BR112020026482A2

BR112020026482A2 - Sistema de detecção, kits, nucleotídeos marcados, métodos e misturas de incorporação

Info

Publication number: BR112020026482A2
Application number: BR112020026482-2A
Authority: BR
Inventors: Jeffrey S. Fisher; Brian D. Mather; Kaitlin M. Pugliese; Jeffrey G. Mandell; Maria Candelaria Rogert Bacigalupo; Boyan Boyanov
Original assignee: Illumina, Inc.
Priority date: 2019-02-15
Filing date: 2020-01-24
Publication date: 2021-09-28
Also published as: EP3942067A2; CN112673112A; WO2020167447A2; SG11202012397SA; US20210310985A1; PH12020552292A1; IL279567A; CA3103670A1; TW202045916A; KR20210125892A; AU2020221765A1; TWI752407B; EP3942067A4; MX2020014068A; WO2020167447A3; JP2022520137A

Abstract

sistema de detecção, kits, nucleotídeos marcados, métodos e misturas de incorporação. em um exemplo, um sistema de detecção inclui um sensor de ph. o sensor de ph inclui dois eletrodos e um canal condutor operativamente conectado aos dois eletrodos. um complexo é ligado ao canal condutor do sensor de ph. o complexo inclui uma polimerase ligada a pelo menos uma fração que altera o ph que é para participar na geração de uma mudança de ph nas proximidades do canal condutor a partir do consumo de um substrato secundário em um fluido que é exposto ao sensor de ph. a pelo menos uma fração de alteração de ph é selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima, um complexo de coordenação de metal, um cofator e um ativador.

Description

SISTEMA DE DETECÇÃO, KITS, NUCLEOTÍDEOS MARCADOS, MÉTODOS E MISTURAS DE INCORPORAÇÃO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório sob Número de Série US 62/806.545, depositado em 15 de fevereiro de 2019; cujo conteúdo está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES

[002] Vários protocolos em pesquisa biológica ou química envolvem a realização de um grande número de reações controladas em superfícies de suporte locais ou dentro de câmaras de reação pré-definidas. As reações designadas podem, então, ser observadas ou detectadas e a análise subsequente pode ajudar a identificar ou revelar as propriedades dos produtos químicos envolvidos na reação. Em alguns exemplos, as reações controladas geram fluorescência e, portanto, um sistema óptico pode ser usado para detecção. Em outros exemplos, as reações controladas alteram carga, condutividade ou alguma outra propriedade elétrica e, portanto, um sistema eletrônico pode ser usado para detecção.

INTRODUÇÃO

[003] Um primeiro aspecto revelado na presente invenção é um sistema de detecção compreendendo um sensor de pH, incluindo dois eletrodos e um canal condutor operativamente conectado aos dois eletrodos; e um complexo ligado ao canal condutor do sensor de pH, o complexo incluindo uma polimerase ligada a pelo menos uma porção que altera o pH que deve participar na geração de uma mudança de pH na proximidade do canal condutor a partir do consumo de um substrato secundário em um fluido que é exposto ao sensor de pH, a pelo menos uma porção que altera o pH sendo selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima, um complexo de coordenação metálico, um cofator e um ativador.

[004] Em um exemplo desse primeiro aspecto, pelo menos uma porção que altera o pH é a enzima, e em que a enzima gera um ácido ou uma base em uma reação com o substrato secundário. Em um exemplo específico, a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em hidrolases e oxidases.

[005] Em um exemplo desse primeiro aspecto, a cinética de pelo menos uma porção que altera o pH é pelo menos 10 vezes mais rápida que a cinética da polimerase.

[006] Em um exemplo desse primeiro aspecto, pelo menos uma porção que altera o pH é a enzima, e o complexo compreende adicionalmente um conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo ligado à enzima.

[007] Em um exemplo desse primeiro aspecto, pelo menos uma porção que altera o pH é a enzima; e o complexo inclui adicionalmente uma segunda enzima ligada à polimerase.

[008] Em um exemplo desse primeiro aspecto, o complexo é uma proteína de fusão ou uma quimera proteica.

[009] Em um exemplo desse primeiro aspecto, o canal condutor do sensor de pH é selecionado a partir do grupo que consiste em uma nanoestrutura semicondutora, uma nanoestrutura de grafeno, uma nanoestrutura metálica e uma nanoestrutura polimérica condutora.

[010] Um exemplo desse primeiro aspecto compreende adicionalmente um suporte que inclui uma pluralidade de depressões separadas por regiões intersticiais, em que pelo menos o canal condutor do sensor de pH está no fundo de uma da pluralidade de depressões; e uma pluralidade de sensores de pH adicionais, em que pelo menos um canal condutor de cada um da pluralidade de sensores de pH adicionais está no fundo de uma respectiva pluralidade de depressões. Em um exemplo específico, cada uma da pluralidade de depressões inclui paredes laterais, e em que as paredes laterais incluem um material tampão de pH.

[011] Deve ser entendido que quaisquer recursos do sistema de detecção revelado na presente invenção podem ser combinados de qualquer maneira e/ou configuração desejada.

[012] Um segundo aspecto revelado na presente invenção é um kit compreendendo um sensor de pH, que inclui dois eletrodos e um canal condutor conectado de modo operacional aos dois eletrodos; e um fluido, que inclui um veículo líquido e um complexo no veículo líquido, o complexo incluindo uma polimerase ligada a pelo menos uma enzima para criar uma mudança de pH nas proximidades do canal condutor a partir do consumo de um substrato secundário em um segundo fluido que é exposto ao sensor de pH.

[013] Um exemplo desse segundo aspecto compreende adicionalmente o segundo fluido que inclui um segundo veículo líquido e um nucleotídeo marcado, que inclui um nucleotídeo, uma molécula de ligação ligada a um grupo fosfato terminal do nucleotídeo, e um marcador ligado à molécula de ligação, sendo o marcador selecionado a partir do grupo que consiste em um primeiro grupo que acentua a cinética da enzima e um segundo grupo que reduz a cinética da enzima. Em um exemplo específico, o substrato secundário está no segundo fluido e é uma molécula separada do nucleotídeo marcado, e o primeiro grupo ou o seguna partir do grupo serve para alterar a cinética de uma reação de geração de ácido ou base que envolve a enzima e o substrato secundário. Em um outro exemplo específico, o substrato secundário está no segundo fluido e é uma molécula separada do nucleotídeo marcado, o marcador é do segundo grupo que reduz a cinética da enzima, e o segundo grupo é selecionado a partir do grupo que consiste em um inibidor alostérico, um grupo de exclusão estérico e um grupo de tamponamento. Em ainda um outro exemplo específico, o substrato secundário está no segundo fluido e é uma molécula separada do nucleotídeo marcado, o marcador é o primeiro grupo que acentua a cinética da enzima, e o primeiro grupo é um cofator da enzima.

[014] Um outro exemplo desse segundo aspecto compreende adicionalmente o segundo fluido que inclui um segundo veículo líquido e um nucleotídeo marcado, que inclui um nucleotídeo e o substrato secundário ligado a uma base ou um açúcar do nucleotídeo, em que a cinética do substrato secundário é pelo menos 10 vezes mais rápida que a cinética da polimerase.

[015] Deve-se compreender que quaisquer recursos do kit podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve-se compreender que qualquer combinação de recursos desse kit e/ou do sistema de detecção podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[016] Um terceiro aspecto revelado na presente invenção é um kit compreendendo um sensor de pH, que inclui dois eletrodos e um canal condutor conectado de modo operacional aos dois eletrodos; e um fluido, que inclui um veículo líquido e um complexo no veículo líquido, o complexo incluindo uma polimerase ligada a um complexo de coordenação metálico para criar uma mudança de pH nas proximidades do canal condutor a partir do consumo de um substrato secundário em um segundo fluido que é exposto ao sensor de pH.

[017] Um exemplo desse terceiro aspecto compreende adicionalmente o segundo fluido que inclui um segundo veículo líquido; o substrato secundário (em que o substrato secundário serve para gerar um ácido ou base através de uma reação com o complexo de coordenação metálico), e um nucleotídeo marcado, que inclui um nucleotídeo, uma molécula de ligação ligada a um grupo fosfato terminal do nucleotídeo, e um marcador ligado à molécula de ligação, em que o marcador é um ligante para um metal do complexo de coordenação metálico, em que o ligante altera uma propriedade catalítica do complexo de coordenação metálico.

[018] Deve-se compreender que quaisquer recursos desse kit podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve-se compreender que qualquer combinação de recursos desse kit e ou do sistema de detecção e/ou do outro kit podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[019] Um quarto aspecto revelado na presente invenção é um nucleotídeo marcado compreendendo um nucleotídeo, uma molécula de ligação ligada a um grupo fosfato terminal do nucleotídeo, e um marcador de catalisador ligado à molécula de ligação, em que o marcador de catalisador serve para criar uma mudança de pH a partir do consumo de um substrato secundário em um fluido com o nucleotídeo marcado.

[020] Em um exemplo do quarto aspecto, o marcador de catalisador é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrolases e oxidases.

[021] Deve-se compreender que quaisquer recursos desse nucleotídeo marcado podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve- se compreender que qualquer combinação de recursos desse nucleotídeo marcado e/ou do sistema de detecção e/ou dos kits podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[022] Um quinto aspecto revelado na presente invenção é um kit compreendendo o nucleotídeo marcado do quarto aspecto, e um sistema de detecção, que inclui dois eletrodos, um canal condutor conectado de modo operacional aos dois eletrodos, e um complexo ligado ao canal condutor, o complexo incluindo uma polimerase conjugada a um cofator ou um ativador do marcador de catalisador do nucleotídeo marcado.

[023] Deve-se compreender que quaisquer recursos desse kit podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve-se compreender que qualquer combinação de recursos desse kit e/ou do sistema de detecção e/ou dos outros kits e/ou do nucleotídeo marcado podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[024] Um sexto aspecto revelado na presente invenção é um nucleotídeo marcado compreendendo um nucleotídeo que tem um grupo de bloqueio 3’-OH, uma molécula de ligação clivável ligada a uma base ou um açúcar do nucleotídeo, e um marcador ligado à molécula de ligação clivável, em que o marcador serve para participar em uma reação de alteração de pH que envolve o substrato secundário.

[025] Deve-se compreender que quaisquer recursos desse nucleotídeo marcado podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve- se compreender que qualquer combinação de recursos desse nucleotídeo marcado e/ou do sistema de detecção e/ou dos kits e/ou do outro nucleotídeo marcado podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[026] Um sétimo aspecto revelado na presente invenção é um kit compreendendo o nucleotídeo marcado do sexto aspecto, e um sistema de detecção, que inclui dois eletrodos, um canal condutor conectado de modo operacional aos dois eletrodos, e um complexo ligado ao canal condutor, o complexo incluindo uma polimerase conjugada a um cofator ou um ativador do marcador de catalisador do nucleotídeo marcado.

[027] Deve-se compreender que quaisquer recursos desse kit podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve-se compreender que qualquer combinação de recursos desse kit e/ou do sistema de detecção e/ou dos kits e/ou dos nucleotídeos marcados podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[028] Um oitavo aspecto revelado na presente invenção é um método compreendendo introduzir um fluido em uma arranjo de sensor que inclui uma pluralidade de canais condutores individualmente acessíveis, ligando assim um complexo a pelo menos parte da pluralidade de canais condutores individualmente acessíveis, o complexo incluindo uma polimerase e uma porção que altera o pH ligada à polimerase, a porção de alteração de pH sendo selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima que serve para catalisar o consumo de um substrato secundário em uma solução que deve ser exposta ao arranjo de sensor, um complexo de coordenação metálico que serve para catalisar o consumo do substrato secundário na solução que deve ser exposta ao arranjo de sensor, e um cofator ou ativador de um marcador de catalisador ligado a um nucleotídeo marcado que deve ser introduzido no arranjo de sensor.

[029] Deve-se compreender que quaisquer recursos desse método podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve-se compreender que qualquer combinação de recursos desse método e/ou do sistema de detecção e/ou dos kits e/ou dos nucleotídeos marcados podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[030] Um nono aspecto revelado na presente invenção é um método compreendendo introduzir uma cadeia polinucleotídica modelo em um sensor que tem uma polimerase conectada a um canal condutor; introduzir um fluido que inclui um substrato secundário e nucleotídeos marcados no sensor, em que um nucleotídeo de um dos nucleotídeos marcados se associa com a polimerase e um marcador de um dos nucleotídeos marcados participa em uma reação de alteração de pH que envolve o substrato secundário que está nas proximidades do canal condutor; e detectar uma resposta do canal condutor.

[031] Em um exemplo desse nono aspecto, a polimerase do sensor é parte de um complexo com um catalisador enzimático, o marcador é um grupo que acentua ou reduz a cinética da catalisador enzimático, e o método compreende adicionalmente detectar uma mudança na carga em comparação com uma carga de linha de base.

[032] Em um exemplo desse nono aspecto, a polimerase do sensor é parte de um complexo com um catalisador enzimático, o marcador é o substrato secundário, e o método compreende adicionalmente detectar uma mudança na carga em comparação com uma carga de linha de base.

[033] Em um exemplo desse nono aspecto, a polimerase do sensor é parte de um complexo com um complexo de coordenação metálico, o marcador é um ligante para um metal do complexo de coordenação metálico, e o método compreende adicionalmente detectar uma mudança na carga em comparação com uma carga de linha de base.

[034] Em um exemplo desse nono aspecto, a polimerase do sensor é parte de um complexo com um catalisador enzimático, um conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo ligado à enzima é ligado ao catalisador enzimático, o marcador é uma sequência oligonucleotídica que é complementar a uma porção do conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo ligado à enzima, e o método compreende adicionalmente detectar uma mudança na carga em comparação com uma carga de linha de base.

[035] Qualquer um ou mais dos exemplos do nono aspecto pode compreender adicionalmente identificar o nucleotídeo associado com a polimerase a partir da mudança da carga ou uma taxa da mudança da carga.

[036] Em um exemplo desse nono aspecto, os nucleotídeos marcados têm taxas de incorporação distintas, e o método compreende adicionalmente identificar o nucleotídeo marcado associado por sua taxa de incorporação distinta.

[037] Deve-se compreender que quaisquer recursos desse método podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve-se compreender que qualquer combinação de recursos desse método e/ou dos outros métodos e/ou do sistema de detecção e/ou dos kits e/ou dos nucleotídeos marcados podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[038] Um décimo aspecto revelado na presente invenção é um método compreendendo selecionar uma porção que altera o pH a partir do grupo que consiste em uma enzima que serve para catalisar o consumo de um substrato secundário em uma solução, um complexo de coordenação metálico que serve para catalisar o consumo do substrato secundário na solução, e um cofator ou ativador de um marcador de catalisador ligado a um nucleotídeo marcado; conjugar uma polimerase à porção de alteração de pH para gerar um complexo; e ligar o complexo a um canal condutor conectado de modo operacional a dois eletrodos.

[039] Deve-se compreender que quaisquer recursos desse método podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve-se compreender que qualquer combinação de recursos desse método e/ou dos outros métodos e/ou do sistema de detecção e/ou dos kits e/ou dos nucleotídeos marcados podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[040] Um décimo-primeiro aspecto revelado na presente invenção é uma mistura de incorporação, compreendendo um veículo líquido; um complexo que inclui uma polimerase e uma porção que altera o pH ligada à polimerase, a porção de alteração de pH sendo selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima que serve para catalisar consumo de um substrato secundário, um complexo de coordenação metálico que serve para catalisar o consumo do substrato secundário, e um cofator ou ativador que serve para catalisar o consumo do substrato secundário; e um nucleotídeo marcado, que inclui um nucleotídeo, uma molécula de ligação ligada a um grupo fosfato terminal do nucleotídeo, e um marcador ligado à molécula de ligação, em que o marcador serve para participar em uma reação de alteração de pH que envolve o substrato secundário.

[041] Em um exemplo desse décimo-primeiro aspecto, a porção de alteração de pH é a enzima, e o marcador é selecionado a partir do grupo que consiste em um primeiro grupo que acentua a cinética da enzima e um segundo grupo que reduz a cinética da enzima; a porção de alteração de pH é o complexo de coordenação metálico, e o marcador é um ligante para um metal do complexo de coordenação metálico, em que o ligante altera uma propriedade catalítica do complexo de coordenação metálico; ou a porção de alteração de pH é o cofator ou ativador, e o marcador é um marcador de catalisador que é ativado pelo cofator ou ativador.

[042] Em um exemplo desse décimo-primeiro aspecto, a porção de alteração de pH é a enzima; o complexo inclui adicionalmente um conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo ligado à enzima; e o marcador é uma sequência oligonucleotídica que é complementar a uma porção do conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo ligado à enzima.

[043] Deve-se compreender que quaisquer recursos dessa mistura de incorporação podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve-se compreender que qualquer combinação de recursos da mistura de incorporação e/ou dos métodos e/ou do sistema de detecção e/ou dos kits e/ou dos nucleotídeos marcados podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[044] Um décimo-segundo aspecto revelado na presente invenção é um kit compreendendo a mistura de incorporação do décimo-primeiro aspecto, e uma mistura de substrato secundário que inclui um segundo veículo líquido e o substrato secundário.

[045] Um exemplo do décimo-segundo aspecto compreende adicionalmente uma célula de fluxo, que inclui um substrato que inclui uma pluralidade de depressões separadas por regiões intersticiais; um canal condutor no fundo de cada uma da pluralidade de depressões; e pelo menos um iniciador enxertado em cada uma das depressões.

[046] Deve-se compreender que quaisquer recursos desse kit podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve-se compreender que qualquer combinação de recursos desse kit e/ou da mistura de incorporação e/ou dos métodos e/ou do sistema de detecção e/ou dos outros kits e/ou dos nucleotídeos marcados podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[047] Um décimo-terceiro aspecto revelado na presente invenção é uma mistura de incorporação compreendendo um veículo líquido que inclui um tampão; um complexo que inclui uma polimerase e uma porção que altera o pH ligada à polimerase, a porção de alteração de pH sendo selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima que serve para catalisar o consumo de um substrato secundário, um complexo de coordenação metálico que serve para catalisar o consumo do substrato secundário, e um cofator ou ativador que serve para catalisar o consumo do substrato secundário; e um nucleotídeo marcado, que inclui um nucleotídeo que tem um grupo de bloqueio 3’-OH, uma molécula de ligação clivável ligada a uma base ou um açúcar do nucleotídeo, e um marcador ligado à molécula de ligação, em que o marcador serve para participar em uma reação de alteração de pH que envolve o substrato secundário.

[048] Em um exemplo do décimo-terceiro aspecto, a porção de alteração de pH é a enzima, e o marcador é selecionado a partir do grupo que consiste em um primeiro grupo que acentua a cinética da enzima, um segundo grupo que reduz a cinética da enzima, e o substrato secundário; ou a porção de alteração de pH é o complexo de coordenação metálico, e o marcador é um ligante para um metal do complexo de coordenação metálico, em que o ligante altera uma propriedade catalítica do complexo de coordenação metálico; ou a porção de alteração de pH é o cofator ou ativador, e o marcador é um marcador de catalisador que é ativada pelo cofator ou ativador.

[049] Em um exemplo desse décimo-terceiro aspecto, a porção de alteração de pH é a enzima; o complexo inclui adicionalmente um conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo ligado à enzima; e o marcador é uma sequência oligonucleotídica que é complementar a uma porção do conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo.

[050] Deve-se compreender que quaisquer recursos desse kit de incorporação podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve-se compreender que qualquer combinação de recursos dessa mistura de incorporação e/ou dos métodos e/ou do sistema de detecção e/ou dos kits e/ou dos nucleotídeos marcados podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[051] Um décimo-quarto aspecto revelado na presente invenção é um kit compreendendo a mistura de incorporação conforme definido no décimo- terceiro aspecto, e uma mistura de substrato secundário que inclui um segundo veículo líquido e o substrato secundário.

[052] Um exemplo do décimo-quarto aspecto compreende adicionalmente uma célula de fluxo, que inclui um substrato que inclui uma pluralidade de depressões separadas por regiões intersticiais; um canal condutor em um fundo de cada uma da pluralidade de depressões; e um iniciador enxertado em cada uma das depressões.

[053] Um exemplo do décimo-quarto aspecto compreende adicionalmente uma solução de agente de desbloqueio.

[054] Deve ser entendido que quaisquer recursos desse kit podem ser combinados de qualquer maneira desejada. Ademais, deve-se compreender que qualquer combinação de recursos desse kit e/ou dos métodos e/ou do sistema de detecção e/ou dos outros kits e/ou dos nucleotídeos marcados e/ou da mistura de incorporação podem ser usados em conjunto, e/ou combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção.

[055] Ainda adicionalmente, deve-se compreender que quaisquer recursos de qualquer um dos aspectos podem ser usados sozinhos ou em combinação de qualquer maneira desejada, e/ou podem ser combinados com qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção pelo menos para alcançar os benefícios conforme descrito na presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[056] Recursos de exemplos da presente invenção se tornarão aparentes por referência à seguinte descrição detalhada e desenhos, nos quais numerais de referência semelhantes correspondem a componentes semelhantes, embora talvez não idênticos. Por uma questão de brevidade, números de referência ou recursos com uma função descrita anteriormente podem ou não ser descritos em conexão com outros desenhos nos quais eles aparecem.

