JP2019503485A - 分子センサーおよび関連方法 - Google Patents

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Abstract

単一分子を検出するように構成された電子センサーならびにそれを使用および製造する方法が開示される。センサーは、センサーギャップによって離れて配置されたソース電極およびドレイン電極；ゲート電極を含み、ここで、ソース電極、ドレイン電極およびゲート電極が協同して、電極回路を形成し；そして、センサーギャップにわたり架橋を形成し、ソース電極およびドレイン電極を接続する架橋分子；および架橋分子にカップリングされたプローブを含み、ここで、プローブと核酸との相互作用は、電極回路のパラメーターをモニターすることによって検出可能である。様々な例において、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１月１４日に出願された“ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＥ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＲＩＤＧＥＳ ＦＯＲ ＮＡＮＯＳＣＡＬＥ ＤＥＶＩＣＥＳ”と題する米国仮特許出願番号第６２／２７８，８８９号；２０１６年１月１４日に出願された“ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＥ ＯＦ ＢＥＡＤＳ ＯＮ Ａ ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ ＦＯＲ ＮＡＮＯＳＣＡＬＥ ＤＥＶＩＣＥＳ”と題する米国仮特許出願番号第６２／２７８，９００号；および２０１６年１月１４日に出願された“ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＵＳＩＮＧ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＳ ＳＥＮＳＯＲＳと題する米国仮特許出願番号第６２／２７８，９０７号に基づく優先権を主張しており、これら仮特許出願の開示は、参考として本明細書中に援用される。
分野
本開示は、電子センサーデバイスに関する。特に、本開示は、測定回路中に１つまたは複数の生体分子構成要素を含み、核酸シーケンシングに使用することができる電子センサーデバイスに関する。
分子スケールで特性を測定することには、求められる感度、および多くの可能性のあるノイズソースの存在のために多数の課題がある。したがって、この目的のためにセンサーを説明する際、全ての測定エラーソースについて明らかにすることが有用である。一般的に、測定され得るあらゆるシステムまたは対象物に関して、測定された状態であるｍは、実際のシステム状態であるａの近似にしかならないこととなる。これは、例えばセンサーの操作、読み出しプロセス、またはシグナル解釈に起因するエラーを反映する不完全なシグナル解釈などのいくつかの要因のいずれかによる可能性があり、一部のケースにおいてセンサーをシステムに接触させることが、システムの状態を撹乱する場合があることが原因の可能性もある。測定された状態であるｍが実際の状態であるａと異なることは、センサー、読み出し、および解釈の組合せの測定エラーを反映する。理想的には、センサーシステムは、この測定エラーをできる限り小さくするように構築されることになる。
分子スケールで状態を測定するために、例えばＤＮＡ分子をシーケンシングするケースにおいて、センサーデバイスが好ましくは単一分子のスケールで目的の分子と接触する「プローブ」を有するが、一方でセンサーデバイスを製造するまたはそれらをシグナル変換システムへと統合する目的のために、センサーデバイスの他の特徴はより大きいナノまたはマイクロスケールであるセンサーシステムを作り出すことに、様々な努力が向けられてきた。
特に、バイオセンサーは、生物学的な認識成分をシグナル変換システムへと機能的に統合して、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質などの生物学的に関連した分子の特性を測定する分析デバイスである。この集積は、生物学的な事象の検出可能な電気シグナルへの迅速で便利な変換を提供する。これまでに考案された様々な電気的バイオセンシング構成のなかでも、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）に基づくシステムが、標的分子（例えば、生体分子）とＦＥＴ表面との相互作用を検出可能な電気シグナルに直接転換できることから有望であると考えられる。典型的なＦＥＴデバイスにおいて、電流は、２つの電極（ソースおよびドレインとも称される）に接続されているチャネルに沿って流れる。ソースとドレインとの間のチャネルコンダクタンスは、薄い誘電性絶縁層を介してチャネルにカップリングされている第３の電極（ゲートとも称される）によって変調することができる。ＦＥＴは、様々な商業的な用途のために、標的化学物質を検出して化学物質の濃度を測定するのに使用することができる。従来の広く使用されている例は、水素イオン濃度を測定するのに使用されるＦＥＴベースのｐＨセンサーである。これは１９７０年代にＢｅｒｇｖｅｌｄによって導入され、ソリッドステートのｐＨセンサーで使用されている。イオン感度ＦＥＴ（ＩＳＦＥＴ）デバイスの一般的な分野は、他の化学物質濃度測定に関しても、その概念に基づいて拡張している。
現在のＦＥＴ型バイオセンサーシステムの限界は、それらの感度である。現在のバイオセンサーシステムは、単一分子の検出および識別を実行することができない。同様にそれらは、単一分子反応の動力学をモニターすることができない。ＦＥＴ型バイオセンサーのこれらの感度の限界のために、重要な生化学アッセイ、例えば単一分子シーケンシング反応などにおける検出器としてのそれらの使用が妨げられる。
ＦＥＴバイオセンサーの感度を向上させる一部の努力は、電極間にチャネルを形成するための、カーボンナノ構造、例えばカーボンナノチューブなどの使用に焦点を当ててきた。しかしながら、カーボンナノ構造は、バイオセンサーの機能化に関して様々な障害をもたらす。特に、機能的なまたは感知するプローブ分子を付着させる目的で、特異的な望ましい、原子の位置に付着部位を操作することはできない。加えて、カーボンナノ構造の合成の精度、制御、およびスケールにおける現在の限界は、個々のセンサーの感度と信頼できる生産、センサーの高密度の拡張可能なアレイの確立、およびセンサー製造の商業的な実現性に関してさらなる課題をもたらす。現在のカーボンナノチューブ合成方法は、典型的には長さが約１００ｎｍまたはそれより長いスケールで構造を生産するが、感度およびマルチセンサープラットフォームにおけるセンサー密度に関して、スケールが限界をもたらす可能性が高い。
したがって、感度および精度の増加、信頼できるエイジニアリングに適合し、マルチセンサープラットフォーム上でのセンサー密度の増加を達成するための効率的で商業的に実現性のある製造方法にさらに適合する構成を有する分子スケール電子バイオセンサーデバイスが望ましい。同様に、このようなセンサーデバイスを製造する向上した方法も望ましい。
（要旨）
本開示は、一般的に、センサー、センサーを含むシステム、ならびにセンサーおよびシステムを形成するおよび使用する方法に関する。例示的なセンサーは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のオリゴヌクレオチドなどの分子をシーケンシングするのに使用することができる。以下で本開示の様々な実施形態が従来技術のセンサーの欠点に取り組む方法をより詳細に論じるが、本開示は、一般的に、製造が比較的簡単で廉価なセンサーを提供する。
本開示の様々な実施形態において、センサーは、ソース電極；センサーギャップによってソース電極から離れて配置されたドレイン電極；ゲート電極であって、ソース電極、ドレイン電極およびゲート電極が協同して、電極回路を形成している、ゲート電極；および前記センサーギャップにわたり架橋形成し、ソース電極およびドレイン電極を接続する架橋分子；および架橋分子にカップリングされたプローブを含み、プローブと核酸との相互作用は、電極回路の少なくとも１つのパラメーターをモニターすることによって検出可能（detectible）である。様々な例において、核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのバリアントを含む。
様々な実施形態において、センサーのプローブは、例えばＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、エキソヌクレアーゼ、またはヘリカーゼなどの酵素を含む。一部のケースにおいて、プローブは、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｐｈｉ２９、ＰｏｌＩ、またはそれらの突然変異体などを含んでいてもよい。
様々な実施形態において、架橋分子は、抗体、二本鎖ＤＮＡまたはタンパク質アルファヘリックスを含んでいてもよい。例えば、抗体は、ＩｇＧ抗体、例えば、ソースもしくはドレイン電極上の少なくとも１つの接触ポイントを認識するＩｇＧ抗体、またはソース電極およびドレイン電極上の接触ポイントを認識するＩｇＧ抗体を含んでいてもよい。他の架橋分子としては、核酸二重鎖、例えば、ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッド二重鎖、ＰＮＡ−ＰＮＡ二重鎖、またはＤＮＡ−ＬＮＡハイブリッド二重鎖などを挙げることができる。
本開示の種々の実施形態によれば、センサーは、第１の電極にカップリングされた第１の接触部、第２の電極にカップリングされた第２の接触部、前記第１の接触部および前記第１の電極のうち１つと前記第２の接触部および前記第２の電極のうち１つとの間に画定されたセンサーギャップ、および、第１の端部と第２の端部とを含む架橋分子を含み、前記架橋分子は、前記第１の端部で前記第１の接触部にカップリングされており、前記第２の端部で前記第２の接触部にカップリングされている。これらの実施形態の様々な態様によれば、架橋分子は、バイオポリマーであるか、または架橋分子は、化学的に合成される。追加の態様によれば、センサーは、第３のまたはゲート電極を含む。これらのケースにおいて、ゲート電極は、センサーデバイスを調整するおよび／または活性化するのに使用することができる。さらなる態様によれば、センサーギャップは、約５ｎｍから約３０ｎｍの間のセンサーギャップ寸法を有する。追加の態様によれば、第１の端部または架橋分子は、第１の自己アセンブルアンカーを含み、さらなる態様によれば、第２の端部は、第２の自己アセンブルアンカーを含む。例示的な架橋分子は、以下の特性：架橋分子は、直鎖状（例えば、直鎖状バイオポリマー）であり得ること、架橋分子の端部から端部までの長さは、架橋分子の持続長より短いこと、および架橋分子の端部から端部までの長さは、センサーギャップの寸法に近似するように構成されていることのうちの１つまたは複数を含み得る。例示的な架橋分子としては、核酸二重鎖、例えば、ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッド二重鎖、ＰＮＡ−ＰＮＡ二重鎖、またはＤＮＡ−ＬＮＡハイブリッド二重鎖などが挙げられる。例示的なセンサーとしては、架橋分子に付着したプローブが挙げられる。プローブは、単一の標的分子と連結されるように構成されていてもよい。例示的なプローブは、溶液中の反応の間に標的分子と連結されるように構成された酵素を含んでいてもよいし、またはそのような酵素であってもよい。
本開示の追加の実施形態によれば、センサーは、基板表面の上にある第１の電極、基板表面の上にある第２の電極、第１の電極と第２の電極との間に（または電極に付着した接触部間に）画定されたセンサーギャップ、および第１の端部と第２の端部とを含む架橋分子を含み、架橋分子は、第１の端部で第１の接触部にカップリングされており、第２の端部で第２の接触部にカップリングされている。センサーギャップは、約５ｎｍから約３０ｎｍの間のセンサーギャップ寸法を含み得る。これらの実施形態の様々な態様によれば、架橋分子は、バイオポリマーであるか、または架橋分子は、化学的に合成される。追加の態様によれば、センサーは、第３のまたはゲート電極を含む。これらのケースにおいて、ゲート電極は、センサーデバイスを調整するおよび／または活性化するのに使用することができる。追加の態様によれば、第１の端部または架橋分子は、第１の自己アセンブルアンカーを含み、さらなる態様によれば、第２の端部は、第２の自己アセンブルアンカーを含む。例示的な架橋分子は、本明細書で特筆された１つまたは複数の特性を含み得る。例示的な架橋分子としては、核酸二重鎖、例えば、ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッド二重鎖、ＰＮＡ−ＰＮＡ二重鎖、またはＤＮＡ−ＬＮＡハイブリッド二重鎖などが挙げられる。例示的なセンサーとしては、架橋分子に付着したプローブが挙げられる。例示的なセンサーは、架橋分子に付着したプローブを含む。プローブは、単一の標的分子と連結されるように構成されていてもよい。例示的なプローブは、溶液中での反応の間に標的分子と連結されるように構成された酵素を含んでいてもよいし、またはそのような酵素であってもよい。
追加の例示的な実施形態によれば、システムは、本明細書で記載されるセンサーを含む。システムは、加えて、１つまたは複数の回路、例えばセンサーを形成するのに使用された基板または上にセンサーがある基板を使用して形成された回路などを含んでいてもよい。システムは、加えて、または代替として、例えばシグナルからノイズを除去したり、および／またはシグナルの解釈を補助したりするために、追加の回路および／またはデバイスを含んでいてもよい。
本開示のさらなる追加の実施形態によれば、方法は、センサー、例えば本明細書で記載されるセンサーなどを提供するステップ；核酸鋳型をポリメラーゼと接触させるステップであって、ポリメラーゼは、センサーの一部を構成する架橋分子にカップリングされている、ステップ；ヌクレオチド塩基ミックスを提供するステップ；ポリメラーゼによって、ヌクレオチド塩基ミックスからのヌクレオチドを合成された核酸に取り込むことを含む取り込み事象を実行するステップ；および取り込み事象によって生成されたシグナルを検出するステップを含む。これらの実施形態の様々な態様によれば、方法は、加えて、例えばセンサーを調整または活性化するために、センサーに電位を印加するステップを含んでいてもよい。さらなる態様によれば、ノイズは、シグナルから除去することができる。
本開示のさらなる追加の実施形態によれば、生体分子感知デバイスを製造する方法は、基板表面上に第１の電極および第２の電極を形成するステップであって、前記第１の電極および前記第２の電極は、電極ギャップによって分離されている、ステップ；前記第１の電極上に第１の接触部および前記第２の電極上に第２の接触部を設置するステップであって、前記第１の接触部および前記第２の接触部は、接触部ギャップによって分離されている、ステップ；ならびに前記第１の接触部および前記第２の接触部に架橋分子を付着させるステップを含む。例示的な方法は、プローブを架橋分子にカップリングするために、架橋分子をプローブと接触させるステップをさらに含んでいてもよい。
また、本開示のさらなる実施形態によれば、オリゴヌクレオチドをシーケンシングする方法は、本明細書で記載される１つまたは複数のセンサーを使用するステップを含む。
本開示の主題は、具体的に指摘され、明細書の終わりの部分で明確に特許請求される。しかしながら、図面を併用して検討すれば、詳細な説明および特許請求の範囲を参照することにより本開示のより完全な理解を十分に得ることができる。
図１は、様々な実施形態によるセンサーの概略図を例示する。
図２Ａおよび２Ｂは、様々な実施形態によるセンサーデバイスの図を例示する。
図３は、様々な実施形態によるセンサーの一部の側面図を例示する。
図４は、様々な実施形態によるバイオポリマー架橋分子を含むセンサーを例示する。
図５は、様々な実施形態によるバイオポリマー架橋分子を含むセンサーを例示する。
図６Ａおよび６Ｂは、様々な実施形態によるセンサーデバイスの図を例示する。
図７は、様々な実施形態によるノイズ除去の前および後のシグナルトレースを例示する。
図８は、様々な実施形態によりＣＭＯＳ技術を使用して電極を製作する方法に関するプロセスフローを例示する。
図９は、様々な実施形態によりＣＭＯＳ技術を使用して接触部を製作する方法に関するプロセスフローを例示する。
図１０は、様々な実施形態によりＣＭＯＳ技術および予め形成された接触部粒子の堆積を使用して接触部を製作する方法に関するプロセスフローを例示する。
図１１Ａ〜１１Ｃは、様々な実施形態によりＣＭＯＳ技術を使用して製作されたセンサーデバイスの図を例示する。
図１２は、様々な実施形態によるバイオポリマー架橋の自己アセンブル後の接触部のアレイの走査型電子顕微鏡写真を例示する。
図１３は、様々な実施形態によるセンサーのバイオポリマー架橋の自己アセンブル事象の間に生成されたシグナルトレースを例示する。
図１４は、様々な実施形態によるセンサーのバイオポリマー架橋へのプローブ結合プロセスの間に生成されたシグナルトレースを例示する。
図１５は、様々な実施形態によるプローブへの鋳型結合の間に生成されたシグナルトレースを例示する。
図１６は、様々な実施形態によるプローブによる鋳型依存性の塩基取り込みの間に生成されたシグナルトレースを例示する。
図１７は、様々な実施形態によるセンサーによる単一の鋳型依存性塩基取り込み事象によって生成されたシグナルトレースを例示する。
図１８は、様々な実験条件下で様々な実施形態によるセンサーによって生成されたシグナルトレースを例示する。
図１９は、様々な実施形態によるセンサーによって、様々な条件下で、改変されていないヌクレオチドおよび５−メチルシトシンで改変されたヌクレオチドを含む標的に応答して生成されたシグナルトレースを例示する。
図２０は、様々な実施形態によるセンサーによって、様々な実験条件下で長い鋳型配列に応答して生成されたシグナルトレースを例示する。
図２１は、様々な実施形態による化学的に合成された架橋分子を例示する。
図２２は、分子回路のエレメント、例えばバイオポリマーが回路中の標的とする位置内で陽極および陰極の両方に結合し、それらを架橋して、アセンブルされた分子回路を形成する一般的な自己アセンブルプロセスを例示する。
図２３は、回路の自己アセンブルにおける材料の接触ポイントの使用を例示する。「Ａ」として示される接触ポイントは、正確な自己アセンブルをガイドし、電気的または機械的な接続を提供することができる、空間的に局在した正確に位置決めされた材料エレメントである。左側に、接触ポイントを付加し、分子エレメントを付着させる基本的ステップを示す。右側に、これがどのようにして望ましい回路をもたらすことができるのかを示す。「Ｂ」基は、接触ポイントに選択的に結合することが可能な、架橋を形成する分子上のコンジュゲート基である。
図２４は、一連のアセンブルステップにおいて、楕円として表される、一次架橋分子へのコンジュゲート結合部位「Ｅ」を有する追加の分子構成要素「Ｄ」で特異的に結合するための追加の接触基「Ｃ」の使用を例示する。
図２５は、電流におけるスパイクがどのようにセンサーデバイスの自己アセンブルにおける各ステップに関連するかを例示する。
図２６は、架橋された接触部（緑色のボックス）および架橋されていない接触部（赤色のボックス）の理想的な画像の図表示である。
図２７は、架橋反応および標識付け反応後の基板の電子顕微鏡画像である。緑色の四角は、架橋がよく形成された接触部を強調する。
図２８は、より高い効率の２０ｎｍの二本鎖ＤＮＡ架橋の、金の接触ポイントのアレイへの結合の画像である。架橋は、画像化の目的のために小さい金のドットで標識されている。緑色の四角は、よく形成された架橋の例を強調する。高塩濃度の緩衝溶液中での堆積による、より高いレベルの金の接触ポイントへの結合、および架橋（架橋反応条件：１μＭの架橋濃度、結合アレイと５×ＴＢＳ緩衝液中で１時間のインキュベーション）。
図２９は、金のドットの接触ポイントの試験アレイに結合しているアルファヘリックスペプチド架橋の画像である。
図３０は、ＩｇＧ抗体架橋結合の画像である。
図３１は、架橋分子における電気的測定に関する試験設定の略図を例示する。
図３２は、架橋−電極結合事象を示す３つのスパイクを示す、電流対時間のプロットを例示する。
図３３は、標識された架橋のＥＭ画像である。
図３４は、金電極のｄｓＤＮＡ架橋のＥＭ画像である。
図３５は、望ましい位置に小さいビーズを製造するのに使用されるプロセス（１）のステップを例示する。図中の左上から始まり、レジスト層（灰色）は、基板（青色）上に直径Ｄの開口部ディスクでパターン化される。次いで接着剤層（緑色）をディスクに堆積させる。次いでこれに、標準的手段によって製作された予め作製されたビーズの溶液を曝露し、ここでビーズは、立体障害が接着性ディスク１つ当たり１つのみのビーズをもたらすような直径ｄを有する。レジストの除去後に残るものは、直径ｄのビーズであり、これは、接着性ディスクの中心の近傍に位置するが、ディスク直径Ｄより小さいサイズを有する。
図３６は、３Ｄの斜視図および上から見た図で示した、図３５からの小さいビーズを確立するためのプロセス（１）のステップを例示する。基板から開始して、標準的なパターン化および堆積方法を使用して、レジストコーティング（灰色）中に描かれたパターンに直径Ｄの材料の接着性ディスクを堆積させる。ビーズへの曝露およびレジストの除去によって接着性パッチに付着したビーズが生じ、立体障害により接着性ディスク１つ当たり１つのみのビーズがもたらされる。したがってこのプロセスにより、パターン化プロセスによって規定される直径より小さい直径で、望ましい位置のビーズが確立される。特に、これは、パターン化方法の分解能を超える分解能で接触ポイントの製造を可能にする。
図３７は、プロセス（２）の実施形態（ａ）のステップを例示する。左上から始まり、好適な基板（青色）上に幅Ｗの長方形のビーズ材料（金）が堆積すると、これが、アニーリングのとき、表面張力の作用下で破壊されて一列のビーズになる。次いで、除去可能なレジストの保護層（赤色）をパターン化し、堆積させ、単一のビーズを含有することになる領域を保護する。残存するビーズを除去し、次いでレジストを除去し、元の長方形の材料の好ましい端部の近傍に単一のビーズを残す。
図３８は、プロセス（２）の代替の実施形態ｂを例示し、図３７に示した実施形態とは対照的に、最終的な堆積した層（赤色）を使用して不要なビーズをカバーすることにより、露出した好ましい端部にビーズのみが残り、より大きいナノデバイスでの使用に利用可能になる。
図３９Ａは、プロセス（２）の１つの好ましい実施形態の例を例示し、使用されるパターン化方法は、ｅ−ビームリソグラフィーであり、その目的は、２つの電極ストリップの近位端にビーズを作製することである。図解は、長方形の層を破壊してビーズにするポイントから、各長方形の好ましい端部に単一のビーズを達成する最終的なステップの前のプロセスを描写する。
図３９Ｂは、高くなったおよびくぼんだ基板の隆起部からなる基板上での実施に移した図３９Ａのプロセスを示す電子顕微鏡画像であり、その基板上に金の層を堆積させ、それを破壊してビーズにする。この画像は、ビーズの直径が、長方形ストリップの基礎となる幅より実質的に小さく、狭い（くぼんだ）ストリップが、単一の一列のビーズが形成される程度に十分に小さいことを示す。
図４０は、長方形パターンが生成され、接着材料１（青色）、それに続く材料２（金）、それに続く界面層の堆積、例えば真空破壊により誘導された酸化（灰色）から、左側の一番上の配置を確立するまでのビーズ形成プロセス（３）を例示する。次いで（矢印の）材料３を薄層に堆積させ（ここでも金として示されている）、これは２と同じ材料であってもよく、次いで（矢印）保護層（赤色）をパターン化し、例えば酸化ケイ素を堆積させ、好ましい端部の小さい領域が露出したままになる。次いで（矢印）アニーリングを実行し、それにより保護層と界面層で囲まれた材料３の小さいパッチを破断してビーズを生成し、長方形領域の端部に位置する一次パターン化寸法未満の直径の、そして一次パターン化寸法の材料３のビーズを形成する。
図４１は、プロセス（１）または（２）を使用して生成されたビーズのアレイを例示する。プロセス（１）のケースにおいて、最初のパターン化および材料堆積プロセスを使用して、基板上に接着性材料のディスクのアレイを作り出すことができ（元のフットプリントは破線の丸で示される）、次いでこのプロセスにより、示された予め形成されたビーズが堆積する。代替として、方法（２）が使用される場合、堆積した最初の長方形の材料のアレイをベースとして、単一の保護ステップでビーズの列の全体を確立することができる。
図４２は、分子エレクトロニクスデバイスのアレイのためのナノ接触ポイントを生成するためのビーズ生成プロセスの使用を例示する。ビーズのアレイは、各電極対が、電極の端部の近傍に位置される接触ポイントとしてビーズの対を受け入れるように位置される。
図４３は、接着性表面上に堆積した金ビーズの電子顕微鏡画像を示す。ビーズは、直径がおよそ５ｎｍから１０ｎｍの金ナノ粒子である。
図４４は、誘導体化されていないケイ素表面に接着性を有する金ビーズを含む対照試料の電子顕微鏡画像を示す。
図４５は、誘導体化された接着性表面上に堆積した金ビーズの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示す。ビーズは、直径がおよそ５ｎｍから１０ｎｍの金ナノ粒子である。
図４６Ａは、ウェルに堆積した金ナノ粒子の様々な濃度を記載したプレートのマップを示し、３連のカラムの繰り返しは、列中に示された様々な希釈率での、緩衝液、親和性抗体、未感作の血清、および対照非特異的マウスＩｇＧである。
図４６Ｂは、ＥＬＩＳＡプレートからの最終的な読取り値のカラーコード化された強度マップである。
図４６Ｃは、数値で示されたＥＬＩＳＡ読取り値の対応する表である。
図４６Ｄは、グラフの形式で要約された最終的なデータの結果を描写しており、特異的な親和性を有する抗体が、表面上に堆積したビーズ濃度の全範囲にわたり、表面ビーズより、様々な対照より大きい結合を有することを示す。
図４７は、ＤＮＡ配列を測定するための分子エレクトロニクス回路の１つの好ましい形態を例示する。酵素は、ソース電極とドレイン電極との間にカップリングされて、印加されたソース−ドレイン電圧およびゲート電圧下における電流などの電気特性、または類似のシステム特性（例えば印加された一定電流での電圧）を測定するためのメーターを含む回路を形成する。時間のトレースとしての測定された特性Ｓ（ｔ）は、この処理中の、ＤＮＡにおける酵素の前進作用および電気的な成分としてのその可変特性のために、基礎となるＤＮＡ配列を反映する。
図４８は、核酸塩基の通常存在するメチル化形態を記載する。メチル化形態がＤＮＡ中に存在する場合、これは生物学的関連性を有する可能性があるため、配列中のこれらの存在も同様に読み出すことが可能であることが望ましい。
図４９は、図１をより標準的なソース−ドレイン−ゲートの幾何学的配置で例示する。
図５０は、ＤＮＡ配列を測定するための分子エレクトロニクス回路の別の好ましい形態の略図を例示する。酵素は、二次エレメントとして、ソース電極とドレイン電極の間の一次導電性エレメントにカップリングされて、酵素がゲーティング機能に加えて伝導も提供することができる回路を形成する。回路は、例えば印加されたソース−ドレインおよびゲート電圧下における電流などの電気特性、または類似のシステム特性（例えば印加された一定電流での電圧）を測定するためのメーターを含む。時間のトレースとしての測定された特性Ｓ（ｔ）は、この処理中の、ＤＮＡにおける酵素の前進作用および電気的な成分としてのその可変特性のために、基礎となるＤＮＡ配列を反映する。
図５１は、図１の略図をより説明的な好ましい実施形態で描写しており、半導体デバイスからのソース−ドレイン−ゲートの幾何学的配置、ならびに一次導電性（conduting）エレメントとしての電極と、近接および可能であれば電気的な接続を確実にする１つの手段としての、酵素を架橋にカップリングするカップリングポイントまたはコンジュゲーション基との分子架橋が共に示される。
図５２は、酵素がポリメラーゼを含む好ましい実施形態を例示し、ポリメラーゼは、ｄＮＴＰを含有する好適な緩衝液が存在すると仮定すると、プライムされた一本鎖ＤＮＡ鋳型を伸長させる。取り込みプロセス（Ａヌクレオチドの取り込みが示される）は、測定された電流のトレースにおいて対応する識別可能な特徴を生成し、それによって配列が決定される。
図５３は、電流ｉなどの測定された回路パラメーターにおけるシグナルスパイクとして示された取り込みの検出可能なシグナルが存在する場合のシーケンシングの実施形態を例示する。単一のヌクレオチドのタイプ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの試験的フローを実行し、洗浄ステップによって分離し（時間軸上の文字および下線で示されたヌクレオチドのフローおよび洗浄のタイミング）、得られた観察されたシグナルスパイクから、示された通りに配列が決定される。ホモポリマーの配列の連続、例えば「ＴＴ」は、対応する試験的フロー中における複数の取り込みスパイクとして示されることに留意されたい。Ａが取り込まれ、シグナルスパイクを生じ、得られるＤＮＡ配列の次の塩基に対応する状況におけるＡ塩基を流した結果を示す。
図５４は、検出可能なシグナルを生成する改変されたヌクレオチドの使用を描写する。各ｄＮＴＰが、取り込みプロセスにおける電流に検出可能な影響を有する改変基（赤色のボールとして示される）を有するケースが示される。このような改変は、切断可能なガンマリン酸上にあってもよく、それゆえにポリメラーゼによって除去され得るか、または感知反応後に実行される別個の切断反応で切断可能であってもよい。改変されたＡ塩基が取り込まれている例が示される。ここでこの概念は、４通りの異なる数の付着したボール（Ｇ：１、Ａ：２、Ｔ：３、Ｃ：４）として表された４通りの異なる改変基により例示され、その結果として同じ数の小さいスパイクが各ヌクレオチドのトレース内に現れるようにトレースが強化される。
図５５は、試験的フローの方法で使用された取り込みの検出可能なシグナルが存在する場合に、シーケンシングの実施形態における取り込みシグナルを強化するための改変されたヌクレオチドの使用を描写する。各ｄＮＴＰが、取り込みプロセスにおける電流に検出可能な影響を有する改変基（赤色のボールとして示される）を有するケースが示される。このような改変は、切断可能なガンマリン酸上にあってもよく、それゆえにポリメラーゼによって除去され得るか、または感知反応後に実行される別個の切断反応で切断可能であってもよい。Ａが取り込みのための正しい塩基である、試験的フロープロセスのＡステップが示される。
図５６は、配列情報の速度論的なコード化を例示する。取り込みスパイク間の時間は、ここではｄＮＴＰ濃度に差があるため、取り込まれている塩基を示す。つまり、Ａが最低濃度であり、それゆえにスパイク間の長い時間が、Ａの取り込みに予測される待機時間を示し、一方でＧが最大濃度であり、したがってスパイク間の最短時間がＧの取り込みを示す（第１のインターバル）。
図５７は、チオール連結（ＤＮＡ端部におけるチオール化されたヌクレオチド、またはアルファヘリックス末端に配置されたシステイン）を介して金接触部にカップリングされたらせん状のポリマー（ｄｓＤＮＡまたはタンパク質アルファヘリックス）である架橋の好ましい実施形態を例示し、酵素にコンジュゲートしたストレプトアビジン（streptavaidin）へカップリングするための特異的に合成された内部ビオチンを共に示す。
図５８は、電極上の接触ポイントに特異的な親和性（一次接触ポイント材料への親和性、または表面の抗原による誘導体化）を有するＩｇＧタンパク質（天然の、または操作された）としての架橋の別の好ましい実施形態を例示し、この架橋は、ＩｇＧに特異的に結合するタンパク質（例えば抗ＩｇＧ抗体、またはプロテインＡもしくはプロテインＧ）を介したカップリングを用いており、このタンパク質は、別様に目的のタンパク質にコンジュゲートしているか、または目的のタンパク質は、天然の、もしくは操作されたコンジュゲーション部位を使用してＩｇＧに直接コンジュゲートしていてもよい。
図５９は、全情報を得るための記載された方法の異なる実施形態を使用した同じ（または複製された）ＤＮＡ鋳型の反復シーケンシングからの部分的な配列情報の組合せを例示する。青色のトレースは、組み合わされた情報（これは、単一のシーケンシング試行では直接観察できない）の灰色のトレースに対する、それぞれ別個の例からの部分的な情報を示す。ここで、鋳型をシーケンシングして（左の実施形態）、部分的な情報を作成し（Ａ塩基のみ検出できることを示す）、再度シーケンシングして（右の実施形態、架橋および酵素に対する変化を示す）、補完的または補助的シーケンシング情報を作成し（Ｇ、Ｔ、Ｃが検出されることを示す）、次いでこれらを組み合わせて全配列を得ることが示される。この２つのシーケンシングの実施形態は、複製鋳型を使用して物理的もしくは一時的に隔離され独立していてもよいし、または同じ鋳型を再度読み取る際の、異なる時間における同じセンサーシステムの異なる状態、すなわち、おそらく緩衝液の変化、温度の変化またはゲート電圧などの印加された電圧の変化によって生じる状態であってもよい。任意の数の補完的な実施形態が、最終的な配列決定を改善するためにそれらの情報を組み合わせ得る。
図６０は、酵素がエキソヌクレアーゼである実施形態を例示する。シグナルは、回路パラメーターに対する、酵素のコンフォメーション、ＤＮＡのコンフォメーション、および遊離のヌクレオチドの作用によって生成される。
図６１は、前進性の酵素が二本鎖ＤＮＡ鋳型をほどくＤＮＡヘリカーゼである実施形態を例示する。
図６２は、酵素が、タンパク質のナノポアおよびＤＮＡを移行させる能力を有するモータータンパク質酵素で形成される複合体である実施形態を例示する。
図６３は、統合されたチップセンサーアレイデバイスを例示する。この様式は、単一のＤＮＡ断片の複製の配列データのロバストな平均化またはデータ統合のために、多くの配列からの配列を同時に大規模並列的に感知することを実行する方法に加えて、各部位に多様なまたは同一のセンサー構築物を配置する選択肢を提供する。
