的特定类型的多个反应组分的经修饰的电荷传感器；和(d)从每个经修饰的电荷传感器中除去特定类型的一种或多种反应组分，以留下附着到每个经修饰的电荷传感器的特定类型的反应组分中的单一一种。
有用的电荷装置包括分析装置，其可以以允许反应事件快速且方便转化为可检测信号的方式，将反应组分引入与转导元件直接空间接触。基于场效应晶体管(FET)的器件可以直接将反应组分(例如聚合酶)和晶体管表面之间的相互作用转化为可读电信号。在标准FET中，电流沿着与两个电极(源极和漏极)连接的导电路径(通道)流动。通过可以经由电介质薄层电容耦合的第三(门极)电极打开或关闭源极和漏极之间的通道电导。
在具体的实施方案中，FET经配置以实现单分子检测。更具体地，这些电荷传感器可以配置为监测单分子反应的动力学。通常在场效应晶体管中发现的任何类型的导电通道可以用于本文中列出的装置或方法中。示例性导电通道由金属、金属氧化物、半导体或纳米级导体，如纳米线或石墨烯形成。
对于单分子检测特别有用的电荷传感器是单壁碳纳米管(SWNT)。参见，例如Staret al.,Nano.Lett.3,459(2003)；Star et al.,Org.Lett.6,2089(2004)；Besterman etal.,Nano.Lett.3,727(2003)；Gruner,Anal.Biooanal.Chem.384,322(2005)；Chen etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,4984(2003)和美国专利公开号2013/0078622A1，每篇通过引用并入本文。SWNT是极小的导体，通常约1纳米级的直径。
可以用化学选择性聚合物、金属或金属氧化物纳米颗粒或反应组分，如蛋白质、核酸或抗体包被SWNT。参见例如Besterman et al.,Nano.Lett.3,727(2003)；及Chen etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,4984(2003)。可以使用本文中列出的方法将单个反应组分附着到这些SWNT和其它电荷传感器。
在一些实施方案中，可以通过例如使用Goldsmith et al.Science 315,77(2007)(其通过引用并入本文)中列出的技术在电荷传感器上创建一个单一共价缺陷将单个反应组分附着到电荷传感器。例如，可以产生具有单个缺陷的SWNT，使得可以使用多种附着化学来选择性将单个反应组分与反应性缺陷位点连接，而不用额外的反应组分包被SWNT的剩余部分。也可以例如使用Chen et al,J.Am.Chem.Soc.123,3838(2001)(其通过引用并入本文)中列出的技术，通过非共价手段将SWNT附着到反应组分。可以如本文中列出的那样修改这些方法，以将单个反应组分以非共价方式可靠地结合到SWNT。
SWNT是具有电子带隙的半导体，所述电子带隙可以从1电子伏特变化到有效地0。SWNT可用作导电通道，因为单分子感测装置在具有或不具有门极电极的情况下，并且在玻璃、塑料或硅基底上从任何类型的SWNT线制作。在美国专利申请公开号2013/0078622A1(其通过引用并入本文)中列出了用于单分子检测的有用的SWNT和它们的构造。
可以修改以用于本文中列出的装置或方法的其它电荷传感器包括但不限于硅纳米线(SiNW)FET、由III-V材料制成的FET、硅FinFET、石墨烯纳米带(nanoribbon)FET以及来自其它2D材料，如MoS2和硅烯(silicene)的纳米带FET，隧道FET(TFET)和陡峭的亚阈值斜率器件(参见例如Swaminathan et al.,Proceedings of the 51st Annual DesignAutomation Conference on Design Automation Conference,pg 1-6,ISBN:978-1-4503-2730-5(2014)及Ionescu et al.,Nature 479,329–337(2011))。碳纳米管也可以是有用的。
可以以电荷传感器阵列的形式提供多个电荷传感器。阵列可以包括至少10、100、1x 103、1x 104、1x 104、1x 104或更多个电荷传感器。每个单独的电荷传感器可以位于阵列中与阵列中的其它电荷传感器分离的离散位置。例如，每个电荷传感器可以驻留在固体支持物中的孔或凹陷中。这些位置(即使当彼此分离时)可以任选地与总体溶液(bulksolution)流体接触。在此类配置中，可以通过经由大量流体递送将常见的试剂递送到所有电荷传感器在电荷传感器阵列上发生多重反应。以核酸测序反应为例，可以通过总体溶液将核苷酸递送到孔(或其它特征)的阵列，每个孔(或其它特征)容纳个别的测序反应。核苷酸递送将导致在孔(或其它特征)处的平行测序反应。
电荷传感器(如Si纳米线)可具有小于10nm宽且大于100nm长的尺寸。可以将Si纳米线或其它电荷传感器置于10nm x 10nm，50nm x 100nm或更大的孔中。例如，电荷传感器驻留的孔可以在表面上具有至少100nm2、1000nm2、5000nm2、1x 104nm2或更大的开口。从电荷感测元件读出信号的电路可以占据1微米x1微米或更大的固体支持物的面积。
在一些实施方案中，电荷传感器将沿着整个长度具有一致的宽度。或者，电荷传感器沿其长度可具有实质的可变的宽度。例如，电荷传感器可以包括相对窄的宽度的区域，类似于“夹紧”区域。夹点区域的宽度可以具有例如电荷传感器的相对较大宽度的区域的直径的75％、50％、40％、30％、20％或10％的直径。夹点可以提供增加聚合酶的带电残基运动对传感器的影响的优点。另一个益处是通道制作的放松的容忍(relaxed tolerances)和FET传感器的第一层电介质钝化的打开/对准。例如，具有20nm直径及10nm夹紧区域的电荷传感器可以是特别有用的。具有夹紧区域的电荷传感器的其它尺寸包括例如至少25、30、35或40nm或更大的直径及至多10、20、30、40或50nm长的夹紧区域。也可以使用具有较小直径的传感器，例如具有至少5、10、15或20nm的直径的那些传感器可以具有在示例的范围中的长度的夹紧区域。应当理解，在一些实施方案中，电荷传感器的最大直径将是50nm、40nm、30nm、20nm、10nm或更小。
可以将用于聚合酶或其它酶的系链附着到夹紧区域或在夹紧区域近端的点处。因此，可以放置系链以在夹紧区域附近定位聚合酶或其它酶。
在图8中显示了具有夹紧区域的电荷传感器的示例性实施方式。可以经由适当的光刻掩模(lithographic mask)设计制作夹紧区域，其中掩模的形状使得它产生期望的夹点。或者，在光刻图案化期间的邻近效应可以用于通过将与传感器正交的电极放置成紧密邻近待夹紧的区域来局部夹紧电荷传感器。在产生期望的夹点外，接近性电极(proximityelectrode)可以用于产生将酶定位于夹点区域处的电泳力。
图9中显示了另一个示例性实施方式。这里，使用局部氧化将夹点引入硅中。在第一步中，用氧化屏障(如氮化硅(SiNx))包被硅线。可以使用局部光刻暴露硅线的区域以蚀刻掉氧化屏障。然后，可以氧化部分包被的线以减小暴露区域处的硅线的宽度。可以实施进一步的蚀刻以暴露用于化学偶联的硅夹点。
本领域技术人员将认识到，用于在电荷传感器中产生夹点的上述方法是示例性的而非限制性的；可以利用半导体制造中常见的许多其它方法，例如经由使用牺牲层、选择性沉积和蚀刻、或额外的光刻掩模等来产生夹点。
阵列的密度可以是每平方cm为2至多达10亿或更多个不同的反应位点。极高密度阵列在本发明中是有用的，包括例如具有至少约10,000,000个反应位点/cm2，包括例如至少约100,000,000个反应位点/cm2、1,000,000,000个反应位点/cm2、直至约2,000,000,000个反应位点/cm2或更高的那些。也可以使用高密度阵列，包括例如在约100,000个反应位点/cm2至约10,000,000个反应位点/cm2范围内的那些。可用于本发明的中等密度阵列的范围可以为约10,000个反应位点/cm2至约100,000个反应位点/cm2。低密度阵列通常小于约10,000个反应位点/cm2。
可以将多种反应组分之中的任一种附着到电荷传感器。例如，受体，如抗体或凝集素；配体，如核苷酸，表位，碳水化合物或候选药物；核酸，如靶核酸，系链核酸或与本文中列出的反应有关的列出的其它核酸；或酶，如聚合酶或其它核酸结合酶，激酶，磷酸酶，外切核酸酶，蛋白酶，或代谢酶。其它有用的反应组分包括但不限于本文中列出或分子生物学或生物化学领域中已知的反应的组分。
多重实施方案(包括例如采用电荷传感器阵列的实施方案)可以配置成使得将单个类型的反应部件附着到每个电荷传感器。例如，可以将多重实施方案中的电荷传感器基本上全部附着到聚合酶。此外，可以将相同种类的聚合酶附着到每个电荷传感器。此配置可以提供来自每个电荷传感器的预期的均匀输出，但是提供与每个相应电荷传感器接触的其它反应组分的差异。可以通过提供当将聚合酶附着到电荷传感器时就具有单一类型的聚合酶而言均质的流体来实现此类配置。
可以在本文中列出的方法或组合物中使用多种聚合酶之中的任一种，包括例如从生物系统分离的基于蛋白质的酶或其功能性变体。除非另有指示，提及特定聚合酶(如下文例示的那些聚合酶)将理解为包括其功能变体。聚合酶的特别有用的功能是使用现有核酸作为模板催化核酸链的聚合。在本文中别处描述其它有用的功能。有用的聚合酶的实例包括DNA聚合酶和RNA聚合酶。示例性DNA聚合酶包括已经通过结构同源性分类为鉴定为A、B、C、D、X、Y和RT的家族的那些DNA聚合酶。家族A中的DNA聚合酶包括例如T7DNA聚合酶、真核线粒体DNA聚合酶γ、大肠杆菌DNA Pol I、栖热水生菌(Thermus aquaticus)Pol I、和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)Pol I。家族B中的DNA聚合酶包括例如真核DNA聚合酶α、δ、和ε；DNA聚合酶ζ；T4DNA聚合酶，Phi29 DNA聚合酶，和RB69噬菌体DNA聚合酶。家族C包括例如大肠杆菌DNA聚合酶IIIα亚基。家族D包括例如源自古细菌的广古生菌界(Euryarchaeota)亚结构域的聚合酶。家族X中的DNA聚合酶包括例如真核聚合酶Polβ、polσ、Polλ和Polμ，以及酿酒酵母(S.cerevisiae)Pol4。家族Y中的DNA聚合酶包括例如Polη、Pol iota、Pol kappa、大肠杆菌Pol IV(DINB)和大肠杆菌Pol V(UmuD’2C)。DNA聚合酶的RT(逆转录酶)家族包括例如逆转录病毒逆转录酶和真核端粒酶。示例性RNA聚合酶包括但不限于病毒RNA聚合酶，如T7RNA聚合酶；真核RNA聚合酶，如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV和RNA聚合酶V；和古细菌RNA聚合酶。
提供上述分类用于例示目的。应当理解，分类系统中的变化是可能的。例如，在至少一个分类系统中，家族C聚合酶已经分类为家族X的亚类。此外，聚合酶可以根据其它特征(无论是功能的还是结构的)分类，所述特征可以或可以不与上文例示的结构特征重叠。在下文更为详细列出了一些示例性特性。
具有固有3’-5’校对外切核酸酶活性的聚合酶可用于一些实施方案。基本上缺乏3’-5’校对外切核酸酶活性的聚合酶也可用于一些实施方案，例如在大多数测序实施方案中。外切核酸酶活性的缺乏可以是野生型特征或由变体或工程化聚合酶结构赋予的特征。例如，外切负(exo minus)Klenow片段是缺乏3’-5’校正外切核酸酶活性的Klenow片段的突变形式。Klenow片段及其外切负变体可以用于本文中列出的方法或组合物。另一方面，A家族DNA聚合酶的大片段(如Bsu DNA聚合酶I(Bsu-LF))天然缺乏3’-5’外切核酸酶功能。
具有3’至5’外切核酸酶活性的聚合酶经历分子内和分子间转换，如例如记载于Lamichhane et al.J.Am.Chem.Soc.135:4735-4742(2013)，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，需要使用缺乏3’至5\x26#39；核酸外切酶活性的聚合酶。例如，在一些实施方案中，转换可以引起难以与由于聚合酶活性而发生并且用于测序或其它分析的一种或多种构象变化区别的构象变化。可以通过除去整个或部分的3’至5’外切核酸酶结构域或通过将功能丧失突变引入3’至5’外切核酸酶结构域除去3’至5’外切核酸酶活性。
可以进一步修饰A家族DNA聚合酶的大片段，如Bsu DNA聚合酶I(Bsu-LF)以用于本文中列出的方法中。天然Bsu-LF不具有半胱氨酸(Cys)残基。可以在Bsu-LF的表面可接近位置处工程化改造一个或多个Cys残基，以允许具有巯基反应性部分的系链或其它接头的方便的附着位点。可以通过检查Bsu-LF或其它同源A家族聚合酶的晶体结构来确定用于引入Cys突变的候选位点。