[057] As Figuras 1A a 1C são ilustrações esquemáticas de diferentes exemplos de nucleotídeos marcados revelados na presente invenção;

[058] A Figura 2 é uma ilustração esquemática que representa um exemplo do sistema de detecção revelado na presente invenção, e um exemplo de um nucleotídeo marcado e um substrato secundário que pode ser usado com esse exemplo do sistema de detecção;

[059] A Figura 3A é uma ilustração esquemática que representa um outro exemplo do sistema de detecção revelado na presente invenção, e um exemplo de nucleotídeos marcados e um substrato secundário que pode ser usado com esse exemplo do sistema de detecção;

[060] A Figura 3B representa o exemplo do sistema de detecção da Figura 3A em uso com um outro exemplo do nucleotídeo marcado revelado na presente invenção;

[061] A Figura 4 é uma ilustração esquemática que representa um outro exemplo do sistema de detecção revelado na presente invenção, e um exemplo de um nucleotídeo marcado e um substrato secundário que pode ser usado com esse exemplo do sistema de detecção;

[062] A Figura 5 é uma ilustração esquemática que representa ainda um outro exemplo do sistema de detecção revelado na presente invenção, e um exemplo de um nucleotídeo marcado e um substrato secundário que pode ser usado com esse exemplo do sistema de detecção;

[063] A Figura 6A é uma ilustração esquemática que representa ainda um outro exemplo do sistema de detecção revelado na presente invenção;

[064] A Figura 6B representa o exemplo do sistema de detecção da Figura 6A em uso com um outro exemplo do nucleotídeo marcado revelado na presente invenção;

[065] A Figura 7A é uma vista superior de um exemplo de uma célula de fluxo;

[066] A Figura 7B é uma vista parcialmente em corte ampliada de um exemplo de uma célula de fluxo adequada para uso com detecção de molécula única;

[067] A Figura 7C é uma vista parcialmente em corte ampliada de um exemplo de uma célula de fluxo adequada para uso com sequenciamento de conjunto; e

[068] A Figura 7D é uma vista parcialmente em corte ampliada de ainda um outro exemplo de uma célula de fluxo adequada para uso com sequenciamento de conjunto.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[069] Alguns dos exemplos de sistemas de detecção revelados na presente invenção podem ser usados para detecção de molécula única em procedimentos de sequenciamento de ácido nucleico. Cada um desses sistemas de detecção inclui um canal condutor com uma polimerase ou um complexo contendo polimerase ligado à ele. Esse canal condutor pode detectar uma mudança da carga como resultado de uma mudança localizada no pH (concentração de íon de hidrogênio). Em uso, nucleotídeos marcados e um substrato secundário são introduzidos no sistema de detecção. Visto que uma base nitrogenadade um dos nucleotídeos marcados é incorporada a uma fita nascente pela polimerase, o substrato secundário é consumido em uma reação de geração de ácido ou base (que aumenta ou diminui a concentração de íons carregados). A reação de geração de ácido ou base também envolve uma porção que altera o pH, que, em alguns exemplos, é imobilizada no canal condutor como parte de um complexo; e, em outros exemplos, é um marcador do nucleotídeo marcado incorporado.

Parte das reações de geração de ácido ou base envolve múltiplas porçõesde alteração de pH, por exemplo, uma como parte do complexo e uma outra como um marcador do nucleotídeo marcado. Essas configurações permitem que a porção de alteração de pH seja posicionada em ou próximo à superfície do canal condutor; e, dessa forma, a reação de geração de ácido ou base está localizada na superfície do canal condutor. Em alguns casos, os íons carregados reagem com grupos de superfície do canal condutor, ocasionando protonação ou desprotonação dos grupos de superfície, que altera a carga dos grupos de superfície. Nesses casos, a carga dos grupos de superfície é detectada. Devido ao fato de que as cargas estão diretamente sobre a superfície do canal condutor, as mesmas não podem ser com eficiência analisadas por íons em solução e, dessa forma, podem induzir grandes mudanças na tensão e corrente limites. Em outros casos, os íons carregados resultantes da geração de ácido ou base são captados.

[070] Alguns dos outros exemplos dos sistemas de detecção revelados na presente invenção podem ser usados para procedimentos de sequenciamento de ácido nucleico de conjunto. Cada um desses sistemas de detecção inclui um canal condutor com um emaranhado de iniciadores (por exemplo, oligapares) no mesmo. Esse canal condutor pode detectar uma mudança da carga como resultado de uma mudança localizada no pH. Em uso, bibliotecas modelos são introduzidas e hibridizadas nos iniciadores. A geração de agrupamento é realizada para gerar várias cadeias polinucleotídicas modelo. Os complexos contendo polimerase, nucleotídeos marcados e substratos secundários são, então, introduzidos no sistema de detecção. Durante ou após uma base nitrogenadados respectivos nucleotídeos marcados ser incorporada (pelas respectivas polimerases dos complexos) nas respectivas fitas nascentes formadas ao longo das respectivas cadeias polinucleotídicas modelo, os substratos secundários são consumidos em uma reação de geração de ácido ou base (que aumenta ou diminui a concentração de íons carregados). Similar à detecção de molécula única, a reação de geração de ácido ou base também envolve uma porção que altera o pH, que é parte do complexo contendo polimerase ou é um marcador dos nucleotídeos marcados incorporados. Essas configurações permitem que a porção de alteração de pH seja posicionada em ou próximo à superfície do canal condutor; e, dessa forma, a reação de geração de ácido ou base está localizada na superfície do canal condutor. Tanto os íons carregados ou a reação dos íons carregados com grupos de superfície do canal condutor são detectados.

[071] Em qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção, as reações de geração de ácido ou base podem gerar centenas, ou milhares, ou ainda mais prótons ou moléculas de base, gerando assim uma mudança de pH ampla e localizada.

[072] Em qualquer um dos exemplos revelados na presente invenção, a porção de alteração de pH pode ser qualquer espécie química que pode participar de uma reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário, ou modificar a atividade de uma outra porção de alteração de pH que está atuando sobre o substrato secundário. Como exemplos, a porção de alteração de pH pode catalisar (ocasionar ou acelerar) a reação de geração de ácido ou base que envolve o substrato secundário, pode inibir a reação de geração de ácido ou base que envolve o substrato secundário, pode acentuar ou reduzir a cinética de reação de geração de ácido ou base, ou pode de outro modo participar na reação de geração de ácido ou base que envolve o substrato secundário. Alguns exemplos da porção de alteração de pH são imobilizados no canal condutor como parte de um complexo; e outros exemplos da porção de alteração de pH são um marcador do nucleotídeo marcado incorporado. Em alguns casos, duas porções de alteração de pH podem interagir para produzir uma mudança de pH.

[073] As reações de geração de ácido ou base (alteração de pH) reveladas na presente invenção envolvem o substrato secundário. Conforme usado na presente invenção, o termo “substrato secundário” se refere a uma espécie química que é consumida em uma reação que gera um ácido ou a base, em que a espécie química é uma molécula separada de um nucleotídeo cuja base tem a capacidade de interagir com uma polimerase do complexo ou é uma molécula distinta ligada ao açúcar ou a base do nucleotídeo cuja base tem a capacidade de interagir com uma polimerase do complexo, e não é um subproduto do evento de incorporação de base nitrogenada. O uso do substrato secundário distinto permite que a cinética da mudança de pH detectada seja desacoplada da cinética da incorporação de nucleotídeo. Em alguns exemplos, a porção de alteração de pH que interage com o substrato secundário pode ser significativamente mais rápida em relação à cinética do que a polimerase que interage com o nucleotídeo. Isso permite que uma mudança de pH mais ampla seja observada para um único evento de incorporação ou para um grupo de eventos de incorporação.

[074] É desejável que as reações de geração de ácido ou base (alteração de pH) ocorram nas proximidades do canal condutor. “Nas proximidades” geralmente se refere a qualquer distância ao longo da qual o ácido ou base gerada podem se difundir. Em um arranjo com sistemas de detecção de repetição/periódica, “nas proximidades” pode ser definido em termos de distância do sensor/sistema de detecção. A distância de sensor ou distância de sistema de detecção se refere à distância entre dois sensores/sistemas de detecção sucessivos ao longo de uma linha. Em um exemplo, a zona de reação (onde o ácido ou base é gerado) do sistema de detecção pode estar dentro da ½ da distância de sensor do canal condutor do sistema de detecção.

[075] Vários exemplos do sistema de detecção 10A a 10E para detecção de molécula única são revelados na presente invenção, e são mostrados e descritos nas Figuras 2, 3A, 3B, 4, 5, 6A e 6B. Um exemplo dos sistemas de detecção 40A e 40B para sequenciamento de conjunto é mostrado nas Figuras 7C e 7D. Cada exemplo do sistema de detecção 10A a 10E ou 40A-40B pode ser usado com um nucleotídeo marcado. Alguns nucleotídeos marcados são capazes de sofrer clivagem naturalmente após a incorporação da base, e esse exemplo é esquematicamente mostrado na Figura 1A. Alguns outros nucleotídeos marcados incluem um terminador reversível que permite que apenas uma incorporação de base única ocorra em cada ciclo de sequenciamento, e exemplos da estrutura química de parte desses nucleotídeos marcados são mostrados na Figura 1B. Qualquer um desses exemplos também pode incluir o substrato secundário como uma molécula distinta ligada ao açúcar ou base (Figura 1C). Cada um dos nucleotídeos marcados será agora descrito. Nucleotídeos Marcados

[076] Conforme representado na Figura 1A, o nucleotídeo marcado 12 inclui um nucleotídeo 14, uma molécula de ligação 16 ligada a um grupo fosfato terminal do nucleotídeo 14 e um marcador 18 ligado à molécula de ligação 16. O nucleotídeo marcado 12 pode ser considerado um nucleotídeo não natural ou sintético devido ao fato de que é estrutural ou quimicamente distinto de um nucleotídeo natural.

[077] O nucleotídeo 14 do nucleotídeo marcado 12 pode ser um nucleotídeo natural. Nucleotídeos naturais incluem uma base heterocíclica contendo nitrogênio (ou base nitrogenada), um açúcar, e um ou mais grupos fosfato. Exemplos de nucleotídeos naturais incluem, por exemplo, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Em um ribonucleotídeo, o açúcar é uma ribose e, em um desoxirribonucleotídeo, o açúcar é uma desoxirribose

(isto é, um açúcar que carece de um grupo hidroxila que está presente na posição 2’ na ribose). Em um exemplo, o nucleotídeo 14 está na forma de polifosfato devido ao fato de que inclui vários grupos fosfato (por exemplo, tri-fosfato (isto é, gama-fosfato), tetra-fosfato, penta-fosfato, hexa-fosfato, etc.). A base heterocíclica pode ser uma base de purina ou uma base de pirimidina ou qualquer outro análogo de nucleobase. Bases de purina incluem adenina (A) e guanina (G), e derivados ou análogos modificados dos mesmos. As bases de pirimidina incluem citosina (C), timina (T) e uracila (U), e derivados ou análogos modificados dos mesmos. O átomo C-1 de desoxirribose é unido a N-1 de uma pirimidina ou N-9 de uma purina.

[078] O nucleotídeo marcado 12 também inclui a molécula de ligação 16. A molécula de ligação 16 pode ser qualquer molécula de cadeia longa que pode quimicamente se unir, em uma extremidade, ao(s) grupo(s) fosfato do nucleotídeo 14 e que pode quimicamente se unir, na outra extremidade, ao marcador 18. Em alguns casos, a molécula de ligação 16 também pode ser selecionada de modo que não interaja com a polimerase 28 (consulte, por exemplo, as Figuras 2, 3A, 4, 5, 6A e 6B). Em outros casos, a molécula de ligação 16 também pode ser selecionada de modo a interagir fracamente com a polimerase 28, visto que essa fraca interação pode ajudar a guiar o marcador 18 nas proximidades do canal condutor. A molécula de ligação 16 pode ser selecionada de modo que seja longa o suficiente para permitir que o marcador 18 se associe com uma porção que altera o pH e/ou um substrato secundário 34 (consulte, por exemplo, a Figura 2) enquanto, por exemplo, o nucleotídeo 14 é retido pela polimerase 28 durante um evento de incorporação.

[079] Como exemplos, a molécula de ligação 16 pode incluir uma cadeia alquila, uma cadeia poli(etilenoglicol), um grupo amido, um grupo fosfato, um heterociclo como um triazol, nucleotídeos, ou combinações dos mesmos.

Exemplos da cadeia alquila podem incluir pelo menos 6 átomos de carbono e exemplos da cadeia poli(etilenoglicol) podem incluir pelo menos 3 unidades de etilenoglicol.

[080] O seguinte exemplo ilustra um exemplo do nucleotídeo marcado 12, em que a molécula de ligação 16 compreende uma cadeia alquila, um grupo amida, uma cadeia poli(etilenoglicol) e um triazol: .

[081] O seguinte exemplo ilustra um outro exemplo do nucleotídeo marcado 12, em que a molécula de ligação 16 compreende cadeias alquila, um grupo amida, cadeias poli(etilenoglicol), um triazol e um grupo fosfato: .

[082] O seguinte exemplo ilustra ainda um outro exemplo do nucleotídeo marcado 12, em que a molécula de ligação 16 compreende cadeias alquila, grupos amida, cadeias poli(etilenoglicol), um triazol e um grupo fosfato: .

[083] O seguinte exemplo ilustra um exemplo adicional do nucleotídeo marcado 12, em que a molécula de ligação 16 compreende cadeias alquila, um grupo amida, cadeias poli(etilenoglicol), um triazol, um grupo fosfato e uma cadeia polinucleotídica: .

[084] Embora vários exemplos de moléculas de ligação 16 tenham sido descritas, deve-se compreender que outras moléculas de ligação 16 podem ser usadas. A seleção da molécula de ligação 16 dependerá, em parte, do marcador 18 que deve ser ligado ao nucleotídeo 14. Ademais, o comprimento da molécula de ligação 16 pode ser selecionado de modo que, quando um respectivo nucleotídeo 14 é retido por uma polimerase de um sistema de detecção individual, o respectivo marcador 18 pode participar na reação de geração de ácido ou base na superfície do canal condutor 26 (consulte, por exemplo, a Figura 2).

[085] Em cada exemplo de nucleotídeo marcado 12, o marcador 18 é ligado (através da molécula de ligação 16) à extremidade de fosfato terminal do nucleotídeo 14. A fixação na extremidade de fosfato terminal pode ser desejável em algumas técnicas de sequenciamento devido ao fato de que, após a incorporação de base de nucleotídeo, a união entre o alfa-fosfato e a molécula de ligação 16 ou entre o alfa-fosfato e o beta-fosfato é naturalmente clivada. Essa clivagem natural permite que o marcador 18 (e a molécula de ligação 16) se dissocie da base de nucleotídeo incorporada e se difunda do sistema de detecção

10A a 10E, de modo que um outro nucleotídeo marcado 12 possa se associar com a polimerase 28 do sistema de detecção 10A a 10E e de modo que uma base anteriormente incorporada não crie sinais duradouros que interfiram na detecção da próxima base incorporada.

[086] O marcador 18 que é incluído no nucleotídeo marcado 12 pode depender, em parte, do sistema de detecção 10A a 10E ou 40A a 40B que deve ser usado com o nucleotídeo marcado 12. Diferentes marcadores 18 serão descritos adicionalmente em referência a cada um dos sistemas de detecção 10A a 10E e 40A a 40B.

[087] Conforme representado na Figura 1B, cada um dos nucleotídeos marcados 12A, 12B, 12C inclui um nucleotídeo 14’ que tem um grupo de bloqueio 3’-OH 38A, 38B, 38C, a molécula de ligação clivável 16’ ligada a uma base ou um açúcar do nucleotídeo 14’, e um marcador 18 ligado à molécula de ligação 16’.

[088] O nucleotídeo 14’ pode ser qualquer um dos exemplos apresentados para o nucleotídeo 14. Nos exemplos revelados na presente invenção, o nucleotídeo 14’ tem um grupo de bloqueio 3’-OH 38A, 38B, 38C ligado a isso. O grupo de bloqueio 3’-OH 38A, 38B, 38C pode ser ligado a um átomo de oxigênio da molécula de açúcar no nucleotídeo 14’. O grupo de bloqueio 3’-OH 38A, 38B, 38C pode ser um terminador reversível que permite que apenas uma incorporação de base única ocorra em cada ciclo de sequenciamento. O terminador reversível impede que bases adicionais sejam incorporadas em uma fita nascente que é complementar a uma cadeia polinucleotídica modelo. Isso permite a detecção e identificação de uma única base incorporada. O grupo de bloqueio 3’-OH 38A, 38B, 38C pode ser subsequentemente removido, permitindo que ocorram ciclos de sequenciamento em cada cadeia polinucleotídica modelo. Exemplos de diferentes grupos de bloqueio 3’-OH 38A,

38B, 38C são mostrados na Figura 1B, que inclui um terminador reversível 3ʹ- ONH2 (mostrado em 38A), um terminador reversível 3ʹ-O-alil (—CH=CHCH2, mostrado em 38B), e terminador reversível 3ʹ-O-azidometil (—CH2N3, mostrado em 38C). Outros terminadores reversíveis adequados incluem o-nitrobenzil éteres, carbonato de alquil o-nitrobenzila, porções éster, outras -porções alílicas, acetais (por exemplo, terc-butoxi-etoxi), porções MOM (—CH2OCH3), 2,4- dinitrobenzeno sulfenil, tetraidrofuranil éter, 3' fosfato, éteres, -F, - H2, -OCH3, - N3, -HCOCH3 e carbonato de 2-nitrobenzeno.

[089] Nos exemplos mostrados na Figura 1B, uma molécula de ligação 16’ é ligada à base (por exemplo, a base de purina ou a base de pirimidina) do nucleotídeo 14’. Em alguns exemplos, a molécula de ligação 16’ inclui um sítio de clivagem, identificado pela seta 42 na Figura 1B. Alguns exemplos de moléculas de ligação adequadas 16’ são mostrados na Figura 1B, embora deva ser compreendido que pode ser usado qualquer ligante de clivagem adequado que pode ligar o marcador 18 à base ou ao açúcar do nucleotídeo 14’.

[090] O marcador 18 que é incluído no nucleotídeo marcado 12A, 12B, 12C pode depender, em parte, do sistema de detecção 10A a 10E ou 40A a 40B que deve ser usado com o nucleotídeo marcado 12A, 12B, 12C. Diferentes marcadores 18 serão descritos adicionalmente em referência a cada um dos sistemas de detecção 10A-10E e 40A-40B.

[091] Ainda um outro exemplo do nucleotídeo marcado 12’ é mostrado na Figura 1C. Conforme representado na Figura 1C, o nucleotídeo marcado 12’ inclui um nucleotídeo 14 e um substrato secundário 34 ligado a uma base ou um açúcar do nucleotídeo 14. Qualquer um dos nucleotídeos 14 ou 14’ pode ser usado nesse caso. O substrato secundário 34 pode ser ligado diretamente à base ou ao açúcar do nucleotídeo 14 ou 14’. Em um exemplo, o substrato secundário 34 pode ser ligado diretamente a um átomo de carbono ou um átomo de nitrogênio da base do nucleotídeo 14 ou 14’. Em um outro exemplo, o substrato secundário 34 pode ser ligado diretamente a um átomo de oxigênio ou um átomo de carbono da molécula de açúcar do nucleotídeo 14 ou 14’. Se o substrato secundário 34 é ligado ao grupo 3’-OH do nucleotídeo 14 conforme mostrado na Figura 1C, isso irá bloquear adicionalmente a incorporação da próxima base (similar aos nucleotídeos marcados 12A a 12C). Esse posicionamento na molécula de açúcar pode ser desejável, devido ao fato de que força o consumo do substrato secundário 34 antes do próximo evento de incorporação e não exige um agente de desbloqueio separado a fim de remover o grupo de bloqueio. Se o nucleotídeo 14’ é usado (que inclui um grupo 3’-OH de bloqueio 38A, 38B, 38C), o substrato secundário 34 pode ser ligado diretamente à posição 2’ da molécula de açúcar do nucleotídeo 14’. Alternativamente, o substrato secundário 34 pode ser ligado indiretamente à base ou ao açúcar do nucleotídeo 14 ou 14’, por exemplo, através de uma molécula de ligação. Exemplos de moléculas de ligação adequadas para ligar o substrato secundário 34 à base ou ao açúcar do nucleotídeo 14 ou 14’ incluem uma cadeia de polietilenoglicol, um grupo alquila, biotina/estreptavidina, propargilamino, ou qualquer grupo ligado a uma nucleobase funcionalizada comercialmente disponível.

[092] Nesse exemplo, o nucleotídeo marcado 12’, o substrato secundário 34 é selecionado de modo que a cinética do consumo do substrato secundário 34 seja pelo menos dez (10) vezes mais rápida que a cinética da polimerase 28 que é usada na incorporação da base de nucleotídeo. Dessa forma, o consumo do substrato secundário 34 ocorre mais rápido que o evento de incorporação, e então a mudança de pH pode ser detectada antes de ou enquanto o evento de incorporação ocorre. Em um exemplo, o substrato secundário 34 pode ser um substrato para uma hidrolase, como uma cadeia de poliéster (que pode ser consumida por uma esterase), celulose (que pode ser consumida por celulase),

um peptídeo (que pode ser consumido por uma protease), um amido (que pode ser consumido por uma amilase), etc. Em um outro exemplo, o substrato secundário 34 é uma cadeia de polifosfato adicional. Nesse exemplo, a cadeia de polifosfato adicional não é bloqueada, e sua reatividade será dependente de uma concentração local mais elevada quando o nucleotídeo 12’ é reagido pela polimerase 28. Também nesse exemplo, o fosfato terminal do nucleotídeo 14 ou 14’ pode incluir um grupo de bloqueio de modo que a cadeia de polifosfato do nucleotídeo 14 ou 14’ não se envolva na reação de geração de ácido ou base. Detecção de Molécula Única

[093] Agora com referência às Figuras 2, 3A, 3B, 4, 5, 6A e 6B, cada um dos sistemas de detecção 10A a 10E pode ser usado na detecção de molécula única. Cada um dos sistemas inclui um sensor de pH 20, que inclui dois eletrodos 22, 24 e um canal condutor 26 conectando os dois eletrodos 22, 24.

