KR20210125892A - 감지 시스템들 - Google Patents
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Abstract
일례에서, 감지 시스템은 pH 센서를 포함한다. pH 센서는 2개의 전극들, 및 2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널을 포함한다. pH 센서의 전도성 채널에 복합체가 부착된다. 복합체는 pH 센서에 노출되는 유체 내의 2차 기질의 소비로부터 전도성 채널 근처 내에서의 pH 변화를 생성하는데 참여할 적어도 하나의 pH 변경 모이어티에 링크된 중합 효소를 포함한다. 적어도 하나의 pH 변경 모이어티는 효소, 금속 배위 복합체, 보조 인자, 및 활성화제로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
Description
[0001]
본 출원은 2019년 2월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/806,545호를 우선권으로 청구하고, 그 미국 가출원의 내용은 그 전체가 인용에 의해 본원에 통합된다.
[0002]
생물학적 또는 화학적 연구에 있어서의 다양한 프로토콜들은 국소 지지 표면들 상에서 또는 미리 정의된 반응 챔버들 내에서 다수의 제어된 반응들을 수행하는 것을 수반한다. 그런다음, 지정된 반응들이 관찰되거나 검출될 수 있고, 후속 분석은 반응에 수반되는 화학물들의 특성들을 식별하거나 밝혀내는데 도움을 줄 수 있다. 일부 예들에서, 제어된 반응들은 형광을 발생시키며, 그에 따라서 광학 시스템이 검출을 위해 사용될 수 있다. 다른 예들에서, 제어된 반응들은 전하, 전도도, 또는 일부 다른 전기적 특성을 변경하고, 그에 따라서 전자 시스템이 검출을 위해 사용될 수 있다.
[0003]
본원에 개시된 제1 양상은 감지 시스템이고, 감지 시스템은 pH 센서 ― pH 센서는 2개의 전극들, 및 2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널을 포함함 ―; 및 pH 센서의 전도성 채널에 부착된 복합체(complex)를 포함하고, 복합체는 pH 센서에 노출되는 유체 내의 2차 기질의 소비로부터 전도성 채널 근처 내에서의 pH 변화를 생성하는 데 참여할 적어도 하나의 pH 변경 모이어티에 링크된 중합 효소를 포함하고, 적어도 하나의 pH 변경 모이어티는 효소, 금속 배위 복합체, 보조 인자 및 활성화제로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
[0004]
이러한 제1 양상의 예에서, 적어도 하나의 pH 변경 모이어티는 효소이고, 그리고 효소는 2차 기질과 반응하여 산 또는 염기를 생성한다. 일 특정 예에서, 효소는 가수 분해 효소들 및 산화 효소들로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
[0005]
이러한 제1 양상의 예에서, 적어도 하나의 pH 변경 모이어티의 동역학은 중합 효소의 동역학보다 적어도 10배 더 빠르다.
[0006]
이러한 제1 양상의 예에서, 적어도 하나의 pH 변경 모이어티는 효소이고, 그리고 복합체는 효소에 부착된 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체를 더 포함한다.
[0007]
이러한 제1 양상의 예에서, 적어도 하나의 pH 변경 모이어티는 효소이고, 그리고 복합체는 중합 효소에 부착된 제2 효소를 더 포함한다.
[0008]
이러한 제1 양상의 예에서, 복합체는 융합 단백질 또는 단백질 키메라이다.
[0009]
이러한 제1 양상의 예에서, pH 센서의 전도성 채널은 반도체 나노구조, 그래핀 나노구조, 금속 나노구조 및 전도성 중합체 나노구조로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
[0010]
이러한 제1 양상의 예는 간극 구역들에 의해 분리된 복수의 함몰부들을 포함하는 지지체 ― pH 센서의 적어도 전도성 채널은 복수의 함몰부들 중 하나의 최하부에 있음 ―; 및 복수의 추가 pH 센서들을 더 포함하고, 복수의 추가 pH 센서들 각각의 적어도 전도성 채널은 복수의 함몰부들 개개의 최하부에 있다. 일 특정 예에서, 복수의 함몰부들 각각은 측벽들을 포함하고, 그리고 측벽들은 pH 완충 재료를 포함한다.
[0011]
본원에 개시된 감지 시스템의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식 및/또는 구성으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0012]
본원에 개시된 제2 양상은 키트(kit)이고, 키트는 pH 센서 ― pH 센서는 2개의 전극들, 및 2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널을 포함함 ―; 및 유체를 포함하고, 유체는 액체 캐리어, 및 액체 캐리어 내의 복합체를 포함하며, 복합체는 pH 센서에 노출되는 제2 유체 내의 2차 기질의 소비로부터 전도성 채널 근처 내에서의 pH 변화를 생성할 적어도 하나의 효소에 링크된 중합 효소를 포함한다.
[0013]
이러한 제2 양상의 예는 제2 유체를 더 포함하고, 제2 유체는 제2 액체 캐리어, 및 라벨링된 뉴클레오티드를 포함하고, 라벨링된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드의 말단 인산기에 부착된 링킹 분자(linking molecule), 및 링킹 분자에 부착된 라벨을 포함하며, 라벨은 효소의 동역학을 강화시키는 제1 그룹 및 효소의 동역학을 감속시키는 제2 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일 특정 예에서, 2차 기질은 제2 유체 내에 있고, 라벨링된 뉴클레오티드와는 별도의 분자이며, 그리고 제1 그룹 또는 제2 그룹은 효소 및 2차 기질을 수반하는 산 또는 염기 생성 반응의 동역학을 변경한다. 다른 특정 예에서, 2차 기질은 제2 유체 내에 있고, 라벨링된 뉴클레오티드와는 별도의 분자이고, 라벨은 효소의 동역학을 감속시키는 제2 그룹이며, 그리고 제2 그룹은 알로스테릭 억제제, 스테릭 배제 그룹 및 완충 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 특정 예에서, 2차 기질은 제2 유체 내에 있고, 라벨링된 뉴클레오티드와는 별도의 분자이며, 라벨은 효소의 동역학을 강화시키는 제1 그룹이며, 그리고 제1 그룹은 효소의 보조 인자이다.
[0014]
이러한 제2 양상의 다른 예는 제2 유체를 더 포함하고, 제2 유체는 제2 액체 캐리어, 및 라벨링된 뉴클레오티드를 포함하고, 라벨링된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드, 및 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 부착된 2차 기질을 포함하고, 2차 기질의 동역학은 중합 효소의 동역학보다 적어도 10배 더 빠르다.
[0015]
키트의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 키트 및/또는 감지 시스템의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0016]
본원에 개시된 제3 양상은 키트이고, 키트는 pH 센서 ― pH 센서는 2개의 전극들, 및 2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널을 포함함 ―; 및 유체를 포함하고, 유체는 액체 캐리어, 및 액체 캐리어 내의 복합체를 포함하며, 복합체는 pH 센서에 노출되는 제2 유체 내의 2차 기질의 소비로부터 전도성 채널 근처 내에서의 pH 변화를 생성할 금속 배위 복합체에 링크된 중합 효소를 포함한다.
[0017]
이러한 제3 양상의 예는 제2 유체를 더 포함하고, 제2 유체는 제2 액체 캐리어, 2차 기질(2차 기질은 금속 배위 복합체와의 반응을 통해 산 또는 염기를 생성함), 및 라벨링된 뉴클레오티드를 포함하고, 라벨링된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드의 말단 인산기에 부착된 링킹 분자, 및 링킹 분자에 부착된 라벨을 포함하고, 라벨은 금속 배위 복합체의 금속에 대한 리간드이고, 그리고 리간드는 금속 배위 복합체의 촉매 특성을 변경한다.
[0018]
이러한 키트의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 키트 또는 감지 시스템 및/또는 다른 키트의 특정들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0019]
본원에 개시된 제4 양상은 라벨링된 뉴클레오티드이고, 라벨링된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드; 뉴클레오티드의 말단 인산기에 부착된 링킹 분자; 및 링킹 분자에 부착된 촉매 라벨을 포함하고, 촉매 라벨은 라벨링된 뉴클레오티드를 갖는 유체 내의 2차 기질의 소비로부터 pH 변화를 생성한다.
[0020]
제4 양상의 예에서, 촉매 라벨은 가수 분해 효소들 및 산화 효소들로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
[0021]
이러한 라벨링된 뉴클레오티드의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 라벨링된 뉴클레오티드 및/또는 감지 시스템 및/또는 키트들의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0022]
본원에 개시된 제5 양상은 키트이고, 키트는 제4 양상의 라벨링된 뉴클레오티드; 및 감지 시스템을 포함하고, 감지 시스템은 2개의 전극들, 2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널, 및 전도성 채널에 부착된 복합체를 포함하고, 복합체는 라벨링된 뉴클레오티드의 촉매 라벨의 보조 인자 또는 활성화제에 접합된 중합 효소를 포함한다.
[0023]
이러한 키트의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 키트 및/또는 감지 시스템 및/또는 다른 키트들 및/또는 라벨링된 뉴클레오티드의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0024]
본원에 개시된 제6 양상은 라벨링된 뉴클레오티드이고, 라벨링된 뉴클레오티드는 3'OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드; 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 부착된 절단가능 링킹 분자; 및 절단가능 링킹 분자에 부착된 라벨을 포함하고, 라벨은 2차 기질을 수반하는 pH 변경 반응에 참여한다.
[0025]
이러한 라벨링된 뉴클레오티드의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 라벨링된 뉴클레오티드 및/또는 감지 시스템 및/또는 키트들 및/또는 다른 라벨링된 뉴클레오티드의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0026]
본원에 개시된 제7 양상은 키트이고, 키트는 제6 양상의 라벨링된 뉴클레오티드; 및 감지 시스템을 포함하고, 감지 시스템은 2개의 전극들, 2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널, 및 전도성 채널에 부착된 복합체를 포함하고, 복합체는 라벨링된 뉴클레오티드의 촉매 라벨의 보조 인자 또는 활성화제에 접합된 중합 효소를 포함한다.
[0027]
이러한 키트의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 키트 및/또는 감지 시스템 및/또는 키트들 및/또는 라벨링된 뉴클레오티드들의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0028]
본원에 개시된 제8 양상은 방법이고, 방법은 복수의 개별적으로 어드레싱가능한 전도성 채널들을 포함하는 센서 어레이에 유체를 도입시키는 단계 ― 그로 인해 복수의 개별적으로 어드레싱가능한 전도성 채널들 중 적어도 일부에 복합체를 부착함 ― 를 포함하고, 복합체는 중합 효소 및 중합 효소에 링크된 pH 변경 모이어티를 포함하고, pH 변경 모이어티는 센서 어레이에 노출될 용액 내의 2차 기질의 소비를 촉진시킬 효소, 센서 어레이에 노출될 용액 내의 2차 기질의 소비를 촉진시킬 금속 배위 복합체, 및 센서 어레이에 도입될 라벨링된 뉴클레오티드에 부착된 촉매 라벨의 보조 인자 또는 활성화제로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
[0029]
이러한 방법의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 방법 및/또는 감지 시스템 및/또는 키트들 및/또는 라벨링된 뉴클레오티드들의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0030]
본원에 개시된 제9 양상은 전도성 채널에 테더링된 중합 효소를 갖는 센서에 주형 폴리뉴클레오티드 사슬을 도입시키는 단계; 2차 기질 및 라벨링된 뉴클레오티드들을 포함하는 유체를 센서에 도입시키는 단계 ― 그로 인해 라벨링된 뉴클레오티드들 중 하나의 뉴클레오티드는 중합 효소와 연관되며, 라벨링된 뉴클레오티드들 중 하나의 라벨은 전도성 채널 근처 내에 있는 2차 기질을 수반하는 pH 변경 반응에 참여함 ―; 및 전도성 채널의 응답을 검출하는 단계를 포함하는 방법이다.
[0031]
이러한 제9 양상의 예에서, 센서의 중합 효소는 효소 촉매를 갖는 복합체의 부분이며, 라벨은 효소 촉매의 동역학을 강화시키거나 감속시키는 그룹이며, 방법은 베이스라인 전하와 비교하여 전하 변화를 검출하는 단계를 더 포함한다.
[0032]
이러한 제9 양상의 예에서, 센서의 중합 효소는 효소 촉매를 갖는 복합체의 부분이며, 라벨은 2차 기질이며, 방법은 베이스라인 전하와 비교하여 전하 변화를 검출하는 단계를 더 포함한다.
[0033]
이러한 제9 양상의 예에서, 센서의 중합 효소는 금속 배위 복합체를 갖는 복합체의 부분이며, 라벨은 금속 배위 복합체의 금속에 대한 리간드이며, 방법은 베이스라인 전하와 비교하여 전하 변화를 검출하는 단계를 더 포함한다.
[0034]
이러한 제9 양상의 예에서, 센서의 중합 효소는 효소 촉매를 갖는 복합체의 부분이며, 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체는 효소 촉매에 부착되며, 라벨은 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열이며, 방법은 베이스라인 전하와 비교하여 전하 변화를 검출하는 단계를 더 포함한다.
[0035]
제9 양상의 예들 중 어느 하나 이상의 예들은 전하 변화 또는 전하 변화의 레이트로부터 중합 효소와 연관된 뉴클레오티드를 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
[0036]
이러한 제9 양상의 예에서, 라벨링된 뉴클레오티드들은 별개의 통합 레이트들을 갖고, 그리고 방법은 라벨링된 뉴클레오티드들의 별개의 통합 레이트에 의해 연관된 라벨링된 뉴클레오티드를 식별하는 단계를 더 포함한다.
[0037]
이러한 방법의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 방법 및/또는 다른 방법들 및/또는 감지 시스템 및/또는 키트들 및/또는 라벨링된 뉴클레오티드들의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0038]
본원에 개시된 제10 양상은 용액 내의 2차 기질의 소비를 촉진시킬 효소, 용액 내의 2차 기질의 소비를 촉진시킬 금속 배위 복합체, 및 라벨링된 뉴클레오티드에 부착된 촉매 라벨의 보조 인자 또는 활성화제로 구성된 그룹으로부터 pH 변경 모이어티를 선택하는 단계; 복합체를 생성하기 위해 중합 효소를 pH 변경 모이어티에 접합시키는 단계; 및 2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널에 복합체를 부착하는 단계를 포함하는 방법이다.
[0039]
이러한 방법의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 방법 및/또는 다른 방법들 및/또는 감지 시스템 및/또는 키트들 및/또는 라벨링된 뉴클레오티드들의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0040]
본원에 개시된 제11 양상은 통합 혼합물이며, 통합 혼합물은 액체 캐리어; 중합 효소 및 중합 효소에 링크된 pH 변경 모이어티를 포함하는 복합체 ― pH 변경 모이어티는 2차 기질의 소비를 촉진시킬 효소, 2차 기질의 소비를 촉진시킬 금속 배위 복합체 및 2차 기질의 소비를 촉진시킬 보조 인자 또는 활성화제로 구성된 그룹으로부터 선택됨 ―; 뉴클레오티드, 뉴클레오티드의 말단 인산기에 부착된 링킹 분자, 및 링킹 분자에 부착된 라벨을 포함하는 라벨링된 뉴클레오티드를 포함하며, 라벨은 2차 기질을 수반하는 pH 변경 반응에 참여한다.
[0041]
이러한 제11 양상의 예에서, pH 변경 모이어티는 효소이며, 그리고 라벨은 효소의 동역학을 강화시키는 제1 그룹 및 효소의 동역학을 감속시키는 제2 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택되며; pH 변경 모이어티는 금속 배위 복합체이고, 그리고 라벨은 금속 배위 복합체의 금속에 대한 리간드이며, 리간드는 금속 배위 복합체의 촉매 특성을 변경시키며; 또는 pH 변경 모이어티는 보조 인자 또는 활성화제이며, 라벨은 보조 인자 또는 활성화제에 의해 활성화되는 촉매 라벨이다.
[0042]
이러한 제11 양상의 예에서, pH 변경 모이어티는 효소이며; 복합체는 효소에 부착된 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체를 더 포함하며; 그리고 라벨은 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열이다.
[0043]
이러한 통합 혼합물의 임의의 특징들이 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 통합 혼합물 및/또는 방법들 및/또는 감지 시스템 및/또는 키트들 및/또는 라벨링된 뉴클레오티드들의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0044]
본원에 개시된 제12 양상은 키트이며, 키트는 제11 양상의 통합 혼합물, 및 제2 액체 캐리어 및 2차 기질을 포함하는 2차 기질 혼합물을 포함한다.
[0045]
제12 양상의 예는 유동 셀을 더 포함하며, 유동 셀은 간극 구역들에 의해 분리된 복수의 함몰부들을 포함하는 기판; 복수의 함몰부들 각각의 최하부에 있는 전도성 채널; 및 함몰부들 각각에 접목된 적어도 하나의 프라이머를 포함한다.
[0046]
이러한 키트의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 키트 및/또는 통합 혼합물 및/또는 방법들 및/또는 감지 시스템 및/또는 다른 키트들 및/또는 라벨링된 뉴클레오티드들의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0047]
본원에 개시된 제13 양상은 통합 혼합물이며, 통합 혼합물은 완충제를 포함하는 액체 캐리어; 중합 효소 및 중합 효소에 링크된 pH 변경 모이어티를 포함하는 복합체 ― pH 변경 모이어티는 2차 기질의 소비를 촉진시킬 효소, 2차 기질의 소비를 촉진시킬 금속 배위 복합체 및 2차 기질의 소비를 촉진시킬 보조 인자 또는 활성화제로 구성된 그룹으로부터 선택됨 ―; 및 3'OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 부착된 절단가능 링킹 분자 및 링킹 분자에 부착된 라벨을 포함하는 라벨링된 뉴클레오티드를 포함하며, 라벨은 2차 기질을 수반하는 pH 변경 반응에 참여한다.
[0048]
제13 양상의 예에서, pH 변경 모이어티는 효소이며, 그리고 라벨은 효소의 동역학을 강화시키는 제1 그룹 및 효소의 동역학을 감속시키는 제2 그룹으로 구성된 그룹 및 2차 기질로부터 선택되며; 또는 pH 변경 모이어티는 금속 배위 복합체이고, 그리고 라벨은 금속 배위 복합체의 금속에 대한 리간드이며, 리간드는 금속 배위 복합체의 촉매 특성을 변경시키며; 또는 pH 변경 모이어티는 보조 인자 또는 활성화제이며, 그리고 라벨은 보조 인자 또는 활성화제에 의해 활성화되는 촉매 라벨이다.
[0049]
제13 양상의 예에서, pH 변경 모이어티는 효소이며; 복합체는 효소에 부착된 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체를 더 포함하며; 그리고 라벨은 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열이다.
[0050]
이러한 통합 키트의 임의의 특징들이 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 통합 혼합물 및/또는 방법들 및/또는 감지 시스템 및/또는 키트들 및/또는 라벨링된 뉴클레오티드들의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0051]
본원에 개시된 제14 양상은 키트이며, 키트는 제13 양상에 정의된 통합 혼합물, 및 제2 액체 캐리어 및 2차 기질을 포함하는 2차 기질 혼합물을 포함한다.
[0052]
제14 양상의 예는 유동 셀을 더 포함하며, 유동 셀은 간극 구역들에 의해 분리된 복수의 함몰부들을 포함하는 기판; 복수의 함몰부들 각각의 최하부에 있는 전도성 채널; 및 함몰부들 각각에 접목된 프라이머를 포함한다.
[0053]
제14 양상의 예는 탈차단제 용액(de-blocking agent solution)을 더 포함한다.
[0054]
이러한 키트의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 이러한 키트 및/또는 방법들 및/또는 감지 시스템 및/또는 다른 키트들 및/또는 라벨링된 뉴클레오티드들 및/또는 통합 혼합물의 특징들의 임의의 조합은 함께 사용되고 그리고/또는 본원에 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0055]
또한 부가적으로, 양상들 중 임의의 양상의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있으며 그리고/또는 적어도 본원에서 설명된 장점들을 달성하기 위해 본원에서 개시된 예들 중 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0056]
본 개시내용의 예들의 특징들은 이하의 상세한 설명 및 도면들을 참조로 하여 명백하게 될 것이며, 도면들에서 유사한 참조 번호들은 혹시 동일하지 않을지라도 유사한 컴포넌트들에 대응한다. 간략화를 위해, 이전에 설명된 기능을 갖는 참조 부호들 또는 특징들은 이들이 출현하는 다른 도면들과 관련하여 설명되거나 또는 설명되지 않을 수 있다
[0057] 도 1a 내지 도 1c는 본원에 개시된 라벨링된 뉴클레오티드들의 상이한 예들의 개략적인 예시들이다.
[0058] 도 2는 본원에 개시된 감지 시스템의 일례를 도시하며 그리고 감지 시스템의 이러한 예와 함께 사용될 수 있는 라벨링된 뉴클레오티드 및 2차 기질의 예를 도시하는 개략적인 예시이다.
[0059] 도 3a는 본원에 개시된 감지 시스템의 다른 예를 도시하며 그리고 감지 시스템의 이러한 예와 함께 사용될 수 있는 라벨링된 뉴클레오티드 및 2차 기질의 예를 도시하는 개략적인 예시이다.
[0060] 도 3b는 본원에 개시된 라벨링된 뉴클레오티드의 다른 예와 함께 사용하는, 도 3a의 감지 시스템의 예를 도시한다.
[0061] 도 4는 본원에 개시된 감지 시스템의 다른 예를 도시하며 그리고 감지 시스템의 이러한 예와 함께 사용될 수 있는 라벨링된 뉴클레오티드 및 2차 기질의 예를 도시하는 개략적인 예시이다.
[0062] 도 5는 본원에 개시된 감지 시스템의 또 다른 예를 도시하며 그리고 감지 시스템의 이러한 예와 함께 사용될 수 있는 라벨링된 뉴클레오티드 및 2차 기질의 예를 도시하는 개략적인 예시이다.
[0063] 도 6a는 본원에 개시된 감지 시스템의 또 다른 예를 도시하는 개략적인 예시이다.
[0064] 도 6b는 본원에 개시된 라벨링된 뉴클레오티드의 다른 예와 함께 사용하는, 도 6a의 감지 시스템의 예를 도시한다.
[0065] 도 7a는 유동 셀의 예의 평면도이다.
[0066] 도 7b는 단분자 감지와 함께 사용하기에 적합한 유동 셀의 예의 확대된 부분 절개도이다.
[0067] 도 7c는 앙상블 서열화와 함께 사용하기에 적합한 유동 셀의 예의 확대된 부분 절개도이다.
[0068] 도 7d는 앙상블 서열화와 함께 사용하기에 적합한 유동 셀의 또 다른 예의 확대된 부분 절개도이다.
[0057] 도 1a 내지 도 1c는 본원에 개시된 라벨링된 뉴클레오티드들의 상이한 예들의 개략적인 예시들이다.
[0058] 도 2는 본원에 개시된 감지 시스템의 일례를 도시하며 그리고 감지 시스템의 이러한 예와 함께 사용될 수 있는 라벨링된 뉴클레오티드 및 2차 기질의 예를 도시하는 개략적인 예시이다.
[0059] 도 3a는 본원에 개시된 감지 시스템의 다른 예를 도시하며 그리고 감지 시스템의 이러한 예와 함께 사용될 수 있는 라벨링된 뉴클레오티드 및 2차 기질의 예를 도시하는 개략적인 예시이다.
[0060] 도 3b는 본원에 개시된 라벨링된 뉴클레오티드의 다른 예와 함께 사용하는, 도 3a의 감지 시스템의 예를 도시한다.
[0061] 도 4는 본원에 개시된 감지 시스템의 다른 예를 도시하며 그리고 감지 시스템의 이러한 예와 함께 사용될 수 있는 라벨링된 뉴클레오티드 및 2차 기질의 예를 도시하는 개략적인 예시이다.