図６４Ａは、ターミネーターシーケンシングプロセスにおける試験的な試行を例示する。ｄＮＴＰ（青色）およびジデオキシターミネーター、ｄｄＮＴＰ（紫色）の混合物の存在下で、重合および感知が進行し、示されているように、ターミネーターがランダムに取り込まれるまでの塩基位置を（示されている８位まで）カウントするのに使用される取り込みスパイクが生じる。反応の終わりに、感知測定が行われ、ターミネーター塩基（このケースではＡ）が識別される。したがって基礎となる配列は、８位にＡを有する。この鋳型または複製鋳型でこのような測定を繰り返し、情報を組み合わせることによって、鋳型に沿った全ての配置における塩基の全配列を決定することができる。
図６４Ｂは、ターミネーターシーケンシングの代替の実施形態を例示し、示されているケースではＡジデオキシ終結（ｄｄＡＴＰ、紫色）である単一の塩基のターミネーターのみが所与の反応に使用される。この様式において、反応が終わったとき、当該の塩基はターミネーターのＡであり、取り込みスパイクの数をカウントすることによりこのＡの鋳型中の位置がわかることが暗示される。Ａに関して複製鋳型を用いて多くの試行を繰り返すことで、鋳型中の全てのＡの配置がランダムに決定されることになり、他のターミネーター塩基Ｃ、Ｇ、Ｔそれぞれに関しても同様な一連の試行を実行することで、鋳型中の全てのこれらの塩基のそれぞれの配置が決定されることになり、それによって配列全体が決定される。
図６４Ｃは、ターミネーターシーケンシングの実施形態を例示し、複製された目的の鋳型が示された各チップにローディングされ、一番上の並びに示されるように、全てのＡ終結のデータが１回の試行からパラレルのセンサーアレイに累積され、Ｃ、Ｇ、およびＴ終結反応についても同様であり、それぞれからの単一の塩基の結果が累積されて（赤色の矢印）、当該の鋳型の全配列が決定される。
図６５は、付着した酵素の代わりの分子センサーにおけるＤＮＡハイブリダイゼーションプローブの使用、および電流などの回路パラメーターをモニターすることによるハイブリダイゼーションの検出を例示する。ハイブリダイゼーションは、異なる電流レベルによって示される。１つの好ましい実施形態では、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブが、プローブ中に配置されたビオチン化塩基を介してストレプトアビジン（オレンジ色の基）にカップリングされる。この形態のプローブおよび検出測定は、複製された鋳型分子に対する情報を提供するプローブのセットを使用して多くのこのような測定値を集めることに基づくハイブリダイゼーションによってシーケンシングを裏付ける。
図６６は、センサーにハイブリダイゼーションプローブを取り込むことの代替の実施形態を例示し、プローブは、架橋分子の全てまたは一部を形成する。好ましい実施形態において、プローブを含有するＤＮＡは、金の接触ポイントおよびＤＮＡ中のチオール化されたヌクレオチドと共に、金−チオール連結を使用して接触ポイントにカップリングされる。この図は、このようなハイブリダイゼーションプローブをＤＮＡ架橋分子の全てまたは一部として構成できる３つの異なる方法を例示する。一番下の例では、プローブが基礎となるＤＮＡにさらに部分的にハイブリダイズすることによって、さらなるストリンジェンシーのために標的との競合ハイブリダイゼーションを構築することができる。
図６７は、酵素による伸長（青色の矢印によって示されるプローブの３’の伸長可能な末端）を使用して、シグナルを強化するための検出可能な基（紫色）を場合により含む、１つまたは複数の塩基を取り込むことによって一次ハイブリダイゼーションシグナルを強化する一例を例示する。このような酵素による伸長は、適した対形成のためのストリンジェンシー／チェックに加えて、電流プロットにおける３つのレベル（ハイブリダイゼーションなし、ハイブリダイゼーション、伸長生成物の存在）により示されるような電子センサーシグナルを強化する手段も追加する。単一の塩基の伸長のケースにおいて、塩基のアイデンティティーが検出可能である（４つのｄＮＴＰが揃っているなかから、または一連の個々のｄＮＴＰ伸長トライアルを介してのいずれかで）場合、もう１つの塩基配列情報も追加して、本方法のシーケンシング能力を強化することができる。
図６８は、バルクの／巨視的なプロセスでシールおよびシール除去することができるマイクロウェルまたはナノウェル中に封入されたセンサーを例示する。このセンサーは、反応物および反応生成物を局在化して、他の検出様式を容易にする。このセンサーはまた、前進性の酵素が、反応生成物を検出するためにプローブと共に存在できるように、ウェル１つ当たり複数のセンサータイプ、またはセンサー１つ当たり複数のプローブ分子から利益を得ることもできる。
図６９は、実験作業に典型的に使用される架橋およびプローブ分子構造の詳細を例示する。このケースにおける架橋は、金属電極上の金接触部へのカップリングのために両方の５’末端にチオール基を有する、示される長さが２０ｎｍ（６０塩基）の二本鎖ＤＮＡ分子である。
図７０は、分子センサーにおける電気的測定に関する試験設定の略図を例示する。図７０の上の部分は、電極−基板構造および架橋分子を介して電圧を印加し電流を測定するための分析器への付着部分の断面を示す。図７０の下の部分は、回路を架橋するための電極アレイの斜視図を例示する。
図７１Ａは、架橋結合のための金の金属ドット接触部を有するチタン電極のアレイの電子顕微鏡画像である。電極は、ケイ素基板上にあり、ｅ−ビームリソグラフィーによって生成された。
図７１Ｂは、図７１Ａにおける電極ギャップの一つの電子顕微鏡のクローズアップ画像であり、７ｍｍの電極ギャップ、および金から金への間隔が１５ｍｍの金のドット接触部ギャップを示す。
図７１Ｃは、図７１Ｂからの単一の電極ギャップの電子顕微鏡のクローズアップ画像であり、２つの電極の先端における直径およそ１０ｎｍの金のドットを示す。
図７２は、電極試験チップの構成を例示する。このケースにおいて、電極アレイは、ｅ−ビームリソグラフィーを使用して１ｃｍのケイ素基板上に形成された。図７２における一連の３つのＳＥＭ画像は、２０個の電極対を、分解能を電極ギャップの１０ｎｍスケールまで連続的に増加させて示す。
図７３は、溶液から電極を保護するために酸化ケイ素の不動態化層が使用されるセンサーデバイスの実施形態を例示する。不動態化中の開口部は、電極領域をｎｍスケールで露出させ、電気的接触パッドを１０ミクロンのスケールで露出させる。
図７４は、センサーチップ表面への液体溶液の曝露の制御を支持するためのフローセルの実施形態を例示する。フローセルは、成形ＰＤＭＳポリマーである。
図７５は、電気的測定のためにチップ担体にマウントされたチップを例示する。
図７６は、アセンブルされたセンサー複合体の導電率を例示し、湿潤（薄い塩緩衝液）および乾燥（空気）条件におけるＤＮＡ架橋分子および完全なセンサー複合体（ポリメラーゼとの架橋）の測定された電流対電圧（Ｉ−Ｖ）特性を、空気、水および薄い塩緩衝液中の開回路電極の対照と共に示す。この図は、架橋およびセンサー複合体が、１ボルトの印加されたソース−ドレイン電圧でおよそ１００ｍピコアンペアの電流で伝導することを示す。測定は、半導体パラメーター分析器でＳＭＵによりなされる。
図７７は、金−ドット接触部の電極上への分子センサーの自己アセンブリの電子的なモニタリングを例示する。電流対時間の測定を使用して、架橋および分子センサー複合体のアセンブリをモニターする。左上：相１：二本鎖ＤＮＡ架橋が５’末端上でチオール基とアセンブルし、電流の急騰によって示されるように電極の金の接触ポイント上にアセンブルする。右上：相２：ポリメラーゼ−ストレプトアビジン複合体が、電流の急騰によって示されるようにｄｓＤＮＡ架橋上のビオチン化部位に結合する。右下：相３：電流対時間のスパイクによって示されるように、プライムされた一本鎖ＤＮＡ鋳型がポリメラーゼに結合して複合体を完成させる。
図７８は、２つの倍率レベルでの最終的なアセンブル構造の電子顕微鏡画像を示す。クローズアップ画像において、架橋複合体は、標識付けをまったく行わなくても目視可能であり、電極と合体したぼんやりした高コントラスト領域（緑色の矢印によって指し示される）のように見える。
図７９は、センサーを用いて取り込みシグナルを測定する４つのプロットであり、センサーを用いて取り込みシグナルを測定することを例示し、様々なプライムされた一本鎖ＤＮＡシーケンシング鋳型ならびに取り込みおよび重合のためのｄＮＴＰを供給されたセンサーから生じる電流シグナルを示す。それぞれのケースにおいて、主要なシグナルスパイクは、別々の取り込み事象からのシグナルに相当し、ポリメラーゼ酵素は伸長する鎖に別の塩基を付加する。左上：鋳型は、２０個のＴ塩基である；右上、鋳型は２０個のＧ塩基である；左下、鋳型は２０個のＡ塩基である；右下、鋳型は２０個のＣ塩基である。観察されたおよその取り込み速度は、１秒当たり１０〜２０塩基であり、これは、標準的な酵素の動態と一致し、ただし律速因子（例えばより低いｄＮＴＰ濃度）に起因する１秒当たり約１塩基のより低い速度を除く。
図８０は、単一の塩基の取り込み事象から生成されたシグナルのクローズアップを例示する。シグナルは、取り込み事象を検出することに加えて塩基のアイデンティティーの特徴付けを助けるのに使用できる可能性がある二重のピーク構造を有する。
図８１は、メチル化塩基を感知する実施形態を例示する。この図は、鋳型中のメチル化の状態または個々のメチル化塩基を感知するためのセンサーの可能性のある使用を示す。この図は、異なるシグナルは、鋳型のメチル化されていない部分とメチル化された部分とに起因すること（緑色のトレース）を示す。高い方のシグナルは、メチル化された部分ではなくメチル化されていない部分に起因する。示された実験は、示されているように、指定された鋳型配列についての、示されるようなセンサーチップ上への一連の異なる溶液の添加のトレースを測定することからなる。ｄＣＴＰのフローは単一の塩基の取り込みスパイクを生成し、次いでｄＧＴＰの添加により取り込みを鋳型のＣＧトラクトを通過して進行させることが可能になり、メチル化された鋳型対メチル化されていない鋳型のシグナルの差が強調される。
図８２は、センサーの長い読取りの能力を例示する。この図は、長いＤＮＡ断片を読み取るかまたは分析する可能性を示し、これは、全ゲノム配列の新たなアセンブリなどのデータの長い範囲の連続性が重要な用途に重要である。ＤＮＡ鋳型は、５．４ｋｂのＰｈｉＸウイルスゲノムである。左側：鋳型（ｄＮＴＰミックス）対重合なしの後続の対照（ターミネーターｄｄＮＴＰミックス、ポリメラーゼ活性ブロック済み）の低時間分解能の読取りからの異なるシグナル。右側：長い鋳型ＤＮＡが目視可能な電極のＳＥＭ画像。
図８３Ａは、ペプチドアルファヘリックス架橋分子を含むセンサーの実施形態を例示する。実施に移された１つの具体的な好ましい実施形態における架橋分子は、６６アミノ酸の配列を有するペプチドを含む。図８３Ｂは、公知のビオチン−ニュートラアビジン結合反応を介してニュートラアビジン分子にカップリングされたアルファヘリックス架橋、さらに、公知のマレイミド−システインの共有結合によるカップリング反応を介してポリメラーゼ上の表面のシステインにコンジュゲートされた追加のビオチン−マレイミドリンカーを介して付着したポリメラーゼを含む十分にアセンブルされたセンサーの実施形態を例示する。
図８４Ａは、ポリメラーゼ取り込みからのシグナルを強化するために実施例９で使用された改変されたＣヌクレオチド（図８４Ｂに描写されたｄＣＰ４−Ｃｙ７との混合物として）を例示する。
図８４Ｂは、ポリメラーゼ取り込みからのシグナルを強化するために実施例９で使用された改変されたＣヌクレオチド（図８４Ａに描写されたｄＣＰ４−ラクトースとの混合物として）を例示する。
図８５Ａは、アルファヘリックスペプチド架橋を用いた配列感知実験からのデータを描写する。プロットは、金接触部に架橋を付着させるために、ＰＢＳ緩衝液中１μＭのペプチド濃度でペプチド架橋分子と共に１時間インキュベートした試験チップ上の電極の電流対電圧のトレースである。最大電流のトレースは、２ボルトの印加されたソース−ドレインにおいて３ナノアンペアの電流に達しており、適所に架橋分子を有する電極を示す。
図８５Ｂは、アルファヘリックスペプチド架橋を用いた配列感知実験からの追加のデータを描写する。プロットは、架橋されたセンサーが、２ボルトのソース−ドレイン電圧の印加を伴いニュートラアビジン溶液に曝露される場合の、およそ１０秒から５０秒の時間における、架橋へのそれに続くニュートラアビジン結合のシグネチャーを示す電流対時間のトレースである。
図８５Ｃは、アルファヘリックスペプチド架橋を用いた配列感知実験からの追加のデータを描写する。プロットは、後者が前者の溶液に曝露される場合の、１０〜２０秒の時間における、ニュートラアビジン−架橋複合体と結合するポリメラーゼ−マレイミド−ビオチンのシグネチャーを示す電流対時間のトレースである。
図８５Ｄは、アルファヘリックスペプチド架橋を用いた配列感知実験からの追加のデータを描写する。プロットは、アセンブルされたセンサーが、一連のＧＴ反復を有する配列：（１０×ＧＴ）ＴＴＴ（１０×ＧＴ）ＡＡＡ（１０×ＧＴ）ＣＣＣ（１０×ＧＴ）を含む鋳型ＤＮＡを含有する溶液を提供された場合に得られたシーケンシングシグナルを表す。図は、主要なスパイクが鋳型のＧＴ反復トラクトに対応し、示された４５秒の間に全体の３つの異なる鋳型ＤＮＡ分子がセンサーと連結するこれらのシグナルの１つの考えられる解釈で注釈が付けられる。
（詳細な説明）
本明細書における例示的な実施形態の詳細な説明は、例証として、およびそれらの最良の形態として例示的な実施形態を示す添付の図面を参照する。これらの例示的な実施形態は、当業者が本発明を実施できる程度に十分詳細に説明されるが、他の実施形態は実現可能であり、論理的な、化学的な、および機械的な変化が本発明の本質および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。したがって、本明細書の詳細な説明は、単に例示のために提示され、限定のためではない。例えば、別段の規定がない限り、方法またはプロセスの説明のいずれかで列挙されたステップは、任意の順番で実行されてもよく、必ずしも提示された順番に限定されない。さらに、いずれの単数形の言及も、複数形の実施形態を含み、いずれの１つより多くの要素またはステップの言及も、単数形の実施形態またはステップを含み得る。また、付着、固定、接続または同種のもののいずれの言及も、永続的な、取り外し可能な、一時的な、部分的な、完全なおよび／または他のあらゆる可能性のある付着の選択肢を含み得る。加えて、接触がない（または類似の成句）への任意の言及は、低減された接触または最小の接触も含み得る。
様々な実施形態において、単一分子バイオセンサーデバイスは、第１の電極および第２の電極を含んでいてもよい。第１の電極および第２の電極は、電極および／または電極に付着した接触部によって画定されたセンサーギャップによって分離されている。第１および第２の電極は、センサーギャップに架かる架橋分子によってカップリングされてもよい。架橋分子は、バイオポリマー、例えば核酸またはアミノ酸ポリマーなどを含んでいてもよい。架橋はまた、化学的に合成された分子を含んでいてもよく、このような分子としては、合成有機分子、バイオポリマー単量体の合成アナログを含むポリマー、または生体分子由来ではない他の全体的に合成の単量体を挙げることができる。「バイオポリマー」と「化学的に合成された分子」との違いは、別様に天然バイオポリマーを有用な架橋分子に改変する合成変換、例えば、引き続く結合および架橋のために、別様に天然に存在するポリ核酸配列の３’および５’末端を合成により改変することなどの可能性を排除するほど文言上厳密ではないことを意図している。架橋分子は、バイオポリマーまたは合成分子で構成されているかどうかにかかわらず、公知の原子的に正確な分子構造を有し得る。電極への架橋分子の付着は、接触部が介在していてもよい。プローブ分子または分子複合体は、架橋分子にカップリングされていてもよい。プローブは、生体分子、例えば単一の標的分子と相互作用するように構成された酵素などであり得る。様々な実施形態において、センサーデバイスは、並行に並べられた複数の単一分子バイオセンサーを含んでいてもよい。このようなマルチセンサーデバイスは、標的および他の分子の複合混合物において、複数の個々の標的分子の並行な検出、識別、および／または特徴付けもしくは識別を実行するのに使用することができる。
図１は、様々な実施形態によるセンサー１０１を含むセンサーデバイス１００の概略図を例示する。センサー１０１は、第１の電極１０２および第２の電極１０３を含む。センサー１０１はまた、以下でより詳細に記載されるようなゲート１０４を含んでいてもよい。センサー１０１は、第１の電極１０２および第２の電極１０３に機能的にカップリングされたセンサー複合体１０５をさらに含んでいてもよい。様々な実施形態において、センサー複合体は、それぞれの電極に付着した第１の接触部１０６および第２の接触部１０７を介して電極にカップリングされていてもよい。センサー複合体１０５は、複数の構成要素、例えば以下でより詳細に記載されるような架橋分子およびプローブ分子などを含んでいてもよい。センサー複合体１０５は、周囲の環境と相互作用し得、それによってセンサー１０１が感知機能を実行できるようになる。例えば、図１で例示されているように、センサー複合体１０５は、例えばＤＮＡ分子などの標的分子１０８と相互作用し得、センサーデバイスは、標的分子の存在および／または特性を検出するのに使用することができる。
様々な実施形態において、センサーデバイス１００およびセンサー１０１は、センサー１０１の電気特性の変化を検出するように、回路１２０に作動可能に接続されていてもよい。回路１２０は、好ましくはセンサー１０１にマイクロスケールで近接した集積回路であるが、回路１２０は、外部の電気計器、例えばベンチトップの電流計などとしても具体化することができる。センサーデバイス１００は、複数のセンサー１０１を含んでいてもよい。集積回路１２０は、ＣＭＯＳ製作方法を使用して製作できる回路構成を含んでいてもよい。集積回路１２０は、各センサー１０１につき、センサーの支持体を提供する同じチップ内に製作された電子測定回路を含んでいてもよい。言い方を変えれば、センサーデバイス１００は、集積超小型回路中にセンサー１０１および集積回路１２０を含んでいてもよい。集積回路１２０は、外部のシグナル処理システム１２１に接続するための、読み出し回路網および入力／出力特徴をさらに含んでいてもよい。
様々な実施形態において、センサー１０１と共通の半導体チップ上に存在する集積回路１２０を使用することで、巨視的な外部回路エレメントによって生成され得る、記録中における電子ノイズのソースを低減することができる。例えば、このような回路は、感度および読み出しに関する性能要件に応じて１から２００個の範囲の少数のトランジスタを含む混合シグナルのＣＭＯＳセンサーであり得る。このような回路は、様々な実施形態において、単一のセンサー１０１における電流を測定するように機能することができる。さらに、センサーデバイス１００は、同じ試料と接触する多数のセンサーの同時操作が支持されるように、センサー１０１のアレイごとにセンサー／読み出し回路を含む集積回路１２０を含んでいてもよい。
様々な実施形態において、センサー１０１と接触する試料は、液相試料を含む。試料を含む溶液は、センサーを使用して実行される電気測定中のノイズを低減するために、極限まで希釈され、低いイオン強度であってもよい。獲得したシグナルは、典型的には、センサー中の電極１０２と１０３との間を流れる電流であるが、例えば電極間の電圧、電極間の抵抗／コンダクタンス、またはゲート電圧などの関連する観察可能な電子パラメーターであってもよい。
様々な実施形態において、現行のＣＭＯＳ製作方法を使用した製作に適した集積マイクロチップチップフォーマットにおけるセンサー１０１および集積回路１２０の配置は、高度に小型化された構成を有するセンサーデバイスの生産を容易にすることができる。様々な実施形態において、センサーごとの集積回路は、センサーギャップの約１００μｍ以内、またはセンサーギャップの約５０μｍ以内、またはセンサーギャップの約２０μｍ以内、またはセンサーギャップの約１０μｍ以内、またはセンサーギャップの約５μｍ以内、またはセンサーギャップの約１μｍ以内に位置していてもよい。さらに、様々な実施形態において、センサーデバイスは、複数のセンサーを含んでいてもよく、各センサーは、上記で特定したパラメーター以内に配置された連結された集積回路を有する。
シグナル処理システム１２１は、センサーデバイス１００の電子制御を提供して、センサーデバイスおよびその中の各センサー１０１からシグナルを受け取り、保存し、受け取ったシグナルを分析するように構成されていてもよい。シグナル処理システム１２１は、各センサー１０１に印加される電圧および電流の制御などの電子制御機能を実行するように、ならびに各センサー１０１から受け取ったシグナルにつきシグナル処理機能を実行するように構成された、プロセッサーおよび／またはソフトウェアを有するコンピューターシステムを含んでいてもよい。
例えば、図１で例示されているように、センサー１０１を含むセンサーデバイス１００は、核酸のシーケンシング反応を実行するのに使用することができる。デバイスの操作中、電圧は、センサー１０１の第１の電極と第２の電極との間に印加されてもよく、センサーと標的との相互作用により、集積回路１２０およびシグナル処理システム１２１を使用して測定することができるバイオポリマー架橋分子（例えば図３の３３３を参照）を通る電流の流れの変調がもたらされる。センサー１０１は、時間ｔにわたりシグナルパターン１２２を生成することができ、シグナルの特徴１２３は、センサー複合体と標的分子１０８の特徴との相互作用に応答してセンサーにより生成される。シグナル処理システム１２１は、シグナルパターンを受け取り、処理して、シグナルパターンに応答する配列出力１２４を提供することができ、この文脈において、この配列出力はシグナルの解釈である。
様々な実施形態において、単一分子バイオセンサーは、電気回路中でチャネルまたは導電性通路として機能する、付着した架橋分子および／もしくはプローブ、および／またはこれらの成分に近接する標的分子および／もしくは液相分子を備えた、トランジスタ、例えば電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）などの形態をとることができる。このような実施形態において、単一のプローブ分子を含むセンサー複合体は、以下でより詳細に説明されるように単一の標的分子に結合するかまたはそれと相互作用するように構成されていてもよく、それによって単一分子感度を有するバイオセンサーが提供される。このようなトランジスタの実施形態は、２もしくは３端子トランジスタを含んでいてもよく、または例えばマルチゲートデバイスのケースのように可能であればそれより多くの端子を含んでいてもよい。
図２Ａおよび２Ｂは、様々な実施形態によるセンサーデバイス２００の図を例示する。例示されたセンサーデバイス２００の図には、センサー複合体は示されていない。センサーデバイス２００は、複数のセンサー２０１を含み、各センサーは第１の電極２０２および第２の電極２０３を含む。各センサーは、センサーギャップ２３９をさらに含んでいてもよい。例示された実施形態において、各センサーは、第１の電極に付着した第１の接触部２０６および第２の電極に付着した第２の接触部２０７を含む。様々な実施形態において、電極は、半導体基板表面上に配置されていてもよい。例えば、センサーデバイス２００は、二酸化ケイ素層２６１の上にある窒化ケイ素層２６０を含んでいてもよい。センサーデバイス２００は、上に電極が配置された半導体基板層の下に存在する埋め込まれたゲート２０４をさらに含んでいてもよい。上述した様々な構成要素は、例えばケイ素チップ２６３などの支持体上に製作することができる。図２Ａで模式的に例示したように、第１の電極２０１、第２の電極２０２、およびゲート２０４のそれぞれは、シグナル処理システム２２１に接続されていてもよく、このシステムは、図解に描写されているように外部の計器であってもよいが、代替として集積回路網であってもよい（詳細は示されていない）。
ここで図３を参照すれば、センサー３０１の一部およびセンサー複合体３０５の側面図がより詳細に例示される。センサー３０１は、第１の電極３０２および第２の電極３０３を含む。第１の電極３０２および第２の電極３０３は、基板３２０上に配置されていてもよい。様々な実施形態において、センサー３０１は、それぞれ第１の電極３０２および第２の電極３０３に作動可能にカップリングされた第１の接触部３０６および第２の接触部３０７をさらに含んでいてもよい。しかしながら、接触部は厳密には必要ではなく、本開示に係るセンサーは第１および第２の接触部を含んでいなくてもよい。第１の電極３０２および第２の電極３０３の末端は、電極ギャップ３３０を画定する。同様に、例えばセンサー３０１などの接触部を含むセンサーの場合、第１の接触部３０６と第２の接触部３０７との距離が、接触部ギャップ３３１を画定する。いずれか所与の第１の接触部および第２の接触部の場合の接触部ギャップの実際の寸法は、接触部と参照のために使用される接触部のポイントとの配置によって変化し得る。例えば、図３で例示される半球形の第１の接触部３０６および第２の接触部３０７の場合、接触部ギャップ３３１の寸法は、接触部の最も近いポイント間で、または中心から中心で測定され得る。様々な実施形態において、電極ギャップおよび接触部ギャップの１つ、または電極および／もしくは接触部によって集合的に、もしくはそれらの様々な組合せによって画定されたギャップは、センサーギャップと称する場合がある。
続けて図３を参照すれば、センサー３０１は、センサー複合体３０５をさらに含む。様々な実施形態において、センサー複合体３０５は、架橋分子３３３およびプローブ３３４を含んでいてもよい。プローブ３３４は、リンカー３３７を介して架橋分子３３３にカップリングされていてもよく、ここでリンカー３３７は、ストレプトアビジン−ビオチン複合体として示されており、ビオチンはＤＮＡ架橋３３３のヌクレオチドに共有結合で取り込まれ、ストレプトアビジンはポリメラーゼ３３４に化学的に共有結合で架橋されている。センサー複合体３０５の様々な構成要素のそれぞれは、以下でより詳細に説明される。
様々な実施形態において、架橋分子３３３は、化学的に合成された架橋分子またはバイオポリマー架橋分子を含んでいてもよい。化学的に合成された架橋分子またはバイオポリマー架橋分子は、構造的および機能的の両方でセンサーギャップに架かるように構成されていてもよい。例えば、化学的に合成された分子またはバイオポリマー分子は、公知のまたは予測可能な構造的パラメーターを有する架橋分子の構築をもたらす原子的に正確な分子のサブユニット（例えば、ポリマー性の架橋分子に取り込むためのモノマー単位）の選択および使用、接触部のポイントへの自己アセンブルおよび架橋分子へのプローブ分子の自己アセンブルを促進する特徴、ならびに電極の電気的な接続にとって好適な電気化学特性の取り込みによって構成されてもよい。
化学的に合成された架橋分子は、合成有機化学の分野における当業者によってアセンブルできる分子である。例えば、化学的に合成された分子は、ポリピロール、ポリアニリン、またはポリチオフェン骨格を含んでいてもよい。図２１を簡単に参照すれば、ポリチオフェンベースの化学的に合成された架橋分子２１００の一般構造の例が例示される。化学的に合成された架橋分子２１００は、架橋分子の骨格を形成するチオフェン環２１０１の鎖を含んでいてもよく、プローブ支持体部分２１０２のいずれかの側のｎ１およびｎ２チオフェン環は、架橋分子２１００中の特定の位置に構成されていてもよい。各チオフェン環２１０１が幅およそ０．３ｎｍであることから、約１０から約１００個の環を含む化学的に合成された架橋分子が、約３ｎｍから約３０ｎｍのギャップに架かるように構築することができる。化学的に合成された架橋分子の末端（例えば、Ａ１およびＡ２）は、チオールもしくはアミン基、または電極もしくは接触部材料に結合するように構成された他の基を含んでいてもよい。化学的に合成された架橋分子はまた、プローブ分子の付着を提供するのに好適なリンカー（例えば、Ｌ）と共に構成されていてもよい。当業者に現在公知の、または以降彼らによって考案され得るあらゆる好適な骨格部分で構成される他のあらゆる化学的に合成された架橋分子の配置が、本開示の様々な実施形態に従って使用することができる。
本明細書で使用される場合、用語「バイオポリマー」は、生物によって産生され得る少なくとも１つのモノマー単位を含むあらゆる分子を含み得るが、バイオポリマーまたはポリマーそれ自身を含む実際のモノマー単位は、生物によって産生されていなくてもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができる。バイオポリマーの例としては、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および多糖類、例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質などのこれらの周知の形態が挙げられる。バイオポリマーを含む架橋分子としては、コラーゲンタンパク質で生じるような単純な「コイルドコイル」配置における、または免疫グロブリン（immunoglobin）分子（例えばＩｇＧ）の場合などの重鎖および軽鎖のポリマー性タンパク質のより複雑なフォールディングにおける多鎖のポリマー性タンパク質を挙げることができる。バイオポリマーを含むこのような複合体としてはまた、一般的な核酸二重鎖ヘリックス、例えば、２つのＤＮＡ一本鎖分子が水素結合によってらせん状の二本鎖に結合したものであるＤＮＡ二重らせん、ＰＮＡ−ＰＮＡ二重鎖、ならびにＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＰＮＡ、およびＤＮＡ−ＬＮＡハイブリッド二重鎖なども挙げられる。バイオポリマー分子はバイオポリマーとして分類されるために、天然に存在するものでなくてもよいし、または生物によって産生されるものでなくてもよい。その代わりに、本開示の目的のために、用語「バイオポリマー」は、酵素的および非酵素的に合成される分子を含む場合があり、同様に、天然に存在するモノマー単位の合成アナログを含む分子を含み得る。例えば、バイオポリマーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびロックト核酸（ＬＮＡ）、強化された安定性特性を有するＤＮＡおよびＲＮＡの合成アナログを含んでいてもよい。加えて、バイオポリマーは、分子に付加することができる様々な改変のいずれかを含んでいてもよい。バイオポリマー架橋分子の使用は、センサーの機能にとって好適なサイズおよび化学的性質を有する正確に制御された構造の合成などの様々な利益を提供することができ、このようなバイオポリマー架橋分子は、必然的にセンサーのための標的分子に対して適合性を有する（例えば、同じ液体緩衝媒体に適合性を有する）可能性があり、生物工学産業は、このような分子をデザインする、工学的に作製する、および合成する、ならびにそれらを経済的にかつ高品質の制御で製造する広範囲の能力を開発してきた。
架橋分子は、架橋分子と電極および／または接触部との間に電子的な通信を提供するのに好適な方式で、センサーギャップをつなぎ、センサーギャップのどちら側でも電極および／または接触部にカップリングされるように構成することができる。
様々な実施形態において、架橋分子は、直鎖状バイオポリマー、例えば二本鎖ＤＮＡへリックスまたはα−ヘリカルポリペプチドなどを含んでいてもよい。図３で例示されているように、架橋分子３３３は、第１の接触部３０６にカップリングされた第１の端部３３４と、第２の接触部３０７にカップリングされた第２の端部３３５とを有する二本鎖ＤＮＡ架橋分子である直鎖状バイオポリマーを含む。
様々な実施形態において、リジッドな架橋構造は、センサー複合体のアセンブル中およびその後に明確な配置をとることに関して利点を提供する可能性がある。理論に制限されることは望まないが、直鎖状バイオポリマーは、その曲げ剛性によって説明可能なセミフレキシブルなポリマーを含んでいてもよい。短尺のスケールでは、直鎖状バイオポリマーはリジッドなポリマーとして振る舞い、ポリマーを曲げるには強い力を必要とする可能性があるが、より長いスケールでは、直鎖状バイオポリマーは、より簡単に曲がったりまたは湾曲したりする可能性がある。ある特定の一連の環境条件において直鎖状バイオポリマーが本質的にリジッドな分子として振る舞う特徴的な曲げ長さの尺度は、持続長と称される。持続長は、ポリマーに曲げる力がかけられる環境条件に依存する可能性があり、例えば周囲環境の温度およびイオン性条件などの変数が持続長に影響を及ぼす。例えば二本鎖ＤＮＡなどの直鎖状バイオポリマーの持続長は、理論上のモデリングに基づいて推測することもできるし、または様々な実施形態によるデバイスが使用され得る予め決定された実験条件に対応する一連の環境条件に関して経験的に測定することもできる。例えば、本開示の様々な実施形態に従ってセンサーを使用できる条件の近似となることができる様々な条件で、二本鎖ＤＮＡの持続長は、約３０ｎｍから約８０ｎｍで計算されており、α−ヘリカルペプチドの持続長は、約８０ｎｍから約１００ｎｍで計算されている。したがって、様々な実施形態において、その長軸に沿って測定した場合、上述したそれぞれの持続長パラメーター未満の端部から端部までの長さを有する二本鎖ＤＮＡ分子またはα−ヘリカルペプチドは、本質的にリジッドなポリマーとして振る舞う可能性があり、それによってデバイスのアセンブルおよび性能に関してある特定の利点または利益が提供される。