[094] Cada sensor de pH 20 pode ser um transistor de efeito de campo (FET). No FET, os eletrodos 22, 24 são terminais de fonte e dreno e o canal condutor 26 é o terminal de porta. O transistor de efeito de campo pode ser p- canal ou n-canal, que afeta a polaridade da resposta, mas não o princípio da detecção. FETs sensíveis a íon (ISFETs), FETs de porta de junção (JFETs), FETs de metal semicondutor (MESFETs), FETs de óxido de metal semicondutor (MOSFETs), ou dispositivos de efeito de campo sem junção são todos detectores adequados nos exemplos revelados na presente invenção.

[095] Os eletrodos 22, 24 podem compreender qualquer material condutor adequado. Exemplos de materiais de fonte e dreno adequados incluem cobalto, siliceto de cobalto, níquel, siliceto de níquel, alumínio, tungstênio, cobre, titânio, molibdênio, óxido de índio e estanho (ITO), óxido de índio e zinco, ouro, platina, carbono, etc.

[096] O canal condutor 26 pode incluir qualquer material eletricamente condutor ou semicondutor e sensível ao pH. Em um exemplo, o canal condutor 26 é um canal eletricamente condutor. Em um exemplo, o material eletricamente condutor ou semicondutor e sensível ao pH tem a capacidade de captar íons carregados em sua superfície. Em um outro exemplo, o material eletricamente condutor ou semicondutor e sensível ao pH inclui grupos de superfície, ou é revestido com um outro material que inclui grupos de superfície que têm a capacidade de ser submetido à protonação e/ou desprotonação em resposta a íons carregados gerados pela reação do substrato secundário 34 com a porção de alteração de pH. O material eletricamente condutor ou semicondutor e sensível ao pH pode compreender um material orgânico, um material inorgânico, ou ambos.

[097] Em alguns exemplos, o material eletricamente condutor ou semicondutor e sensível ao pH pode incluir um material semicondutor, como silício, que tem a capacidade de detectar carga. O material semicondutor e sensível ao pH também pode ter uma porta dielétrica em pelo menos uma porção de sua superfície. Em alguns exemplos, a porta dielétrica pode circundar a totalidade da superfície externa do material semicondutor e sensível ao pH (exceto nos pontos de contato com os eletrodos 22, 24) e, em outros exemplos, a porta dielétrica pode ser posicionada em uma porção da superfície externa do material semicondutor e sensível ao pH. Em um exemplo, a porta dielétrica serve para evitar vazamento de corrente no ambiente circundante (por exemplo, fluido), e também pode fornecer os grupos de superfície que têm a capacidade de ser submetidos à protonação e/ou desprotonação. Exemplos da porta dielétrica incluem dióxido de silício (SiO2), oxinitreto de silício (SiON), nitreto de silício (Si3N4), pentóxido de tântalo (Ta2O5), óxido de háfnio (HfO2), óxido de zircônio (ZrO2), óxido de alumínio (Al2O3), silicatos de háfnio ou zircônio (HfSiO4, ZrSiO4), etc. Os grupos de superfície podem ser grupos silanol (Si-OH), grupos Si-

NH2, grupos carboxila, (-COOH) ou hidroxila (-OH).

[098] Em outros exemplos, o material eletricamente condutor ou semicondutor e sensível ao pH pode incluir um material de carbono (por exemplo, nanotubos de carbono, carbono vítreo, grafeno) sem uma porta dielétrica. Esses materiais eletricamente condutores ou semicondutores e sensíveis ao pH podem incluir grupos carboxila (-COOH), grupos hidroxila (-OH) ou outra funcionalidade de superfície que responde ao pH ou permite que grupos funcionais sensíveis ao pH sejam ligados.

[099] Ainda em outros exemplos, o material eletricamente condutor ou semicondutor e sensível ao pH pode ser uma biomolécula. Exemplos de biomoléculas adequadas incluem peptídeos e ácidos desoxirribonucleicos. Esses materiais podem ter um pKa baixo no pH gerado como resultado da reação de geração de ácido ou base e, portanto, também podem incluir um modulador de condutividade que tem um pKa quase neutro. Por exemplo, a condutividade dos peptídeos pode ser modulada por aminoácidos sensíveis ao pH (histidina, etc.). Para outro exemplo, a condutividade do DNA pode ser modulada com um intercalador responsivo ao pH, como a doxorrubicina (pKa ~ 8) e seus análogos.

[0100] Nos sistemas de detecção de molécula única 10A a 10E, o canal condutor 26 pode ter qualquer geometria adequada, como uma estrutura tubular, uma estrutura de arame, uma estrutura plana, etc. Em alguns exemplos, o canal condutor 26 também pode ser uma nanoestrutura que tem pelo menos uma dimensão na nanoescala (variando de 1 nm a menos de 1 µm). Em um exemplo, essa dimensão se refere à maior dimensão. Em um exemplo, o canal condutor 26 do sensor de pH é selecionado a partir do grupo que consiste em uma nanoestrutura semicondutora, uma nanoestrutura de grafeno, uma nanoestrutura metálica e uma nanoestrutura polimérica condutora. A nanoestrutura pode ser um nanotubo de parede única ou múltipla, um nanofio,

um nanofita, etc.

[0101] Cada um dos sistemas de detecção 10A a 10E adequado para uso com detecção de molécula única inclui uma polimerase 28 ligada à superfície do canal condutor 26. Em alguns exemplos, a polimerase 28 sozinha é ligada ao canal condutor 26 (consulte, por exemplo, a Figura 2) e, em outros exemplos, a polimerase 28 é parte de um complexo 30A a 30D (consulte, por exemplo, as Figuras 3A, 3B, 4, 5, 6A e 6B) que inclui um outro componente ligado à polimerase

28.

[0102] Deve-se compreender que a polimerase 28 tem a capacidade de reter uma cadeia polinucleotídica modelo, e de incorporar um nucleotídeo (de um nucleotídeo marcado 12, 12A, 12B, 12C, ou 12’) po vez a um filamento nascente que está sendo formado ao longo do modelo. Deve-se compreender que a polimerase 28 e suas funções são separadas e distintas da(s) reação(ões) de geração de ácido e base que envolve o substrato secundário 34. Em particular, a polimerase 28 participa de uma reação de geração de ácido separada da(s) reação(ões) de geração de ácido e base que envolve o substrato secundário 34. Por exemplo, a polimerase 28 gera uma pequena quantidade de ácido como resultado de incorporação de base de nucleotídeo (por exemplo, 1 molécula por evento de incorporação), enquanto a(s) reação(ões) de geração de ácido ou base gera centenas, ou milhares, ou mesmo mais prótons ou moléculas de base. O ácido gerado pela polimerase 28 será dominado pela grande quantidade de ácido ou base gerada da reação que envolve o substrato secundário 34. Em alguns casos, a mudança de pH local que resulta das reações de geração de ácido ou base pode afetar a cinética da polimerase 28. Em alguns casos, a mudança de pH pode desativar a atividade de polimerase 28 até que o pH de linha de base seja retomado. Isso pode ser vantajoso para criar um atraso entre eventos de incorporação (por exemplo, quando o nucleotídeo 12 ou 12’ é usado). Outros fatores, como seleção de uma porção que altera o pH, um tampão, mudanças de temperatura durante a incorporação, etc. também podem ser ajustados para adicionalmente acentuar ou neutralizar um efeito particular sobre a cinética da polimerase.

[0103] Com o uso de qualquer um dos sistemas de detecção 10A a 10E, um método para detecção de molécula única inclui introduzir uma cadeia polinucleotídica modelo 44 (consulte, por exemplo, a Figura 2) em um sensor 20 que tem uma polimerase 28 (sozinha ou como parte de um complexo) conectada a um canal condutor 26; introduzir um fluido que inclui um substrato secundário 34 e nucleotídeos marcados 12, 12A, 12B, 12C, ou 12’ no sensor 20, em que um nucleotídeo de um dos nucleotídeos marcados 12, 12A, 12B, 12C ou 12’ se associa com a polimerase 28 e um marcador 18 de um dos nucleotídeos marcados 12, 12A, 12B, 12C ou 12’ participa em uma reação de alteração de pH que envolve o substrato secundário 34 que está nas proximidades do canal condutor 26; e detectar uma resposta do canal condutor 26. Em alguns casos, a mudança da carga detectada será relativa a uma carga de linha de base. Ademais, os diferentes nucleotídeos 12, 12A a 12C, ou 12’ podem ter diferentes taxas de incorporação, que podem afetar, por exemplo, em quanto tempo o ácido ou a base é gerada ou por quanto tempo a reação de geração de ácido ou base é inibida. Isso, por sua vez, irá afetar o nível de pH local e a carga na superfície do canal condutor 26. A taxa de incorporação pode ser usada para distinguir diferentes nucleotídeos.

[0104] Cada dos sistemas de detecção 10A a 10E e quaisquer métodos associados com os sistemas de detecção 10A a 10E serão agora descritos com mais detalhes com referência às figuras individuais em que os mesmos são mostrados. Sistema de Detecção 10A

[0105] Especificamente se referindo à Figura 2, o sistema de detecção 10A inclui o sensor de pH 20 e a polimerase 28 ligada ao canal condutor 26 através de um conector 32.

[0106] Nesse exemplo de sistema de detecção 10A, qualquer polimerase 28 que pode aceitar os nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C (Figura 2), e que pode com sucesso incorporar a base de nucleotídeo à fita nascente 46 ao longo do modelo 44 pode ser usada. Nas técnicas de detecção de molécula única reveladas na presente invenção, é desejável que a polimerase 28 seja altamente processável, de modo que múltiplos eventos de incorporação possam ocorrer. Exemplos de polimerases incluem as polimerases da família A, como Bsu Polimerase, Bst Polimerase, Taq Polimerase, T7 Polimerase e muitas outras; polimerases das famílias B e B2, como a Phi29 polimerase e outras polimerases altamente processáveis (família B2), Pfu Polimerase (família B), KOD Polimerase (família B), 9oN (família B) e muitas outras; polimerases da família C, como Escherichia coli DNA Pol III, e muitas outras, polimerases da família D, como Pyrococcus furiosus DNA Pol II, e muitas outras; polimerases da família X, como DNA Pol µ, DNA Pol β, DNA Pol σ e muitas outras. Em um exemplo, pode ser desejável selecionar uma polimerase 28 que é conhecida por funcionar em pelo menos 2 unidades de pH, que é suficiente para fornecer uma faixa de 100 mV no sinal. Com quatro nucleotídeos diferentes e um estado “desligado”, essa faixa pode envolver a discriminação de alterações de 20 mV, que são detectáveis.

[0107] Nesse sistema de detecção exemplificador 10A, o conector 32 é usado como uma âncora para a polimerase 28. Um exemplo de um conector adequado 32 inclui polietilenoglicol (PEG). No sistema de detecção 10A, o comprimento do conector 32 é suficiente para reter a polimerase 28 próximo o suficiente ao canal 26 de modo que qualquer um dentre o ácido ou base gerada tenha a capacidade de se difundir para o canal 26 antes de ser neutralizada em solução. Em um exemplo, o conector 32 pode ter um comprimento na faixa de cerca de 2 nm a cerca de 200 nm, ou de cerca de 5 nm a cerca de 150 nm, ou de cerca de 10 nm a cerca de 100 nm. Em alguns exemplos, o conector 32 retém a polimerase 28 pelo menos 10 nm distante do canal condutor 26. Isso pode ser desejável, por exemplo, de modo que mudanças conformais à polimerase 28, cargas da polimerase 28, e/ou cargas da cadeia alvo/polinucleotídica modelo retida pela polimerase 28 não interfiram na operação de detecção do sensor de pH 20. Entretanto, deve-se compreender que essa distância mínima exemplificadora (pelo menos 10 nm) pode não ser necessária, por exemplo, quando as mudanças de pH dominam o sinal que é detectado.

[0108] Embora não mostrado, o sistema de detecção 10A também pode incluir um detector para detectar mudanças de tensão e/ou corrente que correspondem à mudança de pH que ocorre em ou próximo à superfície do canal de detecção de pH 26.

[0109] Além disso, embora não mostrado, o sistema de detecção 10A pode ser posicionado em um suporte, como um chip de silício ou um semicondutor complementar de metal-óxido (CMOS). Os eletrodos 22, 24 podem ser conectados a um conjunto de circuitos eletrônicos que permitem sua operação (por exemplo, uma vez associado a um detector e fonte de alimentação).

[0110] Em alguns exemplos, o sensor 10A pode vir pré-montado.

[0111] Em outros exemplos, os componentes de sensor podem fazer parte de um kit, e os componentes de kit podem ser usados para montar o sensor 10A. Um exemplo do kit inclui o sensor de pH 20 no suporte, e uma solução de polimerase separada. A solução de polimerase inclui um veículo líquido e qualquer exemplo da polimerase 28. Em alguns exemplos, a polimerase 28 é ligada ao conector 32 e, em outros exemplos, o conector 32 é ligado ao canal de detecção de pH 26 como parte do sistema de detecção 10A. Como exemplos, o veículo líquido de solução de polimerase pode ser água, ou um fluido tampão de sal iônico, como citrato salino em concentrações milimolar a molar.

[0112] No uso do kit, um usuário pode depositar a solução de polimerase no suporte, e permitir que a solução de polimerase permaneça no suporte durante um tempo adequado para que o conector 32 se ligue ao canal condutor 26, ou para que a polimerase 28 se ligue ao conector 32 no canal condutor 26. O suporte pode ser enxaguado com um tampão adequado para remover qualquer polimerase 28 não ligada.

[0113] Na Figura 2, exemplos do kit também podem incluir um fluido que deve ser usado com o sensor 10A durante a detecção de molécula única. Esse fluido inclui um veículo líquido, nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C e o substrato secundário 34. Em alguns casos, esse fluido também inclui uma cadeia polinucleotídica modelo 44. Em outros casos, uma solução inclui o veículo líquido, os nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C e o substrato secundário 34, e uma outra solução inclui a cadeia polinucleotídica modelo 44.

[0114] A cadeia polinucleotídica modelo 44 pode ser qualquer amostra que deve ser sequenciada, e pode ser composta por DNA, RNA, ou análogos dos mesmos (por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos). A cadeia polinucleotídica modelo 44 pode ser um modelo circular. A fonte da cadeia polinucleotídica modelo (ou alvo) 44 pode ser DNA genômico, RNA mensageiro ou outros ácidos nucléicos de fontes nativas. Em alguns casos, a cadeia polinucleotídica modelo 44 que é derivada de tais fontes pode ser amplificada antes do uso em um método ou sistema revelado na presente invenção. Pode ser usada qualquer uma de uma variedade de técnicas de amplificação conhecidas que inclui, sem limitação, reação da cadeia da polimerase (PCR), amplificação por círculo rolante (RCA), amplificação por deslocamento múltiplo (MDA) ou amplificação de iniciador aleatório (RPA). Deve-se compreender que a amplificação da cadeia polinucleotídica modelo 44 antes do uso no método ou sistema apresentado na presente invenção é opcional. Como tal, a cadeia polinucleotídica modelo 44 não será amplificada antes do uso em alguns exemplos. Cadeias polinucleotídicas modelo/alvo 44 podem opcionalmente ser derivadas de bibliotecas sintéticas. Os ácidos nucleicos sintéticos podem ter composições de DNA ou RNA nativos ou podem ser análogos dos mesmos.

[0115] Os nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C incluem qualquer exemplo do nucleotídeo 14 ou 14’ e da molécula de ligação 16 ou 16’ revelada na presente invenção. O marcador 18 do nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C mostrado na Figura 2 é um marcador de catalisador 18A. Conforme usado na presente invenção, “marcador de catalisador” se refere a uma espécie química que inicia ou acelera uma reação de geração de ácido ou base que envolve o substrato secundário 34. Como tal, o marcador de catalisador 18A é um exemplo de uma porção que altera o pH que está ligada ao nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C. Por exemplo, o marcador de catalisador 18A pode ser uma enzima que reage com o substrato secundário 34 para gerar um ácido, reduzindo assim o pH. Um exemplo específico de um par de geração de ácido inclui acetilcolinesterase como o marcador de catalisador 18A e um substrato de éster (por exemplo, acetilcolina) como o substrato secundário 34. Um outro exemplo específico de um par de geração de ácido inclui anidrase carbônica como o marcador de catalisador 18A e um íon bicarbonato como o substrato secundário

34. Por um outro exemplo, o marcador de catalisador 18A pode ser uma enzima que reage com o substrato secundário 34 para gerar uma base, aumentando assim o pH. Em alguns exemplos, os grupos de superfície na superfície do canal 26 são sensíveis aos íons ácidos ou básicos que são gerados, e podem ser submetidos à protonação ou desprotonação, alterando assim a densidade de carga diretamente na superfície do canal 26. Em outros exemplos, os íons carregados gerados durante as reações de geração de ácido ou de geração de base são captados pelo canal condutor 26.

[0116] O veículo líquido do fluido que pode ser usado com o sensor 10A durante a detecção de molécula única é água ou um fluido de baixo tamponamento (10 mM ou menos) que tem um pH na faixa de cerca de 6 a cerca de 9, ou de cerca de 7 a cerca de 8. O pH do fluido depende da polimerase 28 que é usada e de quaisquer condições que ajudem a maximizar o sinal quando há uma mudança de pH. Devido ao fato de que o marcador de catalisador 18A e o substrato secundário 34 estão ambos presentes no fluido nesse exemplo, alguma reação (ou reações) de geração de ácido ou base pode ocorrer no fluido distante do canal condutor 26. No entanto, os íons gerados nessa(s) reação(ões) podem ser neutralizados no fluido (pelo fluido de baixo tamponamento) e, portanto, podem não resultar em um sinal detectável. Isso evita grandes mudanças globais de pH no fluido. Deve-se compreender, entretanto, que, quando o nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C é retido pela polimerase 28, o marcador de catalisador 18A é retido mais próximo ao canal de detecção de pH 26 (por exemplo, em comparação com quando o nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C está flutuando na solução). Por sua vez, qualquer mudança de pH que resulta de uma reação que envolve o substrato secundário 34 e o marcador de catalisador 18A temporariamente ligado também está mais próxima ao canal de detecção de pH 26. Ademais, a cinética do marcador de catalisador 18A pode ser mais rápida que a cinética da polimerase 28. Por exemplo, a frequência de ciclo da enzima geradora de ácido, acetilcolinesterase, pode ser tão alta quanto

25.000 s-1, enquanto um evento de incorporação pode ocorrer em outro lugar de cerca de 0,1 s-1 a cerca de 100 s-1. Nesse exemplo, o marcador de catalisador 18A pode gerar de cerca de 250 a cerca de 250.000 moléculas de ácido por nucleotídeo que é incorporado (por um evento único de incorporação). Quando o marcador de catalisador 18A e a geração de ácido ou base estão localizadas na superfície do canal condutor 26, um gradiente de pH pode ser gerado ao redor do canal de detecção de pH 26, que pode gerar sinais de carga detectáveis no canal de detecção de pH 26. Esses sinais podem ser registrados.

[0117] Em um exemplo, a concentração de tampão no fluido de baixo tamponamento pode ser inferior a cerca de 10 mM, o que, como descrito na presente invenção, pode evitar mudanças globais de pH, mas pode permitir que mudanças de pH locais perto do canal condutor 16 sejam detectadas. Em alguns casos, a concentração de tampão é significativamente menor que 10 mM, exemplos dos quais incluem cerca de 5 mM, cerca de 2,5, mM, cerca de 2 mM, cerca de 1 mM, cerca de 0,5 mM ou cerca de 0,25 mM. Em outros exemplos, tampões de fase sólida podem ser usados para ajudar a manter um pH global sem tamponamento do ambiente local.

[0118] Em um exemplo do fluido que pode ser usado com o sistema de detecção 10A, quatro diferentes nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C podem ser incluídos. Os quatro nucleotídeos marcados diferentes 12 ou 12A a 12C incluem nucleotídeos 14 ou 14’ distintos (por exemplo, T, A, G ou C) e marcadores de catalisador 18A distintos. Os marcadores de catalisador 18A distintos podem possuir cinéticas diferentes, de modo que o ácido ou base sejam gerados a taxas diferentes, que, por sua vez, irá resultar em diferentes densidades de carga no canal 26. Devido ao fato de que os marcadores de catalisador distintos 10A são nucleotídeo-específicas (por exemplo, um marcador específico 18A é selecionado para uma base específica), a resposta do sensor de pH 20 pode ser indicativo da base incorporada do nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C.