[0062] 도 5는 본원에 개시된 감지 시스템의 또 다른 예를 도시하며 그리고 감지 시스템의 이러한 예와 함께 사용될 수 있는 라벨링된 뉴클레오티드 및 2차 기질의 예를 도시하는 개략적인 예시이다.
[0063] 도 6a는 본원에 개시된 감지 시스템의 또 다른 예를 도시하는 개략적인 예시이다.
[0064] 도 6b는 본원에 개시된 라벨링된 뉴클레오티드의 다른 예와 함께 사용하는, 도 6a의 감지 시스템의 예를 도시한다.
[0065] 도 7a는 유동 셀의 예의 평면도이다.
[0066] 도 7b는 단분자 감지와 함께 사용하기에 적합한 유동 셀의 예의 확대된 부분 절개도이다.
[0067] 도 7c는 앙상블 서열화와 함께 사용하기에 적합한 유동 셀의 예의 확대된 부분 절개도이다.
[0068] 도 7d는 앙상블 서열화와 함께 사용하기에 적합한 유동 셀의 또 다른 예의 확대된 부분 절개도이다.
[0069]
본원에 개시된 예시적인 감지 시스템들의 일부는 핵산 서열화 절차들에서 단분자 검출을 위해 사용될 수 있다. 이들 감지 시스템들의 각각은 하나의 중합 효소 또는 하나의 중합 효소 함유 복합체가 부착된 하나의 전도성 채널을 포함한다. 이러한 전도성 채널은 pH(수소 이온 농도)의 국소적 변화의 결과로써 전하의 변화를 검출할 수 있다. 사용시, 라벨링된 뉴클레오티드들 및 2차 기질은 감지 시스템에 도입된다. 라벨링된 뉴클레오티드들 중 하나의 질소 염기가 중합 효소에 의해 발생기의 스트랜드에 통합됨에 따라, 2차 기질은 (하전된 이온의 농도를 증가 또는 감소시키는) 산 또는 염기 생성 반응에서 소비된다. 산 또는 염기 생성 반응은 또한 일부 예들에서 복합체의 일부로서 전도성 채널에 고정되며 다른 예들에서는 통합된 라벨링된 뉴클레오티드의 라벨인 pH 변경 모이어티를 수반한다. 산 또는 염기 생성 반응들 중 일부는 다수의 pH 변경 모이어티들을 수반하는데, 예컨대 복합체의 일부로서 하나의 pH 변경 모이어티를 수반하며 라벨링된 뉴클레오티드의 라벨로서 다른 pH 변경 모이어티를 수반한다. 이러한 구성들은 pH 변경 모이어티가 전도성 채널의 표면에 또는 이 표면 근처에 위치되는 것을 가능하며; 따라서 산 또는 염기 생성 반응은 전도성 채널의 표면에 국한된다. 일부 경우들에서, 하전된 이온들은 전도성 채널의 표면 그룹들과 반응하여, 표면 그룹들의 양성자화 또는 탈 양성자화를 일으키며, 이는 표면 그룹들의 전하를 변경한다. 이들 경우들에서, 표면 그룹들의 전하는 감지된다. 전하들이 전도성 채널의 표면에 직접 있기 때문에, 전하들은 용액의 이온들에 의해 효율적으로 스크리닝될 수 없고, 따라서 임계 전압 및 전류에 큰 변화들을 유발할 수 있다. 다른 경우들에서, 산 또는 염기 생성으로 인해 발생하는 하전된 이온들이 감지된다.
[0070]
본원에 개시된 예시적인 감지 시스템들 중 일부 다른 감지 시스템들은 앙상블 핵산 서열화 절차들에 사용될 수 있다. 이들 감지 시스템들의 각각은 상부에서 프라이머들의 론 (예컨대, 올리고 쌍들)을 갖는 전도성 채널을 포함한다. 이러한 전도성 채널은 pH의 국소적 변화의 결과로써 전하의 변화를 검출할 수 있다. 사용시, 라이브러리 주형들이 도입되고 프라이머들에 혼성된다. 여러 주형 폴리뉴클레오티드 사슬들을 생성하기 위해 클러스터 생성이 수행된다. 이후, 중합 효소 함유 복합체들, 라벨링된 뉴클레오티드들 및 2차 기질들이 감지 시스템에 도입된다. 개개의 라벨링된 뉴클레오티드들의 질소 염기가 (복합체들의 개개의 중합 효소들에 의해) 개개의 주형 폴리뉴클레오티드 사슬들을 따라 형성된 개개의 발생기의 스트랜드들에 통합되는 동안 또는 그 이후에, 2차 기질들은 (하전된 이온들의 농도를 증가시키거나 또는 감소시키는) 산 또는 염기 생성 반응에서 소비된다. 단분자 감지와 유사하게, 산 또는 염기 생성 반응은 또한 중합 효소 함유 복합체의 일부이거나 통합된 라벨링된 뉴클레오티드들의 라벨인 pH 변경 모이어티를 수반한다. 이러한 구성들은 pH 변경 모이어티가 전도성 채널의 표면에 또는 이 표면 근처에 위치되는 것을 가능하며; 따라서 산 또는 염기 생성 반응은 전도성 채널의 표면에 국한된다. 하전된 이온들 또는 하전된 이온들과 전도성 채널의 표면 그룹들의 반응이 감지된다.
[0071]
본원에 개시된 예들 중 임의의 예에서, 산 또는 염기 생성 반응들은 수백, 수천, 또는 훨씬 더 많은 염기의 분자들 또는 양성자들을 생성하여, 크고 국소적인 pH 변화를 발생시킬 수 있다.
[0072]
본원에 개시된 예들 중 임의의 예에서, pH 변경 모이어티는 2차 기질과의 산 또는 염기 생성 반응에 참여할 수 있거나 2차 기질에 작용하는 다른 pH 변경 모이어티의 활성화를 변형할 수 있는 임의의 화학 종일 수 있다. 예로서, pH 변경 모이어티는 2차 기질을 수반하는 산 또는 염기 생성 반응을 촉진(유발 또는 가속)할 수 있고, 2차 기질을 수반하는 산 또는 염기 생성 반응을 억제할 수 있으며, 산 또는 염기 생성 반응 동역학을 강화시키거나 감속시킬 수 있거나, 또는 그렇지 않으면 2차 기질을 수반하는 산 또는 염기 생성 반응에 참여할 수 있다. pH 변경 모이어티의 일부 예들은 복합체의 일부로서 전도성 채널에 고정되며, pH 변경 모이어티의 다른 예들은 통합된 라벨링된 뉴클레오티드의 라벨이다. 일부 경우들에서, 2개의 pH 변경 모이어티들은 함께 상호작용하여 pH 변화를 초래할 수 있다.
[0073]
본원에 개시된 산 또는 염기 생성(pH 변경) 반응들은 2차 기질을 수반한다. 본원에서 사용된 "2차 기질"이란 용어는 산 또는 염기를 생성하는 반응에서 소비되는 화학 종을 지칭하며, 여기서 화학 종은 염기가 복합체의 중합 효소와 상호 작용할 수 있는 뉴클레오티드와 별도의 분자이거나 또는 염기가 복합체의 중합 효소와 상호 작용할 수 있는 뉴클레오티드의 당 또는 염기에 부착된 별개의 분자이며, 질소 염기 통합 이벤트의 부산물은 아니다. 별개의 2차 기질을 사용하면, 검출된 pH 변화의 동역학이 뉴클레오티드 통합의 동역학으로부터 분리되는 것을 가능하게 한다. 일부 예들에서, 2차 기질과 상호 작용하는 pH 변경 모이어티는 뉴클레오티드와 상호 작용하는 중합 효소보다 동역학적으로 상당히 더 빠를 수 있다. 이는 단일 통합 이벤트 또는 통합 이벤트들의 그룹에 대해 더 큰 pH 변화가 관찰되는 것을 가능하게 한다.
[0074]
산 또는 염기 생성(pH 변경) 반응들이 전도성 채널 근처 내에서 발생하는 것이 바람직하다. "근처 내"는 일반적으로 생성된 산 또는 염기가 확산될 수 있는 임의의 거리를 지칭한다. 반복/주기적 감지 시스템들을 갖는 어레이에서, "근처 내"는 센서/감지 시스템 피치 측면에서 정의될 수 있다. 센서 피치 또는 감지 시스템 피치는 라인을 따라 2개의 연속적인 센서들/감지 시스템들 간의 거리를 지칭한다. 일례에서, 감지 시스템의 반응 구역(산 또는 염기가 생성되는 구역)은 감지 시스템의 전도성 채널로부터 센서 피치의 ½ 내에 있을 수 있다.
[0075]
단분자 감지를 위한 감지 시스템(10A-10E)의 여러 예들이 본원에 개시되고, 도 2, 도 3a, 도 3b, 도 4, 도 5, 도 6a 및 도 6b에 도시되고 설명된다. 앙상블 서열화를 위한 감지 시스템들(40A 및 40B)의 예가 도 7c 및 도 7d에 도시되어 있다. 감지 시스템(10A-10E 또는 40A-40B)의 각각의 예는 라벨링된 뉴클레오티드와 함께 사용될 수 있다. 일부 라벨링된 뉴클레오티드들은 염기 통합 후 자연적으로 절단될 수 있으며, 이 예는 도 1a에 개략적으로 도시된다. 일부 다른 라벨링된 뉴클레오티드들은 단지 단일-염기 통합이 각각의 서열 사이클에서 발생할 수 있게 하는 가역적 종결 부위를 포함하며, 이들 라벨링된 뉴클레오티드들 중 일부의 화학 구조의 예들이 도 1b에 도시된다. 이들 예들 중 임의의 예는 또한 당 또는 염기에 부착된 별개의 분자로서 2차 기질을 포함할 수 있다(도 1c). 라벨링된 뉴클레오티드들의 각각이 지금 설명될 것이다.
[0076]
라벨링된 뉴클레오티드들
[0077]
도 1a에 도시된 바와 같이, 라벨링된 뉴클레오티드(12)는 뉴클레오티드(14), 뉴클레오티드(14)의 말단 인산기에 부착된 링킹 분자(16), 및 링킹 분자(16)에 부착된 라벨(18)을 포함한다. 라벨링된 뉴클레오티드(12)는 천연 뉴클레오티드와 구조적으로 또는 화학적으로 구별되기 때문에 비-천연 또는 합성 뉴클레오티드로 고려될 수 있다.
[0078]
라벨링된 뉴클레오티드(12)의 뉴클레오티드(14)는 천연 뉴클레오티드일 수 있다. 천연 뉴클레오티드들은 질소 함유 헤테로사이클릭 염기(또는 질소 염기), 당 및 하나 이상의 인산기들을 포함한다. 천연 뉴클레오티드들의 예들은 예컨대 리보뉴클레오티드들 또는 데옥시리보뉴클레오티드들을 포함한다. 리보뉴클레오티드에서는 당이 리보스이고, 데옥시리보뉴클레오티드에서는 당이 데옥시리보스(즉, 리보스의 2'포지션에 존재하는 하이드록실기가 없는 당)이다. 일례에서, 뉴클레오티드(14)는 여러 인산기들(예컨대, 트리-인산염(즉, 감마 인산염), 테트라-인산염, 펜타-인산염, 헥사-인산염 등)을 포함하기 때문에 폴리인산염 형태이다. 헤테로사이클 염기는 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기 또는 임의의 다른 핵염기 유사체일 수 있다. 퓨린 염기들은 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 이들의 변형된 유도체들 또는 유사체들을 포함한다. 피리미딘 염기들은 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U) 및 이들의 변형된 유도체들 또는 유사체들을 포함한다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다.
[0079]
라벨링된 뉴클레오티드(12)는 또한 링킹 분자(16)를 포함한다. 링킹 분자(16)는 한쪽 끝에서 뉴클레오티드(14)의 인산기(들)에 화학적으로 결합할 수 있고 다른 쪽 끝에서 라벨(18)에 화학적으로 결합할 수 있는 임의의 긴 사슬 분자일 수 있다. 일부 경우들에서, 링킹 분자(16)는 또한 중합 효소(28)와 상호 작용하지 않도록 선택될 수 있다(예컨대, 도 2, 도 3a, 도 4, 도 5, 도 6a 및 도 6b 참조). 다른 경우들에서, 링킹 분자(16)는 또한 중합 효소(28)와 약하게 상호 작용하도록 선택될 수 있는데, 이는 이러한 약한 상호 작용이 전도성 채널의 근처 내에서 라벨(18)을 안내하는 것을 도울 수 있기 때문이다. 링킹 분자(16)는 라벨(18)이 pH 변경 모이어티 및/또는 2차 기질(34)과 연관될 수 있게 하기에 충분히 길도록 선택될 수 있는 반면(예컨대, 도 2 참조), 예컨대 뉴클레오티드(14)는 통합 이벤트 동안 중합 효소(28)에 의해 유지된다.
[0080]
예들로서, 링킹 분자(16)는 알킬 사슬, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬, 아미도기, 인산기, 트리아졸과 같은 헤테로사이클, 뉴클레오티드들, 또는 이들의 조합들을 포함할 수 있다. 알킬 사슬의 예들은 적어도 6개의 탄소 원자들을 포함할 수 있고, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬의 예들은 적어도 3개의 에틸렌 글리콜 단위들을 포함할 수 있다.
[0081]
다음 예는 라벨링된 뉴클레오티드(12)의 예를 예시하며, 여기서 링킹 분자(16)는 알킬 사슬, 아미드기, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬 및 트리아졸을 포함한다:
다음 예는 라벨링된 뉴클레오티드(12)의 다른 예를 예시하며, 여기서 링킹 분자(16)는 알킬 사슬들, 아미드기, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬들, 트리아졸 및 인산기를 포함한다:
다음 예는 라벨링된 뉴클레오티드(12)의 또 다른 예를 예시하며, 여기서 링킹 분자(16)는 알킬 사슬들, 아미드기들, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬들, 트리아졸 및 인산기를 포함한다:
다음 예는 라벨링된 뉴클레오티드(12)의 또 다른 예를 예시하며, 여기서 링킹 분자(16)는 알킬 사슬들, 아미드기, 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬들, 트리아졸, 인산기 및 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함한다:
[0083]
여러 예시적인 링킹 분자들(16)이 설명되었지만, 다른 링킹 분자들(16)이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 링킹 분자(16)의 선택은 뉴클레오티드(14)에 부착될 라벨(18)에 부분적으로 의존할 것이다. 더욱이, 링킹 분자(16)의 길이는 개개의 뉴클레오티드(14)가 개별 감지 시스템의 중합 효소에 의해 유지될 때 개개의 라벨(18)이 전도성 채널(26)의 표면에서 산 또는 염기 생성 반응에 참여할 수 있도록 선택될 수 있다(예컨대, 도 2 참조).
[0084]
각각의 예시적인 라벨링된 뉴클레오티드(12)에서, 라벨(18)은 (링킹 분자(16)를 통해) 뉴클레오티드(14)의 말단 인산염 말단에 부착된다. 말단 인산염 말단에의 부착은 뉴클레오티드 염기 통합 후, 알파 인산염과 링킹 분자(16) 간의 결합 또는 알파 인산염과 베타 인산염 간의 결합이 자연적으로 절단되기 때문에 일부 서열화 기술들에서 바람직할 수 있다. 이러한 자연적 절단은 라벨(18)(및 링킹 분자(16))이 통합된 뉴클레오티드 염기로부터 해리되고 감지 시스템(10A-10E)으로부터 멀리 확산되는 것을 가능하게 하여, 다른 라벨링된 뉴클레오티드(12)가 감지 시스템(10A-10E)의 중합 효소(28)와 연관될 수 있게 하며 그리고 이전에 통합된 염기가 다음 통합 염기의 검출을 방해하는 지속적인 신호들을 생성하지 않게 한다.
[0085]
라벨링된 뉴클레오티드(12)에 포함된 라벨(18)은 라벨링된 뉴클레오티드(12)와 함께 사용될 감지 시스템(10A-10E 또는 40A-40B)에 부분적으로 의존할 수 있다. 상이한 라벨들(18)은 감지 시스템들(10A-10E 및 40A-40B)의 각각을 참조하여 더 설명될 것이다.
[0086]
도 1b에 도시된 바와 같이, 라벨링된 뉴클레오티드(12A, 12B, 12C)의 각각은 3'OH 차단기(38A, 38B, 38C)를 갖는 뉴클레오티드(14'), 뉴클레오티드(14')의 염기 또는 당에 부착된 절단가능한 링킹 분자(16') 및 링킹 분자(16')에 부착된 라벨(18)을 포함한다.
[0087]
뉴클레오티드(14')는 뉴클레오티드(14)에 대해 제시된 예들 중 임의의 예일 수 있다. 본원에 개시된 예들에서, 뉴클레오티드(14')에는 3'OH 차단기(38A, 38B, 38C)가 부착되어 있다. 3'OH 차단기(38A, 38B, 38C)는 뉴클레오티드(14')에서 당 분자의 산소 원자에 링크될 수 있다. 3'OH 차단기(38A, 38B, 38C)는 단지 단일-염기 통합만이 각각의 서열화 사이클에서 발생할 수 있게 하는 가역적 종결 부위일 수 있다. 가역적 종결 부위는 추가 염기들이 주형 폴리뉴클레오티드 사슬에 상보적인 발생기의 스트랜드에 통합되는 것을 막는다. 이는 통합된 단일 염기를 검출하고 식별하는 것을 가능하게 한다. 3'OH 차단기(38A, 38B, 38C)는 후속적으로 제거되어, 추가 서열화 사이클들이 각각의 주형 폴리뉴클레오티드 사슬에서 발생하는 것을 가능하게 할 수 있다. 상이한 3'OH 차단기들(38A, 38B, 38C)의 예들이 도 1b에 도시되며, 이는 3'-ONH2 가역적 종결 부위(38A로 도시됨), 3'-O- 알릴 가역적 종결 부위((―CH=CHCH2, 38B로 도시됨) 및 3'-O-아지도메틸 가역적 종결 부위(―CH2N3, 38C로 도시됨)를 포함한다. 다른 적합한 가역적 종결 부위들은 o-니트로벤질 에테르들, 알킬 o-니트로벤질 탄산염, 에스테르 모이어티들, 다른 알릴 모이어티들, 아세탈들(예컨대, 테르트-부톡시-에톡시), MOM(―CH2OCH3) 모이어티들, 2,4-디니트로벤젠 설페닐, 테트라하이드로푸라닐 에테르, 3'인산염, 에테르들, -F, -H2, -OCH3, -N3, -HCOCH3, 및 2-니트로벤젠 탄산염을 포함한다.
[0088]
도 1b에 도시된 예들에서, 링킹 분자(16')는 뉴클레오티드(14')의 염기(예컨대, 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기)에 부착된다. 일부 예들에서, 링킹 분자(16')는 도 1b에서 화살표(42)에 의해 식별되는 절단 부위를 포함한다. 적합한 링킹 분자들(16')의 일부 예들이 도 1b에 도시되어 있지만, 라벨(18)을 뉴클레오티드(14')의 염기 또는 당에 부착할 수 있는 임의의 적합한 절단가능 링커가 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[0089]
라벨링된 뉴클레오티드(12A, 12B, 12C)에 포함된 라벨(18)은 라벨링된 뉴클레오티드(12A, 12B, 12C)와 함께 사용될 감지 시스템(10A-10E 또는 40A-40B)에 부분적으로 의존할 수 있다. 상이한 라벨들(18)은 감지 시스템들(10A-10E 및 40A-40B)의 각각을 참조하여 더 설명될 것이다.
[0090]
라벨링된 뉴클레오티드(12')의 또 다른 예는 도 1c에 도시된다. 도 1c에 도시된 바와 같이, 라벨링된 뉴클레오티드(12')는 뉴클레오티드(14) 및 뉴클레오티드(14)의 염기 또는 당에 부착된 2차 기질(34)을 포함한다. 이 경우, 뉴클레오티드들(14 또는 14') 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 2차 기질(34)은 뉴클레오티드(14 또는 14')의 염기 또는 당에 직접 부착될 수 있다. 일례에서, 2차 기질(34)은 뉴클레오티드(14 또는 14')의 염기의 탄소 원자 또는 질소 원자에 직접 부착될 수 있다. 다른 예에서, 2차 기질(34)은 뉴클레오티드(14 또는 14')의 당 분자의 산소 원자 또는 탄소 원자에 직접 부착될 수 있다. 만일 2차 기질(34)이 도 1c에 도시된 바와 같이 뉴클레오티드(14)의 3'OH에 부착되면, 이는 (라벨링된 뉴클레오티드들(12a-12c)과 유사한) 다음 염기의 추가 통합을 차단할 것이다. 당 분자상의 이러한 포지셔닝은 바람직할 수 있는데, 왜냐하면 이는 다음 통합 이벤트 전에 2차 기질(34)의 소비를 강제하고 차단기를 제거하기 위해 별도의 탈차단제를 필요로 하지 않기 때문이다. 만일 (3'OH 차단기(38A, 38B, 38C)를 포함하는) 뉴클레오티드(14')가 사용되면, 2차 기질(34)은 뉴클레오티드(14')의 당 분자의 2'포지션에 직접 부착될 수 있다. 대안적으로, 2차 기질(34)은 예컨대 링킹 분자를 통해 뉴클레오티드(14 또는 14')의 염기 또는 당에 간접적으로 부착될 수 있다. 뉴클레오티드(14 또는 14')의 염기 또는 당에 2차 기질(34)을 부착하는 데 적합한 링킹 분자들의 예들은 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 알킬기, 비오틴/스트렙타아비딘, 프로파길아미노 또는 상업적으로 입수가능한 기능화된 핵염기에 부착된 임의의 그룹을 포함한다.
[0091]
이러한 예시적인 라벨링된 뉴클레오티드(12')에서, 2차 기질(34)은 2차 기질(34)의 소비 동역학이 뉴클레오티드 염기를 통합하는데 사용되는 중합 효소(28)의 동역학보다 적어도 10배 더 빠르도록 선택된다. 따라서, 2차 기질(34)의 소비는 통합 이벤트보다 빠르게 발생하고, 따라서 통합 이벤트가 발생하기 전에 또는 발생함에 따라 pH 변화가 검출될 수 있다. 일례에서, 2차 기질(34)은 폴리에스테르 사슬(에스테라제에 의해 소비될 수 있음), 셀룰로오스(셀룰라아제에 의해 소비될 수 있음), 펩티드(프로테아제에 의해 소비될 수 있음), 녹말(아밀라제에 의해 소비될 수 있음) 등과 같은 가수 분해 효소에 대한 기질일 수 있다. 다른 예에서, 2차 기질(34)은 추가적인 폴리인산염 사슬이다. 이러한 예에서, 추가 폴리인산염 사슬은 차단되지 않으며, 그 반응성은 뉴클레오티드(12')가 중합 효소(28)에 의해 반응할 때 더 높은 국소 농도에 의존할 것이다. 또한, 이러한 예에서, 뉴클레오티드(14 또는 14')의 말단 인산염은 차단기를 포함하여, 뉴클레오티드(14 또는 14')의 폴리인산염 사슬은 산 또는 염기 생성 반응에서 수반되지 않을 수 있다.
[0092]
단분자 검출
[0093]
이제 도 2, 도 3a, 도 3b, 도 4, 도 5, 도 6a 및 도 6b를 참조하면, 감지 시스템들(10A-10E)의 각각은 단분자 감지에 사용될 수 있다. 시스템들 각각은 2개의 전극들(22, 24) 및 2개의 전극들(22, 24)을 연결하는 전도성 채널(26)을 포함하는 pH 센서(20)를 포함한다.