様々な実施形態において、ＤＮＡまたはアミノ酸で構成される直鎖状バイオポリマーの使用は、バイオポリマーのモノマーの組成（すなわち、１次構造）に基づき予め決定された長さを有するナノスケールのセンサー構成要素のわかりやすい構築を可能にする。理論に制限されることは望まないが、持続長未満の端部から端部までの長さを有する直鎖状バイオポリマーの使用が、様々な実施形態による生体分子感知デバイス構築中の自己アセンブルステップの効率を強化する可能性がある。このような直鎖状バイオポリマーの使用は、それらの微小機械特性が、曲がったりまたはフォールディングしたりする可能性があるより長い直鎖状バイオポリマーよりも予測可能なパラメーター内にバイオポリマー架橋分子の仕様を維持する能力を提供し、それによって、例えば、架橋分子合成、取り扱い、自己アセンブル、またはセンサー操作中の望ましくない確率論的な作用の影響が低減される。さらに、直鎖状バイオポリマーの使用は、理論上の構造的モデルの性能およびデバイスの向上を容易に試験し、漸進的な、よく制御された、経験的に試験可能な改変をもたらすさらなる能力を提供するセンサーギャップに対する架橋分子の長さの正確な仕様（すなわち、電極ギャップおよび／または接触部ギャップの寸法および構成）を可能にする。様々な実施形態において、センサーデバイスで使用されるスケール（例えば、約５ｎｍから約３０ｎｍの間の端部から端部までの長さ）で直鎖状バイオポリマー架橋分子は本質的にリジッドな性質であるため、直鎖状バイオポリマー架橋分子は、第１および第２の自己アセンブルアンカーにおける第１の自己アセンブルアンカーと、第１の接触部および第２の接触部の１つへの第２の端部の両方の誤ったカップリングの割合の低減をもたらすように構成されていてもよい。同様に、バイオポリマー架橋分子は、単一の端部のカップリングの割合の低減をもたらすように構成されていてもよい。これは、実質的にリジッドな架橋分子が、第１の接触部に一旦カップリングされたら、接触部の間隔のために第２の端部が望ましい第２の接触ポイントと近接した状態でより長い時間を過ごすように制限するため、望ましい第２のカップリング反応の割合を増加させるという結果をもたらすことができる。
上述したように、バイオポリマー架橋分子は、二本鎖ＤＮＡ分子を含んでいてもよい。様々な実施形態において、二本鎖ＤＮＡは、チオールで改変されたヌクレオチドまたは塩基を含む、チオールで改変されたオリゴを含んでいてもよい。チオールで改変されたヌクレオチドは、金のナノビーズまたは類似の表面の接触部に結合するように構成された自己アセンブルアンカーを含んでいてもよい。様々な実施形態において、自己アセンブルアンカーは、５’−チオールで改変されたヌクレオチドを含んでいてもよく、これは、オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍に位置していてもよい。二本鎖ＤＮＡ分子は、相補的なオリゴヌクレオチド対を含んでいてもよく、各オリゴヌクレオチドは、アセンブルされた二本鎖ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の末端に位置する自己アセンブルアンカーを含むように、５’−チオールで改変されたヌクレオチドを含む。例えば、様々な実施形態において、二本鎖ＤＮＡ分子は、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
５’−／５チオＭＣ６−Ｄ／ＴＧＣ ＧＴＡ ＣＧＴ ＡＴＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＡＴＧ ＧＣＧ ＣＡＧ ＡＣＴ ＧＡＴ ＧＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ ＣＧＴ ＣＧＣ ＴＡＣ ＴＧＣ ＡＧＴ ＡＣＴ−３’（配列番号１）、および
５’−／５チオＭＣ６−Ｄ／ＡＧＴ ＡＣＴ ＧＣＡ ＧＴＡ ＧＣＧ ＡＣＧ ＴＣＡ ＴＡＧ ＧＡＣ Ａ／ｉＢｉｏｄＴ／Ｃ ＡＧＴ ＣＴＧ ＣＧＣ ＣＡＴ ＴＣＡ
ＴＧＡ ＣＡＴ ＡＣＧ ＴＡＣ ＧＣＡ−３’（配列番号２）
「／５チオＭＣ６−Ｄ／」は、５’−チオール調節剤を意味し、「／ｉＢｉｏｄＴ／」は、内部のビオチンで改変されたデオキシチミジンヌクレオチドを意味する（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）。これらのオリゴは、互いにアニールされると、分子の各末端に第１および第２の自己アセンブルアンカーとして５’−チオールで改変されたヌクレオチド（nucelotide）が位置する二本鎖ＤＮＡ分子を提供する。
二本鎖ＤＮＡ分子架橋はまた、相補的なアビジンタイプのリンカー成分を用いたプローブ分子の架橋への連結を容易にするビオチンリンカー成分をさらに含んでいてもよい。様々な実施形態において、および上述したリバースのオリゴヌクレオチド配列で例示されたように、ビオチンで改変されたオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ分子架橋のオリゴの１つに取り込まれていてもよい。様々な実施形態において、ビオチンで改変されたオリゴは、例えば改変チミジン残基（ビオチン−ｄＴ）を介した内部改変である。Ｃ６スペーサーを介したチミジンへの付着、トリエチレングリコールスペーサーを介した付着、光で切断可能なスペーサーアームを介した付着、二重のビオチン改変、デスチオビオチン改変、およびビオチンアジ化物での改変などの、様々なビオチン改変の配置を使用することができる。現在当業者に公知であるか、または以下で考案され得、プローブ分子へのリンケージを容易にするためにオリゴヌクレオチドにされ得る他の改変は、本開示の範囲内である。同様に、タンパク質結合パートナーを有する他の共通の小分子、例えばジゴキシゲニンは、このような架橋分子中の正確に原子的に特定されたポイントでプローブ分子にコンジュゲートさせる目的で、ビオチンの役割と類似した役割を果たす可能性がある。
様々な実施形態において、ペプチドバイオポリマー架橋分子は、様々な望ましい架橋分子の構造および性能特性、例えば電極または接触部の結合の特徴、構造的な特徴、電気的な性能特徴および同種のものを提供するのに好適な、様々な配置および／または特徴を含んでいてもよい。例えば、ペプチドバイオポリマー架橋は、例えば金、パラジウムまたは白金などの強いチオール結合で連結される特異的な金属接触部へのチオール−金属結合を介した自己アセンブルアンカーとして役立つように、アミノ末端とカルボキシル末端の一方または両方にＬ−システイン残基を含んでいてもよい。他の実施形態において、バイオポリマー架橋分子は、自己アセンブルおよび回路への電気機械的な接続の目的で金の接触部と選択的にかつ強く結合する公知の能力を有するペプチドを含んでいてもよい。具体的なこのようなペプチドとしては、以下のアミノ酸配列：ＭＨＧＫＴＱＡＴＳＧＴＩＱＳ（配列番号３）、ＶＳＧＳＳＰＤＳ（配列番号４）、およびＬＫＡＨＬＰＰＳＲＬＰＳ（配列番号５）を有するペプチドが挙げられる。このような特性に関して選択された他のペプチドも同様に、他の特異的な金属または材料の接触部に結合することができる。例えば、ＶＰＳＳＧＰＱＤＴＲＴＴ（配列番号６）は、公知のアルミニウム結合ペプチドであり、ＭＳＰＨＰＨＰＲＨＨＨＴ（配列番号７）は、公知の二酸化ケイ素結合ペプチドである。様々な他の実施形態において、バイオポリマー架橋分子は、直鎖状のリジッドな導電性架橋を提供する安定なアルファへリックスコンフォメーションの形成にとって有利であることが公知の以下のアミノ酸配列モチーフ：ＥＡＡＡＲ（配列番号８）、ＥＡＡＡＫ（配列番号９）、ＥＥＥＥＲＲＲＲ（配列番号１０）、およびＥＥＥＥＫＫＫＫ（配列番号１１）の１つから選択される１つまたは複数のアミノ酸モチーフの反復を含むペプチド配列を含んでいてもよい。このようなペプチドバイオポリマー架橋分子はまた、プローブ分子複合体へのアビジンベースのコンジュゲーションのための正確に原子的に画定された位置にコンジュゲーションポイントを提供するために、共有結合で付着したビオチンを有するリシン残基からなる改変されたアミノ酸を含んでいてもよい。改変されたリシンは、他の点でアルファへリックスの特性を維持するように、またはそのような特性を最低限にしか変更しないように、このようなペプチド配列モチーフにおける標準のリシンまたはアルギニン残基を置き換えることができる。
様々な実施形態において、バイオポリマー架橋分子は、他の配置を有していてもよい。例えば、図４で例示されているように、バイオポリマー架橋分子４３３は、曲げられた、フォールディングされた、またはある程度の２次構造を含む直鎖状の生体分子を含んでいてもよい。様々な実施形態において、バイオポリマー架橋分子は、球状タンパク質、抗体、およびマルチサブユニットのタンパク質複合体などの３次および／または４次構造を有する分子をさらに含んでいてもよい。図５にその例が例示されており、それによればバイオポリマー架橋分子５３３は、免疫グロブリンＧタンパク質（ＩｇＧ）を含む。例示された実施形態において、電気的な接触部（５０６、５０７）は金ナノ粒子であり、このような粒子に結合する特異的な親和性を有するＩｇＧが確立されている。
センサー３０１に類似して、図４および図５に例示される配置はそれぞれ、リンカー（それぞれ４３７および５３７）を介してバイオポリマー架橋分子にカップリングされたプローブ（それぞれ４３６および５３６）を含む。例示された実施形態は、異なる材料および配置を含む電極または接触部、例えば、異なる構造的配置の異なる金属または非金属の伝導性または半導性の接触部などにカップリングすることができる、可能性のあるバイオポリマー架橋分子の配置の範囲を例示することが意図される。様々な実施形態において、電極または接触部は、例えばＩｎｎｏｖａＣｏａｔ ＧＯＬＤナノ粒子（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの製品を使用した架橋のアセンブルおよび／または付着を容易にするために、さらにコーティング、処理または誘導体化されていてもよい。
様々な実施形態によるプローブは、あらゆる好適な分子または多成分の分子複合体を含んでいてもよい。プローブは、センサーで検出しようとする分子またはモニターしようとする生化学反応に基づいて選択することができる。プローブの様々な例としては、ペプチド、タンパク質、酵素、核酸、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、および同種のものが挙げられる。様々な実施形態において、酵素は、リゾチーム、キナーゼ、またはポリメラーゼを含み得る。基質または標的分子の結合または処理に応答して物理的、化学的、または電子的な配置において特異的な変化を示すあらゆる分子または複合体が、本開示の様々な実施形態に従ってプローブとして使用することができる。
様々な実施形態において、プローブは、個々のＤＮＡまたはＲＮＡ標的分子と相互作用するのに好適な、例えばポリメラーゼまたは逆転写酵素などの酵素を含み得る。成長中のオリゴヌクレオチド鎖へのヌクレオチド塩基の鋳型依存性の取り込みを触媒する酵素は、鋳型鎖の核酸塩基の逐次的な遭遇および／または鋳型によって特定される天然もしくは類似の塩基の取り込み（すなわち、取り込み事象）に応答してコンフォメーション変化を受ける。このようなコンフォメーション変化は、プローブをカップリングしている架橋分子を通る電流を変調することができ、それにより鋳型分子に依存する方式で配列特異的なシグナルパターンが提供され得る。上述したように、シグナルパターンは、シグナル処理システムによって検出され、配列データの出力に翻訳されてもよい。さらに、標的核酸配列中の改変されたヌクレオチドの存在は、センサーデバイスおよびシグナル処理システムが塩基１つごとに例えば標的配列中の塩基のメチル化を直接決定できるようにし得る、固有のコンフォメーション変化およびシグナルパターン中の対応するシグナルの特徴を生成し得る。このような標識を用いない直接配列決定方法は、ＤＮＡの全ての４つの塩基に対応する天然および／またはアナログ塩基の混合物を含むヌクレオチド塩基ミックスを使用するシーケンシング反応においてヌクレオチド特異的な取り込み事象の識別を可能にし得るが、連続的および／または周期的な様式で個々の天然またはアナログ塩基を逐次的に提供することを含むシーケンシングプロセスも使用できる。逆転写酵素をプローブ分子として使用することも同様に、中間のｃＤＮＡ変換ステップを必要とすることなくＲＮＡ分子の直接配列決定を可能にし得る。
様々な実施形態において、および上記で簡単に説明したように、プローブは、自己アセンブルリンカーを介して架橋分子に付着させることができる。自己アセンブルリンカーは、第１の生体分子を第２の生体分子に付着させるのに好適ないくつかの構造のいずれを含んでいてもよい。様々な実施形態において、自己アセンブルリンカーは、第１のリンカー成分と、第１のリンカー成分に相補的な第２のリンカー成分とを含んでいてもよい。第１のリンカー成分および第２のリンカー成分は、自己アセンブルにより接合させて、第１のリンカー成分の第２のリンカー成分に対する親和性に基づきアセンブルしたリンカーを形成してもよい。第１のリンカー成分は、例えば架橋分子と会合させることができ、第２のリンカー成分は、プローブと会合させることができる。プローブの架橋への自己アセンブルによって架橋分子上の予め決定された位置でプローブの架橋分子へのカップリングが起こるように、架橋分子と会合させたリンカー成分を、架橋分子中の特異的な部位に工学的に作製してもよい。プローブとの会合のために選択されたリンカー成分は、リンカー成分のサイズおよびそれがプローブにコンジュゲートされる位置の両方に関してプローブと標的との間の干渉を最小化するように構成されていてもよい。この方式で、相補的な第１および第２のリンカー成分を接合させることにより、プローブの架橋分子への機能的な付着を提供することができる。自己アセンブルリンカーは、アビジン（または他のアビジン様）タンパク質である第１のリンカー成分およびビオチン小分子である第２のリンカー成分を用いたビオチン−アビジンカップリングメカニズムを含んでいてもよく、これらの成分は、互いに強い非共有結合を形成する。他のアビジン様タンパク質としては、ストレプトアビジン、リザビジン（ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）、ブラダビジン（ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）、ニュートラビジン、他の様々なアビジンまたはストレプトアビジンのアミノ酸が改変された形態、およびビオチンが結合する官能基を保持するこのようなアビジンの２価またはモノマーの誘導体が挙げられる。様々な実施形態において、例えば、ビオチンは、架橋分子にコンジュゲートしていてもよく、ストレプトアビジンは、プローブ分子にコンジュゲートしていてもよい。自己アセンブルリンカーはまた、バイオコンジュゲーションに関する周知の「クリックケミストリー」メカニズムを含んでいてもよい。自己アセンブルリンカーはまた、抗原−抗体カップリングを含んでいてもよく、例えば架橋分子上に存在する抗原は、プローブ分子にコンジュゲートした抗体にカップリングする。自己アセンブルリンカーはまた、例えば、第１のリンカー成分であるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒペプチドおよび第２のリンカー成分であるＳｐｙＴａｇペプチドを含んでいてもよく、これら２つの成分は結合して、不可逆的な共有結合を形成する。当業者に現在公知の、または以降彼らによって考案され得るあらゆる配置における他のあらゆる自己アセンブルリンカーシステムが、プローブを架橋分子にカップリングするのに使用することができる。
様々な実施形態において、センサーは、架橋分子と異なるプローブ分子を含んでいなくてもよい。その代わりに、架橋分子それ自体は、標的分子によって作用を受けるように構成されていてもよい。例えば、架橋は、タンパク質結合部位、例えばキナーゼ結合部位などを含んでいてもよいし、標的タンパク質の架橋への結合および／または標的タンパク質による架橋の改変に基づいて、試料中の対応するタンパク質の存在および／または活性を検出するのに使用されてもよい。
ここで図６Ａおよび６Ｂを参照すれば、センサーのエンクロージャーを有するおよび有さない、部分的に製作されたセンサーデバイス６００の斜視図が例示される。センサーデバイス６００は、埋め込まれたゲート６４０を含む３端子センサーデバイスである。図６Ａに例示されているデバイス６００は、ＣＭＯＳ製作技術を使用して生産することができるセンサーデバイスの様々な特徴を含み、例えば、電極ギャップ６３０によって分離された第１の電極６０２および第２の電極６０３と共に、基板６４１および酸化物６４２の下に存在するゲート６４０などを含み、各電極には、接触部６０６／６０７が付着されている。架橋分子およびプローブを含む上述した様々なセンサー複合体成分の付着は、下流の自己アセンブルステップで実行されてもよい。様々な実施形態において、および図６Ｂで例示されるように、センサーを架橋および／またはプローブ分子を含む溶液と接触させることによってセンサーのアセンブルを完了させる前に、センサーデバイス６００はまず、センサーギャップ６３０を囲ったりまたはセンサーギャップ６３０の周りにフローセルを形成したりするように構成されたエンクロージャー６４３と共に構成されてもよい。同様に、エンクロージャー６４３は、例えばシーケンシング反応などのアッセイを実行するのにも使用することができる。エンクロージャー６４３は、別々に形成されて、デバイス６００を含む構造に付着させてもよい。
生体分子の検出および核酸塩基の識別
様々な実施形態において、例えばデバイス１００（図１）などの単一分子感知デバイスの動力学および動態を検出するための方法が提供される。本明細書で記載されるセンサーデバイスをモニターするのに、架橋分子を含むセンサー１０１の電気的なコンダクタンスの変化を測定するためのあらゆる方法を使用することができる。様々な実施形態において、約１０Ｖ未満の電圧が生体分子架橋分子を含むセンサーに印加されてもよく、以下でより詳細に説明される様々な実施形態では、約０．５Ｖの電圧が印加される。センサーを介して流れる電流は、集積回路１２０を使用して時間の関数として測定することができる。センサー複合体１０５における標的結合および／またはプローブによる処理事象（すなわち、酵素的プローブのケースでは酵素活性）は、センサー１０１の伝導性に対する変化をもたらし、測定された電流を変調させて、シグナルの特徴１２３を含む時間ｔにわたるシグナルパターン１２２を生成することができる。このような事象、ならびに構造的、化学的および電子的な変化などの関連するコンフォメーション変化（すなわち、酵素、基板、および周囲の溶液における電荷分布）は、標的の結合および処理の動態的な特徴を含んでいてもよく、様々な事象が、当業界において公知のシグナル処理技術を使用して測定、記録、識別、分析または保存できるシグナルの特徴１２３を含む電流の変動をもたらす。シグナルの特徴は、三角形、正弦波の形状を有するウェーブレットなどの様々な可能性のある形態のいずれかを含む場合もあるし、または任意の数のフーリエ成分を有する場合もある。例えば、センサーでプローブとして使用されるポリメラーゼは、鋳型塩基との別々の相互作用（すなわち、標的分子の特徴）および／または鋳型依存性のヌクレオチド取り込み（すなわち、ポリメラーゼ動態のシグネチャーは、鋳型塩基依存性である）のそれぞれにつきポリメラーゼ動態のシグネチャーを提供することができ、核酸鋳型の標的は、標的分子中の別個の位置に標的分子の特徴の配列を含み（すなわち、第１の、第２の、および第ｎの標的分子位置の第１の、第２の、および第ｎの標的分子の特徴）、それぞれの標的分子の特徴は、本開示に係るセンサーによる検出の間に対応するシグナルの特徴を生成する。ｎ個の標的分子の特徴は、一本鎖ＤＮＡ鋳型分子（すなわち、標的）のｎ個の連続した塩基に対応し得るものであり、この鋳型分子は、ポリメラーゼ酵素によって処理されて、これらのｎ個の標的分子の特徴に相補的ヌクレオチドを逐次的に取り込む。一連のシグナルの特徴を含むシグナルパターンの振幅、持続時間、および形状は、標的特異的なセンサー応答をコードする可能性があり、このような応答は、シグナルパターンをシグナル解釈マップと比較して標的の種類を決定するために、シグナル処理システム１２１を使用して分析することができる。シグナルの検出および分析の時間分解能を増加させることで、プローブ−標的相互作用の動態の変化性、遷移、および中間状態をさらに解明する能力を提供することができる。
ヌクレオチド取り込みの忠実度は正確な核酸シーケンシングにとって重要であるため、様々な実施形態において、シーケンシングの方法は、鋳型ベースのヌクレオチド取り込みのコンフォメーション変化を増加させるアナログ塩基に頼ることがあり、それによってよりクリアなシグナルが生成され、および／またはそれ以外の方法でアナログ塩基の取り込みを識別する強化された能力が提供され、それによって強化されたシーケンシング精度が提供される。鋳型依存性ヌクレオチド取り込みの動態または動的な識別を強化するのに使用できる非標識のアナログ塩基が周知であり、そのようなものとしては、プリンおよびピリミジン塩基、ならびにヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースおよびリン酸部分の改変を挙げることができる。特に、これは、追加の基をヌクレオチドのガンマ−リン酸に付加することを含んでいてもよく、これは、取り込み中に切り離されるため成長中の鎖およびそのポリメラーゼとの相互作用に永続的に影響を与えない大きい多様な分子の改変を受け入れる。
様々な実施形態において、方法は、核酸鋳型配列における改変されていないヌクレオチド塩基および改変されたヌクレオチド塩基の検出を提供することができる。例えば、方法は、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ４−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ホルミルシトシン、および５−カルボキシルシトシン塩基、ならびに損傷した鋳型配列の位置、例えば脱塩基部位などを含む改変された鋳型ヌクレオチドを区別するのに好適であり得る。理論に制限されることは望まないが、シーケンシング反応中に相補的核酸鎖へのヌクレオチドの取り込みを触媒するＤＮＡポリメラーゼは、鋳型鎖におけるヌクレオチドの種類に依存する方式で異なるポリメラーゼ動態を示す可能性がある。本開示に係るデバイスおよび方法を使用して、核酸鋳型におけるヌクレオチド塩基の種類は、取り込み事象に対応する電子シグネチャーの検出に基づきほぼリアルタイムで決定することができる。フルオロフォアで標識されたヌクレオチドの取り込みに関連する蛍光シグナルの検出に頼る他のシステムおよび方法とは異なり、蛍光ベースの検出試薬およびシグナル検出デバイスは必要なく、それによってコストとプロセスの複雑さが低減される。
様々な実施形態において、方法は、シグナルトレースからノイズを除去するステップを含んでいてもよい。ノイズを除去することは、例えば６０Ｈｚラインのノイズを除去するために、シグナルの処理を実行することを含んでいてもよい。シグナルトレースからノイズを除去することは、シグナルトレース解釈のエラーを低減することができる。図７に、シグナルから６０Ｈｚラインのノイズを除去する前（上のシグナルトレース）および除去した後（下のシグナルトレース）に、１２塩基の核酸鋳型をシーケンシングすることによって生成されたシグナルトレースの例を例示する。このようなノイズの特徴に応じて様々なノイズ除去方法を使用することができ、このような方法はシグナル処理分野の当業者に周知である。
様々な実施形態において、センサーに結合した標的の配列を決定するためのシグナルの処理は、正確な配列決定というより標的の種類の確率論的な決定を含んでいてもよい。実際の標的分子配列は、いくつかの可能性のある固有の配列の１つである可能性があり、それぞれの可能性のある固有の配列は、固有の理論上のシグナルを有する。標的分子配列の決定は、実験的に測定されたシグナルと、固有の理論上のシグナルのデータベースを含むシグナル解釈マップとの比較を必要とする場合がある。シグナル解釈マップは、公知の標的配列を使用して生成された訓練データセットまたはライブラリー、シグナルアーチファクト、例えばノイズ、不鮮明さ、ドリフトなどを低減させるための陽性および陰性対照の測定に基づくシグナルの処理、ならびに、機械学習および／または統計的方法、例えばニューラルネットワーク、クラスタリング、カーブフィッティング、モデルフィッティング、ベイズの推論などの適用に基づいて作成することができる。
センサーデバイスの製造およびアセンブル
本開示の様々な実施形態において、本明細書で記載される分子バイオセンサーデバイスを生産する方法が提供される。分子バイオセンサーデバイスを生産する方法は、ＣＭＯＳ製作プロセスと分子生物学的方法との組合せを含んでいてもよい。ＣＭＯＳ製作プロセスは、当業界において周知であり、例えばＦＥＴなどのデバイスを含む集積回路の商業的な規模の生産に好適な高解像度光リソグラフィー方法を含んでいてもよい。様々な実施形態において、ＣＭＯＳ製作プロセスは、個々のセンサーを含む集積回路を生産するのに使用することができ、このようなセンサーは、半導体ベース上に堆積させた第１の電極および第２の電極を有し、第１の電極と第２の電極とは正確に画定されたセンサーギャップによって分離されている。好ましい実施形態において、ナノ電極、ギャップおよび接触部のデザインは、ＣＭＯＳプロセス中に完全に製造できるように選ばれる。特に、これらのエレメントについて特定の単純な幾何学的配置が選ばれる場合、それらは、特定の製作施設、例えば主要な鋳造会社（例えば、ＴＳＭＣまたはＧｌｏｂａｌＦｏｕｎｄｒｉｅｓ）の製作施設などによって具体化されるような、位相シフトマスク、複数のパターン形成、ならびに現在および未来の１６ｎｍノード、１４ｎｍノード、１０ｎｍノード、７ｎｍノードおよび５ｎｍノードなどの最も高解像度でのＣＭＯＳ製作ノードを達成するのに使用される他の技術と組み合わされた、高解像度光リソグラフィー方法、例えばエクストリームＵＶ（ＥＵＶ）およびディープＵＶ（ＤＵＶ）ソースなどを使用して製作することができる。このようなプロセスは、例えば直線のセグメント、直線のカット、および円形のスポットなどのある特定の具体的なパターン特徴を作製することについて他に類を見ない程に高い解像度を有する。ナノ電極、ナノ接触部、および／またはギャップの幾何学的配置のデザインにおけるこれらのプロセス特異的な幾何的エレメントの使用は、関連するＣＭＯＳプロセスでの様々な実施形態によるセンサーデバイスの製作を容易にすることができる。しかしながら、一般的に、採用される製造技術はまた、非ＣＭＯＳプロセス方法、例えばｅ−ビームリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィー、またはミリングおよびエッチング技術、例えば集束イオンビームでのミリングおよびプラズマエッチングなどを含み得る。分子生物学的な製作方法は、特別にデザインされた自己アセンブル反応プロセスにおける、原子の配置に対する正確な制御を用いた望ましい架橋分子の合成、ならびに生体分子と上流のＣＭＯＳまたは他の製作方法プロセスで生産された電子センサーの構成要素および／または他の生体分子との相互作用およびカップリングを可能にするのに好適な条件下での、液相中のこのような生体分子の溶液の送達を含み得る。
様々な実施形態において、本明細書に記載されるセンサーデバイスを製造する方法は、集積回路マイクロチップの製造、センサー電極および／または接触部の製作、架橋生体分子の合成、架橋生体分子の電極および／または接触部へのアセンブル、プローブの架橋生体分子へのカップリング、ならびにセンサーデバイスのフローセルへの封入などのステップを含んでいてもよい。様々な実施形態において、センサーは、２端子の回路を含んでいてもよく、またはセンサーは、ゲートと共に３端子の回路を含んでいてもよい。様々な実施形態において、ゲートは、埋め込まれたゲート配置を有していてもよいが、横方向ゲートおよびｆｉｎＦＥＴ構造などの他のゲート配置も使用できる。
様々な実施形態において、電極、接触部、および／またはゲートは、導電性金属材料で構成されていてもよい。例えば、電極、接触部、および／またはゲートは、アルミニウム、チタン、クロム、銅、金、パラジウム、白金、および同種のものを含んでいてもよい。様々な実施形態において、電極、接触部、および／またはゲートは、半導体材料、例えばｎ型およびｐ型半導体電極を生産するのに使用できるドープ半導体材料などを含んでいてもよい。様々な実施形態において、電極および電極に付着した接触部は、同じ材料を含んでいてもよく、様々な他の実施形態において、接触部は、それが付着する電極と異なる材料を含んでいてもよい。
様々な実施形態において、電極は、あらゆる好適な構造的配置を有していてもよい。例えば、電極は全体的に長方形の断面を含んでいてもよいが、他の幾何学的および不規則な断面の輪郭が可能であり、本開示の範囲内である。様々な実施形態において、電極は、約３０ｎｍ未満、または約２５ｎｍ未満、または約２０ｎｍ未満、または約１５ｎｍ未満、または約１４ｎｍ未満、または約１３ｎｍ未満、または約１２ｎｍ未満、または約１１ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満、または約９ｎｍ未満、または約８ｎｍ未満、または約７ｎｍ未満、または約６ｎｍ未満、または約５ｎｍ未満、または約４ｎｍ未満、または約３ｎｍ未満の最大断面寸法（すなわち、電極の断面での電極の最大寸法）を有していてもよい。
同様に、様々な実施形態において、接触部は、あらゆる好適な構造的配置を有していてもよい。例えば、接触部は、全体的に半球状（ｓｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）または半球状（ｈｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）の断面の輪郭を含んでいてもよいが、他の幾何学的および不規則な断面の輪郭が可能であり、本開示の範囲内である。様々な実施形態において、接触部は、約２０ｎｍ未満、または約１５ｎｍ未満、または約１４ｎｍ未満、または約１３ｎｍ未満、または約１２ｎｍ未満、または約１１ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満、または約９ｎｍ未満、または約８ｎｍ未満、または約７ｎｍ未満、または約６ｎｍ未満、または約５ｎｍ未満、または約４ｎｍ未満、または約３ｎｍ未満の最大断面寸法（すなわち、接触部の断面での接触部の最大寸法）を有していてもよい。
様々な実施形態において、第１の電極および第２の電極は、交互にソースおよび／またはドレインと称することができ、様々な実施形態において、ソースおよび／またはドレインは、電極とは異なる構造的要素を含んでいてもよい。
製造方法は、基板表面上に第１の電極の位置および第２の電極の位置を画定するためにリソグラフィー方法を使用するステップを含んでいてもよい。第１の電極の配置および第２の電極の配置は、電極製作の完了時にそれらの間に正確に画定された電極ギャップが生じるように画定することができる。同様に、様々な実施形態において、製造方法は、第１の接触部の位置および第２の接触部の位置を画定するためにリソグラフィー方法を使用するステップを含んでいてもよい。第１の接触部の位置および第２の接触部の位置は、接触部の製作完了時にそれらの間に正確に画定された接触部ギャップが生じるように画定することができる。同様に、接触部は、画定された構造を用いて構成されていてもよい。バイオセンサーを製造するのに使用できる様々な方法は、以下でより詳細に説明される。
ここで図８を参照すると、電極を製作するためのリソグラフ方法８００が例示される。様々な実施形態において、製作方法は、マイクロチップ基板、例えば酸化ケイ素層８８１およびレジスト層８８２が重ねられたケイ素基板８８０から始めることができる。レジスト層は、あらゆる好適なレジスト材料、例えばポリ（メタクリル酸メチル）などを含んでいてもよい。本開示に係る製作プロセスにおいて、接着促進剤が使用されてもよい。例示された実施形態では、ｅ−ビームリソグラフィーを使用して、レジスト層を露光し、レジスト層中に第１の電極トラック８８３および第２の電極トラック８８４を画定する（ステップ８１０）。リソグラフィーステップの後、レジストを現像して（ステップ８２０）、リソグラフィーステップで画定された領域中のレジストを除去する。次に、堆積ステップ（ステップ８３０）を実行して、基板表面上に第１の電極８０２および第２の電極８０３を形成してもよい。例えば金属スパッタコーティングなどのあらゆる好適な材料および堆積方法を使用することができる。同様に、あらゆる好適な基板表面処理、例えば電極と基板との間に好適な結合を提供するための中間付着層の適用などを、堆積ステップの実行前に実行してもよい。様々な実施形態において、第１および第２の電極は、スパッタリング堆積方法を使用して金から製作される。堆積ステップ後、リフトオフステップ（ステップ８４０）を実行し、残存したレジストを除去して、基板表面上に配置された第１の電極および第２の電極を残す。
様々な実施形態において、例えば方法８００などのナノ電極を製作するためのリソグラフ方法は、高度に正確な電極の配置を達成することができる。例えば、電極を、一貫した長さ、幅、および厚さの仕様で構成することができる。様々な実施形態において、電極は、約１０ｎｍから約４０ｎｍの間の幅、例えば約２０ｎｍの幅を有していてもよい。同様に、第１の電極および第２の電極によって画定された電極ギャップを、正確な電極ギャップ寸法で構成することができる。様々な実施形態において、電極ギャップ寸法は、約３ｎｍから約３０ｎｍの間であり得る。例えば、様々な実施形態によるセンサーにおける電極対ごとの電極ギャップは、約３ｎｍから約３０ｎｍの間、または約４ｎｍから約２５ｎｍの間、または約５ｎｍから約２０ｎｍの間、または約６ｎｍから約１７ｎｍの間、または約７ｎｍから約１５ｎｍの間であり得る。様々な実施形態において、電極ギャップは、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約１１ｎｍ、約１２ｎｍ、約１３ｎｍ、約１４ｎｍ、または約１５ｎｍの寸法で製作することができる。当業者には明らかであるように、上述した様々な方法のステップは、ＣＭＯＳ製作および／または他のミクロ電子工学による製作方法を使用したセンサーデバイスの商業的なスケールでの生産に適したプロセスで、高密度かつ高度に正確な物理的な仕様で、複数の電極対を並行に生産するのに使用することができる。
理論に制限されることは望まないが、電極ギャップ（またはセンサーギャップ）を上述したような電極ギャップ寸法で有するセンサーを提供することは、センサーの性能および／または製作に関して様々な利点を提供することができる。例えば、約３ｎｍ未満の寸法を有する電極ギャップの場合、溶液（すなわち、試料環境）およびバルクを通る電流伝導の疑似的なソースが増加し始め、追加のノイズを生じる。加えて、このようなギャップは、例えば酵素などの様々な目的のプローブ分子を収容するほど十分に大きくない可能性がある。さらに、このようなギャップは、現在のＣＭＯＳ製造能に適合しない。例えばバイオポリマーまたは化学的に合成された分子を使用することによって約３０ｎｍより大きい電極ギャップにとって原子的に正確な仕様を有する架橋分子を製造するコストと複雑さは実質的に高まり、様々な架橋分子の剛性は、長さが約３０ｎｍを超えると共に減少する可能性がある。同様に、多くの分子の伝導性が、それらの長さを超えると実質的に有用なパラメーター未満に低下し、それより大きい長さもまた高密度アレイにセンサーを緊密にパッキングする能力を制限する。したがって、約３ｎｍから３０ｎｍの範囲の電極ギャップを有するセンサーが、センサーデバイスの機能、製造可能性、拡張性および経済性に関してある特定の利点をもたらす可能性がある。