还可能期望工程化改造Bsu-LF以引入将与电荷传感器有利地相互作用的带电的残基。例如，有益的修饰是将来自Klenow片段的O-螺旋指结构域的一个或多个残基引入Bsu-LF的相当位置中，其最终结果是将更多的带电荷的氨基酸引入突变体Bsu-LF中。关于Klenow片段的O螺旋指结构域的位置(图中的PolIxxo)和图中的Bsu-LF中要替换的位置(Bsuxxx1)，参见图7。可以对其它A家族聚合酶如Taq DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶进行类似的变化。
聚合酶可以根据其持续合成能力来表征。聚合酶可具有至少约50个核苷酸、100个核苷酸、1,000个核苷酸、10,000个核苷酸、100,000个核苷酸或更多的平均持续合成能力。或者/另外，如本文中所述使用的聚合酶的平均持续合成能力可以是例如至多100万个核苷酸、100,000个核苷酸、10,000个核苷酸、1,000个核苷酸、100个核苷酸或50个核苷酸。聚合酶还可以根据其持续合成能力或核苷酸掺入的速率来表征。例如，许多天然聚合酶可以以每秒至少1,000个核苷酸的速率掺入核苷酸。在一些实施方案中，可以期望较慢的速率。例如，合适的聚合酶和反应条件可以用于实现每秒至多500个核苷酸、每秒100个核苷酸、每秒10个核苷酸、每秒1个核苷酸、每10秒1个核苷酸、每分钟1个核苷酸或更慢的平均速率。如本文中别处更为详细列出，可以使用具有比天然存在的核苷酸更慢或更快的掺入速率的核苷酸类似物。应当理解，可以修饰来自多种来源中的任一种的聚合酶以增加或降低其平均持续合成能力或其平均持续合成能力速率(例如核苷酸掺入的平均速率)或两者。因此，可以使用合适的聚合酶、核苷酸类似物、核酸模板和其它反应条件实现期望的反应速率。
根据待使用的实施方案，聚合酶可以是嗜热的或热可失活的。嗜热性聚合酶通常可用于高温条件或热循环条件，如用于聚合酶链式反应(PCR)技术的那些聚合酶。嗜热性聚合酶的实例包括但不限于9°N DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶，
Figure BDA0001245027480000241
DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、RB69DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶和
Figure BDA0001245027480000242
DNA聚合酶。从非嗜热性生物体分离的大多数聚合酶是热可失活的。实例是来自噬菌体的DNA聚合酶。应当理解，可以修饰来自多种来源之中的任一种的聚合酶以增加或降低它们对高温条件的耐受性。热尖峰(即，升高的温度的短暂时间段)可以用于使阵列中的一种或多种热可失活的聚合酶失活，同时使嗜热性聚合酶处于活性状态，用于随后的反应或用于测序反应的后续循环。
在一个备选实施方案中，可以在电荷传感器的多重收集间附着几种不同类型的反应组分。例如，可以将阵列中的电荷传感器的第一子集附着到第一种聚合酶，并且可以将阵列中的电荷传感器的第二子集附着到第二种聚合酶。可以使用两种、三种或更多种聚合酶。当不同的聚合酶对不同类型的核苷酸或不同的模板序列具有不同的特异性或敏感度时，使用不同种类的聚合酶可以是有用的。例如，当将相同类型的核苷酸掺入核酸的新生链中时，不同类型的聚合酶可产生可由电荷传感器检测的可相互区分的信号。在另一个实例中，不同类型的聚合酶可以包括至少一种DNA聚合酶和至少一种RNA聚合酶。可以通过提供流体实现此类配置，所述流体在将聚合酶附着到电荷传感器时就具有多种类型的聚合酶而言是异质的。
在一些配置中，电荷传感器将具有附着特定类型的多于一个反应组分的能力。例如，电荷传感器可以具有附着多于一种聚合酶的能力。根据电荷传感器的大小和由聚合酶占据的体积，电荷传感器可以具有附着至少2、3、4、5、10、15、25或更多种聚合酶的能力。阵列中的多个电荷传感器可以就是如此。如下文会更为详细列出，可以暂时施加条件以降低电荷传感器的容量、增加聚合酶(或其它反应组分)的空间体积(steric bulk)、或者以其它方式有利于将单一聚合酶(或其它反应组件)附着到单独的电荷传感器。再一次，可以将条件应用于电荷传感器的阵列。
可以使用本领域中已知的多种化学品之中的任一种将反应组分附着到电荷传感器。例如，可以使用化学接头。在许多实施方案中，电荷传感器的表面是SiO2、Al2O3、HfO2、Ta2O5之一。也可以使用其它氧化物，例如来自镧系元素组。氮化物和氮氧化合物(oxinytrides)也是可能的。可以方便地通过表面羟基进行对接头的附着。在具体的实施方案中，接头分子包括至少第一和第二官能团。通常，第一官能团与电荷传感器相互作用，并且第二官能团与反应组分相互作用。示例性的第一官能团包括芘、苯、环己烷和2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌。示例性的第二官能团是马来酰亚胺。可以使用已知将蛋白质与表面或其它部分共价连接的其它化学品，如由Thermo Fisher(Waltham，MA)或Sigma Aldrich(St.Louis，MO)出售的那些。附着到系链的聚合酶上的化学基团可以是硫醇，胺或羧基基团。在传导通道是SWNT的某些实施方案中，SWNT的表面是大约一个原子厚的石墨层。可以将接头分子与一个或几个碳原子共价连接，或者它可以通过pi-pi堆叠与SWNT的侧壁相互作用。
可以通过非共价连接(如在受体和配体之间形成的非共价连接)将反应组分附着到电荷传感器。特别有用的连接是链霉亲合素(或其变体或类似物)和生物素(或其类似物)之间的那些连接、互补核酸之间的那些连接、抗体和表位之间的那些连接，等等。可以将上述对的成员分别附着到反应组分和电荷传感器，使得含有反应组分的流体与具有电荷传感器的固体支持物接触将导致形成非共价键，该非共价键将反应组分附着到电荷传感器。
在一些实施方案中，来自流体的反应组分附着到电荷传感器以形成传导系链。示例性传导系链包括具有包括掺杂聚噻吩、聚(3,4-亚乙基二氧噻吩)、聚乙炔、聚吡咯、聚苯胺、聚芴、聚苯撑、聚芘、聚薁、聚萘、聚咔唑、聚吲哚或聚氮杂卓的结构的那些传导系链。可以通过聚合酶的氧化实现这些系链结构的电荷掺杂。在Vernitskaya etal.Russ.Chem.Rev.66:443ff(1997)；MacDiarmid,Angew.Chem.,Int.Ed.40:2581-2590(2001)；或McNeill et al.,Aust.J.Chem.16:1056-75(1963)(每篇通过引用并入本文)中列出了示例性的传导系链及其创建方法。
在具体的实施方案中，固体支持物可以在容器，如孔、管、通道、小杯、培养皿、瓶等内或者是所述容器的部分。特别有用的容器是流动池，例如如记载于US 2010/0111768 A1或Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008)，每篇通过引用并入本文。示例性流动池是可购自Illumina,Inc.(San Diego,CA)的那些流动池。对于在将反应组分附着到电荷传感器期间或者在用电荷传感器上的反应组分实施的后续反应期间将本体试剂(bulk reagents)递送到电荷传感器的阵列，流动池是方便的。循环过程，如核酸测序反应特别良好地适用于流动池装置。另一个特别有用的容器是多孔板或微量滴定板中的孔。
本文中列出的方法可以包括以下步骤：在下述条件下使多个电荷传感器与含有特定类型的多个反应组分的流体接触，其中反应组分与多个电荷传感器流体连通并且反应组分附着到电荷传感器。结果可以是即使当流体中的反应组分的数目大于由流体接触的电荷传感器的数目时，每个电荷传感器也被附着到反应组分中的单一一种。预期附着到特定类型的反应组分之一且仅之一的电荷传感器的分数将符合泊松分布。泊松分布为下述电荷传感器的分数设置37％占据的最大值，所述电荷传感器当将那些反应组分递送到本体流体中的电荷传感器时附着到特定类型的仅单一反应组分。然而，根据本文中列出的方法，特定类型的反应组分(例如聚合酶或其它核酸酶)的本体流体递送可导致所述多个中的大于35％、40％、50％、75％、90％、95％或99％的电荷传感器被特定类型的单一反应组分占据。
在方法的一些实施方案中，可以例如通过扩散或其它被动过程将反应组分从本体溶液转移到电荷传感器。因此，反应组分对电荷传感器的附着可以例如根据本文中列出的或本领域中已知的化学品发生。或者，可以例如通过电场(e-场)辅助转运将反应组分主动转运到电荷传感器。再一次，使用本文中列出或本领域中已知的化学品可以得到反应组分对电荷传感器的附着。
可以修改本文中列出的方法以使用反应组分到含有电荷传感器的位点的电场(e-场)辅助转运。例如，固体支持物上的每个电荷传感器可存在于电耦合到电源以产生电场的位点处，所述电场将聚合酶或其它反应组分吸引到所述位点并且与所述位点处的电荷传感器接近。用于使用e-场辅助将分析物吸引到阵列的位点的示例性方法和装置记载于US2009/0032401A1，其通过引用并入本文。e-场辅助可用于本公开的方法中，例如，在下述条件下，其中多种不同聚合酶(或其它反应组分)处于溶液中，使得聚合酶与多个电荷传感器流体连通。可以调节每个电荷传感器的位点处的电荷以实现聚合酶(或任何其它特定类型的反应组分)的转运的期望的速率或量。
在利用e-场辅助转运的具体实施方案中，可以贯穿用于将聚合酶(或任何其它特定类型的反应组分)附着到电荷传感器的反应过程一致地应用e-场。或者，随着附着反应进行并且电荷传感器充满聚合酶(或任何其它特定类型的反应组分)，可以改变(例如增加或减少)e-场。例如，增加e-场可以提供增加附着到聚合酶的电荷传感器的数目的益处。可以选择增加e-场的速率和增加的幅度范围，以平衡随时间的反应组分转运到电荷传感器的增加速率与在该相同的时间段里已经被附着到聚合酶上的电荷传感器的增加的数目。e-场的变化速率可以基于聚合酶附着的预测或预期速率。或者，可以响应聚合酶附着到电荷传感器的经验检测改变e-场，如本文中更为详细列出。
在具体的实施方案中，可以将e-场基本上均匀地施加到具有电荷传感器的阵列的所有位点。因此，溶液中的聚合酶(或其它反应组分)将具有被转运到任何给定电荷传感器的相等概率。在一个备选实施方案中，可以将e-场仅应用于阵列中存在的电荷传感器位点的子集。这样，可以使用e-场辅助相对于其它电荷传感器选择性地将聚合酶(或其它反应组分)附着到一些电荷传感器。此外，若想要的话，可以在电荷传感器位点的第一子集处施加吸引电荷，以将聚合酶转运到位点的第一子集，并且同时可以将排斥电荷施加到电荷传感器位点的第二子集以抑制聚合酶被转运到那些位点或从位点的第二子集除去(例如通过解吸或降解)聚合酶。类似地，可以将排斥电荷施加到阵列的不含电荷传感器的间隙区域，以抑制聚合酶被转运到间隙区域或从间隙区域除去(例如通过解吸或降解)聚合酶。
在许多配置中，用于电荷传感器的放大器将占据比传感器自身实质性更多的空间。例如，读出电路可以占据检测装置的从2x2微米到20x20微米的任何值的面积，而单一纳米线晶体管可以占据小至100x500纳米。在一些实施方案中，电荷传感器阵列的大小和尺寸可以受到由多个放大器占据的空间限制，例如若每个电荷传感器存在放大器的话。在本装置和方法的具体实施方案中，可以通过配置电荷传感器的阵列，使得每个放大器与几个电荷传感器可操作连接来克服所述限制。例如，可以将2、3、4、5、6、8、10个或更多个电荷传感器与同一个放大器连接。因此，与在放大器和电荷传感器之间存在一对一连接性的配置中相比，阵列上可以存在更高密度的电荷传感器。在操作中，可以分配放大器以放大来自与其连接(或曾经连接)的多个电荷传感器中的仅一个的信号。例如，电荷传感器阵列可以通过使其与包含特定类型的多个反应组分的流体接触来加载。此种加载技术可以导致大量的电荷传感器附着到特定类型的多于一个反应组分，并且根本不对其它电荷传感器加载所述类型的反应组分之任一。在与共同的放大器连接的几个电荷传感器中，可以将仅已经附着到单一反应组分的单一传感器与其它过载(overloaded)或无载(unloaded)的其它传感器区分开，并且可以分配放大器以从单一加载电荷传感器获取信号，而不从与其连接(或曾经连接)的其它电荷传感器获取信号。
在一些实施方案中，单独的电荷传感器将具有特定类型的大于一个反应组分的容量。以聚合酶为例，每个电荷传感器可以具有一次附着几种聚合酶分子的容量。在此类情况下，可以将聚合酶附着到占据空间体积的排斥部分，所述空间体积空间阻碍多于一个与另一个排斥部分结合的聚合酶附着到单独的电荷传感器。类似地，排斥部分可以具有静电阻碍与另一个排斥部分结合的多于一个聚合酶附着到相同电荷传感器的电荷极性。