[0094]
각각의 pH 센서(20)는 전계 효과 트랜지스터(FET: field effect transistor)일 수 있다. FET에서, 전극들(22, 24)은 소스 및 드레인 단자들이고, 전도성 채널(26)은 게이트 단자이다. 전계 효과 트랜지스터는 p-채널 또는 n-채널일 수 있으며, 이는 응답의 극성에 영향을 미치지만 감지 원리에는 영향을 미치지 않는다. ISFET(Ion sensitive FET)들, JFET(junction gate FET)들, MESFET(metal-semiconductor FET)들, MOSFET(metal-oxide-semiconductor FET)들 또는 접합없는 전계 효과 디바이스들은 본원에 개시된 예들에서 모든 적합한 검출기들이다.
[0095]
전극들(22, 24)은 임의의 적합한 전도성 재료를 포함할 수 있다. 적합한 소스 및 드레인 재료들의 예들은 코발트, 코발트 규화물, 니켈, 니켈 규화물, 알루미늄, 텅스텐, 구리, 티타늄, 몰리브덴, ITO(indium tin oxide), 인듐 아연 산화물, 금, 백금, 탄소 등을 포함한다.
[0096]
전도성 채널(26)은 임의의 전기 전도성 또는 반-전도성 및 pH 민감성 재료를 포함할 수 있다. 일례에서, 전도성 채널(26)은 전기 전도성 채널이다. 일례에서, 전기 전도성 또는 반-전도성 및 pH 민감성 재료는 그 표면에서 하전된 이온들을 감지할 수 있다. 또 다른 예에서, 전기 전도성 또는 반-전도성 및 pH 민감성 재료는 표면 그룹들을 포함하거나, 또는 pH 변경 모이어티와 2차 기질(34)의 반응에 의해 생성된 하전 이온들에 대한 응답으로 양성자화 및/또는 탈양성자화를 겪을 수 있는 표면 그룹들을 포함하는 다른 재료로 코팅된다. 전기 전도성 또는 반-전도성 및 pH 민감성 재료는 유기 재료, 무기 재료 또는 이 돌 모두를 포함할 수 있다.
[0097]
일부 예들에서, 전기 전도성 또는 반-전도성 및 pH 민감성 재료는 전하를 검출할 수 있는 실리콘과 같은 반전도성 재료를 포함할 수 있다. 반-전도성 및 pH 감지 재료는 또한 그 표면의 적어도 일부에서 게이트 유전체를 가질 수 있다. 일부 예들에서, 게이트 유전체는 (전극들(22, 24)과의 접촉 지점들을 제외하고) 반-전도성 및 pH 감지 재료의 전체 외부 표면을 둘러쌀 수 있으며, 다른 예들에서 게이트 유전체는 반-전도성 및 pH 감지 재료의 외부 표면의 일부분상에 포지셔닝될 수 있다. 일례에서, 게이트 유전체는 전류가 주변 환경 (예컨대, 유체)으로 누출되는 것을 방지하는 역할을 하며, 또한 양성자화 및/또는 탈양성자화를 겪을 수 있는 표면 그룹들을 제공할 수 있다. 게이트 유전체의 예들은 이산화실리콘(SiO2), 실리콘 산질화물(SiON), 실리콘 질화물(Si3N4), 탄탈륨 5산화물(Ta2O5), 하프늄 산화물(HfO2), 지르코늄 산화물(ZrO2), 알루미늄 산화물(Al2O3), 하프늄 또는 지르코늄 규산염들(HfSiO4, ZrSiO4) 등을 포함한다. 표면 그룹은 실라놀 기들(Si-OH), Si-NH2 기들, 카르복실 기들, (-COOH) 또는 하이드록실(-OH) 기들일 수 있다.
[0098]
다른 예들에서, 전기 전도성 또는 반-전도성 및 pH 민감성 재료는 게이트 유전체 없이 탄소 재료(예컨대, 탄소 나노튜브들, 유리질 탄소, 그래핀)을 포함할 수 있다. 이들 전기 전도성 또는 반-전도성 및 pH 민감성 재료들은 카르복실 (-COOH) 기들, 히드록실 (-OH) 기들, 또는 pH에 반응하거나 pH 민감성 작용기들이 부착될 수 있게 하는 다른 표면 기능성을 포함할 수 있다.
[0099]
또 다른 예들에서, 전기 전도성 또는 반-전도성 및 pH 민감성 재료가 생체 분자일 수 있다. 적합한 생체 분자들의 예들은 펩티드들 및 데옥시리보핵산들을 포함한다. 이들 재료들은 산 또는 염기 생성 반응의 결과로써 생성된 pH의 낮은 pKa를 가질 수 있으며, 따라서 또한 중성에 가까운 pKa를 갖는 전도도 조절물을 포함할 수 있다. 예컨대, 펩티드들의 전도도는 pH 민감성 아미노산들(히스티딘 등)에 의해 조절될 수 있다. 다른 예의 경우에, DNA의 전도도는 독소루비신(pKa ~ 8) 및 그 유사체들과 같은 pH 반응성 인터칼레이터로 조절될 수 있다.
[00100]
단분자 감지 시스템들(10A-10E)에서, 전도성 채널(26)은 관형 구조, 와이어 구조, 평면 구조 등과 같은 임의의 적합한 기하학적 구조를 가질 수 있다. 일부 예들에서, 전도성 채널(26)은 또한 (1nm 내지 1μm 미만의 범위의) 나노스케일의 적어도 하나의 치수를 갖는 나노구조일 수 있다. 일례에서, 이러한 치수는 가장 큰 치수를 지칭한다. 일례에서, pH 센서의 전도성 채널(26)은 반-전도성 나노구조, 그래핀 나노구조, 금속 나노구조 및 전도성 중합체 나노구조로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 나노구조는 다중 벽 또는 단일 벽 나노튜브, 나노와이어, 나노리본 등일 수 있다.
[00101]
단분자 감지와 함께 사용하기에 적합한 감지 시스템들(10A-10E)의 각각은 전도성 채널(26)의 표면에 부착된 중합 효소(28)를 포함한다. 일부 예들에서, 중합 효소(28)는 단독으로 전도성 채널(26)에 부착되고(예컨대, 도 2 참조), 다른 예에서 중합 효소(28)는 중합 효소(28)에 링크된 다른 컴포넌트를 포함하는 복합체(30A-30D)의 일부이다(예컨대,도 3a, 도 3b, 도 4, 도 5, 도 6a 및 도 6b 참조).
[00102]
중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬을 보유할 수 있고,(라벨링된 뉴클레오티드(12, 12A, 12B, 12C 또는 12')로부터의) 하나의 뉴클레오티드를 한 번에, 주형을 따라 형성되는 발생기의 스트랜드에 통합할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 중합 효소(28) 및 그 작용기들은 2차 기질(34)을 수반하는 산 및 염기 생성 반응(들)과 별도이고 이로부터 구별된다는 것이 이해되어야 한다. 특히, 중합 효소(28)는 2차 기질(34)을 수반하는 산 및 염기 생성 반응(들)으로부터 개개의 산 생성 반응에 참여한다. 예컨대, 중합 효소(28)는 뉴클레오티드 염기 통합의 결과로써 소량의 산(예컨대, 통합 이벤트 당 1분자)을 생성하는 반면에, 산 또는 염기 생성 반응(들)은 수백개, 수천개 또는 훨씬 더 많은 염기의 분자들 또는 양성자들을 생성한다. 중합 효소(28)에 의해 생성된 산은 2차 기질(34)을 수반하는 반응으로부터 생성된 다량의 산 또는 염기에 의해 압도될 것이다. 일부 경우들에서, 산 또는 염기 생성 반응들로 인해 발생하는 국소 pH 변화는 중합 효소(28)의 동역학에 영향을 미칠 수 있다. 일부 경우들에서, pH 변화는 베이스라인 pH가 재개될 때까지 중합 효소(28) 활성을 턴오프할 수 있다. 이는 (예컨대, 뉴클레오티드(12 또는 12')가 사용될 때) 통합 이벤트들사이에 지연을 초래하는데 유리할 수 있다. 다른 인자들, 이를테면 pH 변경 모이어티의 선택, 완충제, 통합 동안 온도 변화들 등은 또한 중합 효소 동역학에 대한 특정 효과를 추가로 강화시키거나 중화시키기 위해 조절될 수 있다.
[00103]
감지 시스템들(10A-10E) 중 임의의 감지 시스템을 사용하면, 단분자 감지를 위한 방법은 전도성 채널(26)에 테더링된 중합 효소(28)를(복합체의 일부로서 또는 단독으로) 갖는 센서(20)에 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 도입시키는 단계(예컨대, 도 2 참조); 2차 기질(34) 및 라벨링된 뉴클레오티드들(12, 12A, 12B, 12C, 또는 12')을 포함하는 유체를 센서(20)에 도입시키는 단계 ― 그로 인해 라벨링된 뉴클레오티드들(12, 12A, 12B, 12C, 또는 12') 중 하나의 뉴클레오티드는 중합 효소(28)와 연관되고, 라벨링된 뉴클레오티드들(12, 12A, 12B, 12C, 또는 12') 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드의 라벨(18)은 전도성 채널(26) 근처 내에 있는 2차 기질(34)을 수반하는 pH 변경 반응에 참여함 ―; 및 전도성 채널(26)의 응답을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 경우들에서, 검출된 전하 변화가 베이스라인 전하에 상대적일 것이다. 더욱이, 상이한 뉴클레오티드들(12, 12A-12C 또는 12')은 상이한 통합 레이트들을 가질 수 있는데, 이는 예컨대 산 또는 염기가 얼마나 오래 생성되지 또는 산 또는 염기 생성 반응이 얼마나 오래 억제되는지에 영향을 미칠 수 있다. 이는 차례로 전도성 채널(26)의 표면에서의 국소 pH 레벨 및 전하에 영향을 미칠 것이다. 통합 레이트는 다른 뉴클레오티드들을 구별하기 위해 사용될 수 있다.
[00104]
감지 시스템들(10A-10E) 및 감지 시스템(10A-10E)과 연관된 임의의 방법들 각각은 이제 이들이 도시된 개별 도면들을 참조하여 더 상세히 설명될 것이다.
[00105]
감지 시스템(10A)
[00106]
구체적으로 도 2를 참조하면, 감지 시스템(10A)은 테더(32)를 통해 전도성 채널(26)에 부착된 중합 효소(28) 및 pH 센서(20)를 포함한다.
[00107]
이러한 예시적인 감지 시스템(10A)에서, 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)(도 2)를 수용할 수 있고 주형(44)을 따라 뉴클레오티드 염기를 발생기의 스트랜드(46)에 성공적으로 통합할 수 있는 임의의 중합 효소(28)가 사용될 수 있다. 본원에 개시된 단분자 감지 기술들에서, 중합 효소(28)가 고도로 진화하여 다수의 통합 이벤트들이 발생할 수 있는 것이 바람직하다. 예시적인 중합 효소들은 Bsu 중합 효소, Bst 중합 효소, Taq 중합 효소, T7 중합 효소 등과 같은 계열 A의 중합 효소들; pHi29 중합 효소 및 다른 고도로 진화한 중합 효소들(계열 B2), Pfu 중합 효소(계열 B), KOD 중합 효소(계열 B), 9oN(계열 B) 등과 같은 계열들 B 및 B2의 중합 효소들; 대장균 DNA Pol III 등과 같은 계열 C의 중합 효소들; Pyrococcus furiosus DNA Pol II 등과와 같은 계열 D의 중합 효소들; 및 DNA Pol μ, DNA Pol β, DNA Pol σ 등과 같은 계열 X의 중합 효소들을 포함한다. 일례에서, 신호에서 100mV 범위를 제공하기에 충분한 적어도 2 pH 단위에 걸쳐 작용하는 것으로 알려진 중합 효소(28)를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 4개의 상이한 뉴클레오티드들 및 "오프” 상태의 경우, 이 범위는 검출가능한 20mV 변화들을 구별하는 것을 수반할 수 있다.
[00108]
이러한 예시적인 감지 시스템(10A)에서, 테더(32)는 중합 효소(28)에 대한 앵커로서 사용된다. 적합한 테더(32)의 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 감지 시스템(10A)에서, 테더(32)의 길이는 생성된 산 또는 염기 중 임의의 것이 용액에서 중화되기 전에 채널(26)로 확산될 수 있도록 중합 효소(28)를 채널(26)에 충분히 가깝게 유지하기에 충분하다. 예에서, 테더(32)는 약 2 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 150 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 100 nm 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 예들에서, 테더(32)는 중합 효소(28)를 전도성 채널(26)로부터 적어도 10 nm 이격하여 유지한다. 예컨대 중합 효소(28), 중합 효소(28)의 전하들 및/또는 중합 효소(28)에 의해 유지되는 타겟/주형 폴리뉴클레오티드 사슬의 전하들에 대한 컨포멀 변화들이 pH 센서(20)의 감지 동작을 간섭하지 않도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 예컨대 pH 변화들이 감지되는 신호를 지배할 때 이러한 예시적인 최소 거리(적어도 10nm)가 필요치 않을 수 있다는 것이 바람직하다.
[00109]
도시되지는 않았지만, 감지 시스템(10A)은 또한 pH 감지 채널(26)의 표면에서 또는 이 표면 근처에서 발생하는 pH 변화에 대응하는 전압 및/또는 전류 변화들을 검출하기 위한 검출기를 포함할 수 있다.
[00110]
또한 도시되지는 않았지만, 감지 시스템(10A)은 실리콘 칩 또는 CMOS(complementary metal-oxide semiconductor)와 같은 지지체상에 포지셔닝될 수 있다. 전극들(22, 24)은 전자 회로에 연결될 수 있으며, 전자 회로는 (예컨대, 일단 검출기 및 파워 서플라이에 접속되면) 전극들의 동작을 인에이블한다.
[00111]
일부 예들에서, 센서(10A)는 사전-조립될 수 있다.
[00112]
다른 예들에서, 센서 컴포넌트들은 키트의 일부일 수 있고, 키트 컴포넌트들은 센서(10A)를 조립하는 데 사용될 수 있다. 키트의 예는 지지체상의 pH 센서(20) 및 별도의 중합 효소 용액을 포함한다. 중합 효소 용액은 액체 캐리어 및 중합 효소(28)의 임의의 예를 포함한다. 일부 예들에서, 중합 효소(28)는 테더(32)에 부착되고, 다른 예들에서 테더(32)는 감지 시스템(10A)의 일부로서 pH 감지 채널(26)에 부착된다. 예들로서, 중합 효소 용액의 액체 캐리어는 물, 또는 이온 소금 완충액, 이를테면 밀리-몰 내지 몰 농도들의 염류 구연산염일 수 있다.
[00113]
키트를 사용할 때, 사용자는 지지체 상에 중합 효소 용액을 증착시킬 수 있으며, 테더(32)가 전도성 채널(26)에 부착되거나 또는 중합 효소(28)가 전도성 채널(26)상의 테더(32)에 부착되기에 적합한 시간 동안 중합 효소 용액이 지지체상에 유지될 수 있다. 지지체는 임의의 비-결합 중합 효소(28)를 제거하기 위해 적합한 완충제로 린스될 수 있다.
[00114]
도 2에서, 키트의 예들은 또한 단분자 감지 동안 센서(10A)와 함께 사용될 유체를 포함할 수 있다. 이러한 유체는 액체 캐리어, 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C) 및 2차 기질(34)을 포함한다. 일부 경우들에서, 이 유체는 또한 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 포함한다. 다른 경우들에서, 하나의 용액은 액체 캐리어, 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C) 및 2차 기질(34)을 포함하고, 다른 용액은 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 포함한다.
[00115]
주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 서열화될 임의의 샘플일 수 있으며, DNA, RNA 또는 이들의 유사체들(예컨대, 펩티드 핵산들)로 구성될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 원형 주형일 수 있다. 주형(또는 타겟) 폴리뉴클레오티드 사슬(44)의 소스는 게놈 DNA, 메신저 RNA, 또는 천연 소스들로부터의 다른 핵산들일 수 있다. 일부 경우들에서, 이러한 소스들로부터 유도된 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 본원에 개시된 방법 또는 시스템에서 사용하기 이전에 증폭될 수 있다. PCR(polymerase chain reaction), RCA(rolling circle amplification), MDA(multiple displacement amplification) 또는 RPA(random primer amplification)를 포함하는(그러나, 이들에 제한되지 않음) 다양한 공지된 증폭 기술들 중 임의의 기술이 사용될 수 있다. 본원에 제시된 방법 또는 시스템에 사용하기 전에 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)의 증폭은 선택적이라는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 일부 예들에서 사용하기 전에 증폭되지 않을 것이다. 주형/타겟 폴리뉴클레오티드 사슬들(44)은 합성 라이브러리들로부터 선택적으로 유도될 수 있다. 합성 핵산들은 천연 DNA 또는 RNA 조성들을 가질 수 있거나 또는 이의 유사체들일 수 있다.
[00116]
라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)은 본원에 개시된 뉴클레오티드(14 또는 14') 및 링킹 분자(16 또는 16')의 임의의 예를 포함한다. 도 2에 도시된 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)의 라벨(18)은 촉매 라벨(18A)이다. 본원에서 사용된 "촉매 라벨"은 2차 기질(34)을 수반하는 산 또는 염기 생성 반응을 개시하거나 가속하는 화학 종을 지칭한다. 따라서, 촉매 라벨(18A)은 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)에 부착된 pH 변경 모이어티의 일례이다. 예컨대, 촉매 라벨(18A)은 2차 기질(34)과 반응하여 산을 생성하고 이에 따라 pH를 낮추는 효소일 수 있다. 산 생성 쌍의 특정 예는 촉매 라벨(18A)로서 아세틸콜린에스테라제를 그리고 2차 기질(34)로서 에스테르 기질(예컨대, 아세틸콜린)을 포함한다. 산 생성 쌍의 다른 특정 예는 촉매 라벨(18A)로서 탄산 탈수 효소를 그리고 2차 기질(34)로서 중탄산염 이온을 포함한다. 다른 예에서, 촉매 라벨(18A)은 염기를 생성하기 위해 2차 기질(34)과 반응하여 pH를 증가시키는 효소일 수 있다. 일부 예들에서, 채널(26)의 표면에 있는 표면 그룹들은 생성되는 산성 또는 염기성 이온들에 민감하며, 양성자화 또는 탈양성자화를 겪을 수 있어 채널(26) 표면에서 직접 전하 밀도를 변경할 수 있다. 다른 예들에서, 산 생성 또는 염기 생성 반응들 동안 생성된 하전 이온들은 전도성 채널(26)에 의해 감지된다.
[00117]
단분자 감지 동안 센서(10A)와 함께 사용될 수 있는 유체의 액체 캐리어는 물 또는 약 6 내지 약 9, 또는 약 7 내지 약 8 범위의 pH를 갖는 저 완충액(10mM 이하)이다. 유체의 pH는 사용되는 중합 효소(28), 및 pH 변화가 있을 때 신호를 최대화하는 데 도움이 되는 임의의 조건들에 의존한다. 촉매 라벨(18A) 및 2차 기질(34) 둘 모두가 이러한 예에서 유체에 존재하기 때문에, 일부 산 또는 염기 생성 반응(들)은 전도성 채널(26)로부터 떨어져 유체에서 발생할 수 있다. 그러나, 이러한 반응(들)에서 생성된 이온들은 (저 완충액에 의해) 유체에서 중화될 수 있으며, 따라서 검출 가능한 신호를 초래하지 않을 수 있다. 이는 유체에서 큰 전역 pH 변화들을 방지한다. 그러나, 라벨링된 뉴클레오티드 (12 또는 12A-12C)가 중합 효소(28)에 의해 유지될 때, 촉매 라벨(18A)은 (예컨대, 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)가 용액에서 부유해 있을 때와 비교하여) pH 감지 채널(26)에 더 근접하여 유지된다는 것이 이해되어야 한다. 차례로, 2차 기판(34) 및 일시적으로 결합된 촉매 라벨(18A)을 포함하는 반응으로 인해 발생하는 임의의 pH 변화는 또한 pH 감지 채널(26)에 근접해 있다. 더욱이, 촉매 라벨(18A)의 동역학은 중합 효소(28)의 동역학보다 더 빠를 수 있다. 예컨대, 산 생성 효소, 즉 아세틸콜린에스테라제의 전환 빈도는 25,000 s-1 정도로 높을 수 있는 반면, 통합 이벤트는 임의의 위치에서 약 0.1 s-1 내지 약 100 s-1 걸릴 수 있다. 이러한 예에서, 촉매 라벨(18A)은 (단일 통합 이벤트 마다) 통합된 뉴클레오티드 당 약 250 내지 약 250,000 산 분자들을 생성할 수 있다. 촉매 라벨(18A) 및 산 또는 염기 생성이 전도성 채널(26)의 표면에 국한될 때, pH 감지 채널(26) 주위에 pH 구배가 생성될 수 있으며, 이는 pH 감지 채널(26)에서 검출 가능한 전하 신호들을 생성할 수 있다. 이러한 신호들이 기록될 수 있다.
[00118]
일례에서, 저 완충액의 완충제 농도는 약 10mM 미만일 수 있으며, 이는, 본원에서 설명된 바와같이, 전역 pH 변화들을 방지할 수 있지만, 전도성 채널(16) 근처의 국소 pH 변화들이 검출될 수 있게 할 수 있다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 10mM보다 상당히 작으며, 이의 예들은 약 5mM, 약 2.5mM, 약 2mM, 약 1mM, 약 0.5mM 또는 약 0.25mM을 포함한다. 다른 예들에서, 고체상 완충제들은 국소 환경을 완충하지 않고 전역 pH를 유지하는 데 도움을 주기 위해 사용될 수 있다.
[00119]
감지 시스템(10A)과 함께 사용될 수 있는 유체의 일례에서, 4개의 상이한 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)이 포함될 수 있다. 4개의 상이한 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)은 별개의 뉴클레오티드들(14 또는 14')(예컨대, T, A, G 또는 C) 및 별개의 촉매 라벨들(18A)을 포함한다. 별개의 촉매 라벨들(18A)은 상이한 동역학을 가질 수 있어서, 산 또는 염기는 상이한 레이트들로 생성되는데, 이는 차례로 채널(26)에서 상이한 전하 밀도들을 초래할 것이다. 별개의 촉매 라벨들(10A)이 뉴클레오티드 특정적이기 때문에(예컨대, 특정 라벨(18A)이 특정 염기에 대해 선택됨), pH 센서(20)의 응답은 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)의 통합된 염기를 표시할 수 있다.
[00120]
다음 설명은 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 및 감지 시스템(10A)을 수반하는 예시적인 방법에 관한 것이다. 이러한 예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 및 2차 기질(34)과 함께 또는 이들과 별도로 생물학적으로 안정한 용액과 같은 유체로 감지 시스템(10A)에 도입될 수 있다. 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)과 연관되어 사슬(44)이 제자리에 유지된다. 라벨링된 뉴클레오티드들(12)의 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드의 상보적인 염기는 중합 효소(28)에 의해 (주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 따라 형성되는) 발생기의 스트랜드(46)에 통합될 것이다. 통합 이벤트 동안, 라벨링된 뉴클레오티드(12)의 촉매 라벨(18A)은 채널(26) 및 채널(26)의 근처 내에 또한 있는 유체 내의 임의의 2차 기질(34)에 근접하게 된다. 촉매 라벨(18A)의 동역학이 통합 이벤트보다 빠를 수 있기 때문에, 염기 통합이 완료되기 전에 2차 기질(34)과 산 또는 염기 생성 반응이 일어난다. 산 또는 염기 생성 반응으로부터의 하전 이온들은 전도성 채널(26)에서 검출될 수 있거나, 반응성 표면 그룹들이 존재하는 경우, 표면 그룹들과 반응하여 표면 그룹들의 전하 상태를 변경할 수 있다. 변경된 전하는 pH 센서(20)에 의해 검출된다.