図１１Ａ〜１１Ｃに、上述した方法に従って製作されたセンサーデバイスの例を例示し、それぞれ３７倍、５０００倍、および５０，０００倍の倍率でのセンサーデバイス１０００の表面の走査型電子顕微鏡写真を示す。センサーデバイス１０００は、２０個のセンサーごとのナノ電極およびナノ接触部、ならびに外部の電流計に接続するためのリードおよびパッドを含む。図１１Ａにおいて、基板表面上に位置するパッドおよびリードが明確に視認できる。センサー電極は、図１１Ｂの中心でより明るい垂直のバンドとして現れる。図１１Ｃにおいて、第１の電極１１０２および第２の電極１１０３は、第１の電極と第２の電極との間に画定された電極ギャップ１１２０と共に明確に見ることができる。
様々な実施形態において、およびここで図９を参照して、生体分子感知デバイスを製造する方法は、接触部の位置を製作および／または決定するためのリソグラフ方法９００を含んでいてもよい。様々な実施形態において、製作方法は、その上に第１の電極８０２および第２の電極８０３が配置された基板を含むマイクロチップから始めることができる。マイクロチップは、酸化ケイ素層８８１および好適なレジスト層９８２が重ねられたケイ素基板８８０を含んでいてもよい。例示された実施形態では、ｅ−ビームリソグラフィーを使用して、レジスト層を露光して、レジスト層中に第１の接触部の位置９８５および第２の接触部の位置９８６を画定する（ステップ９１０）。様々な実施形態において、接触部の位置は、例えば電極ギャップに隣接する電極の遠位端付近に第１の電極および第２の電極の一方が重ねられるように画定することができる。接触部に関して画定されたサイズおよびパターンは、後述するような後続のプロセスステップで形成される接触部のサイズおよび形状の決定に寄与する可能性がある。リソグラフィーステップの後、レジストを現像して（ステップ９２０）、リソグラフィーステップで画定された接触部の位置中のレジストを除去する。次に、堆積ステップ（ステップ９３０）を実行して、第１および第２の電極表面上に第１の接触部９０６および第２の接触部９０７を形成してもよい。電極の場合と同様に、あらゆる好適な材料および堆積方法を使用することができる。同様に、あらゆる好適な基板表面処理、例えば電極と基板との間に好適な結合を提供するための中間付着層の適用などを、堆積ステップの実行前に実行することができる。接触部は、電極とは異なる材料を含んでいてもよいし、または接触部は、電極を製作するのに使用される同じ材料を含んでいてもよい。様々な実施形態において、第１および第２の接触部は、電気化学析出法を使用して金から製作される。堆積ステップ後、リフトオフステップ（ステップ９４０）を実行し、残存したレジストを除去して、第１および第２の電極の表面上に配置された第１の接触部および第２の接触部を残す。
交互に、様々な実施形態において、接触部を製作するための方法は、予め形成された接触部のナノ粒子の堆積を含んでいてもよい。予め形成された接触部のナノ粒子は、レジスト層中に形成され、接触部のナノ粒子を受け入れてそれを接触部の位置に配置させるように構成された空隙に堆積させてもよいし、または接触部のナノ粒子は、接触部の位置での付着を達成するための化学的誘導体化層を使用して堆積させてもよい。
図１０に例示されているように、レジスト層中に形成された空隙に予め形成された接触部粒子を堆積させる方法１０００は、ステップ９１０および９２０に関して、方法９００について上述した同じステップを含んでいてもよい。予め形成された接触部粒子を受け入れるように構成された空隙を作り出した後、複数の予め形成された接触部粒子１０８７を含む溶液をデバイスと接触させ（ステップ１０３０）、圧力、混合、表面張力、浮力、遠心力、または空隙に粒子を導入する他の方法を使用して粒子を空隙に堆積させることができる。粒子の堆積後、過量の溶液および粒子を除去してもよい。ステップ９４０に関して上述したように残存したレジストを除去するためにリフトオフステップを実行してもよいし、それに続いて、強く付着した第１および第２の接触部（１００６、１００７）を形成するために必要に応じて、予め形成された接触部粒子を任意選択で電極にアニールさせてもよい。
代替として、化学的誘導体化処理を使用して予め形成された接触部のナノ粒子を堆積させる方法は、図９に例示した方法に関して上述したステップ９１０および９２０に類似したステップを含んでいてもよい。例えば、ケイ素基板表面に適合する１つのこのような広く使用されている表面誘導体化は、シラン化であり、これは、基板表面を、例えばアミノシラン（例えば、ＡＰＴＥＳ）またはメルカプトシラン（例えば、ＭＰＴＥＳ）などの分子でコーティングすることを含み得る。これらの分子はケイ素表面に接着し、次いでそれらの露出した末端が、例えば金ナノ粒子などの他の材料と容易に架橋を形成して、それらを表面に結合させる。次いで、ステップ９３０に類似したステップにおいて、接触部の金属または他の材料を堆積させることよりも、このような誘導体化処理を適用することができる。ステップ９４０に類似したリフトオフステップを実行した後、第１の電極および第２の電極は、第１の接触部および第２の接触部の付着が意図された位置に表面誘導体化を含むようになる。誘導体化された電極表面を含むデバイスは、複数の予め形成された接触部粒子を含む溶液と接触させることができる。粒子は、誘導体化された電極表面に相補的であるか、またはそれ以外の方法で特異的に結合する表面またはコーティングを有していてもよく、それによって接触部粒子は、画定された接触部の位置に配置される。必要に応じて、誘導体化処理およびあらゆる粒子コーティングを除去ステップで除去して、予め形成された接触部粒子を上述したように電極にアニールさせてもよい。このアプローチの例は、金ナノ粒子に特異的に結合させるためのＡＰＴＥＳでコーティングされたケイ素表面の使用である。
様々な実施形態において、接触部の構造は、例えば原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）の使用によって、または過量のビーズの堆積とそれに続く不要なビーズのＡＦＭ除去によって、金ナノ粒子ビーズを電極上に位置させることなどの様々な直接的な手段によって作り出すことができる。
様々な他の実施形態において、接触部の構造および／または電極ギャップは、例えば集束イオンビーム（ＦＩＢ）ミリングを使用することによる材料の除去を介してその場で形成することができる。例えば、電極ギャップを、ＦＩＢを使用して前もって確立した連続的な金属ナノワイヤーに刻み付け、それによって電極ギャップの形成と同時に第１の電極および第２の電極を作り出すことができる。
センサーまたはセンサーアレイの電極および接触部を製作した後、センサーに液状の溶液を制御して導入することを可能にするのに好適なフローセルまたは類似のデバイスに、センサーを封入してもよい。センサーチップをフローセルに封入することは、典型的にはＰＤＭＳまたは他のポリマーもしくはプラスチックからフローセルを成形すること、およびこれを使用してチップを包み込むことによってなされ、それにより、製作された電極および接触部は、架橋およびプローブのアセンブル、ならびにそれに続く完成したセンサーを使用したアッセイに好適に曝露されたままになる。様々な実施形態において、表面の不動態化処理を基板表面および曝露された電極の一部に適用して、液体試料との接触により生じる可能性がある電気的なノイズを低減することができる。不動態化処理は、電極および／または接触部を未処理のセンサーギャップ領域中に残すのに適用される場合がある。例えば様々な実施形態において、センサーギャップが並べられた幅３０ｎｍの領域が未処理のままであってもよい。不動態化処理は、センサーチップをフローセルで封入する前に実行されてもよい。様々な実施形態によるセンサーは、約０．５Ｖの電圧が印加される場合、約１ｐＡ未満、または約０．９ｐＡ未満、または約０．８ｐＡ未満、または約０．７ｐＡ未満、または約０．６ｐＡ未満、または約０．５ｐＡ未満、または約０．４ｐＡ未満、または約０．３ｐＡ未満、または約０．２ｐＡ未満の電子ノイズを有していてもよく、センサーは、別の状況では酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ酵素の活性を支持するのに好適な低いイオン強度の緩衝溶液に浸される。
バイオポリマー架橋の製作は、ｉｎ ｖｉｖｏでの合成方法、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素による合成方法、化学合成方法、またはそれらのあらゆる組合せなどのバイオポリマー分子を合成するのに使用できる様々な方法のいずれかによって実行することができる。本開示に従って架橋分子として使用するのに好適なバイオポリマー分子を生産するための様々な方法は、当業者に周知である。同様に、バイオポリマー架橋分子を誘導体化または改変して、本明細書に記載されるようなアンカーまたはリンカー成分を提供するための方法も、同様に周知である。本明細書に記載される様々な特異的なバイオポリマー架橋分子は、一例として提供されたものであり、本の開示の範囲を限定すると解釈されるべきではなく、合成架橋分子は、本開示の様々な実施形態に従って使用することができる。
様々な実施形態において、バイオポリマー架橋分子のプローブへの付着は、自己アセンブルの化学反応によって実行され得る。同様に、バイオポリマー架橋分子の電極または接触部への付着も、自己アセンブルの化学反応によって実行され得る。このような自己アセンブル反応は、付着させようとする２つの成分を、成分の少なくとも１つを含む溶液を介して互いに接触した状態にすることによって実行され得る。様々な実施形態において、バイオポリマー架橋のプローブへの付着は、電極または接触部への架橋の付着の前、その後、またはそれと同時に実行されてもよい。類似の検討が、合成化学によって生産された架橋分子に適用される。
様々な実施形態において、センサーデバイスを作製する方法は、バイオポリマー架橋分子を第１の電極および第２の電極にアセンブルするステップを含む。架橋分子のアセンブルステップは、自己アセンブルステップを含んでいてもよい。自己アセンブルは、第１および第２の電極を含む部分的に構築されたセンサーデバイスを、架橋分子を含む溶液と接触させることによって実行されてもよい。架橋分子は、架橋分子の第１の端部および第２の端部と第１の電極および第２の電極との間の親和性に基づき、第１の電極および第２の電極に自己アセンブルする（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅ ｔｏ）ことができる。様々な実施形態において、実施例２で後述するように、および図１３〜１５を参照すれば、センサー構成要素の自己アセンブルは、センサーデバイスによって電子的にモニターすることができる。電子的なモニタリングは、品質制御機能を提供して、適切にアセンブルしたデバイス中のセンサーを確認するのに役立つ可能性がある。予め決定されたパラメーター内のアセンブルプロセスシグナルを提供しないセンサー回路からのシグナルは、例えばそのデバイスで実行されるシーケンシング分析などの下流の分析で無視される場合がある。
（実施例１）
バイオポリマー架橋の自己アセンブル
端部から端部までの長さが約２０ｎｍの二本鎖ＤＮＡバイオポリマー架橋分子を、５’−チオール改変を含む配列番号１に記載のオリゴと、５’−チオール改変および内部のビオチン改変を含む配列番号２に記載のオリゴとを使用して構築した。架橋分子を、可視化の目的でストレプトアビジン−金タグを使用して標識した。接触部の対がそれぞれ中心から中心に約２０ｎｍの接触部ギャップを画定する金接触部の対を堆積させるために、ｅ−ビームリソグラフィー技術を使用して、金ナノ粒子接触部の試験アレイ１２００（図１２）を製作した。金で標識した架橋分子を含む緩衝液を、金ナノ粒子接触部の試験アレイと接触させて置いた。短いインキュベーション期間の後、過量の溶液を除去し、アレイを洗浄して、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって画像化した。図１２に、金接触部１２７０および金タグ１２７１のアレンジメントを示すＳＥＭ画像を例示する。数個の接触部対（矢印で示される）につき、金タグ１２７１が接触部対間に配置されているのがわかり、これは、接触部対への生体分子架橋分子の自己アセンブルが成功していることを示す。
（実施例２）
自己アセンブルステップの検出
中心から中心に約２０ｎｍの接触部ギャップを有する電極に付着した金接触部を含む単一のセンサーを有するセンサーデバイスを、ｅ−ビームリソグラフィー技術を使用して製作した。フローセル内部の第１の端部への液体の導入およびフローセルの第２の端部からの液体の除去が許容されるようにいずれの端部も開いていた幅１ｍｍ×高さ０．４ｍｍのチャネル、ならびにセルをセンサーと接触させる溶液を含むＰＤＭＳフローセルに、センサーを封入した。フローセルチャネルを、センサーを含む電極の方向に対して直角に配向し、センサーは、フローセルチャネルの長さのおよそ中央に位置させた。フローセルに低いイオン強度の緩衝溶液を導入し、それに続く二本鎖ＤＮＡ架橋分子の導入および自己アセンブル（実施例１で上述した通り、ただし金タグなしで）（図１３）、ストレプトアビジンタグを有するクレノー断片の導入および結合（図１４）、５０塩基のプライミングされた一本鎖ＤＮＡ分子の導入および結合（図１５）、ならびにクレノー断片による鋳型ベースの合成を開始させるためのｄＮＴＰミックスの導入（図１６）の連続的なステップにわたり、センサーに０．５Ｖの電位を印加した。ＤＮＡ鋳型分子の配列は、ポリＡ領域を特徴とする以下のオリゴ配列：
５’−ｃｇｃ ｃｇｃ ｇｇａ ｇｃｃ ａａｇ ａａａ ａａａ ａａａ ａａａ ａａａ ａａａ ａａ ｔｔｇｃａｔｇｔｃｃｔｇｔｇａ−３’
を含み、
使用されたプライマーは、
３’−ａａｃ ｇｔａ ｃａｇ ｇａｃ ａｃｔ−５’
であった。
加えて、ポリＡトラクトがポリＣ、Ｇ、およびＴトラクトで置き換えられた類似の配列を使用して、異なる鋳型塩基の作用を調査した。
図１３に例示されているように、測定された電流は、３秒間にわたり上昇する。シグナルトレースにおける２つの屈曲点（ＡおよびＢ）は、５’−チオールで改変された末端塩基アンカーの第１および第２の接触部への結合に対応すると考えられる。ストレプトアビジンタグを有するクレノー断片を含む溶液を導入した後のシグナルトレース（図１４）は、約１．５秒で電流の鋭い増加を示し、これは、クレノー断片酵素のストレプトアビジンリンカー成分がバイオポリマー架橋のビオチンリンカー成分と接触および結合することに対応する可能性が高い。図１５において、鋳型鎖をフローセルに導入した後に、シグナルトレース中に鋭いシグナルピークが存在し、このピークは、クレノー断片による鋳型結合に対応すると解釈される。ＤＮＡ塩基に関する全てを含むｄＮＴＰミックスの導入後に測定されたシグナルトレースは、図１６で例示されており、同様に約１秒で別個のシグナルの特徴を示す。これは、ポリメラーゼ酵素からの合成された二重鎖の解離を表す可能性があり、約０．７秒から約０．９５秒のシグナルトレースは、結合した鋳型ＤＮＡに基づくヌクレオチド取り込みに応答してセンサーによって生成された動態のシグネチャーに対応する可能性がある。
（実施例３）
ヌクレオチド塩基取り込みの検出
バイオポリマー架橋分子およびクレノー断片プローブを含むセンサーデバイスを、実施例２で上述したように製作してアセンブルした。センサーデバイスを使用して、様々な長さおよび配列組成の一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して実行されたＤＮＡ合成反応に応答するシグナルトレースを生成した。図１７は、単一塩基の取り込みを提供する鋳型配列に関するシグナルトレースを例示する。０．５秒におけるシグナルの特徴は、クレノー断片の鋳型依存性活性および塩基取り込みに対応すると解釈され、０．６秒の直後のそれよりかなり弱いシグナルの特徴は、システム中のノイズのある形態または疑似的なシグナルに対応すると解釈される。図１８は、様々な鋳型トラクトのシグナルトレースを例示する。例示された反応には、実施例２で上述した鋳型およびプライマーを使用した。
上および下のシグナルトレースは、センサーにｄＮＴＰ非含有の緩衝液が導入される対照実験である。第２、第３、および第４のシグナルトレース（上から下へ）は、生成されたシグナルが２０、３、および１２の取り込み事象に起因するように、溶液へのｄＴＴＰ導入（鋳型の２０Ａ塩基によって指示される２０の取り込み事象が起こることが予測される）、それに続くｄＣＴＰの添加（３’から５’への鋳型中のＧＡＡの三つ組によって指示される別の３つの取り込みが予測される）、それに続くｄＮＴＰの添加（鋳型の残存する１２塩基を指示された通り重合させることが予測される）に応答して生成された。各シグナルトレースにつき矢印間に位置するシグナルの特徴を含むシグナルトレースは、鋳型依存性酵素活性によるシグナル変調に対応すると解釈される。これらの撹乱されたシグナル領域の相対的な持続時間は、予測される２０：３：１２の比率であり、第３のこのようなトラクトは、１２の別々の取り込み事象に対応する可能性がある明確なスパイクを示す。図７は、上述したデバイスおよび上述した鋳型を１２の対になっていない鋳型塩基と共に使用して実行されたＤＮＡ合成反応によって生成されたシグナルトレースの追加の例を例示する。これらの結果は、様々な実施形態によるセンサーが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼプローブ活性に応答したシグナルの特徴を含むシグナルトレースを生成できることを実証する。これもまた、シグナルの明瞭化におけるノイズ除去の価値を実証しており、図７の上のパネルは、未加工の測定されたシグナルであり、下のパネルは、ノイズを除去するためのシグナルの処理を受けたものであり、このケースでは特定の６０Ｈｚラインのノイズがバンドパスフィルターで消去された。
（実施例４）
メチル化された鋳型塩基の検出
バイオポリマー架橋分子およびクレノー断片プローブを含むセンサーデバイスを、実施例２で上述したように製作してアセンブルした。センサーデバイスを使用して、シトシンおよび５−メチルシトシンで改変されたヌクレオチドの両方を含む一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して実行されたＤＮＡ合成に応答するシグナルトレースを生成した。鋳型配列は、配列５’−１３×（Ｎ）−５×（ＧｍＣ）−５×（ＧＣ）−Ｇ−３’（すなわち、５’−ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＧｍＣ ＧｍＣＧ ｍＣＧｍＣ ＧｍＣＧ ＣＧＣ ＧＣＧ
ＣＧＣ Ｇ−３’（配列番号１２）、式中Ｎは、任意の標準ヌクレオチドであり、ｍＣは、５−メチルシトシンである）を有する対になっていない塩基ヌクレオチドを含んでいた。この鋳型配列は、配列５’−Ｃ−５×（ＧＣ）−５×（ＧＣ）−１３×（Ｎ）−３’（すなわち、５’−ＣＧＣ ＧＣＧ ＣＧＣ ＧＣＧ ＣＧＣ ＧＣＧ ＣＧＣ ＮＮＮ
ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ Ｎ−３’（配列番号１３））を有する相補的な合成鎖を生成するようにデザインされ、下線で示したグアノシン塩基は、鋳型鎖中の５−メチルシトシンで改変されたヌクレオチドの位置に対応する。センサーに０．５Ｖを印加し、水、緩衝液、ｄＣＴＰの緩衝液、ｄＧＴＰの緩衝液、および４つ全てのｄＮＴＰ塩基のミックスを含む緩衝液の逐次的な導入およびそれらとのインキュベーションの経過にわたり電流を測定した。この予測される結果は、単一のｄＣＴＰ取り込み事象、次いで２０個のｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ取り込み事象であり、２０個の取り込み事象のうち最初の１０個は、改変されていないシトシン塩基に対するものであり、後者の１０個は、５−メチルシトシンで改変されたヌクレオチドに対するものである。メチル化の検出は、これらの２０個の事象のうち第２の１０個におけるシグナルの異なる特徴として出現する。
図１９に、各試薬とのインキュベーション中に生成されたシグナルトレースを例示する。水および緩衝液とのインキュベーションは、極めて低いベースラインの電流を生成し、変動はほとんどなかった。ｄＣＴＰを含む溶液の添加は、鋳型リード塩基Ｇに対するｄＣＴＰの単一の塩基取り込みに対応する鋭い配列特徴を生成した。ｄＧＴＰの添加は、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの両方を含む溶液を作り出し、鋳型鎖における、改変されていないヌクレオチドに対応する１０個の塩基取り込みを介した合成、それに続く５−メチルシトシン塩基に対応する１０個の塩基取り込みを介した合成を許容した。このインキュベーション期間中に生成されたシグナルトレースは、約０．３５秒から約０．５秒にわたるより高い電流を有するシグナルの特徴、それに続く約０．５秒から約０．６５秒にわたるより低い電流を有するシグナルの特徴を示す。このシグナル振幅のシフトは、ポリメラーゼに対する鋳型配列のメチル化状態の作用とその結果生じるシグナル変調に応答するセンサーシグナルにおける別個の変化として解釈される。この証拠は、シーケンシング反応の間に標的配列中の改変されたヌクレオチドの存在を直接区別する本開示の様々な実施形態によるセンサーの能力を裏付ける。
（実施例５）
長いＤＮＡ鎖読取りにわたるシグナルの検出
バイオポリマー架橋分子およびクレノー断片プローブを含むセンサーデバイスを、実施例２で上述したように製作してアセンブルした。センサーデバイスを使用して、ファイＸ１７４バクテリオファージのゲノム由来のおよそ５４００ｂｐの鋳型配列を含む一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して実行されたＤＮＡ合成に応答するシグナルトレースを生成した。実験的シーケンシング反応にはｄＮＴＰミックスを供給し、一方で対照反応にはｄｄＮＴＰ（ジデオキシヌクレオチド三リン酸）ミックスを供給した。ｄｄＮＴＰミックスは、このようなジデオキシターミネーターの１つの取り込み後に重合プロセスを終わらせるため、本質的にシーケンシングの感知シグナルは生じないはずである。時間２０ミリ秒のサンプリング分解能でデータを獲得した。これは、個々の取り込みスパイクを観察するには粗すぎるが、１秒当たりおよそ２０塩基の予測される酵素速度で重合プロセス全体を観察するには十分な長さの３００秒にわたるタイマー期間でデータを収集することができた。
図２０は、ｄＮＴＰミックスを用いた実験反応によって生成されたシグナルトレース（上のシグナルトレース）の、ｄｄＮＴＰミックスを使用した対照反応のシグナルトレース（下のトレース）との比較を例示する。実験的なシーケンシング試行のシグナルトレースは、対照反応には存在しないいくつかの別個のグロスのシグナルの特徴（矢印で指摘）を含んでおり、対照反応より高い電流も生成した。示された１００秒間にわたり生成されたシグナルトレースから、本開示の様々な実施形態によるセンサーは、長い鋳型配列の場合の長期のシーケンシング試行の経過にわたり、ＤＮＡポリメラーゼプローブの鋳型ベースのヌクレオチド取り込み活性に応答して検出可能なシグナルを生成するのに好適であり得ることが示唆される。したがって、このようなセンサーが処理できる長さまたは鋳型に対する直接的な制限がない。
（実施例６）
分子架橋の自己アセンブリ
この実施例は、分子エレクトロニクス回路のための分子架橋の構成要素を製造する新しい方法を教示する。ナノ−スケールの電気回路に架橋分子を挿入することは、分子エレクトロニクスの分野において共通する製作上の問題である。典型的には、分子エレメントは、図２２で示されるように、２つの電極間に接続される。分子エレクトロニクスにおける共通する問題は、例示されているように、電極間に所与の分子回路のエレメントをアセンブルすることである。最終的なデバイスは、電極と架橋を形成する分子との間における良好な機械的な接続と良好な電気的な接続の両方を必要とする。また、任意の手作業でのアセンブルを非現実的なものにするナノスケールサイズと多数の電極対のために、デバイスがこの架橋された構成に自己アセンブルすることも好ましい。
この実施例の目的は、分子エレクトロニクス用途のための分子架橋構造を提供することである。これらは、様々なエレクトロニクス使用をもたらす電極にわたる正確な自己アセンブル回路のエレメントである。これは、物質の具体的な組成物、これらを確立するための製造、およびこれらの構造の品質を確実にすることに関する方法を含む。これは、このような架橋分子システムの具体的な好ましい実施形態を含む。
この実施例は、回路のクラスを確立するための具体的なシステム、およびその具体的な好ましい実施形態を教示する。これを解決する好ましい方法は、高度に局在化した正確に配置された材料の粒子またはパッチを導入することであり、このような粒子またはパッチは、本明細書ではナノ「接触ポイント」と称され、自己アセンブリをガイドする必要性の一部または全てを満たし、機械的および電気的な接続をもたらす。これらの目的のためのこのような接触ポイントの使用は、図２３で例示される。この目的のために、接触ポイントは、（ｉ）標的分子上のコンジュゲート基と選択的に結合する；（ｉｉ）高度に空間的に局在化されている；（ｉｉｉ）望ましい位置に正確に配置されている；および（ｉｖ）基板の適所に結合している好適な材料で作製される。図２３で例示されているように、接触ポイント「Ａ」は、正確な自己アセンブリをガイドし、電気的または機械的な接続を提供することができる空間的に局在した正確に配置された材料エレメントである。図２３の左側に、接触ポイント「Ａ」を電極に付加し、次いで分子エレメントを付着させる基本的ステップを示す。最終結果は、図２３の右側に示される望ましい回路である。エレメント「Ｂ」は、接触ポイント「Ａ」に選択的に結合することが可能な、架橋を形成する分子上のコンジュゲート基である。
これに必要な接触ポイント−架橋分子システムの主要な特性は、（１）接触ポイントが、高度に空間的に局在化されていること（「小さい」または「点状」）；（２）接触ポイントが、正確に予め規定された特異的な位置を有すること；（３）接触ポイントが、その機能的な役割を支持する正しい材料の構成で作製されていること；および（４）架橋分子が、接触ポイントに特異的に結合する両方の端部上にコンジュゲート基と共に構築されていることである。
同じ特性は、直接的に、または足場の支持のように間接的にのいずれかで、様々なナノ電気機械的なデバイスのアセンブリの指示において役割を果たすことなど、ここで示された回路構築の単なる例より広い有用性を有する。
このような接触ポイント／架橋分子システムは、内部接触部をさらに有していてもよく、その場合、それに続く分子が付着して、ｉｎ ｓｉｔｕで行われると最も有効な一連のアセンブルステップを介してより複雑な分子構築物を形成することができる。図２４に、電極上および架橋分子内部の接触ポイントによって指示されるこの一連のアセンブルステップを示す。図２４で示されるように、追加の接触基「Ｃ」は、一連のアセンブルステップにおいて、一次架橋分子へのコンジュゲート結合部位「Ｅ」を有する追加の分子構成要素「Ｄ」で特異的に結合するために使用される。特に、ｉｎ ｓｉｔｕで実行される場合、これらのアセンブルステップを、基礎となる回路を用いて電子的にモニターして、適したアセンブリがいつ達成されたか／適したアセンブリが達成されたかどうかを知る手段を提供することができる。図２５に、デバイス内部の電流を介したこのアセンブルのモニタリングを示す。図２５は、電流におけるスパイクがどのようにセンサーデバイスの自己アセンブリにおける各ステップに関連するかを例示する。アセンブリをモニターする能力は、基礎となる回路の電流を感知する特性と組み合わされたｉｎ ｓｉｔｕのアセンブルプロセスの利点である。一般的に、本実施例は、所与の電極につき：（ｉ）電極上にナノ接触ポイントが確立され；（ｉｉ）接触ポイント間のギャップをつなぐことが可能な架橋分子の２つのポイントに、コンジュゲート特異的な結合基が提供され；（ｉｉｉ）コンジュゲート特異的な結合基を有する架橋分子中で、内部結合基が識別され；（ｉｖ）架橋に付着させる他の分子エレメントが、コンジュゲートを特異的に付着させており；（ｖ）一次架橋結合および二次分子結合を含む一連の結合事象が、電極上ｉｎ ｓｉｔｕで実行され；（ｖｉ）印加された電圧下における回路中の内部電流を追跡することによって、結合事象を完了に関してモニターするシステムを提供する。
特に、接触ポイントは、材料特異的な結合を自己アセンブリを指示するのに使用できるように、第２の材料を含む電極上に任意の製作手段によって堆積させた第１の材料のビーズであり得る。本明細書において、非類似の材料は、例えば「材料１」および「材料２」と称される場合がある。
特に、ビーズは、金属製であってもよく、好ましい実施形態においてビーズは、金である。このケースにおいて、架橋分子上の基は、遊離のチオール基に還元することができ（例えば活性化、ジスルフィドの切断を介して、または一時的に）、次いで特異的な周知のチオール−金結合で連結されるチオール置換基（−ＳＨ）、またはスルフィド基を含有する任意の基であり得る。
加えて、金ならびに金属および半導体材料を含む他の材料にも結合する周知の短いペプチドがある。接触部のビーズ材料１にこのようなペプチドを考慮する場合、架橋は、接触ポイントをつなぐことができる２つの別個の「末端」部位に２つのこのようなペプチドドメインを有する任意のタンパク質であり得る。次いでペプチド−材料の結合は、特異的な接触ポイントの結合をもたらすことができる。特に、架橋分子が操作されたタンパク質である場合、それは、好ましくは外部の結合にペプチドをより利用しやすくするリンカー基を用いて、これらのペプチドを直鎖状の配列に操作したものであり得る。好ましいリンカー基は、ＧＳまたはＧＧＧＳなどのグリシンおよびセリンリッチなペプチドリンカーである。このようなペプチドは、タンパク質架橋を形成する単一の鎖上、またはアセンブルして多重鎖タンパク質を形成することができる複数の鎖上の２つの部位に操作することができる。
１つの好ましい実施形態は、金ビーズが、電極材料２と異なる接触部材料１として確立されている特異的なシステムからなる。金は、システインで終結したペプチドとの誘導体であり、これは、スペーサーおよびリンカーをさらに含有し、次いで特異的な免疫グロブリン（Immunoglobin）−Ｇ（ＩｇＧ）抗体、または少なくとも２つの同じように結合するアームを有する他の任意の抗体が存在するペプチド抗原で終結している。システインは、チオール連結によって金に特異的に結合する。次いで、ペプチド抗原に特異的な抗体が結合して、金ビーズ接触部間に架橋を形成することができる。さらに、このシステムにおいて、他の任意のタンパク質、例えば酵素に架橋されている抗ＩｇＧ抗体は、追加の分子構成要素に特異的に結合する役割を果たすことができる。具体的な好ましい実施形態の場合、誘導体化ペプチドは、ＧＳリッチなフレキシブルなリンカーを含むＣＡＬＮＮペプチド、それに続いて「ＦＬＡＧタグ」抗原ペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）からなっていてもよく、例えばＣＡＬＮＮＧＳＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫである。このペプチドは、商業的に利用可能な、十分に確立された抗ＦＬＡＧ ＩｇＧ抗体を有し、これは、この具体的な状況において、これらの金−ペプチド接触ポイントに対して自己アセンブルする分子架橋を形成する。例えばこれがマウス抗ＦＬＡＧ抗体である場合、抗マウスＩｇＧ、例えばヤギ抗マウスＩｇＧは、架橋に特異的に結合し、架橋にカップリングされることが望ましい他の任意のタンパク質に架橋させることができる。
別の好ましい実施形態は、接触ポイント材料が各電極の端部におけるナノ製作によって確立された金ビーズを含み、架橋分子が、いずれかの末端に１または２つのチオール基が存在するように各一本鎖の５’および／または３’末端に改変されたヌクレオチド（チオール化されたヌクレオチド）として統合されたチオール基を有する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を含む実施形態である。追加のチオール化されたヌクレオチドは、より多くのチオール−金の連結をもたらすようにｄｓＤＮＡの末端の近傍に存在していてもよい。これは、架橋分子フレームワーク中で優先的に自己アセンブルする。加えて、単一のビオチン化ヌクレオチドは、ｄｓＤＮＡの内部に、優先的には１つの鎖の中央の塩基に、特異的に取り込まれ得る。これは、ストレプトアビジン分子（天然の、または変更された）のための特異的な連結部位を提供する。ストレプトアビジンは、他の任意の望ましいタンパク質、例えば酵素に架橋されて、このシステムの二次カップリング分子を形成することができる。
別の好ましい実施形態は、接触ポイント材料が各電極の端部におけるナノ製作によって確立された金ビーズを含み、架橋分子が、金の接触ポイントへの特異的なチオール−金連結を形成できるようにアミノおよびカルボキシル末端に／その近傍にシステインアミノ酸を有するタンパク質アルファヘリックス分子である実施形態である。これは、架橋分子フレームワーク中で優先的に自己アセンブルする。加えて、単一のビオチン化アミノ酸は、内部のアルファヘリックスに、優先的には一方の鎖の中央の塩基に特異的に取り込まれ得る。これは、ストレプトアビジン分子（天然の、または変更された）のための特異的な連結部位を提供する。ストレプトアビジンは、他の任意の望ましいタンパク質、例えば酵素に架橋されて、このシステムの二次カップリング分子を形成することができる。
別の好ましい実施形態は、架橋分子としてＩｇＧ抗体に基づいている。このような抗体は、抗原に対して発生させることができ、抗原を含む接触ポイントを作り出す任意の手段は、関連するＩｇＧ抗体を、ＩｇＧにおける２つのＦａｂアームの特異的な抗原−抗体結合を使用して２つの接触ポイントに特異的に結合させる。さらに、このシステムにおいて、他の任意のタンパク質、例えば酵素に架橋されている抗ＩｇＧ抗体は、追加の分子構成要素に特異的に結合する役割を果たすことができる。
