TWI752407B - 感測系統 - Google Patents

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Abstract

在一實例中，一種感測系統包括一pH值感測器。該pH值感測器包括兩個電極及可操作地連接至該兩個電極之一導電通道。一複合物附著至該pH值感測器之該導電通道。該複合物包括連接至至少一個pH值改變部分的一聚合酶，該至少一個pH值改變部分用以參與由於暴露於該pH值感測器的一流體中之一二級基質的消耗而在該導電通道附近產生一pH值變化。該至少一個pH值改變部分選自由以下各者組成之群：一酶、一金屬配位錯合物、一輔因子及一活化物。

Description

感測系統
〔相關申請案〕
本申請案主張2019年2月15日申請的美國臨時申請案第62/806,545號之權益；該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
本申請案係關於感測系統，其包含pH值感測器與複合物，其中該pH值感測器包括兩個電極及可操作地連接至該兩個電極的導電通道且該複合物包括連接至至少一個pH值改變部分的聚合酶，該pH值改變部分用以參與在該導電通道附近產生pH值變化。本申請案亦關於相關套組、經標記核苷酸、方法與併入混合物。
生物或化學研究中之各種方案涉及在局部支撐表面上或預界定之反應腔室內進行大量受控反應。隨後可觀察或偵測指定的反應，且後續分析可幫助鑑定或揭示反應中所涉及之化學物質的特性。在一些實例中，受控反應產生螢光，且因此光學系統可用於偵測。在其他實例中，受控反應改變電荷、電導率或一些其他電學特性，且因此電子系統可用於偵測。
本文揭示之第一態樣係一種感測系統，其包含：一pH值感測器， 該pH值感測器包括兩個電極及可操作地連接至該兩個電極之一導電通道；及一複合物，其附著至該pH值感測器之該導電通道，該複合物包括連接至至少一個pH值改變部分的一聚合酶，該至少一個pH值改變部分用以參與由於暴露於該pH值感測器的一流體中之一二級基質的消耗而在該導電通道附近產生一pH值變化，該至少一個pH值改變部分選自由以下各者組成之群：一酶、一金屬配位錯合物、一輔因子及一活化物。
在此第一態樣之一實例中，該至少一個pH值改變部分為酶，且其中該酶在與該二級基質之一反應中生成一酸或一鹼。在一個特定實例中，該酶選自由以下各者組成之群：水解酶及氧化酶。
在此第一態樣之一實例中，該至少一個pH值改變部分的動力學比聚合酶之動力學快至少10倍。
在此第一態樣之一實例中，該至少一個pH值改變部分為酶，且該複合物進一步包含附著至該酶的一核酸髮夾-酶抑制物共軛物。
在此第一態樣之一實例中，至少一個pH值改變部分為酶；且複合物進一步包括附著至聚合酶之第二酶。
在此第一態樣之一實例中，複合物為融合蛋白質或蛋白質嵌合體。
在此第一態樣之一實例中，pH值感測器之導電通道選自由以下各者組成之群：半導電奈米結構、石墨烯奈米結構、金屬奈米結構及導電聚合物奈米結構。
此第一態樣之一實例進一步包含包括由間隙區域分隔開之複數個凹陷的一支撐件，其中pH值感測器之至少導電通道係在複數個凹陷中之一者的底部處；及複數個額外pH值感測器，其中複數個額外pH值感測器中之每一者的至少一導電通道係在該複數個凹陷中之一各別者的底部。在一個特定實例 中，複數個凹陷中之每一者包括側壁，且其中側壁包括pH值緩衝材料。
應理解，本文中所揭示之感測系統之任何特徵可以任何所需方式及/或組態組合在一起。
本文揭示之第二態樣為一套組，其包含：一pH值感測器，其包括兩個電極及可操作地連接至該兩個電極之一導電通道；及一流體，其包括一液體載劑及在該液體載劑中之一複合物，該複合物包括連接至至少一種酶的一聚合酶，該至少一種酶用以由於暴露於該pH值感測器的一第二流體中之一二級基質的消耗而在該導電通道附近產生一pH值變化。
此第二態樣之實例進一步包含包括一第二液體載劑及一經標記核苷酸的該第二流體，該經標記核苷酸包括：一核苷酸；一連接分子，其附著至該核苷酸之一末端磷酸基；及一標記物，其附著至該連接分子，該標記物選自由以下各者組成之群：增強酶之動力學的第一基及減緩酶之動力學的第二基。在一個特定實例中，二級基質在該第二流體中且為與經標記核苷酸分開之分子，且第一基或第二基用以改變涉及酶及二級基質的酸或鹼生成反應之動力學。在另一特定實例中，二級基質在該第二流體中且為與經標記核苷酸分開之分子，該標記物為減緩酶之動力學的第二基，且第二基選自由以下各者組成之群：異位抑制物、空間排阻基及緩衝基。在再一特定實例中，二級基質在該第二流體中且為與經標記核苷酸分開之分子，該標記物為增強酶之動力學的第一基，且第一基為酶之輔因子。
此第二態樣之另一實例進一步包含包括一第二液體載劑及一經標記核苷酸的該第二流體，該經標記核苷酸包括一核苷酸及附著至核苷酸之鹼基或糖的二級基質，其中二級基質之動力學比聚合酶之動力學快至少10倍。
應理解，套組之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解，此套組及/或感測系統之特徵之任何組合可一起使用，及/或與本文 中所揭示之實例中之任一者組合。
本文揭示之第三態樣為一套組，其包含：一pH值感測器，其包括兩個電極及可操作地連接至該兩個電極之一導電通道；及一流體，其包括一液體載劑及在該液體載劑中之一複合物，該複合物包括連接至金屬配位錯合物的一聚合酶，該金屬配位錯合物用以由於暴露於該pH值感測器的一第二流體中之一二級基質的消耗而在該導電通道附近產生一pH值變化。
此第三態樣之實例進一步包含該第二流體，該第二流體包括：一第二液體載劑；二級基質(其中該二級基質用以經由與金屬配位錯合物之反應生成酸或鹼)及一經標記核苷酸，該經標記核苷酸包括：一核苷酸；一連接分子，其附著至核苷酸之末端磷酸基；及一標記物，其附著至該連接分子，該標記物為用於金屬配位錯合物之金屬的配位體，其中該配位體改變該金屬配位錯合物之催化特性。
應理解，此套組之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解，此套組及或感測系統及/或其他套組之特徵之任何組合可一起使用，及/或與本文中所揭示之實例中之任一者組合使用。
本文揭示之第四態樣為一經標記核苷酸，該經標記核苷酸包含：一核苷酸；一連接分子，其附著至核苷酸之末端磷酸基；及一催化劑標記物，其附著至該連接分子，其中催化劑標記物用以由於具有經標記核苷酸之流體中的二級基質之消耗產生pH值變化。
在第四態樣之一實例中，催化劑標記物選自由以下各者組成之群：水解酶及氧化酶。
應理解，此經標記核苷酸之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解此經標記核苷酸及/或感測系統及/或套組之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文中所揭示之實例中之任一者組合使用。
本文揭示之第五態樣為一套組，其包含第四態樣之經標記核苷酸，及一感測系統，該感測系統包括：兩個電極；一導電通道，其可操作地連接至該兩個電極；及一複合物，其附著至該導電通道，該複合物包括與經標記核苷酸之催化劑標記物的輔因子或活化物共軛的聚合酶。
應理解，此套組之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解此套組及/或感測系統及/或其他套組及/或經標記核苷酸之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文中所揭示之實例中之任一者組合使用。
本文揭示之第六態樣為一經標記核苷酸，該經標記核苷酸包含：一核苷酸，其具有3' OH阻隔基；一可裂解連接分子，其附著至核苷酸之鹼基或糖；及一標記物，其附著至該可裂解連接分子，其中該標記物用以參與涉及二級基質之pH值改變反應。
應理解，此經標記核苷酸之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解此經標記核苷酸及/或感測系統及/或套組及/或其他經標記核苷酸之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文中所揭示之實例中之任一者組合使用。
本文揭示之第七態樣為一套組，其包含第六態樣之經標記核苷酸，及一感測系統，該感測系統包括：兩個電極；一導電通道，其可操作地連接至該兩個電極；及一複合物，其附著至該導電通道，該複合物包括與經標記核苷酸之催化劑標記物的輔因子或活化物共軛的聚合酶。
應理解，此套組之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解此套組及/或感測系統及/或該等套組及/或經標記核苷酸之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文中所揭示之實例中之任一者組合使用。
本文揭示之第八態樣為一種方法，其包含將一流體引入至包括複數個可個別定址導電通道之一感測器陣列，從而將一複合物附著至該複數個可 個別定址導電通道中之至少一些，該複合物包括一聚合酶及連接至該聚合酶之一pH值改變部分，該pH值改變部分選自由以下各者組成之群：一酶，其用以催化將暴露於感測器陣列的溶液中之二級基質的消耗；一金屬配位錯合物，其用以催化將暴露於感測器陣列的溶液中之二級基質的消耗；及附著至將引入至感測器陣列中之經標記核苷酸的催化劑標記物之一輔因子或活化物。
應理解，此方法之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解此方法及/或感測系統及/或該等套組及/或經標記核苷酸之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文中所揭示之實例中之任一者組合。
本文揭示之第九態樣為一種方法，其包含：將一模板聚核苷酸鏈引入至具有栓系(tethered)至一導電通道之聚合酶的一感測器；將包括二級基質及經標記核苷酸之一流體引入至該感測器，從而經標記核苷酸中之一者的核苷酸與該聚合酶相連且該等經標記核苷酸中之一者的標記物參與在導電通道附近的涉及二級基質之pH值改變反應；及偵測導電通道之回應。
在此第九態樣之一實例中，感測器之聚合酶為具有酶催化劑的複合物之部分，該標記物為增強或減緩酶催化劑之動力學的基，且該方法進一步包含偵測與基線電荷相比之電荷變化。
在此第九態樣之一實例中，感測器之聚合酶為具有酶催化劑之複合物的部分，該標記物為二級基質，且該方法進一步包含偵測與基線電荷相比之電荷變化。
在此第九態樣之一實例中，感測器之聚合酶為具有金屬配位錯合物之複合物的部分，該標記物為用於金屬配位錯合物之金屬的配位體，且該方法進一步包含偵測與基線電荷相比之電荷變化。
在此第九態樣之一實例中，感測器之聚合酶為具有酶催化劑之複合物的部分，核酸髮夾-酶抑制物共軛物附著至該酶催化劑，該標記物為與核酸 髮夾-酶抑制物共軛物之一部分互補的寡核苷酸序列，且該方法進一步包含偵測與基線電荷相比之電荷變化。
第九態樣之實例中的任何一或多者可進一步包含自電荷變化或電荷變化之速率鑑定與聚合酶相連之核苷酸。
在此第九態樣之一實例中，經標記核苷酸具有相異併入速率，且該方法進一步包含藉由相連經標記核苷酸之相異併入速率鑑定該相連經標記核苷酸。
應理解，此方法之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解此方法及/或其他方法及/或感測系統及/或套組及/或經標記核苷酸之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文中所揭示之實例中之任一者組合。
本文揭示之第十態樣為一種包含以下各者的方法：自由以下各者組成之群選擇pH值改變部分：一酶，其用以催化溶液中之二級基質的消耗；一金屬配位錯合物，其用以催化溶液中之二級基質的消耗；及附著至經標記核苷酸的催化劑標記物之一輔因子或活化物；將一聚合酶與該pH值改變部分共軛以生成一複合物；及將該複合物附著至可操作地連接至兩個電極之導電通道。
應理解，此方法之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解此方法及/或其他方法及/或感測系統及/或套組及/或經標記核苷酸之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文中所揭示之實例中之任一者組合。
本文揭示之第十一態樣為一併入混合物，其包含：一液體載劑；一複合物，其包括一聚合酶及連接至該聚合酶之一pH值改變部分，該pH值改變部分選自由以下各者組成之群：一酶，其用以催化二級基質之消耗；一金屬配位錯合物，其用以催化二級基質之消耗；及一輔因子或活化物，其用以催化二級基質之消耗；及一經標記核苷酸，該經標記核苷酸包括：一核苷酸；一連接分子，其附著至該核苷酸之末端磷酸基；及一標記物，其附著至該連接分子， 其中該標記物用以參與涉及二級基質之一pH值改變反應。
在此第十一態樣之一實例中，該pH值改變部分為酶，且標記物選自由以下各者組成之群：第一基，其增強該酶之動力學，及第二基，其減緩該酶之動力學；該pH值改變部分為該金屬配位錯合物，且該標記物為用於該金屬配位錯合物之金屬的配位體，其中該配位體改變該金屬配位錯合物之催化特性；或該pH值改變部分為該輔因子或活化物，且該標記物為藉由輔因子或活化物活化的一催化劑標記物。
在此第十一態樣之一實例中，該pH值改變部分為酶；該複合物進一步包括附著至該酶之一核酸髮夾-酶抑制物共軛物；且該標記物為與核酸髮夾-酶抑制物共軛物之一部分互補的一寡核苷酸序列。
應理解，此併入混合物之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解併入混合物及/或方法及/或感測系統及/或套組及/或經標記核苷酸之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。
本文揭示之第十二態樣為一套組，其包含第十一態樣之併入混合物，及包括第二液體載劑及二級基質之二級基質混合物。
第十二態樣之實例進一步包含一流動槽，其包括：一基質，其包括由間隙區域分隔開的複數個凹陷；在該複數個凹陷中之每一者之底部的一導電通道；及接枝於凹陷中之每一者中之每一者中的至少一個引子。
應理解，此套組之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解此套組及/或併入混合物及/或方法及/或感測系統及/或其他套組及/或經標記核苷酸之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。
本文揭示之第十三態樣為一併入混合物，其包含：一液體載劑，其包括一緩衝液；一複合物，其包括一聚合酶及連接至該聚合酶之一pH值改變 部分，該pH值改變部分選自由以下各者組成之群：一酶，其用以催化二級基質之消耗；一金屬配位錯合物，其用以催化二級基質之消耗；及一輔因子或活化物，其用以催化二級基質之消耗；及一經標記核苷酸，該經標記核苷酸包括：一核苷酸，其具有3' OH阻隔基；一可裂解連接分子，其附著至該核苷酸之鹼基或糖；及一標記物，其附著至該連接分子，其中該標記物用以參與涉及二級基質之一pH值改變反應。