[00121]
이러한 예시적인 방법에서, 뉴클레오티드 염기를 발생기의 스트랜드(46)에 통합한 이후에, 알파 인산염과 링킹 분자(16) 사이 또는 알파 인산염과 베타 인산염 사이의 결합이 자연적으로 절단된다. 이러한 자연적 절단은 라벨(18A)(및 링킹 분자(16))이 통합된 뉴클레오티드 염기로부터 해리되고 감지 시스템(10A)으로부터 멀리 확산되는 것을 가능하게 한다. 이후, 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)의 다음 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 염기를 포함하는 다른 라벨링된 뉴클레오티드(12)를 수용할 수 있다.
[00122]
다음 설명은 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 및 감지 시스템(10A)을 수반하는 예시적인 방법에 관한 것이다. 이러한 예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 및 2차 기질(34)과 함께 또는 이들과 별도로 생물학적으로 안정한 용액과 같은 유체로 감지 시스템(10A)에 도입될 수 있다. 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)과 연관되어 사슬(44)이 제자리에 유지된다. 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드의 상보적인 염기는 중합 효소(28)에 의해 (주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 따라 형성되는) 발생기의 스트랜드(46)에 통합될 것이다. 이러한 예에서, 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)는 가역적 종결 부위를 포함한다. 따라서, 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)의 통합은 중합을 위한 종결 부위 역할을 한다. 이는 산 또는 염기 생성 및 전하 검출이 위에서 설명된 것과 유사한 방식으로 일어나는 것을 가능하게 한다.
[00123]
이러한 예시적인 방법에서, 뉴클레오티드 염기를 발생기의 스트랜드(46)에 통합한 이후에, 임의의 비-통합 뉴클레오티드들을 포함하는 유체가 감지 시스템(10A)으로부터 제거될 수 있다. 이는 세정 용액(예컨대, 물)을 사용하여 수행될 수 있다. 이후, 탈차단제는 감지 시스템(10A)에 도입될 수 있다. 탈차단제는 i)(촉매 라벨(18A)을 또한 제거하는) 통합된 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)로부터 임의의 절단 가능한 링킹 분자들(16')을 절단하고 그리고 ii) 통합된 라벨링된 뉴클레오티(12A-12C)로부터 3'OH 차단기(38A, 38B, 38C)(도 1b 참조)를 제거할 수 있다. 3'OH 차단기(38A, 38B, 38C)의 제거는 후속 서열화 사이클이 수행되는 것을 가능하게 한다. 3'OH 차단기들 및 적합한 탈차단제들의 예들은 광분해로 제거될 수 있는 o-니트로벤질 에테르들 및 알킬 o-니트로벤질 탄산염; 염기 가수분해에 의해 제거될 수 있는 에스테르 모이어티들; Nal, 클로로트리메틸실란 및 Na2S2O3로 제거될 수 있거나 또는 아세톤/물의 Hg(II)로 제거될 수 있는 알릴-모이어티들; 포스핀들, 이를테면 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀(TCEP) 또는 트리(히드록시프로필)포스핀(THP)으로 절단될 수 있는 아지도메틸; 산성 상태들로 절단될 수 있는 테르트-부톡시-에톡시와 같은 아세탈들; LiBF4 및 CH3CN/H2O로 절단될 수 있는 MOM(―CH2OCH3) 모이어티들; 티오페놀 및 티오설페이트와 같은 친핵성 시약으로 절단될 수 있는 2,4-디니트로벤젠 술페닐; Ag(I) 또는 Hg(II)로 절단될 수 있는 테트라히드로푸라닐 에테르; 및 포스파타제 효소들(예컨대, 폴리뉴클레오티드 키나제)에 의해 절단될 수 있는 3'인산염을 포함한다. 다른 유용한 가역성 모이어티들은 에테르들, -F, -H2, -OCH3, -N3, -HCOCH3, 및 2-니트로벤젠 탄산염을 포함하며, 그리고 유용한 탈차단 처리들은 (예컨대, 광 절단을 유도하기 위해) 광을 이용한 조사, 가열, 화학 반응물들에 대한 노출, 촉매들에 대한 노출,(예컨대, 전기 분해를 유도하기 위해) 전류에 대한 노출 등을 포함한다.
[00124]
감지 시스템(10B)
[00125]
구체적으로, 도 3a 및 도 3b를 참조하면, 감지 시스템(10B)은 pH 센서(20) 및 pH 센서(20)의 전도성 채널(26)에 부착된 복합체(30A)를 포함한다.
[00126]
복합체(30A)는 pH 센서(20)에 노출된 유체의 2차 기질(34)의 소비로부터 전도성 채널(26) 근처 내에서 pH 변화를 생성하는 데 참여하는 pH 변경 모이어티(이들 예들에서는 50A, 50B 또는 50C로 도시됨)에 링크된 중합 효소(28)를 포함한다.
[00127]
복합체(30A)의 중합 효소(28)는 도 2를 참조하여 설명된 중합 효소의 임의의 예일 수 있다.
[00128]
이러한 예에서, pH 변경 모이어티는 효소(50A), 보조 인자(50B) 및 활성화제(50C)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
[00129]
효소(50A)는 2차 기질(34)과의 반응에서 산 또는 염기를 생성한다. 예들로서, 효소(50A)는 가수 분해 효소들 및 산화 효소들로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 적합한 가수 분해 효소들의 예들은 포스파타제들, 에스테라제들(예컨대, 아세틸콜린에스테라제), 서열 특정 프로테아제들(예컨대, TEV 프로테아제 또는 트롬빈) 및 글리코시다제들(셀룰로스 또는 아밀라제와 같이 리보스를 분해하지 않음)를 포함한다. 또 다른 적합한 가수 분해 효소는 탄산 탈수 효소이다. 적합한 산화 효소들의 예들은 글루코오스 산화 효소, 모노아민 산화 효소, 크산틴 산화 효소 등을 포함한다. 여러 예들이 제공되었지만, 효소 동역학이 중합 효소 동역학보다 빠른 한, 임의의 이용 가능한 효소(50A) 또는 공학적 효소(50A)가 사용될 수 있다고 여겨진다.
[00130]
보조 인자(50B)는 그 존재가 2차 기질(34)과의 반응에서 산 또는 염기를 생성하는 효소의 활성에 필수적인 물질이다. 산화 효소들에 적합한 보조 인자들(50B)의 일부 예들은 FAD(flavin adenine dinucleotide), NAD(nicotine adenine dinucleotide), NADP(nicotine adenine dinucleotide phosphate) 등을 포함한다.
[00131]
활성화제(50C)는 2차 기질(34)과의 산 또는 염기 생성 반응을 개시하거나 자극하는 물질이다. 일부 경우들에서, 활성화제(50C)는 보조 인자(50B)와 유사하게 작용하므로, 보조 인자(50B)의 임의의 예들이 활성화제(50C)에 사용될 수 있다. 금속-의존성 가수 분해 효소들의 경우, 적합한 활성화제들(50C)의 예들이 2가 금속을 포함한다.
[00132]
복합체(30A)에서, 중합 효소(28) 및 pH 변경 모이어티(50A-50C)의 임의의 예가 함께 접합된다. 일례에서, 이러한 복합체(30A)는 융합 단백질 또는 단백질 키메라이다. 복합체(30A)는 스파이태그-스파이캐처 커플링 반응, π-클램프 매개된 시스테인 접합, 비오틴/스트렙타비딘, SUMO(작은 유비퀴틴-형 변형 인자) 단백질, His6/NTA와 금속의 킬레이트화, 시스테인/말레이미드, 디벤조사이클로옥틴(DBCO)/아지드, 또는 임의의 다른 적합한 접합 방법과 같은 접합 방법들을 사용하여 형성될 수 있다.
[00133]
복합체(30A)는 테더(32)를 통해 전도성 채널(26)에 부착될 수 있으며, 이의 예들은 도 2를 참조하여 설명된다. 대안적으로, 복합체(30A)는 pH 변경 모이어티(50A-50C)와 전도성 채널(26)의 표면에 있는 그룹들 사이의 결합을 통해 직접 부착될 수 있다.
[00134]
도시되지는 않았지만, 감지 시스템(10B)은 또한 pH 감지 채널(26)의 표면에서 또는 이 표면 근처에서 발생하는 pH 변화에 대응하는 전압 및/또는 전류 변화들을 검출하기 위한 검출기를 포함할 수 있다.
[00135]
또한 도시되지는 않았지만, 감지 시스템(10B)은 실리콘 칩과 같은 지지체 상에 포지셔닝될 수 있다. 전극들(22, 24)은 전자 회로에 연결될 수 있으며, 전자 회로는 (예컨대, 일단 검출기 및 파워 서플라이에 접속되면) 전극들의 동작을 인에이블한다.
[00136]
일부 예들에서, 센서(10B)는 사전-조립될 수 있다.
[00137]
다른 예들에서, 센서 컴포넌트들은 키트의 일부일 수 있고, 키트 컴포넌트들은 센서(10B)를 조립하는 데 사용될 수 있다. 키트의 예는 지지체상의 pH 센서(20), 및 복합체(30A)를 pH 센서(20)에 도입하는 데 사용되는 유체를 포함한다. 유체는 액체 캐리어와 복합체(30A)를 포함한다. 일부 예들에서, 유체 내의 복합체(30A)는 테더(32)에 부착된다. 다른 예들에서, 테더(32)는 감지 시스템(10B)의 일부로서 pH 감지 채널(26)에 부착된다. pH 변경 모이어티(50A-50C)와 채널(26)의 표면 그룹들 사이에 형성된 직접 결합이 존재하는 또 다른 예들에서, 유체 내의 복합체(30A)가 테더(32)에 부착되지 않고 테더(32)가 pH 감지 채널(26)에 부착되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 일례에서, 액체 캐리어는 물이거나, 또는 밀리-몰 농도들의 염류 구연산염과 같은 저 완충액의 예이다.
[00138]
이러한 키트의 일례에서, 액체 캐리어 내의 복합체(30A)는 적어도 하나의 효소(50A)에 링크된 중합 효소(28)를 포함한다. 이러한 키트의 다른 예에서, 액체 캐리어 내의 복합체(30A)는 보조 인자(50B)에 접합된 중합 효소(28)를 포함한다. 이러한 키트의 또 다른 예에서, 액체 캐리어 내의 복합체(30A)는 활성화제(50C)에 접합된 중합 효소(28)를 포함한다. 이들 예들의 각각에서, 복합체(30A)는 또한 테더(32)를 포함할 수 있다. 키트의 이러한 예들을 사용할 때, 사용자는 지지체상에 유체를 증착시킬 수 있으며, 테더(32)가 전도성 채널(26)에 복합체(30A)를 부착하고, 복합체(30A)가 채널(26)상의 테더(32)에 부착되며 또는 pH 변경 모이어티(50A-50C)가 채널(26)의 표면 그룹들에 결합되는데 적합한 시간 동안 유체가 지지체상에 유지될 수 있게 할 수 있다. 지지체는 임의의 비-결합 복합체들(30A)을 제거하기 위해 적합한 완충제로 린스될 수 있다.
[00139]
키트의 일부 예들은 또한 단분자 감지 동안 감지 시스템(10B)과 함께 사용될 유체(들)를 포함할 수 있다. 유체(들)의 함량들은 어떤 pH 변경 모이어티(50A-50C)가 감지 시스템(10B) 내의 복합체(30A)의 일부인지 그리고 어떤 라벨링된 뉴클레오티드들(12, 12A-12C 또는 12')이 사용되는지에 따라 달라질 수 있다. 이러한 유체(들)의 몇몇 예들이 이제 설명될 것이다.
[00140]
도 3a에 도시된 예들에서, 단분자 서열화 동안 사용되는 유체(들)는 본원에 개시된 액체 캐리어, 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C) 및 2차 기질(34)(이는 이들 예들에서 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)와는 별도의 분자임)의 임의의 예를 포함한다.
[00141]
라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)에 부착된 라벨(18B 또는 18C)은 어떤 pH 변경 모이어티가 복합체(30A)에 포함되는지에 의존할 것이다.
[00142]
감지 시스템(10B)이 복합체(30A)의 일부로서 효소(50A)를 포함할 때, 라벨(18B)이 사용된다. 본원에서 언급된 바와 같이, 효소(50A)는 효소(50A)와 2차 기질(34)이 서로 근처 내에 있을 때 2차 기질(34)과의 반응에서 산 또는 염기를 생성한다. 효소(50A)와 2차 기질(34) 사이의 산 또는 염기 생성 반응을 통합된 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)와 상관시키기 위해, 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)상의 라벨(18B)은 효소(50A)의 동역학을 강화시키거나 또는 효소(50A)의 동역학을 감속시키도록 조정될 수 있다. 따라서, 라벨(18B)은 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)에 부착된 pH 변경 모이어티의 일례이다. 따라서, 시스템(10B)의 이러한 예는 pH 변경 모이어티의 2개의 상이한 예들을 포함한다. 따라서, 일례에서, 라벨(18B)은 효소(50A)의 동역학을 강화시키는 제1 그룹 및 효소(50A)의 동역학을 감속시키는 제2 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
[00143]
라벨(18B)이 효소(50A)의 동역학을 강화시킬 때, 라벨(18B)은 또한 효소(50A) 및 2차 기질(34)을 수반하는 산 또는 염기 생성 반응의 동역학을 강화시킨다(예컨대, 개시 또는 가속화한다). 효소(50A)의 동역학을 강화시키는 라벨들(18B)의 예는 효소의 보조 인자들을 포함한다. 효소(50A)의 동역학을 강화시키는 다른 라벨들(18B)의 예들은 크라우딩 효과를 갖는 것들을 포함한다. 이러한 타입의 라벨(18B)은 다른 분자들에 이용 가능한 물의 부피를 감소시키고 2차 기질(34)의 국소 농도를 효과적으로 증가시킬 수 있는 (이는 차례로 반응 속도를 증가시킴) 큰 크라우딩 에이전트일 수 있다.
[00144]
대조적으로, 라벨(18B)이 효소(50A)의 동역학을 감속시킬 때, 라벨(18B)은 또한 효소(50A) 및 2차 기질(34)을 수반하는 산 또는 염기 생성 반응의 동역학을 감속시킨다. 효소(50A)의 동역학을 감속시키는 라벨들(18B)의 예들은 알로스테릭 억제제, 스테릭 배제 그룹 및 완충 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 알로스테릭 억제제는 효소(50A)의 알로스테릭 부위에 결합되어, 효소(50A)의 활성 부위의 배좌를 변경한다. 결과적으로, 효소(50A)는 더 이상 2차 기질(34)과 반응할 수 없고 비활성화된다. 알로스테릭 억제제와 효소(50A) 사이의 결합이 중합 효소(28)와 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)의 염기 사이의 결합보다 더 약하여 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)만이 단지 라벨(18B)에 의해서만 결합되지 않도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 스테릭 배제 그룹은 2차 기질(34)보다 부피가 더 큰 분자일 수 있다. 통합된 라벨링된 뉴클레오티드의 스테릭 배제 그룹은 2차 기질(34)이 효소(50A)에 충분히 가까워져 반응하는 것을 차단할 수 있다. 다시 말해서, 스테릭 배제 그룹은 효소(50A)에 실제로 결합하지 않고 효소(50A)에 대한 액세스를 감소시킬 수 있다. 완충 그룹은 산 생성 반응 동안 생성된 양성자들 또는 염기 생성 반응 동안 생성된 염기의 분자들을 흡수하여 pH를 중화시키는 국소 완충제 역할을 할 수 있다. 예로서, 다수의 산 또는 염기 그룹들을 갖는 덴드리머들은 전도성 채널(26)의 국소 부근을 완충하는 역할을 할 수 있다.
[00145]
예에서, 상이한 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)(예컨대, A, T, C, G)에 부착된 라벨들(18B)은 상이한 레이트들로 산 또는 염기 생성을 증가 또는 감소시키기 위해 선택될 수 있다. 이러한 예에서, 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C) 중 하나가 중합 효소(28)에 의해 통합될 때, 라벨(18B)은 효소(50A) 및 2차 기질(34)의 근처 내에 있게 되며, 고유한 라벨-의존성 레이트로 반응을 강화시키거나 감속시킨다. 차례로, 전도성 채널(26)에서의 pH가 변경된다. pH의 변화는 증가 또는 감소된 산 또는 염기 생성과 상관되며, 따라서 통합된 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)를 식별하는 데 사용될 수 있다.
[00146]
감지 시스템(10B)이 복합체(30A)의 일부로서 보조 인자(50B) 또는 활성화제(50C)를 포함할 때, 라벨(18C)이 사용된다. 라벨(18C)은 2차 기질(34)과의 반응에서 산 또는 염기를 생성하는 효소일 수 있다. 따라서, 라벨(18C)은 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)에 부착된 pH 변경 모이어티의 일례이다. 따라서 시스템(10B)의 이러한 예는 pH 변경 모이어티의 2개의 상이한 예들을 포함한다. 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)가 중합 효소(28)에 의해 통합될 때, 효소 레벨(18C)은 보조 인자(50B) 또는 활성화제(50C) 및 2차 기질(34)에 근처에 있게 된다. 부착된 보조 인자(50B) 또는 활성화제(50C)는 유체의 2차 기질(34)과 효소 라벨(18C)사이의 반응을 강화시키거나 또는 개시할 수 있다.
[00147]
라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)이 2차 기질(34)을 포함하지 않기 때문에, 도 3a의 예에 표현된 유체(들)는 또한 2차 기질(34)을 포함한다. 2차 기질(34)은 효소(50A)와 반응하여 산 또는 염기를 생성할 수 있거나, 또는 효소 라벨(18C)과의 반응이 보조 인자(50B) 또는 활성화제(50C)에 의해 강화되거나 개시될 수 있는 임의의 2차 기질(34)일 수 있다.
[00148]
다음 설명은 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 및 감지 시스템(10B)을 수반하는 예시적인 방법에 관한 것이다. 이러한 예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 및 2차 기질(34)과 함께 또는 이들과 별도로 생물학적으로 안정한 용액과 같은 유체로 감지 시스템(10B)에 도입될 수 있다. 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)과 연관되어 사슬(44)이 제자리에 유지된다. 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드의 상보적인 염기는 중합 효소(28)에 의해 (주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 따라 형성되는) 발생기의 스트랜드(46)에 통합될 것이다. 통합 이벤트 동안, 라벨링된 뉴클레오티드(12)의 라벨(18B 또는 18C)은 채널(26), pH 변경 모이어티(50A-50C) 및 pH 변경 모이어티(50A-50C)의 근처에 또한 있는 유체의 임의의 2차 기질(34)의 근처에 있게 된다. 2차 기질(34)과의 산 또는 염기 생성 반응은 사용되는 라벨들(18B 또는 18C) 및 복합체(30A)에 따라 강화되거나, 감속되거나 또는 억제될 수 있으며, 이는 채널(26) 표면에서 유체의 pH 및 전하를 변경한다. 이러한 예시적인 방법에서, 뉴클레오티드 염기를 발생기의 스트랜드(46)에 통합한 이후에, 알파 인산염과 링킹 분자(16) 사이 또는 알파 인산염과 베타 인산염 사이의 결합이 자연적으로 절단된다. 이러한 자연적 절단은 라벨(18B 또는 18C)(및 링킹 분자(16))이 통합된 뉴클레오티드 염기로부터 해리되고 감지 시스템(10B)으로부터 멀리 확산되는 것을 가능하게 한다. 이후, 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)의 다음 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 염기를 포함하는 다른 라벨링된 뉴클레오티드(12)를 수용할 수 있다.
[00149]
다음 설명은 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 및 감지 시스템(10B)을 수반하는 예시적인 방법에 관한 것이다. 이러한 예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 및 2차 기질(34)과 함께 또는 이들과 별도로 생물학적으로 안정한 용액과 같은 유체로 감지 시스템(10B)에 도입될 수 있다. 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)과 연관되어 사슬(44)이 제자리에 유지된다. 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드의 상보적인 염기는 중합 효소(28)에 의해 (주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 따라 형성되는) 발생기의 스트랜드(46)에 통합될 것이다. 2차 기질(34)과의 산 또는 염기 생성 반응은 사용되는 라벨들(18B 또는 18C) 및 복합체(30A)에 따라 강화되거나, 감속되거나 또는 억제될 수 있으며, 이는 채널(26) 표면에서 유체의 pH 및 전하를 변경한다. 이러한 예에서, 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)는 가역적 종결 부위를 포함한다. 따라서, 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)의 통합은 중합을 위한 종결 부위 역할을 한다. 이는 강화, 감속 또는 억제되는 산 또는 염기 생성 및 전하 검출이 앞서 설명된 것과 유사한 방식으로 발생하는 것을 가능하게 한다. 이러한 예시적인 방법에서는 탈차단제에 의한 노출 및 세정이 다른 서열화 사이클 동안 감지 시스템(10B)을 준비하기 위해 사용될 수 있다.
[00150]
도 3a를 참조하여 설명된 예들 중 임의의 예에서, 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)가 중합 효소(28)에 의해 통합될 때 라벨(18B 또는 18C)이 pH 변경 모이어티(50A-50C)의 근처에 있게 되도록 중합 효소(28)와 pH 변경 모이어티(50A-50C) 사이의 거리 및 링킹 분자(16, 16')의 길이가 선택될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 이는 산 또는 염기 생성 반응에 대한 예측 가능한 효과들을 가능하게 한다.
[00151]
본원에서 언급된 바와 같이, 감지 시스템(10B)은 또한 라벨링된 뉴클레오티드(12')와 함께 사용될 수 있으며, 라벨링된 뉴클레오티드(12')는 도 1c를 참조하여 설명된 바와 같이 뉴클레오티드(14)에 부착된 2차 기질(34)을 포함한다. 도 3b는 시스템(10B) 및 라벨링된 뉴클레오티드(12')를 예시한다.
[00152]
이러한 예에서, 키트의 유체는 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)이 아닌 라벨링된 뉴클레오티드들(12')을 포함한다. 도 3a를 참조하여 설명된 유체들과 달리, 이러한 유체는 2차 기질(34)이 뉴클레오티드(14)에 부착되기 때문에 별도의 2차 기질(34)을 포함하지 않는다.
[00153]
감지 시스템(10B)이 복합체(30A)의 일부로서 효소(50A)를 포함할 때, 시스템(10B)에 노출된 유체는 액체 캐리어 및 라벨링된 뉴클레오티드들(12')을 포함할 수 있다. 중합 효소(28)가 라벨링된 뉴클레오티드들(12')의 염기를 통합할 때, 2차 기질(34)은 효소(50A)의 근처에 있게 되며, 산 또는 염기 생성 반응이 발생할 수 있다.
[00154]
감지 시스템(10B)이 복합체(30A)의 일부로서 보조 인자(50B) 또는 활성화제(50C)를 포함할 때, 시스템(10B)에 노출된 유체는 액체 캐리어 및 라벨링된 뉴클레오티드들(12')을 포함할 수 있다. 키트의 이러한 예는 또한 라벨링된 뉴클레오티드들(12')을 포함하는 유체와 분리된 효소 유체를 포함할 수 있다. 효소 유체는 라벨링된 뉴클레오티드(12') 및 복합체(30A) 둘 모두가 2차 기질(34)과의 산 또는 염기 생성 반응에 참여하는 효소를 포함하지 않기 때문에 포함된다. 효소 유체는 액체 캐리어(예컨대, 본원에 개시된 완충제들 중 임의의 완충제) 및 2차 기질(34)의 소비에 참여할 효소(54)를 포함할 수 있다. 사용되는 효소(54)는 라벨링된 뉴클레오티드(12')에 부착된 2차 기질(34)에 의존한다.