このＩｇＧシステムのさらに好ましい実施形態において、抗体は、宿主動物、好ましくはマウスまたはウサギに注射された金ナノ粒子に対して惹起される。このような動物によって生成された抗体は、様々な形態の金粒子結合特異性を有していてもよく、それゆえに、材料１の接触部が、ワクチン接種に使用される金ナノ粒子に十分類似した金ビーズである場合、上記のＩｇＧ成分の役割を果たすことができる。このような抗体が有する特異性は、材料（金）特異的、および可能であればワクチン接種用ナノ粒子のおよそのサイズに対するサイズ特異性を有していてもよい。
このＩｇＧシステムのさらに好ましい実施形態において、３から１０ｎｍのサイズ範囲（直径）の金ナノ粒子は、ワクチン接種で使用され、別個の製造プロセスにより、電極上に匹敵するサイズの金ビーズの接触ポイントが確立される。
このＩｇＧシステムのさらに好ましい実施形態において、３から１０ｎｍのサイズ範囲（直径）の金ナノ粒子は、ワクチン接種で使用され、動物は、金粒子のサイズ範囲または金粒子一般のいずれかに特異的な親和性を有する特異的なＩｇＧ源が識別されるように、金ナノ粒子の様々なサイズに対する動物の結合応答に関して、動物の血清および／または単離され精製されたＩｇＧ（例えばＥＬＩＳＡアッセイを介して）を試験することによって選択される。次いでこれらのＩｇＧは、会合した金の接触ポイントのための架橋分子システム（サイズ範囲特異的な、または金ビーズ一般）を形成する。
このＩｇＧシステムのさらに好ましい実施形態において、接触部特異的な結合を有する望ましいＩｇＧを生成するとして識別された動物は次いで、ハイブリドーマ融合プロセスを受けて、モノクローナル抗体のパネルを生成する。次いでパネルからの抗体をそれらのＩｇＧ結合特性に関してスクリーニングして、望ましいモノクローナルを選択する。次いでこれらは、分子架橋システムのためのＩｇＧの好ましい供給源となる。これは、無制限に大量生産することができる特異的特性を有する正確な分子を提供する。
ＩｇＧシステムを確立するためのこのアプローチの代替の好ましい実施形態において、接触部特異的な結合を有する望ましいＩｇＧを生成するとして識別された動物は次いで、Ｂ細胞受容体ディープシーケンシングを受けて、基礎となるＩｇＧ可変ドメインのための候補ＤＮＡ配列を識別し、望ましい受容体配列をクローニングし、発現させ、それらの金粒子結合活性に関して再試験して、望ましいＩｇＧ抗体の特異的なモノクローナルの形態を得る。
このＩｇＧシステムのさらに好ましい実施形態において、ＩｇＧ分子は、結合ポケットの可変ドメイン中に材料結合ペプチドを有する開始鋳型から直接操作される。これは、特異的なチオール−金連結を有するシステインアミノ酸を含み得、または標準的なもしくは新規の金結合ペプチドを、好ましくは利用可能性を強化するために好適なＧＳリッチなリンカーと共に含み得る。全体的に操作されたＩｇＧは、金ビーズ接触部を有する分子架橋システムを形成する。代替として、前記材料から作製された接触ポイントに適合する他の材料と結合するペプチドを使用することができる。加えて、分子スクリーニング、例えばファージディスプレイスクリーニングの方法を使用して、分子架橋システムで使用するための新しいこのような材料結合ペプチドを識別するか、接触ポイントに使用できる材料のタイプをさらに拡張するか、または架橋分子のための所与の材料の接触ポイントの結合特性を改善することができる。
上記のＩｇＧ架橋システムの代替の実施形態において、二次結合分子は、同族の抗ＩｇＧ抗体の代わりに、プロテインＡまたはプロテインＧに基づき得る。
別の実施形態において、酵素を直接操作して、このシステムにおける一次架橋分子を形成することができる。これは、上述した方式で材料結合ペプチドのドメインもしくはシステイン残基を有するように酵素タンパク質を操作することによって、ならびに／またはタンパク質上のスパイもしくはキャッチャードメインのいずれか、および接触ポイントの一部を含むコンジュゲートペプチドを有する標準的なスパイ−キャッチャーペプチドコンジュゲーションシステムにおいて操作することによって達成することができる。一般に、２つの接続を作製するために、チオール連結、材料結合ペプチド、およびスパイ−キャッチャーペプチドカップリングの組合せが使用され、２つの付着ポイントを達成し、さらには、２つの別個の接触ポイントのカップリングシステムが採用される場合（例えば一方の接触ポイントにチオール−金連結、および他方にスパイ−キャッチャー連結）、接触部の好ましい配向を規定することができる。
全てのこのような分子架橋システムにとって、架橋組成物を確立する好ましい手段は、デバイス電流の活性なモニタリングと共に一連のｉｎ ｓｉｔｕにおける結合反応を行うことである。次いで電流の変化が、アセンブルの別々のステップ、すなわち開回路、一次架橋の結合、二次分子の結合が達成されたポイントを識別する。さらに好ましい実施形態において、第３の電極（埋め込まれたゲート）を使用してゲート電圧を印加し、これは、観察された電流レベルをさらに調整するのに使用することができる。加えて、他の実施形態において、電圧分光法／ＡＣシグナルへの応答を使用して、アセンブル中およびその後におけるシステムの様々なコンフォメーションに関するフィンガープリントの識別を提供することができる。
さらに好ましい実施形態において、そのゲートおよび印加された電圧は、架橋構造の電圧によって誘導された突き出しによってジャンクションを「リセット」するのに使用することができる。好適な高い電圧／電流は、一般的に任意の分子架橋構造を部分的にまたは完全に破裂／分解させる。これは、電圧誘導性の酸性度もしくはｐＨ変化、または溶液由来の局所的な分解因子の他の電圧誘導を有し得る好適な「ストリッピング緩衝液」と共に行うことができる。
また、ある特定の実施形態において、印加された電圧（ソース−ドレインまたはゲート）は、電圧によって強化されるアセンブルを可能であれば提供して、アセンブルプロセスを促進または推進し得る。
さらに好ましい実施形態において、上述した全ての方法は、このような分子架橋システムの大きいアレイの作製に適合している。この状況において、アレイ中の個々のデバイスからのデバイス電流のリアルタイムのモニタリングは、どのデバイスがよく形成されているかを識別し、個々のデバイス電圧に対する制御が、ある特定のシステムにおいて、電圧によって指示または促進されるアセンブル、および電圧によって指示されるデバイスのリセット／再初期化／ストリッピングを可能にする。
様々な実施形態において、分子架橋を作り出すためのシステムおよびプロセスは、電極の端部上にナノ接触ポイントを確立すること；一次架橋分子上の２つのポイントにコンジュゲート結合基を確立すること；任意選択で、架橋分子および内部接触ポイントのためのコンジュゲート基を有する二次分子内に、内部接触ポイントを確立すること；ならびに基礎となる回路を通る電流によってモニターされる一連の反応で自己アセンブルさせて、別々のアセンブル事象が実際に起こったことを証明することを含む。様々な例において、接触ポイントは、第１の材料、材料１のビーズであり、電極は、異なる材料、材料２で作製されており、コンジュゲート結合基は、材料１に特異的な結合能力を有する基である。例えば、材料１は材料特異的結合ペプチドを含み、このペプチドは、コンジュゲート基として使用される。
様々な実施形態において、材料１は金であり、材料特異的結合ペプチドは、公知の金結合ペプチドの１つである。他の態様において、材料１は金であり、コンジュゲート基は、特異的な結合としての金−チオール連結のためのチオール基を含有する。さらに、材料１は金であってもよく、材料特異的結合ペプチドはアミノ酸システインであり、これはコンジュゲート結合基に含有される。
他の実施形態において、材料１は金であり、架橋分子は、両方の末端にチオール含有ヌクレオチドが存在する二本鎖ＤＮＡである。または材料１は金であり、架橋分子は、両方の末端にチオール含有ヌクレオチドが存在する二本鎖ＤＮＡであり、さらに内部にビオチン化されたヌクレオチドが存在し、二次分子は、任意選択で追加のタンパク質、特に酵素、特にポリメラーゼに架橋されたストレプトアビジン（天然の、または突然変異した）である。他の態様において、材料１は金であり、架橋分子は、金−チオール連結を介して材料特異的結合を提供するために、システインを両方の末端に、またはそれらの近傍に含有するアルファヘリックスタンパク質である。
様々な実施形態において、内部でビオチン化されたアミノ酸が存在していてもよく、二次分子は、任意選択で追加のタンパク質、特に酵素、特にポリメラーゼに架橋されたストレプトアビジン（天然の、または突然変異した）である。材料１は、特異的なＩｇＧ抗体Ａのための抗原を含んでいてもよく、Ａは、抗原への特異的な結合によって架橋分子を形成する。
他の例において、抗Ａ抗ＩｇＧ抗体は、別のタンパク質、特に酵素、特にポリメラーゼに架橋されており、システムの二次分子を形成する。これらのＩｇＧシステムにおいて、材料１は、ナノ製造プロセスによって確立された金ビーズであってもよく、一方の末端にシステイン基を有するペプチドで誘導体化されていてもよく、特異的なＩｇＧ抗体Ａと共にペプチド抗原を含む。誘導体化するペプチドは、ＣＡＬＮＮと、０またはそれより多くのアミノ酸のＧＳリッチなスペーサー、それに続くＦＬＡＧタグペプチド抗原とからなっていてもよく、抗体Ａは、［宿主］−抗ＦＬＡＧ ＩｇＧであり、二次結合分子は、抗［宿主］−ＩｇＧであり、ここで［宿主］は、標準的な抗体宿主動物のいずれか、特にマウス、ヤギ、ウサギであり、二次ＩｇＧは、任意選択で他の任意のタンパク質、特に酵素、特にポリメラーゼにコンジュゲートしている。
架橋分子は、宿主動物に材料１のナノ粒子を接種することによって惹起されたＩｇＧ抗体であってもよく、この材料１の特異性が架橋結合の基準である。このシステムにおいて、二次分子は、同族の抗ＩｇＧであり、これは、任意選択で別のタンパク質、具体的には酵素、具体的にはポリメラーゼに架橋されていてもよい。代替として、二次分子は、ＩｇＧに特異的に結合するプロテインＡまたはプロテインＧであってもよく、これは、任意選択で別のタンパク質、具体的には酵素、具体的にはポリメラーゼに架橋されていてもよい。材料１は、金、および宿主動物への金ナノ粒子の接種によって惹起された抗体であり得る。例えば、金ナノ粒子は、３ｎｍから１０ｎｍのサイズ範囲であり、特に、マウスまたはウサギの宿主動物において、特に、抗体は、金ナノ粒子の所定のサイズに対するそれらの結合プロファイルに基づき事前選択を受ける。
抗体は、良好な抗体結合応答を有するために選択された、所与のナノ製造プロセスによって製造された金ビーズ接触部に対して良好な結合応答を有するためにさらに選択された宿主動物由来のモノクローナル抗体として生成することができる。
抗体は、良好な抗体結合応答を有するために選択された動物から、所与のナノ製造プロセスによって製造された金ビーズ接触部に対して良好な結合応答を有するためにさらに選択されたクローンを用いて、Ｂ細胞受容体シーケンシングおよびクローニングに基づき操作することができる。
一部の例において、架橋分子は、Ｆａｂ結合ポケットの可変ドメイン中に特定されたアミノ酸配列を有する、ＩｇＧ鋳型において操作された合成タンパク質であってもよく、このような配列は、ＧＳリッチなペプチドリンカーと共に材料１に結合するペプチドを含む。二次結合は、場合によって別のタンパク質、特に酵素、特にポリメラーゼに架橋された同族の抗ＩｇＧ抗体によって提供される。このような操作されたタンパク質の場合、二次結合の代替アプローチに関して、他の操作されたタンパク質、特に操作された酵素、特に操作されたポリメラーゼにおいて、具体的にはこの様式でスパイ−キャッチャーペプチドコンジュゲーションシステムを使用して（ＩｇＧ鋳型に操作されたスパイまたはキャッチャーペプチドを用いて）、コンジュゲートペプチドに結合することができる特異的結合ペプチドの形態での二次接触部部位で操作することがさらに可能である。材料１は、金であってもよく、結合ポケットに操作された材料特異的なペプチドは、ＧＳリッチなリンカーおよびスペーサーと共にシステインの金結合ペプチドを含んでいてもよい。
様々な実施形態において、一次架橋分子は、接触ポイントにコンジュゲートするための結合基を、その直鎖状タンパク質配列に、またはそれが多量体タンパク質である場合はその複合鎖の配列に直接含むように操作された、タンパク質、好ましくは酵素、好ましくはポリメラーゼ酵素を含んでいてもよい。
接触ポイントは、スパイまたはキャッチャードメインを含んでいてもよく、タンパク質は、コンジュゲートペプチドを含んでいてもよく、スパイ−キャッチャーペプチドコンジュゲーションシステムは、接触ポイントへのカップリングを提供する。接触部材料は、金であってもよく、タンパク質は、電極接触ポイントへのカップリングを提供するためのＧＳリッチなリンカーと共に、結合基としてシステインアミノ酸または金結合ペプチドを含有する。
様々な実施形態において、ゲート電圧は、プロセスをモニターする態様において、別の電圧制御を提供するのに使用される。例えば、ゲート電圧および印加されたソース／ドレイン電圧は、構築の段階および得られた分子架橋の構成をさらに特徴付けるために、ならびによく形成された構造を識別するために、電圧分光法、Ｉ−Ｖ特性、またはＡＣ−シグナル応答を実行するのに使用される。ゲート電圧および印加されたソース／ドレイン電圧は、架橋形成を促進し、不適切に形成された架橋構築物をなくするために使用される。
様々な例において、分子架橋構築物は、大きいアレイ中に配置されていてもよく、例えば、電圧によって指示される感知および作動を用いた、よく形成された部位、およびリセット／ストリッピング／再初期化部位の識別を含む電極のアレイ上に配置されていてもよい。
本明細書の実施例６において、図２６〜３４は、以下でより詳細に論じられる上記の実施形態の実験結果を示す。図の第１の群は、チオール−金によって指示される結合を介した金接触部ドット対の試験アレイにおける様々な種類の架橋分子結合／架橋を示す。これは、ＤＮＡ、ペプチドおよび抗体架橋をカバーする。図の次の群は、金接触部ドットを用いた電極への結合／架橋またはチオール−金によって指示された結合を介した標的を、画像化および電気的測定の両方によって評価された結果と共に示す。
図２６〜３４は、結合試験アレイ：ｄｓＤＮＡ架橋；結合試験アレイ：ｄｓＤＮＡ架橋、改善された結合；結合試験アレイ：ペプチドアルファヘリックス架橋；結合試験アレイ：ＩｇＧ抗体架橋；電気的架橋／結合測定のための試験セットアップの略図；金のドット接触部を有する試験電極；架橋および分子アセンブリの電気シグナル；画像化による架橋分子結合の電気シグナル；ならびに適所に標識された架橋を有する電極の画像をさらに提供する。
ここで図２６を参照すると、架橋された接触部（緑色のボックス）および架橋されていない接触部（赤色のボックス）の理想的な画像の図表示が例示される。図２７において、二本鎖ＤＮＡ分子を使用して、金−ドット接触ポイント間に架橋を形成した。この実施例において、架橋分子は、長さ２０ｎｍ（６０塩基）の、接触部のドットへのチオール−金結合のために各鎖の５’末端にチオール基を有する二本鎖ＤＮＡ分子である。金のドットは、ケイ素基板上にｅ−ビームリソグラフィーによって形成される。ＤＮＡ架橋は、標識された架橋の電子顕微鏡画像化を可能にするためのビオチン−金標識の結合のために、１つの鎖上にビオチン化塩基３０を有する。図２７は、架橋反応および標識付け反応後の基板のＥＭ画像を示す。緑色の四角は、架橋がよく形成された接触部を強調する。
図２８は、より高い効率の２０ｎｍの二本鎖ＤＮＡ架橋の、金の接触ポイントのアレイへの結合の画像である。架橋は、画像化のために小さい金のドットで標識される。緑色の四角は、よく形成された架橋の例を強調する。より高いレベルの金の接触ポイントへの結合、および架橋は、高塩濃度の緩衝溶液中での堆積によるものである（架橋反応条件：１μＭの架橋濃度、結合アレイと５×ＴＢＳ緩衝液中で１時間のインキュベーション）。
図２９は、金のドットの接触ポイントの試験アレイに結合しているアルファヘリックスペプチド架橋の画像である。架橋分子は、長さ１０ｎｍの、システインのチオール基を介した金へのチオール結合のために末端にシステインアミノ酸を有するペプチドアルファヘリックスである。架橋は、ストレプトアビジン−金ビーズで標識された内部リシン−ビオチンを介して標識される。結合した架橋を有する接触部の金のドットはそれほど多くなく、多くの金のドット対は、ドットからドットの架橋に一致するドット間に配置された架橋を有する。この実験に関して、ペプチド架橋反応条件は、１μＭの架橋濃度、１×ＰＢＳ緩衝液中で１時間のインキュベーションであった。緑色の四角は、よく形成された架橋の例を強調する。
図３０は、ＩｇＧ抗体架橋結合の画像である。金のドット接触部のアレイはまず、システイン／チオール−金結合を介してＣＡＬＮＮ−ＦＬＡＧタグペプチドで誘導体化される。抗ＦＬＡＧタグＩｇＧは、特異的な親和性結合を介してＦＬＡＧタグに結合する。抗体の位置は、ＩｇＧ定常ドメインに結合する金−ドット−プロテインＡ標識を使用して画像化のために標識される。図３０は、金接触部／ＣＡＬＮＮ−ＦＬＡＧに結合した抗ＩｇＧを示す。数個のドット対は、ドット間に位置する抗体を示し、これは、ドットをつなぐＩｇＧアームでの完全な架橋形成を示唆している。緑色の四角は、よく形成された架橋の例を強調する。
図３１は、架橋分子における電気的測定に関する試験セットアップの略図を例示する。この図の上の部分は、電極−基板構造および架橋分子を介して電圧を印加し電流を測定するための分析器への取り付けの断面図を例示する。この図の下の部分は、回路を架橋するための電極アレイの斜視図を例示する。各電極対は、金属−１の電極上の金属−２の接触ポイントを有する。
図３２〜３３は、架橋分子結合の電気的なシグネチャーを例示する。図３２において、電流対時間は、架橋−電極結合事象を示す３つのスパイクを示す。図３３は、同じ電極の標識された架橋のＥＭ画像であり、観察された３つのシグナルスパイクに一致する最も右側の電極（緑色の矢印）に結合した３つの架橋を示す。これらは電極ギャップを架橋しないが、架橋分子の結合は、電極をつながなくても検出可能な電気シグナルを生成し得ることを示す。
図３４は、金電極のｄｓＤＮＡ架橋のＥＭ画像である。１つの鎖の３’および５’末端上にチオール基を有する２０ｎｍのｄｓＤＮＡ架橋が、金でコーティングされた電極間の架橋として結合していることを示す（緑色の矢印）。架橋は、中央のビオチン化塩基で金−ドット−ストレプトアビジン標識を介した金のドットで標識される。電極は、ケイ素上の５ｎｍのクロム基板上に１５ｎｍの金の層を有する。表面は、酸化ケイ素層によって不動態化されており、幅２０ｎｍの開口領域により架橋のために電極の金表面が露出している（暗くなった水平のバンドが、酸化ケイ素のカバーがない露出した領域である）。
（実施例７）
電極上にナノ接触ポイントを導入すること
この実施例は、正確な位置、形状およびサイズを有する電極などの基板上のビーズを調製するための新しい製造方法を実証する。これらの方法の主要な新規の特徴は、プロセスで使用されたパターン化方法の基本的なパターン特徴より小さい直径の基板上でビーズを位置決めする方法を提供することである。
この実施例は、正確な位置と小さいサイズで固体基板上に配置されるべきナノ粒子に関する。１つの好ましい適用は、以下のタイプの事象、具体的には機械的な接続、電気的な接続、および自己アセンブリをナノメートルスケールで良好に規定され望ましい配置に空間的に局在化させるために、基板上の「接触ポイント」としてナノスケールの材料粒子を使用することである。
これに関する１つの可能な必要性は上記で論じられ、図２２で望ましい分子スケールの回路を作り出す状況においてより詳細に例示されている。ここで分子エレメントは、２つの電極間を接続するべきである。これは、分子エレクトロニクスの分野において共通の問題である。
この問題を解決する１つの好ましい方法は、高度に局在化した正確に位置決めされた材料粒子を導入することであり、このような粒子は、本明細書ではナノ「接触ポイント」と称され、自己アセンブリをガイドする必要性の一部または全てに供され、機械的および電気的な接続をもたらす。このような接触ポイントの使用は上記で論じられており、図２３で例示され、ここでエレメント「Ａ」は接触ポイントである。この目的のために、接触ポイントは、標的分子と選択的に結合する好適な材料で作製され、高度に空間的に局在化され、望ましい位置に正確に配置される。
この適用に必要なナノ粒子の主要な特性は、（１）高度に空間的に局在化されていること（「小さい」かまたは「点状」でなければならない）；（２）正確に予め規定された特定位置を有すること；および（３）その機能的な役割を支持するのに適切な材料で作製されていることである。
同じ特性は、ここで示された回路構築の単なる例より広い有用性を有する。例えば、プラズモン共鳴デバイスの分野では、電磁気エネルギーとのナノ粒子の相互作用が極めて重要な関心事である。
一般に、基板上で所望の小サイズと正確な位置を有するナノスケールのビーズを効率的に製作することが課題である。基板上に所望の材料のディスクを一次パターン化プロセスによって設定されたディスクの形状および直径で作り出すのに、ナノスケールリソグラフィーまたはミリングの標準的な方法を使用することができる。これらの方法としては、スパッタリングまたは蒸着などの様々な材料堆積方法と組み合わせた、ｅ−ビームリソグラフィー、フォトリソグラフィー、ＵＶリソグラフィー、超ＵＶリソグラフィーおよびインプリントリソグラフィー、ならびにイオンビームミリングなどの周知のパターン化方法が挙げられる。この標準的アプローチの第一位の限界は、材料ディスクの直径がパターン化プロセスによって設定されることと、パターン化プロセスの最小限の分解能が、望ましいナノスケールのビーズサイズを提供するほど十分に小さくない場合があることである。これは、特に、望ましいビーズが１０ｎｍ未満の直径を有するケースであり、このような直径は、ほとんどの現行の光学的、ＵＶもしくはｅ−ビームリソグラフィーシステム、またはイオンビームミリングシステムの分解能の限界に近いかまたはそれを超える。本発明は、ビーズが一次パターン化プロセスの分解能の限界より小さい直径である、基板上に正確に位置決めされたビーズを製造するのに、これらの標準的な効率的なパターン化方法を使用するための手段である。これらのビーズはまた、正確に規定された形状で正確に位置決めされる。
この実施例は、プロセスで使用された一次パターン生成方法の最小限の特徴サイズより実質的に小さい直径である、正確に制御されたサイズ、形状および位置のビーズを製造する３つの例示的な方法を教示する。本方法は、以下の通りである：
第１の方法は、本明細書では「プロセス（１）」と称され、図３５および３６で例示される。第１の方法は、ディスクを、標準的なパターン化方法によって保護レジスト層にパターン化することからなる。このステップは、基板上の望ましいディスク領域が露出した保護レジスト層をもたらす。これに堆積プロセスが続き、接着性材料を堆積させ、これは、ここでも接着性材料の化学的性質に応じて標準的な堆積またはコーティング方法によって行うことができる。接着性材料は、基板への結合が可能であり、ビーズ材料にも結合することが可能であるべきである。次いでこれを、事前にバルクの量のナノ粒子（例えばコロイド懸濁液）を作製する標準的手段によって製作された望ましいビーズを含有する溶液に曝露し、次いでこれを接着性ディスク上の適所に結合させることができる。ビーズが十分に大きく、低濃度である場合、物理的なサイズの制約（一般的に「立体障害」として知られる）によって、最大１つのビーズがディスクに結合される。次いでレジストを溶解させて除去し、付着したビーズを残す。代替の実施形態として、一次ビーズが一旦適所に配置されれば、この一連のステップにおいて最初にレジストを除去してもよいが、レジストの存在は、追加のビーズが接着性領域に接近することを制限するのに役立つので、前者のアプローチが好ましい実施形態である。接着剤は、このプロセスにおいて永続的であってもよいし、または代替の実施形態において、溶解によって除去されるべき手順の一過性の態様であってもよく、場合によりビーズを基板に結合させる追加のプロセスステップと共にビーズを適所に残す。いずれにしても、特に、このビーズは、直径がディスクそれ自身より小さくあり得、そうでなくても接着性ディスクの中心の近傍に位置決めされることに留意されたい。特に、ディスクの直径の半分を有するビーズは、ディスク１つ当たり１つのみのビーズが結合可能になるように適切なサイズ排除を提供する。
図３５は、所望の配置に小さいビーズを製造するのに使用されるプロセス（１）のステップを例示する。図３５の左上部分から始まり、レジスト層（灰色）は、基板（青色）上に直径Ｄの開口部ディスクでパターン化される。次いで接着剤層（緑色）をディスクに堆積させる。次いでこれに、標準的手段によって製作された予め作製されたビーズの溶液を曝露し、ここでビーズは、立体障害が接着性ディスク１つ当たり１つのみのビーズを許容するような直径ｄを有する。レジストの除去後に残るものは、直径ｄのビーズであり、これは、接着性ディスクの中心の近傍に位置決めされるが、ディスク直径Ｄより小さいサイズを有する。このプロセスは、より明確にするために、プロセス（１）の主要なエレメントの斜視図および上から見た図の両方を示す図３６において３Ｄで描写される。
第２の方法、「プロセス（２）」は、図３７、３８、３９Ａおよび３９Ｂで例示される。基板から開始して、任意の標準的なパターン化方法を使用して、それが広いより長い幅Ｗの長方形領域をパターン化し、任意の標準的な堆積方法を使用して、この長方形パターンに、ある厚さの、固相、すなわち望ましいビーズ材料Ｍの薄層を堆積させる。次いでこの構成を好適なアニーリングプロセスを使用してアニールし、それによりシステムは、最小エネルギーの構成に展開される。適切な条件下で、これにより堆積した材料のストリップが表面張力の作用下で破壊されてビーズになり、同じ体積の材料を集合的に含有するより小さい直径のビーズの列を形成する。得られた材料Ｍのビーズは、ストリップの幅Ｗより小さい直径を有し、それでもなお同じ中心線の近傍に正確に集中する。ビーズからビーズの間隔は、統計学的に類似し、ここでもこの間隔は、ビーズ直径より実質的に大きくすることができる。このプロセスの最終ステップは、元のストリップの好ましい端部の近傍にちょうど１つの露出したビーズが生じるように意図される。
これを達成するためのこのようなプロセスの２つの代替の実施形態は：
（ａ）標準的なパターン化方法によってパターン化された除去可能な材料／レジストの堆積した層でストリップの端部に最も近いビーズを保護し、次いで全ての他のビーズを洗浄して取り除き、次いで保護されたビーズを露出させて、最初のストリップの端部の近傍に望ましい単一の露出したビーズを到達させること；または
（ｂ）標準的なパターン化および堆積方法を用いて、ストリップの端部に最も近い部分を除いてビーズをカバーする層を堆積させ、再度ストリップの好ましい端部に最も近い望ましいビーズのみを露出させることである。
いずれかの手段によって、参照されたストリップの端部に最も近い単一の露出したビーズが残る。このビーズはまた、正確に規定された形状を有し、この形状は、ほぼ球状であり得るが、一般に、含まれる材料のバルクおよび表面相互作用エネルギーおよびアニーリングプロセスによって規定される。アニーリングは、典型的には、システムを好適な周囲媒体（これは、好ましい実施形態において、真空、または空気、または不活性ガス、例えば窒素であり得る）に浸漬すること、および次いでシステムの温度をある期間上昇させることによって実行される。このビーズ生成プロセスを起こすために、堆積材料、基板材料、および周囲媒体は、好適な物理的特性を有していければならない。好ましい実施形態は、以下の特性を有する：（ｉ）材料と基板との表面張力が基板と周囲との表面張力を超える；および（ｉｉ）材料が、基板を崩壊させない温度でアニールまたは融解する。
これらの好都合な条件下で、好適なアニーリング温度、典型的には融点より十分に低い温度に加熱すると、材料は、可動性になり、好適なアニーリング時間を経過させることができ、材料は、破壊されて表面張力の作用下で一列のビーズになり、一般的にはかなり小さい丸みを帯びたビーズが形成される。ビーズは、材料と基板の間に非常に大きい表面張力がある場合、ほぼ球状であり、別様に表面張力によって成形される。このビーズの直径ｄは、最初の堆積パターンＷの幅より小さい。したがって、このプロセスは、最初のパターン化プロセスの限界より実質的に小さい直径ｄの接触ポイントを達成する。このビーズの位置は、元のスポットの中心の近傍に集まったままになり、したがって空間的な局在化を強化しつつ正確に特定された位置も同様に保持する。このプロセスの別の主要な新規の利点は、最初の堆積した材料の層が不規則性を有していたとしても、得られたビーズが良好に規定された形状を有することであり、これは最終的なビーズの形状は、最初の堆積パターンではなく表面張力によって規定されるためである。
この第２の方法は、以下の通り図３７、３８、および３９Ａ〜Ｂに表されている。
図３７は、プロセス（２）実施形態（ａ）のステップを例示する。図中の左上から始まり、好適な基板（青色）上に幅Ｗの長方形のビーズ材料（金）が堆積すると、これがアニーリングのとき、表面張力の作用下で破壊されて一列のビーズになる。次いで、除去可能なレジストの保護層（赤色）をパターン化し、堆積させ、単一のビーズを含有する領域を保護する。残存するビーズを除去し、次いでレジストを除去し、元の長方形の材料の好ましい端部の近傍に単一のビーズを残す。図３８は、プロセス２の代替の実施形態ｂを例示し、図３７に示した実施形態とは対照的に、最終的な堆積した層（赤色）を使用して不要なビーズをカバーすることにより、露出した好ましい端部にビーズのみが残り、より大きいナノデバイスでの使用に利用可能である。
図３９Ａは、プロセス（２）の１つの好ましい実施形態の例を例示し、使用されるパターン化方法は、ｅ−ビームリソグラフィーであり、その目的は、２つの電極ストリップの近位端にビーズを作製することである。図解は、長方形の層を破壊してビーズにするポイントを通って、各長方形の好ましい端部に単一のビーズを達成する最終的なステップの前のプロセスを描写する。図３９Ｂは、高くなったおよびくぼんだ基板の隆起部からなる基板上での実施に移した図３９Ａのプロセスを示す電子顕微鏡画像であり、その基板上に金の層を堆積させ、それを破壊してビーズにする。この画像は、ビーズの直径が、長方形ストリップの基礎となる幅より実質的に小さく、狭い（くぼんだ）ストリップが、単一のラインのビーズが形成されるに十分小さいことを示す。
第３の方法、「プロセス（３）」は、図４０で例示される。基板から開始して、任意の標準的なパターン化方法を使用して、それが広いより長い幅Ｗの長方形領域をパターン化する。この長方形パターンはさらに、角が丸くなっていてもよいが、好ましい実施形態では、ビーズが作り出されるべき指定された端部で尖ってもおり、それによりビーズ位置の精度を強化することができる。次いで、任意の標準的な堆積方法を使用して、このパターンに、第２の材料２のための接着材料である第１の材料１の層（青色）を堆積させ、これは、材料２が、それに、例えば図３７においてアニーリングのときにビーズ生成が起こらないポイントに強く接着することを意味する。第２の材料２もこの同じパターンに堆積させる。次いでこの表面に、材料の任意の層である薄い界面層（灰色）、またはそれ以外の状況で存在するバルクの構造における崩壊をもたらす分子の格子構造における変更が確立され、好ましい実施形態において、これは、真空システム中に破壊を導入し、空気に曝露させて、表面に酸化層を形成させることによって行われる。界面層が確立された後、望ましいビーズ材料である材料３の追加の薄層の堆積が同じパターンで作製され、ここで好ましい実施形態において、材料３は材料２と同じである。次いでこの構成は、曝露された小さい寸法の好ましい端部のみを残す厚い不動態化層の堆積によって保護される。次いでこの構成は、上記の方法２の場合と同じ考察下でアニーリングを受ける。本構成において、露出した材料３の薄層は、上記の方法２で論じられた通り、アニーリングの作用下で破断してビーズを生成し、露出した領域より小さい寸法のビーズが形成される。材料１が接着層であるために、材料２の層は、材料２および３が同じ材料である好ましい実施形態であっても、このアニーリングプロセス下でビーズを生成しない。界面層は一過性であり、このプロセス中に、特に、界面層が酸化層であり、アニーリングが高い温度でなされる好ましい実施形態において、置き換えられる。結果は、元の長方形パターンの望ましい端部の近傍に配置された、パターン化された寸法より小さいかそれと同じ直径の望ましい材料３のビーズである。注記されるように、好ましい実施形態において、材料２および３は同じ材料であり、界面層としての酸化層を有し、さらに好ましい実施形態において、この材料は、金であり、金の支持表面上に超解像度の寸法の金ビーズを生成する。
一般的に、これらの３つのプロセス（１）、（２）および（３）を使用して、より広範なナノ製作の必要性を支持する、規則正しく規定されたアレイパターンにレイアウトされたビーズを作り出すことができる。図４１は、どのようにプロセス（１）が、接着性ディスクのアレイを作り出すのに容易に使用することができるか、したがって接着性材料のパターン化された堆積を、超解像度の正確に位置決めされ正確に成形されたビーズのアレイに効率的に変換するかを例示する。したがって、このプロセスは、一次パターン化プロセスによって達成可能な分解能を超える分解能で、ナノスケールのビーズの規則正しいアレイのための高度に効率的な製造プロセスを提供する。図４１は、プロセス（１）または（２）を使用して生成されたビーズのアレイを例示する。プロセス（１）のケースにおいて、最初のパターン化および材料堆積プロセスを使用して、基板上に接着性材料のディスクのアレイを作り出すことができる（元のフットプリントは破線の丸で示される）。次いでこのプロセスにより、示された予め形成されたビーズが堆積される。代替として、方法（２）が使用される場合、堆積した最初の長方形の材料のアレイをベースとして、単一の保護ステップでビーズのカラム全体を確立することができる。図４１は、基板上において可能性のある任意の程度の、ビーズの規則正しいパターン化されたアレイの一部を例示する。