在第十三態樣之一實例中，該pH值改變部分為酶，且該標記物選自由以下各者組成之群：一第一基，其增強酶之動力學；一第二基，其減緩酶之動力學；及二級基質；或該pH值改變部分為金屬配位錯合物，且該標記物為用於金屬配位錯合物之金屬的配位體，其中該配位體改變該金屬配位錯合物之催化特性；或該pH值改變部分為輔因子或活化物，且該標記物為藉由該輔因子或活化物活化的催化劑標記物。
在第十三態樣之一實例中，該pH值改變部分為酶；該複合物進一步包括附著至該酶之一核酸髮夾-酶抑制物共軛物；且該標記物為與核酸髮夾-酶抑制物共軛物之一部分互補的一寡核苷酸序列。
應理解，此併入套組之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解此併入混合物及/或方法及/或感測系統及/或套組及/或經標記核苷酸之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。
本文揭示之第十四態樣為一套組，其包含如第十三態樣中所定義之併入混合物，及包括第二液體載劑及二級基質之二級基質混合物。
第十四態樣之實例進一步包含一流動槽，其包括：一基質，其包括由間隙區域分隔開的複數個凹陷；在該複數個凹陷中之每一者之底部的一導電通道；及接枝於凹陷中之每一者中的一引子。
第十四態樣之實例進一步包含一解阻隔劑溶液。
應理解，此套組之任何特徵可以任何所需的方式組合在一起。此外，應理解此套組及/或方法及/或感測系統及/或其他套組及/或經標記核苷酸及/或併入混合物之特徵的任何組合可一起使用，及/或與本文所揭示之實例中之任一者組合。
又另外，應理解該等態樣中之任一者的任何特徵可以任何所需方式單獨或組合使用，及/或可與本文所揭示之實例中之任一者組合使用以至少達成如本文所描述的益處。
10A:感測系統
10B:感測系統
10C:感測系統
10D:感測系統
10E:感測系統
12:經標記核苷酸
12':經標記核苷酸
12A:經標記核苷酸
12B:經標記核苷酸
12C:經標記核苷酸
14:核苷酸
14':核苷酸
16:連接分子
16':可裂解連接分子
18:標記物
18A:標記物
18B:標記物
18C:標記物
18D:標記物
18E:標記物
18F:標記物
20:pH值感測器
22:電極
24:電極
26:導電通道
26':導電通道
28:聚合酶
30A:複合物
30B:複合物
30C:複合物
30D:複合物
32:繫鏈
32':繫鏈
34:二級基質
38A:3' OH阻隔基
38B:3' OH阻隔基
38C:3' OH阻隔基
40A:感測系統
40B:感測系統
42:裂解位點
44:模板聚核苷酸鏈
46:新生股
50A:pH值改變部分/酶
50B:pH值改變部分/輔因子
50C:pH值改變部分/活化物
50D:pH值改變部分/酶
50E:pH值改變部分/金屬配位錯合物
54:酶
58:核酸髮夾-酶抑制物共軛物
60:酶抑制物
62:流動槽
64:流動通道
66:支撐件
68:圖案化材料
70:凹陷
72:間隙區域
74:引子
M:金屬配位錯合物
參考以下實施方式及圖式，本文之揭示內容之實例之特徵將變得明顯，在以下實施方式及圖式中，類似的元件符號對應於類似但或許不完全相同的組件。出於簡潔起見，具有先前所描述功能之參考數字或圖形可能或可能不結合出現該等參考數字或圖形之其他圖式來描述。
[圖1A至圖1C]為本文所揭示之經標記核苷酸的不同實例之示意性說明；[圖2]為描繪本文所揭示之感測系統之一個實例，及可與該感測系統之此實例一起使用的經標記核苷酸及二級基質之實例的示意性說明；[圖3A]為描繪本文所揭示之感測系統之另一實例，及可與該感測系統之此實例一起使用的經標記核苷酸及二級基質之實例的示意性說明；[圖3B]描繪與本文所揭示之經標記核苷酸之另一實例一起使用的圖3A之感測系統的實例；[圖4]為描繪本文所揭示之感測系統的另一實例，及可與該感測系統之此實例一起使用的經標記核苷酸及二級基質之實例的示意性說明； [圖5]為描繪本文所揭示之感測系統之再一實例，及可與該感測系統之此實例一起使用的經標記核苷酸及二級基質之實例的示意性說明；[圖6A]為描繪本文所揭示之感測系統之又一個實例的示意性說明；[圖6B]描繪與本文所揭示之經標記核苷酸之另一實例一起使用的圖6A之感測系統的實例；[圖7A]為流量槽之實例之俯視圖；[圖7B]為適合於與單分子感測一起使用的流動槽之實例之放大及部分剖視圖；[圖7C]為適合於與整體測序一起使用的流動槽之實例之放大及部分剖視圖；且[圖7D]為適合於與整體測序一起使用的流動槽之再一實例之放大及部分剖視圖。
本文所揭示之實例感測系統中之一些可用於核酸測序程序中之單分子偵測。此等感測系統中之每一者包括一個導電通道，其中一個聚合酶或一個含聚合酶之複合物附著至該導電通道。此導電通道可偵測由於pH值(氫離子濃度)之侷限性變化引起的電荷之變化。在使用中，經標記核苷酸及二級基質經引入至感測系統中。當經標記核苷酸中之一者的含氮鹼基藉由聚合酶併入至新生股中時，在酸或鹼生成反應(其增加或減小帶電離子之濃度)中消耗二級基質。酸或鹼生成反應亦涉及pH值改變部分，在一些實例中，該pH值改變部分作為複合物之部分固定在導電通道上；且在其他實例中，該pH值改變部分為所併入經標記核苷酸之標記物。酸或鹼生成反應中之一些涉及多個pH值改變部 分，例如，作為複合物之部分的一個部分及作為經標記核苷酸之標記物的另一部分。此等組態使得pH值改變部分能夠在導電通道之表面處或接近該表面定位；且因此，酸或鹼生成反應侷限化在導電通道的表面。在一些情況下，帶電離子與導電通道的表面基反應，從而引起表面基之質子化或去質子化，此改變表面基之電荷。在此等情況下，表面基之電荷被感測。因為電荷直接在導電通道之表面上，因此其不能藉由溶液中之離子高效篩分且因此可誘發臨限電壓及電流之較大變化。在其他情況下，由酸或鹼生成產生的帶電離子被感測。
本文所揭示之實例感測系統中之一些其他者可用於整體核酸測序程序。此等感測系統中之每一者包括其上具有引子(例如，寡對)菌苔的導電通道。此導電通道可偵測由於pH值之侷限性變化引起的電荷之變化。在使用中，庫模板經引入且與引子雜交。叢集生成經執行以生成若干模板聚核苷酸鏈。含聚合酶之複合物、經標記核苷酸及二級基質隨後引入至感測系統中。在各別經標記核苷酸之含氮鹼基經併入(藉由複合物之各別聚合酶)至沿著各別模板聚核苷酸鏈形成之各別新生股中期間或之後，在酸或鹼生成反應(其增加或減小帶電離子之濃度)中消耗二級基質。類似於單分子感測，酸或鹼生成反應亦涉及pH值改變部分，其為含聚合酶複合物之部分或為所併入經標記核苷酸之標記物。此等組態使得pH值改變部分能夠在導電通道之表面處或接近該表面定位；且因此，酸或鹼生成反應侷限化在導電通道的表面。帶電離子或帶電離子與導電通道之表面基的反應任一者被感測。
在本文所揭示之實例中之任一者中，酸或鹼生成反應可生成鹼基之數百或數千或甚至更多質子或分子，從而生成較大及侷限性pH值變化。
在本文所揭示之實例中之任一者中，pH值改變部分可為任何化學物質，其可參與與二級基質之酸或鹼生成反應，或修飾作用於二級基質的另一pH值改變部分之活性。作為實例，pH值改變部分可催化(促使或加速)涉及 二級基質之酸或鹼生成反應，可抑制涉及二級基質之酸或鹼生成反應，可增強或減緩酸或鹼生成反應動力學，或可另外參與涉及二級基質之酸或鹼生成反應。pH值改變部分之一些實例作為複合物之部分固定在導電通道上；且pH值改變部分之其他實例為所併入經標記核苷酸之標記物。在一些情況下，兩個pH值改變部分可一起相互作用以產生pH值變化。
本文所揭示之酸或鹼生成(pH值改變)反應涉及二級基質。如本文所使用，術語「二級基質」指代在生成酸或鹼之反應中消耗的化學物質，其中該化學物質為與鹼基能夠與複合物之聚合酶相互作用的核苷酸分開的分子或為附著至其鹼基能夠與複合物之聚合酶相互作用的核苷酸之糖或鹼基的相異分子，且並非為含氮鹼基併入事件之副產物。相異二級基質之使用使得所偵測pH值變化之動力學能夠與核苷酸併入之動力學去耦。在一些實例中，與二級基質相互作用的pH值改變部分可比與核苷酸相互作用的聚合酶在動力學方面顯著更快。此使得能夠觀測到對於單一併入事件或一群併入事件的較大pH值變化。
需要酸或鹼生成(pH值改變)反應在導電通道附近發生。「在附近」一般係指所生成酸或鹼可於其中擴散的任何距離。在具有重複/週期性感測系統之陣列中，可依據感測器/感測系統間距來定義「在附近」。感測器間距或感測系統間距指代沿著一線的兩個順次感測器/感測系統之間的距離。在一實例中，感測系統之反應區(其中生成酸或鹼)可在距感測系統之導電通道的感測器間距內。
用於單分子感測的感測系統10A至10E之若干實例在本文中揭示，且在圖2、圖3A、圖3B、圖4、圖5、圖6A及圖6B中展示及描述。用於整體測序的感測系統40A及40B之實例展示於圖7C及圖7D中。感測系統10A至10E或40A至40B之每一實例可與經標記核苷酸一起使用。一些經標記核苷酸能夠在鹼基併入之後天然地裂解，且此實例示意性地展示於圖1A中。一些其他經標記核 苷酸包括允許僅僅單一鹼基併入在每一測序循環中發生的可逆終止子，且此等經標記核苷酸中之一些的化學結構之實例展示於圖1B中。此等實例中之任一者亦可包括作為附著至糖或鹼基之相異分子的二級基質(圖1C)。現將描述經標記核苷酸中之每一者。
經標記之核苷酸
如圖1A中所描繪，經標記核苷酸12包括核苷酸14、附著至核苷酸14之末端磷酸基的連接分子16，及附著至連接分子16之標記物18。經標記核苷酸12可視為非天然或合成核苷酸，此係因為其在結構上或化學上不同於天然核苷酸。
經標記核苷酸12之核苷酸14可為天然核苷酸。天然核苷酸包括含氮雜環鹼基(或含氮鹼基)、糖及一或多個磷酸基。天然核苷酸之實例包括例如核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。在核糖核苷酸中，糖為核糖，且在去氧核糖核苷酸中，糖為去氧核糖(亦即缺乏存在於核糖中之2'位置之羥基)。在一實例中，核苷酸14呈聚磷酸形式，此係因為其包括若干磷酸基(例如磷酸三酯基(亦即γ磷酸基)、磷酸四酯基、磷酸五酯基、磷酸六酯基等)。雜環鹼基可為嘌呤鹼基或嘧啶鹼基或任何其他核鹼基類似物。嘌呤鹼基包括腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)及其經修飾之衍生物或類似物。嘧啶鹼基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)以及其經修飾之衍生物或類似物。去氧核糖之C-1原子結合至嘧啶之N-1或嘌呤之N-9。
經標記核苷酸12亦包括連接分子16。連接分子16可為任何長鏈分子，其可以化學方式在一端結合至核苷酸14之磷酸基且可以化學方式在另一端結合至標記物18。在一些情況下，連接分子16亦可經選擇以使得其不與聚合酶28相互作用(參見例如圖2、圖3A、圖4、圖5、圖6A及圖6B)。在其他情況下， 連接分子16亦可經選擇以使得其與聚合酶28弱相互作用，此係因為此弱相互作用可幫助導引在導電通道附近的標記物18。連接分子16可經選擇以使得其足夠長以准許標記物18與pH值改變部分及/或二級基質34相連(例如參見圖2)，同時例如核苷酸14在併入事件期間藉由聚合酶28保持。
作為實例，連接分子16可包括烷基鏈、聚(乙二醇)鏈、醯胺基、磷酸基、諸如三唑之雜環、核苷酸，或其組合。烷基鏈之實例可包括至少6個碳原子且聚(乙二醇)鏈之實例可包括至少3個乙二醇單元。
以下實例說明經標記核苷酸12之實例，其中連接分子16包含烷基鏈、醯胺基、聚(乙二醇)鏈及三唑：
Figure 109102785-A0305-02-0017-1
以下實例說明經標記核苷酸12之另一實例，其中連接分子16包含烷基鏈、醯胺基、聚(乙二醇)鏈、三唑及磷酸基：
Figure 109102785-A0305-02-0017-2
以下實例說明經標記核苷酸12之又一個實例，其中連接分子16包含烷基鏈、醯胺基、聚(乙二醇)鏈、三唑及磷酸基：
Figure 109102785-A0305-02-0017-3
以下實例說明經標記核苷酸12之再一個實例，其中連接分子16包含烷基 鏈、醯胺基、聚(乙二醇)鏈、三唑、磷酸基及聚核苷酸鏈：
Figure 109102785-A0305-02-0018-5
雖然已描述若干實例連接分子16，但應理解，可使用其他連接分子16。連接分子16之選擇將部分取決於待附著至核苷酸14的標記物18。此外，連接分子16之長度可經選擇以使得當各別核苷酸14藉由個別感測系統之聚合酶保持時，各別標記物18可參與在導電通道26之表面處的酸或鹼生成反應(例如參見圖2)。
在每一實例經標記核苷酸12中，標記物18附著(經由連接分子16)至核苷酸14之末端磷酸酯末端。在末端磷酸酯末端處附著可能在一些測序技術中係所需的，此係因為在核苷酸鹼基併入之後，在α磷酸酯與連接分子16之間或在α磷酸酯與β磷酸酯之間的結合天然地裂解。此天然裂解使得標記物18(及連接分子16)能夠自併入之核苷酸鹼基解離並自感測系統10A至10E擴散掉，使得另一經標記核苷酸12可與感測系統10A至10E之聚合酶28相連且使得先前併入之鹼基不產生干擾下一併入鹼基之偵測的持續信號。
包括於經標記核苷酸12中的標記物18可部分取決於將與經標記核苷酸12一起使用的感測系統10A至10E或40A至40B。將進一步關於感測系統10A至10E及40A至40B中之每一者描述不同標記物18。
如圖1B中所描繪，經標記核苷酸12A、12B、12C中之每一者包括具有3' OH阻隔基38A、38B、38C之核苷酸14'、附著至核苷酸14'之鹼基或糖的可裂解連接分子16'，及附著至連接分子16'之標記物18。
核苷酸14'可為以下中之任一者：針對核苷酸14闡述的實例。在本文所揭示之實例中，核苷酸14'具有附著至其的3' OH阻隔基38A、38B、38C。3' OH阻隔基38A、38B、38C可連接至核苷酸14'中之糖分子的氧原子。3' OH阻隔基38A、38B、38C可為允許僅僅單一鹼基併入在每一測序循環中發生的可逆終止子。可逆終止子阻止額外鹼基併入至與模板聚核苷酸鏈互補的新生股中。此使得能夠偵測及鑑定單一併入鹼基。3' OH阻隔基38A、38B、38C隨後可被移除，從而使得額外測序循環能夠在每一模板聚核苷酸鏈處發生。不同3' OH阻隔基38A、38B、38C的實例展示於圖1B中，包括3'-ONH2可逆終止子(在38A處展示)、3'-0-烯丙基可逆終止子(-CH=CHCH2，在38B處展示)，及3-0-疊氮基甲基可逆終止子(-CH2N3，在38C處展示)。其他合適可逆終止子包括鄰硝苄基醚、烷基鄰硝苄基碳酸酯、酯部分、其他烯丙基部分、縮醛(例如，叔丁氧基-乙氧基)、MOM(-CH2OCH3)部分、2,4-二硝基苯次磺醯基、四氫呋喃基醚、3'磷酸酯、醚、-F、-H2、-OCH3、-N3、-HCOCH3及2-硝基苯碳酸酯。
在圖1B中展示之實例中，連接分子16'附著至核苷酸14'之鹼基(例如，嘌呤鹼基或嘧啶鹼基)。在一些實例中，連接分子16'包括藉由圖1B中之箭頭42鑑定的裂解位點。合適連接分子16'之一些實例展示於圖1B中，但應理解可使用可將標記物18附著至核苷酸14'之鹼基或糖的任何合適之可裂解連接子。
包括於經標記核苷酸12A、12B、12C中的標記物18可部分取決於待與經標記核苷酸12A、12B、12C一起使用的感測系統10A至10E或40A至40B。將進一步關於感測系統10A至10E及40A至40B中之每一者描述不同標記物18。