[00155]
주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44) 및 라벨링된 뉴클레오티드(12')를 포함하는 유체(들) 및 일부 경우들에서 효소 유체가 감지 시스템(10B)에 (순차적으로 또는 동시에) 도입될 때, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 중합 효소(28)와 연관되며, 라벨링된 뉴클레오티드들(12') 중 상보적인 하나는 성장하는 발생기의 스트랜드(46)에 통합된다. 이러한 예에서, 복합체(30A)의 효소(50A) 또는 자유 부유 효소(54)는 2차 기질(34)을 소비하도록 반응하여 산 또는 염기를 생성할 것이며,이러한 반응은 뉴클레오티드 통합보다 더 빠를 것이다. 이러한 예들에서, 2차 기질(34)이 소비되며, 이의 소비시 pH는 베이스라인 레벨로 되돌아갈 것이며, 뉴클레오티드 염기가 통합될 것이다.
[00156]
감지 시스템(10C)
[00157]
구체적으로 도 4를 참조하면, 감지 시스템(10C)은 pH 센서(20) 및 pH 센서(20)의 전도성 채널(26)에 부착된 복합체(30B)를 포함한다.
[00158]
복합체(30B)는 2개의 상이한 효소들(50A 및 50D)에 부착된 중합 효소(28)를 포함한다. 복합체(30A)의 중합 효소(28)는 도 2를 참조하여 설명된 중합 효소의 임의의 예일 수 있다.
[00159]
효소들(50A, 50D)은 이 2개의 효소들(50A, 50D)이 상이한 경우 도 3a 및 도 3b를 참조하여 설명된 효소의 임의의 예일 수 있다. 효소들(50A 및 50D) 각각은 2차 기질(34)과의 반응에서 산 또는 염기를 생성하나; 효소들(50A 및 50D)은 특정 뉴클레오티드 라벨(18D)의 근처에 있을 때 상이한 응답을 갖도록 선택될 수 있다. 일례로서, 효소(50A)는 2가지 타입들의 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)(예컨대, A 및 T)에 부착된 개개의 라벨들(18D)에 반응할 수 있고, 다른 2가지 타입들의 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)(예컨대, C 및 G)에 부착된 개개의 라벨들(18D)에 반응할 수 없다. 역으로, 효소(50D)는 다른 2가지 타입들의 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)(예컨대, C 및 G)에 부착된 개개의 라벨들(18D)에 반응할 수 있으나, 2가지 타입들의 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)(예컨대, A 및 T)에 부착된 개개의 라벨들(18D)에 반응할 수 없다. 이러한 예에서, 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)에 각각 부착된 각각의 라벨(18D)은 다른 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)에 각각 부착된 각각의 다른 라벨(18D)과 상이할 수 있다.
[00160]
복합체(30B)에서, 중합 효소(28) 및 2개의 상이한 효소들(50A, 50D)이 함께 접합된다. 일례에서, 이러한 복합체(30B)는 융합 단백질 또는 단백질 키메라이다. 복합체(30B)는 스파이태그-스파이캐처 커플링 반응, π-클램프 매개된 시스테인 접합, 비오틴/스트렙타비딘, SUMO(작은 유비퀴틴-형 변형 인자) 단백질, His6/NTA와 금속의 킬레이트화, 시스테인/말레이미드, 디벤조사이클로옥틴(DBCO)/아지드, 또는 임의의 다른 적합한 접합 방법과 같은 접합 방법들을 사용하여 형성될 수 있다.
[00161]
(도 4에 도시된 바와 같은) 일례에서, 복합체(30B)는 효소(50A, 50D) 각각에 부착된 테더들(32, 32')을 통해 전도성 채널(26)에 부착될 수 있다. 다른 예에서, 단일 테더(32)는 중합 효소(28)를 전도성 채널(26)에 부착할 수 있고, 효소들(50A, 50D)은 각각 중합 효소(28)에 부착될 수 있다. 또 다른 예에서, 테더들(32, 32')이 없지만, 효소들(50A, 50D) 중 하나 또는 둘 모두가 전도성 채널(26)의 표면 그룹들 및 중합 효소(28)와 직접 결합을 형성할 수 있다.
[00162]
도시되지는 않았지만, 감지 시스템(10C)은 또한 pH 감지 채널(26)의 표면에서 또는 이 표면 근처에서 발생하는 pH 변화에 대응하는 전압 및/또는 전류 변화들을 검출하기 위한 검출기를 포함할 수 있다.
[00163]
또한 도시되지는 않았지만, 감지 시스템(10C)은 실리콘 칩과 같은 지지체 상에 포지셔닝될 수 있다. 전극들(22, 24)은 전자 회로에 연결될 수 있으며, 전자 회로는 (예컨대, 일단 검출기 및 파워 서플라이에 접속되면) 전극들의 동작을 인에이블한다.
[00164]
일부 예들에서, 센서(10C)는 사전-조립될 수 있다.
[00165]
다른 예들에서, 센서 컴포넌트들은 키트의 일부일 수 있고, 키트 컴포넌트들은 센서(10C)를 조립하는 데 사용될 수 있다. 키트의 예는 지지체상의 pH 센서(20), 및 복합체(30B)를 pH 센서(20)에 도입하는 데 사용되는 유체를 포함한다. 유체는 액체 캐리어와 복합체(30B)를 포함한다. 일부 예들에서, 유체 내의 복합체(30B)는 테더들(32, 32')에 부착된다. 다른 예들에서, 유체 내의 복합체(30B)는 중합 효소(28)에 부착된 단일 테더(32)를 포함하고, 효소들(50A 및 50D)은 중합 효소(28)에 부착된다. 또 다른 일부 예들에서, 테더(들)(32, 32')는 감지 시스템(10C)의 일부로서 pH 감지 채널(26)에 부착된다. 효소들(50A, 50D)과 채널(26)의 표면 그룹들 사이에 형성된 직접 결합이 존재하는 또 다른 예들에서, 유체 내의 복합체(30B)가 테더들(32, 32')에 부착되지 않고, 테더들(32, 32')이 pH 감지 채널(26)에 부착되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 일례에서, 액체 캐리어는 물이거나, 또는 밀리-몰 농도들의 염류 구연산염과 같은 저 완충액의 예이다.
[00166]
키의 이들 예들을 사용할 때, 사용자는 지지체상에 유체를 증착할 수 있으며, 테더들(32, 32')이 전도성 채널(26)에 복합체(30B)를 부착하고, 테더(32)가 전도성 채널(26)에 복합체(30B)의 중합 효소(28)를 부착하며 또는 효소들(50A 및 50D)이 채널(26)의 표면 그룹들에 결합되기에 적합한 시간 동안 유체가 지지체상에 유지될 수 있게 할 수 있다. 지지체는 임의의 비-결합 복합체들(30B)을 제거하기 위해 적합한 완충제로 린스될 수 있다.
[00167]
키트의 일부 예들은 또한 단분자 감지 동안 감지 시스템(10C)과 함께 사용될 유체(들)를 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 유체(들)는 본원에 개시된 액체 캐리어, 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C) 및 2차 기질(34)(이는 이들 예들에서 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)와는 별도의 분자임)의 임의의 예를 포함한다.
[00168]
라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)에 부착된 라벨(18D)은 복합체(30B)의 2개의 효소들(50A, 50D)에 의존할 것이다. 본원에서 언급된 바와같이, 효소들(50A, 50D) 각각은 2차 기질(34)과의 반응에서 산 또는 염기를 생성한다. 효소(50A)와 2차 기질(34) 사이의 또는 효소(50D)와 2차 기질(34)사이의 특정 산 또는 염기 생성 반응을 상관시키기 위해, 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)상의 각각의 라벨(18D)은 효소(50A) 또는 효소(50D)의 동역학을 강화(예컨대, 개시 또는 감속)시키거나 또는 효소(50A) 또는 효소(50D)의 동역학을 감속시키도록 조정될 수 있다. 따라서, 라벨(18D)은 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)에 부착된 pH 변경 모이어티의 일례이다. 따라서, 시스템(10B)의 이러한 예는 pH 변경 모이어티의 2개의 상이한 예들을 포함한다. 라벨들(18B) 중 임의의 것이 라벨들(18D)에 사용될 수 있고, 4개의 뉴클레오티드들(예컨대, A, T, C, G) 각각은 산 또는 염기 생성 반응들에 다르게 영향을 미치는 다른 라벨로 라벨링될 수 있다. 일례에서, 질소 염기로서 "A"를 갖는 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)에 대해 선택된 라벨(18D)은 효소(50A) 및 2차 기질(34)에 근접할 때 제1 레이트로 산 생성을 강화시킬 수 있고; 질소 염기로서 "T"를 갖는 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)에 대해 선택된 라벨(18D)은 효소(50A) 및 2차 기질(34)에 근접할 때 제2 레이트로 산 생성을 감속시킬 수 있으며; 질소 염기로서 "C"를 갖는 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)에 대해 선택된 라벨(18D)은 효소(50D) 및 2차 기질(34)에 근접할 때 제3 레이트로 염기 생성을 강화시킬 수 있고; 그리고 질소 염기로서 "G"를 갖는 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)에 대해 선택된 라벨(18D)은 효소(50A) 및 2차 기질(34)에 근접할 때 제4 레이트로 염기 생성을 감속시킬 수 있다. 상이한 라벨링된 뉴클레오티드들이 발생기의 스트랜드(46)에 통합될 때, 상이한 pH 레벨들은 전하 민감성 채널(46)의 표면에서 국소적으로 발생할 것이다.
[00169]
라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)이 2차 기질(34)을 포함하지 않기 때문에, 도 4의 예에 표현된 유체(들)는 또한 2차 기질(34)을 포함한다. 2차 기질(34)은 효소(50A 또는 50D)와 반응하여 산 또는 염기를 생성할 수 있는 임의의 2차 기질(34)일 수 있다.
[00170]
다음 설명은 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 및 감지 시스템(10C)을 수반하는 예시적인 방법에 관한 것이다. 이러한 예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 및 2차 기질(34)과 함께 또는 이들과 별도로 생물학적으로 안정한 용액과 같은 유체로 감지 시스템(10C)에 도입될 수 있다. 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)과 연관되어 사슬(44)이 제자리에 유지된다. 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드의 상보적인 염기는 중합 효소(28)에 의해 (주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 따라 형성되는) 발생기의 스트랜드(46)에 통합될 것이다. 통합 이벤트 동안, 라벨링된 뉴클레오티드(12)의 라벨(18D)은 채널(26), 효소들(50A 및 50D), 및 효소들(50A 및 50D) 근처 내에 또한 있는 유체의 임의의 2차 기질(34)의 근처에 있게 된다. 2차 기질(34)과의 산 또는 염기 생성 반응은 라벨(18D) 및 효소(50A 또는 50D)를 수반하는 반응에 대한 효과에 따라 강화, 감속 또는 억제될 수 있다. 이는 채널(26) 표면에서 유체의 pH와 전하를 변경한다. 이러한 예시적인 방법에서, 뉴클레오티드 염기를 발생기의 스트랜드(46)에 통합한 이후에, 알파 인산염과 링킹 분자(16) 사이 또는 알파 인산염과 베타 인산염 사이의 결합이 자연적으로 절단된다. 이러한 자연적 절단은 라벨(18D)(및 링킹 분자(16))이 통합된 뉴클레오티드 염기로부터 해리되고 감지 시스템(10C)으로부터 멀리 확산되는 것을 가능하게 한다. 이후, 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)의 다음 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 염기를 포함하는 다른 라벨링된 뉴클레오티드(12)를 수용할 수 있다.
[00171]
다음 설명은 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 및 감지 시스템(10C)을 수반하는 예시적인 방법에 관한 것이다. 이러한 예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 및 2차 기질(34)과 함께 또는 이들과 별도로 생물학적으로 안정한 용액과 같은 유체로 감지 시스템(10C)에 도입될 수 있다. 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)과 연관되어 사슬(44)이 제자리에 유지된다. 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드의 상보적인 염기는 중합 효소(28)에 의해 (주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 따라 형성되는) 발생기의 스트랜드(46)에 통합될 것이다. 2차 기질(34)과의 산 또는 염기 생성 반응은 라벨(18D) 및 효소(50A 또는 50D)를 수반하는 반응에 대한 효과에 따라 강화, 감속 또는 억제될 수 있다. 이는 채널(26) 표면에서 유체의 pH와 전하를 변경한다. 이러한 예에서, 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)는 가역적 종결 부위를 포함한다. 따라서, 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)의 통합은 중합을 위한 종결 부위 역할을 한다. 이는 강화, 감속 또는 억제되는 산 또는 염기 생성 및 전하 검출이 앞서 설명된 것과 유사한 방식으로 발생하는 것을 가능하게 한다. 이러한 예시적인 방법에서는 탈차단제에 의한 노출 및 세정이 다른 서열화 사이클 동안 감지 시스템(10C)을 준비하기 위해 사용될 수 있다.
[00172]
도 4를 참조하여 설명된 예들 중 임의의 예에서, 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)가 중합 효소(28)에 의해 통합될 때 라벨(18D)이 효소(50A 및/또는 50D)의 근처에 있게 되도록 중합 효소(28)와 개개의 효소들(50A, 50D) 사이의 거리 및 링킹 분자(16, 16')의 길이가 선택될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 이는 산 또는 염기 생성 반응에 대한 예측 가능한 효과들을 가능하게 한다.
[00173]
감지 시스템(10D)
[00174]
구체적으로 도 5를 참조하면, 감지 시스템(10D)은 pH 센서(20) 및 pH 센서(20)의 전도성 채널(26)에 부착된 복합체(30C)를 포함한다.
[00175]
복합체(30C)는 pH 센서(20)에 노출된 유체의 2차 기질(34)의 소비로부터 전도성 채널(26) 근처 내에서 pH 변화를 생성할 금속 배위 복합체(“M”)에 링크된 중합 효소(28)를 포함한다. 복합체(30C)에서, 중합 효소(28) 대 금속 배위 복합체(M)의 비는 1:1이다. 금속 배위 복합체(M)는 중합 효소(28)에 직접 부착될 수 있거나, 또는 테더는 이들 둘 모두를 함께 링크할 수 있다.
[00176]
복합체(30C)의 중합 효소(28)는 도 2를 참조하여 설명된 중합 효소의 임의의 예일 수 있다.
[00177]
금속 배위 복합체(50E)는 2차 기질(34)과의 반응에서 산 또는 염기를 생성한다는 점에서 효소(50A)와 유사할 수 있다. 금속 배위 복합체의 예들은 비스(2-피리딜메틸)-아민 또는 피리딘 기능화된 시클로덱스트린과 같은 리간드들과의 구리(II) 복합체들을 포함한다.
[00178]
복합체(30C)에서, 중합 효소(28) 및 금속 배위 복합체(50E)는 함께 접합된다. 복합체(30C)는 스파이태그-스파이캐처 커플링 반응, π-클램프 매개된 시스테인 접합, 비오틴/스트렙타비딘, SUMO(작은 유비퀴틴-형 변형 인자) 단백질, His6/NTA와 금속의 킬레이트화, 시스테인/말레이미드, 디벤조사이클로옥틴(DBCO)/아지드, 또는 임의의 다른 적합한 접합 방법과 같은 임의의 수의 접합 방법들을 사용하여 형성될 수 있다.
[00179]
복합체(30C)는 전도성 채널(26)에 부착될 수 있다. 도 5에 도시된 예에서, 금속 배위 복합체(50E)는 채널(26)의 표면에 부착되고, 중합 효소(28)는 금속 배위 복합체(50E)에 부착된다. 이러한 예에서, 복합체(30C)의 부착은 테더(32)(도 5에 도시안됨) 또는 금속 배위 복합체(50E)의 말단 기를 통해 이루어질 수 있다. 다른 예에서, 중합 효소(28)는 채널(26)의 표면에 부착되고, 금속 배위 복합체(50E)는 중합 효소(28)에 부착된다. 이러한 예에서, 복합체(30C)의 부착은 중합 효소(28)에 부착된 테더(32)(도 5에 도시안됨)를 통해 이루어질 수 있다.
[00180]
도시되지는 않았지만, 감지 시스템(10D)은 또한 pH 감지 채널(26)의 표면에서 또는 이 표면 근처에서 발생하는 pH 변화에 대응하는 전압 및/또는 전류 변화들을 검출하기 위한 검출기를 포함할 수 있다.
[00181]
또한 도시되지는 않았지만, 감지 시스템(10D)은 실리콘 칩과 같은 지지체 상에 포지셔닝될 수 있다. 전극들(22, 24)은 전자 회로에 연결될 수 있으며, 전자 회로는 (예컨대, 일단 검출기 및 파워 서플라이에 접속되면) 전극들의 동작을 인에이블한다.
[00182]
일부 예들에서, 센서(10D)는 사전-조립될 수 있다.
[00183]
다른 예들에서, 센서 컴포넌트들은 키트의 일부일 수 있고, 키트 컴포넌트들은 센서(10D)를 조립하는 데 사용될 수 있다. 키트의 예는 지지체상의 pH 센서(20), 및 복합체(30C)를 pH 센서(20)에 도입하는 데 사용되는 유체를 포함한다. 유체는 액체 캐리어와 복합체(30C)를 포함한다. 일례에서, 액체 캐리어는 물이거나, 또는 밀리-몰 농도들의 염류 구연산염과 같은 저 완충액의 예이다.
[00184]
키트의 이들 예들을 사용할 때, 사용자는 지지체 상에 유체를 증착시킬 수 있으며, 테더(32) 또는 금속 배위 복합체(50E)의 말단 단부가 전도성 채널(26)에 복합체(30C)를 부착시키는데 적합한 시간 동안 유체가 지지체상에 유지될 수 있게 할 수 있다. 지지체는 임의의 비-결합 복합체들(30C)을 제거하기 위해 적합한 완충제로 린스될 수 있다.
[00185]
키트의 일부 예들은 또한 단분자 감지 동안 감지 시스템(10D)과 함께 사용될 유체(들)를 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 유체(들)는 본원에 개시된 액체 캐리어, 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C) 및 2차 기질(34)(이는 이들 예들에서 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)와는 별도의 분자임)의 임의의 예를 포함한다.
[00186]
라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)에 부착된 라벨(18E)은 금속 배위 복합체(50E)의 금속에 대한 리간드일 수 있으며, 여기서 리간드는 금속 배위 복합체(50E)의 촉매 특성을 변경한다. 리간드는 금속 배위 복합체(50E)의 동력학을 강화시키거나 또는 금속 배위 복합체(50E)의 동력학을 감속시키기 위해 선택될 수 있다. 이들 예들에서, 라벨(18E)은 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)에 부착된 pH 변경 모이어티의 일례이다. 따라서, 시스템(10D)의 이러한 예는 pH 변경 모이어티(예컨대, 금속 배위 복합체(50E) 및 라벨(18E))의 2개의 상이한 예들을 포함한다.
[00187]
라벨(18E)의 다른 예들은 2차 기질(34)의 소비를 위한 (금속 배위 복합체(50E)에 부가하여) 별도의 촉매로서 작용을 할 수 있다. 별도의 촉매들로서 작용을 하는 라벨들(18E)의 예들은 디아자비시클로운데센, N-헤테로시클릭 카르벤들, 테트라메틸구아니딘 등과 같은 비-금속 유기 촉매들을 포함한다. 이들 예들에서, 라벨(18E)은 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)에 부착된 pH 변경 모이어티의 일례이다. 따라서, 시스템(10D)의 이러한 예는 pH 변경 모이어티(예컨대, 금속 배위 복합체(50E) 및 라벨(18E))의 2개의 상이한 예들을 포함한다.
[00188]
라벨(18E)의 또 다른 예들은 금속 배위 복합체(50E)의 동역학을 감속시키며, 따라서 금속 배위 복합체(50E) 및 2차 기질(34)을 수반하는 산 또는 염기 생성 반응의 동역학을 또한 감속시킨다. 금속 배위 복합체(50E)의 동역학을 감속시키는 라벨들(18E)의 예들은 금속의 촉매 활성을 억제하는 임의의 리간드 또는 금속의 촉매 활성을 변화시키기 위해 금속의 전자 상태를 변경하는 임의의 리간드일 수 있다. 이들 예들에서, 라벨(18E)은 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)에 부착된 pH 변경 모이어티의 일례이다. 따라서, 시스템(10D)의 이러한 예는 pH 변경 모이어티(예컨대, 금속 배위 복합체(50E) 및 라벨(18E))의 2개의 상이한 예들을 포함한다.
[00189]
예에서, 상이한 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)(예컨대, A, T, C, G)에 부착된 개개의 라벨들(18E)은 상이한 레이트들로 산 또는 염기 생성을 증가 또는 감소시키기 위해 선택될 수 있다. 이러한 예에서, 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C) 중 하나가 중합 효소(28)에 의해 통합될 때, 라벨(18E)은 금속 배위 복합체(50E) 및 2차 기질(34)의 근처 내에 있게 되며, 고유한 라벨-의존성 레이트로 반응을 강화시키거나 감속시킨다. 차례로, 전도성 채널(26)의 pH가 변경된다. pH의 변화는 증가 또는 감소된 산 또는 염기 생성과 상관되며, 따라서 통합된 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)를 식별하는 데 사용될 수 있다.
[00190]
라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)이 2차 기질(34)을 포함하지 않기 때문에, 도 5의 예에 표현된 유체(들)는 또한 2차 기질(34)을 포함한다. 2차 기질(34)은 금속 배위 복합체(50E)와 반응하여 산 또는 염기를 생성할 수 있는 임의의 2차 기질(34)일 수 있다.
[00191]
다음 설명은 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 및 감지 시스템(10D)을 수반하는 예시적인 방법에 관한 것이다. 이러한 예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 및 2차 기질(34)과 함께 또는 이들과 별도로 생물학적으로 안정한 용액과 같은 유체로 감지 시스템(10D)에 도입될 수 있다. 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)과 연관되어 사슬(44)이 제자리에 유지된다. 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드의 상보적인 염기는 중합 효소(28)에 의해 (주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 따라 형성되는) 발생기의 스트랜드(46)에 통합될 것이다. 통합 이벤트 동안, 라벨링된 뉴클레오티드(12)의 라벨(18E)은 채널(26), 금속 배위 복합체(50E), 및 금속 배위 복합체(50E)의 근처 내에 또한 있는 유체의 임의의 2차 기질(34)의 근처에 있게 된다. 일부 예들에서, 2차 기질(34)과의 산 또는 염기 생성 반응은 리간드 라벨(18E) 및 금속 배위 복합체(50E)를 수반하는 반응에 대한 효과에 따라 강화, 감속 또는 억제될 수 있다. 다른 예들에서, 라벨(18E)은 금속 배위 복합체(50E)와 함께 2차 기질(34)의 소비에 참여하여, 더 많은 산 또는 염기를 생성할 수 있다. 이들 예들 모두는 채널(26) 표면에서 유체의 pH와 전하를 변경한다. 이들 예시적인 방법들에서, 뉴클레오티드 염기를 발생기의 스트랜드(46)에 통합한 이후에, 알파 인산염과 링킹 분자(16) 사이 또는 알파 인산염과 베타 인산염 사이의 결합이 자연적으로 절단된다. 이들 예들에서, 리간드 라벨(18E)의 결합은 인산염 사슬이 자연적으로 절단될 때 떨어지기에 충분히 약한 것이 바람직할 수 있다. 이러한 자연적 절단은 라벨(18E)(및 링킹 분자(16))이 통합된 뉴클레오티드 염기로부터 해리되고 감지 시스템(10D)으로부터 멀리 확산되는 것을 가능하게 한다. 이후, 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)의 다음 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 염기를 포함하는 다른 라벨링된 뉴클레오티드(12)를 수용할 수 있다.