図４２は、これらの製造プロセスを使用してビーズのアレイを生成するための１つの好ましい適用が、図３４に示されたタイプの分子エレクトロニクスデバイスのアレイの製造の場合であることを例示する。記載されたアレイプロセスは、図４０で示されたように、電極対の先端に位置決めされたビーズのアレイを製造することに使用される。方法（２）および（３）がこの特定のタイプのパターンに特によく適しており、これは単一の保護ステップ（図３８および３９Ａでは赤色の層）は、電極の端部におけるビーズの列全体を保護し確立することができるためであることに留意されたい。図４１に示されるようなビーズは、図３４で示されたような分子電子回路のためのナノ接触ポイントとして作用することができる。プロセスのビーズの使用は、スケーラブルなアレイ様式で最終的な分子エレクトロニクスデバイスを生成するのに使用される全体的な製造プロセスの一部である。これは、特に単一の集積回路チップ上に多くのこのようなデバイスのアレイを生成するのに使用することができる。
様々な実施形態において、本開示は、元のパターンの直径より小さい直径を有するビーズを堆積させるためのプロセスを提供し、これは、基板材料を提供すること；パターン生成および接着剤堆積プロセスを提供すること；多数の溶液中の事前に製作されたビーズを提供すること；パターン生成および接着剤堆積プロセスを使用して、基板上に、パターン化プロセスによって設定された直径を有する接着性材料のディスクまたはパッチを確立し、レジストコーティングによって基板の残部を保護すること；および多数の溶液中の事前に製作されたビーズを接着剤に曝露し、それに結合させることであって、事前に製作されたビーズは、１つのビーズを接着性材料のディスク上に結合させるだけの余地しかない程度の大きさの直径を有していること；およびビーズの結合の前またはレジストコーティングの除去後のいずれかに、個別に、接着性パッチに結合した状態でビーズを残すことを含む。様々な実施形態において、最終的なビーズは、約２０ナノメートル未満の直径を有していてもよい。他の例において、ビーズの直径は、約１０ナノメートル未満であってもよい。
様々な態様において、パターン生成プロセスは、電子ビームリソグラフィー；フォトリソグラフィー；ＵＶリソグラフィー；超ＵＶリソグラフィー；Ｘ線リソグラフィー；ナノ−インプリントリソグラフィー；およびイオンビームミリングのいずれか１つを含んでいてもよい。
様々な例において、前述のプロセスを使用して、ビーズの規則正しいアレイを形成することができ、その場合、ビーズ配置のパターンは、一次パターン化プロセスによって指定される。例えば、ビーズのパターンは、分子電子デバイスのアレイのための電極パターンに対して、接触ポイントの位置にビーズが置かれるようになっていてもよい。一部の態様において、プロセスは、単一のチップ上に１００個より多くの接触ポイントを製作することを含んでいてもよい。他の例において、プロセスは、単一のチップ上に１０，０００個より多くの接触ポイント、または単一のチップ上に１，０００，０００個より多くもの接触ポイントを製作することを含んでいてもよい。
様々な実施形態において、事前に製作されたビーズは、金属ナノ粒子、例えばコロイド金ナノ粒子を含んでいてもよい。一部の例において、事前に製作されたビーズは、金ナノ粒子を含み、接着剤は、チオール化したシラン材料を含む。
前述のプロセスの様々な態様において、接着性材料がその後除去される場合、粒子は、他の能動的または受動的手段によって結合した基板上で適所に残る。一部の例において、事前に製作されたナノ粒子の直径は、接着性ディスクの直径の２分の１に等しいかまたはそれより大きく、最大で１つのこのような粒子を結合させることができる。
他の例において、接着剤は、ディスク以外のいくつかの他の形状にパターン化することができる。
前述のプロセスのバリエーションにおいて、接着性部位１つ当たり単一の粒子が堆積することが有利になるようにするために使用される手段、例えば、これらの他の限定要素：レジスト中のくぼみのアスペクト比（大きい深さ／幅が好都合である）、事前に製作された粒子の溶液濃度（より低い濃度が好都合である）、一次ビーズと、１つの部位に複数の一次ビーズが接触しないようにするためにサイズ排除目的で存在する結合できない別のビーズ種との混合物（より多くのこのような置き換えビーズが好都合である）、および結合反応の持続時間（より短い時間が好都合である）のいずれかまたは全てと併用した粒子サイズ（より大きい直径が好都合である）などが使用される。
ビーズは、部位１つ当たり１つより多くのビーズを付着させることができるが、正確な付着ポイントおよび付着時間においてランダムである部位を充填する確率論的なプロセス（ポアソンの充填の統計）に従うような方法で堆積させることができ、部位の一部は、よく形成された部位について所望のように単一のビーズを獲得する。
ナノ粒子は、接着性部位１つ当たり１つの粒子に堆積を制限するサイズ排除のためにその有効径を増加させる除去可能なコーティングをさらに含んでいてもよく、その場合、ナノ粒子の溶液への曝露が完了した後、それに続く処理ステップで前記コーティングが除去される。
実施例７は、自己アセンブルする分子デバイスのための接触ポイントとして使用するのに望ましい位置にビーズを確立するために、予め形成されたナノスケールのビーズを表面上に堆積させ、パターン化された領域に接着させる本発明の実験結果を記載する。示されたＥＬＩＳＡアッセイの結果は、教示された通りに表面に結合したビーズが、分子自己アセンブル反応の基礎である特異的な分子結合を有する機能的な能力を保持することをさらに実証する。
図４３から４６Ａ〜Ｄは、これらの結果をさらに説明しており、適切に誘導体化された表面領域へのビーズの結合のＥＭ画像；誘導体化されていない表面領域上にビーズが存在しないことを示すＥＭ画像；誘導体化された表面領域に結合したビーズのＡＦＭ画像；および表面に結合した金ビーズへの機能的な分子の結合アッセイを含む。
図４３は、接着性表面上に堆積した金ビーズの電子顕微鏡画像を示す。ビーズは、直径がおよそ５ｎｍから１０ｎｍの金ナノ粒子である。接着性表面は、ナノスケールの高分子マトリックスを使用して多種多様の材料の表面に都合よく結合する市販の「分子接着剤」で誘導体化されたシリコンウェーハである（Ａｎｔｅｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．製のＭｉｘ＆Ｇｏ（商標））。使用される堆積緩衝液は、炭酸塩緩衝液である。画像は、高密度で表面に接着したビーズを示し、これは、効率的な堆積であることを示す。
図４４は、誘導体化されていないケイ素表面に接着性を有する金ビーズを含む対照試料の電子顕微鏡画像を示す。これは、表面結合をガイドするための適した誘導体化がなく、かつ適した堆積緩衝液がないと、ビーズの表面接着の非常に低いバックグラウンドレベルが存在することを示す。それゆえに、表面のパターン化された誘導体化は、誘導体化されていない領域への堆積を起こさずに、ビーズの結合を正確にパターン化された領域に指示するのに使用することができる。
図４５は、誘導体化された接着性表面上に堆積した金ビーズの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示す。ビーズは、直径がおよそ５ｎｍから１０ｎｍの金ナノ粒子である。接着性表面は、ナノスケールの高分子マトリックスを使用して多種多様の材料の表面に都合よく結合する市販の「分子接着剤」で誘導体化されたシリコンウェーハである（Ａｎｔｅｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．製のＭｉｘ＆Ｇｏ（商標））。使用される堆積緩衝液は、炭酸塩緩衝液である。画像は、ナノメートルのトポグラフィー分解能で表面構造を示す。明るい白色の領域は、表面に接着した金ナノ粒子が集中したところである。
図４６Ａ〜４６Ｄは、表面に結合した金ビーズの機能試験を示す。データは、結合したビーズがビーズへの特異的な親和性で単一分子と結合するための官能性を保持することを例示し、それによって分子の自己アセンブリ用途への適性が実証される。図４６Ａ〜４６Ｄは、本明細書の上記で論じられた方法により金ビーズがウェルに結合したウェルプレートで実行されるＥＬＩＳＡアッセイの詳細を示す。このアッセイにおいて、予め形成された５ｎｍの金ビーズに特異的に結合するようにマウスで惹起させた抗体（ＰＡＳ１８０３７−１８０４１）を、Ｍｉｘ＆Ｇｏ（商標）（Ａｎｔｅｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）誘導体化接着性表面でＥＬＩＳＡプレートのウェルの底に付着した同じバッチからのビーズへの結合親和性に関してアッセイする。図４６Ａは、ウェルに堆積した金ナノ粒子の様々な濃度を記載したプレートのマップを示し、３連のカラムの繰り返しは、列中に示された様々な希釈率での、緩衝液、親和性抗体、未感作の血清、および対照非特異的マウスＩｇＧである。図４６Ｂは、ＥＬＩＳＡプレートからの最終的な読み取り値のカラーコード化された強度マップである。図４６Ｃは、数値で示されたＥＬＩＳＡ読み取り値の対応する表である。最後に、図４６Ｄは、グラフの形式で要約された最終的なデータの結果を描写しており、特異的な親和性を有する抗体が、表面上に堆積したビーズ濃度の全範囲にわたり、表面ビーズより、様々な対照より大きい結合を有することを示す。これは、ビーズが強い結合とＥＬＩＳＡアッセイの洗浄条件を介して表面に結合したままであり、目的の分子（ここでは特異的なＩｇＧ抗体）に関してこれまでに確立された特異的な分子結合特性も保持することを示す。
（実施例８）
分子エレクトロニクスセンサーを使用した核酸分析
この実施例は、分子エレクトロニクスセンサーを使用して核酸、具体的にはＤＮＡまたはＲＮＡをシーケンシングする方法を教示する。このようなセンサーの実施形態は、以下で論じられる図４７で例示される。
ＤＮＡの配列の決定は、生物学的調査ならびに遺伝子の生物医学的およびヘルスケア用途において根本的に重要な測定プロセスである。１９５３年にWatsonおよびCrickによってＤＮＡの構造および分子生物学におけるその基本的な役割が最初に解明されてから、所与のＤＮＡ分子を構成する核酸塩基配列を決定するための効率的な方法を開発することに主要な焦点が当てられてきた。天然のＤＮＡ分子は、それぞれ典型的にはＡ、Ｇ、Ｔ、およびＣで表記される４つの核酸塩基から構成されるバイオポリマーである相補鎖で形成される二本鎖ヘリックスである。ＤＮＡをシーケンシングすることは、このポリマーにおけるこれらの核酸塩基の正確な配列を決定することである。ＤＮＡ配列を決定するための第１の一般的な方法は、１９７７年にSangerによって導入された。Hoodらの研究により、１９８０年代後期にこのサンガーシーケンシングプロセスを実行する自動化装置が開発され商品化された。これらの機器がヒトゲノムプロジェクトを推進し、それにより２００１年に１０億ドルを超える全シーケンシングコストでヒトの参照配列が決定された。この研究の過程で、より効率的なＤＮＡシーケンシング方法を開発するための著しい努力がなされた。２００４年に、Rothbergによってこれらの大規模並列システムの１番目が導入され、商品化された。その後、単一のＤＮＡ分子を分析することができるもの、前進性の酵素の速度で分子を迅速にリアルタイムで分析することができるもの、または電子半導体チップセンサーデバイスを使用してＤＮＡ配列を感知することができるものなどの数種の他の大規模並列シーケンシングプラットフォームが導入された。２０１４年には、１０００ドル未満でヒトゲノムをシーケンシングすることが可能なシステムも商品化された。この大きな進歩にもかかわらず、それでもなお、より速く、より安価にすることができ、より少ないエラー、配列のより長い連続読み取り、またはＲＮＡもしくは改変された塩基の読み取りの形態でより高品質の配列データを提供することができるシーケンシング技術の実質的な可能性がある。機器を、より小型であるかまたは携帯可能にする、よりロバストにする、より低い価格にする、および大量生産可能にする実質的な可能性もある。加えて、例えばＲＮＡ分子のシーケンシング、および天然に存在するＤＮＡ中に存在する可能性がある改変されたヌクレオチド、例えば図４８に示されるメチル化ヌクレオチドの配列を決定することにおいて、興味深い関連問題がある。これらの通常存在するメチル化形態がＤＮＡ中に存在する場合、これは生物学的関連性を有する可能性があるため、配列中のこれらの存在も同様に読み出すことが可能であることが望ましい。より一般的には、ＤＮＡが改変されたもしくは類似体ヌクレオチド、または損傷した塩基を含有する場合、存在する標準的な塩基の配列と共にこれらの配列を同じようにして決定することが望ましい場合がある。
分子エレクトロニクス分野は、１９４０年代および１９５０年代における分子の結合および分子中の電子移動の理論に対する基礎研究の一体化から１９７０年代に出現し、同様に１９５９年にFeynmanによって支持されたようなナノテクノロジーが出現した。重要な前提は、個々の分子が、整流器、スイッチまたはセンサーなどの回路構成要素として作用する、ナノスケールの電子回路において重要な構成要素を形成することができることである。これの比類のない価値は、小型化および低出力の回路構成要素における根本原理を利用可能にすることである。さらなる価値は、個々の分子が、それらの分子相互作用により、特に個々の分子の特性を感知するためにセンサーとして比類のない特性を有し得ることである。タンパク質または酵素などの生体分子は進化した高度に洗練された特異的な分子の繰り返しを有するため、これは特に、それらを使用したバイオセンシング分野に当てはまる。
分子エレクトロニクスデバイスに対する初期の研究は１９７０年代に始まったが、１９９０年代後期および２０００年代初期においてやっと、ナノエンジニアリングの状態が、一構成要素として単一分子と統合された回路の特性の大規模調査を始めるのに必要な程度の洗練に到達した。典型的には、このような分子は、電圧を印加できるように電極間の架橋として回路に統合される。センサーとしての適用の場合、このような架橋分子は、標的分析物と相互作用するため、その導電性を変化させる。課せられたゲート電界を介した分子の感知特性をさらに調整するのに印加される「ゲート」電圧がさらに存在していてもよい。
この実施例の目的は、分子エレクトロニクスセンサーデバイスを使用した、ＤＮＡ配列の決定、および関連する核酸の分析を実証することである。これは、この目的に有用な具体的なデバイスの実施形態、およびＤＮＡまたはＲＮＡ分子の配列を決定するかまたは特徴付けるためにこのようなデバイスを使用する方法を含む。
本明細書において、核酸分析に有用な分子エレクトロニクスセンサーの２つの一般的な形態が教示される。これは、ある形態の標的核酸を処理する酵素（天然の、または特性が増大されるように操作された）からなり、このような酵素は、ソース電極およびドレイン電極、ならびに追加の電圧制御のためのゲート電極を有する３つの端部（termal）のデバイスにカップリングされる。図１に、１つの好ましい図式化した実施形態を示し、それにおいて酵素１０５は、一次回路エレメントとしてカップリングされており、回路全体は、電気特性（例えば印加された電圧下での回路中の電流、または印加された電流下での電圧など）を測定するメーターと共に構成されており、それによって測定されたトレースが、酵素１０５と連結されたＤＮＡ分子１０８の配列に関連付けられる。この配置は、酵素−ＤＮＡのコンフォメーションが、複合体を介した／その周りの電荷の伝導を実質的に変更する場合に好ましい。この状況において、「酵素」の概念は、分子生物学における厳密な意味より広くてもよく、基礎となるＤＮＡ配列に関連付けることができる、ＤＮＡ分子との相互作用の検出可能なシグナルを生成する任意の分子であり得る。
この例の状況において、図４７は、ＤＮＡ配列を測定するための分子エレクトロニクス回路の１つの好ましい形態の略図を例示する。酵素は、ソース電極とドレイン電極との間にカップリングされて、印加されたソース−ドレインおよびゲート電圧下における電流などの電気特性、または類似のシステム特性（例えば印加された一定電流での電圧）を測定するためのメーターを含む回路を形成する。時間のトレースとしての測定された特性Ｓ（ｔ）は、この処理中の、ＤＮＡにおける酵素の前進作用および電気的な構成要素としてのその可変特性のために、基礎となるＤＮＡ配列を反映する。
図４９は、酵素が、二次または並列回路のエレメントとしてカップリングされており、このようなエレメントが、一次導電性エレメントに対して導電性およびゲーティング活性の両方を有していてもよく、回路全体が、電気特性（例えば印加された電圧下での回路中の電流、または印加された電流下での電圧）を測定するメーターと共に構成されており、それによって測定されたトレースが、酵素と連結されたＤＮＡ分子の配列に関連付けられる、別の好ましい図式化した実施形態を描写する。略図は、より標準的なソース−ドレイン−ゲートの幾何学的配置で表されている。この配置は、酵素−ＤＮＡのコンフォメーションの変化が、主に配列依存性のゲート電圧を印加する別のゲート電極として作用する一次導電性エレメントに、可変のゲーティング電圧を印加することができる場合に好ましい。この状況において、「酵素」の概念は、分子生物学における厳密な意味より広くてもよく、基礎となるＤＮＡ配列に直接的または間接的に関連付けることができる、ＤＮＡ分子との相互作用の検出可能なシグナルを生成する任意の分子であり得る。
図５０は、ＤＮＡ配列を測定するための分子エレクトロニクス回路の別の好ましい形態の略図を例示する。酵素は、二次エレメントとして、ソース電極とドレイン電極の間の一次導電性エレメントにカップリングされて、酵素がゲーティング機能および導電も提供することができる回路を形成する。回路は、印加されたソース−ドレインおよびゲート電圧下における電流などの電気特性を測定するためのメーター、または類似のシステム特性（例えば印加された一定電流での電圧）を含む。時間のトレースとしての測定された特性Ｓ（ｔ）は、この処理中の、ＤＮＡにおける酵素の前進作用および電気的な成分としてのその可変特性のために、基礎となるＤＮＡ配列を反映する。
図５１は、図１の略図をより説明的な好ましい実施形態で描写しており、半導体デバイスからのソース−ドレイン−ゲートの幾何学的配置、および一次導電性エレメントとしての電極と、近接および可能であれば電気的な接続を確実にする１つの手段としての、酵素を架橋にカップリングするカップリングポイントまたはコンジュゲーション基との分子架橋が共に示される。
これらの一般的な分子電子シーケンシング感知デバイスのクラスを教示してきたが、本発明者らはここで、配列を測定するまたは特徴付けるのにこれらを使用する具体的な好ましい実施形態および方法を教示する。
図５２に示される好ましい一実施形態において、酵素は、ポリメラーゼであり、ＤＮＡ分子は、プライムされた一本鎖であり、酵素の前進作用は、溶液中のｄＮＴＰからの相補鎖の合成である。ポリメラーゼは、ｄＮＴＰを含有する好適な緩衝液が存在すると仮定すると、プライムされた一本鎖ＤＮＡ鋳型を伸長させる。取り込みプロセス（Ａヌクレオチドの取り込み、図５２で示した通り）は、測定された電流のトレースに対応する識別可能な特徴を生成し、それによって配列が決定される。測定される回路パラメーター、例えば電流がモニターされ、具体的なトレース特徴を使用して、どの塩基が取り込まれるかを検出することができ、それによって非同期的な様式で鋳型ＤＮＡの配列が決定される。好ましい一実施形態において、ソース−ドレインおよびゲートにつき一定の印加された電圧下でモニターされるのは、電流である。別の好ましい実施形態において、測定される回路パラメーターは、ソース−ドレイン電圧またはゲート電圧を掃引することにより得られたＩ−Ｖ特性であってもよく、このＩ−Ｖ曲線は、塩基が取り込みプロセスにある完全なＩ−Ｖ曲線が得られ得るように高頻度で繰り返して測定することができる。別の好ましい実施形態において、交流パルスへの応答が、測定された回路パラメーターとして使用することができ、このパルス化は、当該の塩基が取り込みを受けつつ情報を得るのに十分高い周波数で実行される。
図５３に示される別の好ましい実施形態において、シーケンシングは、取り込みが検出可能なシグナルを生成するが、必ずしも取り込まれた塩基のアイデンティティーを決定しない場合に実行することができる。このシナリオでは、１つのみの塩基を含有する試行溶液を、例えば、Ａの試行、洗浄、Ｃの試行、洗浄、Ｇの試行、洗浄、Ｔの試行、洗浄、および繰り返しのような洗浄／フラッシングステップによって逐次的に添加し分離することができ、特定の塩基の試行中に観察された得られたシグナルは、１つまたは複数のその塩基の取り込みを示し、そのため対応する配列を示す。この無期限に繰り返される試行プロセスは、準同期的な様式で配列を決定する。
第１の相で、ｄｄＮＴＰジデオキシターミネーターの溶液への曝露によって可逆的なターミネーターヌクレオチドが取り込まれ、それに続くヌクレオチドの曝露において回路の感知を続け、ヌクレオチドが一時的にポリメラーゼの結合ポケット中に滞留するが、存在するターミネーターにより取り込まれない間にシグナルを収集する第２の相が続く、上記２つのシーケンシング方法の別のバリエーションが本明細書でさらに開示される。これらの曝露は、全てのｄＮＴＰの混合物中で行ってもよいし（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔがポリメラーゼ結合ポケット中に滞留するときにそれらが区別可能なトレースを有する場合に好ましい）、または個々のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ溶液への試行曝露で行ってもよい（結合ポケット中での滞留のシグナルが、塩基間で区別可能ではない場合に好ましい）。いずれのケースにおいても、このようなシグナルは、ある検出可能な方法において、ポケット中で正確に対合する塩基と、ポケット中で不正確に対合する塩基との間で異なり、これは、ターミネーターのためにどれも取り込むことができないとしても、正確に対合するヌクレオチドは、不正確に対合するヌクレオチドに比べて結合ポケット中で異なる滞留特性を有するという事実を反映する。十分に長い時間にわたりこのような１回または複数回の曝露からシグナル情報を収集することにより、正確に対合する塩基の識別は、ポケット中のスパイクの持続時間などのシグナルの差により達成される。この時点で、ターミネーターは逆反応を介して除去され、次の末端の塩基が取り込まれ、プロセスが繰り返される。このようにして、配列が決定される。任意に長い時間にわたりデータを収集することができるため、十分に高い識別力を有するシグナルを蓄積することによって、正しい次の塩基に関する任意の望ましいレベルの確実性を達成することができる。
前述の方法において、上述したように、非標的化または標的化シーケンシングのいずれかを達成するのに、類似の非標的化または標的化プライミングを使用できることが教示される。
以下に記載のように、上記の一般的なシーケンシング方法は、様々な方法によって強化できることがさらに開示される。
ヌクレオチド
図５４および図５５で示された通りに、改変されたヌクレオチドを使用して、取り込みの検出、または上記の方法で取り込みを受けた異なる塩基の識別のいずれかを強化する区別可能なまたは検出可能なシグナルを生成することができる。特に、ガンマリン酸上の基を有するヌクレオチドを使用して、区別可能なシグナルを一時的に生成することができ、この場合、強化のための基は、ポリメラーゼ取り込みプロセスの過程で切り離される。特に、この開示は、電荷を有する基を使用して、測定された電流シグナルの強度または特徴を強化する局所的な一過性の電界効果ゲーティングを生成できることを教示する。この開示はまた、除去可能な検出可能な基を有するヌクレオチドを試行の取り込み様式で使用することができ、それぞれのこのような試行の取り込みの後、多数の検出ステップ、次いで検出可能な基を除去するステップが存在し得ることも教示する。この開示は、このような基は、電荷を有する基であってもよく、検出は、場合により検出を容易にする様々な緩衝液、例えば低い導電率の緩衝液、または検出可能な基を活性化する緩衝液の存在下で、電流などの回路の電気的な検出特性、または特定の印加された電圧に対する応答、電圧の掃引、またはＡＣ電圧を使用できることを教示する。この開示は、このような改変されたヌクレオチドはまた、ターミネーター基を有していてもよく、次いでシーケンシングプロセスは、合成によって可逆的なターミネーターシーケンシングの方式で行うことができ、ターミネーターおよび検出可能な基は、それぞれの取り込みおよび検出ステップが完了した後に切断されることを教示する。
さらに、教示された方法において、システムのリアルタイムな電気的なパラメーターによってモニターされる取り込みの動態を、それぞれの取り込まれた塩基を識別するのに使用できるように、異なるヌクレオチドを、区別可能な動態シグネチャーを有するように調製することができる。特に、異なる動態シグネチャーは、溶液中の異なるヌクレオチドの異なる濃度、またはそれらに対する取り込みの動態を変更する改変によるものであってもよい。動態シグネチャーとしては、図５６で示されるように、取り込みスパイクの高さもしくは幅、または取り込みスパイク間の時間間隔を挙げることができる。
図５６は、配列情報の動態的なコード化を示す。取り込みスパイク間の時間は、ここではｄＮＴＰ濃度に差があるため、取り込まれている塩基を示す。つまり、Ａが最低濃度であり、それゆえにスパイク間の長い時間が、Ａの取り込みに予測される待機時間を示し、一方でＧが最大濃度であり、したがってスパイク間の最短時間がＧの取り込みを示す（第１のインターバル）。
酵素
ポリメラーゼ酵素は、生成されたシグナルを強化するようにタンパク質工学によって改変されていてもよいことがさらに開示される。この１つの好ましい実施形態は、その表面に荷電アミノ酸基を配置することであり、それにより酵素がコンフォメーションを変化させ、それに対応して局所的な電場構造を変化させるときに電流の変動を誘導することができる。
回路のパラメーター
ゲート電圧は、これらの取り込みのシグナルまたは塩基識別を最大に強化するように設定できることがさらに開示される。本発明者らは、印加されたＡＣ電圧もしくは電圧分光法または特定の印加された電圧の波形に対する応答は、取り込みの検出、または塩基識別を強化するのに使用できることを教示する。特に、ゲート−ドレイン電圧、および／またはゲート電圧を掃引して、特定のヌクレオチド（天然の、または改変された）が滞留している時間、取り込み中の時間、取り込まれる時間、またはプロセスの検出相を受けている時間中にシステムのＩ−Ｖ特性を得ることができる。このようなＩ−Ｖ特性は、どの１つまたは複数の塩基が存在するかを決定することができる。
緩衝液
このプロセスで使用された緩衝液は、一般的に塩およびヌクレオチドを含有し、シグナルを生成するように最適化できることがさらに開示される。特に、例えば、緩衝液のイオンによって持ち込まれる電流からのノイズを低減するか、またはデバイ長とそれに対応する電場が溶液に浸透する程度を増加させるために、緩衝液は、実質的に希釈される場合がある。このような希釈緩衝液において、本発明者らはまた、溶液中でのマグネシウムイオンを比較的低濃度に維持しながらそれらのポリメラーゼへの利用可能性を増加させるために、取り込まれるべきｄＮＴＰを事前にマグネシウムと複合体化できることも教示する。
架橋
図５７および５８に、追加の好ましい実施形態を例示する。図５７は、チオール連結（ＤＮＡ端部におけるチオール化されたヌクレオチド、またはアルファヘリックス末端に配置されたシステイン）を介して金接触部にカップリングされたらせん状のポリマー（ｄｓＤＮＡまたはタンパク質アルファヘリックス）を含む架橋の好ましい実施形態を例示し、酵素にコンジュゲートしたストレプトアビジンへカップリングするための特異的に合成された内部ビオチンを共に示す。図５８は、電極上の接触ポイントに特異的な親和性（一次接触ポイント材料への親和性、または表面の抗原による誘導体化）を有するＩｇＧタンパク質（天然の、または操作された）としての架橋の別の好ましい実施形態を例示し、この架橋は、ＩｇＧに特異的に結合するタンパク質（例えば抗ＩｇＧ抗体、またはプロテインＡもしくはプロテインＧ）を介したカップリングを用いており、このタンパク質は、一方で目的のタンパク質にコンジュゲートしているか、または目的のタンパク質は、天然の、もしくは操作されたコンジュゲーション部位を使用してＩｇＧに直接コンジュゲートしていてもよい。架橋分子は、分子の端部におけるチオール化されたヌクレオチドを介して電極上の金接触部ビーズにカップリングされた二本鎖ＤＮＡ分子である。カップリングは、ＤＮＡ内部のビオチン化したヌクレオチドを使用することによって達成され、このヌクレオチドは、ストレプトアビジンにコンジュゲートすることができ、これは順にポリメラーゼにコンジュゲートすることができる。同様に、架橋は、別の方法で同様にカップリングされ連結されるタンパク質アルファヘリックスであってもよい。架橋の別の好ましい実施形態は、図５８で示されるような、ソースおよびドレイン上の接触ポイントにとって好適な特異的な親和性を有し、ポリメラーゼにコンジュゲートしたＩｇＧ結合タンパク質（例えば抗ＩｇＧ、プロテインＡまたはプロテインＧ）によって媒介されるカップリングを有するＩｇＧ抗体分子（天然の、または操作された）である。
複製および統合
図５９で例示されているように、上記からの異なる具体的な実施形態を用いて実行された独立したシーケンシング試行から獲得されたデータを統合して、部分的に獲得された情報から完全なシーケンシング情報を生成することができる。図５９は、全情報を達成するための記載された方法の異なる実施形態を使用した同じ（または複製された）ＤＮＡ鋳型の複製シーケンシングからの部分的な配列情報の組合せを示す。青色のトレースは、組み合わされた情報（これは、単一のシーケンシング試行では直接観察できない）の灰色のトレースに対する、それぞれ別個の例からの部分的な情報を示す。ここで、鋳型をシーケンシングして（左の実施形態）、部分的な情報を作成し（Ａ塩基のみ検出できることを示す）、再度シーケンシングして（右の実施形態、架橋および酵素に対する変化を示す）、補完的または補助的シーケンシング情報を作成し（Ｇ、Ｔ、Ｃが検出されることを示す）、次いでこれらを組み合わせて全配列を得ることが示される。この２つのシーケンシングの実施形態は、複製鋳型を使用して物理的もしくは一時的に隔離され独立していてもよいし、または同じ鋳型を再度読み取る際の、異なる時間における同じセンサーシステムの異なる状態、すなわち、おそらく緩衝液の変化、温度の変化またはゲート電圧などの印加された電圧の変化によって生じ得る状態であってもよい。このような補完的な実施形態のいずれもが、最終的な配列決定を改善するためにそれらの情報を組み合わせる場合がある。好ましい一実施形態において、これは、同じセンサー−ＤＮＡコンジュゲートであるが、緩衝液、ｄＮＴＰ、温度、印加された電圧、モニターされる回路パラメーター、計測プロセスなどへの変化など異なる全体条件下であってもよく、この場合、ＤＮＡ鋳型は、ある方式で再度読み取られる（ストリッピングおよび再伸長させて、環状またはヘアピンの鋳型を介して読み取り、同じ鎖を再度照合する、または相補鎖を照合する）。別の好ましい実施形態において、１つのデバイスは、単一のチップのフォーマット上に統合された多様なセンサー（異なる架橋分子、酵素など、または好ましい一実施形態において、異なる印加された電圧）を含有していてもよい。多数の複製鋳型（クローンまたはＰＣＲ複製物）が、並行して異なるセンサーがそれらそれぞれのＤＮＡコピーを照合するように適用される。次いでこれらの独立したセンサー測定を統合することにより、調査中の鋳型に関する完全なシーケンシング情報が得られる。好ましい一実施形態において、センサーは、それらの制御された特性において実質的に同一であってもよく、多様性は単に、センサーの特性および性能におけるノイズまたは制御不能なバリエーションを平均化する手段を提供する。別の好ましい実施形態において、シーケンシングの化学において同じ鋳型および同じ一次溶液に曝露される１つのチップ上に、補完的な検出力を有する様々な架橋および改変された酵素を配置して、並行して補完的な情報を生成することができる。別の好ましい実施形態において、当該のセンサーは、その鋳型を保持しており、この鋳型は、異なる条件下（緩衝液、温度、印加された電圧、回路の計測、ｄＮＴＰもしくはｄＮＴＰの混合物（天然の、もしくは改変された）の濃度）、または異なるシーケンシング試行において上記のような異なるシーケンシング方法で、好適には複数回読み取られ（伸長した鎖のストリッピング、または環状もしくはヘアピンの鋳型の使用を介して）、時間に関して一連の部分的な配列情報の補完的な獲得をもたらし、これを統合して、より完全な配列情報を得ることができる。
上記のものなどのシステムはまた、ＤＮＡ鎖中に存在する様々な改変されたヌクレオチドまたは塩基類似体、例えば図４８のメチル化塩基も区別できることがさらに開示される。
上記の方法において、取り込みステップは、部分的に決定された配列情報が生じるように、獲得されたシグナルから区別不可能なヌクレオチドを含む場合があり（例えば、適用されたｄＮＴＰ混合物は、ヌクレオチドのサブセット、例えば｛Ａ，Ｔ｝を含有する可能性がある）、それゆえに取り込みスパイクは、サブセットのメンバーが取り込まれたことを示す。それにより、部分的な配列情報を得ることができる。このような情報は、上述したような複製シーケンシングを介して、補完的な方法で組み合わせて（異なるヌクレオチドのサブセット）、異なる部分的な観察に一致する基礎となる配列をさらに決定することができる。
分子フィンガープリンティング
例えば部分的にまたは単独で区別可能な取り込みスパイクに基づく上記の方法を使用して、長い範囲の分子フィンガープリンティングを実行することができる。本出願において、局所的なシーケンシング情報を生成する方法のいずれもが、局所的なシーケンシング情報のストレッチを生成するのに採用することができる。次いで全ての４つのｄＮＴＰを添加し、システムは、ある長さの時間にわたり自由な取り込みを許容し、その時間の間に取り込みスパイクを検出し、カウントして、この取り込み相によってつなげられた塩基の数の尺度を提供する。次いでこの相を、例えばｄＮＴＰ緩衝液をフラッシングで除くことによって停止させ、局所的なシーケンシング方法を再開して、別の局所的な配列特徴を決定する。このプロセスは、長いＤＮＡ鋳型の全長にわたり繰り返すことができる。得られた配列コンテクスト（Ｓｉ）、およびそれらの間の塩基距離の推測値（ｄｉ）は、リスト｛Ｓ１、ｄ１、Ｓ２、ｄ２、Ｓ３、ｄ３・・・｝として、ＤＮＡ断片の全体構造を識別するフィンガープリントを形成する。この情報は、オーバーラップする断片の収集の大規模な構造的なマッピングに、または所与の参照ゲノムに対するこのようなマッピングに使用することができる。