特别有用的排斥部分是核酸。排斥核酸可提供空间和静电阻碍两者以限制占据。排斥核酸非常适合于对核酸具有结合亲和力的聚合酶、核酸酶和其它反应组分。然而，应当理解，这种类型的亲和力不是必需的，因为合成方法可以用于将排斥核酸附着到反应组分，例如使用本文中列出的或本领域中已知的接头、系链和附着化学品进行。可以调节排斥核酸的长度、序列组成或二级结构以实现期望的占据。例如，当电荷传感器对于将与电荷传感器附着的反应组分具有相对高的容量时，可以使用较大的核酸。较小的核酸可以足以限制较小电荷传感器的加载(或者当使用相对大的反应组分或高度带电的反应组分时，因此仅需要排斥性质的小增加)。核酸也可用作排斥部分，因为可以选择核酸的序列以实现对聚合酶或其它核酸酶的期望的结合特性。
在一些实施方案中，排斥核酸可以被压缩成纳米球结构。将核酸压缩的方法是本领域中已知的(例如，如由Bloomfield,Curr.Opin.Struct.Biol.6(3):334-41(1996)，和美国专利申请公开号2007/0099208A1描述，每篇通过引用并入本文)。例如，可以使用醇或多胺如精胺或亚精胺。压缩的核酸将具有比在不存在压缩剂或压缩条件的情况下核酸的结构更密集压紧的结构，并且该结构通常类似于球或球体。此类压缩的核酸球的产生可用于创建排斥部分。可以使用各种方法来产生期望大小的球，例如使用各种压缩技术和/或改变扩增子中的拷贝数进行。通常，压缩的扩增子具有范围为约0.1μm至约5μm，例如约0.1μm、约0.2μm、约0.5μm、约1μm、2μm、约3μm、约4μm和约5μm的平均直径或宽度。
其它聚合分子也可用作排斥部分，包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、特氟隆(Teflon)、尼龙、聚酰胺、聚缩醛、聚酯、布纳橡胶(Buna rubbers)、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯和聚氯三氟乙烯。由固体支持物材料或凝胶制成的珠或颗粒也可以发挥排斥部分的功能。
在反应组分参与要由与反应组分附着的电荷传感器检测的特定反应时，排斥部分可以保持附着到反应组分。例如，在将聚合酶加载到电荷传感器上并附着到电荷传感器时，与聚合酶结合的排斥部分可以在由电荷传感器检测的随后的核苷酸添加反应中保持附着到聚合酶。或者，在已经将反应组分附着到电荷传感器之后，可以从反应组分中除去排斥部分。再次以聚合酶为例，可以在聚合酶参与检测的与靶核酸的反应前，从聚合酶中除去排斥部分，如排斥核酸。可以通过本领域技术人员已知的技术除去与聚合酶或其它反应组分结合的排斥部分以导致除去。例如，可以通过清洗或使用结合反应组分的其它部分的竞争性置换除去非共价结合的部分。可以通过化学或物理手段(如本文中就切割系链而言列出的那些手段)除去共价结合的部分。一旦从反应组分中除去，可以从保持附着反应组分的电荷传感器洗去排斥部分。
在一些实施方案中，可以过载具有用于特定类型的多于一个反应组分的容量的电荷传感器，使得将单独的电荷传感器附着到几个反应组分，然后可以从电荷传感器除去(或失活或降解)反应组分，从而仅留下附着到单独电荷传感器的单一活性反应组分。例如，可以实施将反应组分附着到电荷传感器的方法，以在每个反应组分和与其附着的电荷传感器之间创建可切割的系链。在一些情况下，在流体中递送的反应组分可以包括可切割系链的前体，电荷传感器可以包括可切割系链的前体，或者反应组分和电荷传感器两者都可以具有一起起反应以形成可切割系链的前体。
可以通过由于物理或化学过程所致的键断裂切割可切割的系链。例如，本文中列出的方法可以包括通过光化学切割、电化学切割、电场、机械搅拌、化学切割或热切割可切割的系链的步骤。有用的可切割系链及其前体包括用于修饰蛋白质的那些，并且例如可购自Thermo Fisher(Waltham,MA),or Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。
可以使用其它方法从电荷传感器中除去一种或多种反应组分。例如，可以通过从每个电荷传感器降解一种或多种反应组分实现除去。可以通过物理方法，如热、光氧化、超声处理等实现降解。化学降解也是可能的，例如使用pH变化、化学变性剂、蛋白酶等。在一些情况下，可以通过使传感器附着的反应组分与保护部分接触调节降解的程度。可以滴定供应到电荷传感器阵列的保护部分的量，以导致平均每个电荷传感器对单一反应组分的结合。当随后进行降解时，除了附着到每个电荷传感器的受保护的反应组分以外的全部都将被降解。这将留下附着到每个电荷传感器的单一反应组分。当保护部分参与由电荷传感器检测的反应时保护部分可以保持与反应组分结合，或者可以除去保护部分。在一些情况下，通过用化学或光化学活性寡核苷酸类似物结合聚合酶活性位点可发生降解。可以应用化学或光化学处理以使寡核苷酸类似物与聚合酶交联。因此，可以使这些聚合酶不能接受靶核酸或引物，或者可以使聚合酶不能构象变化(例如开放-关闭构象变化)，所述构象变化将由电荷传感器检测。
有用的保护部分的实例是核酸，如DNA纳米球。例如，可以使用核酸结合聚合酶或其它核酸酶以针对变性或化学修饰提供稳定性。核酸还可以提供空间阻断，阻止蛋白酶接近附着到电荷传感器的聚合酶。另一个实例是引物杂交的单链DNA；在此情况下，引物的3’末端将与聚合酶的催化中心结合，防止反应性聚合酶失活部分的结合。保护部分的另一个实例是蛋白质，如特异性靶向聚合酶的抗体。蛋白质或抗体可以防止化学修饰或提供阻止蛋白酶进入聚合酶的空间阻断。如果期望除去抗体，那么可以使用例如热除去抗体。合适的温度将是抗体不再与聚合酶稳定结合，而是聚合酶为稳定的温度。本文中已经例示的用作排斥部分的其它材料可充当保护部分。
可以在监测或不监测电荷传感器的情况下进行来自电荷传感器的过多反应组分的降解、失活或除去以测定降解或除去的程度。例如，在具体的实施方案中，从经修饰的电荷传感器除去特定类型的一种或多种反应组分的过程可以包括以下步骤：(i)从每个经修饰的电荷传感器中除去一种或多种反应组分，(ii)监测所述电荷传感器以区分多个反应组分的存在与单一反应组分的存在，并且(iii)中断除去以留下附着到每个经修饰的电荷传感器的反应组分的单一一种。可以通过检测来自电荷传感器的信号的变化监测电荷传感器的状态。或者/另外，可使用不同的传感器检测电荷传感器的表面处反应组分的存在或缺乏。可以使用多种检测形式中的任一种，包括例如检测反应组分上的荧光标记物的荧光测定法、光学散射法、检测发色团的吸光度法和本领域中已知的与蛋白质和其它反应组分的检测有关的其它分析检测方法。
本公开的方法可以包括以下步骤：对包含至少一个电荷传感器的固体支持物提供一种或多种靶核酸。在具体实施方案中，先前将电荷传感器附着到将在期望的反应中与核酸起反应的另一反应组分，其实例包括核酸酶，如聚合酶。在其它实施方案中，可以在将其它反应组分(例如核酸酶或聚合酶)递送到电荷传感器之前或同时将靶核酸递送到电荷传感器。
在本公开的方法或装置中使用的靶核酸可以由DNA、RNA或其类似物组成。靶核酸的来源可以是基因组DNA、信使RNA或来自天然来源的其它核酸。在一些情况下，可以在本文中的方法或组合物中使用之前扩增源自此类来源的靶核酸。可以使用多种已知的扩增技术中的任何一种，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)、或随机引发扩增(random prime amplification,RPA)。应当理解，在本文中列出的方法或装置中使用前靶核酸的扩增是任选的。因此，不会在本文中列出的方法和组合物的一些实施方案中使用前扩增靶核酸。任选地，靶核酸可以源自合成文库。合成核酸可以具有天然DNA或RNA组合物或可以是其类似物。
可以衍生靶核酸的示例性生物样品包括例如来自哺乳动物，如啮齿类、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、有蹄动物、马、绵羊、猪、山羊、牛、猫、犬、灵长类、人或非人灵长类；植物，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米、高粱、燕麦、小麦、稻、芥花(canola)或大豆；藻，如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)；线虫，如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)；昆虫，如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、蚊、果蝇、蜜蜂或蜘蛛；鱼，如斑马鱼；爬行类；两栖类，如蛙或非洲爪蟾(Xenopus laevis)；盘基网柄菌(dictyosteliumdiscoideum)；真菌，如卡氏肺囊虫(pneumocystis carinii)，红鳍东方鲀(Takifugurubripes)，酵母，酿酒酵母(Saccharamoyces cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；或恶性疟原虫(plasmodium falciparum)。靶核酸还可以源自原核生物，如细菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、葡萄球菌(staphylococci)或肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae)；古菌(archae)；病毒，如丙型肝炎病毒、埃博拉病毒(ebola virus)或人免疫缺陷病毒；或类病毒。靶核酸可以源自上述生物体的均质培养物或群体，或者备选源自几种不同生物体的集合，例如在群落或生态系统中。
靶核酸不需要源自天然来源，而是可以使用已知技术合成。例如，可以合成基因表达探针或基因型分型探针，并且用于本文中列出的方法和装置中。
在一些实施方案中，可以作为一个或多个较大核酸的片段获得靶核酸。可以使用本领域中已知的多种技术中的任一种进行片段化，包括例如雾化、超声处理、化学切割、酶促切割或物理剪切。片段化也可以源自使用通过仅复制较大核酸的一部分而产生扩增子的特定扩增技术。例如，PCR扩增产生具有由原始模板上的核苷酸序列的长度限定的大小的片段，所述核苷酸序列在扩增期间侧翼引物杂交的位置之间。
靶核酸群体或其扩增子可以具有对于本文中列出的方法或装置的特定应用期望或适合的平均链长度。例如，平均链长度可以小于约100,000个核苷酸、50,000个核苷酸、10,000个核苷酸、5,000个核苷酸、1,000个核苷酸、500个核苷酸、100个核苷酸、或50个核苷酸。或者/另外，平均链长度可以大于约10个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、500个核苷酸、1000个核苷酸、5,000个核苷酸、10,000个核苷酸、50,000个核苷酸或100,000个核苷酸。靶核酸群体或其扩增子的平均链长度可以在上文列出的最大值和最小值之间的范围内。
在一些情况下，可以在条件下产生靶核酸群体或以其它方式构建成具有其成员的最大长度。例如，在本文阐述的方法的一个或多个步骤中使用或存在于特定组合物中的成员的最大长度可以小于约100,000个核苷酸，50,000个核苷酸，10,000个核苷酸，5,000个核苷酸，1,000个核苷酸，500个核苷酸，100个核苷酸或50个核苷酸。或者或另外，靶核酸群或其扩增子可在条件下产生或以其它方式构造成具有其成员的最小长度。例如，在本文阐述的方法的一个或多个步骤中使用或存在于特定组合物中的成员的最小长度可以大于约10个核苷酸，50个核苷酸，100个核苷酸，500个核苷酸，1000个核苷酸，5,000个核苷酸，10,000个核苷酸，50,000个核苷酸或100,000个核苷酸。群体中靶核酸的最大和最小链长度可以在上述最大值和最小值之间的范围内。
本公开提供了检测核苷酸的方法。方法可以包括以下步骤：(a)提供栓系于固体支持物电荷传感器的核苷酸结合蛋白(例如聚合酶)；(b)提供一种或多种经标记的核苷酸，由此当标记物接近电荷传感器时，可以通过电荷传感器检测标记物的存在；并且(c)使用电荷传感器检测经标记的核苷酸与蛋白质的结合。
可以基于电荷标记物向酶的募集检测核苷酸与核酸结合酶(如聚合酶)的结合，所述募集继而引起附着有酶的电荷传感器周围的场中的可检测的扰动。先前在本文中列出了示例性电荷标记物。在具体实施方案中，将电荷标记物附着到核苷酸的β-或γ-磷酸位置。在核苷酸的β-或γ-磷酸位置处附着标记物的优点是，当将核苷酸掺入新生链中时，可以通过聚合酶的催化活性除去标记物。然而，不需要通过聚合酶活性除去标记物。因此，可以在核苷酸上的多个位置中的任何位置附着标记物，包括例如通过接头与核苷酸的碱基部分(参见例如美国专利号7,427,673；7,414,116；和7,057,026和PCT公开文本WO 91/06678和WO 07/123744中列出的核苷酸位置和接头，每篇通过引用并入本文)。也可以在核苷酸的α-磷酸位置或核苷酸的核糖部分处附着标记物。任选地，可以在检测后例如通过电荷接头的切割从核苷酸切割附着到核苷酸的多个部分之任一个的标记物。