[00192]
다음 설명은 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 및 감지 시스템(10D)을 수반하는 예시적인 방법에 관한 것이다. 이러한 예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 및 2차 기질(34)과 함께 또는 이들과 별도로 생물학적으로 안정한 용액과 같은 유체로 감지 시스템(10D)에 도입될 수 있다. 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)과 연관되어 사슬(44)이 제자리에 유지된다. 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드의 상보적인 염기는 중합 효소(28)에 의해 (주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 따라 형성되는) 발생기의 스트랜드(46)에 통합될 것이다. 일부 예들에서, 2차 기질(34)과의 산 또는 염기 생성 반응은 리간드 라벨(18E) 및 금속 배위 복합체(50E)를 수반하는 반응에 대한 효과에 따라 강화, 감속 또는 억제될 수 있다. 다른 예들에서, 라벨(18E)은 금속 배위 복합체(50E)와 함께 2차 기질(34)의 소비에 참여하여, 더 많은 산 또는 염기를 생성할 수 있다. 이들 예들 모두는 채널(26) 표면에서 유체의 pH와 전하를 변경한다. 이러한 예에서, 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)는 가역적 종결 부위를 포함한다. 따라서, 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)의 통합은 중합을 위한 종결 부위 역할을 한다. 이는 강화, 감속 또는 억제되는 산 또는 염기 생성 및 전하 검출이 앞서 설명된 것과 유사한 방식으로 발생하는 것을 가능하게 한다. 이러한 예시적인 방법에서는 탈차단제에 의한 노출 및 세정이 다른 서열화 사이클 동안 감지 시스템(10D)을 준비하기 위해 사용될 수 있다.
[00193]
도 5를 참조하여 설명된 예들 중 임의의 예에서, 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)가 중합 효소(28)에 의해 통합될 때 라벨(18E)이 금속 배위 복합체(50E) 근처에 있게 되도록 중합 효소(28)와 금속 배위 복합체(50E) 사이의 거리 및 링킹 분자(16, 16')의 길이가 선택될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 이는 산 또는 염기 생성 반응에 대한 예측 가능한 효과들을 가능하게 한다.
[00194]
감지 시스템(10E)
[00195]
구체적으로, 도 6a 및 도 6b를 참조하면, 감지 시스템(10D)은 pH 센서(20) 및 pH 센서(20)의 전도성 채널(26)에 부착된 복합체(30D)를 포함한다.
[00196]
복합체(30D)는 효소(50A)에 링크된 중합 효소(28)를 포함한다. 이러한 예에서, 복합체(30D)는 효소(50A)에 부착된 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58)를 추가로 포함한다.
[00197]
복합체(30D)의 중합 효소(28)는 도 2를 참조하여 설명된 중합 효소의 임의의 예들일 수 있다.
[00198]
효소(50A)는 도 3a 및도 3b를 참조하여 설명된 효소의 임의의 예일 수 있다.
[00199]
핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58)는 상보적이고 분자 내 염기쌍을 거쳐 쌍이없는 루프로 끝나는 이중 나선을 형성하는 2개의 구역들을 갖는 단일 스트랜드 DNA 또는 RNA를 포함한다. 쌍이없는 루프의 한쪽 끝은 효소(50A)에 부착되고, 쌍이없는 루프의 다른 쪽 끝은 효소 억제제(60)를 포함한다. 도 6a에 도시된 바와 같은 루프형 구성에 있을 때, 효소 억제제(60)는 적어도 효소 활성을 감소시킨다.
[00200]
복합체(30D)에서, 효소(50A) 및 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58)가 함께 접합되고, 효소(50A)는 또한 중합 효소(28)에 접합된다.
[00201]
복합체(30D)는 테더(32)를 통해 전도성 채널(26)에 부착될 수 있으며, 이의 예들은 도 2를 참조하여 설명된다. 대안적으로, 복합체(30D)는 pH 변경 모이어티(50A)와 전도성 채널(26)의 표면에 있는 그룹들 사이의 결합을 통해 직접 부착될 수 있다.
[00202]
도시되지는 않았지만, 감지 시스템(10E)은 또한 pH 감지 채널(26)의 표면에서 또는 이 표면 근처에서 발생하는 pH 변화에 대응하는 전압 및/또는 전류 변화들을 검출하기 위한 검출기를 포함할 수 있다.
[00203]
또한 도시되지는 않았지만, 감지 시스템(10E)은 실리콘 칩과 같은 지지체 상에 포지셔닝될 수 있다. 전극들(22, 24)은 전자 회로에 연결될 수 있으며, 전자 회로는 (예컨대, 일단 검출기 및 파워 서플라이에 접속되면) 전극들의 동작을 인에이블한다.
[00204]
일부 예들에서, 센서(10E)는 사전-조립될 수 있다.
[00205]
다른 예들에서, 센서 컴포넌트들은 키트의 일부일 수 있고, 키트 컴포넌트들은 센서(10E)를 조립하는 데 사용될 수 있다. 키트의 예는 지지체상의 pH 센서(20), 및 복합체(30D)를 pH 센서(20)에 도입하는 데 사용되는 유체를 포함한다. 유체는 액체 캐리어와 복합체(30D)를 포함한다. 일부 예들에서, 유체 내의 복합체(30D)는 테더(32)에 부착된다. 다른 예들에서, 테더(32)는 감지 시스템(10E)의 일부로서 pH 감지 채널(26)에 부착된다. pH 변경 모이어티(50A)와 채널(26)의 표면 그룹들 사이에 형성된 직접 결합이 존재하는 또 다른 예들에서, 유체 내의 복합체(30D)가 테더(32)에 부착되지 않고 테더(32)가 pH 감지 채널(26)에 부착되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 일례에서, 액체 캐리어는 물이거나, 또는 밀리-몰 농도들의 염류 구연산염과 같은 저 완충액의 예이다.
[00206]
키트의 이러한 예들을 사용할 때, 사용자는 지지체상에 유체를 증착시킬 수 있으며, 테더(32)가 전도성 채널(26)에 복합체(30D)를 부착하고, 복합체(30D)가 채널(26)상의 테더(32)에 부착되며 또는 pH 변경 모이어티(50A)가 채널(26)의 표면 그룹들에 결합되는데 적합한 시간 동안 유체가 지지체상에 유지될 수 있게 할 수 있다. 지지체는 임의의 비-결합 복합체들(30D)을 제거하기 위해 적합한 완충제로 린스될 수 있다.
[00207]
키트의 일부 예들은 또한 단분자 감지 동안 감지 시스템(10E)과 함께 사용될 유체(들)를 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 유체(들)는 본원에 개시된 액체 캐리어, 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C) 및 2차 기질(34)(이는 이들 예들에서 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)와는 별도의 분자임)의 임의의 예를 포함한다.
[00208]
라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)에 부착된 라벨(18F)은 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58)의 뉴클레오티드 염기들 중 적어도 일부에 상보적인 염기들을 포함하는 뉴클레오티드들의 스트랜드이다. 라벨(18F)은 헤어핀 개방 반응을 개시한 다음, 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58)의 단일 DNA 또는 RNA 스트랜드의 일부와 염기-쌍을 개시할 수 있다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 라벨(18F)의 도입 및 반응은 효소 억제제(60)를 효소(50A)로부터 멀리 이동시키고, 이에 따라 효소 활성을 가능하게 한다. 라벨(18F)이 산 또는 염기 생성으로 이어지는 효소 활성에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이는 또한 pH 변경 모이어티의 일례이다. 2차 기질(34)과의 산 또는 염기 생성 반응은 라벨(18F)이 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58)를 개방할 때 일어나서, 전도성 채널(26)의 표면에서 pH의 변화를 초래할 수 있다. 헤어핀의 개방 및 폐쇄는 고속 프로세스일 수 있으며, 그 결과 중합 효소(28)의 평균 억제 레벨을 초래할 수 있다. 따라서, 상이한 활성 또는 억제 레벨들이 상이한 수의 상보적 염기들을 사용하여 달성되어 염기 식별을 가능하게 할 수 있다.
[00209]
라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C)이 2차 기질(34)을 포함하지 않기 때문에, 도 6a 및 도 6b의 예에 표현된 유체(들)는 또한 2차 기질(34)을 포함한다. 2차 기질(34)은 효소(50A)와 반응하여 산 또는 염기를 생성할 수 있는 임의의 2차 기질(34)일 수 있다.
[00210]
다음 설명은 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 및 감지 시스템(10E)을 수반하는 예시적인 방법에 관한 것이다. 이러한 예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 및 2차 기질(34)과 함께 또는 이들과 별도로 생물학적으로 안정한 용액과 같은 유체로 감지 시스템(10E)에 도입될 수 있다. 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)과 연관되어 사슬(44)이 제자리에 유지된다. 라벨링된 뉴클레오티드들(12) 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드의 상보적인 염기는 중합 효소(28)에 의해 (주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 따라 형성되는) 발생기의 스트랜드(46)에 통합될 것이다. 통합 이벤트 동안, 라벨링된 뉴클레오티드(12)의 라벨(18F)은 채널(26), 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58) 및 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58) 근처에 또한 있는 유체의 임의의 2차 기질(34) 근처에 있게 된다. 라벨(18F)은 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58)를 개방하며, 이는 효소(50A)가 2차 기질(34)과 반응하여 산 또는 염기를 생성할 수 있게 한다. 이는 채널(26) 표면에서 유체의 pH와 전하를 변경한다. 이러한 예시적인 방법에서, 뉴클레오티드 염기를 발생기의 스트랜드(46)에 통합한 이후에, 알파 인산염과 링킹 분자(16) 사이 또는 알파 인산염과 베타 인산염 사이의 결합이 자연적으로 절단된다. 이러한 예들에서, 리간드 라벨(18F)의 결합은 인산염 사슬이 자연적으로 절단될 때 떨어질 정도로 약한 것이 바람직할 수 있다. 이러한 자연적 절단은 라벨(18F)(및 링킹 분자(16))이 통합된 뉴클레오티드 염기로부터 해리되고 감지 시스템(10E)으로부터 멀리 확산되는 것을 가능하게 한다. 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58)는 스템 루프 포지션으로 복귀하여 다시 효소(50A) 활성을 적어도 부분적으로 억제한다. 이후, 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)의 다음 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 염기를 포함하는 다른 라벨링된 뉴클레오티드(12)를 수용할 수 있다.
[00211]
다음 설명은 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 및 감지 시스템(10E)을 수반하는 예시적인 방법에 관한 것이다. 이러한 예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)은 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 및 2차 기질(34)과 함께 또는 이들과 별도로 생물학적으로 안정한 용액과 같은 유체로 감지 시스템(10C)에 도입될 수 있다. 중합 효소(28)는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)과 연관되어 사슬(44)이 제자리에 유지된다. 라벨링된 뉴클레오티드들(12A-12C) 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드의 상보적인 염기는 중합 효소(28)에 의해 (주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)을 따라 형성되는) 발생기의 스트랜드(46)에 통합될 것이다. 라벨(18F)은 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58)를 개방하며, 이는 효소(50A)가 2차 기질(34)과 반응하여 산 또는 염기를 생성할 수 있게 한다. 이는 채널(26) 표면에서 유체의 pH와 전하를 변경한다. 이러한 예에서, 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)는 가역적 종결 부위를 포함한다. 따라서, 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)의 통합은 중합을 위한 종결 부위 역할을 한다. 이는 산 또는 염기 생성 및 전하 검출이 위에서 설명된 것과 유사한 방식으로 일어나는 것을 가능하게 한다. 이러한 예시적인 방법에서는 탈차단제에 의한 노출 및 세정이 다른 서열화 사이클 동안 감지 시스템(10E)을 준비하기 위해 사용될 수 있다.
[00212]
도 6a 및 도 6b를 참조하여 설명된 예들 중 임의의 예에서, 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)가 중합 효소(28)에 의해 통합될 때 라벨(18F)이 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58) 근처에 있게 되도록 중합 효소(28)와 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58) 사이의 거리 및 링킹 분자(16, 16')의 길이가 선택될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 이는 산 또는 염기 생성 반응에 대한 예측 가능한 효과들을 가능하게 한다.
[00213]
감지 시스템 어레이들
[00214]
단분자 감지 시스템들(10A-10E)의 임의의 예는 이러한 감지 시스템의 어레이에 포함될 수 있다. 일부 예들에서, 어레이는 여러 감지 시스템들(10A-10E)을 포함할 수 있으며, 이 감지 시스템들 각각은 지지체 상에 포지셔닝되며, 개별적으로 어드레싱가능하고 판독가능하도록 전자 회로로 구성된다. 일례에서, 어레이의 각각의 감지 시스템(10A-10E)은 개별 함몰부에서 지지체상에 포지셔닝될 수 있다. 함몰부들은 감지 시스템들(10A-10E) 각각을 물리적으로 분리하고, 이는 적어도 인접한 감지 시스템들(10A-10E)에 대한 pH 구배들의 교차-오염을 감소시킨다. 감지 시스템들(10A-10E)의 어레이는 유동 셀(62)의 일부일 수 있으며, 이의 예는 7a에 도시되어 있다. 이러한 예에서, 유동 셀(62)은 유동 채널들(64)을 포함한다. 여러 개의 유동 채널들(64)이 도시되어 있지만, 임의의 수의 채널들(64)(예컨대, 단일 채널(64), 4개의 채널들(64) 등)이 유동 셀(62)에 포함될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 각각의 유동 채널(64)은 2개의 결합된 컴포넌트들(예컨대, 기질과 덮개 또는 2개의 기질들) 사이에 정의된 영역이며, 이는 그에 도입되고 그로부터 제거되는 유체들(예컨대, 본원에서 설명된 유체들)을 가질 수 있다. 각각의 유동 채널(64)은 임의의 특정 유동 채널(64)로 도입된 유체가 임의의 인접한 유동 채널(64)내로 유동하지 않도록 각각의 다른 유동 채널(64)로부터 격리될 수 있다. 유동 채널들(64) 내에 도입된 유체들의 일부 예들은 반응 컴포넌트들(예컨대, 복합체들(30A-30D), 라벨링된 뉴클레오티드들(12, 12A-12C, 12' 등)), 세정 용액들, 탈차단제들 등을 도입할 수 있다.
[00215]
유동 셀(62)의 유동 채널들(64) 내의 구조의 예가 도 7b에 도시된다.
[00216]
도 7b에 도시된 예에서, 유동 셀(64)은 지지체(66) 및 지지체(66) 상에 포지셔닝된 패턴화된 재료(68)를 포함한다. 패턴화된 재료(68)는 간극 구역(72)에 의해 분리된 함몰부들(70)을 정의한다. 이러한 예에서, 지지체(66)의 표면은 함몰부들(70) 각각에서 노출되고, 감지 시스템(10A-10E)이 표면에 포지셔닝된다.
[00217]
도 7b의 지지체(66)는 유동 셀(62)의 다른 컴포넌트들에 대한 지지체를 제공한다. 지지체(66)는 일반적으로 강체이며, 수용성 액체에 불용성이다. 적합한 지지체들(66)의 예들은 에폭시 실록산, 유리, 개질 유리, 플라스틱들, 나일론, 세라믹/세라믹 산화물들, 실리카 (실리콘 산화물(SiO2)), 용융 실리카, 실리카-계 재료들, 알루미늄 실리케이트, 실리콘, 개질 실리콘(예컨대, 붕소 도핑된 p+ 실리콘), 실리콘 질화물 (Si3N4), 탄탈륨 5산화물(TaO5) 또는 다른 탄탈륨 산화물(들)(TaOx), 하프늄 산화물(HfO2), 무기 유리들 등을 포함한다. 기질(14)에 적합한 플라스틱들의 일부 예들은 아크릴화, 폴리스티렌, 스티렌 및 다른 재료들의 공중합체들, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄들, 폴리테트라플루오로에틸렌(이를테면, Chemours의 TEFLON®), 사이클릭 올레핀들/사이클로-올레핀 중합체들(COP)(이를테면, Zeon의 ZEONOR®), 폴리이미드들 등을 포함한다. 지지체는 또한 표면에 탄탈륨 산화물 또는 다른 세라믹 산화물의 코팅층을 갖는 유리 또는 실리콘일 수 있다.
[00218]
지지체(66)의 형태는 웨이퍼, 패널, 직사각형 시트, 다이 또는 임의의 다른 적합한 구성일 수 있다. 일례에서, 지지체(66)는 약 2mm 내지 약 300mm 범위의 직경을 갖는 원형 웨이퍼 또는 패널일 수 있다. 보다 특정한 예로서, 지지체(66)는 약 200mm 내지 약 300mm 범위의 직경을 갖는 웨이퍼이다. 또 다른 예에서, 지지체(66)는 최대 약 10 피트(~ 3 미터)의 가장 큰 치수를 갖는 직사각형 시트 또는 패널일 수 있다. 특정 예로서, 지지체(66)는 약 0.1mm 내지 약 10mm 범위의 폭을 갖는 다이이다. 예시적인 치수들이 제공되었지만, 임의의 적합한 치수들을 갖는 지지체(66)가 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[00219]
도 7b에 도시된 예에서, 패턴화된 재료(68)는 지지체(66) 상에 포지셔닝된다. 함몰부들(70) 및 간극 구역들(72)을 형성하기 위해 선택적으로 증착되거나 증착 및 패턴화될 수 있는 임의의 재료가 패턴화된 재료(68)에 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[00220]
일례로서, 무기 산화물은 진공 증착, 에어로졸 인쇄 또는 잉크젯 인쇄를 통해 지지체(66)에 선택적으로 적용될 수 있다. 적합한 무기 산화물들의 예들은 탄탈륨 산화물(예컨대, Ta2O5), 알루미늄 산화물(예컨대, Al2O3), 실리콘 산화물(예컨대, SiO2), 하프늄 산화물(예컨대, HfO2) 등을 포함한다.
[00221]
다른 예로서, 수지는 지지체(66)에 적용된 후 패턴화될 수 있다. 적합한 증착 기술들은 화학 기상 증착, 딥 코팅, 덩크 코팅, 스핀 코팅, 스프레이 코팅, 퍼들 디스펜싱, 초음파 스프레이 코팅, 닥터 블레이드 코팅, 에어로졸 인쇄, 스크린 인쇄, 미세접촉 인쇄 등을 포함한다. 적합한 패터닝 기술들은 포토리소그래피, 나노임프린트 리소그래피(NIL), 스탬핑 기술들, 엠보싱 기술들, 몰딩 기술들, 마이크로에칭 기술들, 인쇄 기술들 등을 포함한다. 적합한 수지들의 일부 예들은 POSS(polyhedral oligomeric silsesquioxane)-계 수지, 비-POSS 에폭시 수지, 폴리(에틸렌 글리콜) 수지, 폴리에테르 수지(예컨대, 개환 에폭시들), 아크릴 수지, 아크릴레이트 수지, 메타크릴레이트 수지, 비정질 플루오로중합체 수지(예컨대, Bellex의 CYTOP®), 및 이들의 조합들을 포함한다.
[00222]
본원에 사용된 "POSS(polyhedral oligomeric silsesquioxane)"은 실리카(SiO2)와 실리콘(R2SiO) 화학 조성물 사이의 혼성 중간체(예컨대, RSiO1.5)인 화학 조성물을 지칭한다. POSS의 예는 “Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86(2009), pp. 776-778”에 설명된 것일 수 있으며, 이는 그 전체가 인용에 의해 통합된다. 일례에서, 조성물은 화학식 [RSiO3/2]n을 갖는 유기실리콘 화합물이며, 여기서 R 기들은 동일하거나 상이할 수 있다. POSS에 대한 예시적인 R 기들은 에폭시, 아지드/아지도, 티올, 폴리(에틸렌 글리콜), 노르보르넨, 테트라진, 아크릴레이트들 및/또는 메타크릴레이트들, 또는 추가로, 예컨대, 알킬, 아릴, 알콕시 및/또는 할로알킬 기들을 포함한다. 본원에 개시된 수지 조성물은 단량체 단위로서 하나 이상의 상이한 케이지 또는 코어 구조들을 포함할 수 있다.
[00223]
또 다른 예로서, 패턴화된 재료(68)는 pH 완충 재료일 수 있다. pH 완충 재료는 높은 pH 완충 용량을 가지며, 이는 낮은 용액 완충 농도를 갖는 유체의 사용을 가능하게 한다. 높은 pH 완충 용량의 예는 약 0.01 meq/g 내지 약 2 meq/g 범위일 수 있다. pH 완충 재료의 예는 표면적이 높고 완충 용량이 높은 SiCOH이다. 패턴화된 재료(68)가 pH 완충 재료가 아닌 예들에서, 함몰부들(70)의 측벽들은 함몰부들(70) 각각에 높은 pH 완충 용량을 부여하기 위해 pH 완충 재료로 코팅될 수 있다.
[00224]
도 7b에 도시된 바와 같이, 패턴화된 재료(68)는 내부에 정의된 함몰부들(70) 및 인접 함몰부들(70)을 분리하는 간극 구역들(72)을 포함한다. 규칙적, 반복적 및 비-규칙적 패턴들을 포함하는 함몰부들(70)의 많은 상이한 레이아웃들이 예상될 수 있다. 일례에서, 함몰부들(70)은 밀착 패킹 및 개선된 밀도를 위해 6각형 그리드로 배치된다. 다른 레이아웃들은 예컨대 직선(직사각형) 레이아웃들, 삼각형 레이아웃들 등을 포함할 수 있다. 일부 예들에서, 레이아웃 또는 패턴은 행들 및 열들에 있는 함몰부들(70)의 x-y 포맷일 수 있다. 일부 다른 예들에서, 레이아웃 또는 패턴은 함몰부들(70) 및/또는 간극 구역들(72)의 반복 배열일 수 있다. 또 다른 예들에서, 레이아웃 또는 패턴은 함몰부들(70) 및/또는 간극 구역들(72)의 랜덤 배열일 수 있다. 패턴은 스폿들, 패드들, 우물들, 기둥들, 스트라이프들, 소용돌이들, 선들, 삼각형들, 직사각형들, 원들, 호들, 체크들, 격자 무늬들, 대각선들, 화살표들, 정사각형들 및/또는 크로스-해치들을 포함할 수 있다.
[00225]
함몰부들(70)의 레이아웃 또는 패턴은 정의된 영역에서 함몰부들(70)의 밀도(함몰부들(70)의 수)와 관련하여 특징지워질 수 있다. 예컨대, 함몰부들(70)은 mm2당 약 2 백만개의 밀도로 존재할 수 있다. 밀도는 예컨대 mm2 당 약 100개, mm2 당 약 1,000개, mm2 당 약 1십만개, mm2당 약 1백만개, mm2당 약 2백만개, mm2당 약 5백만개, mm2당 약 1천만개, mm2당 약 5천만개, 또는 그 초과 또는 그 미만의 밀도를 포함하는 상이한 밀도들로 튜닝될 수 있다. 패터닝된 재료(68)의 함몰부들(70)의 밀도가 앞의 범위들로부터 선택된 하위 값들 중 하나 내지 상위 값들 중 하나일 수 있다는 것이 추가로 이해되어야 한다. 예들로서, 고밀도 어레이는 약 100nm 미만으로 분리된 함몰부들(70)을 갖는 것으로 특징지워질 수 있고, 중간 밀도 어레이는 약 400nm 내지 약 1㎛로 분리된 함몰부들(20)을 갖는 것으로 특징지워질 수 있으며, 저밀도 어레이는 약 1 ㎛ 초과로 분리된 함몰부들(70)을 갖는 것으로 특징지워질 수 있다. 예시적인 밀도들이 제공되었지만, 임의의 적합한 밀도들이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 함몰부들(70)의 밀도는 함몰부들(70)의 깊이 및 생성된 산 또는 염기의 확산 능력에 부분적으로 의존할 수 있다. 일부 경우들에서, 함몰부들 사이의 간격은 본원에서 리스트된 예들보다 훨씬 더 큰 것이 바람직할 수 있다.