他の好ましい実施形態では、酵素がＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素であり得、対応する、シーケンシングされるＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型を伴う。
シグナル処理および配列分析アルゴリズム
獲得したシグナルから配列を決定するのに、シグナル処理方法が必要な場合がある。これは、訓練または較正訓練データを使用した分類器システムの訓練または機械学習、および基礎となる配列を決定または制限するための様々なデコンボリューションまたは分類または隠れマルコフモデルの使用を含み得る。この開示は、これらの方法がしばしば全体的な配列決定プロセスの不可欠な部分であることを教示する。好ましい実施形態において、これは、特徴をセグメント化し、ノイズから、および代替の候補配列エレメントに関連する特徴間で特徴を識別／分類するためのシグナル処理方法を含む。このプロセスは、スパイク間の時間、スパイクの高さ、持続時間、およびセグメント化シグナル中の下位特徴のような特徴などのセグメント化シグナルからのパラメーターの抽出を含んでいてもよい。次いで最終的な配列決定分析はさらに、処理したシグナルを基礎となる配列のモデルにデコンボリューションまたはフィッティングし、データと最もよくフィッティングするモデルを探し、このようなフィッティングに信頼水準またはオッズを割り当てるアルゴリズムを含んでいてもよい。特に、分析の１つの好ましい実施形態において、未加工のシグナルからノイズ除去するための前処理、および未加工のシグナルのセグメント化、および未加工のシグナルの正規化を行ってもよく、次いで一般的に基礎となるシーケンシングから生成されたシグナルのモデルがあり、観察されたデータが基礎となるシーケンシング候補に由来するオッズが割り当てられる。次いで最大尤度の配列を決定することができる。別の好ましい実施形態において、配列予測は、観察されたシグナルと予測されたシグナルとの差を測定したコスト汎関数の最適化と定義することができ、最適化理論の方法を使用して、基礎となる配列に関するこのような公式化を効率的に解決することができる。
上記の方法は、全配列ほど情報を提供しないＤＮＡのある特性、例えば断片の単なる長さ、または部分的な配列情報、または数種の可能性のある配列群の１つにＤＮＡ鋳型を分類するのに使用できる情報を測定することができる。これは、単一の塩基のシーケンシングまたは遺伝子型解析の適用を含む。これはまた、断片長の分析、例えばマイクロサテライトマーカーのタイピング、またはインデル多形のタイピングで使用されるものも含む。
このようにして得られた配列情報を、同じＤＮＡ分子、またはそれらの複製の複数の試行から組み合わせて、エラーをフィルター除去し、基礎となる配列を決定することができる。本発明者らは、第２の鎖を取り出し、同じ分子を再シーケンシングして、これらのデータを組み合わせることによって精度を改善できることを教示する。本発明者らは、ＤＮＡ分子が環状である場合、ＤＮＡ分子を直線的に読み取ることによって繰り返してシーケンシングして、精度を改善することができ、ＤＮＡ分子がヘアピンの形態を有する場合、両方の鎖を直線的に読み取り、フォワードおよびリバースの配列情報を得て、精度を改善することができることを教示する。シーケンシング技術分野の当業者に公知のこれらおよび他のこのような方法は、本発明に適合する。
酵素は、リガーゼであってもよく、ＤＮＡオリゴのライゲーションが検出され、配列情報を得る、または配列を分類するのに使用される。複数回の連続的なライゲーションを使用して、同じ分子に連続的になされるか、または異なる回でなされるかにかかわらず、配列を決定することができる。ライゲーションのシグナルは、上記の様々な手段によって強化することができる。
酵素は、例えば図６０に示されるようにエキソヌクレアーゼであってもよく、それにより、塩基が処理および放出されるときに塩基の数またはアイデンティティーが検出される。切り出しまたは塩基識別のシグナルは、上記の様々な手段によって強化することができる。図６０は、酵素がエキソヌクレアーゼである実施形態を例示する。シグナルは、回路パラメーターに対する、酵素のコンフォメーション、ＤＮＡのコンフォメーション、および解放されたヌクレオチドの作用によって生成される。
他の実施形態において、酵素は、図６１に示されるようにヘリカーゼであってもよく、塩基がヘリカーゼを通過するときに塩基の数またはアイデンティティーが検出される。切り出しまたは塩基識別のシグナルは、特に、ＤＮＡを含むヌクレオチドの改変、またはヘリカーゼへの操作された変化などの上記の様々な手段によって強化することができる。図６１は、前進性の酵素が、二本鎖ＤＮＡ鋳型をほどくＤＮＡヘリカーゼである実施形態を例示する。
酵素はまた、図６２で示されるようにタンパク質のナノポアを含んでいてもよい。図６２は、酵素が、タンパク質のナノポアおよびＤＮＡ移行能力を有するモータータンパク質酵素で形成される複合体であるその実施形態を例示する。特に、酵素は、ＤＮＡ移行機能を有する前進性の酵素（例えばヘリカーゼ、ポリメラーゼ、またはウイルスモータータンパク質）およびタンパク質のナノポアの複合体であってもよい。この実施形態において、システム電流または他の電気的なパラメーターもしくは応答における変化は、ナノポアを横切る塩基を反映する。デコンボリューション方法を使用して、基礎となる配列を再構築することができる。この状況においてＤＮＡが環状である場合、精度の改善のために同じ分子を繰り返して読み取ることができる。塩基識別のシグナルは、上記の様々な手段によって強化することができる。
シーケンシング化学の当業者はまた、改善されたシーケンシング結果をもたらすために本発明の上記の要素の多くをどのように組み合わせるかも理解している。
全ての上記の方法は、このようなセンサーのアレイを含有し、測定回路およびデータ読み出し回路成分を大規模並列の様式で支持する、図６３に示されたセンサーアレイ集積回路チップ上で実行して、大量生産可能なデバイス上で多くのＤＮＡ断片の大規模並列シーケンシングを達成することができる。図６３は、統合されたチップセンサーアレイデバイスを例示する。この様式は、単一のＤＮＡ断片の複製の配列データのロバストな平均化またはデータ統合のために、多くの配列からの配列を同時に大規模並列的に感知することを実行する方法、および各部位に多様なまたは同一なセンサー構築物を配置する選択肢を提供する。特に、センサー全体は、１０ｎｍの寸法を有するナノスケールのデバイスであってもよく、これは、必要に応じてＣＭＯＳ半導体ノードを１４ｎｍまたはそれ未満で使用して、測定のための電子機器を局所的に統合できることを助け、チップ上に統合されたセンサーの非常に高密度のアレイをもたらす。これは、標準的な寸法の単一のチップ（すなわち単一のステッパー露出領域）上に最大１０，０００，０００個のセンサーを有効にすることを可能にする場合がある。また、この様式で、上記および図５９に記載したように、多様なまたは同一であってもよいセンサーのアレイに対してＤＮＡ分子のクローンまたは複製集団が適用される場合、それにより同じ分子の複数の読み取りを組み合わせて、シーケンシング中のエラーをフィルター除去し、より一層正確なシーケンシング結果をもたらすことができる。
センサーアレイでの多重部位分析
このようなセンサーアレイに、複数の部位にプライムされた長い一本鎖ＤＮＡ断片を導入して、記載されたシーケンシング方法のいずれかを使用して、異なるセンサー位置でポリメラーゼ酵素によって捕捉される多数のプライムされた部位でシーケンシングを開始させることができる。これは、長い断片から同時に複数のシーケンシングの読み取りを得る新規の方法を提供する。これは、このような断片の読み取りを促進し、かつバリアントのフェージング、またはハプロタイピング、または大規模構造分析などの断片の長い範囲の距離の構造をアセンブルするのに使用できる情報を提供することが可能である。
ターミネーターシーケンシング
ターミネーターシーケンシングでは、ジデオキシターミネーターｄｄＮＴＰおよびｄＮＴＰのミックスが供給され、それによりｄＮＴＰ（天然の、またはシグナルを強化するように改変された）の取り込みからの取り込みシグナルスパイクは、ターミネーターが取り込まれるまで（天然の、または検出基を付加した）、鋳型に沿った塩基位置のカウントを提供する（１位、２位、３位、・・・、Ｌ位、ここでＬは、鋳型の塩基長さである）。次いで前記ターミネーターは検出手順を介して照合され、検出手順は、同じ形態または異なる形態、例えば異なる検出緩衝液、温度の使用を感知することであってもよく、あるいは好ましい実施形態において、存在するｄｄＮＴＰを識別し、それによって鋳型に沿った指示された位置の塩基を識別するための、電圧の掃引もしくは波形またはＡＣ応答またはＩ−Ｖ特性の使用であってもよい。好ましくは図６３の場合のように複製された鋳型が供給されたセンサーアレイチップ上で並行して実行される多くのこのような試験試行からのデータを組み合わせ、結果をアセンブルすることによって、それぞれの可能性のある塩基の配置（１，２、３、・・・、Ｌ）における塩基のアイデンティティーを決定することができ、それによって配列全体を決定することができる。図６４Ｂに示されるターミネーターシーケンシングの別の好ましい実施形態において、単にｄｄＡＴＰターミネーターと混合されたｄＮＴＰを用いて別個の反応を試行することができ、それぞれのこのような試行は、ｄＡＴＰの代わりにｄｄＡＴＰのランダムな取り込みにより反応が終結する鋳型中のＡ塩基の位置を識別する。多くのこのような試行を実行することは、鋳型中の全てのＡ塩基の配置を識別する。これは、センサーアレイチップ上で単一の並行反応の試行で優先的になされて、１つの並行反応におけるこのような全てのＡ終結データが蓄積される。同様にＣ、Ｇ、およびＴ終結の別個の反応がそれぞれ実行されて、それぞれ鋳型中のこれらの塩基の配置を決定し、このような全ての単一の塩基終結結果の組合せが、配列全体を決定する。図６４Ａは、ターミネーターシーケンシングプロセスにおける試験的な試行を例示する。ｄＮＴＰ（青色）およびジデオキシターミネーター、ｄｄＮＴＰ（紫色）の混合物の存在下で、重合および感知が進行し、示されているように、ターミネーターがランダムに取り込まれるまでの塩基位置を（示されている８位まで）カウントするのに使用される取り込みスパイクが生じる。反応の終わりに、感知測定が行われ、ターミネーター塩基（このケースではＡ）が識別される。したがって基礎となる配列は、８位にＡを有する。この鋳型または複製鋳型でこのような測定を繰り返し、情報を組み合わせることによって、鋳型に沿った全ての配置における塩基の全配列を決定することができる。
この好ましい実施形態は、アレイ１つ当たり１つの高レベルの反応試行で基礎となる鋳型ＤＮＡの配列を効率的に決定するために、図６４Ｃで示されたようにそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴ終結反応に専用の４つのセンサーアレイチップを使用することである。
ハイブリダイゼーションによるシーケンシング
特殊なケースのセンサー構築物を使用したハイブリダイゼーションによるシーケンシングがさらに開示され、そこに付着した分子は酵素ではなく、架橋に係留したＤＮＡハイブリダイゼーションプローブであり、または別の好ましい実施形態において、プローブは、図６５および６６に例示されるように架橋の全てまたは一部として作用する。最も一般的には、架橋複合体は、利用可能なハイブリダイゼーションプローブを含み、多くの可能性のある実施形態がある。このケースにおけるセンサーシグナルは、標的ＤＮＡ一本鎖に対するハイブリダイゼーションが起こったかどうかを示す。ハイブリダイゼーションプロセスによる一般的に公知のシーケンシングの場合と同様に、好ましくは図６３の場合のようなセンサーアレイで並行して実行される多くのこのような測定に基づく、プローブが標的ＤＮＡにハイブリダイズするかまたはハイブリダイズしないことに関する集合データを使用して、鋳型配列の完全決定までどれだけの可能性のある基礎となる配列がデータに最も適合するか推測することができる。このプロセスにおいて、シグナルは、図６７で示されるように伸長反応を介して強化することができ、ここで酵素による伸長は、検出可能なシグナルを増加させる基を含む１つまたは複数の塩基を取り込むことができる。加えて、不適切に対合したハイブリダイゼーションを識別する／不安定化するために、ゲート電圧を使用して電子的なストリンジェンシーを適用してもよく、それによって誤ったハイブリダイゼーション検出を低減することができる。ストリンジェンシーはまた、記録されたシグナルに基づいていてもよく、それにより不完全な対合から完全な対合を識別して、誤ったハイブリダイゼーション検出を消去することができる。ヘアピンの配置、ＲＮＡまたはヌクレオチド酸類似体（ＬＮＡ、ＰＮＡなど）から作製されるプローブの使用、イノシンまたは他の普遍的に結合するプローブ塩基の使用、およびまたポリメラーゼ伸長などの酵素的な処理、または特異性の尺度としてのライゲーションなどのストリンジェンシーを増加させる当業者に公知の様々な方法も適用できることがさらに教示される。チップ様式において、ハイブリダイゼーションによるシーケンシングは、並行して実行することができる。チッププローブへのプローブハイブリダイゼーションを、溶液中に適用された検出可能な区別可能なハイブリダイゼーションプローブ、または一次ライゲーションプローブのシーケンシング可能な伸長のある数の塩基の組合せのセットの結合／ライゲーションと組み合わせることは、このアプローチのシーケンシング能力、すなわちより多くの配列情報を必要とする能力をさらに拡張することができる。本発明者らはまた、チップ上に無名で設置されたハイブリダイゼーションプローブは、前記プローブ上の検出可能な標識を含ませることによって、またはプローブ上の結合バーコードをデコードするための組合せの結合プロセスによってデコードし識別できることも教示する。特に、プローブは、一連の検出可能なオリゴハイブリダイゼーションによってデコード可能な組合せのＤＮＡバーコードを有していてもよい。プローブは、事前の光学的な画像化プロセスによってデコードされた光学的な標識またはバーコードを有していてもよい。本発明者らは、センサー部位の電子的なアドレス指定が、公知のプローブが望ましい部位に置かれるように指示された様式でハイブリダイゼーションプローブを堆積させるのに使用できることをさらに教示する。本発明者らは、ハイブリダイゼーションプロセスを促進するのに電圧を使用でき、特に、遊離のＤＮＡ鋳型をプローブに引き付けるのにゲート電圧を使用でき、ハイブリダイゼーションの速度を増加させ、必要な鋳型の量を低減することを教示する。
参照に対する新たな構造的なアセンブルまたは構造的なアセンブルのために長い断片の大規模並列フィンガープリンティングを実行するために、上述した分子フィンガープリンティングシーケンシング化学と共にアレイを使用することがさらに開示される。
上記のプロセスで使用されたプローブ分子または酵素は、制御可能に電子的であり得る、すなわち、天然型で、もしくは操作された改変を介してのいずれかで、または緩衝液の特性（例えば酸または塩基の誘導）を介して、それらのＤＮＡとの相互作用を可能にするもしくは強化するか、またはその相互作用を不可能にするもしくは阻害するかのいずれかが可能である。特に、これは、例えばゲート電圧によって影響を受ける可能性がある。本発明者らは、これは、より迅速に、またはより高いストリンジェント（良好なシグナル対ノイズ）条件下でデータを集めるのに使用することができ、いずれの方法においても、操作時間単位当たりに収集された正味の量の情報を増加させることをさらに教示する。特に、アレイの設定において、アレイ上の様々なセンサープローブまたは酵素の異なる電子的な制御を使用して、当該の配列または配列特性にとって全体的なより大きい有益性を提供することができる多様な補完的情報を集めることができる。例えば、電子的な制御が酵素による処理をスピードアップまたはスローダウンし得る場合、異なるセンサーが断片の異なる領域により迅速に処理を行うことができ、次いでより正確な局所的情報に焦点を当て、センサーアレイに複製で供給された長い鋳型の長さに沿ってより正確な評価を得ることができる。
プローブ分子は、ゲート電圧などの電子的な制御下でそれらのＤＮＡ鋳型を放出するように作製されていてもよい。これは、獲得したシーケンシング情報に基づき望ましい断片を保持し、望ましくない断片をシステムから放出しフラッシングすることによってそれらを追い出すのに使用することができる。その後、より大規模なシーケンシング、または部分配列分析による存在する可能性がある改変されたまたは損傷した塩基の決定などのさらなる使用のために、望ましい断片を放出させ、周囲の溶液から収集することができる。このような後続の分析は、現行の手段または他の手段、例えば質量分析を介していてもよい。例えば、これは、がん細胞由来のＤＮＡを分析する状況において、起こったＤＮＡ損傷を研究するために、またはニューロン細胞もしくは幹細胞などの特殊な環境で生じるＤＮＡの改変を研究することにおいて興味深い可能性がある。
液体の移行および処理
記載された様々なシーケンシング方法は、１つまたは複数の緩衝液を用いた作業を伴う。本発明者らは、この状況においてこれらのデバイスを用いて効率的に作業する数々の方法を教示する。本発明者らは、センサーまたはセンサーアレイをフローセル中に設置すること、および微小流体システムを使用して、セルにおよびセルから外に緩衝液をポンプで送ることを教示する。本発明者らはまた、異なる緩衝液容器間でセンサーまたはセンサーアレイチップそれ自身を移行させ、それを各々浸漬させて、ポンピングシステムで可能な流体交換より迅速な流体交換を達成することも教示する。
マイクロウェルの単離
追加の検出方法も可能にする、この液体移行の概論の特殊なケースにおいて、本発明者らはまた、アレイ中の個々のセンサーは、それら自身のマイクロウェルのくぼみ（すなわち、ミクロサイズの容量を有するウェル）、またはマイクロウェル１つ当たり複数のくぼみ中に存在していてもよいこと、および図６８で示されるように、センサーのアレイ全体が多数のこのようなマイクロウェル内に含有されていることも教示する。単一の巨視的なカバー／カバー除去またはシール／シール除去プロセスは、処理および液体移行を同時に行うために、このようなウェルをシールおよびシール除去するのに使用される。その利点は、シールしたマイクロウェル中に反応物および反応生成物が局在化され、バルクの流体に損失しないこと、およびさらに、任意のこのような捕捉された分子が繰り返し近接して封入されたセンサーを通過することであり、それにより、反応物を局所的に蓄積させて、電子的な検出可能なシグナルを生成することを必要とする、または所与の標的を同じセンサーに複数回連結したりそれから離脱させたりして、検出可能なシグナルを得ることを必要とする異なるタイプの感知反応を容易にすることができる。または、最初の開始分子が、経時的に局所的に蓄積するはずであるシグナル伝達分子のカスケード生成をもたらしてもよい。特に、これは、一次シーケンシング反応が分子を放出し（例えば、Ｈ、ピロリン酸、およびガンマリン酸に付着したタグを放出するポリメラーゼ伸長、または次の切り取られた塩基を放出するエキソヌクレアーゼ）、分子センサーが、この分子、このような分子の累積、または開始分子から生じる分子のカスケードを検出するのに必要なプローブ分子を含む場合、有用である可能性がある。図６８は、バルクの／巨視的なプロセスでシールおよびシール除去することができるマイクロウェルまたはナノウェル中に封入されたセンサーを例示する。このセンサーは、反応物および反応生成物を局在化して、他の検出様式を容易にする。このセンサーはまた、前進性の酵素が、反応生成物を検出するためにプローブと共に存在できるように、ウェル１つ当たり複数のセンサータイプ、またはセンサー１つ当たり複数のプローブ分子から利益を得ることもできる。
様々な例において、３つの末端の分子電子センサーは、一次ソース電極およびドレイン電極ならびに電界効果ゲート電極を含み、プローブ分子は、ソース電極とドレイン電極との間にカップリングされているか、またはプローブ分子は、ソース電極とドレイン電極の間にカップリングされた架橋分子にカップリングされており、プローブ分子は、検出可能な相互作用で核酸ポリマーと連結されており、検出は、回路パラメーターをモニターすることを含む。様々な例において、検出可能な相互作用は、候補配列エレメントのあるセットに対する、それにより相互作用する核酸ポリマーの配列の組成と関連し得る。ポリマーは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってもよく、候補配列エレメントのセットは、それぞれＤＮＡの場合は｛Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ｝、またはＲＮＡの場合は｛Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｕ｝であってもよい。
様々な例において、候補配列エレメントは、改変されたヌクレオチドを含んでいてもよく、それによって関連するシーケンシングプロセスは、ＤＮＡ鋳型中の改変されたヌクレオチドを識別する。改変されたヌクレオチドは、様々な形態のメチルＣ、例えば５−メチル−Ｃを含有していてもよく、それによって関連するシーケンシングプロセスは、ＤＮＡ鋳型中のこれらの改変されたヌクレオチドを識別する。
様々な実施形態において、プローブ分子は、酵素、またはＤＮＡもしくはＲＮＡハイブリダイゼーションプローブである。図６６に、後者の２つの実施形態の好ましい配置を示す。一例として、プローブ分子は、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＰｈｉ２９もしくはその突然変異体、またはＰｏｌＩもしくはその突然変異体などを含む。
様々な他の非限定的な例において、プローブ分子は、逆転写酵素、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡを移行させる酵素、ヘリカーゼ、タンパク質のナノポア、移行させる酵素と複合体化したタンパク質のナノポア、またはリボソームのいずれか１つを含んでいてもよい。
非限定的な例において、架橋分子は、例えば二本鎖ＤＮＡ、タンパク質アルファヘリックス、ＩｇＧ抗体、ソース電極およびドレイン電極上の接触ポイントに特異的な親和性を有するＩｇＧ抗体、またはソース電極およびドレイン電極上の接触ポイントに特異的な親和性を有するように操作されたＩｇＧ抗体鋳型であり得る。
様々な態様において、ソース電極およびドレイン電極への接触ポイントのカップリングは、金ビーズなどの金接触部と、架橋分子中のチオールを含有する基との間のチオール−金結合を介する。より具体的な例において、内部のカップリングポイントは、架橋分子中のビオチン、ストレプトアビジン（天然の、または改変された）、およびストレプトアビジンにコンジュゲートしたプローブ分子を介していてもよい。
センサーのエレメントのアセンブルは、マルチステップのｉｎ ｓｉｔｕアセンブルプロセスの経過中に電気的なパラメーターを介してモニターすることができる。例えば、モニターされる電気的なパラメーターは、印加されたソース−ドレイン電圧およびゲート電圧下での供給されたドレイン電流；印加されたソース−ドレイン電流下での供給されたドレインまたはゲート電圧；印加されたソース−ドレイン電圧およびゲート電圧下での供給されたドレイン電流；値のある範囲にわたりソース−ドレイン電圧および／またはゲート電圧が掃引されるときのＩ−Ｖ特性；ならびにソース−ドレインまたはゲートに印加された印加電圧波形に対する電流応答のいずれか１つであり得る。
他の態様において、プローブ分子は、ポリメラーゼであってもよく、そのため検出可能なシグナルは、ポリメラーゼに結合したプライムされた一本鎖ＤＮＡ分子鋳型の配列を決定するために一連のヌクレオチドの試験的フローを介してモニターされる取り込みのシグナルである。より具体的な例において、ポリメラーゼは、取り込みのシグナルを強化するように改変される。同様に、ヌクレオチドは、取り込みのシグナルを強化するように改変することができる。
様々な態様において、プローブ分子は、ポリメラーゼであり、検出可能なシグナルは、異なる塩基も区別する取り込みのシグナルであり、これは、システムがｄＮＴＰの混合物に曝露されている間にモニターされて、配列が決定される。さらに、ポリメラーゼは、取り込みのシグナルが強化されるように改変されていてもよく、ヌクレオチドは、異なる塩基の取り込みの区別可能なシグナルが強化されるように改変されていてもよい。
様々な例において、センサーは、（｛Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ｝に加えて）鋳型中の追加の改変された塩基、例えば５−メチル−Ｃの存在を区別するのに使用することができる。
プローブ分子がポリメラーゼである例において、検出可能なシグナルは、取り込みのシグナルであってもよく、これは、それぞれ別個のターミネーター−Ａ、−Ｃ、−Ｇ、−Ｔにつきターミネーターシーケンシング反応を実行し、それによって鋳型分子の配列をアセンブルするのに使用することができる。例えば、電気的測定は、４つの異なるターミネーターを識別することができ、ターミネーターシーケンシングは、ターミネーターの識別と共にターミネーターのミックスの多くの試行の結果をアセンブルすることによって実行される。
他の例において、プローブ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡハイブリダイゼーションプローブを含み、多様なこのようなプローブからのＤＮＡ相互作用のシグナルは、対応する反応に複製で供給されたＤＮＡ断片をシーケンシングまたは類別するのに使用することができる。
様々な例において、センサーアレイの様式が展開されていてもよい。例えば、１，０００個もしくはそれより多くのこのようなセンサーのアレイ、または１０，０００個もしくはそれより多くのこのようなセンサーのアレイ、または１００，０００個もしくはそれより多くのこのようなセンサーのアレイ、または１，０００，０００個もしくはそれより多くのこのようなセンサーのアレイ、または１０，０００，０００個もしくはそれより多くのこのようなセンサーのアレイ、または１００，０００，０００個もしくはそれより多くのこのようなセンサーのアレイである。展開は、ＣＭＯＳセンサー電子機器を含むチップ上であってもよい。このようなチップシステムを使用して、プローブおよびＤＮＡの相互作用の多数の検出可能なシグナルを並行して収集すること、ならびにこの情報を集めることによって、ＤＮＡをシーケンシングすることができる。これらの様々な実施形態において、チップシステムを使用して、多数のＤＮＡ分子の大規模並列シーケンシングを実行するか、または様々なターミネーターシーケンシング反応を介して複製で供給されたＤＮＡ断片のターミネーターシーケンシングを実行することができ、このようなＤＮＡ断片はそれぞれ、４つの別個のチップ上で大規模並列の様式で適用されるか、または単一のチップ上の一連の４つの反応で適用される。
チップシステムを使用して、様々なターミネーターシーケンシング反応を介して複製で供給されたＤＮＡ断片のターミネーターシーケンシングを実行することができ、このようなＤＮＡ断片はそれぞれ、４つの別個のチップ上で大規模並列の様式で適用されるか、または単一のチップ上の一連の４つの反応で適用され、必要数の各タイプの個々の反応を達成する。チップシステムを使用して、様々なターミネーターシーケンシング反応を介して複製で供給されたＤＮＡ断片のターミネーターシーケンシングを実行することができ、これは、単一のチップ上で大規模並列の様式で実行されて、必要な数の個々の反応を達成することができる。チップシステムを概説した通りのシーケンシング方法および概説した通りの取り込みの検出シグナルと共に使用して、新たな断片のアセンブルまたは参照に対するアセンブルが集合的に達成されるように、アレイに適用された断片の分子フィンガープリンティングを生成することができる。
これらの様々なチップシステムにおいて、プローブは、断片上でのハイブリダイゼーションによってシーケンシングを実行するために十分に情報を提供するＤＮＡハイブリダイゼーションプローブの集合体であってもよい。プローブのアイデンティティーは、一連のデコード反応を介してデコードできる組合せの様式でコードされていてもよい。例えば、デコード反応は、ハイブリダイゼーションタグのプールに対するハイブリダイゼーション反応を含んでいてもよく、前記反応結果の読み取りは、観察可能な回路パラメーターを使用するハイブリダイゼーションシグナルの電子的な検出を介する。
一部の例において、プローブは、断片上でのハイブリダイゼーションによってシーケンシングを実行するために十分に情報を提供するＤＮＡハイブリダイゼーションプローブの集合体であってもよく、前記断片は、アレイに複製で適用されて、その配列が決定される。
様々な実施形態において、より希釈された／低いイオン強度の緩衝液などの緩衝液の改変または条件は、上述の例のいずれかにおいてシグナル検出を改善するのに使用することができる。
チップベースのセンサーアレイにおいて、センサーの多様性を使用して、上記のシーケンシング方法の場合のように補完的な測定を行うことができ、これをさらに組み合わせて、より大きい総計の精度を達成する。特に、アレイに１つのＤＮＡ断片が複製で供給される場合、アレイ上の独立したセンサーからの情報を使用して、この断片の配列が高い精度で決定される。センサーの多様性は、架橋構造の多様性にわたり、または改変されたプローブ分子中の多様性において提供することができる。様々な態様において、センサーの多様性は、アレイ上のセンサーの配置および動作条件におけるランダムな（制御不能な）多様性にわたっており、この情報を集めることが、より正確な配列を得るためにこのようなノイズを除去する方法を構成する。
プローブ分子がポリメラーゼである例において、ヌクレオチドは、異なる動態シグネチャーを有し、それによって検出可能なシグナルが提供されるような方法で調製し、供給することができる。異なる動態は、溶液中のヌクレオチドの異なる濃度に起因するものでもよく、シグネチャーとしては、取り込みシグナル間のタイミングが挙げられる。
様々な実施形態において、センサーの酵素は、エキソヌクレアーゼであり、ＤＮＡ鋳型は、検出を強化するために改変された塩基を用いて調製されてもよく、エキソヌクレアーゼは、前記ヌクレオチドのこの検出を強化するためにさらに改変されていてもよく、得られたシーケンシングシグナルは、エキソヌクレアーゼが塩基を順番に切断するときに発生する。
様々な例において、プローブ分子（天然の、または改変された）は、そのＤＮＡとの反応を可能にするもしくは強化する、または阻害するもしくは不可能にするように電子的に制御される能力を有する。例えば、プローブ分子は、その処理能力を可能にするもしくは強化すること、または阻害もしくは不可能にすることに関して電子的な制御が可能な酵素であってもよく、これは、収集された配列データの有益性を改善するのに使用される。特に、チップセンサーアレイ様式において、これは、このような異なって獲得された測定値の多様性を、全体的な有益性を増加させるために並行して獲得することを可能にする。特に、ポリメラーゼのケースにおいて、これを使用して、個々のポリメラーゼを鋳型に沿ってより速く移動させて、全てのセンサーに適用された長い複製断片のより遠位の領域に到達させ、次いで速度を落とし、それを照合することができる。
様々な実施形態において、ゲート電圧は、シグナル検出を改善するように設定することができる。
ハイブリダイゼーションによるシーケンシングに関する例において、電子的な制御を適用して、ハイブリダイゼーションを促進するためのプローブの近傍における電圧によって駆動する鋳型ＤＮＡの濃縮、不適切に対合したハイブリッドを排除するための電圧ベースのストリンジェンシー、または正確にハイブリダイズした断片を迅速にアニールするためのこのストリンジェンシーの電圧サイクリング、または適したハイブリダイゼーションをミスマッチしたもしくは不適切なハイブリダイゼーションと区別する方法で検出されたシグナルを変更する印加された電圧などの性能を改善することができる。
様々な実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡ鋳型は、電子的に保持または放出されてもよく、配列決定に基づいてある特定の断片が保持され、その残りが放出され除去され、保持されたものがそれに続く使用または追加の分析のための溶液中に放出され捕捉される。
一部の例において、可逆的なターミネーター塩基を使用して、終結した当該の塩基を識別するためのより大規模な電子的識別による感知、それに続くターミネーターの除去、および望ましい数の塩基がシーケンシングされるまでのこのプロセスの繰り返しのための時間を見込んで終結した反応を提供する。例えば、可逆的なターミネーターを使用して、１つまたは複数の試行ヌクレオチドｄＮＴＰ混合物の導入によってターミネーターを過ぎて次の塩基にプロービングし、結合ポケット中にいる間に一時的に生成されたシグナルにおける正確に対合した塩基と不正確に対合した塩基との検出可能な差により次の塩基の決定を可能にするシグナルデータを獲得し、それに続いてターミネーターを除去し、次のステップにプロセスを進行させるために別の可逆的なターミネーターを取り込み、望ましい数の塩基がシーケンシングされるまでこのプロセスを繰り返すことを可能にする。
使用することができるプライマーは、伸長可能ではない／ターミネータープライマーであり、それにおける照合を使用して、単一の塩基のシーケンシングを実行し、プライマーの後に続く第１の塩基のアイデンティティーを得る。
様々な例において、酵素は、ポリメラーゼであってもよく、その使用は、鋳型の導入の前、またはこのようなプライマーが架橋またはポリメラーゼ分子上の適所に係留される前のいずれかにおける、鋳型にプライマーを付けるための標的化プライマーであってもよく、可能であれば別個の標的化反応ステップなしでｉｎ ｓｉｔｕでの標的化シーケンシングを達成することができる。本明細書において、このようなプライマーは、標準的なオリゴプライマー、または親和性が増加したプライマー、またはリコンビナーゼによって強化されたプライマーであってもよく、後者は二本鎖ＤＮＡにプライマーを付けるためである。