用于本文中列出的方法或装置中的标记物可以进一步包括寡核苷酸部分。示例性寡核苷酸部分包括如本文中先前列出的DNA、RNA和PNA。如本文中先前示例的，寡核苷酸部分可以用于与核酸系链或其它核酸杂交，以局部化电场扰动，从而以电荷传感器的期望距离发生。寡核苷酸部分可以作为核苷酸和带电荷的部分之间的中间结构存在。然而，电荷部分是任选的，并且不需要位于寡核苷酸部分的末端，所述寡核苷酸部分在对核苷酸的附着点远端。尽管本文中参照具有与核酸系链相互作用的寡核苷酸部分的核苷酸类似物例示了几个实施方案，但是应当理解，核苷酸类似物可以具有其它接头组分替换寡核苷酸部分。接头组分可以包括与作为系链的一部分的另一成员相互作用的结合对的一个成员。
在一些实施方案中，可以将不同的核苷酸类型附着到不同的标记物。因此，源自标记物的信号差异可用于区分不同的核苷酸类型。这对于核酸测序方法是特别有用的，其中将几种不同类型的核苷酸以在检测事件期间几种不同类型的核苷酸平行存在的方式递送至聚合酶。例如，可以使用具有四个不同电荷部分的四种不同核苷酸，如先前在本文中就图2和图3而言例示。或者/另外，标记物部分可以含有与不同的系链序列杂交以在电荷传感器处产生相互截然不同的信号的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，本文中列出的方法中使用的几个经标记的核苷酸将分别具有不同的电荷标记物，但每个所述经标记的核苷酸将具有能够与相同的固定的系链序列杂交的寡核苷酸部分。如本文中先前列出，不同的核苷酸类似物可以具有有不同长度的寡核苷酸部分，或者备选地，两个或更多个核苷酸类似物可以具有相同长度的寡核苷酸部分。
不同的核苷酸不需要具有不同的标记物。可以将不同的核苷酸分别递送至反应，使得基于何时和何地递送核苷酸的认识区分它们。例如，测序反应可以包括每个循环连续添加四种不同的核苷酸，在核苷酸添加之间进行清洗。可以完成核苷酸的此种分开的递送，无论是将不同的核苷酸独特标记还是一致标记。
在具体实施方案中，可以如下进行核酸测序的方法：(a)提供拴系到固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)提供一种或多种经标记的核苷酸，由此当标记物接近电荷传感器时，可以通过电荷传感器检测标记物的存在；并且(c)使用电荷传感器检测经标记的核苷酸对与模板核酸互补的新生链的掺入。可以连续检测多个掺入事件以测定序列。或者，对于每个新生链仅检测单一掺入事件，并且将此信息与用于新生链(或其与其杂交的模板)的序列的知识组合以得到序列。
在多重实施方案中，固体支持物可以包括栓系于聚合酶的多个电荷传感器，并且方法包括以下步骤：检测在多个聚合酶中的每个聚合酶处将经标记的核苷酸掺入与模板核酸互补的新生链中。在多重实施方案中使用的多个聚合酶可以任选地包括至少两种不同类型的聚合酶。可以选择不同类型的聚合酶以在将相同类型的核苷酸掺入核酸的新生链中时，产生可由电荷传感器检测的可相互区分的信号。这样，具有不同的附着的聚合酶(例如每个电荷传感器一个)的电荷传感器阵列可以比使用仅具有附着到电荷传感器的一类聚合酶的阵列可获得的情形区分更大的多种核酸序列或提供更大的灵敏性。例如，当通过两种不同聚合酶的作用测序时，相同的模板将产生两种不同的信号系列。可以比较或以其它方式组合使用两个系列的信号，以提供比来自仅一类聚合酶的仅一个系列的信号可推导出的核苷酸序列更准确的核苷酸序列。
本公开的阵列(例如，已经通过本文中列出的方法生产的阵列)可以用于多种应用中的任何一种。特别有用的应用是核酸测序。一个例子是合成测序(SBS)。在SBS中，监测核酸引物沿核酸模板(例如靶核酸或其扩增子)的延伸以测定模板中的核苷酸序列。基础化学过程可以是聚合(例如，如通过聚合酶催化)。在特定的基于聚合酶的SBS实施方案中，以模板依赖性方式将核苷酸添加至引物(从而延伸引物)，使得添加至引物的核苷酸的顺序和类型的检测可用于测定模板的序列。在本文中列出的阵列的不同电荷传感器处的多个不同模板可以在下述条件下经受SBS技术，其中针对不同模板发生的事件可以由于它们在阵列的特定电荷传感器处的位置而区分。
流动池提供用于容纳阵列的方便的形式，所述阵列通过本公开的方法产生并且经受SBS或牵涉循环中重复传递试剂的其它检测技术。例如，为了启动第一SBS循环，可以使一种或多种核苷酸(任选地具有电荷标记物)流入/流过流动池，所述流动池容纳电荷传感器的阵列，每个电荷传感器具有与核酸模板结合的附着的聚合酶。可以检测引物延伸引起掺入核苷酸的阵列的那些位点。任选地，核苷酸可以进一步包括一旦已经将核苷酸添加到引物就终止进一步引物延伸的可逆终止性质。例如，可以将具有可逆终止剂部分的核苷酸类似物添加到引物，使得不能发生随后的延伸，直到递送去封闭剂以除去该部分。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以将去封闭试剂递送到流动池(在检测发生之前或之后)。可以在各个递送步骤之间进行清洗。然后，可以将该循环重复n次以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。可以容易地改编以与通过本公开的方法产生的阵列一起使用的示例性SBS程序和流体系统记载于例如Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008)，WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281，和US 2008/0108082，每篇通过引用并入本文。
连接测序也是有用的，包括那些记载于Shendure et al.Science309:1728-1732(2005)；US 5,599,675；和US 5,750,341的，每篇通过引用并入本文。一些实施方案可包括杂交测序方法，如记载于例如Bains et al.,Journal of Theoretical Biology 135(3),303-7(1988)；Drmanac et al.,Nature Biotechnology 16,54-58(1998)；Fodor et al.,Science 251(4995),767-773(1995)；和WO 1989/10977，每篇通过引用并入本文。在连接测序和杂交测序程序两者中，使靶核酸(或其扩增子)经历寡核苷酸递送和检测的重复循环。可以容易地修改此类方法以检测连接酶构象变化或检测电荷标记的寡核苷酸，替换发表的方法中描述的光学标记物的荧光检测。
本公开的阵列(例如已经通过本文中列出的方法产生)的另一个有用的应用是基因表达分析。可以使用RNA测序技术(例如称为数字RNA测序的那些技术)检测或量化基因表达。可以使用本领域中已知的测序方法进行RNA测序技术，如上文列出的那些技术，只是可以用本文中列出的基于电荷的检测方法替换光学经标记的核苷酸的荧光检测。还可以使用通过与阵列的直接杂交进行的杂交技术或使用多重测定法(其产物在阵列上检测)来检测或量化基因表达。可用于基于阵列的表达和基因型分型分析的示例性分子生物学测定法记载于美国专利号7,582,420；6,890,741；6,913,884或6,355,431或美国专利公开号2005/0053980 A1；2009/0186349 A1或US 2005/0181440 A1，每篇通过引用并入本文。可以通过用本文中列出的基于电荷的检测技术以及任选地电荷标记物替换光学标记物和荧光检测改编这些方法。
由本公开提供的核酸测序的方法可以包括以下步骤：(a)提供拴系到固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)提供一种或多种经标记的核苷酸，由此当标记物接近电荷传感器时，可以通过电荷传感器检测标记物的存在，其中一种或多种经标记的核苷酸具有可逆的终止剂部分；(c)使用电荷传感器检测一个或多个经标记的核苷酸对与模板核酸互补的新生链的掺入，从而形成可逆终止的新生链；(d)修饰可逆终止的新生链，以使所述新生链能够进一步掺入核苷酸；和(e)重复(b)至(d)以获得模板核酸的序列。
在测序反应中使用可逆终止的核苷酸提供了对聚合酶延伸过程的步骤控制的优点，所述聚合酶延伸过程在其它情况下将是连续的。此步骤控制可用于增加新延伸的核酸链在可检测状态中花费的时间量。例如，可以在通过聚合酶添加后，且直到通过电荷传感器累积期望的信号量，将在可逆终止的核苷酸上的电荷标记物保持在新生链上。这可以允许增加的信号收集。然后，测序过程可以通过添加去封闭剂，接着是随后的核苷酸添加循环来进行。
通过使用可逆终止的核苷酸赋予的步骤控制的另一个优点是使经历相同反应的反应组分的整体同步的能力。因此，可以对在电荷传感器所在的位点处与多个聚合酶结合的相同核酸的多个拷贝进行本文中列出的测序方法(例如，可以将多个聚合酶附着到单一电荷传感器)。可以通过使用可逆终止的核苷酸有效地同步用于鉴定在聚合酶活性的每个循环期间添加的核苷酸的检测步骤。虽然可逆终止的核苷酸提供了整体检测的优点，但是应当理解，当将单一聚合酶附着到单独的电荷传感器时，可以使用采用可逆终止的核苷酸的测序方法。
可以设置测序反应的整体以包括附着到共同电荷传感器的多个聚合酶，其中聚合酶与具有相同模板序列的靶核酸和具有相同序列的引物(或新生链)结合。可以将聚合酶附着到电荷传感器，如本文中先前列出。然后，可以使包含相同模板序列的多个重复的一个或多个靶核酸与聚合酶接触。例如，可以将具有模板序列的多联体重复的靶核酸分子将递送至特定位点处的聚合酶。在此情况下，形成每个重复的序列的亚基可以作为单独的模板序列发挥功能。任选地，可以切割编码多联体重复的核酸以形成各自具有单一模板序列的单独分子。然后，可以通过位点处的聚合酶对这些单独的分子进行测序。可以通过滚环扩增(RCA)创建编码多联体重复的核酸，例如，如记载于Lizardi et al.,Nat.Genet.19:225-232(1998)和美国专利申请公开No.2007/0099208A1，每篇通过引用并入本文。
还提供了核酸测序的方法，其包括以下步骤：(a)提供拴系到固体支持物电荷传感器的聚合酶；(b)在下述条件下使聚合酶与模板核酸和一种或多种不同核苷酸类型接触，其中聚合酶催化添加一种或多种核苷酸类型以形成核酸模板的核酸互补物，并且其中添加一种或多种不同的核苷酸类型产生由电荷传感器检测的来自聚合酶的构象信号变化；(c)使用电荷传感器检测来自聚合酶的信号的变化；并且(d)测定用于添加一种或多种不同核苷酸类型的信号变化的速率、极性、幅度或时间持续，从而测定模板核酸的核苷酸序列。
在具体实施方案中，核酸模板的核苷酸序列可以基于核酸酶，如聚合酶中发生的构象变化测定。区分与酶相互作用的每种类型的核苷酸发生的构象变化并且测定哪些变化的序列可用于测定核酸的序列。例如，序贯添加核苷酸到新生核酸链的聚合酶随着每个核苷酸添加而经历构象变化。如本文中更为详细列出的，可以使用电荷传感器(或基于将哪个/些核苷酸以流体递送至监测测序的基底的知识)来区分添加的每种类型的核苷酸发生的构象变化，并且可以检测那些变化的序列以测定核酸的序列。
可以标记核酸酶以在其与一种或多种反应物，如核酸或核苷酸相互作用时产生一种或多种指示酶的构象变化的信号。可以构象标记聚合酶，使得可以通过检测变构电荷移动监测聚合酶的活性。例如，可以构象标记聚合酶以允许检测指示核苷酸结合的信号、指示核苷酸对生长的核酸分子添加的信号、或指示结合和催化之间的聚合酶构象的中间变化的信号。因此，聚合酶可包括由电荷传感器检测的至少一个非天然标记物部分。可以工程化改造聚合酶以具有负电荷和正电荷，其通过变构移动使每单位体积的电荷变化最大化。如果此单位体积接近电荷传感器，则可以容易地检测到此移动。在具体实施方案中，由电荷传感器从构象标记的聚合酶检测的信号可以区分结合事件与催化事件。然而，此类区别对于一些实施方案可能不是必需的，并且信号可以仅仅指示核苷酸的总体添加。或者/另外，信号可以区分正确碱基配对的核苷酸的结合与不正确碱基配对的核苷酸的结合。
可以附着到本文中列出的方法或装置中使用的聚合酶或其它核酸酶的特别有用的标记物部分是负电荷标记物，其实例包括但不限于磷酸根基团、羧基基团、氨基酸、DMT和/或FMOC。正电荷标记物也是有用的，包括例如伯胺。内在标记物，如氨基酸侧链或天然存在的翻译后修饰(例如磷酸化、黄素的添加，二硫化物的还原等)也可以提供可用于在本文中列出的方法或装置中检测的部分。
一些实施方案可以采用核苷酸类似物，其通过聚合酶以下述速率掺入多核苷酸链中，所述速率可测量地与通过聚合酶将另一核苷酸掺入链中的速率不同。另一种有用的核苷酸类似物是以下述速率与聚合酶结合的类似物，所述速率可测量地与另一个核苷酸与聚合酶结合的速率不同。以可测量地与另一个核苷酸不同的速率引起聚合酶的构象变化的核苷酸类似物也是有用的。可相对于具有相同Watson-Crick碱基配对配偶体的天然核苷酸或相对于核酸合成反应中使用的其它核苷酸来测量核苷酸类似物的结合、掺入或聚合酶构象变化的相对速率。对于核苷酸类似物，相对速率可以更快或更慢。
根据具体实施方案，可以构象标记聚合酶或其它核酸酶。核酸酶的构象标记提供了核酸序列分析的优点。下文就标记的聚合酶而言例示构象标记的分子及其制备和使用的方法。应当理解，可以类似地制备和使用其它核酸酶，如外切核酸酶和逆转录酶。