經標記核苷酸12'之再一實例展示於圖1C中。如圖1C中所描繪，經標記核苷酸12'包括核苷酸14及附著至核苷酸14之鹼基或糖的二級基質34。可在此情況下使用核苷酸14或14'中之任一者。二級基質34可直接附著至核苷酸14或14'之鹼基或糖。在一個實例中，二級基質34可直接附著至核苷酸14或14'之鹼 基的碳原子或氮原子。在另一實例中，二級基質34可直接附著至核苷酸14或14'之糖分子的氧原子或碳原子。若二級基質34如圖1C中所展示附著至核苷酸14之3'OH，則其將阻斷下一鹼基之其他併入(類似於經標記核苷酸12A至12C)。在糖分子上的此定位可係所需的，此係因為其迫使在下一併入事件之前消耗二級基質34且不需要單獨解阻隔劑以便移除阻隔基。若使用核苷酸14'(其包括3' OH阻隔基38A、38B、38C)，則二級基質34可直接附著至核苷酸14'之糖分子的2'位置。可替代地，二級基質34可例如經由連接分子間接附著至核苷酸14或14'之鹼基或糖。用於將二級基質34附著至核苷酸14或14'之鹼基或糖的合適連接分子之實例包括聚乙二醇鏈、烷基、生物素/抗生蛋白鏈菌素、炔丙基胺基，或附著至可市面上購得的官能化核鹼基的任何基。
在此實例經標記核苷酸12'中，二級基質34經選擇以使得二級基質34之消耗的動力學比在併入核苷酸鹼基時使用的聚合酶28之動力學至少快十(10)倍。因此，二級基質34之消耗比併入事件發生更快，且因此可在併入事件發生之前或發生時偵測到pH值變化。在一實例中，二級基質34可為用於羥化酶之基質，諸如聚酯鏈(其可藉由酯酵素消耗)、纖維素(其可藉由纖維素酵素消耗)、肽(其可藉由蛋白酶消耗)、澱粉(其可藉由澱粉酶消耗)等。在另一實例中，二級基質34為額外聚磷酸鏈。在此實例中，額外聚磷酸鏈並不被阻斷，且其反應度將取決於在核苷酸12'藉由聚合酶28反應時的較高局部濃度。亦在此實例中，核苷酸14或14'之末端磷酸酯可包括阻隔基以使得核苷酸14或14'之聚磷酸鏈不在酸或鹼生成反應中涉及。
單分子偵測
現參看圖2、圖3A、圖3B、圖4、圖5、圖6A及圖6B，感測系統10A至10E中之每一者可用於單分子感測。系統中之每一者包括pH值感測器20， 其包括兩個電極22、24及連接兩個電極22、24之導電通道26。
每一pH值感測器20可為場效電晶體(FET)。在FET中，電極22、24為源極端及汲極端，且導電通道26為閘極端。場效電晶體可為p通道或n通道，其影響回應之極性而非感測原理。離子敏感FET(ISFET)、接面閘極FET(JFET)、金屬半導體FET(MESFET)、金氧半導體FET(MOSFET)或無接面場效裝置為本文所揭示之實例中的全部合適之偵測器。
電極22、24可包含任何合適的導電材料。合適之源極及汲極材料之實例包括鈷、矽化鈷、鎳、矽化鎳、鋁、鎢、銅、鈦、鉬、氧化銦錫(ITO)、氧化銦錫、金、鉑、碳等。
導電通道26可包括任何導電或半導電及pH值敏感材料。在一個實例中，導電通道26為導電通道。在一個實例中，導電或半導電及pH值敏感材料能夠感測在其表面處之帶電離子。在另一實例中，導電或半導電及pH值敏感材料包括表面基，或塗佈有包括能夠回應於由二級基質34與pH值改變部分之反應生成的帶電離子而經歷質子化及/或去質子化的表面基的另一材料。導電或半導電及pH值敏感材料可包含有機材料、無機材料或兩者。
在一些實例中，導電或半導電及pH值敏感材料可包括能夠偵測電荷的半導電材料，諸如矽。半導電及pH值感測材料亦可在其表面之至少一部分上具有閘極介電質。在一些實例中，閘極介電質可環繞半導電及pH值感測材料(除在與電極22、24之觸點外)的整個外表面，且在其他實例中，閘極介電質可定位於半導電及pH值感測材料的外表面之一部分上。在一個實例中，閘極介電質用以防止電流洩漏至周圍環境(例如，流體)中，且亦可提供能夠經歷質子化及/或去質子化的表面基。閘極介電質之實例包括二氧化矽(SiO2)、氮氧化矽(SiON)、氮化矽(Si3N4)、五氧化鉭(Ta2O5)、氧化鉿(HfO2)、氧化鋯(ZrO2)、氧化鋁(Al2O3)、矽酸鉿或矽酸鋯(HfSiO4、ZrSiO4)等。表面基可 為矽烷醇基(Si-OH)、Si-NH2基、羧基、(-COOH)或羥基(-OH)基團。
在其他實例中，導電或半導電及pH值敏感材料可包括碳材料(例如，碳奈米管、玻璃態碳、石墨烯)而無閘極介電質。此等導電或半導電及pH值敏感材料可包括羧基(-COOH)基、羥基(-OH)基，或回應於pH值或允許pH值敏感官能團被附著的其他表面功能性。
在另外其他實例中，導電或半導電及pH值敏感材料可為生物分子。合適之生物分子的實例包括胜肽及去氧核糖核酸。此等材料可具有在由於酸或鹼生成反應所生成的pH值下的低pKa，且因此亦可包括具有靠近中性之pKa的導電性調變器。舉例而言，胜肽之導電性可藉由pH值敏感氨基酸(組胺酸等)調變。對於另一實例，DNA之導電性可運用pH值回應性嵌入劑(諸如阿黴素(pKa約8)及其類似物)調變。
在單分子感測系統10A至10E中，導電通道26可具有任何合適的幾何形狀，諸如管狀結構、線結構、平面結構等。在一些實例中，導電通道26亦可為具有至少一個奈米級尺寸(範圍介於1nm至小於1μm)的奈米結構。在一個實例中，此尺寸指代最大尺寸。在一實例中，pH值感測器之導電通道26選自由以下各者組成之群：半導電奈米結構、石墨烯奈米結構、金屬奈米結構及導電聚合物奈米結構。奈米結構可為多壁或單壁之奈米管、奈米線、奈米帶等。
適合於與單分子感測一起使用的感測系統10A至10E中之每一者包括附著至導電通道26之表面的聚合酶28。在一些實例中，聚合酶28單獨附著至導電通道26(例如參見圖2)，且在其他實例中，聚合酶28為包括連接至聚合酶28之另一組份的複合物30A至30D之部分(例如參見圖3A、圖3B、圖4、圖5、圖6A及圖6B)。
應理解聚合酶28能夠保持模板聚核苷酸鏈，且能夠一次併入一個核苷酸(來自經標記核苷酸12、12A、12B、12C或12')至沿著模板形成的新生 股中。應理解，聚合酶28及其功能與涉及二級基質34之酸及鹼生成反應分開且不同。詳言之，聚合酶28參與與涉及二級基質34之酸及鹼生成反應分開的酸生成反應。舉例而言，聚合酶28由於核苷酸鹼基併入而生成少量酸(例如，每併入事件1個分子)，而酸或鹼生成反應產生鹼基之數百或數千或甚至更多質子或分子。由聚合酶28產生的酸將藉由由涉及二級基質34之反應生成的大量酸或鹼壓倒。在一些情況下，由酸或鹼生成反應產生的局部pH值變化可影響聚合酶28之動力學。在一些情況下，pH值變化可斷開聚合酶28活性直至基線pH值恢復為止。此可對於在併入事件之間產生延遲(例如，當使用核苷酸12或12'時)係有利的。其他因數(諸如pH值改變部分的選擇、緩衝液、併入期間之溫度變化等)亦可經調整以進一步增強或抵消對聚合酶動力學的特定效應。
使用感測系統10A至10E中之任一者，一種用於單分子感測之方法包括：將模板聚核苷酸鏈44(例如參見圖2)引入至具有栓系至導電通道26的聚合酶28(單獨或作為複合物之部分)的感測器20；將包括二級基質34及經標記核苷酸12、12A、12B、12C或12'之一流體引入至該感測器20，從而經標記核苷酸12、12A、12B、12C或12'中之一者的核苷酸與聚合酶28相連且經標記核苷酸12、12A、12B、12C或12'中之一者的標記物18參與在導電通道26附近的涉及二級基質34之pH值改變反應；及偵測導電通道26之回應。在一些情況下，所偵測電荷之變化將與基線電荷相關。此外，不同核苷酸12、12A至12C或12'可具有不同併入速率，此可影響例如生成酸或鹼的時長或抑制酸或鹼生成反應的時長。此隨後將影響在導電通道26之表面的局部pH位準及電荷。併入速率可用於區分不同核苷酸。
感測系統10A至10E中之每一者及與感測系統10A至10E相關聯的任何方法現將參考其中展示其之個別圖更詳細地來描述。
感測系統10A
特定地參考圖2，感測系統10A包括pH值感測器20及經由繫鏈32附著至導電通道26的聚合酶28。
在此實例感測系統10A中，可使用可接受經標記核苷酸12或12A至12C(圖2)並可將核苷酸鹼基沿著模板44成功地併入至新生股46中之任何聚合酶28。在本文所揭示之單分子感測技術中，需要聚合酶28為高度進行型，以使得可發生多個併入事件。實例聚合酶包括：來自A族之彼等聚合酶，諸如Bsu聚合酶、Bst聚合酶、Taq聚合酶、T7聚合酶及許多其他者；來自B族及B2之聚合酶，諸如Phi29聚合酶及其他高度進行型聚合酶(族B2)、Pfu聚合酶(族B)、KOD聚合酶(族B)、9oN(族B)及許多其他者；來自C族之聚合酶，諸如大腸桿菌DNA PolIII族及許多其他者；來自D族之聚合酶，諸如強烈火球菌DNA Pol II，及許多其他者；來自X族之聚合酶，諸如DNA Polμ、DNA Polβ、DNA Polσ及許多其他者。在一個實例中，可能需要選擇已知在至少2個pH值單位內起作用的聚合酶28，此足以在信號中提供100mV範圍。在四個不同核苷酸及「斷開」狀態下，此範圍可涉及區分20mV變化，其係可偵測的。
在此實例感測系統10A中，繫鏈32用作聚合酶28之錨定器。合適之繫鏈32之實例包括聚乙二醇(PEG)。在感測系統10A中，繫鏈32之長度足以保持聚合酶28足夠接近於通道26以使得所生成酸或鹼中之任一者能夠在其在溶液中被中和之前擴散至通道26。在一實例中，繫鏈32可具有範圍介於約2nm至約200nm，或約5nm至約150nm，或約10nm至約100nm的長度。在一些實例中，繫鏈32保持聚合酶28遠離導電通道26至少10nm。舉例而言，此可為所需的，使得對聚合酶28之保形變化、聚合酶28之電荷及/或由聚合酶28保持之目標/模板聚核苷酸鏈之電荷不干擾pH值感測器20之感測操作。然而，應理解例如當pH值變化主導感測之信號時可能不需要此實例最小距離(至少10nm)。
雖然圖中未示，但感測系統10A亦可包括用以偵測與在pH值感測通道26之表面或接近該表面發生的pH值變化對應之電壓及/或電流變化的偵測器。
此外雖然圖中未示，但感測系統10A可定位於支撐件(諸如矽晶片或互補金屬氧化物半導體(CMOS))上。電極22、24可連接至啟用其操作的電子電路(例如，在鉤掛至偵測器及電力供應器後)。
在一些實例中，感測器10A可預先裝配。
在其他實例中，感測器組件可為一套組之部分，且套組組件可用於裝配感測器10A。套組之實例包括在支撐件上的pH值感測器20，及獨立聚合酶溶液。聚合酶溶液包括液體載劑及聚合酶28之任何實例。在一些實例中，聚合酶28附著至繫鏈32，且在其他實例中，繫鏈32作為感測系統10A之部分附著至pH值感測通道26。作為實例，聚合酶溶液之液體載劑可為水，或離子鹽緩衝流體，諸如在毫莫耳至莫耳濃度下的檸檬酸鹽水。
當使用套組時，使用者可將聚合酶溶液沈積於支撐件上，且允許聚合酶溶液保留在支撐件上持續合適之時間以供繫鏈32附著至導電通道26，或供聚合酶28附著至導電通道26上的繫鏈32。支撐件可運用合適之緩衝液沖洗以移除任何未結合聚合酶28。
在圖2中，套組之實例亦可包括將在單分子感測期間與感測器10A一起使用的流體。此流體包括液體載劑、經標記核苷酸12或12A至12C，及二級基質34。在一些情況下，此流體亦包括模板聚核苷酸鏈44。在其他情況下，一種溶液包括液體載劑、經標記核苷酸12或12A至12C，及二級基質34，且另一種溶液包括模板聚核苷酸鏈44。
模板多核苷酸鏈44可為待測序之任何樣本，且可由DNA、RNA或其類似物(例如肽核酸)構成。模板聚核苷酸鏈44可為圓形模板。模板(或 目標)聚核苷酸鏈44之來源可為基因組DNA、信使RNA或來自天然來源之其他核酸。在一些情況下，衍生自此類來源之模板聚核苷酸鏈44可在用於本文所揭示之方法或系統中之前擴增。可使用各種已知擴增技術中之任一者，包括(但不限於)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction；PCR)、滾環擴增(rolling circle amplification；RCA)、多重置換擴增(multiple displacement amplification；MDA)或隨機引子擴增(random prime amplification；RPA)。應理解，模板聚核苷酸鏈44在用於本文所闡述之方法或系統中之前的擴增為視情況存在。如此，在一些實例中，模板聚核苷酸鏈44在使用之前將不擴增。模板/目標聚核苷酸鏈44可視情況衍生自合成庫。合成核酸可具有天然DNA或RNA組成或可為其類似物。
經標記核苷酸12或12A至12C包括本文所揭示之核苷酸14或14'及連接分子16或16'之任何實例。圖2中展示的經標記核苷酸12或12A至12C之標記物18為催化劑標記物18A。如本文所使用，「催化劑標記物」指代起始或加速涉及二級基質34之酸或鹼生成反應的化學物質。如此，催化劑標記物18A為附著至經標記核苷酸12或12A至12C的pH值改變部分之一個實例。舉例而言，催化劑標記物18A可為與二級基質34反應以產生酸從而降低pH值的酶。酸生成對之特定實例包括作為催化劑標記物18A之乙醯膽鹼酯酶及作為二級基質34之酯基質(例如，乙醯膽鹼)。酸生成對之另一特定實例包括作為催化劑標記物18A之碳酸酐酶及作為二級基質34之碳酸氫鹽離子。舉例而言，催化劑標記物18A可為與二級基質34反應以產生鹼從而增加pH值的酶。在一些實例中，在通道26之表面的表面基對所生成的酸或鹼離子敏感，且可經歷質子化或去質子化，從而直接改變在通道26表面上之電荷密度。在其他實例中，在酸生成或鹼生成反應期間所生成的帶電離子係藉由導電通道26感測。
可在單分子感測期間與感測器10A一起使用的流體之液體載劑為具有範圍介於約6至約9或約7至約8之pH值的水或低緩衝流體(10mM或更 小)。流體之pH值取決於所使用的聚合酶28及當存在pH值變化時幫助最大化信號的任何條件。因為催化劑標記物18A及二級基質34兩者在此實例中均存在於流體中，因此某一(些)酸或鹼生成反應可發生在遠離導電通道26的流體中。然而，此等反應中所生成的離子可在流體中被中和(藉由低緩衝流體)，且因此可不產生可偵測信號。此防止流體中大的整體pH值變化。然而，應理解當經標記核苷酸12或12A至12C藉由聚合酶28保持時，催化劑標記物18A保持更接近於pH值感測通道26(例如，相較於當經標記核苷酸12或12A至12C在溶液中浮動時)。隨後，由涉及二級基質34及暫時結合催化劑標記物18A之反應產生的任何pH值變化亦更接近於pH值感測通道26。此外，催化劑標記物18A之動力學可比聚合酶28之動力學更快。舉例而言，酸生成酶、乙醯膽鹼酯酶之轉換頻率可高達25,000s-1，而併入事件可在任何位置採用約0.1s-1至約100s-1。在此實例中，催化劑標記物18A可生成被併入(每單一併入事件)的每核苷酸約250至約250,000個酸分子。當催化劑標記物18A及酸或鹼生成侷限化在導電通道26之表面時，可在pH值感測通道26周圍生成pH值梯度，其可在pH值感測通道26處生成可偵測電荷信號。可記錄此等信號。
在一實例中，低緩衝流體中的緩衝液濃度可小於約10mM，其如本文中所描述，可防止整體pH值變化，但可允許靠近導電通道16的局部pH值變化待被偵測。在一些情況下，緩衝液濃度顯著小於10mM，其實例包括約5mM、約2.5mM、約2mM、約1mM、約0.5mM或約0.25mM。在其他實例中，固相緩衝液可用於幫助維持整體pH值而不緩衝局部環境。
在可與感測系統10A一起使用的流體之一個實例中，可包括四個不同經標記核苷酸12或12A至12C。四個不同經標記核苷酸12或12A至12C包括相異核苷酸14或14'(例如，T、A、G或C)及相異催化劑標記物18A。相異催化劑標記物18A可擁有不同動力學，以使得以不同速率生成酸或鹼，其隨後將在通道 26處產生不同電荷密度。因為相異催化劑標記物10A為核苷酸特定的(例如，特定標記物18A經選擇用於特定鹼基)，因此pH值感測器20之回應可指示經標記核苷酸12或12A至12C之併入鹼基。
以下描述係關於涉及經標記核苷酸12及感測系統10A的實例方法。在此實例中，模板聚核苷酸鏈44可與經標記核苷酸12及二級基質34一起或分開引入至流體(諸如生物穩定溶液)中之感測系統10A中。聚合酶28與模板聚核苷酸鏈44相連，以使得鏈44保持在適當的位置。經標記核苷酸12中之一者的互補鹼基將藉由聚合酶28併入至新生股46(其沿著模板聚核苷酸鏈44形成)中。在併入事件期間，經標記核苷酸12之催化劑標記物18A進入通道26及亦在通道26附近之流體中的任何二級基質34附近。因為催化劑標記物18A之動力學可比併入事件更快，因此與二級基質34之酸或鹼生成反應在鹼併入完成之前發生。來自酸或鹼生成反應之帶電離子可在導電通道26處被偵測，或在反應性表面基存在的情況下，可與表面基反應以改變表面基之電荷狀態。改變之電荷係藉由pH值感測器20偵測。
在此實例方法中，在將核苷酸鹼基併入至新生股46中之後，α磷酸酯與連接分子16之間或α磷酸酯與β磷酸酯之間的結合被天然地裂解。此天然裂解使得標記物18A(及連接分子16)能夠自所併入核苷酸鹼基解離並遠離感測系統10A擴散。聚合酶28可隨後接收包括與模板聚核苷酸鏈44中之下一核苷酸互補的核苷酸鹼基的另一經標記核苷酸12。
以下描述係關於涉及經標記核苷酸12A至12C及感測系統10A的實例方法。在此實例中，模板聚核苷酸鏈44可與經標記核苷酸12A至12C及二級基質34一起或分開引入至流體(諸如生物穩定溶液)中之感測系統10A中。聚合酶28與模板聚核苷酸鏈44相連，以使得鏈44保持在適當的位置。經標記核苷酸12A至12C中之一者的互補鹼基將藉由聚合酶28併入至新生股46(其沿著模板聚 核苷酸鏈44形成)中。在此實例中，經標記核苷酸12A至12C包括可逆終止子。如此，經標記核苷酸12A至12C之併入充當用於聚合的終止子。此使得酸或鹼生成及電荷偵測能夠以類似於上文所描述之方式的方式發生。
在此實例方法中，在將核苷酸鹼基併入至新生股46中之後，包括任何未併入核苷酸之流體可自感測系統10A移除。此可使用洗滌溶液(例如，水)實現。解阻隔劑接著可引入至感測系統10A中。解阻隔劑可能能夠i)自所併入經標記核苷酸12A至12C裂解任何可裂解連接分子16'(其亦移除催化劑標記物18A)及ii)自所併入經標記核苷酸12A至12C移除3' OH阻隔基38A、38B、38C(參見圖1B)。3' OH阻隔基38A、38B、38C之移除使得後續測序循環能夠被執行。3' OH阻隔基及合適之解阻斷試劑的實例包括：鄰硝苄基醚及烷基鄰硝苄基碳酸酯，其可以光解方式被移除；酯部分，其可藉由鹼水解而移除；烯丙基部分，其可運用Nal、氯三甲基矽烷及Na2S2O3或運用丙酮/水中之Hg(II)來移除；疊氮基甲基，其可運用膦來裂解，諸如三(2-羧基乙基)磷化氫(TCEP)或三(羥丙基)磷化氫(THP)；縮醛，諸如可運用酸性條件裂解的叔丁氧基乙氧基；MOM(-CH2OCH3)部分，其可運用LiBF4及CH3CN/H2O裂解；2,4-二硝基苯次磺醯基，其可運用諸如硫苯酚及硫代硫酸鹽之親核試劑裂解；四氫呋喃基醚，其可運用Ag(I)或Hg(II)裂解；及3'磷酸酯，其可藉由磷酸酶(例如，聚核苷酸激酶)裂解。其他適用可逆部分包括醚、-F、-H2、-OCH3、-N3、-HCOCH3及2-硝基苯碳酸酯，且適用解阻斷處理包括運用光照射(例如，以誘發光裂解)、加熱、暴露於化學反應物、暴露於催化劑、暴露於電流(例如，以誘發電解)或其類似者。
感測系統10B
特定地參考圖3A及圖3B，感測系統10B包括pH值感測器20及附 著至pH值感測器20之導電通道26的複合物30A。
複合物30A包括連接至pH值改變部分(在此等實例中展示為50A、50B或50C)的聚合酶28，該pH值改變部分用以參與由於暴露於pH值感測器20的流體中之二級基質34的消耗在導電通道26附近產生pH值變化。
複合物30A之聚合酶28可為關於圖2描述之聚合酶之任何實例。
在此實例中，pH值改變部分選自由以下各者組成之群：酶50A、輔因子50B及活化物50C。
酶50A在與二級基質34之反應中生成酸或鹼。作為實例，酶50A可選自由以下各者組成之群：水解酶及氧化酶。合適水解酶之實例包括磷酸酶、酯酶(例如，乙醯膽鹼酯酶)、序列特定蛋白酶(例如，TEV蛋白酶或凝血酶)及醣苷酶(其不降解核糖，諸如纖維素或澱粉酶)。另一合適之羥化酶為碳酸酐酶。合適氧化酶之實例包括葡萄糖氧化酶、單胺氧化酶、黃嘌呤氧化酶等。雖然已提供若干實例，但咸信可使用任何可用酶50A或工程酶50A，只要酶動力學比聚合酶動力學快。
輔因子50B為其存在對一酶之活性為至關重要的物質，該酶在與二級基質34之反應中生成酸或鹼。用於氧化酶的合適輔因子50B之一些實例包括黃素腺二核苷酸(FAD)、菸鹼腺二核苷酸(NAD)、菸鹼腺二核苷酸磷酸酯(NADP)等。
活化物50C為起始或刺激與二級基質34之酸或鹼生成反應的物質。在一些情況下，活化物50C功能類似於輔因子50B，且因此輔因子50B之任何實例可用於活化物50C。對於金屬相依水解酶，合適活化物50C之實例包括二價金屬。
在複合物30A中，聚合酶28及pH值改變部分50A至50C之任何實例經共軛在一起。在一個實例中，此複合物30A為融合蛋白質或蛋白質嵌合體。 複合物30A可使用共軛方法而形成，該等共軛方法諸如spytag-spycatcher偶合反應、π-夾鉗介導半胱氨酸共軛、生物素/抗生蛋白鏈菌素、小泛素樣修飾物(small ubiquitin-like modifier；SUMO)蛋白質、與金屬之His6/NTA螯合、半胱氨酸/順丁烯二醯亞胺、二苯并環辛炔(DBCO)/疊氮化物，或任何其他合適之共軛方法。
複合物30A可經由繫鏈32附著至導電通道26，關於圖2描述該繫鏈的實例。可替代地，複合物30A可經由pH值改變部分50A至50C與在導電通道26的表面處之基之間的結合而直接附著。
雖然圖中未示，但感測系統10B亦可包括用以偵測與在pH值感測通道26之表面或接近該表面發生的pH值變化對應之電壓及/或電流變化的偵測器。
此外雖然圖中未示，但感測系統10B可定位於支撐件(諸如矽晶片)上。電極22、24可連接至啟用其操作的電子電路(例如，在鉤掛至偵測器及電力供應器後)。
在一些實例中，感測器10B可預先裝配。
在其他實例中，感測器組件可為一套組之部分，且套組組件可用於裝配感測器10B。套組之實例包括支撐件上之pH值感測器20，及用以引入複合物30A至pH值感測器20的流體。流體包括液體載劑及複合物30A。在一些實例中，流體中之複合物30A附著至繫鏈32。在其他實例中，繫鏈32附著至作為感測系統10B之部分的pH值感測通道26。在其中存在形成於pH值改變部分50A至50C與通道26之表面基之間的直接結合的另外其他實例中，應理解流體中之複合物30A不附著至繫鏈32，且繫鏈32不附著至pH值感測通道26。在一實例中，液體載劑為水或低緩衝流體之實例，諸如在毫莫耳濃度下的檸檬酸鹽水。
在此套組之一個實例中，液體載劑中之複合物30A包括連接至至 少一種酶50A之聚合酶28。在此套組之另一實例中，液體載劑中之複合物30A包括與輔因子50B共軛的聚合酶28。在此套組之再一實例中，液體載劑中之複合物30A包括與活化物50C共軛的聚合酶28。在此等實例中之每一者中，複合物30A亦可包括繫鏈32。當使用套組之此等實例時，使用者可將流體沈積於支撐件上，並允許流體保留在支撐件上持續合適之時間以供繫鏈32將複合物30A附著至導電通道26，供複合物30A附著至通道26上的繫鏈32，或供pH值改變部分50A至50C結合至通道26之表面基。支撐件可運用合適之緩衝液沖洗以移除任何未結合複合物30A。
套組之一些實例亦可包括待在單分子感測期間與感測系統10B一起使用的流體。流體之內含物可取決於哪一pH值改變部分50A至50C為感測系統10B的複合物30A之部分及使用哪些經標記核苷酸12、12A至12C或12'而變化。現將描述此等流體之若干實例。
在圖3A中所展示之實例中，待在單分子測序期間使用的流體包括本文所揭示之液體載劑、經標記核苷酸12或12A至12C及二級基質34(在此等實例中，其為與經標記核苷酸12或12A至12C分開的分子)的任何實例。
附著至經標記核苷酸12或12A至12C之標記物18B或18C將取決於哪一pH值改變部分包括於複合物30A中。
當感測系統10B包括作為複合物30A之部分的酶50A時，使用標記物18B。如本文中所提及，當酶50A及二級基質34兩者彼此接近時，酶50A在與二級基質34之反應中生成酸或鹼。為使酶50A與二級基質34之間的酸或鹼生成反應與所併入經標記核苷酸12或12A至12C相關，經標記核苷酸12或12A至12C上之標記物18B可適合於增強酶50A之動力學或緩慢酶50A之動力學。如此，標記物18B為附著至經標記核苷酸12或12A至12C的pH值改變部分之一個實例。系統10B之此實例因此包括pH值改變部分之兩個不同實例。因此，在一個實例中， 標記物18B選自由以下各者組成之群：增強該酶50A之動力學的一第一基及減緩該酶50A之動力學的一第二基。
當標記物18B增強酶50A之動力學時，其亦增強(例如，起始或加速)涉及酶50A及二級基質34的酸或鹼生成反應之動力學。增強酶50A之動力學的標記物18B之實例包括酶之輔因子。增強酶50A之動力學的其他標記物18B之實例包括具有擁擠效應的彼等標記物。標記物18B之此類型可為大擁擠劑，其可減少可用於其他分子之水的容積並有效增加二級基質34之局部濃度(其隨後增加反應速度)。
相比之下，當標記物18B減緩酶50A之動力學時，其亦減緩涉及酶50A及二級基質34之酸或鹼生成反應的動力學。緩慢酶50A之動力學的標記物18B之實例可選自由以下各者組成之群：異位抑制物、空間排阻基及緩衝基。異位抑制物結合至酶50A之異位部位，且改變酶50A之活性位點的構形。結果，酶50A不再能夠與二級基質34反應且變得無活性。可需要異位抑制物與酶50A之間的結合比聚合酶28與經標記核苷酸12或12A至12C之鹼基之間的結合更弱以使得經標記核苷酸12或12A至12C不僅僅藉由標記物18B結合。空間排阻基可為比二級基質34更大的分子。所併入經標記核苷酸之空間排阻基可阻斷二級基質34足夠接近於酶50A而發生反應。換言之，空間排阻基可減少接近酶50A而實際上不結合至酶50A。緩衝基可充當局部緩衝液以吸收在酸生成反應期間所生成的質子或在鹼生成反應期間所生成的鹼之分子，且從而中和pH值。作為實例，具有多個酸或鹼基之樹枝狀聚合物可用以緩衝導電通道26之局部附近。
在一實例中，附著至不同核苷酸12或12A至12C(例如，A、T、C、G)之標記物18B可經選擇以按不同速率增加或減小酸或鹼生成。在此實例中，當經標記核苷酸12或12A至12C中之一者藉由聚合酶28併入時，標記物18B進入酶50A及二級基質34附近，並按獨特標記物相依速率增強或減緩反應。隨 後，在導電通道26處的pH值改變。pH值之變化與增加或減小之酸或鹼生成相關，且因此可用以鑑定所併入經標記核苷酸12或12A至12C。
當感測系統10B包括作為複合物30A之部分的輔因子50B或活化物50C時，使用標記物18C。標記物18C可為在與二級基質34之反應中生成酸或鹼的酶。如此，標記物18C為附著至經標記核苷酸12或12A至12C的pH值改變部分之一個實例。系統10B之此實例因此包括pH值改變部分之兩個不同實例。當經標記核苷酸12或12A至12C藉由聚合酶28併入時，酶標記物18C進入輔因子50B或活化物50C及二級基質34附近。所附著輔因子50B或活化物50C可增強或起始酶標記物18C與流體中之二級基質34之間的反應。
因為經標記核苷酸12或12A至12C不包括二級基質34，因此在圖3A的實例中表示的流體亦包括二級基質34。二級基質34可為可與酶50A反應以生成酸或鹼，或其與酶標記物18C之反應可藉由輔因子50B或活化物50C增強或起始的任何二級基質34。
以下描述係關於涉及經標記核苷酸12及感測系統10B的實例方法。在此實例中，模板聚核苷酸鏈44可與經標記核苷酸12及二級基質34一起或分開引入至流體(諸如生物穩定溶液)中之感測系統10B中。聚合酶28與模板聚核苷酸鏈44相連，以使得鏈44保持在適當的位置。經標記核苷酸12中之一者的互補鹼基將藉由聚合酶28併入至新生股46(其沿著模板聚核苷酸鏈44形成)中。在併入事件期間，經標記核苷酸12之標記物18B或18C進入通道26、pH值改變部分50A至50C，及亦在pH值改變部分50A至50C附近之在流體中之任何二級基質34附近。與二級基質34之酸或鹼生成反應可取決於在通道26表面處之所使用的複合物30A及標記物18B或18C(其改變流體之pH值)及電荷而增強、減緩或抑制。在此實例方法中，在將核苷酸鹼基併入至新生股46中之後，α磷酸酯與連接分子16之間或α磷酸酯與β磷酸酯之間的結合被天然地裂解。此天然裂解使得標 記物18B或18C(及連接分子16)能夠自所併入核苷酸鹼基解離並遠離感測系統10B擴散。聚合酶28可隨後接收包括與模板聚核苷酸鏈44中之下一核苷酸互補的核苷酸鹼基的另一經標記核苷酸12。
以下描述係關於涉及經標記核苷酸12A至12C及感測系統10B的實例方法。在此實例中，模板聚核苷酸鏈44可與經標記核苷酸12A至12C及二級基質34一起或分開引入至流體(諸如生物穩定溶液)中之感測系統10B中。聚合酶28與模板聚核苷酸鏈44相連，以使得鏈44保持在適當的位置。經標記核苷酸12A至12C中之一者的互補鹼基將藉由聚合酶28併入至新生股46(其沿著模板聚核苷酸鏈44形成)中。與二級基質34之酸或鹼生成反應可取決於在通道26表面處之所使用的複合物30A及標記物18B或18C(其改變流體之pH值)及電荷而增強、減緩或抑制。在此實例中，經標記核苷酸12A至12C包括可逆終止子。如此，經標記核苷酸12A至12C之併入充當用於聚合的終止子。此使得增強、減緩或抑制的酸或鹼生成及電荷偵測能夠以類似於上文所描述方式之方式發生。在此實例方法中，洗滌及暴露於解阻隔劑可用於為另一測序循環準備感測系統10B。
在關於圖3A描述的實例中之任一者中，應理解聚合酶28與pH值改變部分50A至50C之間的距離及連接分子16、16'之長度可經選擇以使得當其經標記核苷酸12或12A至12C藉由聚合酶28併入時標記物18B或18C進入pH值改變部分50A至50C附近。此實現對於酸或鹼生成反應之可預測效果。
如本文中所提及，感測系統10B亦可與經標記核苷酸12'一起使用，該經標記核苷酸如關於圖1C描述包括附著至核苷酸14之二級基質34。圖3B說明系統10B及經標記核苷酸12'。
在此實例中，套組中之流體包括經標記核苷酸12'，而非經標記核苷酸12或12A至12C。不同於關於圖3A所描述的流體，此流體不包括獨立二級基質34，此係因為二級基質34附著至核苷酸14。
當感測系統10B包括作為複合物30A之部分的酶50A時，暴露於系統10B之流體可包括液體載劑及經標記核苷酸12'。當聚合酶28併入經標記核苷酸12'之鹼基時，二級基質34進入酶50A附近，且酸或鹼生成反應可發生。
當感測系統10B包括作為複合物30A之部分的輔因子50B或活化物50C時，暴露於系統10B之流體可包括液體載劑及經標記核苷酸12'。套組之此實例亦可包括與含有經標記核苷酸12'之流體分開的酶流體。包括酶流體，此係因為經標記核苷酸12'既不複合物30A亦不含有參與與二級基質34之酸或鹼生成反應的酶。酶流體可包括液體載劑(例如，本文所揭示之緩衝液中之任一者)及用以參與二級基質34之消耗的酶54。所使用的酶54取決於附著至經標記核苷酸12'的二級基質34。
當含有模板聚核苷酸鏈44及經標記核苷酸12'之流體及在一些情況下酶流體經引入(依次或同時)至感測系統10B時，模板聚核苷酸鏈44與聚合酶28相連且經標記核苷酸12'中之互補者經併入至生長新生股46中。在此實例中，複合物30A之酶50A或自由浮動酶54將反應以消耗二級基質34以生成酸或鹼，且此反應將比核苷酸併入更快。在此等實例中，消耗二級基質34，且在其消耗後，pH值將返回至基線位準且核苷酸鹼基將被併入。
感測系統10C
特定地參考圖4，感測系統10C包括pH值感測器20及附著至pH值感測器20之導電通道26的複合物30B。
複合物30B包括附著至兩個不同酶50A及50D之聚合酶28。複合物30A之聚合酶28可為關於圖2描述之聚合酶之任何實例。
酶50A、50D可為關於圖3A及圖3B描述的酶之任何實例，只要兩種酶50A、50D不同。酶50A及50D中之每一者在與二級基質34之反應中生成酸或 鹼；然而，酶50A及50D可經選擇以使得其當在特定核苷酸標記物18D附近時具有不同回應。作為一個實例，酶50A可對附著至兩種類型經標記核苷酸12或12A至12C(例如，A及T)之各別標記物18D作出回應，且可對附著至其他兩種類型之經標記核苷酸12或12A至12C(例如，C及G)的各別標記物18D不作出回應。相反地，酶50D可對附著至其他兩種類型之經標記核苷酸12或12A至12C(例如，C及G)的各別標記物18D作出回應，但可對附著至兩種類型之經標記核苷酸12或12A至12C(例如，A及T)的各別標記物18D不作出回應。在此實例中，分別附著至核苷酸12或12A至12C之每一標記物18D可與分別附著至其他核苷酸12或12A至12C之每一其他標記物18D不同。
在複合物30B中，聚合酶28及兩個不同酶50A、50D經共軛在一起。在一個實例中，此複合物30B為融合蛋白質或蛋白質嵌合體。複合物30B可使用共軛方法而形成，該等共軛方法諸如spytag-spycatcher偶合反應、π-夾鉗介導半胱氨酸共軛、生物素/抗生蛋白鏈菌素、小泛素樣修飾物(SUMO)蛋白質、與金屬之His6/NTA螯合、半胱氨酸/順丁烯二醯亞胺、二苯并環辛炔(DBCO)/疊氮化物，或任何其他合適之共軛方法。
在一個實例(如圖4中所展示)中，複合物30B可經由附著至酶50A、50D中之每一者的繫鏈32、32'附著至導電通道26。在另一實例中，單一繫鏈32可將聚合酶28附著至導電通道26，且酶50A、50D可分別附著至聚合酶28。在再一實例中，不存在繫鏈32、32'，但實際上酶50A、50D中之一者或兩者可形成與導電通道26之表面基及聚合酶28的直接結合。
雖然圖中未示，但感測系統10C亦可包括用以偵測與在pH值感測通道26之表面或接近該表面發生的pH值變化對應之電壓及/或電流變化的偵測器。
此外雖然圖中未示，但感測系統10C可定位於支撐件(諸如矽晶 片)上。電極22、24可連接至啟用其操作的電子電路(例如，在鉤掛至偵測器及電力供應器後)。
在一些實例中，感測器10C可預先裝配。
在其他實例中，感測器組件可為一套組之部分，且套組組件可用於裝配感測器10C。套組之實例包括支撐件上之pH值感測器20，及用以引入複合物30B至pH值感測器20的流體。流體包括液體載劑及複合物30B。在一些實例中，流體中之複合物30B附著至繫鏈32、32'。在其他實例中，流體中之複合物30B包括附著至聚合酶28的單一繫鏈32，且酶50A及50D附著至聚合酶28。在再一些其他實例中，繫鏈32、32'附著至作為感測系統10C之部分的pH值感測通道26。在其中存在形成於酶50A、50D與通道26之表面基之間的直接結合的另外其他實例中，應理解流體中之複合物30B不附著至繫鏈32、32'且繫鏈32、32'不附著至pH值感測通道26。在一實例中，液體載劑為水或低緩衝流體之實例，諸如在毫莫耳濃度下的檸檬酸鹽水。
當使用套組之此等實例時，使用者可將流體沈積於支撐件上，且允許流體保留在支撐件上持續合適之時間以供繫鏈32、32'將複合物30B附著至導電通道26，供繫鏈32將複合物30B之聚合酶28附著至導電通道26，或供酶50A及50D結合至通道26之表面基。支撐件可運用合適之緩衝液沖洗以移除任何未結合複合物30B。
套組之一些實例亦可包括待在單分子感測期間與感測系統10C一起使用的流體。在此實例中，流體包括本文所揭示之液體載劑、經標記核苷酸12或12A至12C及二級基質34(在此等實例中，其為與經標記核苷酸12或12A至12C分開之分子)的任何實例。
附著至經標記核苷酸12或12A至12C之標記物18D將取決於複合物301B的兩種酶50A、50D。如本文中所提及，酶50A、50D中之每一者在與二級 基質34之反應中生成酸或鹼。為與酶50A與二級基質34之間或酶50D與二級基質34之間的特定酸或鹼生成反應相關，經標記核苷酸12或12A至12C上之每一標記物18D可適合於增強(例如，起始或加速)酶50A或酶50D之動力學或減慢酶50A或酶50D之動力學。如此，標記物18D為附著至經標記核苷酸12或12A至12C的pH值改變部分之一個實例。系統10B之此實例因此包括pH值改變部分之兩個不同實例。標記物18B中之任一者可用於標記物18D，且四個核苷酸(例如，A、T、C、G)中之每一者可經標記有以不同方式影響酸或鹼生成反應的不同標記物。在一個實例中，經選擇用於具有「A」作為含氮鹼基之經標記核苷酸12或12A至12C的標記物18D可在接近酶50A及二級基質34時以第一速率增強酸生成；經選擇用於具有「T」作為含氮鹼基之經標記核苷酸12或12A至12C的標記物18D可在接近酶50A及二級基質34時以第二速率減緩酸生成；經選擇用於具有「C」作為含氮鹼基之經標記核苷酸12或12A至12C的標記物18D可在接近酶50A及二級基質34時以第三速率增強鹼生成；且經選擇用於具有「G」作為含氮鹼基之經標記核苷酸12或12A至12C的標記物18D可在接近酶50A及二級基質34時以第四速率減緩酸生成。當不同經標記核苷酸經併入至新生股46中時，不同pH值位準將在電荷敏感通道46之表面局部產生。
因為經標記核苷酸12或12A至12C不包括二級基質34，因此在圖4之實例中表示的流體亦包括二級基質34。二級基質34可為可與酶50A或50D反應以生成酸或鹼的任何二級基質34。
以下描述係關於涉及經標記核苷酸12及感測系統10C的實例方法。在此實例中，模板聚核苷酸鏈44可與經標記核苷酸12及二級基質34一起或分開引入至流體(諸如生物穩定溶液)中之感測系統10C中。聚合酶28與模板聚核苷酸鏈44相連，以使得鏈44保持在適當的位置。經標記核苷酸12中之一者的互補鹼基將藉由聚合酶28併入至新生股46(其沿著模板聚核苷酸鏈44形成)中。 在併入事件期間，經標記核苷酸12之標記物18D進入通道26、酶50A及50D及亦在酶50A及50D附近之流體中之任何二級基質34附近。與二級基質34之酸或鹼生成反應可取決於標記物18D及其對涉及酶50A或50D之反應的效應而增強、減緩或抑制。此改變在通道26表面處流體之pH值及電荷。在此實例方法中，在將核苷酸鹼基併入至新生股46中之後，α磷酸酯與連接分子16之間或α磷酸酯與β磷酸酯之間的結合被天然地裂解。此天然裂解使得標記物18D(及連接分子16)能夠自所併入核苷酸鹼基解離並遠離感測系統10C擴散。聚合酶28可隨後接收包括與模板聚核苷酸鏈44中之下一核苷酸互補的核苷酸鹼基的另一經標記核苷酸12。
以下描述係關於涉及經標記核苷酸12A至12C及感測系統10C的實例方法。在此實例中，模板聚核苷酸鏈44可與經標記核苷酸12A至12C及二級基質34一起或分開引入至流體(諸如生物穩定溶液)中之感測系統10C中。聚合酶28與模板聚核苷酸鏈44相連，以使得鏈44保持在適當的位置。經標記核苷酸12A至12C中之一者的互補鹼基將藉由聚合酶28併入至新生股46(其沿著模板聚核苷酸鏈44形成)中。與二級基質34之酸或鹼生成反應可取決於標記物18D及其對涉及酶50A或50D之反應的效應而增強、減緩或抑制。此改變在通道26表面處流體之pH值及電荷。在此實例中，經標記核苷酸12A至12C包括可逆終止子。如此，經標記核苷酸12A至12C之併入充當用於聚合的終止子。此使得增強、減緩或抑制的酸或鹼生成及電荷偵測能夠以類似於上文所描述方式之方式發生。在此實例方法中，洗滌及暴露於解阻隔劑可用於為另一測序循環準備感測系統10C。
在關於圖4描述的實例中之任一者中，應理解聚合酶28與各別酶50A、50D之間的距離及連接分子16、16'之長度可經選擇以使得當其經標記核苷酸12或12A至12C藉由聚合酶28併入時標記物18D進入酶50A及/或及50D附近。此實現對於酸或鹼生成反應之可預測效果。
感測系統10D
特定地參考圖5，感測系統10D包括pH值感測器20及附著至pH值感測器20之導電通道26的複合物30C。
複合物30C包括連接至一金屬配位錯合物(「M」)的一聚合酶28，該金屬配位錯合物用以由於暴露於pH值感測器20的流體中之二級基質34的消耗在導電通道26附近產生一pH值變化。在複合物30C中，聚合酶28與金屬配位錯合物M之比率為1：1。該金屬配位錯合物M可直接附著至聚合酶28，或繫鏈可將兩者連接在一起。
複合物30C之聚合酶28可為關於圖2描述之聚合酶之任何實例。
金屬配位錯合物50E類似於酶50A，原因在於其在與二級基質34之反應中生成酸或鹼。金屬配位錯合物之實例包括具有配位體的銅(II)複合物，配位體諸如雙(2-吡啶基甲基)-胺或吡啶官能化環糊精。
在複合物30C中，聚合酶28及金屬配位錯合物50E經共軛在一起。複合物30C可使用任何數目種共軛方法而形成，該等共軛方法諸如spytag-spycatcher偶合反應、π-夾鉗介導半胱氨酸共軛、生物素/抗生蛋白鏈菌素、小泛素樣修飾物(SUMO)蛋白質、與金屬之His6/NTA螯合、半胱氨酸/順丁烯二醯亞胺、二苯并環辛炔(DBCO)/疊氮化物，或任何其他合適之共軛方法。
複合物30C可附著至導電通道26。在圖5中所展示之實例中，金屬配位錯合物50E附著至通道26之表面，且聚合酶28附著至金屬配位錯合物50E。在此實例中，複合物30C之附著可經由繫鏈32(圖5中未展示)或金屬配位錯合物50E之端基。在另一實例中，聚合酶28附著至通道26之表面，且金屬配位錯合物50E附著至聚合酶28。在此實例中，複合物30C之附著可經由附著至聚合酶28的繫鏈32(圖5中未展示)。
雖然圖中未示，但感測系統10D亦可包括用以偵測與在pH值感測通道26之表面或接近該表面發生的pH值變化對應之電壓及/或電流變化的偵測器。
此外雖然圖中未示，但感測系統10D可定位於支撐件(諸如矽晶片)上。電極22、24可連接至啟用其操作的電子電路(例如，在鉤掛至偵測器及電力供應器後)。
在一些實例中，感測器10D可預先裝配。
在其他實例中，感測器組件可為一套組之部分，且套組組件可用於裝配感測器10D。套組之實例包括支撐件上之pH值感測器20，及用以引入複合物30C至pH值感測器20的流體。流體包括液體載劑及複合物30C。在一實例中，液體載劑為水或低緩衝流體之實例，諸如在毫莫耳濃度下的檸檬酸鹽水。
當使用套組之此等實例時，使用者可將流體沈積於支撐件上，且允許流體保留在支撐件上持續合適之時間以供繫鏈32或該金屬配位錯合物50E之末端將複合物30C附著至導電通道26。支撐件可運用合適之緩衝液沖洗以移除任何未結合複合物30C。
套組之一些實例亦可包括待在單分子感測期間與感測系統10D一起使用的流體。在此實例中，流體包括本文所揭示之液體載劑、經標記核苷酸12或12A至12C及二級基質34(在此等實例中，其為與經標記核苷酸12或12A至12C分開之分子)的任何實例。
附著至經標記核苷酸12或12A至12C之標記物18E可為用於金屬配位錯合物50E之金屬的配位體，其中配位體改變金屬配位錯合物50E之催化特性。配位體可經選擇以增強金屬配位錯合物50E之動力學，或減慢金屬配位錯合物50E之動力學。在此等實例中，標記物18E為附著至經標記核苷酸12或12A至12C的pH值改變部分之一個實例。系統10D之此實例因此包括pH值改變部分之兩 個不同實例(例如，金屬配位錯合物50E及標記物18E)。
標記物18E之其他實例可充當獨立催化劑(除了該金屬配位錯合物50E外)以用於二級基質34之消耗。充當獨立催化劑之標記物18E的實例包括非金屬有機催化劑，諸如二氮雜雙環十一烯、N-雜環碳烯、四甲基胍等。在此等實例中，標記物18E為附著至經標記核苷酸12或12A至12C的pH值改變部分之一個實例。系統10D之此實例因此包括pH值改變部分之兩個不同實例(例如，金屬配位錯合物50E及標記物18E)。
標記物18E之再其他實例減慢金屬配位錯合物50E之動力學，且因此亦減慢涉及金屬配位錯合物50E及二級基質34之酸或鹼生成反應的動力學。減慢金屬配位錯合物50E之動力學的標記物18E的實例可為抑制金屬之催化活性的任何配位體，或改變金屬之電子能態以改變金屬之催化活性的任何配位體。在此等實例中，標記物18E為附著至經標記核苷酸12或12A至12C的pH值改變部分之一個實例。系統10D之此實例因此包括pH值改變部分之兩個不同實例(例如，金屬配位錯合物50E及標記物18E)。
在一實例中，附著至不同核苷酸12或12A至12C(例如，A、T、C、G)之各別標記物18E可經選擇以按不同速率增加或減小酸或鹼生成。在此實例中，當經標記核苷酸12或12A至12C中之一者藉由聚合酶28併入時，標記物18E進入金屬配位錯合物50E及二級基質34附近，且按獨特標記物相依速率增強或減緩反應。隨後，在導電通道26處的pH值改變。pH值之變化與增加或減小之酸或鹼生成相關，且因此可用以鑑定所併入經標記核苷酸12或12A至12C。
因為經標記核苷酸12或12A至12C不包括二級基質34，因此在圖5之實例中表示的流體亦包括二級基質34。二級基質34可為可與金屬配位錯合物50E反應以生成酸或鹼的任何二級基質34。
以下描述係關於涉及經標記核苷酸12及感測系統10D的實例方 法。在此實例中，模板聚核苷酸鏈44可與經標記核苷酸12及二級基質34一起或分開引入至流體(諸如生物穩定溶液)中之感測系統10D中。聚合酶28與模板聚核苷酸鏈44相連，以使得鏈44保持在適當的位置。經標記核苷酸12中之一者的互補鹼基將藉由聚合酶28併入至新生股46(其沿著模板聚核苷酸鏈44形成)中。在併入事件期間，經標記核苷酸12之標記物18E進入通道26、金屬配位錯合物50E及亦在金屬配位錯合物50E附近的流體中之任何二級基質34附近。在一些實例中，與二級基質34之酸或鹼生成反應可取決於配位體標記物18E及其對涉及金屬配位錯合物50E之反應的效應而增強、減緩或抑制。在其他實例中，標記物18E可連同金屬配位錯合物50E一起參與二級基質34之消耗，因此生成更多酸或鹼。所有此等實例改變在通道26表面處流體之pH值及電荷。在此等實例方法中，在將核苷酸鹼基併入至新生股46中之後，α磷酸酯與連接分子16之間或α磷酸酯與β磷酸酯之間的結合被天然地裂解。在此等實例中，可需要配位體標記物18E之結合足夠弱以當磷酸酯鏈天然地裂解時脫落。此天然裂解使得標記物18E(及連接分子16)能夠自所併入核苷酸鹼基解離並遠離感測系統10D擴散。聚合酶28可隨後接收包括與模板聚核苷酸鏈44中之下一核苷酸互補的核苷酸鹼基的另一經標記核苷酸12。
以下描述係關於涉及經標記核苷酸12A至12C及感測系統10D的實例方法。在此實例中，模板聚核苷酸鏈44可與經標記核苷酸12A至12C及二級基質34一起或分開引入至流體(諸如生物穩定溶液)中之感測系統10D中。聚合酶28與模板聚核苷酸鏈44相連，以使得鏈44保持在適當的位置。經標記核苷酸12A至12C中之一者的互補鹼基將藉由聚合酶28併入至新生股46(其沿著模板聚核苷酸鏈44形成)中。在一些實例中，與二級基質34之酸或鹼生成反應可取決於配位體標記物18E及其對涉及金屬配位錯合物50E之反應的效應而增強、減緩或抑制。在其他實例中，標記物18E可連同金屬配位錯合物50E一起參與二級基 質34之消耗，因此生成更多酸或鹼。所有此等實例改變在通道26表面處流體之pH值及電荷。在此實例中，經標記核苷酸12A至12C包括可逆終止子。如此，經標記核苷酸12A至12C之併入充當用於聚合的終止子。此使得增強、減緩或抑制的酸或鹼生成及電荷偵測能夠以類似於上文所描述方式之方式發生。在此實例方法中，洗滌及暴露於解阻隔劑可用於為另一測序循環準備感測系統10D。
在關於圖5描述的實例中之任一者中，應理解聚合酶28與金屬配位錯合物50E之間的距離及連接分子16、16'之長度可經選擇以使得當其經標記核苷酸12或12A至12C藉由聚合酶28併入時標記物18E進入金屬配位錯合物50E附近。此實現對於酸或鹼生成反應之可預測效果。
感測系統10E
特定地參考圖6A及圖6B，感測系統10D包括pH值感測器20及附著至pH值感測器20之導電通道26的複合物30D。
複合物30D包括連接至酶50A之聚合酶28。在此實例中，複合物30D進一步包括附著至酶50A之核酸髮夾-酶抑制物共軛物58。
複合物30D之聚合酶28可為關於圖2描述之聚合酶之任何實例。
酶50A可為關於圖3A及圖3B描述的酶之任何實例。
核酸髮夾-酶抑制物共軛物58包括具有兩個區的單股DNA或RNA，兩個區係互補的且經歷分子內鹼基配對以形成在未配對循環中終止的雙螺旋。未配對循環之一端附著至酶50A，且未配對循環之另一端包括酶抑制物60。當在如圖6A中所展示之循環組態中時，酶抑制物60至少減小酶活性。
在複合物30D中，酶50A及核酸髮夾-酶抑制物共軛物58經共軛在一起，且酶50A亦與聚合酶28共軛。
複合物30D可經由繫鏈32附著至導電通道26，關於圖2描述該繫 鏈的實例。可替代地，複合物30D可經由pH值改變部分50A與在導電通道26的表面處之基之間的結合而直接附著。
雖然圖中未示，但感測系統10E亦可包括用以偵測與在pH值感測通道26之表面或接近該表面發生的pH值變化對應之電壓及/或電流變化的偵測器。
此外雖然圖中未示，但感測系統10E可定位於支撐件(諸如矽晶片)上。電極22、24可連接至啟用其操作的電子電路(例如，在鉤掛至偵測器及電力供應器後)。
在一些實例中，感測器10E可預先裝配。
在其他實例中，感測器組件可為一套組之部分，且套組組件可用於裝配感測器10E。套組之實例包括支撐件上之pH值感測器20，及用以引入複合物30D至pH值感測器20的流體。流體包括液體載劑及複合物30D。在一些實例中，流體中之複合物30D附著至繫鏈32。在其他實例中，繫鏈32附著至作為感測系統10E之部分的pH值感測通道26。在其中存在形成於pH值改變部分50A與通道26之表面基之間的直接結合的另外其他實例中，應理解流體中之複合物30D不附著至繫鏈32，且繫鏈32不附著至pH值感測通道26。在一實例中，液體載劑為水或低緩衝流體之實例，諸如在毫莫耳濃度下的檸檬酸鹽水。
當使用套組之此等實例時，使用者可將流體沈積於支撐件上，並允許流體保留在支撐件上持續合適之時間以供繫鏈32將複合物30D附著至導電通道26，供複合物30D附著至通道26上的繫鏈32，或供pH值改變部分50A結合至通道26之表面基。支撐物可運用合適之緩衝液沖洗以移除任何未結合複合物30D。
套組之一些實例亦可包括待在單分子感測期間與感測系統10E一起使用的流體。在此實例中，流體包括本文所揭示之液體載劑、經標記核苷 酸12或12A至12C及二級基質34(在此等實例中，其為與經標記核苷酸12或12A至12C分開之分子)的任何實例。
附著至經標記核苷酸12或12A至12C的標記物18F為包括與核酸髮夾-酶抑制物共軛物58之核苷酸鹼基中之至少一些互補的鹼基的核苷酸之股。標記物18F能夠起始髮夾開口反應且隨後與核酸髮夾-酶抑制物共軛物58的單一DNA或RNA股之一部分的鹼基配對。如圖6B中所展示，標記物18F之引入及反應將酶抑制物60移離酶50A，因此啟用其酶活性。因為標記物18F可影響導致酸或鹼生成之酶活性，因此其亦為pH值改變部分之一個實例。與二級基質34之酸或鹼生成反應能夠在標記物18F打開核酸髮夾-酶抑制物共軛物58時發生，導致在導電通道26之表面處pH值的變化。髮夾之打開及閉合可為快速過程，從而導致聚合酶28之抑制的平均位準。因此，可使用不同數目個互補鹼基達成活性或抑制之不同位準，因此啟用鹼基區分。
因為經標記核苷酸12或12A至12C不包括二級基質34，因此在圖6A及圖6B之實例中表示的流體亦包括二級基質34。二級基質34可為可與酶50A反應以生成酸或鹼的任何二級基質34。
以下描述係關於涉及經標記核苷酸12及感測系統10E的實例方法。在此實例中，模板聚核苷酸鏈44可與經標記核苷酸12及二級基質34一起或分開引入至流體(諸如生物穩定溶液)中之感測系統10E中。聚合酶28與模板聚核苷酸鏈44相連，以使得鏈44保持在適當的位置。經標記核苷酸12中之一者的互補鹼基將藉由聚合酶28併入至新生股46(其沿著模板聚核苷酸鏈44形成)中。在併入事件期間，經標記核苷酸12之標記物18F進入通道26、核酸髮夾-酶抑制物共軛物58及亦在核酸髮夾-酶抑制物共軛物58附近的流體中之任何二級基質34附近。標記物18F打開核酸髮夾-酶抑制物共軛物58，其允許酶50A與二級基質34反應以生成酸或鹼。此改變在通道26表面處流體之pH值及電荷。在此實例方法中， 在將核苷酸鹼基併入至新生股46中之後，α磷酸酯與連接分子16之間或α磷酸酯與β磷酸酯之間的結合被天然地裂解。在此等實例中，可需要配位體標記物18F之結合足夠弱以當磷酸酯鏈天然地裂解時脫落。此天然裂解使得標記物18F(及連接分子16)能夠自所併入核苷酸鹼基解離並遠離感測系統10E擴散。核酸髮夾-酶抑制物共軛物58恢復至主幹環圈(stem loop)位置，從而再次至少部分抑制酶50A活性。聚合酶28可隨後接收包括與模板聚核苷酸鏈44中之下一核苷酸互補的核苷酸鹼基的另一經標記核苷酸12。
以下描述係關於涉及經標記核苷酸12A至12C及感測系統10E的實例方法。在此實例中，模板聚核苷酸鏈44可與經標記核苷酸12A至12C及二級基質34一起或分開引入至流體(諸如生物穩定溶液)中之感測系統10C中。聚合酶28與模板聚核苷酸鏈44相連，以使得鏈44保持在適當的位置。經標記核苷酸12A至12C中之一者的互補鹼基將藉由聚合酶28併入至新生股46(其沿著模板聚核苷酸鏈44形成)中。標記物18F打開核酸髮夾-酶抑制物共軛物58，其允許酶50A與二級基質34反應以生成酸或鹼。此改變在通道26表面處流體之pH值及電荷。在此實例中，經標記核苷酸12A至12C包括可逆終止子。如此，經標記核苷酸12A至12C之併入充當用於聚合的終止子。此使得酸或鹼生成及電荷偵測能夠以類似於上文所描述之方式的方式發生。在此實例方法中，洗滌及暴露於解阻隔劑可用於為另一測序循環準備感測系統10E。
在關於圖6A及圖6B描述的實例中之任一者中，應理解聚合酶28與核酸髮夾-酶抑制物共軛物58之間的距離及連接分子16、16'之長度可經選擇以使得當其經標記核苷酸12或12A至12C藉由聚合酶28併入時標記物18F進入核酸髮夾-酶抑制物共軛物58附近。此實現對於酸或鹼生成反應之可預測效果。
感測系統陣列
單分子感測系統10A至10E之任何實例可包括於此類感測系統之陣列中。在一些實例中，陣列可包括若干感測系統10A至10E，其中之每一者定位於支撐件上且經組態有電子電路以使得其係可個別定址及可讀的。在一實例中，陣列之每一感測系統10A至10E可定位於個別凹陷中之支撐件上。凹陷實體地分開感測系統10A至10E中之每一者，其至少減小與相鄰感測系統10A至10E的pH值梯度之交叉污染。感測系統10A至10E之陣列可為流動槽62之部分，在圖7A中描繪流動槽之實例。在此實例中，流動槽62包括流動通道64。雖然展示了若干流動通道64，但應理解，任何數目個通道64可包括於流動槽62中(例如單個通道64、四個通道64等)。每一流動通道64為界定於兩個結合組件(例如基質及蓋，或兩個基質)之間的區域，該區域可具有引入至其中且自其移除之流體(例如，本文中所描述之彼等流體)。每一流動通道64可與每一其他流動通道64分離，使得引入至任何特定流動通道64中之流體不流入任何相鄰流動通道64中。引入流動通道64中的流體之一些實例可引入反應組件(例如，複合物30A至30D、經標記核苷酸12、12A至12C、12'等)、洗滌溶液、解阻隔劑等。
圖7B展示流動槽62之流動通道64內之架構的實例。
在圖7B中所展示之實例中，流動槽64包括支撐件66及定位於支撐件66上的圖案化材料68。圖案化材料68界定由間隙區域72分隔開的凹陷70。在此實例中，支撐件66之表面暴露於凹陷70中之每一者處，且感測系統10A至10E定位於表面上。
圖7B中之支撐件66為流動槽62之其他組件提供支撐。支撐件66一般為剛性的且不溶於水性液體中。合適支撐件66之實例包括環氧矽氧烷、玻璃、經修飾之玻璃、塑膠、耐綸、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化矽(氧化矽(SiO2))、熔融二氧化矽、基於二氧化矽之材料、矽酸鋁、矽、經修飾之矽(例如硼摻雜p+矽)、氮化矽(Si3N4)、五氧化鉭(TaO5)或其他一或多個氧化鉭(TaOx)、氧 化鉿(HfO2)、無機玻璃或其類似物。用於基板14之合適塑膠之一些實例包括丙烯酸樹脂、聚苯乙烯、苯乙烯與其他材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺脂、聚四氟乙烯(諸如，來自Chemours公司之TEFLON®)、環狀烯烴/環烯烴聚合物(COP)(諸如來自Zeon之ZEONOR®)、聚醯亞胺等。支撐件亦可為在表面具有氧化鉭或另一種陶瓷氧化物塗層之玻璃或矽。
支撐件66之形式可為晶圓、面板、矩形薄片、晶粒或任何其他合適組態。在一實例中，支撐件66可為直徑在約2mm至約300mm範圍內之圓形晶圓或面板。作為一更特定實例，支撐件66為直徑在約200mm至約300mm範圍內的晶圓。在另一實例中，支撐件66可為其最大尺寸至多約10尺(約3米)之矩形薄片或面板。作為一特定實例，支撐件66為寬度在約0.1mm至約10mm範圍內之晶粒。雖然已提供實例尺寸，但應理解，可使用具有任何合適之尺寸的支撐件66。
在圖7B中所展示之實例中，圖案化材料68定位於支撐件66上。應理解，可選擇性地沈積或沈積及圖案化以形成凹陷70及間隙區域72之任何材料均可用於圖案化材料68。
作為一個實例，無機氧化物可經由氣相沈積、氣溶膠印刷或噴墨印刷選擇性地施加至支撐件66。合適之無機氧化物之實例包括氧化鉭(例如Ta2O5)、氧化鋁(例如Al2O3)、氧化矽(例如SiO2)、氧化鉿(例如HfO2)等。
作為另一實例，樹脂可施加至支撐件66且隨後經圖案化。合適之沈積技術包括化學氣相沈積、浸塗(dip coating)、浸塗(dunk coating)、旋塗、噴塗、覆液分配、超音波噴塗、刮刀塗佈、氣溶膠印刷、網板印刷、微接觸印刷等。合適之圖案化技術包括光微影、奈米壓印微影(NIL)、衝壓技術、壓印技術、模製技術、微蝕刻技術、印刷技術等。合適之樹脂之一些實例包括基於多面體寡聚倍半矽氧烷樹脂(POSS)之樹脂、非POSS環氧樹脂、聚(乙二醇)樹脂、聚醚樹脂(例如開環環氧樹脂)、丙烯酸類樹脂、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯 樹脂、非晶形含氟聚合物樹脂(例如來自Bellex之CYTOP®)及其組合。
如本文所用，術語「多面體寡聚倍半矽氧烷」(POSS)指代一種化學組成物，其為二氧化矽(SiO2)與聚矽氧(R2SiO)之間的雜交中間物(例如，RSiO1.5)。POSS之實例可為Kehagias等人，微電子工程技術86(2009)，第776-778頁中所述之POSS，該參考文獻以全文引用的方式併入本文中。在一實例中，組合物為具有化學式[RSiO3/2]n之有機矽化合物，其中R基可相同或不同。POSS之實例R基包括環氧基、疊氮/疊氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯及/或甲基丙烯酸酯，或另外例如烷基、芳基、烷氧基及/或鹵烷基。本文所揭示之樹脂組成物可包含一或多種不同籠或核結構作為單體單元。
作為再一實例，圖案化材料68可為pH值緩衝材料。pH值緩衝材料具有高pH值緩衝能力，其實現具有低溶液緩衝液濃度之流體的使用。高pH值緩衝能力之實例可在約0.01毫當量/克至約2毫當量/克範圍內。pH值緩衝材料之實例為SiCOH，其具有高表面區域及高緩衝能力。在其中圖案化材料68並非為pH值緩衝材料之實例中，凹陷70之側壁可用pH值緩衝材料塗佈以賦予高pH值緩衝能力給凹陷70中之每一者。
如圖7B中所示，圖案化材料68包括界定於其中之凹陷70及分開相鄰凹陷70之間隙區域72。可設想凹陷70之許多不同佈局，其包括有規則、重複及非規則圖案。在一實例中，為緊密堆積及改良密度，將凹陷70安置於六邊形柵格中。其他佈局可包括例如直線(矩形)佈局、三角佈局等。在一些實例中，佈局或圖案可為成列及成行的x-y格式之凹陷70。在一些其他實例中，佈局或圖案可為凹陷70及/或間隙區域72之重複配置。在另外其他實例中，佈局或圖案可為凹陷70及/或間隙區域72之無規則配置。圖案可包括點、小片、孔、柱、條帶、漩渦、線、三角形、矩形、圓形、弧線、方格、格子花、對角線、箭頭、方形及/或交叉影線。
凹陷70之佈局或圖案可以關於界定區域中凹陷70之密度(凹陷70之數目)為特徵。舉例而言，凹陷70可以大致每平方毫米2百萬個之密度存在。密度可經調整至不同密度，包括例如以下密度：約100個/平方毫米、約1,000個/平方毫米、約10萬個/平方毫米、約1百萬個/平方毫米、約2百萬個/平方毫米、約5百萬個/平方毫米、約1千百萬個/平方毫米、約5千萬個/平方毫米或更大或更小。應進一步理解，圖案化材料68中之凹陷70之密度可在選自以上範圍之下限值中之一者與上限值中之一者之間。作為實例，高密度陣列可特徵化為使凹陷70分隔開小於約100nm，中等密度陣列可特性化為使凹陷20分隔開約400nm至約1μm，且低密度陣列可特徵化為使凹陷70分隔開大於約1μm。儘管已提供實例密度，但應瞭解可使用任何合適之密度。凹陷70之密度可部分取決於凹陷70之深度及所生成酸或鹼的擴散能力。在一些情況下，可需要凹陷之間的間距甚至大於本文中所列出的實例。
凹陷70之佈局或圖案亦可或替代地以平均間距或自凹陷70之中心至相鄰凹陷70之中心的間距(中心至中心空間)或自一個凹陷70之邊緣至相鄰凹陷70之邊緣的間距(邊緣間空間)之方面為特徵。圖案可為有規則的，以使得關於平均間距之變化係數較小，或圖案可為不規則的，在此情況下，變化係數可能相對較大。在任一情況下，平均間距可為例如約50nm、約0.1μm、約0.5μm、約1μm、約5μm、約10μm、約100μm或更長或更短。凹限20之特定圖案的平均間距可在選自以上範圍的下限值中之一者與上限值中之一者之間。在一實例中，凹限20具有約1.5μm之間距(中心至中心空間)。雖然已提供實例平均間距值，但應理解可使用其他平均間距值。
每一凹陷70之大小特徵可為其容積、開口面積、深度及/或直徑。
每一凹陷70可具有能夠限制流體之任何容積。最小或最大容積可經選擇(例如)以適應流動槽62之下游使用所預期的通量(例如多樣性)、解析度、 經標記核苷酸12、12A至12C或12'、二級基質34或分析物反應度。舉例而言，容積可為至少約1×10-3μm3、至少約1×10-2μm3、至少約0.1μm3、至少約1μm3、至少約10μm3、至少約100μm3或更多。替代地或另外，容積可為至多約1×104μm3、至多約1×103μm3、至多約100μm3、至多約10μm3、至多約1μm3、至多約0.1μm3或更小。可基於如上文關於容積所闡述之類似準則選擇每一凹陷開口所佔據之面積。舉例而言，每一凹陷開口之面積可為至少約1×10-3μm2、至少約1×10-2μm2、至少約0.1μm2、至少約1μm2、至少約10μm2、至少約100μm2或更大。替代地或另外，面積可為至多約1×10-3μm2、至多約100μm2、至多約10μm2、至多約1μm2、至多約0.1μm2、至多約1×10-2μm2或更小。由每一凹陷開口所佔據之面積可大於、小於上文指定之值或介於該等值之間。
每一凹陷70之深度可足夠大以容納一個感測系統10A至10E。在一實例中，深度可為至少約1μm、至少約10μm、至少約100μm或更大。替代地或另外，深度可為至多約1×103μm、至多約100μm、至多約10μm或更小。每一凹陷70之深度可大於、小於上文指定之值或介於該等值之間。
在一些情況下，每一凹陷70之直徑或長度及寬度可為至少約50nm、至少約0.1μm、至少約0.5μm、至少約1μm、至少約10μm、至少約100μm或更大。替代地或另外，直徑或長度及寬度可為至多約1×103μm、至多約100μm、至多約10μm、至多約1μm、至多約0.5μm、至多約0.1μm或更小(例如約50nm)。每一凹陷70之直徑或長度及寬度可大於、小於上文指定之值或介於該等值之間。
如圖7B中所描繪，陣列中之凹陷70中之每一者包括各別感測器10A至10E。需要每一凹陷70中之每一感測器10A至10E具有附著至其的一個聚合酶28，該聚合酶單獨或作為複合物30A至30D之部分。在一些實例中，每一凹陷70中之每一感測器10A至10E具有附著至其的一個聚合酶28或複合物30A至 30D。在其他實例中，一些凹陷70中之一些感測器10A至10E具有附著至其的一個聚合酶28或複合物30A至30D；其他凹陷70中之其他感測器10A至10E具有附著至其的多於一個聚合酶28或複合物30A至30D；且其他凹陷70中之再其他感測器10A至10E不具有附著至其的聚合酶28或複合物30A至30D。在此等實例中，變為附著至任何給定感測系統10A至10E的聚合酶28或複合物30A至30D之數目可為隨機的且藉由泊松分佈來判定。
為附著聚合酶28或複合物30A至30D，方法包括將一流體引入至包括複數個可個別定址導電通道26的感測器陣列，從而將一聚合酶28或一複合物30A至30D附著至該複數個可個別定址導電通道26中之至少一些，該複合物30A至30D包括聚合酶28及連接至該聚合酶28的pH值改變部分50A至50E之不同實例，該pH值改變部分50A至50E選自由以下各者組成之群：酶50A，其用以催化將暴露於感測器陣列的溶液中之二級基質34的消耗；一金屬配位錯合物50E，其用以催化將暴露於感測器陣列的溶液中之二級基質34的消耗；及附著至將被引入至感測器陣列中的經標記核苷酸之催化劑標記物的一輔因子50B或一活化物50C。流體可允許培育所需時間且在允許聚合酶28或複合物30A至30D附著之所需溫度下培育。
在本文揭示用於單分子感測之方法之任何實例期間，經標記核苷酸12或12A至12C或12'中之一者藉由各別聚合酶28併入至形成於凹陷70中之每一者中的感測系統10A至10E處的新生股46中。換言之，在橫越流動槽62之每一模板聚核苷酸鏈44處，各別聚合酶28藉由存在於所引入流體中的核苷酸12、12A至12C或12'中之一者延伸新生股46。
感測器10A至10E中之每一者個別地電可定址且可讀。如此，由回應於二級基質34之消耗而發生在每一凹陷70內的pH值變化產生的電荷信號可經個別地偵測及分析以鑑定所併入經標記核苷酸12、12A至12C或12'。發生在每 一凹陷內的酸或鹼生成反應將取決於所使用的標記物18A至18F與聚合酶28或複合物30A至30D組合，其實例關於圖3A及圖3B、圖4、圖5以及圖6A及圖6B而描述。
整體偵測
感測系統40A及40B之其他實例展示於圖7C及圖7D中，且此等感測系統40A及40B可用於整體感測。在此等實例中，感測系統40A及40B可定位在流動槽62之凹陷70中之每一者中。流動槽62包括如本文所描述的通道64、支撐件66、圖案化材料68及圖案化材料68。
在圖7C中所展示之實例中，感測系統40A包括pH值感測器20及附著至pH值感測器20之導電通道26及/或在每一凹陷70處暴露的支撐件66之表面的引子74。
在凹陷70處暴露的支撐件66之表面可經官能化以使得引子74可附著至表面且不附著至圖案化材料68之間隙區域72。在一些實例中，官能化該支撐表面涉及矽烷化在凹陷70處暴露的表面及在矽烷化表面上形成聚合物層。矽烷化可使用任何矽烷或矽烷衍生物來實現。聚合物(圖中未示)接著可應用於矽烷化表面。聚合物可為對液體及氣體係可透的半剛性聚合材料。聚合物之實例包括丙烯醯胺共聚物，諸如聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共-丙烯醯胺、PAZAM或另一合適之聚合水凝膠。
引子74可為包括可附著至導電通道26之表面及/或支撐件66之表面的官能基的任何前向擴增引子或反向擴增引子。合適官能基封端之引子的實例包括炔烴封端之引子、四嗪封端之引子、疊氮基封端之引子、胺基封端之引子、環氧基或縮水甘油基封端之引子、硫代磷酸酯封端之引子、硫醇封端之引子、醛封端之引子、肼封端之引子及三唑啉二酮封端之引子。亦可使用引子之 混合物。合適引子之特定實例包括P5及/或P7引子，其在藉由伊路米那公司出售的一些商業流動槽之表面上使用。
在一實例中，引子74可使用接枝製程附著，諸如經由沈積之流動(例如，當流動槽62具有結合至其的蓋時)、浸塗、噴塗、覆液分配，或藉由將附著引子74的另一合適之方法。此等實例技術中之每一者可使用引子溶液或混合物，其可包括引子、水、緩衝液(例如，鹽溶液)及催化劑。
在圖7D中所展示之實例中，感測系統40B包括一平面導電通道26'及附著至該平面導電通道26'之引子74。平面導電通道26'可為任何材料，該材料能夠感測帶電離子，或包括可藉由在本文所揭示之酸或鹼生成反應期間所生成之帶電離子質子化或去質子化的表面基。平面導電通道26'連接至可整合至支撐件66中並連接至啟用其操作的電子電路的電極22、24(圖7D中未展示)。引子74中之任一者可被使用且可如本文所描述而附著。此外，若平面導電通道26'具有可附著引子74的表面基，則可不執行平面導電通道26'的額外官能化。
流動槽62之此等實例可用於整體測序。在整體測序中，可使用引子74在流動槽表面上形成將被測序的模板聚核苷酸鏈44(圖7C及圖7D中未展示)。在模板聚核苷酸鏈形成開始時，庫模板可根據任何核樣本(例如DNA樣本或RNA樣本)準備。核酸樣本可經片段化成單股，類似大小(例如，<1000bp)為DNA或RNA片段。在準備期間，轉接子可被添加至此等片段之末端。經由減少之循環擴增，不同基序可引入於轉接子中，諸如測序結合位點、索引，及與凹陷70中之引子74互補的區。最終庫模板包括DNA或RNA片段及在兩個末端處之轉接子。在一些實例中，來自單一核酸樣本之片段具有向其中添加之相同轉接子。
複數個庫模板可引入至流動槽62中。因為流動槽62包括凹陷70之一陣列，因此多個庫模板例如與固定於其中的兩種類型引子74中的一者雜交。
可隨後執行叢集生成。在叢集生成之一個實例中，使用高保真DNA聚合酶藉由3'延伸自雜交引子74複製庫模板。原始庫模板經變性，留下固定於凹陷70中的複本。等溫橋式擴增可用於擴增固定之複本。舉例而言，複製之模板循環以與相鄰的互補引子74雜交，且聚合酶複製經複製之模板以形成雙股橋，其變性以形成兩個單股之股。此兩個股環循環且與相鄰的互補引子74雜交並再次延伸以形成兩個新的雙股循環。藉由等溫變性及擴增之循環在各模板複本上重複該過程以產生密集的純系叢集。使雙股橋之各群集變性。在一實例中，藉由特定鹼基裂解移除反向股，從而留下正向模板聚核苷酸股。群集導致若干模板聚核苷酸鏈44形成於每一凹陷70中。群集之此實例為橋式擴增，且為可執行之擴增之一個實例。應理解，可使用其他擴增技術，諸如排除擴增(Examp)工作流(伊路米那公司)。
為起始測序，併入混合物可被添加至流動槽62。
在一個實例中，併入混合物包括液體載劑、本文所揭示之複合物30A至30D的任何實例，及經標記核苷酸12或12A至12C之任何實例。複合物30A至30D包括一聚合酶28及連接至該聚合酶28之一pH值改變部分50A至50E，該pH值改變部分50A至50E選自由以下各者組成之群：一酶50A，其用以催化一二級基質34之消耗；一金屬配位錯合物50D，其用以催化該二級基質34之消耗；及一輔因子50B或一活化物50C，其用以催化該二級基質34之消耗。經標記核苷酸12包括核苷酸14；連接分子16，其附著至核苷酸14之末端磷酸基；及一標記物18，其附著至該連接分子16，其中該標記物用以參與涉及二級基質34之pH值改變反應。經標記核苷酸12A至12C包括：一核苷酸14'，其具有3' OH阻隔基；一可裂解連接分子16'，其附著至該核苷酸14'之鹼基或糖；及一標記物18，其附著至該連接分子16'，其中該標記物18用以參與涉及二級基質34之pH值改變反應。
經標記核苷酸12或12A至12C之標記物18將取決於所使用的複合 物30A至30D，且可使用組合及如關於圖3A及圖3B、圖4、圖5以及圖6A及圖6B描述之相關聯酸或鹼生成反應。作為一個實例，當複合物30A之pH值改變部分為酶50A時，標記物18B被使用，且可選自由以下各者組成之群：增強酶50A之動力學的一第一基及減緩酶50A之動力學的一第二基。作為另一實例，pH值改變部分為金屬配位錯合物50E，且可使用標記物18E。如本文關於圖5所論述，標記物18E為用於金屬配位錯合物50E之金屬的配位體，其中配位體改變金屬配位錯合物50E之催化特性。作為再一實例，pH值改變部分為輔因子50B或活化物50C，且標記物18C為藉由輔因子50B或活化物50C活化的一催化劑標記物。作為又一個實例，pH值改變部分為酶50A，且複合物30D包括核酸髮夾-酶抑制物共軛物58。標記物18F為與核酸髮夾-酶抑制物共軛物58之一部分互補的寡核苷酸序列。
併入混合物引入複合物30A至30D及經標記核苷酸12或12A至12C至流動槽62。併入混合物亦可包括與模板聚核苷酸鏈44上之互補序列雜交之測序引子。此測序引子使得模板聚核苷酸鏈44呈現準備好進行測序。
另一流體可用於引入二級基質34至流動槽62。併入混合物及包括二級基質34之流體可為套組之部分。流動槽62(在圖7C及圖7D中展示)之任一實例可包括在套組中。
當併入混合物包括經標記核苷酸12(其標記物18在併入之後天然地裂解)時，應理解併入混合物及具有二級基質34之流體可同時或一個接一個引入至流動槽62中，以使得二級基質34在併入事件期間存在於流動槽62中。因為標記物18在併入之後天然地裂解，因此需要二級基質34存在同時標記物18保持在導電通道26或26'附近。相比之下，當併入混合物包括經標記核苷酸12A至12C(其包括阻隔基且因此其標記物18未天然地裂解)時，應理解併入混合物及具有二級基質34之流體可同時或一個接一個引入至流動槽62中，或具有二級基 質34之流體可在併入已發生之後引入。因為標記物18保持栓系直至解阻隔劑被引入為止，因此二級基質34可在併入事件期間或在併入事件之後的任何時候引入。
當併入混合物及具有二級基質34之流體引入至流動槽62中時，流體進入凹陷70(其中模板聚核苷酸鏈44存在)。經標記核苷酸12或12A至12C中之一者藉由各別複合物30A至30D之各別聚合酶28併入至延伸測序引子且與模板聚核苷酸鏈44互補之新生股46中。換言之，在橫越流動槽62的模板聚核苷酸鏈44中之至少一些中，各別聚合酶28藉由溶液中之經標記核苷酸12或12A至12C中之一者延伸雜交測序引子。
在此等實例中，因為聚合酶28為包括pH值改變部分50A至50E的複合物30A至30D之部分且因為聚合酶28參與核苷酸併入，因此pH值改變部分50A至50E在併入事件期間進入導電通道26或26'附近。所併入核苷酸12或12A至12C之標記物18亦進入pH值改變部分50A至50E及導電通道26、26'附近。此使得pH值改變部分50A至50E及標記物18能夠參與與靠近導電通道26、26'之二級基質34的酸或鹼生成反應。特定部分50A至50E與標記物18組合之各個反應及效果與關於圖3A及圖3B、圖4、圖5以及圖6A及圖6B所描述相同。由於酸或鹼生成反應引起的pH值之變化改變導電通道26、26'處的電荷，且電荷之變化被偵測。電荷變化及/或電荷變化之速率可用於鑑定所併入核苷酸。因為多個併入事件發生在單一凹陷內之任何多個引子74上，因此電荷信號可為強且在每一個別導電通道26、26'處可容易偵測。
在包括經標記核苷酸12之整體測序的實例中，標記物18及連接分子16在併入之後天然地裂解。
在包括經標記核苷酸12A至12C之整體測序的實例中，標記物18及連接分子16'保持併入直至解阻隔劑被添加及經由流動槽62洗滌為止。
在整體測序之一些實例中，複合物30A至30D之聚合酶28可為高度進行型，且因此可並不需要在每一測序循環中被引入。在其他實例中，新的聚合酶28(例如，作為複合物30A至30D之部分)可在每一測序循環中被引入。
在如關於圖7C及圖7D描述之使用流動槽62整體測序之另一實例中，併入混合物可不包括複合物30A至30D之實例，但實際上可自行包括聚合酶28。除聚合酶28存在於併入混合物中且不栓系至導電通道26、26'之表面以外，此實例類似於圖2中所描述之實例。併入混合物之此實例可包括載劑液體、聚合酶28及包括標記物18A之經標記核苷酸12或12A至12C；如關於圖2所描述，該標記物為起始或加速涉及二級基質34之酸或鹼生成反應的催化劑。第二流體包括載劑液體且二級基質34可與併入混合物之此實例一起使用。
當併入混合物之此實例及具有二級基質34之流體引入至圖7B及圖7C中展示的流動槽62之實例中時，流體進入凹陷70(其中模板聚核苷酸鏈44存在)。經標記核苷酸12或12A至12C中之一者藉由各別聚合酶28併入至延伸測序引子且與模板多核苷酸鏈44互補之新生股46中。換言之，在橫越流動槽62的模板聚核苷酸鏈44中之至少一些中，各別聚合酶28藉由溶液中之經標記核苷酸12或12A至12C中之一者延伸雜交測序引子。
在此等實例中，所併入核苷酸12或12A至12C之催化劑標記物18A進入導電通道26、26'附近。此使得催化劑標記物18A能夠參與與靠近導電通道26、26'之二級基質34的酸或鹼生成反應。催化劑標記物18A之各個反應及效果與關於圖2所描述的相同。由於酸或鹼生成反應引起的pH值之變化改變導電通道26、26'處的電荷，且電荷之變化被偵測。電荷變化及/或電荷變化之速率可用於鑑定所併入核苷酸。因為多個併入事件發生在單一凹陷內之任何多個引子74，因此電荷信號可為強且在每一個別導電通道26、26'處可容易偵測。
結論
雖然已詳細地描述單分子偵測及整體偵測，但應理解本文所揭示之酸或鹼生成反應可與另一測序方案一起用於基因分型，或用於其他化學及/或生物應用
應瞭解，前述概念及下文更詳細地論述之額外概念的所有組合(限制條件為此等概念並不彼此不相容)被視為本文中所揭示之發明標的的部分。詳言之，在本文之揭示內容結尾處出現之所請標的的全部組合被視為本文所揭示發明性標的的部分。亦應瞭解，本文中明確採用的且亦可出現在以引用方式併入之任何揭示內容中的術語應符合與本文所揭示之特定概念最一致的含義。
貫穿本說明書對於「一個實例」、「另一實例」、「實例」等的提及意謂結合該實例描述的特定元件(例如，特徵、結構及/或特性)被包括於本文中所描述的至少一個實例中，且可或可不存在於其他實例中。此外應理解，除非上下文另外明確規定，否則關於任何實例所述之要素可在各種實例中以任何適合方式組合。
在本文之揭示內容(包括申請專利範圍)中所使用之術語「實質上(substantially)」及「約(about)」用於描述及解釋諸如歸因於處理之變化的小波動。舉例而言，其可指小於或等於±5%，諸如小於或等於±2%、諸如小於或等於±1%、諸如小於或等於±0.5%、諸如小於或等於±0.2%、諸如小於或等於±0.1%、諸如小於或等於±0.05%。
此外，應理解，本文所提供之範圍包括所述範圍及所述範圍內之任何值或子範圍，如同其等被明確列舉一般。舉例而言，由1nm至小於1μm表示之範圍應解譯為不僅包括1nm至小於1μm之明確列舉限值，且亦包括個別值，諸如約15nm、222.5nm、275nm等，及子範圍，諸如約20nm至約800nm等。
雖然已詳細描述了若干實例，但應理解，可修改所揭示實例。因此，前述描述應被視為非限制性的。
12、12'、12A、12B、12C:經標記核苷酸
14:核苷酸
14':核苷酸
16:連接分子
16':可裂解連接分子
18:標記物
34:二級基質
38A:3' OH阻隔基
38B:3' OH阻隔基
38C:3' OH阻隔基
42:裂解位點

Claims (43)

  1. 一種感測系統，其包含：一pH值感測器，其包括：兩個電極；及一導電通道，其可操作地連接至該兩個電極；及一具有pH值改變部分的複合物，其附著至該pH值感測器之該導電通道，該複合物包括連接至至少一個pH值改變部分的一聚合酶，該至少一個pH值改變部分用以參與由於暴露於該pH值感測器的一流體中之一二級基質的消耗而在該導電通道附近產生一pH值變化，該至少一個pH值改變部分選自由以下各者組成之群：一酶、一金屬配位錯合物、一輔因子、及一活化物。
  2. 如請求項1之感測系統，其中該至少一個pH值改變部分為該酶，且其中該酶在與該二級基質之一反應中生成一酸或一鹼。
  3. 如請求項2之感測系統，其中該酶選自由以下各者組成之群：水解酶及氧化酶。
  4. 如請求項1之感測系統，其中該至少一個pH值改變部分的動力學比該聚合酶之動力學快至少10倍。
  5. 如請求項1之感測系統，其中該至少一個pH值改變部分為該酶，且其中該複合物進一步包含附著至該酶之一核酸髮夾-酶抑制物共軛物。
  6. 如請求項1之感測系統，其中：該至少一個pH值改變部分為該酶；且該複合物進一步包括附著至該聚合酶之一第二酶。
  7. 如請求項1之感測系統，其中該複合物為一融合蛋白質或一蛋白質嵌合體。
  8. 如請求項1之感測系統，其中該pH值感測器之該導電通道選自 由以下各者組成之群：一半導電奈米結構、一石墨烯奈米結構、一金屬奈米結構及一導電聚合物奈米結構。
  9. 如請求項1之感測系統，其進一步包含：一支撐件，其包括由間隙區域分隔開的複數個凹陷，其中該pH值感測器之至少該導電通道係在該複數個凹陷中之一者的一底部處；及複數個額外pH值感測器，其中該複數個額外pH值感測器中之每一者的至少一導電通道係在該複數個凹陷中之一各別者的一底部處。
  10. 如請求項9之感測系統，其中該複數個凹陷中之每一者包括側壁，且其中該等側壁包括一pH值緩衝材料。
  11. 一種用於感測由一二級基質之消耗產生的pH值變化的套組，其包含：一pH值感測器，其包括：兩個電極；及一導電通道，其可操作地連接至該兩個電極；及一流體，其包括：一液體載劑；及該液體載劑中之一具有pH值改變部分的複合物，該複合物包括連接至至少一種酶的一聚合酶，該至少一種酶用以由於暴露於該pH值感測器的一第二流體中之該二級基質的消耗在該導電通道附近產生該pH值變化。
  12. 如請求項11之套組，其進一步包含該第二流體，該第二流體包括：一第二液體載劑；及一經標記核苷酸，其包括：一核苷酸； 一連接分子，其附著至該核苷酸之一末端磷酸基；及一標記物，其附著至該連接分子，該標記物選自由以下各者組成之群：增強該酶之動力學的一第一基及減緩該酶之動力學的一第二基。
  13. 如請求項12之套組，其中：該二級基質在該第二流體中且為與該經標記核苷酸分開的一分子；且該第一基或該第二基用以改變涉及該酶及該二級基質之一酸或鹼生成反應的動力學。
  14. 如請求項12之套組，其中：該二級基質在該第二流體中且為與該經標記核苷酸分開的一分子；該標記物為減緩該酶之動力學的該第二基；且該第二基選自由以下各者組成之群：一異位抑制物、一空間排阻基及一緩衝基。
  15. 如請求項12之套組，其中：該二級基質在該第二流體中且為與該經標記核苷酸分開的一分子；該標記物為增強該酶之動力學的該第一基；且該第一基為該酶之一輔因子。
  16. 如請求項11之套組，其進一步包含該第二流體，該第二流體包括：一第二液體載劑；及一經標記核苷酸，其包括：一核苷酸；及該二級基質，其附著至該核苷酸之一鹼基或一糖，其中該二級基質之動力學比該聚合酶之動力學至少快10倍。
  17. 一種用於感測由一二級基質之消耗產生的pH值變化的套組，其包含： 一pH值感測器，其包括：兩個電極；及一導電通道，其可操作地連接至該兩個電極；及一流體，其包括：一液體載劑；及該液體載劑中之一具有pH值改變部分的複合物，該複合物包括連接至一金屬配位錯合物的一聚合酶，該金屬配位錯合物用以由於暴露於該pH值感測器的一第二流體中之該二級基質的消耗在該導電通道附近產生該pH值變化。
  18. 如請求項17之套組，其進一步包含該第二流體，該第二流體包括：一第二液體載劑；該二級基質，其中該二級基質用以經由與該金屬配位錯合物之一反應而生成一酸或鹼；及一經標記核苷酸，其包括：一核苷酸；一連接分子，其附著至該核苷酸之一末端磷酸基；及一標記物，其附著至該連接分子，該標記物為用於該金屬配位錯合物之一金屬的一配位體，其中該配位體改變該金屬配位錯合物之一催化特性。
  19. 一種經標記核苷酸，其包含：一核苷酸；一連接分子，其附著至該核苷酸之一末端磷酸基；及一催化劑標記物，其附著至該連接分子，其中該催化劑標記物用以由於具有該經標記核苷酸之一流體中之一二級基質的消耗而產生一pH值變化；其中一具有pH值改變部分的複合物參與該pH值變化之產生。
  20. 如請求項19之經標記核苷酸，其中該催化劑標記物選自由以下各者組成之群：水解酶及氧化酶。
  21. 一種用於感測由一二級基質之消耗產生的pH值變化的套組，其包含：如請求項19之經標記核苷酸；及一感測系統，其包括：兩個電極；一導電通道，其可操作地連接至該兩個電極；及一複合物，其附著至該導電通道，該複合物包括與該經標記核苷酸之該催化劑標記物之一輔因子或一活化物共軛的一聚合酶。
  22. 一種經標記核苷酸，其包含：一核苷酸，其具有一3' OH阻隔基；一可裂解連接分子，其附著至該核苷酸之一鹼基或一糖；及一標記物，其附著至該可裂解連接分子，其中該標記物用以參與涉及該二級基質之一pH值改變反應；其中一具有pH值改變部分的複合物參與該pH值改變反應。
  23. 一種用於感測涉及一二級基質之一pH值改變反應的套組，其包含：如請求項22之經標記核苷酸；一感測系統，其包括：兩個電極；一導電通道，其可操作地連接至該兩個電極；及一具有pH值改變部分的複合物，其附著至該導電通道，該複合物包括與該經標記核苷酸之該催化劑標記物之一輔因子或一活化物共軛的一聚合酶。
  24. 一種用於生成一感測系統的方法，其包含：將一流體引入至包括複數個可個別定址導電通道的一感測器陣列，從而將一具有pH值改變部分的複合物附著至該複數個可個別定址導電通道中之至少一些，該複合物包括：一聚合酶；及一pH值改變部分，其連接至該聚合酶，該pH值改變部分選自由以下各者組成之群：一酶，其用以催化將暴露於該感測器陣列的一溶液中之一二級基質的消耗；一金屬配位錯合物，其用以催化將暴露於該感測器陣列的該溶液中之該二級基質之消耗；及一催化劑標記物之一輔因子或一活化物，該催化劑標記物附著至將引入至該感測器陣列的一經標記核苷酸。
  25. 一種用於偵測涉及一二級基質之一pH值改變反應的方法，其包含：將一模板聚核苷酸鏈引入至具有栓系(tethered)至一導電通道之一聚合酶的一感測器；將包括該二級基質及經標記核苷酸之一流體引入至該感測器，從而該等經標記核苷酸中之一者的一核苷酸與該聚合酶相連且該等經標記核苷酸中之該一者的一標記物參與涉及在該導電通道附近的該二級基質之該pH值改變反應，其中一具有pH值改變部分的複合物進行該pH值改變反應；及偵測該導電通道之一回應。
  26. 如請求項25之方法，其中：該感測器之該聚合酶為具有一酶催化劑之一複合物的部分；該標記物為增強或減緩該酶催化劑之動力學的一基；且該方法進一步包含偵測與一基線電荷相比之一電荷變化。
  27. 如請求項25之方法，其中： 該感測器之該聚合酶為具有一酶催化劑之一複合物的部分；該標記物為該二級基質；且該方法進一步包含偵測與一基線電荷相比之一電荷變化。
  28. 如請求項25之方法，其中：該感測器之該聚合酶為具有一金屬配位錯合物之一複合物的部分；該標記物為用於該金屬配位錯合物之一金屬的一配位體；且該方法進一步包含偵測與一基線電荷相比之一電荷變化。
  29. 如請求項25之方法，其中：該感測器之該聚合酶為具有一酶催化劑之一複合物的部分；一核酸髮夾-酶抑制物共軛物附著至該酶催化劑；該標記物為與該核酸髮夾-酶抑制物共軛物之一部分互補的一寡核苷酸序列；且該方法進一步包含偵測與一基線電荷相比之一電荷變化。
  30. 如請求項26至29中任一項之方法，其進一步包含自該電荷變化或該電荷變化之一速率鑑定與該聚合酶相連的該核苷酸。
  31. 如請求項25之方法，其中該等經標記核苷酸具有相異併入速率，且其中該方法進一步包含藉由相連經標記核苷酸之相異併入速率鑑定該相連經標記核苷酸。
  32. 一種用於生成一感測系統的方法，其包含：自由以下各者組成之群選擇一pH值改變部分：一酶，其用以催化一溶液中之一二級基質的消耗；一金屬配位錯合物，其用以催化該溶液中之該二級基質的消耗；及附著至一經標記核苷酸的一催化劑標記物之一輔因子或一活化物；將一聚合酶與該pH值改變部分共軛以生成一具有pH值改變部分的複合物；及將該複合物附著至可操作地連接至兩個電極之一導電通道。
  33. 一種併入混合物，其包含： 一液體載劑；一具有pH值改變部分的複合物，其包括：一聚合酶；及一pH值改變部分，其連接至該聚合酶，該pH值改變部分選自由以下各者組成之群：一酶，其用以催化一二級基質之消耗；一金屬配位錯合物，其用以催化該二級基質之消耗；及一輔因子或一活化物，其用以催化該二級基質之消耗；及一經標記核苷酸，其包括：一核苷酸；一連接分子，其附著至該核苷酸之一末端磷酸基；及一標記物，其附著至該連接分子，其中該標記物用以參與涉及該二級基質之一pH值改變反應。
  34. 如請求項33之併入混合物，其中：該pH值改變部分為該酶，且該標記物選自由以下各者組成之群：增強該酶之動力學的一第一基及減緩該酶之動力學的一第二基；該pH值改變部分為該金屬配位錯合物，且該標記物為用於該金屬配位錯合物之一金屬的一配位體，其中該配位體改變該金屬配位錯合物之一催化特性；或該pH值改變部分為該輔因子或該活化物，且該標記物為藉由該輔因子或該活化物活化的一催化劑標記物。
  35. 如請求項33之併入混合物，其中：該pH值改變部分為該酶；該複合物進一步包括附著至該酶之一核酸髮夾-酶抑制物共軛物；且該標記物為與該核酸髮夾-酶抑制物共軛物之一部分互補的一寡核苷酸序列。
  36. 一種用於感測涉及一二級基質之一pH值改變反應的套組，其包含： 如請求項33之併入混合物；及一二級基質混合物，其包括一第二液體載劑及該二級基質。
  37. 如請求項36之套組，其進一步包含：一流動槽，其包括：一基質，其包括由間隙區域隔開之複數個凹陷；一導電通道，其在該複數個凹陷中之每一者的一底部處；及至少一個引子，其在該等凹陷中之每一者中之每一者中接枝。
  38. 一種併入混合物，其包含：一液體載劑，其包括一緩衝液；一具有pH值改變部分的複合物，其包括：一聚合酶；及一pH值改變部分，其連接至該聚合酶，該pH值改變部分選自由以下各者組成之群：一酶，其用以催化一二級基質之消耗；一金屬配位錯合物，其用以催化該二級基質之消耗；及一輔因子或一活化物，其用以催化該二級基質之消耗；及一經標記核苷酸，其包括：一核苷酸，其具有一3' OH阻隔基；一可裂解連接分子，其附著至該核苷酸之一鹼基或一糖；及一標記物，其附著至該連接分子，其中該標記物用以參與涉及該二級基質之一pH值改變反應。
  39. 如請求項38之併入混合物，其中：該pH值改變部分為該酶，且該標記物選自由以下各者組成之群：增強該酶之動力學的一第一基、減緩該酶之動力學的一第二基及該二級基質；或該pH值改變部分為該金屬配位錯合物，且該標記物為用於該金屬配位錯合物之一金屬的一配位體，其中該配位體改變該金屬配位錯合物之一催化特性；或 該pH值改變部分為該輔因子或該活化物，且該標記物為藉由該輔因子或該活化物活化的一催化劑標記物。
  40. 如請求項38之併入混合物，其中：該pH值改變部分為該酶；該複合物進一步包括附著至該酶之一核酸髮夾-酶抑制物共軛物；且該標記物為與該核酸髮夾-酶抑制物共軛物之一部分互補的一寡核苷酸序列。
  41. 一種用於感測涉及一二級基質之一pH值改變反應的套組，其包含：如請求項38之併入混合物；及一二級基質混合物，其包括一第二液體載劑及該二級基質。
  42. 如請求項41之套組，其進一步包含：一流動槽，其包括：一基質，其包括由間隙區域隔開之複數個凹陷；一導電通道，其在該複數個凹陷中之每一者的一底部處；及一引子，其在該等凹陷中之每一者中接枝。
  43. 如請求項41之套組，其進一步包含一解阻隔劑溶液。
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