チップアレイシステムにおいて、複数の部位にプライムされた長いＤＮＡ分子を使用して、複数のポリメラーゼによって捕捉されるアレイに導入し、複数の同時のシーケンシング反応を受けることができ、またはバリアントのフェージング、ハプロタイプ、もしくは連続した長いＤＮＡ分子の構造を決定するのに使用することができる。
一部の例において、マイクロウェルチャンバー内の複数の分子センサーは、チップ上に配置されていてもよく、多数のこのようなマイクロウェルがチップ上にあり、このようなウェルをシールおよびシール除去するための単一の巨視的なプロセスは、独立した含有される反応および検出を封入されたウェル内で起こすことができるような方法で行われる。これは、分子センサープローブ分子が、前進反応それ自身（重合、またはエキソヌクレアーゼ）から放出されたもしくは作り出された副産物分子、またはそれに続くこのような一次分子から生じる分子カスケード分子を検出するいくつかのシグナル検出様式を可能にする。
微小流体システムおよびフローセルは、センサーまたはセンサーアレイに必要な反応混合物および緩衝液を提供する。
チップアレイシステムにおいて、チップは、シーケンシングプロセスで使用される異なる緩衝液への迅速な曝露を達成するために、反応緩衝液の異なる容器間を直接移行させてもよい。
プローブ分子がポリメラーゼである例において、これらの例は、両方の鎖の読み取りまたは同じ鎖の繰り返しの読み取りを達成して、精度を強化する同じ鋳型の複数の読み取りが生成するように、鎖置換ポリメラーゼを、環状鋳型またはヘアピンに適合させた鋳型と共に使用することを提供する。さらに、同じ鋳型のストリッピングおよび再シーケンシングが、同じ目的を直接達成することができる。
実施例８は、数種の重要な適用設定（例えばホモポリマーの長さ、単一塩基の決定、メチル化、および長い読み取り）でポリメラーゼによる取り込みのシグナルを観察するための、ベースのセンサーの構築、その特性、およびその適用に関する実験結果を記載する。この実施例は、重要な適用での実施化を確立し、他の適用も同様に実施に移すことができるという前提の強い根拠を提供する。この実施例は、分子センサー構造、電気的測定設定、電極の画像、センサーチップの画像、チップ不動態化、フローセル、チップのパッケージング、センサーのＩ−Ｖ特性、センサー自己アセンブルの電気的な観察、ホモポリマーＤＮＡにおける別々のポリメラーゼ取り込み事象シグナル、単一の塩基検出シグナル、メチル化ＤＮＡの検出、および長い読み取り能力に関する、例えば図面で例示される結果を記載する。
ＤＮＡの配列の決定は、根本的に重要な測定プロセスである。
図６９は、この実験作業に使用される分子構造を例示する。図６９は、実験作業に典型的に使用される架橋およびプローブ分子構造の詳細を示す。このケースにおける架橋は、金属電極上の金接触部へのカップリングのために両方の５’末端にチオール基を有する、示される長さが２０ｎｍ（６０塩基）の二本鎖ＤＮＡ分子である。プローブ分子は、ポリメラーゼであり、ここではＥ．ＣｏｌｉのＰｏｌＩであり、これはストレプトアビジンタンパク質に化学的に架橋され、順に合成ＤＮＡオリゴ中のビオチン化ヌクレオチドにおける架橋にカップリングされる。図６９は、６個の分子および原子のスケールにして示される。
図７０を参照すると、分子センサー上での電気的測定のための試験設定の略図が示されている。図７０の上の部分は、電極−基板構造および架橋分子を介して電圧を印加し電流を測定するための分析器への付着部分の断面を示す。図７０の下の部分は、回路を架橋するための電極アレイの斜視図を例示する。各電極対は、金属−１電極（すなわち、非類似の金属）上に金属−２接触ポイントを有する。本実験において、接触ポイントは、金ビーズまたは金でコーティングされた電極の先端であり、これは、チオール−金結合を介した適所へのチオール化分子の自己アセンブルを支持する。
図７１Ａ、７１Ｂおよび７１Ｃは、電極の電子顕微鏡画像を様々な倍率レベルで示す。画像は、架橋結合のために使用される金の金属ドット接触部を有する電極の画像である。電極は、ケイ素基板上にあり、ｅ−ビームリソグラフィーによって生成された。図７１Ａは、電極のアレイのＥＭ画像である。ここで電極はチタンであり、金のドット接触部を有する。図７１Ｂは、７ｎｍの電極ギャップおよび金から金への間隔が１５ｎｍの金のドット接触部を示すクローズアップのＥＭ画像である。図７１Ｃは、電極の先端におよそ１０ｎｍの金のドットを示すクローズアップのＥＭ画像である。
図７２は、電極試験チップの構成を例示する。このケースにおいて、電極アレイは、ｅ−ビームリソグラフィーを使用して１ｃｍのケイ素基板上に形成された。図７２における一連の３つのＳＥＭ画像は、２０個の電極対を、分解能を電極ギャップの１０ｎｍスケールまで連続的に増加させて示す。
図７３は、溶液から電極を保護するための、デバイス上での不動態化層の使用を例示する。このケースにおいて、不動態化層は、酸化ケイ素である。不動態化中の開口部は、電極領域をナノメートルスケールで露出させ、電気的接触パッドを１０ミクロンのスケールで露出させる。
図７４は、センサーチップ表面への液状溶液の曝露の制御を支持するために使用されるフローセルを例示する。このケースにおいて、フローセルは、成形ＰＤＭＳポリマーを含む。
図７５は、電気的測定のためにチップ担体にマウントされたチップを例示する。
図７６は、アセンブルされたセンサー複合体の導電率の特徴付けを記載する。図７６は、湿潤（薄い塩緩衝液）および乾燥（空気）条件におけるＤＮＡ架橋分子および完全なセンサー複合体（ポリメラーゼとの架橋）の測定された電流対電圧（Ｉ−Ｖ）特性を、空気、水および薄い塩緩衝液中の開回路電極の対照と共に示す。図７６は、架橋およびセンサー複合体が、１ボルトの印加されたソース−ドレイン電圧でおよそ１００ｍピコアンペアの電流で伝導することを示す。測定は、半導体パラメーター分析器でＳＭＵによりなされる。
図７７は、金−ドット接触部の電極を有する分子センサーの自己アセンブルの電子的なモニターを例示する。電流対時間の測定を使用して、架橋および分子センサー複合体の自己アセンブルの進行をモニターした。図７７の左上におけるプロットは、相１を示し、二本鎖ＤＮＡ架橋が５’末端上でチオール基とアセンブルし、電流の急騰によって示されるように電極の金の接触ポイント上にアセンブルする。図７７の右上におけるプロットは、相２を示し、ポリメラーゼ−ストレプトアビジン複合体が、電流の急騰によって示されるようにｄｓＤＮＡ架橋上のビオチン化部位に結合する。図７７の右下におけるプロットは、相３を示し、電流対時間のスパイクによって示されるように、プライムされた一本鎖ＤＮＡ鋳型がポリメラーゼに結合して複合体を完成させる。
図７８は、最終的なアセンブルの画像を提供する。より高分解能の画像において、架橋−複合体は、標識付けなしで直接目視可能であり、電極と合体したぼんやりした高コントラスト領域（緑色の矢印によって指し示される）のように見える。
図７９は、センサーを用いて取り込みシグナルを測定する４つのプロットである。図７９のプロットは、様々なプライムされた一本鎖ＤＮＡシーケンシング鋳型ならびに取り込みおよび重合のためのｄＮＴＰを供給されたセンサーから生じる電流シグナルを示す。それぞれのケースにおいて、主要なシグナルスパイクは、別々の取り込み事象からのシグナルに相当し、ポリメラーゼ酵素は伸長する鎖に別の塩基を付加する。図７９の左上の部分のプロットにおいて、鋳型は２０個のＴ塩基である；右上のプロットにおいて、鋳型は２０個のＧ塩基である；左下のプロットにおいて、鋳型は２０個のＡ塩基である；右下のプロットにおいて、鋳型は２０個のＣ塩基である。観察されたおよその取り込み速度は、１秒当たり１０〜２０塩基であり、これは、標準的な酵素の動態と一致し、ただし律速因子（例えばより低いｄＮＴＰ濃度）に起因する１秒当たり約１塩基のより低い速度を除く。
図８０は、単一の塩基の取り込み事象から生成されたシグナルのクローズアップである。このケースにおいて、シグナルは、二重のピーク構造を有し、これは、取り込み事象を検出することに加えて塩基の識別を助けるのに使用できる可能性があり得る。
図８１は、メチル化塩基の電気的な感知を示すプロットを提供する。図８１は、鋳型中のメチル化の状態または個々のメチル化塩基を感知するためのセンサーの可能性のある使用を実証する。このプロットは、鋳型のメチル化されていない部分とメチル化された部分とによって生じる異なるシグナル（緑色のトレース）を示す。高い方のシグナルは、メチル化された部分ではなくメチル化されていない部分に起因する。示された実験は、示されているように、指定された鋳型配列ごとの、センサーチップ上への一連の異なる溶液の添加のトレースを測定することからなる。ｄＣＴＰのフローは単一の塩基の取り込みスパイクを生成し、次いでｄＧＴＰの添加により取り込みを鋳型のＣＧトラクトを通過して進行させることが可能になり、メチル化された鋳型対メチル化されていない鋳型のシグナルの差が強調される。
図８２は、センサーの長い読み取りの能力を例示する。この図は、長いＤＮＡ断片を読み取るかまたは分析する可能性を示し、これは、全ゲノム配列の新たなアセンブルなどのデータの広範な連続性が重要な用途に重要である。ＤＮＡ鋳型は、５．４ｋｂのＰｈｉＸウイルスゲノムである。左側の電流対時間プロットにおいて、鋳型（ｄＮＴＰミックス）対重合なしの後続の対照（ターミネーターｄｄＮＴＰミックス、ポリメラーゼ活性ブロック済み）の低時間分解能の読み取りからの異なるシグナルが記録される。右側のＳＥＭ画像は、長い鋳型ＤＮＡが目視可能な電極を示す。
（実施例９）
改変されたｄＮＴＰを用いて塩基の取り込みシグナルを検出するペプチド架橋センサーを有する分子センサー
センサーの別の好ましい実施形態は、架橋分子としてタンパク質アルファヘリックスを利用する。タンパク質アルファヘリックスは、好都合な構造であり、これは、タンパク質アルファヘリックスは、比較的固定されており、電子移動および電流伝導を許容することがわかっており、原子的に正確な構造仕様と自己アセンブルのためのカップリング基を有するペプチドとして合成できるためである。図８３Ａおよび８３Ｂに、このようなペプチドアルファヘリックス架橋および関連するセンサーを例示する。この実施例の実験作業で使用された特定のペプチドは、以下の６６アミノ酸の配列を有するペプチドである：
ＣＡＥＡＡＡＲＥＡＡＡＲＥＡＡＡＲＥＡＡＡＲＥＡＡＡＲＥＡＡＡ｛Ｌｙｓ−Ａｈｘ−ビオチン｝ＥＡＡＡＲＥＡＡＡＲＥＡＡＡＲＥＡＡＡＲＥＡＡＡＲＥＡＡＡＲＣ（配列番号１４）。
これは、ペプチドのアルファヘリックス構造にとって有利であることが公知のモチーフＥＡＡＡＲの反復をベースとした６１−アミノペプチドを特徴とする。末端におけるシステインアミノ酸は、クロム電極上の金接触部へのチオール−金カップリングをもたらす。ペプチド中に配置された中央のリシンは、カップリング目的でニュートラアビジンタンパク質の結合を支持するためにＡｈｘ（６炭素の直鎖状アミノヘキサン酸）リンカー上のビオチンを含むように改変される。ペプチドのアルファヘリックスの形態は、およそ９ｎｍの長さである。ポリメラーゼは、公知のマレイミド−システイン共有結合反応によりポリメラーゼ上の表面のシステインアミノ酸に結合したビオチン−マレイミド基を介してニュートラアビジンにカップリングする。
図８３Ａは、上述した６６アミノ酸の配列を有するペプチドを使用して実施に移されたペプチドアルファヘリックス架橋を含む実施形態を示す。図８３Ｂは、公知のビオチン−ニュートラアビジン結合反応を介してニュートラアビジンにカップリングされたアルファヘリックス架橋、また、公知のマレイミド−システインの共有結合によるカップリング反応を介してポリメラーゼ上の表面のシステインにコンジュゲートされた追加のビオチン（biotion）−マレイミドリンカーを介して付着したポリメラーゼを有する十分にアセンブルされたセンサーを例示する。
図８５Ａ〜Ｄに、この実施形態の実験的な実施化を示す。２０個の電極対を有する試験チップを他の実施例と同様にしてｅ−ビームリソグラフィーによって製作した。電極は、ペプチド架橋へのカップリングのために金の層を堆積させたクロムであった。架橋堆積の直前に、チップを酸素プラズマクリーナーで２４０秒クリーニングした。ペプチド架橋を、ＰＢＳ緩衝液中、１μＭ濃度で１時間、チップと共にインキュベートした。それに続き、ＰＢＳ中で、ソース−ドレイン電圧を０から２ボルトに変化させて電極の電流−電圧特性を測定した。アセンブルおよびシーケンシング中の経時モニタリングのために、最大電流を有する電極対を選択した。架橋結合のためのニュートラアビジン（neutravidn）、ニュートラアビジン−架橋への結合のためのポリメラーゼ−マレイミド−ビオチン、およびポリメラーゼの取り込み活性のためのＤＮＡ鋳型＋ｄＮＴＰを供給するプロセスにわたり、電流対時間をモニターした。図８５Ａ〜Ｄで示されるように、センサーのアセンブルプロセスのニュートラアビジン結合およびポリメラーゼ結合相に対応するシグナルスパイクが生成された。ポリメラーゼは、鋳型−ヌクレオチド溶液に曝露されたときに活性を示したことから、これは、ＤＮＡ鋳型を捕捉し相補的塩基を取り込むセンサーの一連の３つの事象として解釈することができた（示された通り）。
鋳型配列は、１０ＧＴ反復の４つの主要なトラクトを有していた。具体的には、鋳型配列は、以下を含んでいた：
ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＡＡＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＣＣＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴ（配列番号１５）。
示されたデータ解釈において、ＧＴトラクトは、異なる入ってくる鋳型とセンサーが３回連続して連結する間に持続的活性のスパイクを生成する。この実施例は、架橋分子の他の好ましい形態が、配列分析の基礎となる取り込みシグナルを生成できることを例示する。
このＧリッチな鋳型から取り込みシグナルを強化するために、反応混合物の取り込みに改変されたＣを使用した。具体的には、ｄＮＴＰヌクレオチド混合物中の標準ｄＣＴＰヌクレオチドを、図８４Ａおよび８４Ｂに示される２つの異なる改変されたｄＣＴＰ分子の等量の混合物で置き換え、ｄＣＴＰ分子の形態は、標準ｄＣＴＰに対して実質的な電子化学的な変化を生じるように選択された。これらの形態は、図８４Ａに描写されたｄＣ４Ｐ−ラクトース、および図８４Ｂに描写されたｄ４ＣＰ−Ｃｙ７であり、ＣＬＩＣＫケミストリー反応を介して生成される。どちらの形態も、三リン酸連結を四リン酸連結で置き換えており、ＤＢＣＯ ＣＬＩＣＫケミストリーリンカーを介して末端のリン酸上に追加の基を付加している。ここで使用された基は、糖、ラクトース、および色素分子「Ｃｙ７」であり、結果としてｄＣＴＰのｄＣＰ４−ラクトースおよびｄＣＰ−Ｃｙ７で改変された形態がもたらされた。取り込み中に改変がポリメラーゼによって切り出され、天然生成物のＤＮＡのみが残るように、改変は一次ｄＣＴＰのガンマに付加される。このアプローチは、酵素の機能または処理能力を損なう可能性があるＤＮＡの形態を変更することなく、大きい分子の変動、したがってシグナル強化をもたらすことができる。
図８５Ａは、アルファヘリックスペプチド架橋を用いた配列感知実験からのデータを描写する。プロットは、金接触部に架橋を付着させるために、ＰＢＳ緩衝液中１μＭのペプチド濃度でペプチド架橋分子と共に１時間インキュベートした試験チップ上の電極の電流対電圧のトレースである。最大電流のトレースは、２ボルトの印加されたソース−ドレインにおいて３ナノアンペアの電流に達しており、適所に架橋分子を有する電極を示す。
さらに、図８５Ｂは、アルファヘリックスペプチド架橋を用いた配列感知実験からの追加のデータを描写する。プロットは、架橋されたセンサーが、２ボルトのソース−ドレイン電圧の印加を伴いニュートラアビジン溶液に曝露される場合の、およそ１０秒から５０秒の時間における、それに続く架橋へのニュートラアビジン結合のシグネチャーを示す電流対時間のトレースである。
図８５Ｃは、アルファヘリックスペプチド架橋を用いた配列感知実験からの追加のデータを描写する。プロットは、後者が前者の溶液に曝露される場合の、１０〜２０秒の時間における、ニュートラアビジン−架橋複合体と結合するポリメラーゼ−マレイミド−ビオチンのシグネチャーを示す電流対時間のトレースである。
最後に、図８５Ｄは、アルファヘリックスペプチド架橋を用いた配列感知実験からの追加のデータを描写する。プロットは、アセンブルされたセンサーが、一連のＧＴ反復を有する配列：（１０×ＧＴ）ＴＴＴ（１０×ＧＴ）ＡＡＡ（１０×ＧＴ）ＣＣＣ（１０×ＧＴ）を含む鋳型ＤＮＡを含有する溶液を提供された場合に得られたシーケンシングシグナルを表す。図８４Ｄは、主要なスパイクは鋳型のＧＴ反復トラクトに対応し、示された４５秒の間に全体の３つの異なる鋳型ＤＮＡ分子がセンサーと連結されるというこれらのシグナルの１つの考えられる解釈で注釈が付けられる。
追加の実施例
本開示の追加の非限定的な実施例としては、以下のものが挙げられる。
第１の電極にカップリングされた第１の接触部；第２の電極にカップリングされた第２の接触部；第１の接触部および第１の電極の１つと、第２の接触部および第２の電極の１つとの間に画定されたセンサーギャップ；および第１の端部と第２の端部とを含む架橋分子を含むセンサーであって、架橋分子は、バイオポリマーの架橋分子であり、架橋分子は、第１の端部で第１の接触部にカップリングされており、第２の端部で第２の接触部にカップリングされている、センサー。
基板表面の上にある第１の電極；基板表面の上にある第２の電極；第１の電極と第２の電極との間に画定されたセンサーギャップ；および第１の端部と第２の端部とを含む架橋分子を含むセンサーであって、センサーギャップは、約５ｎｍから約３０ｎｍの間のセンサーギャップ寸法を含み、架橋分子は、第１の端部で第１の接触部にカップリングされており、第２の端部で第２の接触部にカップリングされている、センサー。
様々な実施形態において、センサーは、ゲート電極をさらに含んでいてもよい。
様々な実施形態において、センサーギャップは、約５ｎｍから約３０ｎｍの間のセンサーギャップ寸法を有する。
様々な実施形態において、架橋分子の第１の端部は、第１の自己アセンブルアンカーを含み、および／または架橋分子の第２の端部は、第２の自己アセンブルアンカーを含む。
様々な実施形態において、架橋分子は、バイオポリマーの架橋分子を含む。様々な実施形態において、バイオポリマーの架橋分子の第１および／または第２の端部は、様々な化学反応によって化学的に改変されている。
様々な実施形態において、架橋分子は、化学的に合成された架橋分子を含む。
様々な実施形態において、架橋分子は、直鎖状バイオポリマーを含む。
様々な実施形態において、架橋分子は、架橋分子の持続長未満の端部から端部までの長さを含む。
様々な実施形態において、架橋分子は、センサーギャップ寸法に近似するように構成された端部から端部までの長さを含む。
様々な実施形態において、架橋分子は、核酸二重鎖を含む。
様々な実施形態において、核酸二重鎖は、ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッド二重鎖、ＰＮＡ−ＰＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＬＮＡハイブリッド二重鎖の１つを含む。
様々な実施形態において、核酸二重鎖は、チオールで改変されたオリゴを含む。
様々な実施形態において、第１の自己アセンブルアンカーおよび第２の自己アセンブルアンカーの１つは、５’−チオールで改変されたヌクレオチドを含む。
様々な実施形態において、核酸二重鎖は、内部ビオチンで改変されたヌクレオチドをさらに含む。
様々な実施形態において、架橋分子は、ペプチド配列を含み、第１の自己アセンブルアンカーおよび第２の自己アセンブルアンカーの１つは、Ｌ−システイン残基を含む。
様々な実施形態において、架橋分子は、架橋分子を含む流動性の媒体が第１の接触部および第２の接触部の１つと接触するときに自己アセンブルして架橋分子のコンフォメーションを生じるように構成されている。
様々な実施形態において、センサーは、プローブをさらに含み、プローブは、架橋分子に付着している。
様々な実施形態において、センサーは、架橋分子に付着したリンカーをさらに含む。
様々な実施形態において、プローブは、単一の標的分子を連結するように構成されている。
様々な実施形態において、分子架橋および／またはプローブは、酵素を含む。
様々な実施形態において、酵素は、ポリメラーゼおよび逆転写酵素の１つである。
様々な実施形態において、標的分子は、複数の標的分子の特徴を含み、第１の標的分子の特徴は第１の位置にあり、第２の標的分子の特徴は第２の位置にあり、第ｎの標的分子の特徴は第ｎの位置にあることを含め、各標的分子の特徴は別々の位置を有する。
様々な実施形態において、プローブは、複数の異なる標的分子を含む溶液中での反応の間に標的分子と連結されるように構成された酵素であり、この反応は期間ｔを含み、標的分子を接触させることにより、複数の標的分子の特徴に応答して酵素における複数のコンフォメーション変化が生じ、複数の配置変化のそれぞれは、シグナルの特徴が生成されるようにセンサー中の電流を変調する。
様々な実施形態において、システムは、本明細書の上記に記載したようなセンサーを含む。
様々な実施形態において、システムは、センサーにカップリングされ、シグナルの特徴を検出するように構成された、シグナル処理システムをさらに含む。
様々な実施形態において、システムおよび／またはセンサーは、期間ｔにわたり検出された複数のシグナルの特徴を含むシグナルトレースを生成するように構成されている。
様々な実施形態において、システムは、シグナル解釈デバイスをさらに含む。
様々な実施形態において、シグナル解釈デバイスは、シグナル解釈マップを含む。
様々な実施形態において、シグナル解釈マップは、公知の標的配列からのシグナルトレースに対して較正される。
様々な実施形態において、シグナル解釈デバイスは、標的配列によって生成されたシグナルトレースに応答してシグナル解釈を戻すように構成されている。
様々な実施形態において、シグナル解釈は、シグナルトレース解釈が可能性のある実際の配列と一致する見込みの確率論的な評価を含む。
様々な実施形態において、方法は、本明細書の上記の例のいずれかに記載のセンサーを提供するステップ；核酸鋳型をポリメラーゼと接触させるステップであって、ポリメラーゼは、センサーの一部を含む架橋分子にカップリングされている、ステップ；任意選択で、センサーに電位を印加するステップ；ヌクレオチド塩基ミックスを提供するステップ；ポリメラーゼによって、ヌクレオチド塩基ミックスからのヌクレオチドを、合成される核酸に取り込むことを含む取り込み事象を実行するステップ；および取り込み事象によって生成されたシグナルを検出するステップを含む。
様々な実施形態において、方法は、期間ｔで実行される一連の取り込み事象をさらに含み、一連の取り込み事象は、シグナルの特徴の配列を含むシグナルトレースを生成する。
様々な実施形態において、各シグナルの特徴は、一連の取り込み事象の１つに対応する。
様々な実施形態において、シグナルトレースは、ノイズをさらに含み、方法は、シグナルトレースからノイズを除去するステップをさらに含む。
様々な実施形態において、各取り込み事象は、鋳型塩基依存性のポリメラーゼの動態シグネチャーを生成する。
様々な実施形態において、ポリメラーゼの動態シグネチャーは、シグナルの特徴に寄与する。
様々な実施形態において、方法は、改変されていない鋳型ヌクレオチドに応答して生成された第１のシグナルの特徴と、改変された鋳型ヌクレオチドに応答して生成された第２のシグナルの特徴とを区別するのに好適である。
様々な実施形態において、改変された鋳型ヌクレオチドは、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ４−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ホルミルシトシン、および５−カルボキシルシトシンの１つである。
様々な実施形態において、改変された鋳型ヌクレオチドは、非塩基部位である。
様々な実施形態において、生体分子感知デバイスは、基板表面上に第１の電極および第２の電極を形成するステップであって、第１の電極および第２の電極は、電極ギャップによって分離されている、ステップ；第１の電極上に第１の接触部および第２の電極上に第２の接触部を設置するステップであって、第１の接触部および第２の接触部は、接触部ギャップによって分離されている、ステップ；ならびに第１の接触部および第２の接触部に架橋分子を付着させるステップを含む。
様々な実施形態において、生体分子感知デバイスは、架橋分子をプローブと接触させて、プローブを架橋分子にカップリングするステップをさらに含み、プローブは、自己アセンブルによって架橋分子にカップリングされている。
様々な実施形態において、第１の接触部および第２の接触部に架橋分子を付着させるステップは、自己アセンブルステップを含む。
様々な実施形態において、電極ギャップおよび／または接触部ギャップは、約５ｎｍから約３０ｎｍの間である。
様々な実施形態において、第１の接触部および／または第２の接触部は、約５ｎｍの直径を有する金ナノ粒子を含む。
様々な実施形態において、第１の接触部の位置および／または第２の接触部の位置は、リソグラフィー方法を使用して決定される。
様々な実施形態において、フォトレジスト層を第１の電極および第２の電極を含む基板表面上に設置し、リソグラフィー方法を使用して第１の接触部の位置および第２の接触部の位置を画定する。
様々な実施形態において、方法は、第１の接触部の位置および第２の接触部の位置における基板表面への表面誘導体化処理を適用するステップをさらに含む。
様々な実施形態において、表面誘導体化処理は、シラン化を含む。
様々な実施形態において、方法は、金の層を堆積させるステップ、ならびにリフトオフステップを実行して、第１の電極上に配置された第１の金接触部および／または第２の電極上に配置された第２の金接触部を残すステップをさらに含む。
様々な実施形態において、方法は、デバイスを複数の金ナノ粒子を含む溶液と接触させるステップ、ならびに第１の接触部の位置における第１の金ナノ粒子および／または第２の接触部の位置における第２の金粒子を導入するステップをさらに含む。
様々な実施形態において、架橋分子をプローブと接触させる前に、架橋分子を自己アセンブルによって第１の接触部および第２の接触部に付着させる。
様々な実施形態において、架橋分子を自己アセンブルによって第１の接触部および第２の接触部に付着させる前に、架橋分子をプローブと接触させて、自己アセンブルによってセンサー複合体を生成する。
様々な実施形態において、方法は、第１の電極および第２の電極に電子的にカップリングされた集積回路を製作するステップをさらに含む。
様々な実施形態において、集積回路、第１の電極、および第２の電極は、混成のシグナル集積回路を含む。
様々な実施形態において、集積回路、第１の電極、および第２の電極は、ＣＭＯＳ製作方法を使用して製作される。
様々な実施形態において、第１および第２の接触部は、ＣＭＯＳ製作方法を使用して製作される。
様々な実施形態において、集積回路、第１の電極、および第２の電極は、電界効果トランジスタを生成するのに好適な製作方法を使用して製作される。
本明細書において、利益、他の利点、および問題に対する解決法を具体的な実施形態に関して説明した。さらに、本明細書に含有される様々な図面に示された接続ラインは、様々なエレメント間の例示的な機能的関係および／または物理的なカップリングを表すことが意図される。多くの代替物または追加の機能的関係または物理的な接続が、実用的なシステムに存在する場合があることに注目すべきである。しかしながら、利益、利点、問題に対する解決法、およびあらゆる利益、利点、もしくは解決法をもたらし得るまたはそれらをより顕著にし得るあらゆるエレメントが、重要な、必要な、または必須の本発明の特徴またはエレメントとして解釈されないものとする。したがって本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとし、それにおける単数形のエレメントの言及は、明示的にそのように述べられていない限り「唯一の」を意味することは意図されず、「１つまたは複数の」を意味することが意図される。さらに、特許請求の範囲で「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つ」に類似した成句が使用される場合、その成句が、ある実施形態でＡ単独が存在し得ること、ある実施形態でＢ単独が存在し得ること、ある実施形態でＣ単独が存在し得ることを意味するか、または単一の実施形態でエレメントＡ、ＢおよびＣのあらゆる組合せ、例えば、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ、ＢおよびＣ、もしくはＡおよびＢおよびＣが存在し得ることを意味すると解釈されることが意図される。図面にわたり、異なる斜交平行線の陰影が異なる部品を意味するのに使用されているが、必ずしも同一または異なる材料を意味するわけではない。
システム、方法および装置が本明細書で提供される。本明細書の詳細な説明において、「一実施形態」、「ある実施形態」、「例示的な実施形態」などへの言及は、記載される実施形態が、特定の特徴、構造、または特徴を含み得るが、全ての実施形態が、必ずしも特定の特徴、構造、または特徴を含むとは限らないことを示す。さらに、このような成句は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、ある実施形態に関連して特定の特徴、構造、または特徴が記載される場合、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、他の実施形態に関連するこのような特徴、構造、または特徴に影響を与えることは、当業者の知見の範囲内であることが提起される。本明細書に記載される様々な実施例および実施形態は、核酸標的に関するシグナルの検出方法を指すが、本開示のデバイスおよび方法は、核酸の検出およびシーケンシングを含む適用に決して限定されない。同様に、本明細書に記載される様々な実施例および実施形態は、バイオポリマー架橋分子を含むセンサーを指すが、化学的に合成された架橋分子は、本開示の範囲内である。この記載を読めば、関連分野の当業者には、代替の実施形態においてどのように本開示を実施するか明らかである。
さらに、本開示におけるエレメント、成分、または方法のステップは、エレメント、成分、または方法のステップが明示的に特許請求の範囲に列挙されているかどうかに関係なく、一般に提供されることは意図されない。本明細書の特許請求されるエレメントはいずれも、そのエレメントが成句「〜するための手段」を使用して明確に列挙されない限り、合衆国法典第３５巻第１１２条（ｆ）の規定に基づき解釈されないものとする。本明細書で使用される場合、用語「含む」、「含むこと」、またはそれらの他のあらゆる変化形は、エレメントの列挙を含むプロセス、方法、物品、または装置が、そのようなエレメントだけを含むのではなく、明確に列挙されていない、またはこのようなプロセス、方法、物品、もしくは装置に固有の他のエレメントを含み得るように、非排他的な包含を網羅することが意図される。

Claims (13)

  1. ソース電極；
    センサーギャップによって前記ソース電極から離れて配置されたドレイン電極；
    ゲート電極；を備えるセンサーであって、
    ここで、前記ソース電極、前記ドレイン電極および前記ゲート電極が協同して、電極回路を形成し；そして
    前記センサーギャップにわたり架橋形成し、前記ソース電極および前記ドレイン電極を接続する架橋分子；および
    前記架橋分子にカップリングされたプローブを含み、
    ここで、前記プローブと核酸との相互作用は、前記電極回路の少なくとも１つのパラメーターをモニターすることによって検出可能である、センサー。
  2. 前記核酸が、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのバリアントを含む、請求項１に記載のセンサー。
  3. 前記プローブが、酵素を含む、請求項１に記載のセンサー。
  4. 前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、エキソヌクレアーゼ、またはヘリカーゼを含む、請求項３に記載のセンサー。
  5. 前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項４に記載のセンサー。
  6. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｈｉ２９、ＰｏｌＩ、またはそれらの突然変異体である、請求項５に記載のセンサー。
  7. 前記架橋分子が、抗体、二本鎖ＤＮＡまたはタンパク質アルファヘリックスを含む、請求項１に記載のセンサー。
  8. 前記抗体が、ＩｇＧ抗体を含む、請求項７に記載のセンサー。
  9. 前記ＩｇＧ抗体が、前記ソース電極または前記ドレイン電極上の少なくとも１つの接触ポイントを認識する、請求項８に記載のセンサー。
  10. 前記ＩｇＧ抗体が、前記ソース電極および前記ドレイン電極上の接触ポイントを認識する、請求項８に記載のセンサー。
  11. 基板表面の上にある第１の電極；
    前記基板表面の上にある第２の電極；
    前記第１の電極と前記第２の電極との間に画定されたセンサーギャップ；および
    第１の端部と第２の端部とを含む架橋分子
    を含むセンサーであって、前記センサーギャップは、約５ｎｍから約３０ｎｍの間のセンサーギャップ寸法を含み、前記架橋分子は、前記第１の端部で第１の接触部にカップリングされており、前記第２の端部で第２の接触部にカップリングされている、センサー。
  12. バイオポリマーの架橋分子が、核酸二重鎖を含む、請求項１１に記載のセンサー。
  13. 前記核酸二重鎖が、ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッド二重鎖、ＰＮＡ−ＰＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＬＮＡハイブリッド二重鎖の１つを含む、請求項１２に記載のセンサー。
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