[00226]
함몰부들(70)의 레이아웃 또는 패턴은 대안적으로 또는 부가적으로 평균 피치, 함몰부(70)의 중심으로부터 인접한 함몰부(70)의 중심까지의 간격(중심-대-중심 간격) 또는 하나의 함몰부(70)의 에지로부터 인접한 함몰부(70)의 에지까지의 간격(에지-대-에지 간격) 측면에서 특징지워질 수 있다. 패턴은 약 평균 피치의 변동 계수가 작도록 규칙적일 수 있거나, 또는 패턴은 비-규칙적일 수 있으며, 이 경우에 변동 계수가 상대적으로 클 수 있다. 어떤 경우든지, 평균 피치는 예컨대 약 50nm, 약 0.1μm, 약 0.5μm, 약 1μm, 약 5μm, 약 10μm, 약 100μm 또는 그 초과 또는 그 미만일 수 있다. 함몰부들(20)의 특정 패턴에 대한 평균 피치는 앞의 범위들로부터 선택된 하위 값들 중 하나 내지 상위 값들 중 하나일 수 있다. 일례에서, 함몰부들(20)은 약 1.5㎛의 피치(중심-대-중심 간격)를 갖는다. 예시적인 평균 피치 값들이 제공되었지만, 다른 평균 피치 값들이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[00227]
각각의 함몰부(70)의 크기는 함몰부(70)의 부피, 개방 면적, 깊이 및/또는 직경에 의해 특징지워질 수 있다.
[00228]
각각의 함몰부(70)는 유체를 한정할 수 있는 임의의 부피를 가질 수 있다. 최소 또는 최대 부피는 예컨대 스루풋(예컨대, 멀티플렉시티), 분해능, 라벨링된 뉴클레오티드들(12, 12A-12C 또는 12'), 2차 기질들(34) 또는 유동 셀(62)의 다운스트림 사용에서 예상되는 분석물 반응성을 수용하기 위해 선택될 수 있다. 예컨대, 부피는 적어도 약 1×10-3 μm3, 적어도 약 1×10-2 μm3, 적어도 약 0.1 μm3, 적어도 약 1 μm3, 적어도 약 10 μm3, 적어도 약 100 μm3, 또는 그 초과일 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 부피는 최대 약 1×104 μm3, 최대 약 1×103 μm3, 최대 약 100 μm3, 최대 약 10 μm3, 최대 약 1 μm3, 최대 약 0.1 μm3, 또는 그 미만일 수 있다. 각각의 함몰부 개구부가 차지하는 면적은 부피에 대해 위에서 설명된 것들과 유사한 기준들에 기초하여 선택될 수 있다. 예컨대, 각각의 함몰부 개구부에 대한 면적은 적어도 약 1×10-3 μm2, 적어도 약 1×10-2 μm2, 적어도 약 0.1 μm2, 적어도 약 1 μm2, 적어도 약 10 μm2, 적어도 약 100 μm2, 또는 그 초과일 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 면적은 최대 약 1×103 μm2, 최대 약 100 μm2, 최대 약 10 μm2, 최대 약 1 μm2, 최대 약 0.1 μm2, 최대 약 1×10-2 μm2, 또는 그 미만일 수 있다. 각각의 함몰부 개구부가 차지하는 면적은 위에 특정된 값들보다 크거나 또는 작거나 또는 이들 값들 사이에 있을 수 있다.
[00229]
각각의 함몰부(70)의 깊이는 하나의 감지 시스템(10A-10E)을 하우징하기 충분히 클 수 있다. 일례에서, 깊이는 적어도 약 1 μm, 적어도 약 10 μm, 적어도 약 100 μm, 또는 그 초과일 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 깊이는 최대 약 1×103 μm, 최대 약 100 μm, 최대 약 10 μm, 또는 그 미만일 수 있다. 각각의 함몰부(70)의 깊이는 위에 특정된 값들보다 크거나 또는 작거나 또는 이들 값들 사이에 있을 수 있다.
[00230]
일부 경우들에서, 각각의 함몰부(70)의 직경 또는 길이 및 폭은 적어도 약 50nm, 적어도 약 0.1μm, 적어도 약 약 0.5μm, 적어도 약 1μm, 적어도 약 10μm, 적어도 약 100μm 또는 그 초과일 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 직경 또는 깊이 및 폭은 최대 약 1×103 μm, 최대 약 100 μm, 최대 약 10 μm, 최대 약 1 μm, 최대 약 0.5 μm, 최대 약 0.1 μm, 또는 그 미만(예컨대, 약 50 nm)일 수 있다. 각각의 함몰부(70)의 직경, 또는 길이 및 폭은 위에 특정된 값들보다 크거나 또는 작거나 또는 이들 값들 사이에 있을 수 있다.
[00231]
도 7b에 도시된 바와 같이, 어레이의 함몰부들(70)의 각각은 개개의 센서(10A-10E)를 포함한다. 각각의 함몰부(70)의 각각의 센서(10A-10E)가 그에 부착된 복합체(30A-30D)의 일부로서 또는 단독으로 하나의 중합 효소(28)를 가지는 것이 바람직하다. 일부 예들에서, 각각의 함몰부(70)의 각각의 센서(10A-10E)에는 하나의 중합 효소(28) 또는 복합체(30A-30D)가 부착되어 있다. 다른 예들에서, 일부 함몰부들(70)의 일부 센서들(10A-10E)에는 하나의 중합 효소(28) 또는 복합체(30A-30D)가 부착되어 있으며; 다른 함몰부들(70)의 다른 센서들(10A-10E)에는 하나 초과의 중합 효소(28) 또는 복합체(30A-30D)가 부착되어 있으며; 다른 함몰부들(70)의 또 다른 센서들(10A-10E)에는 중합 효소(28) 또는 복합체(30A-30D)가 부착되어 있지 않다. 이들 예들에서, 임의의 주어진 감지 시스템(10A-10E)에 부착되는 중합 효소(들)(28) 또는 복합체(들)(30A-30D)의 수는 랜덤하고 푸아송 분포에 의해 결정될 수 있다.
[00232]
중합 효소들(28) 또는 복합체들(30A-30D)을 부착하기 위해, 방법은 복수의 개별적으로 어드레싱가능한 전도성 채널들(26)을 포함하는 센서 어레이에 유체를 도입시키는 단계 ― 그로 인해 복수의 개별적으로 어드레싱가능한 전도성 채널들(26) 중 적어도 일부에 중합 효소(28) 또는 복합체(30A-30D)를 부착함 ― 를 포함하고, 복합체(30A-30D)는 중합 효소(28) 및 중합 효소(28)에 링크된 pH 변경 모이어티(50A-50E)의 상이한 예들을 포함하고, pH 변경 모이어티(50A-50E)는 센서 어레이에 노출될 용액 내의 2차 기질(34)의 소비를 촉진시킬 효소(50A), 센서 어레이에 노출될 용액 내의 2차 기질(34)의 소비를 촉진시킬 금속 배위 복합체(50E), 및 센서 어레이에 도입될 라벨링된 뉴클레오티드에 부착된 촉매 라벨의 보조 인자(50B) 또는 활성화제(50C)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 유체는 중합 효소들(28) 또는 복합체들(30A-30D)이 부착될 수 있도록 바람직한 시간 동안 그리고 바람직한 온도에서 배양하도록 허용될 수 있다.
[00233]
단분자 감지를 위해 본원에 개시된 방법들 중 임의의 예들 동안, 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C 또는 12') 중 하나는 개개의 중합 효소(28)에 의해 함몰부들(70) 각각의 감지 시스템(10A-10E)에서 형성되는 발생기의 스트랜드(46)로 통합된다. 다시 말해서, 유동 셀(62)을 가로지르는 각각의 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)에서, 개개의 중합 효소들(28)은 도입된 유체에 존재하는 뉴클레오티드들(12, 12A-12C 또는 12') 중 하나에 의해 발생기의 스트랜드(46)를 연장시킨다.
[00234]
센서들(10A-10E) 각각은 개별적으로 전기적으로 어드레싱 가능하고 판독가능하다. 따라서, 2차 기질(34)의 소비에 대한 응답으로 각각의 함몰부(70) 내에서 발생하는 pH 변화들로 인해 발생하는 전하 신호들은 통합된 라벨링된 뉴클레오티드(12, 12A-12C 또는 12')를 식별하기 위해 개별적으로 검출되고 분석될 수 있다. 각각의 함몰부 내에서 발생하는 산 또는 염기 생성 반응은 라벨(18A-18F) 및 사용되는 중합 효소(28) 또는 복합체(30A-30D) 조합에 의존할 것이며, 이의 예들은 도 3a 및 도 3b, 도 4, 도 5, 및 도 6a 및 도 6b를 참조로 하여 설명된다.
[00235]
앙상블 검출
[00236]
감지 시스템들(40A 및 40B)의 다른 예들이 도 7c 및 도 7d에 도시되고, 이들 감지 시스템들(40A 및 40B)은 앙상블 감지에 사용될 수 있다. 이들 예들에서, 감지 시스템들(40A 및 40B)은 유동 셀(62)의 함몰부들(70)의 각각에 포지셔닝될 수 있다. 유동 셀(62)은 채널들(64), 지지체(66), 패턴화된 재료(68) 및 본원에서 설명되는 바와같은 패턴화된 재료(68)를 포함한다.
[00237]
도 7c에 도시된 예에서, 감지 시스템(40A)은 pH 센서(20), 및 pH 센서(20)의 전도성 채널(26)에 그리고/또는 각각의 함몰부(70)에 노출된 지지체(66)의 표면에 부착된 프라이머들(74)을 포함한다.
[00238]
함몰부들(70)에 노출된 지지체(66)의 표면은 프라이머들(74)이 패턴화된 재료(68)의 간극 구역들(72)에 부착되는 것이 아니라 표면에 부착될 수 있도록 기능화될 수 있다. 일부 예들에서, 지지 표면을 기능화하는 것은 함몰부들(70)에서 노출된 표면을 실란화하는 것 및 실란화된 표면상에 중합체 층을 형성하는 것을 수반한다. 실란화는 임의의 실란 또는 실란 유도체를 사용하여 수행될 수 있다. 이후, 중합체(도시안됨)는 실란화된 표면에 적용될 수 있다. 중합체는 액체들 및 기체들이 투과할 수 있는 반-강체 중합체 재료일 수 있다. 중합체의 예는 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴 아미드, PAZAM 또는 다른 적합한 중합체 하이드로겔과 같은 아크릴아미드 공중 합체를 포함한다.
[00239]
프라이머들(74)은 전도성 채널(26)의 표면에 그리고/또는 지지체(66)의 표면에 부착될 수 있는 작용기를 포함하는 임의의 순방향 증폭 프라이머 또는 역방향 증폭 프라이머일 수 있다. 적합한 작용기 종결 프라이머들의 예들은 알킨 종결 프라이머, 테트라진 종결 프라이머, 아지도 종결 프라이머, 아미노 종결 프라이머, 에폭시 또는 글리시딜 종결 프라이머, 티오포스페이트 종결 프라이머, 티올 종결 프라이머, 알데히드 종결 프라이머, 히드라진 종결 프라이머 및 트리아졸린디온 종결 프라이머를 포함한다. 프라이머들의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 적합한 프라이머들의 특정 예들은 Illumina Inc.에 의해 판매하는 일부 상업적 유동 셀들의 표면상에서 사용되는 P5 및/또는 P7 프라이머들을 포함한다.
[00240]
일례에서, 프라이머들(74)은 그래프팅 프로세스, 이를테면 (예컨대, 유동 셀(62)에 덮개가 결합되어 있을 때) 유동 스루 증착, 덩크 코팅, 스프레이 코팅, 퍼들 디스펜싱을 사용하여, 또는 프라이머(들)(74)를 부착할 다른 적합한 방법에 의해 부착될 수 있다. 이들 예시적인 기술들 각각은 프라이머(들), 물, 완충제(예컨대, 소금 용액) 및 촉매를 포함할 수 있는 프라이머 용액 또는 혼합물을 활용할 수 있다.
[00241]
도 7d에 도시된 예에서, 감지 시스템(40B)은 평면 전도성 채널(26') 및 평면 전도성 채널(26')에 부착된 프라이머들(74)을 포함한다. 평면 전도성 채널(26')은 하전 이온들을 감지할 수 있거나 또는 본원에 개시된 산 또는 염기 생성 반응들 동안 생성된 하전 이온들에 의해 양성자화 또는 탈양성자화될 수 있는 표면 그룹들을 포함하는 임의의 재료일 수 있다. 평면형 전도성 채널(26')은 지지체(66)에 통합될 수 있고 전자 회로에 연결될 수 있는 전극들(22, 24)(도 7d에 도시되지 않음)에 연결되며, 전자 회로는 이들 전극들의 동작을 인에이블한다. 프라이머들(74) 중 임의의 것이 본원에서 설명되는 바와같이 사용되고 부착될 수 있다. 더욱이, 평면 전도성 채널(26')이 프라이머(74)를 부착할 수 있는 표면 그룹들을 갖는 경우, 평면 전도성 채널(26')의 추가 기능화가 수행되지 않을 수 있다.
[00242]
유동 셀(62)의 이들 예들은 앙상블 서열화를 위해 사용될 수 있다. 앙상블 서열화에서, 서열화될 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)(도 7c 및 도 7d에 도시되지 않음)은 프라이머들(74)을 사용하여 유동 셀 표면상에 형성될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드 사슬 형성의 시초에, 라이브러리 주형들은 임의의 핵산 샘플(예컨대, DNA 샘플 또는 RNA 샘플)로부터 준비될 수 있다. 핵산 샘플은 단일-스트랜드 유사 크기(예컨대, 1000 bp 미만의 크기) DNA 또는 RNA 단편들로 분해될 수 있다. 준비 동안, 어댑터들이 이들 단편들의 끝에 추가될 수 있다. 감소된 사이클 증폭을 통해, 함몰부들(70)의 프라이머들(74)에 상보적인 서열화 결합 부위들, 인덱스들 및 구역들과 같은 상이한 모티프들이 어댑터들에 도입될 수 있다. 최종 라이브러리 주형들은 양쪽 끝들에서 DNA 또는 RNA 단편 및 어댑터들을 포함한다. 일부 예들에서, 단일 핵산 샘플로부터의 단편들에는 동일한 어댑터들이 추가되어 있다.
[00243]
복수의 라이브러리 주형들은 유동 셀(62)에 도입될 수 있다. 유동 셀(62)이 함몰부들(70)의 어레이를 포함하기 때문에, 다수의 라이브러리 주형들은 예컨대 내부에 고정된 2개의 타입들의 프라이머들(74) 중 하나에 혼성된다.
[00244]
이후, 클러스터 생성이 수행될 수 있다. 클러스터 생성의 일례에서, 라이브러리 주형들은 고-충실도 DNA 중합 효소를 사용하여 3'확장에 의해 혼성된 프라이머들(74)로부터 복사된다. 원래의 라이브러리 주형들이 변성되어, 복사본들이 함몰부들(70)에 고정된 채 유지된다. 등온 브리지 증폭은 고정된 복사본들을 증폭하는 데 사용될 수 있다. 예컨대, 복사된 주형들은 인접한 상보적인 프라이머(74)에 혼성하기 위해 루프 오버하고, 중합 효소는 복사된 주형들을 복사하여, 2개의 단일 스트랜드된 스트랜드들을 형성하기 위해 변성되는 이중 스트랜드 브리지들을 형성한다. 이들 2개의 스트랜드들은 인접한 상보적인 프라이머들(74)을 루프 오버하여 이들에 혼성하고, 2개의 새로운 이중 스트랜드 루프들을 형성하기 위해 다시 연장된다. 프로세스는 밀도가 높은 클론 클러스터들을 생성하기 위해 등온 변성 및 증폭의 사이클들에 의해 각각의 주형 복사본에 대해 반복된다. 이중 스트랜드 브리지들의 각각의 클러스터는 변성된다. 일례에서, 역방향 스트랜드는 특정 염기 절단에 의해 제거되어, 순방향 주형 폴리뉴클레오티드 스트랜드들을 남긴다. 클러스터링은 각각의 함몰부(70)에서 여러 주형 폴리뉴클레오티드 사슬들(44)을 형성한다. 클러스터링의 이러한 예는 브리지 증폭이며, 수행될 수 있는 증폭의 일례이다. 배제 증폭(Examp) 워크플로우(Illumina Inc.)와 같은 다른 증폭 기술들이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[00245]
서열화를 개시하기 위해, 통합 혼합물이 유동 셀(62)에 추가될 수 있다.
[00246]
일례에서, 통합 혼합물은 액체 캐리어, 본원에 개시된 복합체(30A-30D)의 임의의 예, 및 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)의 임의의 예를 포함한다. 복합체(30A-30D)는 중합 효소(28) 및 중합 효소(28)에 링크된 pH 변경 모이어티(50A-50E)를 포함하며, pH 변경 모이어티(50A-50E)는 2차 기질(34)의 소비를 촉매할 효소(50A), 2차 기질(34)의 소비를 촉매할 금속 배위 복합체(50D), 및 2차 기질(34)의 소비를 촉매할 보조 인자(50B) 또는 활성화제(50C)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 라벨링된 뉴클레오티드(12)는 뉴클레오티드(14); 뉴클레오티드(14)의 말단 인산기에 부착된 링킹 분자(16); 및 링킹 분자(16)에 부착된 라벨(18)을 포함하며, 여기서 라벨은 2차 기질(34)을 수반하는 pH 변경 반응에 참여하는 것이다. 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)는 3'OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드(14'); 뉴클레오티드(14')의 염기 또는 당에 부착된 절단 가능한 링킹 분자(16'); 및 링킹 분자(16')에 부착된 라벨(18)을 포함하며, 여기서 라벨(18)은 2차 기질(34)을 수반하는 pH 변경 반응에 참여한다.
[00247]
라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)의 라벨(18)은 사용되는 복합체(30A-30D)에 의존할 것이며, 도 3a 및 도 3b, 도 4, 도 5, 및 도 6a 및 도 6b를 참조로 하여 설명되는 바와같은 조합들 및 연관된 산 또는 염기 생성 반응들이 사용될 수 있다. 일례로서, 복합체(30A)의 pH 변경 모이어티가 효소(50A)일 때, 라벨(18B)이 사용되며, 효소(50A)의 동역학을 강화하는 제1 그룹 및 효소(50A)의 동역학을 감속시키는 제2 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 예로서, pH 변경 모이어티는 금속 배위 복합체(50E)이고, 라벨(18E)이 사용될 수 있다. 도 5를 참조하여 본원에서 논의된 바와 같이, 라벨(18E)은 금속 배위 복합체(50E)의 금속에 대한 리간드이고, 여기서 리간드는 금속 배위 복합체(50E)의 촉매 특성을 변경한다. 또 다른 예로서, pH 변경 모이어티는 보조 인자(50B) 또는 활성화제(50C)이고, 라벨(18C)은 보조 인자(50B) 또는 활성화제(50C)에 의해 활성화되는 촉매 라벨이다. 또 다른 예로서, pH 변경 모이어티는 효소(50A)이고, 복합체(30D)는 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58)를 포함한다. 라벨(18F)은 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체(58)의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열이다.
[00248]
통합 혼합물은 복합체(30A-30D) 및 라벨링된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)를 유동 셀(62)에 도입한다. 통합 혼합물은 또한 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)상의 상보적 서열에 혼성하는 서열화 프라이머를 포함할 수 있다. 이러한 서열화 프라이머는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)이 서열화할 준비가 되게 한다.
[00249]
다른 유체는 2차 기질(34)을 유동 셀(62)에 도입하는데 사용될 수 있다. 보조 기질(34)을 포함하는 유체 및 통합 혼합물은 키트의 일부일 수 있다. 유동 셀(62)의 어느 예(도 7c 및도 7d에 도시됨)도 키트에 포함될 수 있다.
[00250]
통합 혼합물이 라벨링된 뉴클레오티드(12)(이의 라벨(18)은 통합후 자연적으로 절단됨)를 포함할 때, 2차 기질(34)을 갖는 유체 및 통합 혼합물이 동시에 또는 연이어 유동 셀(62)내로 유동되어 2차 기질(34)이 통합 이벤트 동안 유동 셀(62)에 존재할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 라벨(18)이 통합 이후에 자연적으로 절단되기 때문에, 라벨(18)이 전도성 채널(26 또는 26') 근처 내에 유지되는 동안 2차 기질(34)이 존재하는 것이 바람직하다. 대조적으로, 통합 혼합물이 (차단기를 포함하고 따라서 그 라벨(18)이 자연적으로 절단되지 않는) 라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)를 포함할 때, 2차 기질(34)을 갖는 유체 및 통합 혼합물이 동시에 또는 연이어 유동 셀(62)내로 도입될 수 있거나 또는 2차 기질(34)을 갖는 유체는 통합이 발생한 이후에 도입될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 탈차단제들이 도입될 때까지 라벨(18)이 테더링된 상태를 유지하기 때문에, 제2 기질(34)은 통합 이벤트 동안 또는 그 이후에 언제든지 도입될 수 있다.
[00251]
2차 기질(34)을 갖는 유체 및 통합 혼합물이 유동 셀(62)내에 도입될 때, 유체들은 함몰부들(70)(여기에 주형 폴리뉴클레오티드 사슬들(44)이 존재함)로 진입한다. 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C) 중 하나는, 개개의 복합체(30A-30D)의 개개의 중합 효소(28)에 의해, 서열화 프라이머를 연장하고 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)에 상보적인 발생기의 스트랜드(46)로 통합된다. 다시 말해서, 유동 셀(62)을 가로지르는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬들(44) 중 적어도 일부에서, 개개의 중합 효소들(28)은 용액에서 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C) 중 하나에 의해, 혼성된 서열 프라이머를 연장한다.
[00252]
이러한 예들에서, 중합 효소(28)가 pH 변경 모이어티(50A-50E)를 포함하는 복합체(30A-30D)의 일부이기 때문에 그리고 중합 효소(28)가 뉴클레오티드 통합에 참여하기 때문에, pH 변경 모이어티(50A-50E)는 통합 이벤트 동안 전도성 채널(26 또는 26')의 근처 내에 있게 된다. 통합된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)의 라벨(18)은 또한 pH 변경 모이어티(50A-50E) 및 전도성 채널(26, 26') 근처 내에 있게 된다. 이는 pH 변경 모이어티(50A-50E) 및 라벨(18)이 전도성 채널(26, 26') 근처의 2차 기질(34)과의 산 또는 염기 생성 반응에 참여할 수 있게 한다. 특정 모이어티(50A-50E) 및 라벨(18) 조합들의 다양한 반응들 및 효과들은 도 3a 및 도 3b, 도 4, 도 5, 및 도 6a 및 도 6b 참조하여 설명된 것과 동일하다. 산 또는 염기 생성 반응의 결과로써 pH의 변화는 전도성 채널(26, 26')에서 전하를 변경하고, 전하의 변화가 검출된다. 전하의 변화 및/또는 전하 변화의 레이트는 통합된 뉴클레오티드들을 식별하는 데 사용될 수 있다. 다수의 통합 이벤트들이 단일 함몰부 내에서 다수의 프라이머들(74)에서 발생하기 때문에, 전하 신호들은 강하고, 각각의 개별 전도성 채널(26, 26')에서 쉽게 검출될 수 있다.