聚合酶在合成核酸聚合酶的过程中经历构象变化。例如，聚合酶在核苷酸结合后经历从开放构象到封闭构象的构象变化。因此，与核酸模板和生长引物结合的聚合酶处于本领域中称为“开放”构象的构象。与核酸模板、引物和正确碱基配对的核苷酸结合的聚合酶处于在本领域中称为“封闭”构象的构象。在更为详细的结构水平上，从开放构象到闭合构象的转变的特征在于聚合酶内的相对移动，导致“拇指”结构域和“指”结构域彼此更接近。在开放构象中，拇指结构域与手结构域更远，类似于手掌的打开和闭合。在各种聚合酶中，指尖端和拇指之间的距离可以在“开放”和“封闭”构象之间变化高达30埃。指尖端和蛋白质结构域的其余部分之间的距离也可以改变达10埃。应当理解，也可以发生更大的变化，并且可以在本文中列出的方法中利用，使得可以检测到大于10埃的变化。此外，可以检测更小的变化，包括小于约10、8、6、4或2埃的那些变化，只要距离的变化足以使用电荷传感器可检测。
在具体的实施方案中，可以将附着到指结构域的电荷标记物附着到位置376的残基或距Phi29 DNA聚合酶的位置376的半径5埃内的残基，并且可以将附着到拇指或其它结构域的标记物附着到位置535、203、510、564处的残基或距Phi29 DNA聚合酶的这些位置的5埃半径内的残基。可以在各位置处，并且使用美国专利公开号2011/0312529 A1；美国专利号6,908,763或WO 2010/068884 A2(每篇通过引用并入本文)中列出的方法附着标记物。
可以使用构象标记物检测聚合酶的构象变化(例如从开放构象到封闭构象)。可以使用任何标记物，其产生响应氨基酸残基的结构、形状或排列的变化，如在聚合酶的开放和封闭构象之间发生的变化的电荷信号。
可以将电荷标记物附着到聚合酶，例如，通过共价连接。或者/另外，可以将探针附着到接近聚合酶的另一分子，使得聚合酶中的构象变化引起来自探针的信号的变化。例如，可以将聚合酶附着到电荷传感器，并且电荷传感器可以具有探针，所述探针能够以下述方式与聚合物相互作用，使得来自探针的信号响应聚合酶的构象变化而改变。在一个具体的实施方案中，可以如下将电荷标记物以位点特异性方式附着于聚合酶：在聚合酶中的期望位置处引入半胱氨酸残基，然后用具有与半胱氨酸的硫基团特异性起反应的部分的标记物修饰聚合酶，示例性的反应活性部分是反应性马来酰亚胺部分。也可以通过分割内含肽(split inteins)将标记物引入聚合酶或其它核酸酶，如记载于Yang etal.J.Am.Chem.Soc.,131:11644–11645(2009)，其通过引用并入本文。也可以通过遗传编码的非天然氨基酸将标记物引入核酸酶。一个实例记载于Fleissner et al.Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 106:21637-42(2009)，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，可以将一个或多个系链在聚合酶上的下述位置处附着到聚合酶，其中将构象变化传输到也与系链附着的电荷传感器。例如，构象变化可以引起由一个或多个传导系链传输到电荷传感器的扰动。在一些情况下，可以经由两个或更多个系链将单一聚合酶附着到电荷传感器。在此配置中，聚合酶构象的变化可以改变两个或更多个系链的相对位置，这又可以产生可以由电荷传感器检测的场扰动。可以使用已知的诱变方法、化学修饰或两者将一个或多个系链以位点选择性地附着到聚合酶。例如，可以在工程化聚合酶中作为位点特异性突变引入一个或多个半胱氨酸，从而允许硫反应性系链附着于半胱氨酸。示例性附着点包括本文中和美国专利申请公开号2011/0312529A1(其通过引用并入本文)中列出的用于附着构象标记物的。
在本文中列出和在其它情况下在本领域中已知的构象变化外，聚合酶在将核苷酸添加至新生链的过程中经历几个转变。可以彼此区分转变，例如通过动力学表征。可区别的转变包括例如美国专利申请公开号2011/0312529 A1中列出的那些转变。可以通过电荷传感器检测当将核苷酸添加至核酸时聚合酶经历的一个或多个转变，例如使用任选构象标记的聚合酶。对由与聚合酶附着的电荷传感器检测的信号的基于时间的测量或动力学测量可用于区分一个转变与另一个。
在具体实施方案中，附着到电荷传感器的聚合酶的基于时间的测量或动力学测量可用于区分添加到核酸的核苷酸种类。例如，基于时间的测量或动力学测量可以用于区分与聚合酶结合以形成美国专利申请公开号2011/0312529 A1中列出的一种或多种复合物的核苷酸种类。或者/另外，电荷传感附着的聚合酶的基于时间的测量或动力学测量可用于区分正确Watson-Crick碱基配对的核苷酸与同模板核酸不正确碱基配对的核苷酸的结合/或掺入。
可以通过在与实时检测偶联的电荷传感器处使用试剂的非常快速的混合来促进使用核苷酸的基于时间的辨别或动力学辨别的方法。根据可用的停止流动仪器，可以在亚毫秒时间表上发生混合。可以使用快速流体学、主动或被动混合以及反应的适当约束(confinement)(例如混合物褶皱(mix blousing))以克服由扩散所致的限制来实现试剂的快速混合。停止流动递送是特别有用的。停止流动递送使用快速的流体流动，随后突然停止流动来将流体递送到检测位点。递送的流体通常从检测位点置换相等体积的流体。流体可以与固相分析物，如附着到电荷传感器的聚合酶混合。停止流体流体递送的死时间(deadtime)可以例如小于2毫秒(msec)。因此，死时间可以不长于2msec、1.5msec、1msec、0.8msec、0.6msec、0.5msec或0.4msec。对于有用的停止流动和快速混合流体系统，参见例如Chance,B.J.Frank.Inst.,229,613(1940)，和美国专利申请公开号US 2013/0165328A1，每篇通过引用并入本文。
可以使用电荷传感器附着的聚合酶的基于时间的测量或动力学测量的顺序测定由聚合酶用于合成互补链的模板核酸的序列。应当理解，模板链的序列可以从掺入正在延伸的链中的核苷酸序列推断。因此，一条链的序列的测定应理解为包括测定其互补链的序列。
多种核苷酸种类中的任一种可用于本文中列出的方法或组合物。例如，可以使用天然存在的核苷酸，如ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP、和dGMP。通常，通过DNA聚合酶将dNTP核苷酸掺入DNA链中，并且通过RNA聚合酶将NTP核苷酸掺入RNA链中。在具体的实施方案中，可以通过DNA聚合酶将NTP核苷酸或其类似物掺入DNA中，例如在下述情况中，其中NTP或其类似物能够通过DNA聚合酶掺入DNA，且其中使用NTP或其类似物的DNA聚合酶转变的速率或时间持续可以与使用另一核苷酸的DNA聚合酶转变的速率或时间持续区分开。或者，可以通过RNA聚合酶将dNTP核苷酸或其类似物掺入RNA中，例如，在下述情况中，其中dNTP或其类似物能够通过RNA聚合酶掺入RNA中，并且其中使用dNTP或其类似物的RNA聚合酶转变的速率或时间持续可以与使用另一核苷酸的RNA聚合酶转变的速率或时间持续区分开。另外，可以通过逆转录酶将dNTP核苷酸或其类似物从RNA模板掺入DNA中，例如，在下述情况中，其中dNTP或其类似物能够通过逆转录酶从RNA模板掺入到DNA中，并且其中使用dNTP或其类似物的逆转录酶转变的速率或时间持续可以与使用另一核苷酸的逆转录酶转变的速率或时间持续区分开。速率或时间持续的相对差异可以是速率的相对增加、持续时间的相对增加、速率的相对减少或持续时间的相对减少。
非天然核苷酸类似物也是有用的。特别有用的非天然核苷酸类似物包括但不限于产生聚合酶移位的可检测地不同的速率或时间持续的那些非天然核苷酸类似物，其可与在另一核苷酸的情况下聚合酶移位的速率或时间持续区分开。例如，非天然核苷酸类似物可有用地产生聚合酶移位的可检测地不同的速率或时间持续，其可与在另一核苷酸(如天然存在的核苷酸)的情况下聚合酶的相同移位的速率或时间持续区分开。可以使用的示例性核苷酸类似物包括但不限于dNTPαS；NTPαS；具有Hwang et al,.Nucl.Acids Res.34:2037-2045(2006)(通过引用并入本文)中鉴定为ICS、3MN、7AI、BEN、DM5、TM、2Br、3Br、4Br、2CN、3CN、4CN、2FB、3FB、MM1、MM2和MM3的非天然核碱基的核苷酸；或具有其它非天然核碱基的核苷酸，如那些记载于Patro et al.Biochem.48:180-189(2009)的(通过引用并入本文)，其包括2-氨基-1-脱氮嘌呤、1-脱氮嘌呤、2-吡啶、次黄嘌呤、嘌呤、6-Cl-嘌呤、2-氨基-dA、2-氨基嘌呤或6-Cl-2-氨基-嘌呤或具有非天然核碱基的核苷酸，如那些记载于Krueger etal.Chem Biol.16:242-8(2009)的(通过引用并入本文)，其包括异-G、异-C、5SICS、MMO2、Ds、Pa、FI、FB、dZ、DNB、胸腺嘧啶等排物、5-NI、dP、唑羧酰胺(azole-carboxamide)、xA、Im-No、Im-ON、J、A*、T*。
具有5’修饰的非天然核苷酸类似物是特别有用的。非天然核苷酸类似物通常具有三磷酸酯，但可以具有更多或更少的磷酸酯。在具体实施方案中，将非天然核苷酸的α磷酸酯，β磷酸酯或γ磷酸酯中的一种或多种共价附着到除氧以外的部分。附着到磷酸酯或以其它方式存在于5’位置的部分可以提供负电荷、正电荷、金属螯合活性或空间体积。示例性部分包括但不限于L-对映异构体形式或R-对映异构体形式的氨基酸，如组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸或脯氨酸；氨基基团；螯合金属，如镁或锰；甲基基团；卤素，如溴、氯或碘；硫醇基团；吸电子基团；给电子基团；芳香胺；或脂肪族胺。这些和其它部分在它们提供与聚合酶或其它核酸酶的相互作用的实施方案中可以是有利的，所述相互作用不同于酶具有的与缺少所述部分的核苷酸的相互作用。因此，可以利用在相应核苷酸种类上的部分的存在和缺乏以在测序方法中区分核苷酸种类，例如，基于作用于核苷酸种类的核酸酶中构象信号变化的速率、时间持续和/或强度。
反应组合物或方法可以包括一种或多种核苷酸物质。例如，用于序列分析的反应组合物或方法可以包括能够与正在合成的核酸模板中的四个相应核苷酸物质形成Watson-Crick碱基对的四种不同核苷酸物质。具体实施方案可以包括至少两种不同的核苷酸种类、至少三种不同的核苷酸种类、至少四种不同的核苷酸种类或更多。至少两个核苷酸物质可以是非天然核苷酸类似物，至少三个核苷酸物质可以是非天然核苷酸类似物，或至少四个核苷酸物质可以是非天然核苷酸类似物。因此，反应组合物或方法可以包括天然核苷酸和非天然核苷酸类似物的混合物。或者，反应组合物可缺少天然核苷酸，取而代之仅具有非天然核苷酸类似物。可以在仅通过聚合酶或其它核酸酶将非天然核苷酸类似物掺入生长的核酸中的条件下实施反应。
在一些实施方案中，反应组合物或方法可以包括在核酸模板中与不超过一个核苷酸物种碱基配对的核苷酸物质。例如，可以下述条件下实施方法，其中在单独的序贯反应中使不同的核苷酸物质与聚合酶和核酸接触。具体地，可以在第一反应中添加与A碱基配对的核苷酸种类，可以在第二反应中添加与C碱基配对的核苷酸种类，可以在第三反应中添加与T碱基配对的核苷酸种类，并且可以在第四反应中添加与G碱基配对的核苷酸物质。反应称为第一，第二，第三和第四仅仅是为了说明反应是分开的，但这不一定限制可以在本文中列出的方法中添加的种类的顺序。相反，与A，C，T或G碱基配对的核苷酸种类可以以对于方法的具体实施方案而言期望或适合的任何顺序添加。通常在测序方法中，序贯添加与给定模板核酸中的四种不同核苷酸物质碱基配对的核苷酸物质以完成测序方法的循环。然而，应当理解，在一些实施方案中可以使用少于四个核苷酸添加。此外，应当理解，可以使用与多于一种但不超过2、3或4种核苷酸种类碱基配对的核苷酸混合物。类似地，可以使用与多于两种但不多于3或4种核苷酸种类碱基配对的核苷酸的混合物，或者可以使用与多于三种但不超过4种核苷酸种类碱基配对的核苷酸的混合物。
多重方法也是可能的。例如，在本公开的方法中使用的固体支持物可以包括附着到聚合酶的多个电荷传感器，可以在下述条件下使聚合酶与模板核酸和至少四种不同核苷酸类型接触，其中聚合酶催化序贯添加核苷酸类型以形成核酸模板的核酸互补物；可以使用电荷传感器检测来自聚合酶的信号的一系列变化；并且可以为模板核酸测定核苷酸的序列。存在于固体支持物上的多个聚合酶可以包括至少两种不同类型的聚合酶。当将相同类型的核苷酸掺入新生核酸链时，不同类型的聚合酶可任选地产生可由电荷传感器检测的可相互区分的信号。区分这些可相互区分的信号可以用作测定多个核酸的序列的基础。
贯穿本申请，引用了各种出版物、专利申请或专利。在此通过引用将这些出版物的全部公开内容并入本申请中，以更完全地描述本发明所属的技术发展水平。
术语“包括”在本文中旨在是开放式的，不仅包括叙述的要素，还包括任何另外的要素。
虽然已经参照上面提供的实施例描述了本发明，但是应当理解，在不脱离本发明的情况下可以进行各种修改。因此，本发明仅由权利要求书限制。