[0119] A seguinte descrição se refere a um método exemplificador que envolve os nucleotídeos marcados 12 e o sistema de detecção 10A. Nesse exemplo, a cadeia polinucleotídica modelo 44 pode ser introduzida no sistema de detecção 10A em um fluido, como uma solução biologicamente estável, junto com ou separado dos nucleotídeos marcados 12 e do substrato secundário 34. A polimerase 28 se associa com a cadeia polinucleotídica modelo 44, de modo que a cadeia 44 seja retida no lugar. Uma base complementar de um dos nucleotídeos marcados 12 será incorporada a uma fita nascente 46 (que está sendo formada ao longo da cadeia polinucleotídica modelo 44) pela polimerase 28. Durante o evento de incorporação, o marcador de catalisador 18A do nucleotídeo marcado 12 é colocado nas proximidades do canal 26 e qualquer substrato secundário 34 no fluido que também está nas proximidades do canal 26. Devido ao fato de que a cinética do marcador de catalisador 18A pode ser mais rápida que o evento de incorporação, a reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário 34 ocorre antes de a incorporação da base ser concluída. Os íons carregados da reação de geração de ácido ou base podem ser detectados no canal condutor 26 ou, se grupos de superfície reativos estão presentes, podem reagir com os grupos de superfície para alterar o estado de carga dos grupos de superfície. A carga alterada é detectada pelo sensor de pH 20.

[0120] Nesse método exemplificador, após a incorporação da base de nucleotídeo à fita nascente 46, a união entre o alfa-fosfato e a molécula de ligação 16 ou entre o alfa-fosfato e beta-fosfato é naturalmente clivada. Essa clivagem natural permite que o marcador 18A (e a molécula de ligação 16) se dissociem da base de nucleotídeo incorporada e se difundam do sistema de detecção 10A. A polimerase 28 pode, então, receber um outro nucleotídeo marcado 12 que inclui uma base de nucleotídeo que é complementar ao próximo nucleotídeo na cadeia polinucleotídica modelo 44.

[0121] A seguinte descrição se refere a um método exemplificador que envolve os nucleotídeos marcados 12A a 12C e o sistema de detecção 10A. Nesse exemplo, a cadeia polinucleotídica modelo 44 pode ser introduzida no sistema de detecção 10A em um fluido, como uma solução biologicamente estável, junto com ou separado dos nucleotídeos marcados 12A a 12C e do substrato secundário 34. A polimerase 28 se associa com a cadeia polinucleotídica modelo 44, de modo que a cadeia 44 seja retida no lugar. Uma base complementar de um dos nucleotídeos marcados 12A a 12C será incorporada a uma fita nascente 46 (que está sendo formada ao longo da cadeia polinucleotídica modelo 44) pela polimerase 28. Nesse exemplo, o nucleotídeo marcado 12A a 12C inclui um terminador reversível. Como tal, a incorporação do nucleotídeo marcado 12A a 12C serve como um terminador para polimerização. Isso permite que a geração de ácido ou base e a detecção de carga ocorram de maneira similar conforme descrito acima.

[0122] Nesse método exemplificador, após a incorporação da base de nucleotídeo à fita nascente 46, o fluido, que inclui quaisquer nucleotídeos não incorporados, pode ser removido do sistema de detecção 10A. Isso pode ser realizado com o uso de uma solução de lavagem (por exemplo, água). Um agente de desbloqueio pode, então, ser introduzido no sistema de detecção 10A. O agente de desbloqueio pode ter a capacidade de i) clivar quaisquer moléculas de ligação cliváveis 16’ do nucleotídeo marcado incorporado 12A a 12C (que também remove o marcador de catalisador 18A) e ii) remover o grupo de bloqueio 3’-OH 38A, 38B, 38C (consulte a Figura 1B) do nucleotídeo marcado incorporado 12A a 12C. A remoção a partir do grupo de bloqueio 3’-OH 38A, 38B, 38C permite que o ciclo de sequenciamento subsequente seja realizado. Exemplos de grupos de bloqueio 3’-OH e agentes de desbloqueio adequados incluem: o-nitrobenzil éteres e carbonato de alquil o-nitrobenzila que podem ser removidos fotoliticamente; porções de éster que podem ser removidas por hidrólise de base; alil-porções que podem ser removidas com Nal, clorotrimetilsilano e Na2S2O3 ou com Hg(II) em acetona/água; azidometil que pode ser clivado com fosfinas, como tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) ou tri(hidroxipropil)fosfina (THP); acetais, como terc-butoxi-etoxi que podem ser clivados com condições ácidas; porções de MOM (—CH2OCH3) que podem ser clivadas com LiBF4 e CH3CN/H2O; 2,4-dinitrobenzenossulfenil que pode ser clivado com nucleófilos como tiofenol e tiossulfato; tetraidrofuranil éter que pode ser clivado com Ag(I) ou Hg(II); e 3'-fosfatos que podem ser clivado por enzimas fosfatase (por exemplo, quinase de polinucleotídeo). Outras porções reversíveis úteis incluem éteres, -F, -H2, -OCH3, -N3, -HCOCH3, e 2-nitrobenzeno carbonato, e tratamentos de desbloqueio úteis incluem irradiação com luz (por exemplo, para induzir fotoclivagem), aquecimento, exposição a reagentes químicos, exposição a catalisadores, exposição à corrente elétrica (por exemplo, para induzir eletrólise), ou similares. Sistema de Detecção 10B

[0123] Especificamente se referindo às Figuras 3A e 3B, o sistema de detecção 10B inclui o sensor de pH 20 e um complexo 30A ligado ao canal condutor 26 do sensor de pH 20.

[0124] O complexo 30A inclui a polimerase 28 ligada a uma porção que altera o pH (mostrado nesses exemplos como 50A, 50B ou 50C) que serve para participar na geração de uma mudança de pH nas proximidades do canal condutor 26 a partir do consumo de um substrato secundário 34 em um fluido que é exposto ao sensor de pH 20.

[0125] A polimerase 28 do complexo 30A pode ser qualquer exemplo da polimerase descrita em referência à Figura 2.

[0126] Nesse exemplo, a porção de alteração de pH é selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima 50A, um cofator 50B e um ativador 50C.

[0127] A enzima 50A gera um ácido ou base em uma reação com o substrato secundário 34. Como exemplos, a enzima 50A pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em hidrolases e oxidases. Exemplos de hidrolases adequadas incluem fosfatases, esterases (por exemplo, acetilcolinesterase), proteases específicas de sequência (por exemplo, TEV protease ou trombina), e glicosidases (que não degradam a ribose, como celulose ou amilase). Uma outra hidrolase adequada é anidrase carbônica. Exemplos de oxidases adequadas incluem glicose oxidase, monoamina oxidase, xantina oxidase, etc. Embora vários exemplos tenham sido fornecidos, acredita-se que qualquer enzima disponível 50A ou enzima manipulada 50A possa ser usada, desde que a cinética de enzima seja mais rápida que a cinética de polimerase.

[0128] O cofator 50B é uma substância cuja presença é essencial para a atividade de uma enzima que gera um ácido ou base em uma reação com o substrato secundário 34. Alguns exemplos de cofatores adequados 50B para oxidases incluem dinucleotídeo de flavina-adenina (FAD), dinucleotídeo de nicotina-adenina (NAD), dinucleotídeo de nicotina-adenina fosfato (NADP), etc.

[0129] O ativador 50C é uma substância que inicia ou estimula a reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário 34. Em alguns casos, o ativador 50C funciona de modo similar ao cofator 50B e, dessa forma, quaisquer exemplos do cofator 50B podem ser usados para o ativador 50C. Para hidrolases dependentes de metal, exemplos de ativadores adequados 50C incluem metais divalentes.

[0130] No complexo 30A, a polimerase 28 e qualquer exemplo da porção de alteração de pH 50A a 50C são conjugados em conjunto. Em um exemplo, esse complexo 30A é uma proteína de fusão ou uma quimera proteica. O complexo 30A pode ser formado com o uso de métodos de conjugação, tal como uma reação de acoplamento spytag-spycatcher, uma conjugação de cisteína mediada por π-clamp, biotina/estreptavidina, uma proteína SUMO (pequeno modificador similar à ubiquitina), quelação His6/NTA com o metal, cisteína/maleimida,

dibenzociclo-octina (DBCO)/azida ou qualquer outro método de conjugação adequado.

[0131] O complexo 30A pode ser ligado ao canal condutor 26 através de um conector 32, exemplos dos quais estão descritos em referência à Figura 2. Alternativamente, o complexo 30A pode ser diretamente ligado através de união entre a porção de alteração de pH 50A a 50C e grupos na superfície do canal condutor 26.

[0132] Embora não mostrado, o sistema de detecção 10B também pode incluir um detector para detectar mudanças de tensão e/ou corrente que correspondem à mudança de pH que ocorre em ou próximo à superfície do canal de detecção de pH 26.

[0133] Além disso, embora não mostrado, o sistema de detecção 10B pode ser posicionado em um suporte, como um chip de silício. Os eletrodos 22, 24 podem ser conectados a um conjunto de circuitos eletrônicos que permitem sua operação (por exemplo, uma vez associado a um detector e fonte de alimentação).

[0134] Em alguns exemplos, o sensor 10B pode vir pré-montado.

[0135] Em outros exemplos, os componentes de sensor podem fazer parte de um kit, e os componentes de kit podem ser usados para montar o sensor 10B. Um exemplo do kit inclui o sensor de pH 20 no suporte, e um fluido que é usado para introduzir o complexo 30A no sensor de pH 20. O fluido inclui um veículo líquido e o complexo 30A. Em alguns exemplos, o complexo 30A no fluido é ligado ao conector 32. Em outros exemplos, o conector 32 é ligado ao canal de detecção de pH 26 como parte do sistema de detecção 10B. Em ainda outros exemplos em que existe uma união direta formada entre a porção de alteração de pH 50A a 50C e os grupos de superfície do canal 26, deve-se compreender que o complexo 30A no fluido não é ligado ao conector 32, e o conector 32 não é ligado ao canal de detecção de pH 26. Em um exemplo, o veículo líquido é água ou um exemplo do fluido de baixo tamponamento, como citrato salino a concentrações milimolares.

[0136] Em um exemplo desse kit, o complexo 30A no veículo líquido inclui a polimerase 28 ligada a pelo menos uma enzima 50A. Em um outro exemplo desse kit, o complexo 30A no veículo líquido inclui a polimerase 28 conjugada ao cofator 50B. Em ainda um outro exemplo desse kit, o complexo 30A no veículo líquido inclui a polimerase 28 conjugada ao ativador 50C. Em cada um desses exemplos, o complexo 30A também pode incluir o conector 32. Durante o uso desses exemplos do kit, um usuário pode depositar o fluido no suporte, e permitir que o fluido permaneça no suporte por um tempo adequado para que o conector 32 ligue o complexo 30A ao canal condutor 26, para que o complexo 30A se ligue a um conector 32 no canal 26 ou para que a porção de alteração de pH 50A-50C se una aos grupos de superfície do canal 26. O suporte pode ser enxaguado com um tampão adequado para remover quaisquer complexos não ligados 30A.

[0137] Alguns exemplos do kit também podem incluir fluido(s) que deve(m) ser usado(s) com o sistema de detecção 10B durante a detecção de molécula única. O conteúdo do(s) fluido(s) pode(m) variar, dependendo de qual porção de alteração de pH 50A a 50C é parte do complexo 30A do sistema de detecção 10B e quais nucleotídeos marcados 12, 12A a 12C ou 12’ são usados. Vários exemplos desse fluido (ou fluidos) serão agora descritos.

[0138] Nos exemplos mostrados na Figura 3A, o(s) fluido(s) a ser(em) usado(s) durante sequenciamento de molécula única incluem qualquer exemplo do veículo líquido revelado na presente invenção, os nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C, e o substrato secundário 34 (que, nesses exemplos, é uma molécula separada dos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C).

[0139] O marcador 18B ou 18C que é ligado aos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C irá depender de qual porção de alteração de pH está incluída no complexo 30A.

[0140] Quando o sistema de detecção 10B inclui a enzima 50A como parte do complexo 30A, o marcador 18B é usado. Conforme mencionado na presente invenção, a enzima 50A gera um ácido ou base em uma reação com o substrato secundário 34 quando os dois estão próximos entre si. Para correlacionar a reação de geração de ácido ou base entre a enzima 50A e o substrato secundário 34 com o nucleotídeo marcado incorporado 12 ou 12A a 12C, o marcador 18B nos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C pode ser adaptado para acentuar a cinética da enzima 50A ou reduzir a cinética da enzima 50A. Como tal, o marcador 18B é um exemplo de uma porção que altera o pH que é ligada ao nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C. Esse exemplo do sistema 10B dessa forma inclui dois diferentes exemplos da porção de alteração de pH. Dessa forma, em um exemplo, o marcador 18B é selecionada a partir do grupo que consiste em um primeiro grupo que acentua a cinética da enzima 50A e um seguna partir do grupo que reduz a cinética da enzima 50A.

[0141] Quando o marcador 18B acentua a cinética da enzima 50A, isso também acentua (por exemplo, inicia ou acelera) a cinética da reação de geração de ácido ou base que envolve a enzima 50A e o substrato secundário 34. Exemplos de marcadores 18B que acentuam a cinética da enzima 50A incluem cofatores da enzima. Exemplos de outros marcadores 18B que acentuam a cinética da enzima 50A incluem aquelas que têm um efeito de aglomeração. Esse tipo de marcador 18B pode ser uma grande agente de aglomeração que pode reduzir o volume de água disponível para outras moléculas e aumentar de maneira eficaz a concentração local do substrato secundário 34 (que, por sua vez, aumenta a velocidade da reação).

[0142] Em contrapartida, quando o marcador 18B reduz a cinética da enzima 50A, isso também reduz a cinética da reação de geração de ácido ou base que envolve a enzima 50A e o substrato secundário 34. Exemplos de marcadores 18B que reduzem a cinética da enzima 50A podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em um inibidor alostérico, um grupo de exclusão estérico e um grupo de tamponamento. Um inibidor alostérico se liga a um sítio alostérico da enzima 50A e altera a conformação de um sítio ativo da enzima 50A. Como resultado, a enzima 50A já não tem a capacidade de reagir com o substrato secundário 34 e se torna inativa. Pode ser desejável que a ligação entre o inibidor alostérico e a enzima 50A seja mais fraca que a ligação entre a polimerase 28 e a base do nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C de modo que nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C não sejam ligados apenas pelo marcador 18B. Um grupo de exclusão estérico pode ser uma molécula que é mais volumosa que o substrato secundário 34. O grupo de exclusão estérico de um nucleotídeo marcado incorporado pode impedir que o substrato secundário 34 se aproxime o suficiente da enzima 50A para reação. Em outras palavras, o grupo de exclusão estérico pode reduzir o acesso à enzima 50A sem realmente se ligar à enzima 50A. Um grupo de tamponamento pode atuar como um tampão local para absorver os prótons gerados durante uma reação de geração de ácido ou as moléculas de base geradas durante uma reação de geração de base e, assim, neutralizar o pH. Como um exemplo, dendrímeros que têm múltiplos grupos de ácido ou base podem servir para tamponar a vizinhança local do canal condutor

26.

[0143] Em um exemplo, os marcadores 18B que são ligados aos diferentes nucleotídeos 12 ou 12A-12C (por exemplo, A, T, C, G) podem ser selecionadas para aumentar ou diminuir a geração de ácido ou base a diferentes taxas. Nesse exemplo, quando um dos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C está sendo incorporado pela polimerase 28, o marcador 18B é colocado nas proximidades da enzima 50A e do substrato secundário 34, e acentua ou reduz a reação a uma taxa dependente de marcador único. Por sua vez, o pH no canal condutor 26 é alterado. A mudança no pH está relacionada à geração de ácido ou base aumentada ou diminuída e, dessa forma, pode ser usada para identificar o nucleotídeo marcado incorporado 12 ou 12A a 12C.

[0144] Quando o sistema de detecção 10B inclui o cofator 50B ou o ativador 50C como parte do complexo 30A, o marcador 18C é usado. O marcador 18C pode ser a enzima que gera um ácido ou base em uma reação com o substrato secundário 34. Como tal, o marcador 18C é um exemplo de uma porção que altera o pH que é ligada ao nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C. Esse exemplo do sistema 10B dessa forma inclui dois diferentes exemplos da porção de alteração de pH. Quando o nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C é incorporado pela polimerase 28, o marcador de enzima 18C é colocado nas proximidades do cofator 50B ou do ativador 50C e o substrato secundário 34. O cofator 50B ou o ativador 50C ligado pode acentuar ou iniciar a reação entre o marcador de enzima 18C e o substrato secundário 34 no fluido.

[0145] Devido ao fato de que os nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C não incluem o substrato secundário 34, o(s) fluido(s) representado(s) no exemplo da Figura 3A também inclui o substrato secundário 34. O substrato secundário 34 pode ser qualquer substrato secundário 34 que possa reagir com a enzima 50A para gerar um ácido ou base, ou cuja reação com o marcador de enzima 18C pode ser acentuada ou iniciada pelo cofator 50B ou pelo ativador 50C.

[0146] A seguinte descrição se refere a um método exemplificador que envolve os nucleotídeos marcados 12 e o sistema de detecção 10B. Nesse exemplo, a cadeia polinucleotídica modelo 44 pode ser introduzida no sistema de detecção 10B em um fluido, como uma solução biologicamente estável, junto com ou separado dos nucleotídeos marcados 12 e do substrato secundário 34. A polimerase 28 se associa com a cadeia polinucleotídica modelo 44, de modo que a cadeia 44 seja retida no lugar. Uma base complementar de um dos nucleotídeos marcados 12 será incorporada a uma fita nascente 46 (que está sendo formada ao longo da cadeia polinucleotídica modelo 44) pela polimerase 28. Durante o evento de incorporação, o marcador 18B ou 18C do nucleotídeo marcado 12 é colocado nas proximidades do canal 26, a porção de alteração de pH 50A a 50C, e qualquer substrato secundário 34 no fluido que também está nas proximidades da porção de alteração de pH 50A a 50C. A reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário 34 pode ser acentuada, reduzida ou inibida dependendo do complexo 30A e marcadores 18B ou 18C que são usados, que altera o pH do fluido, e a carga, na superfície do canal 26. Nesse método exemplificador, após a incorporação da base de nucleotídeo à fita nascente 46, a união entre o alfa-fosfato e a molécula de ligação 16 ou entre o alfa-fosfato e beta-fosfato é naturalmente clivada. Essa clivagem natural permite que o marcador 18B ou 18C (e a molécula de ligação 16) se dissociem da base de nucleotídeo incorporada e se difundam do sistema de detecção 10B. A polimerase 28 pode, então, receber um outro nucleotídeo marcado 12 que inclui uma base de nucleotídeo que é complementar ao próximo nucleotídeo na cadeia polinucleotídica modelo 44.

[0147] A seguinte descrição se refere a um método exemplificador que envolve os nucleotídeos marcados 12A a 12C e o sistema de detecção 10B. Nesse exemplo, a cadeia polinucleotídica modelo 44 pode ser introduzida no sistema de detecção 10B em um fluido, como uma solução biologicamente estável, junto com ou separado dos nucleotídeos marcados 12A a 12C e do substrato secundário 34. A polimerase 28 se associa com a cadeia polinucleotídica modelo 44, de modo que a cadeia 44 seja retida no lugar. Uma base complementar de um dos nucleotídeos marcados 12A a 12C será incorporada a uma fita nascente 46 (que está sendo formada ao longo da cadeia polinucleotídica modelo 44) pela polimerase 28. A reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário 34 pode ser acentuada, reduzida ou inibida dependendo do complexo 30A e marcadores 18B ou 18C que são usados, que altera o pH do fluido, e a carga, na superfície do canal 26. Nesse exemplo, o nucleotídeo marcado 12A a 12C inclui um terminador reversível. Como tal, a incorporação do nucleotídeo marcado 12A a 12C serve como um terminador para polimerização. Isso permite que a geração de ácido ou base e detecção de carga acentuada, reduzida ou inibida ocorram de maneira similar conforme descrito acima. Nesse método exemplificador, a lavagem e a exposição a um agente de desbloqueio podem ser usados para preparar o sistema de detecção 10B para um outro ciclo de sequenciamento.

[0148] Em qualquer um dos exemplos descritos em referência à Figura 3A, deve-se compreender que a distância entre a polimerase 28 e a porção de alteração de pH 50A a 50C e o comprimento da molécula de ligação 16, 16’ pode ser selecionada de modo que o marcador 18B ou 18C seja colocado nas proximidades da porção de alteração de pH 50A a 50C quando seu nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C está sendo incorporado pela polimerase 28. Isso permite efeitos previsíveis sobre a reação de geração de ácido ou base.

[0149] Conforme mencionado na presente invenção, o sistema de detecção 10B também pode ser usado com o nucleotídeo marcado 12’, que, conforme descrito em referência à Figura 1C, inclui o substrato secundário 34 ligado ao nucleotídeo 14. A Figura 3B ilustra o sistema 10B e o nucleotídeo marcado 12’.

[0150] Nesse exemplo, o fluido no kit inclui os nucleotídeos marcados 12’, ao invés dos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C. Diferente dos fluidos descritos em referência à Figura 3A, esse fluido não inclui substrato secundário separado 34 devido ao fato de que o substrato secundário 34 é ligado ao nucleotídeo 14.

[0151] Quando o sistema de detecção 10B inclui a enzima 50A como parte do complexo 30A, o fluido exposto ao sistema 10B pode incluir o veículo líquido e os nucleotídeos marcados 12’. Quando a polimerase 28 incorpora a base dos nucleotídeos marcados 12’, o substrato secundário 34 é colocado nas proximidades da enzima 50A, e a reação de geração de ácido ou base pode ocorrer.

[0152] Quando o sistema de detecção 10B inclui o cofator 50B ou o ativador 50C como parte do complexo 30A, o fluido exposto ao sistema 10B pode incluir o veículo líquido e os nucleotídeos marcados 12’. Esse exemplo do kit também pode incluir um fluido de enzima que é separado do fluido contendo os nucleotídeos marcados 12’. O fluido de enzima é incluído devido ao fato de que nem o nucleotídeo marcado 12’ tampouco o complexo 30A contêm a enzima que participa na reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário 34. O fluido de enzima pode incluir um veículo líquido (por exemplo, qualquer um dos tampões revelados na presente invenção) e uma enzima 54 que serve para participar no consumo do substrato secundário 34. A enzima 54 usada depende do substrato secundário 34 que é ligado ao nucleotídeo marcado 12’.

[0153] Quando o(s) fluido(s) contendo a cadeia polinucleotídica modelo 44 e o nucleotídeo marcado 12’ e, em alguns casos, o fluido de enzima, são introduzidos (sequencial ou simultaneamente) no sistema de detecção 10B, a cadeia polinucleotídica modelo 44 se associa à polimerase 28 e aquele complementar dentre os nucleotídeos marcados 12’ é incorporado à fita nascente crescente 46. Nesse exemplo, a enzima 50A do complexo 30A ou a enzima flutuante livre 54 irá reagir para consumir o substrato secundário 34 para gerar o ácido ou base, e essa reação será mais rápida que a incorporação de nucleotídeo. Nesses exemplos, o substrato secundário 34 é consumido e,

mediante esse consumo, o pH retornará ao nível de linha de base e a base de nucleotídeo será incorporada. Sistema de Detecção 10C

[0154] Especificamente se referindo à Figura 4, o sistema de detecção 10C inclui o sensor de pH 20 e um complexo 30B ligado ao canal condutor 26 do sensor de pH 20.

[0155] O complexo 30B inclui a polimerase 28 ligada a duas enzimas diferentes 50A e 50D. A polimerase 28 do complexo 30A pode ser qualquer exemplo da polimerase descrita em referência à Figura 2.

[0156] As enzimas 50A, 50D podem ser qualquer exemplo da enzima descrita em referência às Figuras 3A e 3B, desde que as duas enzimas 50A, 50D sejam diferentes. Cada uma das enzimas 50A e 50D gera um ácido ou base em uma reação com o substrato secundário 34; entretanto, as enzimas 50A e 50D podem ser selecionadas de modo que tenham uma resposta diferente quando próximas de um marcador de nucleotídeo particular 18D. Como um exemplo, a enzima 50A pode responder aos respectivos marcadores 18D ligados a dois tipos de nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C (por exemplo, A e T), e pode não responder aos respectivos marcadores 18D ligados aos outros dois tipos de nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C (por exemplo, C e G). De maneira oposta, a enzima 50D pode responder aos respectivos marcadores 18D ligados aos outros dois tipos de nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C (por exemplo, C e G), mas pode não responder aos respectivos marcadores 18D ligados aos dois tipos de nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C (por exemplo, A e T). Nesse exemplo, cada marcador 18D respectivamente ligada aos nucleotídeos 12 ou 12A a 12C pode ser diferente de cada outro marcador 18D respectivamente ligada aos outros nucleotídeos 12 ou 12A a 12C.

[0157] No complexo 30B, a polimerase 28 e as duas enzimas diferentes 50A,

50D são conjugados em conjunto. Em um exemplo, esse complexo 30B é uma proteína de fusão ou uma quimera proteica. O complexo 30B pode ser formado com o uso de métodos de conjugação, tal como uma reação de acoplamento spytag-spycatcher, uma conjugação de cisteína mediada por π-clamp, biotina/estreptavidina, uma proteína SUMO (pequeno modificador similar à ubiquitina), quelação His6/NTA com o metal, cisteína/maleimida, dibenzociclo- octina (DBCO)/azida ou qualquer outro método de conjugação adequado.

[0158] Em um exemplo (conforme mostrado na Figura 4), o complexo 30B pode ser ligado ao canal condutor 26 através de conectores 32, 32’ ligados a cada uma das enzimas 50A, 50D. Em um outro exemplo, um único conector 32 pode ligar a polimerase 28 ao canal condutor 26, e as enzimas 50A, 50D podem ser respectivamente ligadas à polimerase 28. Em ainda um outro exemplo, não existem conectores 32, 32’, mas ao invés disso, uma ou ambas as enzimas 50A, 50D podem formar uma união diretamente com os grupos de superfície do canal condutor 26 e com a polimerase 28.

[0159] Embora não mostrado, o sistema de detecção 10C também pode incluir um detector para detectar mudanças de tensão e/ou corrente que correspondem à mudança de pH que ocorre em ou próximo à superfície do canal de detecção de pH 26.

[0160] Além disso, embora não mostrado, o sistema de detecção 10C pode ser posicionado em um suporte, como um chip de silício. Os eletrodos 22, 24 podem ser conectados a um conjunto de circuitos eletrônicos que permitem sua operação (por exemplo, uma vez associado a um detector e fonte de alimentação).

[0161] Em alguns exemplos, o sensor 10C pode vir pré-montado.

[0162] Em outros exemplos, os componentes de sensor podem fazer parte de um kit, e os componentes de kit podem ser usados para montar o sensor 10C.

Um exemplo do kit inclui o sensor de pH 20 no suporte, e um fluido que é usado para introduzir o complexo 30B no sensor de pH 20. O fluido inclui um veículo líquido e o complexo 30B. Em alguns exemplos, o complexo 30B no fluido é ligado aos conectores 32, 32’. Em outros exemplos, o complexo 30B no fluido inclui um único conector 32 ligado a polimerase 28, e as enzimas 50A e 50D são ligadas à polimerase 28. Em ainda alguns outros exemplos, o conector (ou conectores) 32, 32’ é ligado ao canal de detecção de pH 26 como parte do sistema de detecção 10C. Em ainda outros exemplos em que existe uma união direta formada entre as enzimas 50A, 50D e os grupos de superfície do canal 26, deve-se compreender que o complexo 30B no fluido não é ligado aos conectores 32, 32’ e os conectores 32, 32’ não são ligados ao canal de detecção de pH 26. Em um exemplo, o veículo líquido é água ou um exemplo do fluido de baixo tamponamento, como citrato salino a concentrações milimolares.

[0163] Durante o uso desses exemplos do kit, um usuário pode depositar o fluido no suporte, e permitir que o fluido permaneça no suporte por um tempo adequado para que os conectores 32, 32’ liguem o complexo 30B ao canal condutor 26, para que o conector 32 ligue a polimerase 28 do complexo 30B ao canal condutor 26 ou para que as enzimas 50A e 50D se unam aos grupos de superfície do canal 26. O suporte pode ser enxaguado com um tampão adequado para remover quaisquer complexos não ligados 30B.

[0164] Alguns exemplos do kit também podem incluir fluido(s) que deve(m) ser usado com o sistema de detecção 10C durante a detecção de molécula única. Nesse exemplo, o(s) fluido(s) incluído(s) em qualquer exemplo do veículo líquido revelado na presente invenção, os nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C, e o substrato secundário 34 (que, nesses exemplos, é uma molécula separada dos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C).

[0165] O marcador 18D que é ligado aos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C irá depender das duas enzimas 50A, 50D do complexo 30B.

Conforme mencionado na presente invenção, cada uma das enzimas 50A, 50D gera um ácido ou base em uma reação com o substrato secundário 34. Para correlacionar uma reação de geração de ácido ou base particular entre a enzima 50A e o substrato secundário 34 ou entre a enzima 50D e o substrato secundário 34, cada marcador 18D nos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C pode ser adaptada para acentuar (por exemplo, iniciar ou acelerar) a cinética da enzima 50A ou da enzima 50D, ou reduzir a cinética da enzima 50A ou da enzima 50D.

Como tal, o marcador 18D é um exemplo de uma porção que altera o pH que é ligada ao nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C.

Esse exemplo do sistema 10B dessa forma inclui dois diferentes exemplos da porção de alteração de pH.

Qualquer um dos marcadores 18B pode ser usado para os marcadores 18D, e cada um dos quatro nucleotídeos (por exemplo, A, T, C, G) pode ser marcado com um marcador diferente que afeta as reações de geração de ácido ou base de maneira diferente.

Em um exemplo, o marcador 18D selecionado para o nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C com “A” como a base nitrogenada pode acentuar a geração de ácido a uma primeira taxa quando próximo da enzima 50A e do substrato secundário 34; o marcador 18D selecionado para o nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C com “T” como a base nitrogenada pode reduzir a geração de ácido a uma segunda taxa quando próximo da enzima 50A e do substrato secundário 34; o marcador 18D selecionado para o nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C com “C” como a base nitrogenada pode acentuar a geração de base a uma terceira taxa quando próximo da enzima 50D e do substrato secundário 34; e o marcador 18D selecionado para o nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C com “G” como a base nitrogenada pode reduzir a geração de base a uma quarta taxa quando próximo da enzima 50A e do substrato secundário 34. Quando os diferentes nucleotídeos marcados são incorporados à fita nascente 46, diferentes níveis de pH irão resultar localmente na superfície do canal sensível à carga 46.

[0166] Devido ao fato de que os nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C não incluem o substrato secundário 34, o(s) fluido(s) representado(s) no exemplo da Figura 4 também inclui o substrato secundário 34. O substrato secundário 34 pode ser qualquer substrato secundário 34 que pode reagir com a enzima 50A ou 50D para gerar um ácido ou base.

[0167] A seguinte descrição se refere a um método exemplificador que envolve os nucleotídeos marcados 12 e o sistema de detecção 10C. Nesse exemplo, a cadeia polinucleotídica modelo 44 pode ser introduzida no sistema de detecção 10C em um fluido, como uma solução biologicamente estável, junto com ou separado dos nucleotídeos marcados 12 e do substrato secundário 34. A polimerase 28 se associa com a cadeia polinucleotídica modelo 44, de modo que a cadeia 44 seja retida no lugar. Uma base complementar de um dos nucleotídeos marcados 12 será incorporada a uma fita nascente 46 (que está sendo formada ao longo da cadeia polinucleotídica modelo 44) pela polimerase 28. Durante o evento de incorporação, o marcador 18D do nucleotídeo marcado 12 colocado em proximidade do canal 26, as enzimas 50A e 50D, e qualquer substrato secundário 34 no fluido que também está nas proximidades das enzimas 50A e 50D. A reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário 34 pode ser acentuada, reduzida ou inibida dependendo do marcador 18D e seu efeito sobre a reação que envolve a enzima 50A ou 50D. Isso altera o pH do fluido, e a carga, na superfície do canal 26. Nesse método exemplificador, após a incorporação da base de nucleotídeo à fita nascente 46, a união entre o alfa- fosfato e a molécula de ligação 16 ou entre o alfa-fosfato e beta-fosfato é naturalmente clivada. Essa clivagem natural permite que o marcador 18D (e a molécula de ligação 16) se dissociem da base de nucleotídeo incorporada e se difundam do sistema de detecção 10C. A polimerase 28 pode, então, receber um outro nucleotídeo marcado 12 que inclui uma base de nucleotídeo que é complementar ao próximo nucleotídeo na cadeia polinucleotídica modelo 44.

[0168] A seguinte descrição se refere a um método exemplificador que envolve os nucleotídeos marcados 12A a 12C e o sistema de detecção 10C. Nesse exemplo, a cadeia polinucleotídica modelo 44 pode ser introduzida no sistema de detecção 10C em um fluido, como uma solução biologicamente estável, junto com ou separado dos nucleotídeos marcados 12A a 12C e do substrato secundário 34. A polimerase 28 se associa com a cadeia polinucleotídica modelo 44, de modo que a cadeia 44 seja retida no lugar. Uma base complementar de um dos nucleotídeos marcados 12A a 12C será incorporada a uma fita nascente 46 (que está sendo formada ao longo da cadeia polinucleotídica modelo 44) pela polimerase 28. A reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário 34 pode ser acentuada, reduzida ou inibida dependendo do marcador 18D e seu efeito sobre a reação que envolve a enzima 50A ou 50D. Isso altera o pH do fluido, e a carga, na superfície do canal 26. Nesse exemplo, o nucleotídeo marcado 12A a 12C inclui um terminador reversível. Como tal, a incorporação do nucleotídeo marcado 12A a 12C serve como um terminador para polimerização. Isso permite que a geração de ácido ou base e detecção de carga acentuada, reduzida ou inibida ocorram de maneira similar conforme descrito acima. Nesse método exemplificador, a lavagem e a exposição a um agente de desbloqueio podem ser usados para preparar o sistema de detecção 10C para um outro ciclo de sequenciamento.

[0169] Em qualquer um dos exemplos descritos em referência à Figura 4, deve-se compreender que a distância entre a polimerase 28 e as respectivas enzimas 50A, 50D e o comprimento da molécula de ligação 16, 16’ podem ser selecionados de modo que o marcador 18D seja colocado nas proximidades da enzima 50A e/ou e 50D quando seu nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C está sendo incorporado pela polimerase 28. Isso permite efeitos previsíveis sobre a reação de geração de ácido ou base. Sistema de Detecção 10D

[0170] Especificamente se referindo à Figura 5, o sistema de detecção 10D inclui o sensor de pH 20 e um complexo 30C ligado ao canal condutor 26 do sensor de pH 20.

[0171] O complexo 30C inclui a polimerase 28 ligada a um complexo de coordenação metálico (“M”) para criar a mudança de pH nas proximidades do canal condutor 26 a partir do consumo de um substrato secundário 34 em um fluido que é exposto ao sensor de pH 20. No complexo 30C, a razão entre a polimerase 28 e o complexo de coordenação metálico M é 1:1. O complexo de coordenação metálico M pode ser ligado diretamente a uma polimerase 28, ou o conector pode ligar os dois juntos.

[0172] A polimerase 28 do complexo 30C pode ser qualquer exemplo da polimerase descrita em referência à Figura 2.

[0173] O complexo de coordenação metálico 50E é similar à enzima 50A, visto que gera um ácido ou base em uma reação com o substrato secundário 34. Exemplos do complexo de coordenação metálico incluem complexos de cobre (II) com ligantes como bis(2-piridilmetil)-amina ou ciclodextrina funcionalizada com piridina.

[0174] No complexo 30C, a polimerase 28 e o complexo de coordenação metálico 50E são conjugados juntos. O complexo 30C pode ser formado com o uso de qualquer número de métodos de conjugação, tal como uma reação de acoplamento spytag-spycatcher, uma conjugação de cisteína mediada por π- clamp, biotina/estreptavidina, uma proteína SUMO (pequeno modificador similar à ubiquitina), quelação His6/NTA com o metal, cisteína/maleimida, dibenzociclo-octina (DBCO)/azida ou qualquer outro método de conjugação adequado.

[0175] O complexo 30C pode ser ligado ao canal condutor 26. No exemplo mostrado na Figura 5, o complexo de coordenação metálico 50E é ligado à superfície do canal 26, e a polimerase 28 é ligada ao complexo de coordenação metálico 50E. Nesse exemplo, a ligação do complexo 30C pode ser através do conector 32 (não mostrado na Figura 5) ou um grupo terminal do complexo de coordenação metálico 50E. Em um outro exemplo, a polimerase 28 é ligada à superfície do canal 26, e o complexo de coordenação metálico 50E é ligado à polimerase 28. Nesse exemplo, a ligação do complexo 30C pode ser através do conector 32 (não mostrado na Figura 5) ligado a polimerase 28.

[0176] Embora não mostrado, o sistema de detecção 10D também pode incluir um detector para detectar mudanças de tensão e/ou corrente que correspondem à mudança de pH que ocorre em ou próximo à superfície do canal de detecção de pH 26.

[0177] Além disso, embora não mostrado, o sistema de detecção 10D pode ser posicionado em um suporte, como um chip de silício. Os eletrodos 22, 24 podem ser conectados a um conjunto de circuitos eletrônicos que permitem sua operação (por exemplo, uma vez associado a um detector e fonte de alimentação).

[0178] Em alguns exemplos, o sensor 10D pode vir pré-montado.

[0179] Em outros exemplos, os componentes de sensor podem fazer parte de um kit, e os componentes de kit podem ser usados para montar o sensor 10D. Um exemplo do kit inclui o sensor de pH 20 no suporte, e um fluido que é usado para introduzir o complexo 30C no sensor de pH 20. O fluido inclui um veículo líquido e o complexo 30C. Em um exemplo, o veículo líquido é água ou um exemplo do fluido de baixo tamponamento, como citrato salino a concentrações milimolares.

[0180] Durante o uso desses exemplos do kit, um usuário pode depositar o fluido no suporte, e permitir que o fluido permaneça no suporte por um tempo adequado para que o conector 32 ou a extremidade terminal do complexo de coordenação metálico 50E ligue o complexo 30C ao canal condutor 26. O suporte pode ser enxaguado com um tampão adequado para remover quaisquer complexos não ligados 30C.

[0181] Alguns exemplos do kit também podem incluir fluido(s) que deve(m) ser usado com o sistema de detecção 10D durante a detecção de molécula única. Nesse exemplo, o(s) fluido(s) incluído(s) em qualquer exemplo do veículo líquido revelado na presente invenção, os nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C, e o substrato secundário 34 (que, nesses exemplos, é uma molécula separada dos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C).

[0182] O marcador 18E que é ligado aos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C pode ser um ligante para um metal do complexo de coordenação metálico 50E, em que o ligante altera uma propriedade catalítica do complexo de coordenação metálico 50E. O ligante pode ser selecionado para acentuar a cinética do complexo de coordenação metálico 50E, ou reduzir a cinética do complexo de coordenação metálico 50E. Nesses exemplos, o marcador 18E é um exemplo de uma porção que altera o pH que é ligada ao nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C. Esse exemplo do sistema 10D inclui dessa forma dois diferentes exemplos da porção de alteração de pH (por exemplo, o complexo de coordenação metálico 50E e o marcador 18E).

[0183] Outros exemplos do marcador 18E podem funcionar como um catalisador separado (além do complexo de coordenação metálico 50E) para o consumo do substrato secundário 34. Exemplos de marcadores 18E que funcionam como catalisadores separados incluem organocatalisadores não metálicos, como diazabicicloundeceno, carbenos N-heterocíclicos,

tetrametilguanidina, etc. Nesses exemplos, o marcador 18E é um exemplo de uma porção que altera o pH que é ligada ao nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C. Esse exemplo do sistema 10D inclui dessa forma dois diferentes exemplos da porção de alteração de pH (por exemplo, o complexo de coordenação metálico 50E e o marcador 18E).

[0184] Ainda outros exemplos do marcador 18E reduzem a cinética do complexo de coordenação metálico 50E e, dessa forma, também reduzem a cinética da reação de geração de ácido ou base que envolve o complexo de coordenação metálico 50E e o substrato secundário 34. Exemplos de marcadores 18E que reduzem a cinética do complexo de coordenação metálico 50E podem ser qualquer ligante que inibe a atividade catalítica do metal, ou qualquer ligante que altera o estado eletrônico do metal para alterar a atividade catalítica do metal. Nesses exemplos, o marcador 18E é um exemplo de uma porção que altera o pH que é ligada ao nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C. Esse exemplo do sistema 10D inclui dessa forma dois diferentes exemplos da porção de alteração de pH (por exemplo, o complexo de coordenação metálico 50E e o marcador 18E).

[0185] Em um exemplo, os respectivos marcadores 18E que são ligados a diferentes nucleotídeos 12 ou 12A a 12C (por exemplo, A, T, C, G) podem ser selecionadas para aumentar ou diminuir a geração de ácido ou base a diferentes taxas. Nesse exemplo, quando um dentre os nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C está sendo incorporado pela polimerase 28, o marcador 18E é colocada nas proximidades do complexo de coordenação metálico 50E e do substrato secundário 34, e acentua ou reduz a reação a uma taxa dependente de marcador único. Por sua vez, o pH no canal condutor 26 é alterado. A mudança no pH está relacionada à geração de ácido ou base aumentada ou diminuída e, dessa forma, pode ser usada para identificar o nucleotídeo marcado incorporado 12 ou 12A a

12C.

[0186] Devido ao fato de que os nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C não incluem o substrato secundário 34, o(s) fluido(s) representado(s) no exemplo da Figura 5 também inclui o substrato secundário 34. O substrato secundário 34 pode ser qualquer substrato secundário 34 que pode reagir com o complexo de coordenação metálico 50E para gerar um ácido ou base.

[0187] A seguinte descrição se refere a um método exemplificador que envolve os nucleotídeos marcados 12 e o sistema de detecção 10D. Nesse exemplo, a cadeia polinucleotídica modelo 44 pode ser introduzida no sistema de detecção 10D em um fluido, como uma solução biologicamente estável, junto com ou separado dos nucleotídeos marcados 12 e do substrato secundário 34. A polimerase 28 se associa com a cadeia polinucleotídica modelo 44, de modo que a cadeia 44 seja retida no lugar. Uma base complementar de um dos nucleotídeos marcados 12 será incorporada a uma fita nascente 46 (que está sendo formada ao longo da cadeia polinucleotídica modelo 44) pela polimerase 28. Durante o evento de incorporação, o marcador 18E do nucleotídeo marcado 12 é colocado em proximidade do canal 26, o complexo de coordenação metálico 50E, e qualquer substrato secundário 34 no fluido que também está nas proximidades do complexo de coordenação metálico 50E. Em alguns exemplos, a reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário 34 pode ser acentuada, reduzida ou inibida dependendo do marcador de ligante 18E e seu efeito sobre a reação que envolve o complexo de coordenação metálico 50E. Em outros exemplos, o marcador 18E pode participar no consumo do substrato secundário 34 junto com o complexo de coordenação metálico 50E, gerando dessa forma mais ácido ou base. Todos esses exemplos alteram o pH do fluido, e a carga, na superfície do canal 26. Nesses métodos exemplificadores, após a incorporação da base de nucleotídeo à fita nascente 46, a união entre o alfa-fosfato e a molécula de ligação 16 ou entre o alfa-fosfato e beta-fosfato é naturalmente clivada. Nesses exemplos, pode ser desejável que a ligação do marcador de ligante 18E seja fraca o suficiente para cair quando a cadeia de fosfato é naturalmente clivada. Essa clivagem natural permite que o marcador 18E (e a molécula de ligação 16) se dissociem da base de nucleotídeo incorporada e se difundam do sistema de detecção 10D. A polimerase 28 pode, então, receber um outro nucleotídeo marcado 12 que inclui uma base de nucleotídeo que é complementar ao próximo nucleotídeo na cadeia polinucleotídica modelo 44.

[0188] A seguinte descrição se refere a um método exemplificador que envolve os nucleotídeos marcados 12A a 12C e o sistema de detecção 10D. Nesse exemplo, a cadeia polinucleotídica modelo 44 pode ser introduzida no sistema de detecção 10D em um fluido, como uma solução biologicamente estável, junto com ou separado dos nucleotídeos marcados 12A a 12C e do substrato secundário 34. A polimerase 28 se associa com a cadeia polinucleotídica modelo 44, de modo que a cadeia 44 seja retida no lugar. Uma base complementar de um dos nucleotídeos marcados 12A a 12C será incorporada a uma fita nascente 46 (que está sendo formada ao longo da cadeia polinucleotídica modelo 44) pela polimerase 28. Em alguns exemplos, a reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário 34 pode ser acentuada, reduzida ou inibida dependendo do marcador de ligante 18E e seu efeito sobre a reação que envolve o complexo de coordenação metálico 50E. Em outros exemplos, o marcador 18E pode participar no consumo do substrato secundário 34 junto com o complexo de coordenação metálico 50E, gerando dessa forma mais ácido ou base. Todos esses exemplos alteram o pH do fluido, e a carga, na superfície do canal 26. Nesse exemplo, o nucleotídeo marcado 12A a 12C inclui um terminador reversível. Como tal, a incorporação do nucleotídeo marcado 12A a 12C serve como um terminador para polimerização. Isso permite que a geração de ácido ou base e detecção de carga acentuada, reduzida ou inibida ocorram de maneira similar conforme descrito acima. Nesse método exemplificador, a lavagem e a exposição a um agente de desbloqueio podem ser usadas para preparar o sistema de detecção 10D para um outro ciclo de sequenciamento.

[0189] Em qualquer um dos exemplos descritos em referência à Figura 5, deve-se compreender que a distância entre a polimerase 28 e o complexo de coordenação metálico 50E e o comprimento da molécula de ligação 16, 16’ podem ser selecionados de modo que o marcador 18E seja colocado nas proximidades do complexo de coordenação metálico 50E quando seu nucleotídeo marcado 12 ou 12A-12C está sendo incorporado pela polimerase 28. Isso permite efeitos previsíveis sobre a reação de geração de ácido ou base.

[0190] Sistema de Detecção 10E

[0191] Especificamente se referindo às Figuras 6A e 6B, o sistema de detecção 10D inclui o sensor de pH 20 e um complexo 30D ligado ao canal condutor 26 do sensor de pH 20.

[0192] O complexo 30D inclui a polimerase 28 ligada a uma enzima 50A. Nesse exemplo, o complexo 30D inclui adicionalmente um conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58 ligado à enzima 50A.

[0193] A polimerase 28 do complexo 30D pode ser quaisquer exemplos da polimerase descrita em referência à Figura 2.

[0194] A enzima 50A pode ser qualquer exemplo da enzima descrita em referência às Figuras 3A e 3B.

[0195] O conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58 inclui um DNA ou RNA de fita simples que tem duas regiões que são complementares e que são submetidas a pareamento de base intramolecular para formar uma hélice dupla que termina em um loop não emparelhado. Uma extremidade do loop não emparelhado é ligada à enzima 50A, e a outra extremidade do loop não emparelhado inclui um inibidor de enzima 60. Quando na configuração em loop conforme mostrado na Figura 6A, o inibidor de enzima 60 pelo menos reduz atividade enzimática.

[0196] No complexo 30D, a enzima 50A e o conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58 são conjugados, e a enzima 50A também é conjugada à polimerase 28.

[0197] O complexo 30D pode ser ligado ao canal condutor 26 através de um conector 32, exemplos dos quais estão descritos em referência à Figura 2. Alternativamente, o complexo 30D pode ser diretamente ligado através de união entre a porção de alteração de pH 50A e grupos na superfície do canal condutor

26.

[0198] Embora não mostrado, o sistema de detecção 10E também pode incluir um detector para detectar mudanças de tensão e/ou corrente que correspondem à mudança de pH que ocorre em ou próximo à superfície do canal de detecção de pH 26.

[0199] Além disso, embora não mostrado, o sistema de detecção 10E pode ser posicionado em um suporte, como um chip de silício. Os eletrodos 22, 24 podem ser conectados a um conjunto de circuitos eletrônicos que permitem sua operação (por exemplo, uma vez associado a um detector e fonte de alimentação).

[0200] Em alguns exemplos, o sensor 10E pode vir pré-montado.

[0201] Em outros exemplos, os componentes de sensor podem fazer parte de um kit, e os componentes de kit podem ser usados para montar o sensor 10E. Um exemplo do kit inclui o sensor de pH 20 no suporte, e um fluido que é usado para introduzir o complexo 30D no sensor de pH 20. O fluido inclui um veículo líquido e o complexo 30D. Em alguns exemplos, o complexo 30D no fluido é ligado ao conector 32. Em outros exemplos, o conector 32 é ligado ao canal de detecção de pH 26 como parte do sistema de detecção 10E. Em ainda outros exemplos em que existe uma união direta formada entre a porção de alteração de pH 50A e os grupos de superfície do canal 26, deve-se compreender que o complexo 30D no fluido não é ligado ao conector 32, e o conector 32 não é ligado ao canal de detecção de pH 26. Em um exemplo, o veículo líquido é água ou um exemplo do fluido de baixo tamponamento, como citrato salino a concentrações milimolares.

[0202] Durante o uso desses exemplos do kit, um usuário pode depositar o fluido no suporte, e permitir que o fluido permaneça no suporte por um tempo adequado para que o conector 32 ligue o complexo 30D ao canal condutor 26, para que o complexo 30D se ligue a um conector 32 no canal 26 ou para que a porção de alteração de pH 50A se una aos grupos de superfície do canal 26. O suporte pode ser enxaguado com um tampão adequado para remover quaisquer complexos não ligados 30D.

[0203] Alguns exemplos do kit também podem incluir fluido (ou fluidos) que deve ser usado com o sistema de detecção 10E durante a detecção de molécula única. Nesse exemplo, o fluido (ou fluidos) incluído qualquer exemplo do veículo líquido revelado na presente invenção, os nucleotídeos marcados 12 ou 12A-12C, e o substrato secundário 34 (que, nesses exemplos, é uma molécula separada dos nucleotídeos marcados 12 ou 12A-12C).

[0204] O marcador 18F que é ligado aos nucleotídeos marcados 12 ou 12A- 12C é uma fita de nucleotídeos que inclui bases complementares a pelo menos parte das bases de nucleotídeo do conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58. O marcador 18F tem a capacidade de iniciar a reação de abertura do ácido nucleico em grampo e, então, emparelhamento de base com uma porção da fita de DNA ou RNA simples do conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo

58. Conforme mostrado na Figura 6B, a introdução e a reação do marcador 18F movem o inibidor de enzima 60 na direção contrária à enzima 50A, permitindo dessa forma sua atividade enzimática. Devido ao fato de que o marcador 18F pode afetar a atividade enzimática que conduz à geração de ácido ou base, isso também é um exemplo de uma porção que altera o pH. A reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário 34 tem a capacidade de ocorrer quando o marcador 18F abre o conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58, resultando na mudança no pH na superfície do canal condutor 26. A abertura e o fechamento do ácido nucleico em grampo pode ser um processo rápido, resultando em um nível médio de inibição da polimerase 28. Dessa forma, diferentes níveis de atividade ou inibição pode ser alcançados com o uso de um número diferente de bases complementares, permitindo dessa forma a discriminação de base.

[0205] Devido ao fato de que os nucleotídeos marcados 12 ou 12A-12C não incluem o substrato secundário 34, o fluido (ou fluidos) representado no exemplo das Figuras 6A e 6B também inclui o substrato secundário 34. O substrato secundário 34 pode ser qualquer substrato secundário 34 que pode reagir com a enzima 50A para gerar um ácido ou base.

[0206] A seguinte descrição se refere a um método exemplificador que envolve os nucleotídeos marcados 12 e o sistema de detecção 10E. Nesse exemplo, a cadeia polinucleotídica modelo 44 pode ser introduzida no sistema de detecção 10E em um fluido, como uma solução biologicamente estável, junto com ou separado dos nucleotídeos marcados 12 e do substrato secundário 34. A polimerase 28 se associa com a cadeia polinucleotídica modelo 44, de modo que a cadeia 44 seja retida no lugar. Uma base complementar de um dos nucleotídeos marcados 12 será incorporada a uma fita nascente 46 (que está sendo formada ao longo da cadeia polinucleotídica modelo 44) pela polimerase 28. Durante o evento de incorporação, o marcador 18F do nucleotídeo marcado 12 é colocado nas proximidades do canal 26, o conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58, e qualquer substrato secundário 34 no fluido que também está nas proximidades do conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58. O marcador 18F abre o conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58, que permite que a enzima 50A reaja com o substrato secundário 34 para gerar um ácido ou uma base. Isso altera o pH do fluido, e a carga, na superfície do canal

26. Nesse método exemplificador, após a incorporação da base de nucleotídeo à fita nascente 46, a união entre o alfa-fosfato e a molécula de ligação 16 ou entre o alfa-fosfato e beta-fosfato é naturalmente clivada. Nesses exemplos, pode ser desejável que a ligação do marcador de ligante 18F seja fraca o suficiente para cair quando a cadeia de fosfato é naturalmente clivada. Essa clivagem natural permite que o marcador 18F (e a molécula de ligação 16) se dissociem da base de nucleotídeo incorporada e se difundam do sistema de detecção 10E. O conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58 reverte-se para a posição de loop de haste, inibindo assim novamente pelo menos parcialmente a atividade da enzima 50A. A polimerase 28 pode, então, receber um outro nucleotídeo marcado 12 que inclui uma base de nucleotídeo que é complementar ao próximo nucleotídeo na cadeia polinucleotídica modelo

44.

[0207] A seguinte descrição se refere a um método exemplificador que envolve os nucleotídeos marcados 12A-12C e o sistema de detecção 10E. Nesse exemplo, a cadeia polinucleotídica modelo 44 pode ser introduzida no sistema de detecção 10C em um fluido, como uma solução biologicamente estável, junto com ou separado dos nucleotídeos marcados 12A-12C e do substrato secundário

34. A polimerase 28 se associa com a cadeia polinucleotídica modelo 44, de modo que a cadeia 44 seja retida no lugar. Uma base complementar de um dos nucleotídeos marcados 12A-12C será incorporada a um filamento nascente 46 (que está sendo formada ao longo da cadeia polinucleotídica modelo 44) pela polimerase 28. O marcador 18F abre o conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58, que permite que a enzima 50A reaja com o substrato secundário 34 para gerar um ácido ou uma base. Isso altera o pH do fluido, e a carga, na superfície do canal 26. Nesse exemplo, o nucleotídeo marcado 12A-12C inclui um terminador reversível. Como tal, a incorporação do nucleotídeo marcado 12A-12C serve como um terminador para polimerização. Isso permite que a geração de ácido ou base e a detecção de carga ocorram de maneira similar conforme descrito acima. Nesse método exemplificador, a lavagem e a exposição a um agente de desbloqueio podem ser usados para preparar o sistema de detecção 10E para um outro ciclo de sequenciamento.

[0208] Em qualquer um dos exemplos descritos em referência às Figuras 6A e 6B, deve-se compreender que a distância entre a polimerase 28 e o conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58, e o comprimento da molécula de ligação 16, 16’ podem ser selecionados de modo que o marcador 18F seja colocado nas proximidades do conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58 quando seu nucleotídeo marcado 12 ou 12A-12C está sendo incorporado pela polimerase 28. Isso permite efeitos previsíveis sobre a reação de geração de ácido ou base. Arranjos de Sistema de Detecção

[0209] Qualquer exemplo dos sistemas de detecção de molécula única 10A a 10E pode ser incluído em um arranjo de tais sistemas de detecção. Em alguns exemplos, um arranjo pode incluir vários sistemas de detecção 10A a 10E, cada um é posicionado em um suporte e é configurado com um conjunto de circuitos eletrônicos de modo que seja individualmente acessível e legível. Em um exemplo, cada sistema de detecção 10A a 10E do arranjo pode ser posicionado no suporte em uma depressão individual. As depressões fisicamente separam cada um dos sistemas de detecção 10A a 10E, o que pelo menos reduz a contaminação cruzada dos gradientes de pH a sistemas de detecção adjacentes 10A a 10E. O arranjo de sistemas de detecção 10A a 10E pode ser parte de uma célula de fluxo 62, um exemplo disso sendo representado na Figura 7A. Nesse exemplo, a célula de fluxo 62 inclui canais de fluxo 64. Embora vários canais de fluxo 64 sejam mostrados, deve-se compreender que qualquer número de canais 64 pode ser incluído na célula de fluxo 62 (por exemplo, um canal único 64, quatro canais 64, etc.). Cada canal de fluxo 64 é uma área definida entre dois componentes unidos (por exemplo, um substrato e uma tampa, ou dois substratos), que pode ter fluidos (por exemplo, aqueles descritos na presente invenção) introduzido na mesma e os da mesma. Cada canal de fluxo 64 pode ser isolado de cada outro canal de fluxo 64 de modo que o fluido introduzido em qualquer canal de fluxo particular 64 não flua em qualquer canal de fluxo 64 adjacente. Alguns exemplos dos fluidos introduzidos nos canais de fluxo 64 podem introduzir componentes de reação (por exemplo, complexos 30A a 30D, nucleotídeos marcados 12, 12A a 12C. 12’, etc.), soluções de lavagem, agentes de desbloqueio, etc.

[0210] Um exemplo da arquitetura nos canais de fluxo 64 da célula de fluxo 62 é mostrado Figura 7B.

[0211] No exemplo mostrado na Figura 7B, a célula de fluxo 64 inclui um suporte 66 e um material padronizado 68 posicionado no suporte 66. O material padronizado 68 define depressões 70 separadas por regiões intersticiais 72. Nesse exemplo, uma superfície do suporte 66 é exposta a cada uma das depressões 70, e um sistema de detecção 10A a 10E é posicionado sobre a superfície.

[0212] O suporte 66 na Figura 7B fornece suporte para os outros componentes da célula de fluxo 62. O suporte 66 é geralmente rígido e é insolúvel em um líquido aquoso. Exemplos de suportes adequados 66 incluem epóxi siloxano, vidro, vidro modificado, plásticos, náilon, cerâmicas/óxidos cerâmicos, sílica (óxido de silício (SiO2)), sílica fundida, materiais à base de sílica, silicato de alumínio, silício, silício modificado (por exemplo, silício p+ dopado com boro), nitreto de silício (Si3N4), pentóxido de tântalo (TaO5) ou outro óxido (ou óxidos) de tântalo (TaOx), óxido de háfnio (HfO2), vidros inorgânicos, ou similares. Alguns exemplos de plásticos adequados para o substrato 14 incluem acrílicos, poliestireno, copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, politetrafluoroetileno (como TEFLON® da Chemours), olefinas cíclicas/polímeros de ciclo-olefina (COP) (como ZEONOR® da Zeon), poliimidas, etc. O suporte também pode ser de vidro ou silício, com uma camada de revestimento de óxido de tântalo ou outro óxido de cerâmica na superfície.

[0213] A forma do suporte 66 pode ser uma pastilha, um painel, uma folha retangular, uma matriz, ou qualquer outra configuração adequada. Em um exemplo, o suporte 66 pode ser uma pastilha ou painel circular que tem um diâmetro na faixa de cerca de 2 mm a cerca de 300 mm. Como um exemplo mais específico, o suporte 66 é uma pastilha que tem um diâmetro na faixa de cerca de 200 mm a cerca de 300 mm. Em um outro exemplo, o suporte 66 pode ser uma folha ou painel que retangular tem sua dimensão mais ampla até cerca de 3 metros (10 pés). Como um exemplo específico, o suporte 66 é uma matriz que tem uma largura na faixa de cerca de 0,1 mm a cerca de 10 mm. Embora dimensões exemplificadoras sejam fornecidas, deve-se compreender que um suporte 66 com quaisquer dimensões adequadas pode ser usado.

[0214] No exemplo mostrado na Figura 7B, o material padronizado 68 é posicionado no suporte 66. Deve-se compreender que qualquer material que pode ser seletivamente depositado, ou depositado e padronizado para formar as depressões 70 e as regiões intersticiais 72 podem ser usadas para o material padronizado 68.

[0215] Como um exemplo, um óxido inorgânico pode ser seletivamente aplicado ao suporte 66 através de deposição de vapor, impressão em aerossol ou impressão a jato de tinta. Exemplos de óxidos inorgânicos adequados incluem óxido de tântalo (por exemplo, Ta2O5), óxido de alumínio (por exemplo, Al2O3), óxido de silício (por exemplo, SiO2), óxido de háfnio (por exemplo, HfO2), etc.

[0216] Como um outro exemplo, uma resina pode ser aplicada ao suporte 66 e, então, padronizada. As técnicas de deposição adequadas incluem deposição de vapor químico, revestimento por imersão, revestimento por mergulho, revestimento por rotação, revestimento por aspersão, dispensação de poça, revestimento por aspersão ultrassônica, método do bastão de vidro, impressão por aerossol, impressão de tela, impressão por microcontato, etc. Técnicas de padronização adequadas incluem fotolitografia, litografia de nanoimpressão (NIL), técnicas de estampagem, técnicas de gravação em relevo, técnicas de moldagem, técnicas de microgravura, técnicas de impressão, etc. Alguns exemplos de resinas adequadas incluem uma resina à base de silsesquioxano oligomérica poliédrica (POSS), uma resina epóxi não-POSS, uma resina de poli(etilenoglicol), uma resina de poliéter (por exemplo, epóxis de anel aberto), uma resina acrílica, uma resina de acrilato, uma resina de metacrilato, uma resina de fluoropolímero amorfa (por exemplo, CYTOP® da Bellex) e combinações dos mesmos.

[0217] Conforme usado na presente invenção, o termo “silsesquioxano oligomérico poliédrico” (POSS) se refere a uma composição química que é um intermediário híbrido (por exemplo, RSiO1.5) entre aquele de sílica (SiO2) e silicone (R2SiO). Um exemplo de POSS pode ser aquele descrito em Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), páginas 776 a 778, que está incorporado na presente invenção a título de referência em sua totalidade. Em um exemplo, a composição é um composto de organossilício com a fórmula química [RSiO3/2]n, em que os grupos R podem ser iguais ou diferentes. Grupos R exemplificadores para POSS incluem epóxi, azida/azido, um tiol, um poli(etilenoglicol), um norborneno, uma tetrazina, acrilatos e/ou metacrilatos, ou ainda, por exemplo, grupos alquila, arila, alcoxi e/ou haloalquila. A composição de resina revelada na presente invenção pode compreender uma ou mais diferentes estruturas de núcleo ou células como unidades monoméricas.

[0218] Ainda como um outro exemplo, o material padronizado 68 pode ser um material tampão de pH. Um material tampão de pH tem uma alta capacidade de tamponamento de pH, que permite o uso de um fluido com baixa concentração de solução tampão. Um exemplo de uma alta capacidade de tamponamento de pH pode encontrar-se na faixa de cerca de 0,01 meq/g a cerca de 2 meq/g. Um exemplo de um material tampão de pH é SiCOH, que tem uma ampla área de superfície e uma alta capacidade de tamponamento. Em exemplos em que o material padronizado 68 não é um material tampão de pH, as paredes laterais das depressões 70 podem ser revestidas com o material tampão de pH para conferir a alta capacidade de tamponamento de pH a cada uma das depressões 70.

[0219] Conforme mostrado na Figura 7B, o material padronizado 68 inclui as depressões 70 definidas no mesmo, e regiões intersticiais 72 que separam depressões adjacentes 70. Muitos modelos diferentes das depressões 70 podem ser previstos, o que inclui padrões regulares, repetidos e não regulares. Em um exemplo, as depressões 70 são dispostas em uma grade hexagonal para embalagem próxima e densidade aprimorada. Outros modelos podem incluir, por exemplo, modelos retilíneos (retangulares), modelos triangulares, e assim em diante. Em alguns exemplos, o modelo ou padrão pode ser qualquer formato x-y de depressões 70 que estão em fileiras e colunas. Em alguns outros exemplos, o modelo ou padrão pode ser uma disposição de repetição de depressões 70 e/ou regiões intersticiais 72. Em ainda outros exemplos, o modelo ou padrão pode ser uma disposição aleatória de depressões 70 e/ou regiões intersticiais 72. O padrão pode incluir manchas, almofadas, poços, postes, listras, redemoinhos, linhas, triângulos, retângulos, círculos, arcos, verificações, xadrez, diagonais, setas, quadrados e/ou hachuras cruzadas.

[0220] O modelo ou padrão das depressões 70 pode ser caracterizado em relação à densidade das depressões 70 (número de depressões 70) em uma área definida. Por exemplo, as depressões 70 podem estar presentes a uma densidade de aproximadamente 2 milhões por mm2. A densidade pode ser ajustada a diferentes densidades que incluem, por exemplo, uma densidade de cerca de 100 por mm2, cerca de 1.000 por mm2, cerca de 0,1 milhão por mm2, cerca de 1 milhão por mm2, cerca de 2 milhões por mm2, cerca de 5 milhões por mm2, cerca de 10 milhões por mm2, cerca de 50 milhões por mm2, ou mais, ou menos. Deve- se compreender ainda que a densidade de depressões 70 no material padronizado 68 pode ser entre um dos valores mais baixos e um dos valores mais altos selecionados das faixas acima. Como exemplos, um arranjo de alta densidade pode ser caracterizado como tendo depressões 70 separadas por menos que cerca de 100 nm, um arranjo de média densidade pode ser caracterizada como tendo depressões 20 separadas por cerca de 400 nm a cerca de 1 µm, e um arranjo de baixa densidade pode ser caracterizada como tendo depressões 70 separadas por mais que cerca de 1 µm. Embora densidades exemplificadoras tenham sido fornecidas, deve-se compreender que quaisquer densidades adequadas podem ser usadas. A densidade das depressões 70 pode depender, em parte, da profundidade das depressões 70 e a capacidade de difusão do ácido ou base gerada. Em alguns casos, pode ser desejável que o espaçamento entre depressões seja ainda maior que os exemplos listados na presente invenção.

[0221] O modelo ou padrão das depressões 70 também podem adicional ou alternativamente ser caracterizados em termos do passo médio, ou o espaçamento do centro da depressão 70 até o centro de uma depressão adjacente 70 (espaçamento centro-a-centro) ou da borda de uma depressão 70 até a borda de uma depressão adjacente 70 (espaçamento borda-a-borda). O padrão pode ser regular, de modo que o coeficiente de variação ao redor do afastamento médio seja pequeno, ou o padrão possa ser não regular caso no qual o coeficiente de variação pode ser relativamente grande. Em qualquer um dos casos, o afastamento médio pode ser, por exemplo, cerca de 50 nm, cerca de 0,1 μm, cerca de 0,5 μm, cerca de 1 μm, cerca de 5 μm, cerca de 10 μm, cerca de 100 μm, ou mais ou menos. O afastamento médio para um padrão particular de depressões 20 pode ser entre um dos valores mais baixos e um dos valores mais altos selecionados das faixas acima. Em um exemplo, as depressões 20 têm um afastamento (espaçamento centro-a-centro) de cerca de 1,5 μm. Embora valores de afastamento médio exemplificadores tenham sido fornecidos, deve-se compreender que outros valores de afastamento médio podem ser usados.

[0222] O tamanho de cada depressão 70 pode ser caracterizado por seu volume, área de abertura, profundidade e/ou diâmetro.

[0223] Cada depressão 70 pode ter qualquer volume que tem a capacidade de confinar um fluido. O volume mínimo ou máximo pode ser selecionado, por exemplo, a fim de acomodar o rendimento (por exemplo, multiplexidade), resolução, nucleotídeos marcados 12, 12A a 12C ou 12’, substratos secundários

34, ou reatividade de analito esperada para usos a jusante da célula de fluxo 62. Por exemplo, o volume pode ser pelo menos cerca de 1×10−3 μm3, pelo menos cerca de 1×10−2 μm3, pelo menos cerca de 0,1 μm3, pelo menos cerca de 1 μm3, pelo menos cerca de 10 μm3, pelo menos cerca de 100 μm3, ou mais. Alternativa ou adicionalmente, o volume pode ser no máximo cerca de 1×104 μm3, no máximo cerca de 1×103 μm3, no máximo cerca de 100 μm3, no máximo cerca de 10 μm3, no máximo cerca de 1 μm3, no máximo cerca de 0,1 μm3, ou menos. A área ocupada por cada abertura de depressão pode ser selecionada com base em critérios similares aqueles estabelecidos acima para o volume. Por exemplo, a área para cada abertura de depressão pode ser pelo menos cerca de 1×10−3 μm2, pelo menos cerca de 1×10−2 μm2, pelo menos cerca de 0,1 μm2, pelo menos cerca de 1 μm2, pelo menos cerca de 10 μm2, pelo menos cerca de 100 μm2, ou mais. Alternativa ou adicionalmente, a área pode ser no máximo cerca de 1×103 μm2, no máximo cerca de 100 μm2, no máximo cerca de 10 μm2, no máximo cerca de 1 μm2, no máximo cerca de 0,1 μm2, no máximo cerca de 1×10−2 μm2, ou menos. A área ocupada por cada abertura de depressão pode ser maior que, menos que ou entre os valores especificados acima.

[0224] A profundidade de cada depressão 70 pode ser grande o suficiente para alojar um sistema de detecção 10A a 10E. Em um exemplo, a profundidade pode ser pelo menos cerca de 1 μm, pelo menos cerca de 10 μm, pelo menos cerca de 100 μm, ou mais. Alternativa ou adicionalmente, a profundidade pode ser no máximo cerca de 1×103 μm, no máximo cerca de 100 μm, no máximo cerca de 10 μm, ou menos. A profundidade de cada depressão 70 pode ser maior que, menos que ou entre os valores especificados acima.

[0225] Em alguns casos, o diâmetro ou o comprimento e a largura de cada depressão 70 pode ser pelo menos cerca de 50 nm, pelo menos cerca de 0,1 μm, pelo menos cerca de 0,5 μm, pelo menos cerca de 1 μm, pelo menos cerca de 10 μm, pelo menos cerca de 100 μm, ou mais. Alternativa ou adicionalmente, the diâmetro ou comprimento e largura pode ser no máximo cerca de 1×103 μm, no máximo cerca de 100 μm, no máximo cerca de 10 μm, no máximo cerca de 1 μm, no máximo cerca de 0,5 μm, no máximo cerca de 0,1 μm, ou menos (por exemplo, cerca de 50 nm). O diâmetro ou o comprimento e a largura de cada depressão 70 pode ser maior que, menos que ou entre os valores especificados acima.

[0226] Conforme representado na Figura 7B, cada uma das depressões 70 no arranjo inclui um respectivo sensor 10A a 10E. É desejável que cada sensor 10A a 10E em cada depressão 70 tenha uma polimerase 28, sozinha ou como parte de um complexo 30A a 30D, ligada ao mesmo. Em alguns exemplos, cada sensor 10A a 10E em cada depressão 70 tem uma polimerase 28 ou complexo 30A a 30D ligado ao mesmo. Em outros exemplos, alguns sensores 10A a 10E em algumas depressões 70 têm uma polimerase 28 ou complexo 30A a 30D ligado aos mesmos; outros sensores 10A a 10E em outras depressões 70 têm mais de uma polimerase 28 ou complexo 30A a 30D ligado aos mesmos; e ainda outros sensores 10A a 10E em outras depressões 70 não têm polimerase 28 ou complexo 30A a 30D ligado aos mesmos. Nesses exemplos, o número de polimerase(s) 28 ou complexo(s) 30A a 30D que se ligam a qualquer dado sistema de detecção 10A a 10E pode ser aleatório e determinado por meio da distribuição de Poisson.

[0227] Para ligar a polimerases 28 ou complexos 30Aa 30D, o método inclui introduzir um fluido em um arranjo de sensor que inclui uma pluralidade de canais condutores individualmente acessíveis 26, ligando assim uma polimerase 28 ou um complexo 30A a 30D a pelo menos parte da pluralidade de canais condutores individualmente acessíveis 26, o complexo 30A a 30D incluindo uma polimerase 28 e diferentes exemplos da porção de alteração de pH 50A a 50E ligados à polimerase 28, a porção de alteração de pH 50A a 50E sendo selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima 50A que serve para catalisar consumo de um substrato secundário 34 em uma solução que deve ser exposta ao arranjo de sensor, um complexo de coordenação metálico 50E que serve para catalisar o consumo do substrato secundário 34 na solução que deve ser exposta ao arranjo de sensor, e um cofator 50B ou um ativador 50C de um marcador de catalisador ligado a um nucleotídeo marcado que deve ser introduzido no arranjo de sensor. Pode ser permitido que o fluido seja incubado durante um tempo desejável e a uma temperatura desejável a fim de permitir que as polimerases 28 ou os complexos 30A a 30D se liguem.

[0228] Durante quaisquer exemplos dos métodos revelados na presente invenção para detecção de molécula única, um dos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C ou 12’ é incorporado, por uma respectiva polimerase 28, a um filamento nascente 46 que está sendo formada no sistema de detecção 10A a 10E em cada uma das depressões 70. Em outras palavras, em cada cadeia polinucleotídica modelo 44 ao longo da célula de fluxo 62, respectivas polimerases 28 estendem a fita nascente 46 por meio de um dos nucleotídeos 12, 12A a 12C ou 12’ presentes no fluido introduzido.

[0229] Cada um dos sensores 10A a 10E é individualmente acessível e legível eletricamente. Como tal, os sinais de carga que resultam de mudanças de pH que ocorrem em cada depressão 70, em resposta ao consumo do substrato secundário 34, podem ser individualmente detectados e analisados para identificar o nucleotídeo marcado incorporado 12, 12A a 12C ou 12’. A reação de geração de ácido ou base que ocorre em cada depressão irá depender do marcador 18A-18F e da combinação da polimerase 28 ou do complexo 30A a 30D que é usada, exemplos dos quais são descritos em referência às Figura 3A e Figura 3B, Figura 4, Figura 5, e Figura 6A e Figura 6B.

Detecção de Conjunto

[0230] Outros exemplos dos sistemas de detecção 40A e 40B são mostrados nas Figuras 7C e 7D, e esses sistemas de detecção 40A e 40B podem ser usados na detecção de conjunto. Nesses exemplos, os sistemas de detecção 40A e 40B podem ser posicionados em cada uma das depressões 70 da célula de fluxo 62. A célula de fluxo 62 inclui os canais 64, o suporte 66, o material padronizado 68 e o material padronizado 68 conforme descrito na presente invenção.

[0231] No exemplo mostrado na Figura 7C, o sistema de detecção 40A inclui o sensor de pH 20 e iniciadores 74 ligados ao canal condutor 26 do sensor de pH 20 e/ou à superfície do suporte 66 exposta em cada depressão 70.

[0232] A superfície do suporte 66 exposta nas depressões 70 pode ser funcionalizada de modo que os iniciadores 74 possam se ligar à superfície e não às regiões intersticiais 72 do material padronizado 68. Em alguns exemplos, funcionalização da superfície de suporte envolve a silanização da superfície exposta nas depressões 70 e que forma uma camada polimérica na superfície silanizada. A silanização pode ser realizada com o uso de qualquer silano ou derivado de silano. Um polímero (não mostrado) pode, então, ser aplicado à superfície silanizada. O polímero pode ser um material polimérico semirrígido que é permeável a líquidos e gases. Um exemplo do polímero inclui um copolímero de acrilamida, como poli (N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co- acrilamida, PAZAM, ou outro hidrogel polimérico adequado.

[0233] Os iniciadores 74 podem ser qualquer iniciador de amplificação direta ou reversa que inclui um grupo funcional que pode se ligar à superfície do canal condutor 26 e/ou à superfície do suporte 66. Exemplos de iniciadores terminados em grupo funcional adequados incluem um iniciador alcino terminal, um iniciador tetrazina terminal, um iniciador azido terminal, um iniciador amino terminal, um iniciador epóxi ou glicidila terminal, um iniciador tiofosfato terminal, um iniciador tiol terminal, um iniciador aldeído terminal, um iniciador hidrazina terminal e um iniciador triazolinediona terminal. Uma mistura de iniciadores também pode ser usada. Exemplos específicos de iniciadores adequados incluem iniciadores P5 e/ou P7, que são usados na superfície de algumas células de fluxo comerciais vendidas pela Illumina Inc.

[0234] Em um exemplo, os iniciadores 74 podem ser ligados com o uso de um processo de enxerto, como fluxo por deposição (por exemplo, quando a célula de fluxo 62 tem uma tampa unida a isso), revestimento por imersão, revestimento por aspersão, dispensação de poça, ou por meio de outro método adequado que irá ligar o(s) iniciador(s) 74. Cada uma dessas técnicas exemplificadoras pode utilizar uma solução ou mistura de iniciador, que pode incluir o(s) iniciador(s), água, um tampão (por exemplo, uma solução salina) e um catalisador.

[0235] No exemplo mostrado na Figura 7D, o sistema de detecção 40B inclui um canal condutor plano 26’ e iniciadores 74 ligados ao canal condutor plano 26’. O canal condutor plano 26’ pode ser qualquer material que tem a capacidade de captar íons carregados, ou que inclui grupos de superfície que podem ser protonados ou desprotonados por íons carregados gerados durante as reações de geração de ácido ou base reveladas na presente invenção. O canal condutor plano 26’ é conectado a eletrodos 22, 24 (não mostrado na Figura 7D) que podem ser integrados ao suporte 66 e conectados ao conjunto de circuitos eletrônicos que permite sua operação. Qualquer um dos iniciadores 74 pode ser usado e pode ser ligado conforme descrito na presente invenção. Ademais, se o canal condutor plano 26’ tem grupos de superfície que podem ligar os iniciadores 74, a funcionalização adicional do canal condutor plano 26’ pode não ser realizada.

[0236] Esses exemplos da célula de fluxo 62 podem ser usadas para sequenciamento de conjunto. No sequenciamento de conjunto, uma cadeia polinucleotídica modelo 44 (não mostrado nas Figuras 7C e 7D) que deve ser sequenciada pode ser formada na célula de fluxo superfície com o uso dos iniciadores 74. No início da formação de cadeia polinucleotídica modelo, modelos de biblioteca podem ser preparados a partir de qualquer amostra de ácido nucleico (por exemplo, uma amostra de DNA ou uma amostra de RNA). A amostra de ácido nucleico pode ser fragmentada em fragmentos de DNA ou RNA de tamanho similar (por exemplo, < 1.000 bp) de fita simples. Durante a preparação, adaptadores podem ser adicionados às extremidades desses fragmentos. Através do ciclo reduzido de amplificação, diferentes padrões estruturais podem ser introduzidos nos adaptadores, como sítios de ligação de sequenciamento, índices, e regiões que são complementares aos iniciadores 74 nas depressões 70. Os modelos de biblioteca finais incluem o fragmento de DNA ou RNA e adaptadores em ambas as extremidades. Em alguns exemplos, os fragmentos de uma amostra de ácido nucleico única têm os mesmos adaptadores adicionados aos mesmos.

[0237] Uma pluralidade de bibliotecas modelo pode ser introduzida na célula de fluxo 62. Devido ao fato de que a célula de fluxo 62 inclui um arranjo de depressões 70, múltiplas bibliotecas modelo são hibridizadas, por exemplo, em um dos dois tipos de iniciadores 74 imobilizados no mesmo.

[0238] A geração de agrupamento pode, então, ser realizada. Em um exemplo de geração de agrupamento, as bibliotecas modelo são copiadas dos iniciadores hibridizados 74 por extensão 3’ com o uso de uma polimerase de DNA de alta fidelidade. As bibliotecas modelo originais são desnaturadas, deixando as cópias imobilizadas nas depressões 70. A amplificação da ponte isotérmica pode ser usada para amplificar as cópias imobilizadas. Por exemplo, os modelos copiados fazem um loop para hibridizar em um iniciador complementar 74 adjacente e uma polimerase copia os modelos copiados para formar pontes de fita dupla, que são desnaturadas para formar duas fitas simples. Essas duas fitas se enrolam e hibridizam em iniciadores complementares 74 adjacentes e são estendidas novamente para formar dois novos loops de fita dupla. O processo é repetido em cada cópia do modelo por ciclos de desnaturação isotérmica e amplificação para criar agrupamentos clonais densos. Cada agrupamento de pontes de fita dupla é desnaturado. Em um exemplo, a fita reversa é removida por clivagem de base específica, deixando fitas diretas de polinucleotídeo modelo. O agrupamento resulta na formação de várias cadeias polinucleotídicas modelo 44 em cada depressão 70. Esse exemplo de agrupamento é a amplificação de ponte e é um exemplo da amplificação que pode ser realizada. Deve-se compreender que outras técnicas de amplificação podem ser usadas, como o fluxo de trabalho (Illumina Inc.) de amplificação por exclusão (Examp).

[0239] Para iniciar o sequenciamento, uma mistura de incorporação pode ser adicionada à célula de fluxo 62.

[0240] Em um exemplo, a mistura de incorporação inclui um veículo líquido, qualquer exemplo do complexo 30A a 30D revelado na presente invenção, e qualquer exemplo do nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C. O complexo 30A a 30D inclui uma polimerase 28 e uma porção que altera o pH 50A a 50E ligada à polimerase 28, a porção de alteração de pH 50A a 50E sendo selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima 50A que serve para catalisar o consumo de um substrato secundário 34, um complexo de coordenação metálico 50D que serve para catalisar o consumo do substrato secundário 34, e um cofator 50B ou um ativador 50C que serve para catalisar o consumo do substrato secundário 34. O nucleotídeo marcado 12 inclui um nucleotídeo 14; uma molécula de ligação 16 ligada a um grupo fosfato terminal do nucleotídeo 14; e um marcador 18 ligado à molécula de ligação 16, em que o marcador serve para participar em uma reação de alteração de pH que envolve o substrato secundário 34. O nucleotídeo marcado 12A a 12C inclui um nucleotídeo 14’ que tem um grupo de bloqueio 3’- OH; uma molécula de ligação clivável 16’ ligada a uma base ou um açúcar do nucleotídeo 14’; e um marcador 18 ligado à molécula de ligação 16’, em que o marcador 18 serve para participar em uma reação de alteração de pH que envolve o substrato secundário 34.

[0241] O marcador 18 do nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C irá depender do complexo 30A-30D que é usado, e as combinações e reações de geração de ácido ou base associadas conforme descrito em referência às Figuras 3A e 3B, 4, 5, e 6A e 6B podem ser usadas. Como um exemplo, quando a porção de alteração de pH do complexo 30A é uma enzima 50A, o marcador 18B é usado, e pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em um primeiro grupo que acentua a cinética da enzima 50A e um seguna partir do grupo que reduz a cinética da enzima 50A. Como um outro exemplo, a porção de alteração de pH é o complexo de coordenação metálico 50E, e o marcador 18E pode ser usado. Conforme discutido na presente invenção em referência à Figura 5, o marcador 18E é um ligante para um metal do complexo de coordenação metálico 50E, em que o ligante altera a propriedade catalítica do complexo de coordenação metálico 50E. Ainda como um outro exemplo, a porção de alteração de pH é o cofator 50B ou ativador 50C, e o marcador 18C é um marcador de catalisador que é ativado pelo cofator 50B ou ativador 50C. Ainda como um outro exemplo, a porção de alteração de pH é a enzima 50A, e o complexo 30D inclui o conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58. O marcador 18F é a sequência oligonucleotídica que é complementar a uma porção do conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo 58.

[0242] A mistura de incorporação introduz o complexo 30A a 30D e o nucleotídeo marcado 12 ou 12A a 12C na célula de fluxo 62. A mistura de incorporação também pode incluir um iniciador de sequenciamento que hibridiza em uma sequência complementar na cadeia polinucleotídica modelo

44. Esse iniciador de sequenciamento faz com que a cadeia polinucleotídica modelo 44 fique pronta para o sequenciamento.

[0243] Um outro fluido pode ser usado para introduzir o substrato secundário 34 na célula de fluxo 62. A mistura de incorporação e o fluido que inclui o substrato secundário 34 pode ser parte de um kit. Qualquer exemplo da célula de fluxo 62 (mostrado nas Figuras 7C e 7D) pode ser incluído no kit.

[0244] Quando a mistura de incorporação inclui o nucleotídeo marcado 12 (o marcador 18 do qual é naturalmente clivada após a incorporação), deve-se compreender que a mistura de incorporação e o fluido com o substrato secundário 34 podem ser introduzidos na célula de fluxo 62 simultaneamente ou um logo após o outro, de modo que o substrato secundário 34 esteja presente na célula de fluxo 62 durante o evento de incorporação. Devido ao fato de que o marcador 18 é naturalmente clivado após a incorporação, é desejável que o substrato secundário 34 esteja presente enquanto o marcador 18 é retido nas proximidades do canal condutor 26 ou 26’. Em contrapartida, quando a mistura de incorporação inclui o nucleotídeo marcado 12A a 12C (que inclui o grupo de bloqueio e dessa forma seu marcador 18 não é naturalmente clivada), deve-se compreender que a mistura de incorporação e o fluido com o substrato secundário 34 pode ser introduzida na célula de fluxo 62 simultaneamente ou um logo após o outro, ou o fluido com o substrato secundário 34 pode ser introduzido após a incorporação ter ocorrido. Devido ao fato de que o marcador 18 permanece aglutinado até que um agente de desbloqueio seja introduzido, o substrato secundário 34 pode ser introduzido a qualquer momento durante ou após o evento de incorporação.

[0245] Quando a mistura de incorporação e o fluido com o substrato secundário 34 são introduzidos na célula de fluxo 62, os fluidos entram nas depressões 70 (onde as cadeias polinucleotídicas modelo 44 estão presentes). Um dos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C é incorporado, por uma respectiva polimerase 28 de um respectivo complexo 30A a 30D, em um filamento nascente 46 que estende o iniciador de sequenciamento e que é complementar à cadeia polinucleotídica modelo 44. Em outras palavras, em pelo menos algumas das cadeias polinucleotídicas modelo 44 ao longo da célula de fluxo 62, as respectivas polimerases 28 estendem o iniciador de sequenciamento hibridizado por um dos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C na solução.

[0246] Nesses exemplos, devido ao fato de que a polimerase 28 faz parte do complexo 30A-30D que inclui a porção de alteração de pH 50A a 50E e devido ao fato de que a polimerase 28 participa na incorporação de nucleotídeo, a porção de alteração de pH 50A a 50E é colocada nas proximidades do canal condutor 26 ou 26’ durante o evento de incorporação. O marcador 18 do nucleotídeo incorporado 12 ou 12A a 12C também é colocado nas proximidades da porção de alteração de pH 50A a 50E e do canal condutor 26, 26’. Isso permite que a porção de alteração de pH 50A a 50E e o marcador 18 participem de uma reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário 34 próximo ao canal condutor 26, 26’. As várias reações e os efeitos da combinações de porção específica 50A a 50E e do marcador 18 são iguais conforme descrito em referência às Figuras 3A e 3B, 4, 5, e 6A e 6B. A mudança no pH como resultado da reação de geração de ácido ou base altera a carga no canal condutor 26, 26’, e a mudança da carga é detectada. A mudança na carga e/ou a taxa da mudança da carga pode ser usada para identificar os nucleotídeos incorporados. Devido ao fato de que múltiplos eventos de incorporação estão ocorrendo em múltiplos iniciadores 74 em uma única depressão, os sinais de carga podem ser fortes e prontamente detectáveis em cada canal condutor individual 26, 26’.

[0247] Em exemplos de sequenciamento de conjunto que incluem o nucleotídeo marcado 12, o marcador 18 e a molécula de ligação 16 naturalmente clivam após a incorporação.

[0248] Em exemplos de sequenciamento de conjunto que incluem o nucleotídeo marcado 12A a 12C, o marcador 18 e a molécula de ligação 16’ permanecem incorporados até que um agente de desbloqueio seja adicionado e lavado através da célula de fluxo 62.

[0249] Em alguns exemplos de sequenciamento de conjunto, a polimerase 28 do complexo 30A a 30D pode ser altamente processável, e pode dessa forma não precisar ser introduzido com cada ciclo de sequenciamento. Em outros exemplos, uma polimerase fresca 28 (por exemplo, como parte de um complexo 30A a 30D) pode ser introduzida com cada ciclo de sequenciamento.

[0250] Em um outro exemplo de sequenciamento de conjunto que usa a célula de fluxo 62 conforme descrito em referência às Figuras 7C e 7D, a mistura de incorporação pode não incluir um exemplo do complexo 30A a 30D, mas invés pode incluir a polimerase 28 sozinho. Esse exemplo é similar ao exemplo descrito na Figura 2, exceto que a polimerase 28 está presente na mistura de incorporação e não é conectada à superfície do canal condutor 26, 26’. Esse exemplo da mistura de incorporação pode incluir um líquido veículo, a polimerase 28, e os nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C que incluem o marcador 18A que, conforme descrito em referência à Figura 2, é um catalisador que inicia ou acelera uma reação de geração de ácido ou base que envolve o substrato secundário 34. Um segundo fluido que inclui um líquido veículo e o substrato secundário 34 pode ser usado com esse exemplo da mistura de incorporação.

[0251] Quando esse exemplo da mistura de incorporação e o fluido com o substrato secundário 34 são introduzidos no exemplo da célula de fluxo 62 mostrado nas Figuras 7B e 7C, os fluidos entram nas depressões 70 (onde as cadeias polinucleotídicas modelo 44 estão presentes). Um dos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C é incorporado, por uma respectiva polimerase 28, em um filamento nascente 46 que estende o iniciador de sequenciamento e que é complementar à cadeia polinucleotídica modelo 44. Em outras palavras, em pelo menos algumas das cadeias polinucleotídicas modelo 44 ao longo da célula de fluxo 62, as respectivas polimerases 28 estendem o iniciador de sequenciamento hibridizado por um dos nucleotídeos marcados 12 ou 12A a 12C na solução.

[0252] Nesses exemplos, o marcador de catalisador 18A do nucleotídeo incorporado 12 ou 12A a 12C é colocada nas proximidades do canal condutor 26, 26’. Isso permite que o marcador de catalisador 18A participe na reação de geração de ácido ou base com o substrato secundário 34 próximo ao canal condutor 26, 26’. As várias reações e os efeitos do marcador de catalisador 18A são iguais conforme descrito em referência à Figura 2. A mudança no pH como resultado da reação de geração de ácido ou base altera a carga no canal condutor 26, 26’, e a mudança da carga é detectada. A mudança na carga e/ou a taxa da mudança da carga pode ser usada para identificar os nucleotídeos incorporados. Devido ao fato de que múltiplos eventos de incorporação estão ocorrendo em quaisquer múltiplos iniciadores 74 em uma única depressão, os sinais de carga podem ser fortes e prontamente detectáveis em cada canal condutor individual 26, 26’. Conclusão

[0253] Embora a detecção de molécula única e a detecção de conjunto tenham sido descritas em detalhes, deve ser entendido que as reações de geração de ácido ou base reveladas na presente invenção podem ser utilizadas com outro protocolo de sequenciamento, para genotipagem ou em outras aplicações químicas e/ou biológicas.

[0254] Deve ser apreciado que todas as combinações dos conceitos anteriores e conceitos adicionais discutidos em mais detalhes abaixo (desde que tais conceitos não sejam mutuamente inconsistentes) são contemplados como sendo parte da matéria inventiva revelada na presente invenção. Em particular, todas as combinações da matéria reivindicada que aparecem no final desta invenção são contempladas como sendo parte da matéria inventiva revelada na presente invenção. Também deve ser apreciado que a terminologia explicitamente empregada na presente invenção, que também pode aparecer em qualquer invenção incorporada a título de referência, deve receber um significado mais consistente com os conceitos específicos revelados na presente invenção.

[0255] Referência ao longo da especificação a “um (numeral) exemplo”, “outro exemplo”, “um exemplo” e assim por diante, significa que um elemento particular (por exemplo, recurso, estrutura e/ou característica) descrito em conjunto com o exemplo está incluído em pelo menos um exemplo descrito na presente invenção, e pode ou não estar presente em outros exemplos. Além disso, deve ser entendido que os elementos descritos para qualquer exemplo podem ser combinados de qualquer maneira adequada nos vários exemplos, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[0256] Os termos “substancialmente” e “cerca de” usados ao longo desta invenção, incluindo as reivindicações, são usados para descrever e contabilizar pequenas flutuações, como devido a variações no processamento. Por exemplo, os mesmos podem se referir a menos que ou igual a ±5%, como menos que ou igual a ±2%, como menos que ou igual a ±1%, como menos que ou igual a ±0,5%, como menos que ou igual a ±0,2%, como menos que ou igual a ±0,1%, como menos que ou igual a ±0,05%.

[0257] Ademais, deve ser entendido que as faixas fornecidas na presente invenção incluem a faixa declarada e qualquer valor ou subfaixa dentro da faixa declarada, como se fossem explicitamente citados.

Por exemplo, uma faixa representada por 1 nm a menos de 1 µm deve ser interpretada como incluindo não apenas os limites explicitamente citados de 1 nm a menos de 1 µm, mas também incluindo valores individuais, como cerca de 5 nm, 222,5 nm, 275 nm, etc., e subfaixas, como de cerca de 150 nm a cerca de 800 nm, etc.

Embora vários exemplos tenham sido descritos em detalhes, deve ser entendido que os exemplos revelados podem ser modificados.

Portanto, a descrição supracitada deve ser considerada como não limitativa.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Sistema de detecção, caracterizado pelo fato de que compreende: um sensor de pH incluindo: dois eletrodos; e um canal condutor operativamente conectado aos dois eletrodos; e um complexo ligado ao canal condutor do sensor de pH, o complexo incluindo uma polimerase ligada a pelo menos uma porção que altera o pH que é para participar na geração de uma mudança de pH nas proximidades do canal condutor a partir do consumo de um substrato secundário em um fluido que é exposto ao sensor de pH, em que pelo menos uma porção que altera o pH sendo selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima, um complexo de coordenação metálico, um cofator e um ativador.

2. Sistema de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção que altera o pH é a enzima, e em que a enzima gera um ácido ou uma base em uma reação com o substrato secundário.

3. Sistema de detecção de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em hidrolases e oxidases.

4. Sistema de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cinética de pelo menos uma porção que altera o pH é pelo menos 10 vezes mais rápida que a cinética da polimerase.

5. Sistema de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção que altera o pH é a enzima, e em que o complexo compreende adicionalmente um conjugado de inibidor enzimático- ácido nucleico em forma de grampo de cabelo ligado à enzima.

6. Sistema de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que:

pelo menos uma porção que altera o pH é a enzima; e o complexo inclui adicionalmente uma segunda enzima ligada à polimerase.

7. Sistema de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o complexo é uma proteína de fusão ou uma quimera proteica.

8. Sistema de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o canal condutor do sensor de pH é selecionado a partir do grupo que consiste em uma nanoestrutura semicondutora, uma nanoestrutura de grafeno, uma nanoestrutura metálica e uma nanoestrutura polimérica condutora.

9. Sistema de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: um suporte incluindo uma pluralidade de depressões separadas por regiões intersticiais, em que pelo menos o canal condutor do sensor de pH está em um fundo de uma da pluralidade de depressões; e uma pluralidade de sensores de pH adicionais, em que pelo menos um canal condutor de cada um da pluralidade de sensores de pH adicionais está em um fundo de uma respectiva depressão da pluralidade de depressões.

10. Sistema de detecção de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que cada uma da pluralidade de depressões inclui paredes laterais, e em que as paredes laterais incluem um material tampão de pH.

11. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: um sensor de pH, incluindo: dois eletrodos; e um canal condutor operativamente conectado aos dois eletrodos; e um fluido, incluindo: um veículo líquido; e um complexo no veículo líquido, o complexo incluindo uma polimerase ligada a pelo menos uma enzima que é para criar uma mudança de pH nas proximidades do canal condutor a partir do consumo de um substrato secundário em um segundo fluido que é exposto ao sensor de pH.

12. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o segundo fluido, incluindo: um segundo veículo líquido; e um nucleotídeo marcado, incluindo: um nucleotídeo; uma molécula de ligação ligada a um grupo fosfato terminal do nucleotídeo; e um marcador ligado à molécula de ligação, o marcador sendo selecionado a partir do grupo que consiste em um primeiro grupo que acentua a cinética da enzima e um segundo grupo que reduz a cinética da enzima.

13. Kit de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que: o substrato secundário está no segundo fluido e é uma molécula separada do nucleotídeo marcado; e o primeiro grupo ou o segundo grupo é para alterar cinética de uma reação de geração de ácido ou base que envolve a enzima e o substrato secundário.

14. Kit de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que: o substrato secundário está no segundo fluido e é uma molécula separada a partir do nucleotídeo marcado; o marcador é o segundo grupo que reduz a cinética da enzima; e o segundo grupo é selecionado a partir do grupo que consiste em um inibidor alostérico, um grupo de exclusão estérico, e um grupo de tamponamento.

15. Kit de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que: o substrato secundário está no segundo fluido e é uma molécula separada do nucleotídeo marcado; o marcador é o primeiro grupo que acentua a cinética da enzima; e o primeiro grupo é um cofator da enzima.

16. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o segundo fluido, incluindo: um segundo veículo líquido; e um nucleotídeo marcado, incluindo: um nucleotídeo; e o substrato secundário ligado a uma base ou um açúcar do nucleotídeo, em que a cinética do substrato secundário é pelo menos 10 vezes mais rápida que a cinética da polimerase.

17. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: um sensor de pH, incluindo: dois eletrodos; e um canal condutor operativamente conectado aos dois eletrodos; e um fluido, incluindo: um veículo líquido; e um complexo no veículo líquido, o complexo incluindo uma polimerase ligada a um complexo de coordenação metálico que é para criar uma mudança de pH nas proximidades do canal condutor a partir do consumo de um substrato secundário em um segundo fluido que é exposto ao sensor de pH.

18. Kit de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o segundo fluido, incluindo: um segundo veículo líquido; o substrato secundário, em que o substrato secundário é para gerar um ácido ou base através de uma reação com o complexo de coordenação metálico; e um nucleotídeo marcado, incluindo: um nucleotídeo; uma molécula de ligação ligada a um grupo fosfato terminal do nucleotídeo; e um marcador ligado à molécula de ligação, o marcador sendo um ligante para um metal do complexo de coordenação metálico, em que o ligante altera uma propriedade catalítica do complexo de coordenação metálico.

19. Nucleotídeo marcado, caracterizado pelo fato de que compreende: um nucleotídeo; uma molécula de ligação ligada a um grupo fosfato terminal do nucleotídeo; e um marcador de catalisador ligado à molécula de ligação, em que o marcador de catalisador é para criar uma mudança de pH a partir do consumo de um substrato secundário em um fluido com o nucleotídeo marcado.

20. Nucleotídeo marcado de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o marcador de catalisador é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrolases e oxidases.

21. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: o nucleotídeo marcado definido na reivindicação 19; e um sistema de detecção, incluindo: dois eletrodos; um canal condutor operativamente conectado aos dois eletrodos; e um complexo ligado ao canal condutor, o complexo incluindo uma polimerase conjugada a um cofator ou um ativador do marcador de catalisador do nucleotídeo marcado.

22. Nucleotídeo marcado, caracterizado pelo fato de que compreende: um nucleotídeo tendo um grupo de bloqueio 3' OH;

uma molécula de ligação clivável ligada a uma base ou um açúcar do nucleotídeo; e um marcador ligado à molécula de ligação clivável, em que o marcador é para participar em uma reação que altera o pH envolvendo o substrato secundário.

23. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: o nucleotídeo marcado definido na reivindicação 22; um sistema de detecção, incluindo: dois eletrodos; um canal condutor operativamente conectado aos dois eletrodos; e um complexo ligado ao canal condutor, o complexo incluindo uma polimerase conjugada a um cofator ou um ativador do marcador de catalisador do nucleotídeo marcado.

24. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir um fluido em um arranjo de sensor incluindo uma pluralidade de canais condutores individualmente endereçáveis, ligando assim um complexo a pelo menos alguma da pluralidade de canais condutores individualmente endereçáveis, o complexo incluindo: uma polimerase; e uma porção que altera o pH ligada à polimerase, a porção que altera o pH sendo selecionada do grupo que consiste em uma enzima que é para catalisar o consumo de um substrato secundário em uma solução que é para ser exposto ao arranjo de sensor, um complexo de coordenação metálico que é para catalisar o consumo do substrato secundário na solução que é para ser exposto ao arranjo de sensor, e um cofator ou ativador de um marcador de catalisador ligado a um nucleotídeo marcado que é para ser introduzido no arranjo de sensor.

25. Método, caracterizado pelo fato de que compreende:

introduzir uma cadeia polinucleotídica modelo a um sensor tendo uma polimerase conectada a um canal condutor; introduzir um fluido incluindo um substrato secundário e nucleotídeos marcados ao sensor, em que um nucleotídeo de um dos nucleotídeos marcados se associa com a polimerase e um marcador de um dos nucleotídeos marcados participa em uma reação que altera o pH envolvendo o substrato secundário que está nas proximidades do canal condutor; e detectar uma resposta do canal condutor.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que: a polimerase do sensor é parte de um complexo com um catalisador enzimático; o marcador é um grupo que acentua ou reduz a cinética do catalisador enzimático; e o método compreende adicionalmente detectar uma mudança na carga comparado a uma carga de linha de base.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que: a polimerase do sensor é parte de um complexo com um catalisador enzimático; o marcador é o substrato secundário; e o método compreende adicionalmente detectar uma mudança na carga comparado a uma carga de linha de base.

28. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que: a polimerase do sensor é parte de um complexo com um complexo de coordenação metálico;

o marcador é um ligante para um metal do complexo de coordenação metálico; e o método compreende adicionalmente detectar uma mudança na carga comparado a uma carga de linha de base.

29. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que: a polimerase do sensor é parte de um complexo com um catalisador enzimático; um conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo é ligado ao catalisador enzimático; o marcador é uma sequência oligonucleotídica que é complementar a uma porção do conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo; e o método compreende adicionalmente detectar uma mudança na carga comparado a uma carga de linha de base.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente identificar o nucleotídeo associado com a polimerase a partir da mudança na carga ou uma taxa da mudança na carga.

31. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos marcados têm taxas de incorporação distintas, e em que o método compreende adicionalmente identificar o nucleotídeo marcado associado por sua taxa de incorporação distinta.

32. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: selecionar uma porção que altera o pH a partir do grupo que consiste em uma enzima que é para catalisar o consumo de um substrato secundário em uma solução, um complexo de coordenação metálico que é para catalisar o consumo do substrato secundário na solução, e um cofator ou um ativador de um marcador de catalisador ligado a um nucleotídeo marcado; conjugar uma polimerase à porção que altera o pH para gerar um complexo; e ligar o complexo a um canal condutor operativamente conectado a dois eletrodos.

33. Mistura de incorporação, caracterizada pelo fato de que compreende: um veículo líquido; um complexo incluindo: uma polimerase; e uma porção que altera o pH ligada à polimerase, a porção que altera o pH sendo selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima que é para catalisar o consumo de um substrato secundário, um complexo de coordenação metálico que é para catalisar o consumo do substrato secundário e um cofator ou um ativador que é para catalisar o consumo do substrato secundário; e um nucleotídeo marcado, incluindo: um nucleotídeo; uma molécula de ligação ligada a um grupo fosfato terminal do nucleotídeo; e um marcador ligado à molécula de ligação, em que o marcador é para participar em uma reação que altera o pH envolvendo o substrato secundário.

34. Mistura de incorporação de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que: a porção que altera o pH é a enzima, e o marcador é selecionado a partir do grupo que consiste em um primeiro grupo que acentua a cinética da enzima e um segundo grupo que reduz a cinética da enzima; a porção que altera o pH é o complexo de coordenação metálico, e o marcador é um ligante para um metal do complexo de coordenação metálico, em que o ligante altera a propriedade catalítica do complexo de coordenação metálico; ou a porção que altera o pH é o cofator ou o ativador, e o marcador é o marcador de catalisador que é ativado pelo cofator ou pelo ativador.

35. Mistura de incorporação de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que: a porção que altera o pH é a enzima; o complexo inclui adicionalmente um conjugado de inibidor enzimático- ácido nucleico em forma de grampo de cabelo ligado à enzima; e o marcador é uma sequência oligonucleotídica que é complementar a uma porção do conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo.

36. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: a mistura de incorporação definida na reivindicação 33; e uma mistura de substrato secundário incluindo um segundo veículo líquido e o substrato secundário.

37. Kit de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: uma célula de fluxo incluindo: um substrato incluindo uma pluralidade de depressões separadas por regiões intersticiais; um canal condutor em um fundo de cada uma da pluralidade de depressões; e pelo menos um iniciador enxertado em cada uma das depressões.

38. Mistura de incorporação, caracterizada pelo fato de que compreende: um veículo líquido incluindo um tampão;

um complexo incluindo: uma polimerase; e uma porção que altera o pH ligada à polimerase, a porção que altera o pH sendo selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima que é para catalisar o consumo de um substrato secundário, um complexo de coordenação metálico que é para catalisar o consumo do substrato secundário, e um cofator ou um ativador que é para catalisar o consumo do substrato secundário; e um nucleotídeo marcado, incluindo: um nucleotídeo tendo um grupo de bloqueio 3' OH; uma molécula de ligação clivável ligada a uma base ou um açúcar do nucleotídeo; e um marcador ligado à molécula de ligação, em que o marcador é para participar em uma reação que altera o pH envolvendo o substrato secundário.

39. Mistura de incorporação de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que: a porção que altera o pH é a enzima, e o marcador é selecionado a partir do grupo que consiste em um primeiro grupo que acentua a cinética da enzima, um segundo grupo que reduz a cinética da enzima, e o substrato secundário; ou a porção que altera o pH é o complexo de coordenação metálico, e o marcador é um ligante para um metal do complexo de coordenação metálico, em que o ligante altera a propriedade catalítica do complexo de coordenação metálico; ou a porção que altera o pH é o cofator ou o ativador, e o marcador é o marcador de catalisador que é ativada pelo cofator ou pelo ativador.

40. Mistura de incorporação de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que: a porção que altera o pH é a enzima;

o complexo inclui adicionalmente um conjugado de inibidor enzimático- ácido nucleico em forma de grampo de cabelo ligado à enzima; e o marcador é uma sequência oligonucleotídica que é complementar a uma porção do conjugado de inibidor enzimático-ácido nucleico em forma de grampo de cabelo.

41. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: a mistura de incorporação definida na reivindicação 38; e uma mistura de substrato secundário incluindo um segundo veículo líquido e o substrato secundário.

42. Kit de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: uma célula de fluxo, incluindo: um substrato incluindo uma pluralidade de depressões separadas por regiões intersticiais; um canal condutor em um fundo de cada uma da pluralidade de depressões; e um iniciador enxertado em cada uma das depressões.

43. Kit de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a solução de agente de desbloqueio.