[00253]
라벨링된 뉴클레오티드(12)를 포함하는 앙상블 서열화의 예들에서, 라벨(18) 및 링킹 분자(16)는 통합 후 자연적으로 절단된다.
[00254]
라벨링된 뉴클레오티드(12A-12C)를 포함하는 앙상블 서열화의 예들에서, 라벨(18) 및 링킹 분자(16')는 탈차단제가 유동 셀(62)을 통해 추가 및 세정될 때까지 통합된 채 유지된다.
[00255]
앙상블 서열화의 일부 예들에서, 복합체(30A-30D)의 중합 효소(28)는 고도로 진화할 수 있으며, 따라서 각각의 서열화 사이클과 함께 도입될 필요가 없을 수 있다. 다른 예들에서, (예컨대, 복합체(30A-30D)의 일부로서) 새로운 중합 효소(28)가 각각의 서열화 상이클과 함께 도입될 수 있다.
[00256]
도 7c 및 도 7d를 참조하여 설명된 바와 같은 유동 셀(62)을 사용하는 앙상블 서열화의 또 다른 예에서, 통합 혼합물은 복합체(30A-30D)의 예를 포함하지 않을 수 있지만, 자체적으로 중합 효소(28)를 포함할 수 있다. 이러한 예는 중합 효소(28)가 통합 혼합물에 존재하고 전도성 채널(26, 26')의 표면에 테더링되지 않는다는 점을 제외하고는 도 2에 설명된 예와 유사하다. 통합 혼합물의 이러한 예들은 라벨(18A)을 포함하는 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C), 중합 효소(28) 및 캐리어 액체를 포함할 수 있으며; 라벨(18A)은 도 2를 참조하여 설명된 바와 같이, 2차 기질(34)을 수반하는 산 또는 염기 생성 반응을 개시하거나 가속하는 촉매이다. 캐리어 액체 및 2차 기질(34)을 포함하는 제2 유체가 통합 혼합물의 이러한 예와 함께 사용될 수 있다.
[00257]
2차 기질(34)을 갖는 유체 및 통합 혼합물의 이러한 예가 도 7b 및 도 7c에 도시된 유동 셀(62)의 예에 도입될 때, 유체들은 함몰부들(70)(여기서, 주형 폴리뉴클레오티드 사슬들(44)이 존재함)로 진입한다. 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C) 중 하나는, 개개의 중합 효소(28)에 의해, 서열화 프라이머를 연장하고 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(44)에 상보적인 발생기의 스트랜드(46)로 통합된다. 다시 말해서, 유동 셀(62)을 가로지르는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬들(44) 중 적어도 일부에서, 개개의 중합 효소들(28)은 용액에서 라벨링된 뉴클레오티드들(12 또는 12A-12C) 중 하나에 의해, 혼성된 서열 프라이머를 연장한다.
[00258]
이들 예들에서, 통합된 뉴클레오티드(12 또는 12A-12C)의 촉매 라벨(18A)은 전도성 채널(26, 26') 근처내에 있게 된다. 이는 촉매 라벨(18A)이 전도성 채널(26, 26') 근처의 2차 기질(34)과의 산 또는 염기 생성 반응에 참여하는 것을 가능하게 한다. 촉매 라벨(18A)의 다양한 반응들 및 효과들은 도 2를 참조하여 설명된 것과 동일하다. 산 또는 염기 생성 반응의 결과로써 pH의 변화는 전도성 채널(26, 26')에서 전하를 변경하고, 전하의 변화가 검출된다. 전하의 변화 및/또는 전하 변화의 레이트는 통합된 뉴클레오티드들을 식별하는 데 사용될 수 있다. 다수의 통합 이벤트들이 단일 함몰부 내에서 임의의 다수의 프라이머들(74)에서 발생하기 때문에, 전하 신호들은 강하고, 각각의 개별 전도성 채널(26, 26')에서 쉽게 검출될 수 있다.
[00259]
결론
[00260]
단분자 검출 및 앙상블 검출이 상세하게 설명되었지만, 본원에 개시된 산 또는 염기 생성 반응들은 유전형 분석을 위해 또는 다른 화학적 및/또는 생물학적 응용들에서 다른 서열화 프로토콜과 함께 활용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[00261]
전술한 개념들 및 아래에서 보다 상세히 논의되는 추가 개념들의 모든 조합들(이러한 개념들이 서로 모순되지 않는 경우에)이 본원에 개시된 발명의 요지의 일부인 것으로 고려된다는 것이 인식되어야 한다. 특히, 본 개시내용의 끝에 나타나는 청구된 요지의 모든 조합들은 본원에 개시된 발명의 요지의 일부인 것으로 고려된다. 또한, 인용에 의해 통합된 임의의 개시내용에서 또한 나타날 수 있는, 본원에서 명시적으로 사용되는 용어에는 본원에 개시된 특정 개념들과 가장 일치하는 의미가 부여되어야 한다는 것이 또한 인식되어야 한다.
[00262]
명세서 전반에 걸친 "일례", "다른 예", "예" 등의 언급은 그 예와 관련하여 설명된 특정 엘리먼트(예컨대, 특징, 구조 및/또는 특성)가 본원에서 설명된 적어도 하나의 예에 포함되며 다른 예들에서 제시되거나 또는 제시되지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 더욱이, 임의의 예에 대해 설명된 엘리먼트들은 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 다양한 예들에서 임의의 적합한 방식으로 결합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
[00263]
청구항들을 포함하여 본 개시내용 전반에 걸처 사용되는 “대략” 및 “약”이라는 용어들은 이를테면 프로세싱의 변화들로 인한 작은 변동들을 설명하고 감안하기 위해 사용된다. 예컨대, 이들 용어들은 ±5% 이하, 이를테면 ±2% 이하, 이를테면, ±1% 이하, 이를테면 ±0.5% 이하, 이를테면 ±0.2% 이하, 이를테면 ±0.1% 이하, 이를테면 ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다.
[00264]
또한, 본원에서 제공된 범위들은 그들이 명시적으로 언급된 것처럼 언급된 범위 및 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위를 포함한다는 것이 이해되어야 한다. 예컨대, 1nm 내지 1μm 미만으로 표현된 범위는 1nm 내지 1μm 미만의 명시적으로 언급된 제한치들 뿐만아니라 약 5nm, 222.5 nm, 275 nm 등과 같은 개별 값들 및 약 150 nm 내지 약 800 nm 등과 같은 하위 범위들을 포함하는 것을 해석되어야 한다.
[00265]
여러 예들이 상세하게 설명되었지만, 개시된 예들이 수정될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 전술한 설명은 비-제한적인 것으로 간주되어야 한다.
Claims (43)
- pH 센서 ― 상기 pH 센서는,
2개의 전극들, 및
상기 2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널을 포함함 ―; 및
상기 pH 센서의 전도성 채널에 부착된 복합체(complex)를 포함하고;
상기 복합체는 상기 pH 센서에 노출되는 유체 내의 2차 기질의 소비로부터 상기 전도성 채널 근처 내에서의 pH 변화를 생성하는 데 참여할 적어도 하나의 pH 변경 모이어티에 링크된 중합 효소를 포함하고, 상기 적어도 하나의 pH 변경 모이어티는 효소, 금속 배위 복합체, 보조 인자 및 활성화제로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 감지 시스템. - 제1 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 pH 변경 모이어티는 상기 효소이고, 그리고 상기 효소는 상기 2차 기질과 반응하여 산 또는 염기를 생성하는, 감지 시스템. - 제2 항에 있어서,
상기 효소는 가수 분해 효소들 및 산화 효소들로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 감지 시스템. - 제1 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 pH 변경 모이어티의 동역학은 상기 중합 효소의 동역학보다 적어도 10배 더 빠른, 감지 시스템. - 제1 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 pH 변경 모이어티는 상기 효소이고, 그리고 상기 복합체는 상기 효소에 부착된 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체를 더 포함하는, 감지 시스템. - 제1 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 pH 변경 모이어티는 상기 효소이고; 그리고
상기 복합체는 상기 중합 효소에 부착된 제2 효소를 더 포함하는, 감지 시스템. - 제1 항에 있어서,
상기 복합체는 융합 단백질 또는 단백질 키메라인, 감지 시스템. - 제1 항에 있어서,
상기 pH 센서의 전도성 채널은 반도체 나노구조, 그래핀 나노구조, 금속 나노구조 및 전도성 중합체 나노구조로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 감지 시스템. - 제1 항에 있어서,
간극 구역들에 의해 분리된 복수의 함몰부들을 포함하는 지지체 ― 상기 pH 센서의 적어도 전도성 채널은 상기 복수의 함몰부들 중 하나의 함몰부의 최하부에 있음 ―; 및
복수의 추가 pH 센서들을 더 포함하고, 상기 복수의 추가 pH 센서들 각각의 적어도 전도성 채널은 상기 복수의 함몰부들 개개의 함몰부의 최하부에 있는, 감지 시스템. - 제9 항에 있어서,
상기 복수의 함몰부들 각각은 측벽들을 포함하고, 그리고 상기 측벽들은 pH 완충 재료를 포함하는, 감지 시스템. - pH 센서 ― 상기 pH 센서는,
2개의 전극들, 및
상기 2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널을 포함함 ―; 및
유체를 포함하고;
상기 유체는,
액체 캐리어, 및
상기 액체 캐리어 내의 복합체를 포함하며;
상기 복합체는 상기 pH 센서에 노출되는 제2 유체 내의 2차 기질의 소비로부터 상기 전도성 채널 근처 내에서의 pH 변화를 생성할 적어도 하나의 효소에 링크된 중합 효소를 포함하는, 키트. - 제11 항에 있어서,
상기 제2 유체를 더 포함하고;
상기 제2 유체는,
제2 액체 캐리어, 및
라벨링된 뉴클레오티드를 포함하며;
상기 라벨링된 뉴클레오티드는,
뉴클레오티드,
상기 뉴클레오티드의 말단 인산기에 부착된 링킹 분자(linking molecule), 및
상기 링킹 분자에 부착된 라벨을 포함하며;
상기 라벨은 상기 효소의 동역학을 강화시키는 제1 그룹 및 상기 효소의 동역학을 감속시키는 제2 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 키트. - 제12 항에 있어서,
상기 2차 기질은 상기 제2 유체 내에 있고, 상기 라벨링된 뉴클레오티드와 별도의 분자이며; 그리고
상기 제1 그룹 또는 상기 제2 그룹은 상기 효소 및 상기 2차 기질을 수반하는 산 또는 염기 생성 반응의 동역학을 변경하는, 키트. - 제12 항에 있어서,
상기 2차 기질은 상기 제2 유체에 있으며, 상기 라벨링된 뉴클레오티드와 별도의 분자이며;
상기 라벨은 상기 효소의 동역학을 감속시키는 상기 제2 그룹이며; 그리고
상기 제2 그룹은 알로스테릭 억제제, 스테릭 배제 그룹 및 완충 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 키트. - 제12 항에 있어서,
상기 2차 기질은 상기 제2 유체에 있으며, 상기 라벨링된 뉴클레오티드와 별도의 분자이며;
상기 라벨은 상기 효소의 동역학을 강화시키는 상기 제1 그룹이며; 그리고
상기 제1 그룹은 상기 효소의 보조 인자인, 키트. - 제11 항에 있어서,
상기 제2 유체를 더 포함하고;
상기 제2 유체는,
제2 액체 캐리어, 및
라벨링된 뉴클레오티드를 포함하며;
상기 라벨링된 뉴클레오티드는,
뉴클레오티드, 및
상기 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 부착된 상기 2차 기질을 포함하고;
상기 2차 기질의 동역학은 상기 중합 효소의 동역학보다 적어도 더 10배 더 빠른, 키트. - pH 센서 ― 상기 pH 센서는,
2개의 전극들, 및
상기 2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널을 포함함 ―; 및
유체를 포함하고;
상기 유체는,
액체 캐리어, 및
상기 액체 캐리어 내의 복합체를 포함하며;
상기 복합체는 상기 pH 센서에 노출되는 제2 유체 내의 2차 기질의 소비로부터 상기 전도성 채널 근처 내에서의 pH 변화를 생성할 금속 배위 복합체에 링크된 중합 효소를 포함하는, 키트. - 제17 항에 있어서,
상기 제2 유체를 더 포함하고;
상기 제2 유체는,
제2 액체 캐리어,
상기 2차 기질 ― 상기 2차 기질은 상기 금속 배위 복합체와의 반응을 통해 산 또는 염기를 생성함 ―, 및
라벨링된 뉴클레오티드를 포함하고,
상기 라벨링된 뉴클레오티드는,
뉴클레오티드,
상기 뉴클레오티드의 말단 인산기에 부착된 링킹 분자, 및
상기 링킹 분자에 부착된 라벨을 포함하고;
상기 라벨은 상기 금속 배위 복합체의 금속에 대한 리간드이고, 그리고 상기 리간드는 상기 금속 배위 복합체의 촉매 특성을 변경하는, 키트. - 라벨링된 뉴클레오티드로서,
뉴클레오티드;
상기 뉴클레오티드의 말단 인산기에 부착된 링킹 분자; 및
상기 링킹 분자에 부착된 촉매 라벨을 포함하고, 상기 촉매 라벨은 상기 라벨링된 뉴클레오티드를 갖는 유체 내의 2차 기질의 소비로부터 pH 변화를 생성하는, 라벨링된 뉴클레오티드. - 제19 항에 있어서,
상기 촉매 라벨은 가수 분해 효소들 및 산화 효소들로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 라벨링된 뉴클레오티드. - 제19 항에 정의된 상기 라벨링된 뉴클레오티드, 및
감지 시스템을 포함하고;
상기 감지 시스템은,
2개의 전극들,
상기 2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널, 및
상기 전도성 채널에 부착된 복합체를 포함하고, 상기 복합체는 상기 라벨링된 뉴클레오티드의 촉매 라벨의 보조 인자 또는 활성화제에 접합된 중합 효소를 포함하는, 키트. - 라벨링된 뉴클레오티드로서,
3'OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드;
상기 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 부착된 절단가능 링킹 분자; 및
상기 절단가능 링킹 분자에 부착된 라벨을 포함하고, 상기 라벨은 2차 기질을 수반하는 pH 변경 반응에 참여하는, 라벨링된 뉴클레오티드. - 제22 항에 정의된 상기 라벨링된 뉴클레오티드, 및
감지 시스템을 포함하고;
상기 감지 시스템은,
2개의 전극들,
상기 2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널, 및
상기 전도성 채널에 부착된 복합체를 포함하고, 상기 복합체는 상기 라벨링된 뉴클레오티드의 촉매 라벨의 보조 인자 또는 활성화제에 접합된 중합 효소를 포함하는, 키트. - 복수의 개별적으로 어드레싱가능한 전도성 채널들을 포함하는 센서 어레이에 유체를 도입시키는 단계 ― 그로 인해 상기 복수의 개별적으로 어드레싱가능한 전도성 채널들 중 적어도 일부에 복합체를 부착함 ― 를 포함하고;
상기 복합체는,
중합 효소, 및
상기 중합 효소에 링크된 pH 변경 모이어티를 포함하고, 상기 pH 변경 모이어티는 상기 센서 어레이에 노출될 용액 내의 2차 기질의 소비를 촉진시킬 효소, 상기 센서 어레이에 노출될 상기 용액 내의 2차 기질의 소비를 촉진시킬 금속 배위 복합체, 및 상기 센서 어레이에 도입될 라벨링된 뉴클레오티드에 부착된 촉매 라벨의 보조 인자 또는 활성화제로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법. - 전도성 채널에 테더링된 중합 효소를 갖는 센서에 주형 폴리뉴클레오티드 사슬을 도입시키는 단계;
2차 기질 및 라벨링된 뉴클레오티드들을 포함하는 유체를 센서에 도입시키는 단계 ― 그로 인해 상기 라벨링된 뉴클레오티드들 중 하나의 뉴클레오티드는 상기 중합 효소와 연관되고, 상기 라벨링된 뉴클레오티드들 중 하나의 라벨링된 뉴클레오티드의 라벨은 상기 전도성 채널 근처 내에 있는 상기 2차 기질을 수반하는 pH 변경 반응에 참여함 ―; 및
상기 전도성 채널의 응답을 검출하는 단계를 포함하는, 방법. - 제25 항에 있어서,
상기 센서의 중합 효소는 효소 촉매를 갖는 복합체의 부분이고;
상기 라벨은 상기 효소 촉매의 동역학을 강화시키거나 감속시키는 그룹이며; 그리고
상기 방법은 베이스라인 전하와 비교하여 전하의 변화를 검출하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제25 항에 있어서,
상기 센서의 중합 효소는 효소 촉매를 갖는 복합체의 부분이고;
상기 라벨은 상기 2차 기질이고; 그리고
상기 방법은 베이스라인 전하와 비교하여 전하의 변화를 검출하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제25 항에 있어서,
상기 센서의 중합 효소는 금속 배위 복합체를 갖는 복합체의 부분이고,
상기 라벨은 상기 금속 배위 복합체의 금속에 대한 리간드이며, 그리고
상기 방법은 베이스라인 전하와 비교하여 전하의 변화를 검출하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제25 항에 있어서,
상기 센서의 중합 효소는 효소 촉매를 갖는 복합체의 부분이고,
상기 효소 촉매에 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체가 부착되고,
상기 라벨은 상기 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열이고, 그리고
상기 방법은 베이스라인 전하와 비교하여 전하의 변화를 검출하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제26 항 내지 제29 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전하의 변화 또는 상기 전하의 변화의 레이트로부터 상기 중합 효소와 연관된 뉴클레오티드를 식별하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제25 항에 있어서,
상기 라벨링된 뉴클레오티드들은 별개의 통합 레이트들을 갖고; 그리고
상기 방법은 상기 라벨링된 뉴클레오티드들의 별개의 통합 레이트에 의해 상기 연관된 라벨링된 뉴클레오티드를 식별하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 용액 내의 2차 기질의 소비를 촉진시킬 효소, 상기 용액 내의 2차 기질의 소비를 촉진시킬 금속 배위 복합체, 및 라벨링된 뉴클레오티드에 부착된 촉매 라벨의 보조 인자 또는 활성화제로 구성된 그룹으로부터 pH 변경 모이어티를 선택하는 단계;
복합체를 생성하기 위해 중합 효소를 상기 pH 변경 모이어티에 접합시키는 단계; 및
2개의 전극들에 동작가능하게 연결된 전도성 채널에 상기 복합체를 부착하는 단계를 포함하는, 방법. - 액체 캐리어;
복합체 ― 상기 복합체는 중합 효소, 및 상기 중합 효소에 링크된 pH 변경 모이어티를 포함하며, 상기 pH 변경 모이어티는 2차 기질의 소비를 촉진시킬 효소, 상기 2차 기질의 소비를 촉진시킬 금속 배위 복합체, 및 상기 2차 기질의 소비를 촉진시킬 보조 인자 또는 활성화제로 구성된 그룹으로부터 선택됨 ―; 및
라벨링된 뉴클레오티드를 포함하고;
상기 라벨링된 뉴클레오티드는,
뉴클레오티드,
상기 뉴클레오티드의 말단 인산기에 부착된 링킹 분자, 및
상기 링킹 분자에 부착된 라벨을 포함하고, 상기 라벨은 상기 2차 기질을 수반하는 pH 변경 반응에 참여하는, 통합 혼합물. - 제33 항에 있어서,
상기 pH 변경 모이어티는 상기 효소이고, 그리고 상기 라벨은 상기 효소의 동역학을 강화시키는 제1 그룹 및 상기 효소의 동역학을 감속시키는 제2 그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택되며;
상기 pH 변경 모이어티는 상기 금속 배위 복합체이고, 상기 라벨은 상기 금속 배위 복합체의 금속에 대한 리간드이며, 그리고 상기 리간드는 상기 금속 배위 복합체의 촉매 특성을 변경시키며; 또는
상기 pH 변경 모이어티는 상기 보조 인자 또는 상기 활성화제이고, 그리고 상기 라벨은 상기 보조 인자 또는 상기 활성화제에 의해 활성화되는 촉매 라벨인, 통합 혼합물. - 제33 항에 있어서,
상기 pH 변경 모이어티는 상기 효소이고,
상기 복합체는 상기 효소에 부착된 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체를 더 포함하고, 그리고
상기 라벨은 상기 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열인, 통합 혼합물. - 제33 항에서 정의된 상기 통합 혼합물; 및
제2 액체 캐리어 및 2차 기질을 포함하는 2차 기질 혼합물을 포함하는, 키트. - 제36 항에 있어서,
유동 셀을 더 포함하고;
상기 유동 셀은,
간극 구역들에 의해 분리된 복수의 함몰부들을 포함하는 기판,
상기 복수의 함몰부들 각각의 최하부에 있는 전도성 채널, 및
상기 함몰부들 각각에 접목된 적어도 하나의 프라이머를 포함하는, 키트. - 완충제를 포함하는 액체 캐리어;
복합체 ― 상기 복합체는 중합 효소, 및 상기 중합 효소에 링크된 pH 변경 모이어티를 포함하며, 상기 pH 변경 모이어티는 2차 기질의 소비를 촉진시킬 효소, 상기 2차 기질의 소비를 촉진시킬 금속 배위 복합체, 및 상기 2차 기질의 소비를 촉진시킬 보조 인자 또는 활성화제로 구성된 그룹으로부터 선택됨 ―; 및
라벨링된 뉴클레오티드를 포함하고;
상기 라벨링된 뉴클레오티드는,
3'OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드,
상기 뉴클레오티드의 염기 또는 당에 부착된 절단가능 링킹 분자, 및
상기 링킹 분자에 부착된 라벨을 포함하고, 상기 라벨은 상기 2차 기질을 수반하는 pH 변경 반응에 참여하는, 통합 혼합물. - 제38 항에 있어서,
상기 pH 변경 모이어티는 상기 효소이고, 그리고 상기 라벨은 상기 효소의 동역학을 강화시키는 제1 그룹, 상기 효소의 동역학을 감속시키는 제2 그룹, 및 상기 2차 기질로 구성된 그룹으로부터 선택되며; 또는
상기 pH 변경 모이어티는 상기 금속 배위 복합체이고, 상기 라벨은 상기 금속 배위 복합체의 금속에 대한 리간드이며, 그리고 상기 리간드는 상기 금속 배위 복합체의 촉매 특성을 변경시키며; 또는
상기 pH 변경 모이어티는 상기 보조 인자 또는 상기 활성화제이고, 그리고 상기 라벨은 상기 보조 인자 또는 상기 활성화제에 의해 활성화되는 촉매 라벨인, 통합 혼합물. - 제38 항에 있어서,
상기 pH 변경 모이어티는 상기 효소이고;
상기 복합체는 상기 효소에 부착된 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체를 더 포함하고; 그리고
상기 라벨은 상기 핵산 헤어핀-효소 억제제 접합체의 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열인, 통합 혼합물. - 제38 항에서 정의된 상기 통합 혼합물; 및
제2 액체 캐리어 및 상기 2차 기질을 포함하는 2차 기질 혼합물을 포함하는, 키트. - 제41 항에 있어서,
유동 셀을 더 포함하고;
상기 유동 셀은,
간극 구역들에 의해 분리된 복수의 함몰부들을 포함하는 기판,
상기 복수의 함몰부들 각각의 최하부에 있는 전도성 채널, 및
상기 함몰부들 각각에 접목된 프라이머를 포함하는, 키트. - 제41 항에 있어서,
탈차단제 용액(de-blocking agent solution)을 더 포함하는, 키트.
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