Claims (13)

1.用于将聚合酶附着到电荷传感器的方法，所述方法包括：
(a)提供包含多个电荷传感器的固体支持物；
(b)提供包含多个聚合酶的液体，其中每个聚合酶结合到排斥部分(repellantmoiety)；并且
(c)在下述条件下使所述固体支持物与所述液体接触，其中
(i)所述多个聚合酶与所述多个电荷传感器液体连通，
(ii)所述液体中聚合酶的数目大于所述固体支持物上的电荷传感器的数目；
(iii)来自所述液体的所述聚合酶通过形成传导系链附着到所述电荷传感器，并且
(iv)结合到每个所述聚合酶的所述排斥部分防止所述多个聚合酶中的多于一个所述聚合酶附着到每个所述电荷传感器。
2.权利要求1的方法，其中所述排斥部分包含核酸。
3.权利要求1的方法，其中所述排斥部分包括核酸纳米球(nanoball)。
4.权利要求1的方法，其中所述聚合酶包含至少两种不同类型的聚合酶，其中所述不同类型的聚合酶附着于所述固体支持物的单独的电荷传感器。
5.权利要求4的方法，其中当将相同类型的核苷酸掺入新生核酸链时，所述不同类型的聚合酶产生能被所述电荷传感器检测的可相互区分的信号。
6.权利要求1的方法，其中所述排斥部分占据空间体积，其在空间上阻碍所述多个聚合酶中的多于一个聚合酶附着到每个所述电荷传感器。
7.权利要求1的方法，其中所述排斥部分包括电荷极性，其在静电上阻碍所述多个聚合酶中的多于一个聚合酶附着到每个所述电荷传感器。
8.权利要求1的方法，其中每个所述电荷传感器具有附着超过两个所述聚合酶的能力。
9.权利要求1的方法，所述方法还包括在所述聚合酶附着到所述电荷传感器后从所述聚合酶中除去结合的排斥部分。
10.权利要求9的方法，其中在除去所述结合的排斥部分前且在所述聚合酶附着到所述电荷传感器后从所述固体支持物除去所述液体。
11.权利要求1的方法，其中在步骤(c)后将至少50％的所述电荷传感器附着到单一聚合酶。
12.权利要求1的方法，其中通过施加电场将所述聚合酶主动输送到所述电荷传感器。
13.权利要求1的方法，其中所述传导系链包括掺杂聚噻吩(dopedpolythiophene)、聚(3,4-亚乙基二氧噻吩)(poly(3,4-ethylenedioxythiophene))、聚乙炔(polyacetylene)、聚吡咯(polypyrrole)、聚苯胺(polyaniline)、聚芴(polyfluorene)、聚苯撑(polyphenylene)、聚芘(polypyrene)、聚薁(polyazulene)、聚萘(polynaphthalenes)、聚咔唑(polycarbazole)、聚吲哚(polyindole)或聚氮杂卓(polyazepine)。
CN201580049367.5A 2014-07-15 2015-07-14 生物化学激活的电子装置 Active CN107075579B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111054232.1A CN113913505A (zh) 2014-07-15 2015-07-14 生物化学激活的电子装置

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462024856P 2014-07-15 2014-07-15
US62/024,856 2014-07-15
US201462069198P 2014-10-27 2014-10-27
US62/069,198 2014-10-27
US201562161709P 2015-05-14 2015-05-14
US62/161,709 2015-05-14
US201562171523P 2015-06-05 2015-06-05
US62/171,523 2015-06-05
PCT/US2015/040296 WO2016010975A2 (en) 2014-07-15 2015-07-14 Biochemically activated electronic device

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111054232.1A Division CN113913505A (zh) 2014-07-15 2015-07-14 生物化学激活的电子装置

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107075579A CN107075579A (zh) 2017-08-18
CN107075579B true CN107075579B (zh) 2021-10-08

Family

ID=53783324

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111054232.1A Pending CN113913505A (zh) 2014-07-15 2015-07-14 生物化学激活的电子装置
CN201580049367.5A Active CN107075579B (zh) 2014-07-15 2015-07-14 生物化学激活的电子装置

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111054232.1A Pending CN113913505A (zh) 2014-07-15 2015-07-14 生物化学激活的电子装置

Country Status (11)

Country Link
US (3) US10605766B2 (zh)
EP (3) EP3460075B1 (zh)
JP (2) JP6510029B2 (zh)
CN (2) CN113913505A (zh)
AU (2) AU2015289828B2 (zh)
CA (1) CA2955356C (zh)
DK (2) DK3460075T3 (zh)
ES (2) ES2845548T3 (zh)
PL (1) PL3169805T3 (zh)
SG (2) SG11201700348VA (zh)
WO (1) WO2016010975A2 (zh)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7056661B2 (en) * 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US9194838B2 (en) 2010-03-03 2015-11-24 Osaka University Method and device for identifying nucleotide, and method and device for determining nucleotide sequence of polynucleotide
US9926596B2 (en) 2011-05-27 2018-03-27 Genapsys, Inc. Systems and methods for genetic and biological analysis
CN104105797B (zh) 2011-12-01 2016-08-31 吉纳普赛斯股份有限公司 用于高效电子测序与检测的系统和方法
US9708656B2 (en) 2013-05-06 2017-07-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time electronic sequencing
EP3556864B1 (en) 2014-04-18 2020-12-09 Genapsys, Inc. Methods and systems for nucleic acid amplification
KR102104164B1 (ko) 2015-05-12 2020-04-23 일루미나, 인코포레이티드 전계-효과 장치 및 핵산 서열결정 방법
JP7166586B2 (ja) 2015-06-25 2022-11-08 ロズウェル バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド 生体分子センサーおよび方法
US10190158B2 (en) 2015-08-06 2019-01-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Systems and methods for selectively addressing sparsely arranged electronic measurement devices
JP7280590B2 (ja) 2016-01-28 2023-05-24 ロズウェル バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド 大スケールの分子電子工学センサアレイを使用する被分析物を測定するための方法および装置
US10712334B2 (en) 2016-01-28 2020-07-14 Roswell Biotechnologies, Inc. Massively parallel DNA sequencing apparatus
WO2017139493A2 (en) 2016-02-09 2017-08-17 Roswell Biotechnologies, Inc. Electronic label-free dna and genome sequencing
US10597767B2 (en) 2016-02-22 2020-03-24 Roswell Biotechnologies, Inc. Nanoparticle fabrication
KR20190075010A (ko) * 2016-04-27 2019-06-28 퀀텀 바이오시스템즈 가부시키가이샤 생체분자의 측정 및 시퀀싱을 위한 시스템 및 방법
US9829456B1 (en) 2016-07-26 2017-11-28 Roswell Biotechnologies, Inc. Method of making a multi-electrode structure usable in molecular sensing devices
JP7022443B2 (ja) * 2016-08-01 2022-02-18 ロズウェル バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド 分子電子センサーのための修飾ヌクレオチド三リン酸
CN106244712B (zh) * 2016-08-31 2019-11-19 北京大学 Dna测序方法
CN106442679B (zh) * 2016-09-20 2018-10-26 德州学院 一种检测分子之间结合能及结合动力学的传感装置及方法
CN109790578B (zh) 2016-10-05 2024-04-09 豪夫迈·罗氏有限公司 使用纳米晶体管的核酸测序
US10718756B2 (en) * 2016-10-27 2020-07-21 The Regents Of The University Of California Mitochondrial apoptotic sensor
WO2018098286A1 (en) * 2016-11-22 2018-05-31 Roswell Biotechnologies, Inc. Nucleic acid sequencing device containing graphene
CA3052062A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Roswell Biotechnologies, Inc. Methods and systems for dna data storage
KR20230158636A (ko) * 2017-01-19 2023-11-20 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 2차원 레이어 재료를 포함하는 솔리드 스테이트 시퀀싱 디바이스들
US10508296B2 (en) 2017-04-25 2019-12-17 Roswell Biotechnologies, Inc. Enzymatic circuits for molecular sensors
EP3615685A4 (en) 2017-04-25 2021-01-20 Roswell Biotechnologies, Inc ENZYMATIC CIRCUITS FOR MOLECULAR SENSORS
CA3057155A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 Roswell Biotechnologies, Inc. Binding probe circuits for molecular sensors
CN111182972B (zh) 2017-08-15 2022-03-08 欧姆尼奥姆股份有限公司 用于检测化学和生物分析物的扫描装置和方法
WO2019046589A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 Roswell Biotechnologies, Inc. PROCESSIVE ENZYME MOLECULAR ELECTRONIC SENSORS FOR STORING DNA DATA
US20240003896A1 (en) * 2017-09-15 2024-01-04 lllumina, Inc. Sequence-detection system
CN111566224A (zh) * 2017-09-21 2020-08-21 吉纳普赛斯股份有限公司 用于核酸测序的系统和方法
US11100404B2 (en) 2017-10-10 2021-08-24 Roswell Biotechnologies, Inc. Methods, apparatus and systems for amplification-free DNA data storage
EP3527673A1 (en) * 2018-02-15 2019-08-21 QIAGEN GmbH Sequencing method
US10851131B2 (en) 2018-02-16 2020-12-01 Illumina, Inc. Charge-tagged nucleotides and methods of use thereof
MX2019014137A (es) * 2018-02-16 2021-01-29 Illumina Inc Nucleotidos etiquetados y usos de los mismos.
NL2021376B1 (en) 2018-06-29 2020-01-06 Illumina Inc Sensor and sensing system
TWI730352B (zh) * 2018-08-06 2021-06-11 英商伊路米納劍橋有限公司 流體槽與定序系統及製備用於其之基板的方法
CO2018008743A1 (es) * 2018-08-21 2019-02-28 Pontificia Univ Javeriana Nanosensor de efecto de campo para la detección de metabolitos simples en organismos vivos
WO2020078595A1 (en) * 2018-10-19 2020-04-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Electric field-assisted junctions for sequencing
WO2020101795A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 Omniome, Inc. Electronic detection of nucleic acid structure
CN211311438U (zh) 2018-12-04 2020-08-21 欧姆尼欧美公司 流动池
JP7482795B2 (ja) * 2018-12-21 2024-05-14 イルミナ インコーポレイテッド 感知システム
EP3674702A1 (en) * 2018-12-27 2020-07-01 Imec VZW Method for sequencing a polynucleotide using a biofet
EP3924513B1 (en) 2019-02-14 2023-04-12 Pacific Biosciences of California, Inc. Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes
BR112020026482A2 (pt) * 2019-02-15 2021-09-28 Illumina, Inc. Sistema de detecção, kits, nucleotídeos marcados, métodos e misturas de incorporação
WO2020172444A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Omniome, Inc. Scanning apparatus and methods for detecting chemical and biological analytes
WO2021050681A1 (en) 2019-09-10 2021-03-18 Omniome, Inc. Reversible modification of nucleotides
DE202019106694U1 (de) 2019-12-02 2020-03-19 Omniome, Inc. System zur Sequenzierung von Nukleinsäuren in Fluidschaum
WO2021158511A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 Omniome, Inc. Flow cells and methods for their manufacture and use
EP4146823A1 (en) * 2020-05-04 2023-03-15 Illumina, Inc. Compositions and methods for sequencing using polymer bridges
WO2021252800A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Nautilus Biotechnology, Inc. Methods and systems for computational decoding of biological, chemical, and physical entities
US20230235388A1 (en) * 2020-06-30 2023-07-27 Illumina Singapore Pte. Ltd. Compositions and methods for sequencing using at least altering electrical characteristics of bridges between electrodes
US11692217B2 (en) 2020-11-11 2023-07-04 Nautilus Subsidiary, Inc. Affinity reagents having enhanced binding and detection characteristics
WO2022108701A1 (en) * 2020-11-20 2022-05-27 Illumina, Inc. Compositions and methods for sequencing using fluorophores and quenchers or donors
US20220227890A1 (en) 2021-01-21 2022-07-21 Nautilus Biotechnology, Inc. Systems and methods for biomolecule preparation
WO2022192591A1 (en) 2021-03-11 2022-09-15 Nautilus Biotechnology, Inc. Systems and methods for biomolecule retention
WO2022211905A1 (en) * 2021-03-30 2022-10-06 Illumina, Inc. Compositions and methods for sequencing using polymers with metal-coated regions and exposed regions
WO2023038859A1 (en) 2021-09-09 2023-03-16 Nautilus Biotechnology, Inc. Characterization and localization of protein modifications
WO2023049073A1 (en) 2021-09-22 2023-03-30 Nautilus Biotechnology, Inc. Methods and systems for determining polypeptide interactions
US20230149883A1 (en) 2021-11-03 2023-05-18 Nautilus Biotechnology, Inc. Systems and methods for surface structuring
US20230314324A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Nautilus Subsidiary, Inc. Integrated arrays for single-analyte processes
WO2023250364A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Nautilus Subsidiary, Inc. Method for detecting analytes at sites of optically non-resolvable distances
WO2024073599A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Nautilus Subsidiary, Inc. Preparation of array surfaces for single-analyte processes

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101669026A (zh) * 2006-12-14 2010-03-10 离子流系统有限公司 利用大规模fet阵列测量分析物的方法和装置
CN101743319A (zh) * 2007-03-02 2010-06-16 Dna电子有限公司 使用固态pH传感器的qPCR

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
EP0450060A1 (en) 1989-10-26 1991-10-09 Sri International Dna sequencing
US5856091A (en) * 1993-03-18 1999-01-05 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2
US5552278A (en) 1994-04-04 1996-09-03 Spectragen, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
US5968784A (en) 1997-01-15 1999-10-19 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Method for analyzing quantitative expression of genes
US6908763B1 (en) 1997-08-22 2005-06-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Mammalian common lymphoid progenitor cell
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US20050244870A1 (en) 1999-04-20 2005-11-03 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing using microsphere arrays
GB9923644D0 (en) * 1999-10-06 1999-12-08 Medical Biosystems Ltd DNA sequencing
EP1990428B1 (en) 2000-02-07 2010-12-22 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6913884B2 (en) 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
DE60131194T2 (de) 2000-07-07 2008-08-07 Visigen Biotechnologies, Inc., Bellaire Sequenzbestimmung in echtzeit
AU2002227156A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
DK3002289T3 (en) 2002-08-23 2018-04-23 Illumina Cambridge Ltd MODIFIED NUCLEOTIDES FOR POLYNUCLEOTIDE SEQUENCE
US7414116B2 (en) 2002-08-23 2008-08-19 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
GB2398383B (en) * 2003-02-12 2005-03-09 Global Genomics Ab Method and means for nucleic acid sequencing
US20050053980A1 (en) 2003-06-20 2005-03-10 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
GB2423819B (en) 2004-09-17 2008-02-06 Pacific Biosciences California Apparatus and method for analysis of molecules
DK1907583T4 (da) 2005-06-15 2020-01-27 Complete Genomics Inc Enkeltmolekyle-arrays til genetisk og kemisk analyse
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
WO2007111924A2 (en) 2006-03-23 2007-10-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Motion resolved molecular sequencing
US8241573B2 (en) 2006-03-31 2012-08-14 Illumina, Inc. Systems and devices for sequence by synthesis analysis
EP2089517A4 (en) 2006-10-23 2010-10-20 Pacific Biosciences California POLYMERASEENZYME AND REAGENTS FOR ADVANCED NUCKIC ACID SEQUENCING
EP2173467B1 (en) 2007-07-13 2016-05-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and apparatus using electric field for improved biological assays
CN101582444A (zh) 2008-05-14 2009-11-18 清华大学 薄膜晶体管
GB2461026B (en) * 2008-06-16 2011-03-09 Plc Diagnostics Inc System and method for nucleic acids sequencing by phased synthesis
WO2010044932A2 (en) * 2008-07-11 2010-04-22 Cornell University Nanofluidic channels with integrated charge sensors and methods based thereon
WO2010033966A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 The Government of the United State of America, as represented by the Secretary of the Navy Tether-containing conducting polymers
US20110294116A1 (en) 2008-12-11 2011-12-01 The Regents of the Unicersity of California Methods and systems for direct sequencing of single dna molecules
US8652779B2 (en) * 2010-04-09 2014-02-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing using charge blockade labels
US9353412B2 (en) 2010-06-18 2016-05-31 Illumina, Inc. Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids
WO2012012703A2 (en) * 2010-07-23 2012-01-26 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Identification of differentially represented fetal or maternal genomic regions and uses thereof
US8685324B2 (en) * 2010-09-24 2014-04-01 Life Technologies Corporation Matched pair transistor circuits
EP2678444B1 (en) * 2011-02-23 2016-02-17 Eve Biomedical, Inc. Rotation-dependent transcriptional sequencing systems and methods of using
US9164053B2 (en) 2011-09-26 2015-10-20 The Regents Of The University Of California Electronic device for monitoring single molecule dynamics
WO2013056241A2 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time redox sequencing
WO2013096692A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Illumina, Inc. Apparatus and methods for kinetic analysis and determination of nucleic acid sequences
US10246479B2 (en) * 2012-04-09 2019-04-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method of preparation of nanopore and uses thereof
CN103896244B (zh) 2012-12-29 2016-08-10 清华大学 反应器及生长碳纳米管的方法
US9708656B2 (en) 2013-05-06 2017-07-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time electronic sequencing

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101669026A (zh) * 2006-12-14 2010-03-10 离子流系统有限公司 利用大规模fet阵列测量分析物的方法和装置
CN101743319A (zh) * 2007-03-02 2010-06-16 Dna电子有限公司 使用固态pH传感器的qPCR

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment);Tivoli J. Olsen et al.;《J Am Chem Soc》;20130529;第135卷(第21期);摘要，图1b *

Also Published As

Publication number Publication date
DK3460075T3 (da) 2021-02-01
US20200348257A1 (en) 2020-11-05
JP6875442B2 (ja) 2021-05-26
EP3828279B1 (en) 2022-11-16
ES2697428T3 (es) 2019-01-23
CN107075579A (zh) 2017-08-18
CN113913505A (zh) 2022-01-11
US10605766B2 (en) 2020-03-31
US20160017416A1 (en) 2016-01-21
WO2016010975A2 (en) 2016-01-21
AU2015289828B2 (en) 2019-12-19
DK3169805T3 (en) 2018-11-26
ES2845548T3 (es) 2021-07-27
AU2019284046B2 (en) 2022-04-21
SG11201700348VA (en) 2017-02-27
US20180112265A1 (en) 2018-04-26
JP2017521082A (ja) 2017-08-03
CA2955356C (en) 2024-01-02
US10545115B2 (en) 2020-01-28
EP3460075B1 (en) 2020-11-04
EP3460075A1 (en) 2019-03-27
AU2019284046A1 (en) 2020-01-23
DK3169805T5 (en) 2018-12-03
CA2955356A1 (en) 2016-01-21
EP3828279A1 (en) 2021-06-02
PL3169805T3 (pl) 2019-01-31
AU2015289828A1 (en) 2017-02-02
EP3169805A2 (en) 2017-05-24
SG10201901475VA (en) 2019-03-28
JP6510029B2 (ja) 2019-05-08
JP2019134713A (ja) 2019-08-15
WO2016010975A3 (en) 2016-04-21
EP3169805B1 (en) 2018-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019284046B2 (en) Biochemically Activated Electronic Device
EP3294908B1 (en) Methods for sequencing nucleic acids
US20210310985A1 (en) Sensing systems
GUNDERSON et al. Patent 2984112 Summary
JP2023525525A (ja) 電極に連結した粒子を含むデバイス、並びにこれを作製及び使用する方法。

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant