JP2019515317A - バイオ分子の測定およびシーケンシングのためのシステムおよび方法 - Google Patents

バイオ分子の測定およびシーケンシングのためのシステムおよび方法 Download PDF

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Abstract

【課題】 高精度かつ低コストで天然ＤＮＡ塩基の高スループットかつ高速な測定を行うである。【解決手段】 本開示は、トンネル標識を用いて核酸分子をシーケンシングするためのシステムおよび方法を提供する。核酸分子の配列は、センサーを含むチップを用いて高精度で同定され得、それぞれの個別のセンサーは、ギャップによって分離された少なくとも２つの電極を含み得る。電極は、ヌクレオチドに関連付けられたトンネル標識の結合時に少なくとも１つの電気シグナルを生成するように構成され得る。エピジェネティック情報も核酸配列と同時に決定され得る。【選択図】 図２Ｃ

Description

相互参照
本出願は、２０１６年４月２７日出願の米国仮特許出願第６２／３２８，５２７号、２０１６年９月９日出願の米国仮特許出願第６２／３８５，７８２号、および２０１６年７月７日出願の米国仮特許出願第６２／３５９，６４８号（これらのそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
背景
遺伝情報の理解を深めるために、かつ核酸配列検出法およびエピジェネティクスに関する課題を提起するために新しい研究が続けられている。高速なデータの測定および抽出に関する課題が存在する。いくつかの方法は、修飾塩基を介した光学シグナル測定に依拠する。いくつかの方法は、イオン電流測定と天然塩基への特定の修飾とに依拠する。しかしながら、これらの方法は、スピードおよびスループットが不足し得、かつエラー、たとえば位相エラー、光毒性、欠失および反復塩基エラー、ならびにホモポリマーカウントエラーを有し得る。加えて、多くの方法は、クローン増幅または全ゲノム増幅を必要とすることから増幅バイアスを生じ得る。いかなるシステムも、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列ならびにエピジェネティクスを同時に直接決定することができない。
概要
高精度かつ低コストで天然ＤＮＡ塩基の高スループットかつ高速な測定を行う必要性が本明細書で認識される。
本開示のいくつかの態様は、チップ上の大規模並列システムを用いて、トンネル標識を有する塩基に基づくトンネル電流を高スループットで測定することによるポリヌクレオチドシーケンシング方法を提供する。
本開示のいくつかの態様は、ＤＮＡなどのポリヌクレオチド分子をシーケンシングするためのシステムを提供する。システムは、非伝導性ギャップによって分離されて基材上に配設された２つの電極を含み得る。電極およびギャップは、２つの電極の近傍にポリメラーゼを収容するように構成され得る。電極およびギャップは、トンネル標識を含む少なくとも１つのヌクレオチドがポリメラーゼの存在下でポリヌクレオチドの一本鎖部分の隣に組み込まれるかまたは結合されると、電子または正孔のトンネル電流を検出するようにさらに構成され得る。
本開示のいくつかの態様は、非伝導性ギャップによって分離されて基材上に配設された少なくとも２つの電極を含む機器を提供する。電極およびギャップは、２つの電極の近傍にポリメラーゼを収容するように構成され得る。電極およびギャップは、ポリメラーゼの存在下でのポリヌクレオチドへのヌクレオチドの取込み時およびまたは結合時に電子または正孔のトンネル電流を検出するように適合され得る。ヌクレオチドは、トンネル標識を含み得る。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一本鎖部分に取り込まれ得るかまたは結合され得る。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの結合および放出の動態をモニターし得る。結合動態は、核酸の標的鎖のエピジェネティック構成などに関する情報を提供するために使用され得る。
本開示のいくつかの態様は、オリゴの生物学的情報を決定する方法を提供する。本方法は、基材上の２つの電極間にオリゴを配置することと、２つの電極間にバイアス電圧を印加することと、２つの電極間の電流を測定することと、オリゴのコンダクタンスまたは抵抗を計算することと、コンダクタンスまたは抵抗に基づいて生物学的情報を決定することとを含み得る。
本開示の態様は、（ａ）ギャップによって分離された少なくとも２つの電極を含む基材を提供することであって、基材は、固体である、提供することと、（ｂ）１つ以上の標識ヌクレオチドタイプと、核酸増幅反応に必要な試薬とを含む反応混合物をギャップに方向付けることと、（ｃ）核酸分子の増幅産物を得るのに十分な条件下で反応混合物の少なくとも一部分を核酸増幅反応に付すことであって、増幅産物は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの少なくとも１つを含み得る、付すことと、（ｄ）増幅産物がギャップ内で伸長される結果としてであり得るか、または増幅産物がギャップを通るように方向付けられることによるものであり得る、増幅産物からの少なくとも１つの電気シグナルを、少なくとも２つの電極を用いて検出することであって、少なくとも１つの電気シグナルは、トンネル電流を含む、検出することと、（ｅ）（ｄ）で検出された電気シグナルに基づいて核酸分子またはその一部分の核酸配列を同定することとを含む、核酸分子をシーケンシングする方法を提供する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの電気シグナルは、少なくとも部分的に非ファラデー電流である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシグナルは、複数のシグナルを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシグナルは、トンネル電流またはトンネル電流およびホッピング電流を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプは、トンネル電流およびまたはホッピング電流の生成を促進し得る１つ以上の分子およびまたは他の部分で標識され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の分子およびまたは他の部分は、伝導性部分を含み得る。いくつかの実施形態では、伝導性部分は、１つ以上の分子およびまたは他の部分が電位差に曝されたときに電流の通過を可能にする。いくつかの実施形態では、電流は、直流（ＤＣ）であり得る。いくつかの実施形態では、電流は、交流（ＡＣ）であり得る。いくつかの実施形態では、分子は、トンネル標識を含み得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの所与のヌクレオチドの塩基部分に結合され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの所与のヌクレオチドタイプのリン酸鎖に結合され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの所与のヌクレオチドタイプに可逆結合され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプは、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチドタイプまたはそれらの修飾体を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのタイプのヌクレオチドまたはそれらの修飾体の各タイプは、異なるトンネル標識で標識され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、双性イオン性化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、約１０塩基以上を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、二本鎖部分と一本鎖部分とを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの少なくとも１つは、ターミネーターを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、電気シグナルの検出後、増幅産物に取り込まれた所与の標識ヌクレオチドからターミネーターを除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、ターミネーターに結合され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、ターミネーターに可逆結合され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの電気シグナルは、約１００対１以上のシグナル対ノイズ比で検出され得る。いくつかの実施形態では、シグナル対ノイズ比は、約１０００対１以上であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの電気シグナルは、リアルタイムで検出され得る。いくつかの実施形態では、試薬は、酵素を含み得る。いくつかの実施形態では、酵素は、核酸ポリメラーゼ活性を有し得る。いくつかの実施形態では、酵素は、ポリメラーゼであり得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２つの電極の流体環境中にポリメラーゼを配設することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２つの電極間の誘電体上にポリメラーゼを配設することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２つの電極のうちの少なくとも１つの電極の表面上にポリメラーゼを配設することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２つの電極のトップにポリメラーゼを配設することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、増幅産物への１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの少なくとも１つの取込みを促進し得る。いくつかの実施形態では、試薬は、イオンを含み得る。いくつかの実施形態では、イオンは、カチオンを含み得る。いくつかの実施形態では、カチオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、またはそれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、カチオンは、触媒カチオン、非触媒カチオン、またはそれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、ギャップの幅または間隔は、約１ナノメートル（ｎｍ）以上であり得る。いくつかの実施形態では、ギャップの幅または間隔は、約２０ｎｍ以下であり得る。いくつかの実施形態では、ギャップの幅または間隔は、２０ｎｍ超であり得る。いくつかの実施形態では、フローチャネルは、約１００ｎｍ以上の深さを有し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの電極を備えたセンサーは、第１の部分と、第１の部分の下側に相接する第２の部分とを有し得る。いくつかの実施形態では、第１の部分は、第１の幅を有し得、および第２の部分は、第１の幅未満の第２の幅を有し得る。いくつかの実施形態では、センサーは、逆円錐の断面形状を有し得る。いくつかの実施形態では、核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸増幅反応は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸増幅反応は、核酸伸長反応を含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル核酸分子またはその一部分の少なくとも約５塩基を同定するまで、工程（ｃ）〜（ｅ）に記載されるように標識ヌクレオチドの結合、検出および取込みを含み得る工程のセットを繰り返すことをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、基材は、複数の電極対であって、各対は、異なるサンプル核酸分子またはその一部分の核酸配列を同定するように構成されている、複数の電極対を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸分子またはその一部分の核酸配列は、少なくとも約９０％の精度で同定され得る。いくつかの実施形態では、精度は、少なくとも約９５％であり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子またはその一部分の核酸配列は、核酸分子の少なくとも約１００連続核酸塩基にわたり少なくとも約９０％の精度で同定され得る。
本開示の他の態様は、ギャップによって分離された少なくとも２つの電極をフローチャネルの一部として含む基材であって、固体であり得る基材と、基材に作動結合され、かつ（ａ）１つ以上の標識ヌクレオチドタイプと、核酸増幅反応に必要な試薬とを含む反応混合物を電極対センサーまたは電極対センサーのセットに方向付けることと、（ｂ）核酸分子の増幅産物を得るのに十分な条件下で反応混合物の少なくとも一部分を核酸増幅反応に付すことであって、増幅産物は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの少なくとも１つを含み得る、付すことと、（ｃ）増幅産物が生成され得ることによる、およびまたはギャップを通るように方向付けられ得ることによる結合標識ヌクレオチドまたは増幅産物からの少なくとも１つの電気シグナルを、少なくとも２つの電極を用いて検出することであって、少なくとも１つの電気シグナルは、トンネル電流を含み得る、検出することと、（ｄ）（ｃ）で検出された電気シグナルに基づいて核酸分子またはその一部分の核酸配列を同定することとを行うようにプログラムされたコンピュータープロセッサーとを含む、核酸分子をシーケンシングするシステムを提供する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの電気シグナルは、少なくとも部分的に非ファラデー電流であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシグナルは、複数のシグナルを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの電気シグナルは、トンネル電流を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプは、トンネル電流およびホッピング電流の生成を促進し得る分子で標識され得る。いくつかの実施形態では、標識は、伝導性部分を含み得る。いくつかの実施形態では、伝導性部分は、標識が電位差に曝され得るときに電流の通過を可能にし得る。いくつかの実施形態では、電流は、直流（ＤＣ）であり得る。いくつかの実施形態では、電流は、交流（ＡＣ）であり得る。
いくつかの実施形態では、電流は、直流と交流との組合せであり得る。いくつかの実施形態では、分子は、トンネル標識を含み得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの所与のヌクレオチドタイプの塩基部分に結合され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの所与のヌクレオチドのリン酸鎖に結合され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプのセットの所与のヌクレオチドのリボースまたは他の骨格分子の任意の位置に結合され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの所与のヌクレオチドに可逆結合され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプは、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチドまたはそれらの修飾体を含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのタイプのヌクレオチドまたはそれらの修飾体の各タイプは、異なるトンネル標識で標識され得る。
いくつかの実施形態では、トンネル標識は、双性イオン性化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、約１０塩基以上を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、二本鎖部分と一本鎖部分とを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプは、ターミネーターを含み得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、ターミネーターに結合され得る。
いくつかの実施形態では、トンネル標識は、ターミネーターに可逆結合され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの電気シグナルは、約１００対１以上のシグナル対ノイズ比で検出され得る。いくつかの実施形態では、シグナル対ノイズ比は、約１０００対１以上であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの電気シグナルは、リアルタイムで検出され得る。いくつかの実施形態では、試薬は、酵素を含み得る。いくつかの実施形態では、酵素は、核酸ポリメラーゼ活性を有し得る。いくつかの実施形態では、酵素は、ポリメラーゼであり得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、少なくとも２つの電極の流体環境中に配設され得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、少なくとも２つの電極間の誘電体上に配設され得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、少なくとも２つの電極のうちの少なくとも１つの電極の表面上に配設され得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、少なくとも２つの電極のトップに配設され得る。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの少なくとも１つを増幅産物に結合または取り込むことを促進し得る。いくつかの実施形態では、試薬は、イオンを含み得る。いくつかの実施形態では、イオンは、カチオンを含み得る。いくつかの実施形態では、カチオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、またはそれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、カチオンは、触媒カチオン、非触媒カチオン、またはそれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、ギャップは、約１ナノメートル（ｎｍ）以上であり得る。いくつかの実施形態では、ギャップの幅または間隔は、約２０ｎｍ以下であり得る。いくつかの実施形態では、フローチャネルは、約１００ｎｍ以上の深さを有する。
いくつかの実施形態では、電極対を含むセンサーは、第１の部分と、第１の部分の下側に相接する第２の部分とを有し得る。いくつかの実施形態では、第１の部分は、第１の幅を有し得、および第２の部分は、第１の幅未満の第２の幅を有し得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、第２の幅を超えかつ第１の幅未満であるサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、電極対を含むセンサーは、逆円錐の断面形状を有し得る。
いくつかの実施形態では、核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸増幅反応は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸増幅反応は、プライマー伸長反応を含み得る。
いくつかの実施形態では、核酸分子またはその一部分の核酸配列は、少なくとも約９０％の精度で同定され得る。いくつかの実施形態では、精度は、少なくとも約９５％であり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子またはその一部分の核酸配列は、核酸分子の少なくとも約１００連続核酸塩基にわたり少なくとも約９０％の精度で同定され得る。
いくつかの実施形態では、システムは、センサーを含むチップをさらに含み得、およびセンサーは、基材を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの電極は、電気回路に結合され得る。いくつかの実施形態では、センサーは、少なくとも１つの電気シグナルを処理する電気回路に結合され得る。いくつかの実施形態では、チップは、個別の電極対をそれぞれ含む複数のセンサーを含み得る。いくつかの実施形態では、チップは、少なくとも約１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、１００，０００，０００、１，０００，０００，０００、１０，０００，０００，０００個または１０，０００，０００，０００個超のセンサーを含み得る。いくつかの実施形態では、複数のセンサーまたはセンサーの複数のセットのそれぞれは、独立して、アドレス指定可能であり得る。
本開示の他の態様は、１つ以上のコンピュータープロセッサーによる実行時、核酸分子をシーケンシングする方法を実現する機械実行可能コードを含む非一時的コンピューター可読媒体を提供する。本方法は、（ａ）フローチャネル領域内においてギャップによって分離された少なくとも２つの電極を含む基材を提供することであって、基材は、固体であり得る、提供することと、（ｂ）１つ以上の標識ヌクレオチドタイプと、核酸増幅反応に必要な試薬とを含む反応混合物を少なくとも２つの電極に方向付けることと、（ｃ）核酸分子の増幅産物を得るのに十分な条件下で反応混合物の少なくとも一部分を核酸増幅反応に付すことであって、増幅産物は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの少なくとも１つを含み得る、付すことと、（ｄ）増幅プロセスの工程中、少なくとも１つの電気シグナルを、少なくとも２つの電極を用いて検出することであって、標識ヌクレオチドは、ギャップ内に結合され得るか、または増幅産物は、ギャップ内に結合され得るかもしくはギャップを通るように方向付けられ得、少なくとも１つの電気シグナルは、トンネル電流を含み得る、検出することと、（ｅ）（ｄ）で検出された電気シグナルに基づいて核酸分子またはその一部分の核酸配列を同定することとを含む。
本開示の他の態様は、（ａ）フローチャネルの領域と共に、ギャップによって分離された少なくとも２つの電極を含む基材を提供することであって、基材は、固体であり得る、提供することと、（ｂ）１つ以上の標識ヌクレオチドタイプを含む核酸分子を、電極間のギャップを通るように方向付けることと、（ｃ）１つ以上の標識ヌクレオチドタイプを含む核酸分子からの少なくとも１つの電気シグナルを、少なくとも２つの電極を用いて検出することであって、少なくとも１つの電気シグナルは、トンネル電流を含み得る、検出することと、（ｄ）（ｃ）で検出された電気シグナルに基づいて核酸分子またはその一部分の核酸配列を同定することとを含む、核酸分子をシーケンシングする方法を提供する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの電気シグナルは、非ファラデー電流であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシグナルは、複数のシグナルを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの電気シグナルは、トンネル電流を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプは、トンネル電流またはトンネル電流およびホッピング電流の生成を促進し得る分子およびまたは他の部分で標識され得る。いくつかの実施形態では、分子およびまたは他の部分は、トンネル標識を含み得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの所与のヌクレオチドの塩基部分に結合され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの所与のヌクレオチドタイプのリン酸鎖に結合され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの所与のヌクレオチドタイプに可逆結合され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプは、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチドまたはそれらの修飾体を含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのタイプのヌクレオチドまたはそれらの修飾体の各タイプは、異なるトンネル標識で標識され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプは、ターミネーターを含み得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、ターミネーターに結合され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、ターミネーターに可逆結合され得る。
本開示の他の態様は、フローチャネル領域内においてギャップによって分離された少なくとも２つの電極を含む基材であって、固体であり得る基材と、基材に作動結合され、かつ（ａ）１つ以上の標識ヌクレオチドタイプを含む核酸分子を、フローチャネルを介して少なくとも２つの電極に方向付けることと、（ｂ）１つ以上の標識ヌクレオチドタイプを含む核酸分子からの少なくとも１つの電気シグナルを、少なくとも２つの電極を用いて検出することであって、少なくとも１つの電気シグナルは、トンネル電流を含み得る、検出することと、（ｃ）（ｂ）で検出された電気シグナルに基づいて核酸分子またはその一部分の核酸配列を同定することとを行うようにプログラムされたコンピュータープロセッサーとを含む、核酸分子をシーケンシングするシステムを提供する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの電気シグナルは、少なくとも部分的に非ファラデー電流であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシグナルは、複数のシグナルを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの電気シグナルは、トンネル電流を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプは、トンネル電流またはトンネル電流およびホッピング電流の生成を促進する分子で標識され得る。いくつかの実施形態では、分子は、トンネル標識を含み得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの所与のヌクレオチドタイプの塩基部分に結合され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの所与のヌクレオチドタイプのリン酸鎖に結合され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプの所与のヌクレオチドに可逆結合され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプは、少なくとも２つの異なるタイプのヌクレオチドタイプまたはそれらの修飾体を含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのタイプのヌクレオチドまたはそれらの修飾体の各タイプは、異なるトンネル標識で標識され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標識ヌクレオチドタイプは、ターミネーターを含み得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、ターミネーターに結合され得る。いくつかの実施形態では、トンネル標識は、ターミネーターに可逆結合され得る。
本開示の追加の態様および利点は、本開示の単なる例示的な実施形態が示され説明されているにすぎない以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろう。認識されるように、すべて本開示から逸脱することなく、本開示は、他のおよび異なる実施形態が可能であり、かつそのいくつかの詳細は、明らかな各種の観点から変更が可能である。したがって、図面および詳細な説明は、本質的に例示的なものであり、限定的なものではないと見すべきである。
参照による組込み
本明細書に挙げたすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別的に明示されて参照により組み込まれたのと同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
図面の簡単な説明
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に特定的に示される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られるであろう。
ポリマーのトンネルコンダクタンスのグラフを示す。 トンネルコンダクタンスを有するいくつかの異なるポリマー分子を示す。 トンネルコンダクタンスを有するいくつかの異なるポリマー分子を示す。 トンネルコンダクタンスを有するいくつかの異なるポリマー分子を示す。 ＤＮＡ鎖およびそれを介するトンネル電流を示す。 ＤＮＡ配列を含有するホモポリマーの長さの関数としてコンダクタンスを示す。 異なるＧＣ含有ＤＮＡ配列の長さの関数としてコンダクタンスを示す。 鎖ホッピングトンネルコンダクタンス路を示す。 標識を合成する方法を示す。 双性イオン性分子およびそれと２つの電極との関係を表す。 ヌクレオチドに結合された伝導性標識を示す。 ＳＡＭの形成および電極上に形成されたＳＡＭの密度測定の方法を示す。 ＳＡＭの形成および電極上に形成されたＳＡＭの密度測定の方法を示す。 ＳＡＭの形成および電極上に形成されたＳＡＭの密度測定の方法を示す。 ＳＡＭの形成および電極上に形成されたＳＡＭの密度測定の方法を示す。 ２つの電極に、それらに結合されたＳＡＭにより結合されたＤＮＡ標識を示す。 測定プロセスにおける異なる工程を示す。 測定プロセスにおける異なる工程を示す。 測定プロセスにおける異なる工程を示す。 ポリメラーゼおよび関連するシーケンシング方法のプロセスフロー図を示す。 エピジェネティックシーケンシング方法のいくつかの工程および得られる電流を図示する。 ナノギャップセンサーの作製工程を示す。 ナノギャップセンサーの作製工程を示す。 ナノギャップセンサーの作製工程を示す。 ナノギャップセンサーの作製工程を示す。 図３Ａ〜３Ｄに示されるプロセスを用いて形成されたセンサーのＳＥＭ画像およびＴＥＭ画像を示す。 図３Ａ〜３Ｄに示されるプロセスを用いて形成されたセンサーのＳＥＭ画像およびＴＥＭ画像を示す。 図３Ａ〜３Ｄに示されるプロセスを用いて形成されたセンサーのＳＥＭ画像およびＴＥＭ画像を示す。 図３Ａ〜３Ｄに示されるプロセスを用いて形成されたセンサーのＳＥＭ画像およびＴＥＭ画像を示す。 図３Ａ〜３Ｄに示されるプロセスを用いて形成されたセンサーのＳＥＭ画像およびＴＥＭ画像を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 ナノギャップセンサーの他の形成法を示す。 より狭いナノギャップを備えたナノギャップセンサーを表す。 積分センサーセル回路の簡略図を概略的に表す。 センサーアレイおよび関連する回路に対する複数の流体路を備えたチップを示す。 ユニバーサルヘアピンプライマーを示す。
詳細な説明
本発明の各種の実施形態を本明細書に示し説明してきたが、かかる実施形態が例として提供されているにすぎないことは当業者に明らかであろう。当業者には、本発明から逸脱することなく多くの変形形態、変更形態、および置換形態が想到され得る。本明細書に記載される本発明の実施形態の各種の代替形態を利用し得ることが理解されるべきである。
本開示は、バイオ分子シーケンシング、たとえばポリヌクレオチドシーケンシングに関するシステムおよび方法を提供すると共に、バイオ分子の検出および定量をはじめとする他の目的でのトンネル標識の使用を提供する。システムおよびまたは方法の例は、電極対により形成されたギャップ内でのポリヌクレオチド合成に基づくトンネル電流の測定と、各塩基に関連付けられるトンネルシグナルの同定とを含み得る。
本明細書で用いられる「ギャップ」という用語は、材料中または電極間に形成されるかまたは他に提供される容積、空間、細孔、チャネル、または通路を一般に意味する。材料は、基材などの固体状態材料であり得るか、または基材上に形成された異なる層で形成され得る。ギャップは、センシング回路またはセンシング回路に結合された電極に隣接または近接して配設され得る。いくつかの例では、ギャップは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１，０００ｎｍ程度の特徴的な幅または直径を有し得る。ナノメートル程度の幅を有するギャップは、「ナノギャップ」と呼ばれ得る（本明細書では「ナノギャップ」ともいう）。いくつかの状況では、ナノギャップは、約０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約５０ｎｍ、０．５ｎｍ〜３０ｎｍもしくは０．５ｎｍ〜１０ｎｍ、０．５ｎｍ〜５ｎｍもしくは０．５ｎｍ〜２ｎｍ、５〜３０ｎｍ、１０ｎｍ〜２０ｎｍ、５ｎｍ〜２０ｎｍ、１５ｎｍ〜２５ｎｍ、または約２ｎｍ以下、１ｎｍ以下、０．９ｎｍ以下、０．８ｎｍ以下、０．７ｎｍ以下、０．６ｎｍ以下、もしくは０．５ｎｍ以下であり得る幅または間隔を有し得る。いくつかの場合、ナノギャップは、少なくとも約０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、７．５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、または３０ｎｍ超の幅を有する。いくつかの場合、ナノギャップの幅または間隔は、シーケンシング反応に使用されるバイオ分子の直径超であり得るか、またはサンプルバイオ分子もしくはサンプルバイオ分子のサブユニット（たとえば、モノマー）の直径未満であり得る。
本明細書で用いられる「バイオ分子」または「バイオポリマー」という用語は、ナノギャップ電極を横切って電気的パラメーター（たとえば、電流、電圧、差動インピーダンス、トンネル電流、トンネル電流およびもしくはホッピング電流、抵抗、キャパシタンス、またはコンダクタンス）の関数としてインテロゲート可能な任意の生体物質を一般に意味する。バイオ分子は、核酸分子、タンパク質、または炭水化物であり得る。バイオ分子は、１つ以上のサブユニット、たとえばヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
本明細書で用いられる「核酸」という用語は、１つ以上の核酸サブユニットを含む分子を一般に意味する。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、それらの脱塩基体または変異体、たとえば任意の天然に存在するまたは天然に存在しない（たとえば、修飾もしくは工学操作された）エピジェネティック修飾塩基など（デオキシリボース、リボース、ＰＮＡ（タンパク質核酸）、Ｌ−ＤＮＡ、ロックド核酸、または任意の他の標準的もしくは非標準的ポリマー骨格に結合され得る）から選択される１つ以上のサブユニットを含み得る。ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、もしくはＵ、またはそれらの変異体を含み得る。ヌクレオチドは、成長中の核酸鎖に取り込まれ得る任意のサブユニットを含み得る。ヌクレオチドは、成長中の核酸鎖に結合するが、取り込まれない任意のサブユニットを含み得る。かかるサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵであり得るか、あるいは１つ以上の相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、もしくはＵに特異的であるか、またはプリン（すなわちＡもしくはＧまたはそれらの変異体）もしくはピリミジン（すなわちＣ、ＴもしくはＵまたはそれらの変異体）に相補的である任意の他のサブユニットであり得る。サブユニットは、個別の核酸塩基または一群の塩基（たとえば、ＡＡ、ＴＡ、ＡＴ、ＧＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＣ、ＧＴ、ＴＧ、ＡＣ、ＣＡ、またはそれらのウラシルカウンターパート）を分割可能にし得る。いくつかの例では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）またはそれらの誘導体である。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖または部分的に一本鎖および部分的に二本鎖であり得、複数の一本鎖部分を有し得るかまたは複数の二本鎖部分を有し得る。
本明細書で用いられる「タンパク質」という用語は、アミノ酸のモノマー、サブユニット、もしくは残基を１つ以上有する生物学的分子もしくはマクロ分子を一般に意味するか、またはそれぞれアミノ酸のモノマー、サブユニット、もしくは残基を１つ以上有し得るマクロ分子の複合体を意味し得る。たとえば、５０アミノ酸以下を含有するタンパク質は、「ペプチド」と呼ばれ得る。アミノ酸モノマーは、任意の天然に存在するおよびまたは合成されたアミノ酸モノマー、たとえば天然に存在する２０、２１、２２アミノ酸などから選択され得る。いくつかの場合、２０アミノ酸は、対象の遺伝暗号にコードされる。いくつかのタンパク質は、天然に存在するおよび天然に存在しない約５００アミノ酸から選択されるアミノ酸を含み得る。いくつかの状況では、タンパク質は、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンおよびバリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、およびチロシンから選択される１つ以上のアミノ酸を含み得る。
本明細書で用いられる「隣接」または「〜に隣接する」という用語は、「〜の隣」、「〜に相接する」、「〜に接触する」、および「〜に近接する」を含む。いくつかの場合、隣接するコンポーネントは、１つ以上の介在層により互いに分離される。たとえば、１つ以上の介在層は、約１０マイクロメートル（「ミクロン」）未満、１ミクロン、５００ナノメートル（「ｎｍ」）、１００ｎｍ、５０ｎｍ、１０ｎｍ、１ｎｍ、またはそれを下回る厚さを有し得る。一例では、第１の層は、第１の層が第２層に直接接触している場合、第２層に隣接する。他の例では、第１の層は、第１の層が第３の層により第２層から分離されている場合、第２層に隣接する。
本明細書で用いられる「トンネリング」という用語は、乗り越えるのに十分なエネルギーを粒子が有していないポテンシャル障壁を介した電子などの粒子の移動を一般に意味する。これは、いずれのエネルギー障壁も乗り越えるのに十分なエネルギーを粒子が有し得る標準的コンダクタンスと対照的であり得る。
部分（たとえば、本明細書で用いられる「トンネル標識」という用語は、部分内のもしくは部分を介したまたは１つ以上の電極と部分との間の電子または正孔のトンネリングを促進し得る部分（たとえば、化合物、分子、粒子、およびそれらの組合せ）を一般に意味する。いくつかの場合、トンネリングは、トンネル電流およびまたはホッピング電流として測定され得る。
本明細書で用いられる「トンネル電流」という用語は、電圧（たとえば、バイアス電圧）が印加された２つの電極間の電子または正孔のトンネリングに関連付けられる電流シグナルを一般に意味する。トンネリングは、トンネル標識に入るか、トンネル標識から出るか、トンネル標識を通るか、またはそれらの任意の組合せであり得る。いくつかの場合、トンネリングは、ホッピングが起こり得る伝導路の部分と組み合わされ得る。
本明細書で用いられる「同期化学法」という用語は、サイクル時間が限定されている方法を一般に意味する。同期化学法は、適切な測定の時間が既知であり得ると共に、適切な測定の実施を保証するために複数回の測定が必要でない可能性があることから、１回の測定のみを必要とし得る。
本明細書で用いられる「非同期化学法」という用語は、サイクル時間が確定されておらずかつ変動し得る方法を一般に意味する。非同期化学法は、いつ測定を行う必要があり得るかを決定できないため、所望の測定が行われ得ることを保証するためにある時間にわたり何回かの測定が必要な可能性があることから、複数回の測定の必要性を特に有し得る。
本明細書で用いられる「スタック末端」という用語は、スタック末端に相補的であり得る領域で少なくとも部分的に一本鎖であり得る、トンネル標識の一部分を含み得る相補的核酸または少なくとも部分的に相補的な核酸に結合またはハイブリダイズされ得るように、ＳＡＭの一部であり得、かつ少なくとも部分的に一本鎖であり得る核酸配列を含み得る。
本明細書で用いられる「スティッキー末端」という用語は、スタック末端に相補的であり得る領域で少なくとも部分的に一本鎖であり得、したがってそれに結合またはハイブリダイズされ得る、トンネル標識の一部分を含み得る核酸配列を一般に意味する。
本明細書で用いられる「バックフィル」という用語は、名目上バイオ不活性であり、したがって核酸、たとえばサンプル核酸、標識の一部分を含み得る核酸、ヌクレオチド、酵素をはじめとするタンパク質、または他のバイオ分子と結合しなくてもまたは相互作用しなくてもよく、かつＳＡＭの一部として結合されて、バイオ分子と、ＳＡＭが結合され得る表面との間の相互作用を防止し得る、ＳＡＭの一部を一般に意味する。
本明細書で用いられる「スキップリード法」という用語は、いくつかのサイクルで同期化学法を利用し得、次いで懸濁させ、その後、ある時間にわたり非同期化学法を利用し得、次いで懸濁させ、その後、いくつかのサイクルで同期化学法を利用し得るシーケンシング方法を一般に意味する。非同期化学法が利用される時間は、「スキップ時間」であるとみなされ得る。非同期化学法が利用される時間には測定を行わなくてよい。
本明細書で用いられる「物理的ブロッカー」という用語は、第２の部分に結合される第１の部分を一般に意味する。ただし、第１の部分は、測定プロセスの一部として使用される部分であり、かつ第２の部分は、第２の部分のサイズの関数として第１の部分を互いに分離させ得るサイズである。物理的ブロッカーは、センサーに対して第１の部分の個別の局在化を可能にするために使用され得るか、または第２の部分が不在である場合に第１の部分が離間され得る間隔よりも大きくいことができる比較的規則的な間隔で第１の部分を離間させるために使用され得る。そのため、第２の部分は、物理的ブロッカーであるとみなされ得る。
本明細書で用いられる「インテロゲート塩基」という用語は、伸長プライマーの一部として取り込まれた相補的塩基を有していない最初の塩基であり得、かつポリメラーゼまたは他の酵素により取り込まれ得る隣の塩基に相補的であり得る塩基を一般に意味する。そのため、取り込まれる塩基は、伸長プライマーの一部である相補的塩基を有する最後の塩基から５’方向の１塩基であり得ると共に、ポリメラーゼなどの酵素の活性部位にさらに結合し得る１塩基であり得る。
量子トンネルデバイスは、ポリヌクレオチドをシーケンシングするためにヌクレオチドの直接測定に使用する場合、いくつかの課題をもたらす可能性がある。
単分子シーケンシングで起こり得る他の課題は、チップ上に何百万以上のデバイスを備えた大規模並列シーケンサーを製造する道を切り開くデバイス製造である。これは、ナノデバイスの技法および技術の大きい課題をもたらし得る。しかしながら、これは、たとえば、全ゲノム単分子シーケンシングの目的で必要であり得る。
たとえば、蛍光分子は、おそらく約６０００光子を形成し得るが、光子のごくわずかなパーセント（約１０％）が電子に変換されるにすぎない。いくつかの場合、バックグラウンド誘導ノイズに起因して、適正なシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を得るために多くの蛍光分子を使用する必要がある。多くの蛍光分子を使用したとしても、色素濃度が低いこともあり、非常に高い照射量（光子／秒／単位面積）が必要とされる可能性があるため、結果として高価なレーザー照明システムとなることが多い。
ｐＨ検出も、シグナルを生成するために多数の分子を必要とし得る。既存のシステムは、適正なシグナル対ノイズ比を得るために１００，０００分子超を必要とし得る。
トンネル標識
本明細書に提供されるように、トンネル標識は、トンネル電流により低バックグラウンドレベルで単一ポリマー分子から多数の電子を提供する媒介化合物であり得る。たとえば、１秒間に１ｎＡの電流は、６．２Ｍ電子を生成し得る。５ｐＡのバックグラウンドの存在下では、これは、＞１０００：１のショットノイズ限界Ｓ／Ｎレベルをもたらし得る。
いくつかの場合、トンネル標識は、１０−１１未満、１０−１１〜１０−１０、１０−１０〜１０−９、１０−９〜１０−８、もしくは１０−８〜１０−７ジーメンス、またはそれを超えるコンダクタンスに対応する電流を提供し得る。そのため、１０ｍＶ未満、１０ｍＶ〜１００ｍＶ、１００ｍＶ〜２５０ｍＶ、２５０ｍＶ超などの公称バイアス電位を用いて、多くのシステムでショットノイズが有意でないとみなされ得るように有意な電流を生成し得る。
トンネル標識は、たとえば、コヒーレントもしくはインコヒーレントなトンネリング、インコヒーレントな熱誘起ホッピング、またはそれらの組合せの結果として伝導され得る。対照的に、より標準的な伝導路は、コヒーレントまたはインコヒーレントのいずかにかかわらず、トンネリングの使用を含まない。いくつかの場合、トンネル路は、式Ｒ＝Ｒ０ｅ（βＬ）で表される抵抗を有し得る。式中、Ｌは、電子、正孔、または電流が通り抜け得るトンネル路の長さであり、かつβは、分子および分子状態、たとえば水和状態に依存する定数であり、かかるトンネル路を有する分子の例は、図１Ａおよび１Ｂに示される。いくつかの場合、トンネル標識を通る伝導路は、少なくとも部分的にホッピング電流に基づき得る。ホッピングが起こる伝導路の部分は、式Ｒ＝Ｒ０＋αＬ＝Ｒ０＋α∞Ｌｅ（Ｅａ／ｋＴ）で表される抵抗を有し得る。式中、Ｌは、電子または電流が通り抜け得るトンネル路の長さであり、Ｅａは、活性化エネルギーであり、ｋは、ボルツマン定数であり、かつＴは、温度である。かかる電流は、トンネル標識を通る電子または正孔のいくつかの比較的小さい運動から生じ得ると共に、それにより、トンネル標識よりも長い部分を通る電流を生成する。ホッピング電流部分は、熱依存性であってもなくてもよい。トンネル電流部分は、温度依存性であってもなくてもよい。いくつかの場合、コヒーレントまたはインコヒーレントのいずれかであり得るトンネリングおよびホッピングの両方は、トンネル標識の単一部分を通って起こり得る。
いくつかの場合、トンネリングは、π電子軌道または積層π電子軌道の結果として起こり得る。たとえば、トンネリングは、二本鎖ＤＮＡで起こるようにオーバーラップπ電子軌道の存在の結果として支援され得る。オーバーラップ電子軌道がトンネリングに有用な方法で存在し得る他の位置は、ベンゼン環および他の類似の構造、たとえばかかる構造がｓｐ２混成軌道またはｐｚ軌道を形成し得る位置を含む。
図１Ｅに示されるように、トンネル電流は、２つの電極１０７Ａおよび１０７Ｂ間を通り得るため、かつリンカー１０９Ａおよび１０９Ｂを越えてまたは通ってトンネルし得るため、かつ塩基の積層π電子軌道を通ってトンネルまたはホッピングし得るため、π軌道１１１を通る核酸ポリマーの長さに沿った電流通過をもたらす。電子の共有は、電子軌道のエネルギーレベルに影響を及ぼし得る。たとえば、最高エネルギー被占分子軌道（ＨＯＭＯ）レベルは、かかる共有の結果として増加し得ると共に、これにより、共有軌道のエネルギーレベルと電極のエネルギーレベルとの間のより良好なマッチングを可能にし得るため、より高いコンダクタンスレベルおよび電流レベルが得られる。
いくつかの場合、トンネル標識の長さは、主にトンネル標識を通るトンネリングの代わりに、主にトンネル標識を通るホッピングが起こり得る長さであり得る。このいくつかの例は、ホモポリマー核酸、特により良好なπ軌道オーバーラップを有し得るＧ塩基およびＡ塩基のものであり得る。かかる移行は、主に逆指数関数を有するものから主に逆線形関数を有するものへのコンダクタンスの変化をもたらし得る。かかる移行は、図１Ｆに示されるようにおよびGriese et. al. in Nature 2001, 412 318（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、Ａホモポリマー配列の長さが約３塩基対に達したときのホモポリマーＡ塩基対で起こり得る。同様に、ＧＣリピート配列は、図１Ｇに示されるようにおよびXiang et. al. in Nature Chemistry 2015 7 221（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、塩基対のＧＣ対の数の増加の関数として主にホッピング伝導を有し得る。図中、Ｘ軸は、ＧＣ塩基対の数であり、黒四角は、ＧＣリピートであり、三角は、ＧおよびＣのリピートホモポリマーであり、かつＹ軸は、Ｍオームである。図１Ｈは、ＧＣリピート配列を通るコンダクタンス路を示す。
いくつかの場合、トンネル標識は、オリゴマーなどのポリマーを含み得る。限定されるものではないが、ポリマーの例としては、オリゴチオフェン、オリゴフェニレンイミン、電子供与体と電子受容体との組合せ、たとえば、それぞれテトラチアフルバレンとピロメリト酸ジイミドとの組合せ、カーボンナノリボン、カロテノイド、アルカン、トラン、オリゴペプチド、オリゴポルフィリン、ペリレンテトラカルボン酸ジイミド、フラーレン、カーボンナノチューブ、シングルウォールナノチューブ、グラフェンナノリボン、さまざまなタイプの核酸、二本鎖核酸、三本鎖核酸、もしくは四本鎖核酸、またはそれらの組合せ（たとえば、直列組合せ、並列組合せ、またはキメラを形成する直列並列組合せ）が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、トンネル標識は、たとえば、標識の少なくとも一部分の配向に依存して対称または非対称のコンダクタンスを有し得る。いくつかの場合、コンダクタンスの対称性または非対称性は、標識の配向の決定に利用され得る。
トンネル標識のタイプまたは構成は、トンネル標識のコンダクタンスに有意に影響を及ぼし得る。たとえば、図１Ａに示されるように、異なるタイプのポリマーの長さ（オングストローム単位）は、そのコンダクタンス（ジーメンス単位）に対応して描かれ、可能性のあるトンネル標識の構造は、図１Ｂおよび１Ｃに示される。図中、１０１Ａは、アルカンの各種長さおよび関連コンダクタンスを示し、かつ１０１Ｂは、アルカンの構造を示し、１０２Ａは、同様にオリゴペプチドの各種長さおよび関連コンダクタンスを示し、かつ１０２Ｂは、例示的オリゴペプチドの構造を示し、１０３Ａは、同様にカロテノイドポリマーの各種長さおよび関連コンダクタンスを示し、かつ１０３Ｂは、例示的カロテノイドポリマーの構造を示し、１０４Ａは、同様にオリゴチオフェンの各種長さおよび関連コンダクタンスを示し、かつ１０４Ｂは、例示的オリゴチオフェンの構造を示す。図１Ｃには、対称コンダクタンスを有し得る９，１０−ジ（２’−（パラ−アセチルメルカプトフェニル）エチニル）−アントラセン１０５および非対称コンダクタンスを有し得る２，５−ジ（２’−（パラ−アセチルメルカプトフェニル）エチニル）−４−ニトロ−アセチ−アニリン１０６の例示的化学構造が示されている。いくつかの場合、単分子トランジスターまたは有機トランジスターの一部として使用される分子は、いずれもトンネル標識の少なくとも一部として使用するのに好適であり得る。
いくつかの場合、金属は、テトラフェニルポルホリンの化学構造が描かれた図１Ｄに示されるポルフィリンの場合のようにポリマーの一部分に結合し得る。ヘムおよびフェロセンなどの他のキレート化分子は、１つ以上の金属イオンがトンネル標識の一部分を構成し得るように金属イオンを結合するために利用され得る。
いくつかの場合、トンネル標識は、金属、たとえば金属のナノ粒子、ナノビーズ、ナノロッド、または任意の他の形状の金属を含み得る。いくつかの場合、核酸などのポリマーは、ナノビーズに結合し得ると共に、核酸ポリマーは、センサーの電極に結合し得る核酸に少なくとも部分的に相補的であり得るものであり、その結果、核酸は、ハイブリダイズしてナノビーズをセンサーの電極に結合し得る。いくつかの場合、金属ナノ粒子は、少なくとも１つの電極に、かつ金属ナノ粒子に結合された対応する核酸に標的核酸が少なくとも部分的に相補的であり得るサンドイッチアッセイを用いて結合し得るものであり、したがって、金属ナノ粒子を結合して、自由電子を有する導体間にトンネル路およびまたはホッピング路を提供する。いくつかの場合、核酸鎖は、Baiglらの国際公開第２００８／０３５７８７号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような技術を用いて金属化し得る。いくつかの場合、かかる金属化処理は、トンネル標識の一部分を構成し得る核酸の二本鎖部分に適用され得ると共に、核酸の末端に存在し得る一本鎖部分は、ハイブリダイゼーションによるトンネル標識の結合を可能にする。いくつかの場合、たとえば、化学量論法を用いて標識の一部のみを金属化し得る。いくつかの場合、標識は、オリゴを含み得ると共に、オリゴのいくつかを金属化し得る。標識の残りの部分は、オリゴまたは他の伝導性ポリマーもしくは金属粒子を含み得ると共に、ライゲーション、クリックケミストリー、または他の共有結合技術もしくは非共有結合技術を用いて結合し得る。
いくつかの場合、オリゴは、標識の一部分を構成し得る。オリゴは、各種のオリゴヌクレオチド合成方法を用いて形成され得る。いくつかの例では、オリゴヌクレオチド合成は、長いＧホモポリマーまたは高ＧＣ含有率のオリゴでは困難であり得る。かかる場合、オリゴは、オリゴ合成とライゲーション法との組合せを用いてオリゴヌクレオチド合成技術のみを利用した場合に可能であり得るよりも高い収率を可能にすることにより形成され得る。
トンネル標識は、ポリマーを含み得る。ポリマーは、任意の適切な結合機構を用いて、たとえばチオール、ジスルフィド、アミン、ジアミン、または任意の他の適切な結合部分を介して、標識に含まれる金属粒子に結合し得る。ポリマーは、トンネリングおよびまたはホッピングのコンダクタンス路の提供を支援し得る任意のタイプのポリマーであり得る。ポリマーは、核酸分子（たとえば、ポリマー）を含み得る。核酸分子は、電極に関連付けられ得る（たとえば、結合され得る）１つ以上の核酸分子（たとえば、ポリマー）に相補的およびまたは部分相補的であり得る。これは、核酸分子間のハイブリダイズ結合を用いないときに生じ得るよりも高いトンネル電流を可能にし得る。
いくつかの場合、複数の結合部分およびまたは結合しない部分は、金属、たとえば金属のナノ粒子、ナノビーズ、ナノロッド、または他の形状の金属に結合し得る。
いくつかの場合、ヌクレオ塩基に関連付けられる標識は、特定の核酸ポリマートンネル標識化合物の配列およびまたは長さの関数として、異なる塩基タイプに対して異なる標識を利用し得る。特定のトンネル標識化合物に関連付けられるトンネル電流は、ＤＮＡの長さおよびＡＴ含有率の増加に伴って減少し得る。いくつかの場合、ＧＣリッチ配列を利用し得る。ＧＣリッチ配列は、異なる順序のトンネリングおよびまたはホッピングがトンネル標識化合物を通り過ぎ得る電子または正孔により利用され得るように、さまざまな順序のＧ塩基およびＣ塩基を有し得る。いくつかの場合、ＡＴリッチ配列を使用し得る。他の実施形態では、ＡＴリッチセクションとＧＣリッチセクションとの混合物を使用し得る。
いくつかの場合、標識は、少なくとも部分的にＧ四本鎖で作製され得る。たとえば、Ｇホモポリマーの末端は、Ｇホモポリマーでなくてもよく、したがってテトラマー形で結合しなくてもよいため、テトラマー形で結合しないＧ四本鎖の部分に相補的なＤＮＡ配列を含み得、かつ電極に結合し得るＳＡＭへの結合に利用可能であり得る。
いくつかの場合、トンネル標識内で１つ以上のミスマッチまたは欠失塩基を利用し得る。ミスマッチまたは欠失塩基は、トンネル標識がセルフアセンブル単層（ＳＡＭ）に結合し得る領域で利用され得る。いくつかの場合、ミスマッチまたは欠失塩基は、トンネル標識がＳＡＭとのなんらかの相互作用前に二本鎖であり得るトンネル標識の少なくとも一部分内に存在し得る。いくつかの場合、塩基のミスマッチと同様に１つ以上の脱塩基または非天然ヌクレオ塩基を利用し得る。いくつかの場合、１つ以上の脱塩基、非天然塩基、天然に存在する非標準的塩基、たとえばメチル化Ｃ塩基、メチル化Ａ塩基、または任意の他のタイプの天然に存在するもしくは合成のヌクレオ塩基、およびそれらの修飾体を利用し得る。
いくつかの場合、修飾塩基は、少なくとも部分的に修飾アデニンを含み得る。修飾アデニンは、窒素から７番目の位置にＣ−Ｈ基への置換を有し得ることから、７−デアザアデニンを形成し得る。このように修飾されたアデニンの塩基対合は、影響を受けない可能性があり、かつ関連トンネル電流は、（潜在的にグアニンの場合とほとんど同一の電流レベルに）増加し得る。いくつかの場合、同様にグアニンヌクレオ塩基を修飾し得る。修飾グアニンは、潜在的に天然グアニンのトンネル電流からトンネル電流を増加させ得ると共に、修飾ＧＣリッチトンネル標識化合物を用いてかなり高いトンネル電流を達成できる可能性がある。
トンネル標識（たとえば、トンネル標識化合物）は、二本鎖核酸、一本鎖核酸、またはそれらの組合せを含み得る。いくつかの例では、トンネル標識は、部分的に二本鎖の核酸と、部分的に一本鎖の核酸とを含み、核酸鎖は、２つの「スティッキー末端」を有し得ると共に、スティッキー末端は、標識の二本鎖領域を越えて延在する核酸の両方の一本鎖セクションの３’末端または５’末端のいずれかを構成し得る。この場合、相補的な対の両方の鎖は、相補的セクションを越えて延在し得る。他の実施形態では、トンネル化合物は、より長い一本鎖が電極対の両方の電極上のセルフアセンブル単層と相互作用し得るように、より短い二本鎖セクションの両方の末端を越えて延在するより長い一本鎖を有し得る。
いくつかの場合、いずれの標的ｓｓＤＮＡにもそれほど結合し得ないより短い相補的ＳＡＭを可能にするために、トンネル標識の一部としてロックド核酸（ＬＮＡ）およびまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）を利用し得る。いくつかの場合、ＳＡＭの相補的部分を構成する核酸およびトンネル標識は、ＳＡＭとトンネル標識化合物との間ではハイブリダイゼーションが起こり得るが、反対のヘリックス回転によりＳＡＭが標的ｓｓＤＮＡ鎖に結合し得ないように、少なくとも部分的に左巻きヘリックスＤＮＡ（Ｌ−ＤＮＡ）を含み得る。いくつかの場合、ＳＡＭ上の短い相補的領域とトンネル標識化合物とを可能にしつつ、標的ｓｓＤＮＡの結合を防止するために、ロックドＤＮＡとＬ−ＤＮＡとの組合せを利用し得る。
いくつかの場合、標識としておよびまたはスタック末端としてデンドリマーを使用し得る。デンドリマー構造は、いくつかの同時代替経路を提供し得るため、単一デンドリマー構造は、電極の結晶構造の差から生じる可能性のある変動と、それから生じる可能性のある電流の変動とを効果的に軽減可能にする。デンドリマーのさまざまな性質は、多くの方法によりかつ多くの部位によりＳＡＭに結合し得る汎用性のあるトンネリング／ホッピング標識をもたらし得る。デンドリマー構造は、同一のまたは異なる核酸配列を含み得る。いくつかの場合、デンドリマーの少なくとも一部分（たとえば、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超える）は、同一または類似の核酸配列を含む。いくつかの場合、デンドリマーの少なくとも一部分（たとえば、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超える）は、異なる配列を有する。
いくつかの場合、すべてのヌクレオチド塩基に対して同一のデンドリマー部分を標識として使用し得る。いくつかの場合、シーケンシングサイクル内のサブサイクルとしてポリメラーゼとの相互作用によりヌクレオチドを結合し得るように、異なるヌクレオチド塩基を含有する流体をフローセルに進入させ得る。異なる塩基を含有する流体は、各サイクルで同一のデンドリマー標識を用いてポリメラーゼとの相互作用によりヌクレオチドを逐次的に結合し得るようにフローセルに進入させ得る。いくつかの場合、サブサイクル後、ヌクレオチド塩基を含有する流体を除去し得ると共に、洗浄緩衝液を導入して異なるタイプのヌクレオ塩基を分離し得る。また、同一タイプのデンドリマー標識を含む異なるヌクレオチド塩基を含有する流体は、ポリメラーゼとの相互作用により標識ヌクレオ塩基を結合し得るようにフローセルに進入させ得る。サンプル核酸配列は、バイアス電圧により生じたデンドリマーを通るトンネル／ホッピング電流により検出されたヌクレオチド結合のパターンから決定され得る。
いくつかの場合、単一の標識構造または複数の標識を有するデンドリマー構造は、単一の構造に結合された複数のヌクレオチドも含み得る。いくつかの場合、複数のヌクレオチドは、同一タイプのヌクレオ塩基であり得ると共に、他の場合、異なるヌクレオチドは、異なるタイプのヌクレオ塩基を含み得る。さらなる場合、デンドリマー構造は、単一タイプの標識を含み得ると共に、他の場合、デンドリマー構造は、異なるタイプの標識を含み得る。いくつかの異なるタイプの非標準的ヌクレオ塩基またはエピジェネティック修飾ヌクレオ塩基を試験する場合のようにいくつかの異なる結合部分が望まれ得るいくつかの場合、デンドリマー構造は、識別コードとして結合し得る異なる標識の組合せにより同定され得る。
いくつかの場合、トンネル標識を通るトンネル電流を増加させるためにトンネル標識にハイブリダイズまたは結合される標識およびまたはＳＡＭは、天然非修飾ヌクレオ塩基を含み得る。いくつかの場合、修飾塩基（たとえば、天然に存在する塩基または天然に存在しない塩基）が利用される。いくつかの場合、骨格は、リボースを有する天然に存在するリン酸骨格を含み得る。いくつかの場合、骨格に関連付けられる電荷を除去することを含めて、天然に存在しない修飾、たとえば硫黄修飾または任意の他の修飾を利用し得る。たとえば、リボースの代わりにＰＮＡを利用するか、またはリン酸上のＯＨ基を非荷電基と交換し得る。アプタマーに使用されるような任意の他の骨格修飾、たとえばゼノ核酸（ＸＮＡ）骨格、Ｌ−ＤＮＡ、ロックドＤＮＡ、またはＡ型ＤＮＡも利用し得る。
いくつかの場合、標識のコンダクタンスを変化させるために異なる溶媒条件を利用し得る。たとえば、完全にまたは主に水性の溶媒中でＢ型を有し得る標識は、溶媒条件の変化によりＡ型を取り得る。たとえば、エタノールまたはイソプロパノールなどのアルコールの添加は、より短いよりコンパクトな構造への標識の変化をもたらし得る。この場合、塩基の大部分は、互いに垂直になり得ず、代わりにわずかにオフセットされ得る。かかるＢ型では、標識配列に関連付けられるコンダクタンスは、特に標識配列がＧＣＧＣまたはホモポリマーＡＡＡＡなどの主に規則的な配列を有してない場合、標識配列がＡ型である状況よりも高くなり得る。いくつかの場合、Ｂ型から修飾された型の標識は、標識配列がＢ型である場合よりも高いホッピングレベルを有し得る。主にＢ型である間、コンダクタンスは、主にトンネル方式で標識を介して生じ得ると共に、Ａ型などの非Ｂ型では、標識コンダクタンスは、主にホッピング方式で生じ得る。いくつかの場合、標識は、Ｚ型であり得る。異なる型間の差は、たとえば、ヘリックスの直径（標準的Ｂ型では２０オングストローム、Ａ型では２３オングストローム、およびＺ型では１８オングストローム）、１塩基対当たりの上昇（標準的Ｂ型では３．３２オングストローム、Ａ型では２．３オングストローム、およびＺ型では３．８オングストローム）、１回転またはターン当たりの塩基対の数（標準的Ｂ型では１０．５塩基対、Ａ型では１１塩基対、およびＺ型では１２塩基対）、およびさまざまな他の特徴を含めて、いくつかの方法で特徴付けられ得る。ポリマーは、異なる特徴の１つ以上がその特定の特徴に関する異なる型間の差の約５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、またはそれ未満である場合、主に１つの型であるとして記述され得る。たとえば、特定の溶媒条件下の核酸鎖は、１塩基対当たりの上昇が２．８１オングストローム超かつ３．５６オングストローム未満である場合、したがってＡ型とＢ型との間の差の半分超、Ｚ型とＢ型との間の差の半分未満である場合、主にＢ型であるとみなされ得る。
いくつかの場合、リボヌクレオチドを利用し得る。リボヌクレオチドは、主にＡ型を取り得る。リボヌクレオチドは、水性または主に水性の溶媒中で標識のＡ型を可能にしつつ、可変であり、潜在的に有意に可変であり得る標識配列のより高い伝導率を可能し得る。
いくつかの場合、ハイブリダイズされた標識とＳＡＭとのより密なおよびもしくはより均一な結合、ならびにまたは標識内の結合に関連付けられるより均一なかつより高いコンダクタンスを可能にするために、修飾塩基を利用し得る。修飾塩基は、より強いまたはより弱い結合を有し得る。修飾塩基は、名目上均一な結合よりも解れを起こしにくくし得るように、かつ変性が起こるまでコンダクタンスをより高い平均値に維持し得るように、ＳＡＭの「スタック末端」およびもしくは標識の「スティッキー末端」の一部として、ならびにまたは二本鎖部分であり得る標識部分の末端およびもしくはスタック末端の塩基の一部として、あるパターンで利用され得る。
いくつかの場合、トンネル標識の１つまたは複数の部分は、一本鎖が互いに比較的ごく近接して４つの３ｍｅｒホモポリマーグアニン領域を有することにより天然に形成されるように、三本鎖型または四本鎖型のヌクレオ塩基ポリマーを含み得る。この場合、フーグスティーン塩基対合によりグアニン塩基を四本鎖にすることにより、標準的二本鎖結合よりも安定にし得る。かかる複合体は、単一の鎖、２つの鎖、３つの鎖、または４つの鎖を含み得る。四本鎖複合体は、追加のπ結合の結果として天然の二本鎖よりも高い伝導率を有し得る。
他の場合、望ましくないまたは偶発的な四本鎖形成を防止するために７−デアザグアニン塩基を利用し得る。四本鎖形成が望ましくない可能性がある場合、７−デアザアデニン塩基を利用し得る。この場合、７−デアザアデニン塩基のトンネル伝導率は、標準的アデニン塩基の伝導率よりもかなり高くなり得ると共に、そのままではグアニン塩基間で起こる可能性のあるフーグスティーン結合を防止する役割も果たし得る。
いくつかの場合、サンプル塩基およびまたはサンプル塩基への修飾を決定するために、トンネル標識およびまたはヌクレオ塩基セットの一部として修飾塩基を使用し得る。限定されるものではないが、修飾塩基の例としては、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ３−メチルアデノシン、Ｎ７−メチルグアノシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、プソイドウリジン、チオウリジン、イソグアノシン、イソシトシン、ジヒドロウリジン、キューオシン、ワイオシン、イノシン、トリアゾール、ジアミノプリン、β−Ｄ−グルコピラノシルオキシメチルウラシル、８−オキソグアノシン、または２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシンもしくは２’−Ｏ−メチルウリジン、いずれかの既知の１４０種のエピジェネティックＲＮＡ修飾体、あるいはそれらの組合せが挙げられる。
いくつかの場合、酵素またはポリメラーゼに結合されたオリゴにハイブリダイズするように使用されるオリゴは、たとえば、ＰＮＡまたは他の非荷電オリゴまたはロックドＤＮＡを使用した結果として、より長い長さまたはより密な結合を有し得る。酵素またはポリメラーゼに結合されたオリゴのハイブリダイゼーションは、トンネル標識と、トンネル標識のトンネル電流を増加させることを意図してＳＡＭの一部として結合されたオリゴとの間のハイブリダイゼーションよりも高い温度でアニールされ得る。
いくつかの場合、トンネルコンダクタンス標識は、四本鎖核酸ポリマーを含み得る。四本鎖核酸ポリマーは、１つ、２つ、３つ、または４つの核酸ポリマーから形成され得る。四本鎖核酸ポリマーは、二本鎖核酸ポリマーよりも高いことができるコンダクタンスを有する高コンダクタンス標識を形成するために、グアノシン塩基のフーグスティーン結合または天然に存在するエピジェネティック修飾ヌクレオチドまたは天然に存在しないヌクレオチドを用いて形成され得る。いくつかの場合、複数の四本鎖標識を利用し得る。四本鎖標識は、二本鎖標識または他のタイプの標識と組み合わせて使用され得る。四本鎖標識は、スティッキー末端を有するように構成され得る。スティッキー末端は、電極対の電極に結合されたＳＡＭへの標識の結合を可能にし得る。スティッキー末端は、結合挙動およびまたは速度論的挙動を試験するために、ヌクレオチドに結合されたリンカーを有するようにさらに構成され得る。
いくつかの場合、トンネル標識は、ヌクレオ塩基の５’リン酸鎖に結合し得る。標識は、ＰＥＧ、またはアルカンリンカー、または三リン酸が示された図１Ｋに示されるように標識とヌクレオ塩基との間のキメラ鎖であり得る他の好適な柔軟性鎖により結合し得るが、他の長さのリン酸鎖を利用しても以下に記載の他の鎖を利用し得る。いくつかの場合、標識は、３’位のヌクレオ塩基に結合し得る。標識は、光切断可能リンカーまたは化学切断可能リンカーであり得る切断可能リンカーにより結合し得る。切断可能リンカーは、標識を意図的に除去し得るまで、標識を酵素複合体に結合した状態を維持し得る。
いくつかの場合、標識は、ヌクレオ塩基に結合し得ると共に、ヌクレオ塩基に酵素が結合し得る。酵素は、ポリメラーゼを含み得る。酵素が結合しない他の標識および関連ヌクレオ塩基は除去され得る。標識は、ＳＡＭに結合し得る。ヌクレオ塩基を組み込み得ると共に、ヌクレオ塩基とその関連標識との間でリンカーを切断し得る。その際、ＳＡＭが依然として結合した状態で標識を測定し得ると共に、したがって切断後に標識を局在化して核酸鎖を標的とした測定が可能である。
所望の標識の合成が困難な可能性のあるいくつかの場合、特に所望のヌクレオチドへのリンカーの共有結合であり得る結合と組み合わせる場合、一体として合成するのではなく、標識をいくつかの部分で構築した後でアセンブルし得る。図１Ｉに示されるように、リンカー１２１を有し得る主コアオリゴ１２０は、コアオリゴ１２０の一部分に、かつスタック末端１２４Ａおよび１２４Ｂに相補的であり得る非結合オリゴ１２３Ａおよび１２２Ｂと組み合わせ得る。以前に遊離していたが、この時点でライゲートされるオリゴ１２２Ａおよび１２３Ｂは、この時点でコアオリゴ１２０へのライゲーションを用いて結合されて１つ以上の完全標識を形成し得る。この場合、所望のヌクレオチドは、ライゲーション前またはライゲーション後のいずれかでリンカー１２１の末端に結合されたものであり得る。
いくつかの場合、標識は、線形空間、対数空間、または指数関数空間に設定された比であり得る固定コンダクタンス比に設定され得る。いくつかの場合、バックグラウンドノイズレベルの関数として標識コンダクタンスの差を設定し得る。たとえば、コンダクタンスレベルの間隔は、コンダクタンス分布のオーバーラップが異なる標識間の所望のオーバーラップに相当し得るように、規定のコンダクタンスレベルで畳み込んだノイズレベルの関数として設定され得る。
いくつかの場合、ノイズレベルは、ポリメラーゼ複合体が結合しない拡散性ヌクレオチドの動態を含み得る。いくつかの場合、ノイズレベルは、ポリメラーゼ複合体が結合しないヌクレオチドのスティッキー末端と、電極対の電極に結合し得るＳＡＭのスタック末端との関連結合を含み得る。いくつかの場合、ノイズレベルは、スタック末端への高伝導性標識のスティッキー末端の拡散および関連結合に関連付けられるノイズにより支配され得る。これは、最も低い伝導性の標識のコンダクタンスがその次の伝導性の標識のコンダクタンスから有意にさらに分離されることを必要とし得る。いくつかの場合、標識の両方のスティッキー末端は、同一の配列を含み得るが、他の場合、標識２つのスティッキー末端は、異なる配列を含み得る。
いくつかの場合、リンカーとヌクレオ塩基とを含み得る分子では、分子の標識部分は、一方の側が正に荷電されかつ他方の側が負に荷電された双性イオン性化合物として選択され得る。いくつかの場合、分子の標識部分は、正味の負電荷、正味の正電荷、または正味の中性電荷を有し得る。いくつかの場合、標識部分は、正味の負電荷と正味の正電荷とをそれぞれ有する２つの末端を有し得る。正味の正に荷電された末端および正味の負に荷電された末端は、図１Ｊに示されるように異なる電極にそれぞれ引き寄せられ得る。図中、双性イオン性標識は、２つの電極間に示され、双性イオン性標識の異なって荷電された末端は、異なる電位を有する２つの異なる電極に引き寄せられ得る。いくつかの場合、標識は、正味の中性電荷を有し得る。たとえば、ＰＮＡ塩基を用いて、またはリン酸基が非荷電であるように結合リン酸基への修飾を行うことにより標識を形成し得る場合である。
いくつかの場合、標識部分は、電極ギャップまたは結合位置よりもわずかに長いサイズを有し得る。たとえば、分子の標識部分の対向末端に異なる正味電荷を有する双性イオンまたは類似の分子は、トンネルギャップを横切って延在し得ると共に、電界が印加されると２つの電極へのトンネル接続を行い得る。
他のタイプの標識の使用
いくつかの場合、たとえば、結合動態を検出するために蛍光標識を利用し得る。蛍光標識は、ゼロモード導波路ナノ細孔、ＴＩＲＦ検出器、またはナノ細孔により局在化されたフルオロフォアの検出を含み得るシステムを用いて検出され得る。フルオロフォアは、ナノ細孔構造のシス側のナノ細孔の入口前で検出され得る。いくつかの場合、フルオロフォアは、ナノ細孔構造のトランス側の出口直後で検出される。かかる場合、ポリメラーゼは、結合の結果としてヌクレオチドの一過性結合を観測し得るように、ゼロモード導波路またはナノ細孔に固定的に結合し得る。蛍光標識の異なる色または波長は、ヌクレオチドのセットの異なるヌクレオチドに関連付けられ得るため、トンネル標識およびまたはホッピング標識に関して以上に記載されるようにそれらの間の区別が可能である。
いくつかの場合、電荷ブロック標識を利用し得る。電荷ブロック標識は、酵素が結合している間、電荷ブロック標識の存在の結果としてナノ細孔を通る電流の差を低減し得るように利用され得る。酵素は、ポリメラーゼであり得る。ポリメラーゼは、固定的または一過的にナノ細孔に結合し得る。電荷標識の異なるサイズは、ヌクレオチドのセットの異なるヌクレオチドに関連付けられ得るため、トンネル標識およびまたはホッピング標識に関して以上に記載されるようにヌクレオチドタイプ間の区別が可能である。
いくつかの場合、電気化学標識を利用し得る。電気化学標識は、酸化および還元に適した電圧に維持し得る電極対の２つの異なる電極における酸化および還元の結果として結合ヌクレオチドが電流を生成し得るように利用され得る。いくつかの場合、２つ以上のタイプのヌクレオチドに対して同一の電気化学標識を利用し得る。拡散の差は、たとえば、異なるヌクレオチドの異なる拡散速度の結果として、異なるヌクレオチドタイプで異なる平均電流の生成をもたらし得る。異なる拡散速度は、同一の電気化学標識を異なる追加の部分に関連付けることにより生じ得る。異なる追加の部分は、電気化学的に不活性であり得る。異なる追加の部分は、ヌクレオチドに結合し得る電気化学標識の拡散を遅くし得る。
いくつかの場合、異なる電気化学標識を利用し得ると共に、電極対に関連付けられる電流を異なる時間で測定し得る。異なる電極対に関連付けられた電流を用いて異なる電気化学標識を区別し得るように、バルク溶液の電位を基準にして一方または両方の電極に異なる電位を利用し得る。
いくつかの場合、２つ以上の電極対を利用し得る。２つ以上の電極対は、２セット以上の電極対に標識ヌクレオチドがアクセス可能になり得るように酵素結合部位に関連付けられ得る。標識ヌクレオチド（たとえば、ヌクレオチドに関連付けられた標識）に酵素が結合し得る。異なる電極対に関連付けられた電流を用いて異なる電気化学標識を区別し得るように、異なる電極対は、バルク溶液を基準にして異なる電位の一方または両方の電極を有し得る。
いくつかの場合、異なる電極対に関連付けられた電流を用いて異なる電気化学標識を区別し得るように、異なる電極の複数のセットの組合せを使用し得る。同一の電気化学標識を有し得る異なるヌクレオチドは、タンパク質などの１つ以上の追加の部分をさらに含み得る。１つ以上の追加の部分は、同一であってもなくてよい。いくつかの場合、１つ以上の追加の部分は、同一の電気化学標識が異なる拡散速度と、したがって異なる電流とを有し得るように異なり得る。
いくつかの場合、単一標識分子は、リンカーを介して結合された１つのヌクレオ塩基を含み得る。いくつかの場合、１つ以上のリンカーを介して単一標識に結合された単一標識分子は、複数のヌクレオ塩基を含み得る。いくつかの場合、複数のヌクレオ塩基のすべては、同一タイプのヌクレオ塩基であり得る。いくつかの場合、複数の塩基の一部は、異なるタイプの塩基を含み得る。異なるタイプの塩基は、アデノシンまたはグアノシンなどの異なるタイプのヌクレオ塩基を含み得るか、または修飾ヌクレオ塩基、たとえばエピジェネティック修飾体もしくは骨格修飾体をはじめとする任意の他のタイプの修飾体であり得る。いくつかの場合、単一標識分子は、１つ以上のヌクレオ塩基と１つ以上の標識とを含み得る。この場合、標識は、同一であり得、またはおそらく異なる結合機構を有して潜在的に異なる結合動態もしくは異なるコンダクタンスを有して異なり得る。
複数の標識を結合一体化して１つ以上のヌクレオ塩基に関連付け得る場合、システムの電流測定能と対比して結合動態を遅くし得るように、かつ動態およびまたはコンダクタンスの結果として標識の少なくとも一部分（たとえば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはそれを超える）を同定し得るように、システムを構成し得る。標識は、異なるコンダクタンスおよびまたは異なる結合動態を有し得る。いくつかの場合、各標識に対して標識の一部または全部を同定し得る。いくつかの場合、標識に結合された部分は、標識の同定の結果として同定され得るため、より少数の個別の同定可能な標識を用いつつ、より多数の異なるタイプの標識部分を同定可能である。
いくつかの場合、スティッキー末端であり得る同一のまたは異なる結合部分を利用し得る。異なる塩基タイプの結合部分を利用し得る。異なる塩基タイプは、エピジェネティック修飾を含み得る。異なる結合部分は、異なる配列を含み得る。動態が平均コンダクタンスに影響を及ぼし得るように、異なる配列は、異なる動態を有し得る。いくつかの場合、ポリヌクレオチドを含むＳＡＭへの結合に関連付けられる配列の小さい変化は、コンダクタンスのごくわずかな変化をもたらし得るにすぎないが、平均結合時間に実質的な差をもたらし得るため、有意差のある平均電流をもたらす。
いくつかの場合、蛍光標識、電荷ブロック標識、または電気化学標識を異なるヌクレオチドタイプに結合、連結、または関連付け得る。いくつかの場合、蛍光標識、電荷ブロック標識、または電気化学標識を他の異なる部分に結合、連結、または関連付け得る。限定されるものではないが、部分の例としては、アミノ酸、オリゴヌクレオチドプローブ、アプタマー、抗体、もしくは任意の他のタイプの結合部分、またはそれらの組合せが挙げられる。いくつかの場合、異なる標的部分間の区別は、標識を結合し得る１つの部分と他の部分との間の相互作用を検出し得るように、かつ異なる標的部分を異なる標識の検出により検出し得るように、検出領域の一部における１つの部分の結合または局在化により達成され得る。
いくつかの場合、異なる部分は、近接ライゲーションアッセイに類似したアッセイを用いて検出され得る。アッセイでは、２つの異なる結合部分は、両方とも標的部分に結合し得る。局所濃度の増加は、異なる結合部分間の追加の相互作用を可能にし得ると共に、結合部分は、ライゲーション、ハイブリダイゼーション、または他の結合相互作用の結果として相互作用し得る。その際、ライゲーション、ハイブリダイゼーション、または他の結合相互作用は、２つの結合部分標識の局所近接の結果として、たとえば２つの異なるフルオロフォア間のＦＲＥＴとして、２つの電極間の電位差が単一電気化学部分のいずれにも不適切であり得るが、電気化学対には適切であり得る、電極対に関連付ける２つの電気化学部分の電気化学対合として、いずれの標識も短すぎて電極対の２つの電極間のギャップにまたがり得ないか、または一方の側のＳＡＭにのみ相補的であり得るが、２つの標識のハイブリダイズまたはライゲートされた組合せが、電極対の両方の電極上のＳＡＭへの同時ハイブリダイゼーションを可能にする役割をさらに果たし得る組合せ標識の長さの伸長の結果として検出を可能にし得る、２つのトンネルオリゴ標識およびまたはホッピングオリゴ標識の組合せとして検出を可能にし得る。
いくつかの場合、物理的ブロッカーは、物理的ブロッカーが外力、たとえば電界、電気浸透フロー、磁力、またはそれらの任意の組合せに応答して移動し得るように、負電荷または正電荷などの正味電荷を有し得るか、あるいは正味の中性電荷または最小限の正電荷もしくは負電荷を有し得るか、あるいは磁性コアもしくは常磁性コアまたは関連部分を有し得る。
いくつかの場合、物理的ブロッカーは、酵素、たとえば逆転写酵素または任意の他の所望のタイプの酵素に結合し得ると共に、適切なリンカー、たとえばアルカンリンカー、ＰＥＧリンカー、またはポリマー、キメラポリマー、もしくは他の部分と組み合わされたポリマーであり得る任意のタイプのリンカーを介して結合し得る。いくつかの場合、物理的ブロッカーは、たとえば、ライゲーションによる複合体化後の複合体化オリゴに結合または装着され得る。物理的ブロッカーの非複合体化部分は、装着または結合の前に複合体化部分の濃度よりも高い潜在的にかなり高い濃度で提供され得る。他の場合、物理的ブロッカーは、複合体化前または後に伸長され得る。
いくつかの場合、物理的ブロッカーは、環化されたサンプル核酸であり得る環状核酸を含み得るか、または合成もしくはコピーされた天然核酸であり得る。環化された核酸は、複合体化され得ると共に伸長され得るため、物理的ブロッカーとして作用し得る核酸ボールを形成し、またセンサーへのポリメラーゼまたは他の酵素の結合前または後のいずれかに伸長され得る。環状核酸を形成する物理的ブロッカーをセンサーへのポリメラーゼまたは他の酵素の結合または装着後に伸長させる場合、ポリメラーゼまたは他の酵素は、既存のポリメラーゼまたは他の酵素を結合し得る同一のセンサーでの他のポリメラーゼまたは他の酵素による結合を防止するのに十分な大きさに伸長環状核酸を拡大し得るように伸長を行える程度に、結合速度に対して十分に低い濃度で提供され得る。
いくつかの場合、環状核酸の伸長は、追加のポリメラーゼまたは他の酵素、環化核酸、取込み可能ヌクレオチド、および触媒２価カチオンの連続フローを提供することによりセンサーへの装着または結合前に大部分が防止され得る。この場合、ポリメラーゼまたは他の酵素、環化核酸、取込み可能ヌクレオチド、および触媒２価カチオンは、センサーへの導入前にすべてが複合体化および伸長に利用可能であるとは限らない。
いくつかの場合、物理的ブロッカーは、電極対の電極間のギャップの幅または間隔よりも大きいことができる。物理的ブロッカーは、電極対の電極の長さよりも長いことができる。いくつかの場合、物理的ブロッカーは、たとえば、酵素と結合表面との間のリンカーの長さ、酵素の寸法、および電極対を含む電極構造に関連付けられた酵素から結合表面までのいずれかのリンカーの長さをはじめとする因子を考慮した場合でも、物理的ブロッカーが他の酵素および物理的ブロッカー対の結合を立体的に妨害する結果として、２つ以上の酵素および物理的ブロッカー対が同一の電極対に結合し得ないように、幅または長さが電極対の電極の少なくとも約１１０％、１２５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％（またはそれを超える）であり得る。
電極のクリーニング
いくつかの場合、アミンＳＡＭまたはチオールＳＡＭの除去に記載したように、ＳＡＭの除去は、電界を用いて達成され得る。いくつかの場合、ＳＡＭを除去して電極に適用し得る。いくつかの場合、ＳＡＭを新しくするためにＳＡＭを除去して同一タイプのＳＡＭを同一の電極に適用し得る。いくつかの場合、ＳＡＭを除去して異なるタイプのＳＡＭを電極に適用し得る。
いくつかの場合、電極対の表面をクリーニングし得る。表面は、電気化学クリーニングプロセスを用いてクリーニングされ得る。電気化学クリーニングプロセスは、電極の表面に結合し得るいずれの汚染物質も除去するために、ＳＡＭの形成に関連する試薬の導入前に洗浄工程と組み合わせ得る。
いくつかの場合、電気化学クリーニングプロセスは、ＳＡＭの適用後に電極表面から汚染物質を除去するために使用され得る。プロセスは、電圧を利用し得る。電圧は、汚染物質の除去には十分であり得るが、ＳＡＭの除去には不十分であり得る。
いくつかの場合、センサーまたはセンサーのセットを少なくとも部分的にクリーニングするために、プラズマクリーニングを利用し得る。いくつかの場合、センサーまたはセンサーのセットをクリーニングするために高温酸化クリーニングを使用し得る。温度は、５００℃以上、６００℃以上、７００℃以上、８００℃以上、９００℃以上、１，０００℃以上、１，１００℃以上、１，２００℃以上、１，３００℃以上、１，４００℃以上、１，５００℃以上、１，６００℃以上、１，７００℃以上、１，８００℃以上、１，９００℃以上、２，０００℃以上、またはそれを超え得る。いくつかの場合、センサーまたはセンサーのセットをクリーニングするために、ピラニア、硫酸、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、または他の酸化性もしくは還元性クリーニング法を利用し得る。
いくつかの場合、センサーを用いた方法で利用され得る水性または主に水性の溶媒によりセンサー構造の濡れを可能にするために、主に水性の溶媒をセンサーに近接させる前に達成され得るか、または主に水性でないかつ後続的に主に水性の溶媒と交換され得る相溶性溶媒、接触角を低下させる混合物を用いて達成され得るクリーニング、エレクトロウェッティング、または以上のいずれかの組合せを利用し得る。たとえば、主に水性の溶媒が、ナノギャップを含み得るセンサー構造の完全濡れができない可能性がある場合、アルコールを利用して濡れを可能にし得る。いくつかの場合、金または他の貴金属のセンス電極およびバイアス電極を利用し得るナノギャップ構造の適正エレクトロウェッティングを行うために、対Ａｇ／ＡｇＣｌで−０．５Ｖ〜−０．７Ｖ、−０．７Ｖ〜−１．０Ｖ、または−１．０Ｖ未満であり得るエレクトロウェッティング電位を使用し得る。他の金属に関連付けられる均等な電位を使用し得る。
いくつかの場合、センサー構造の濡れおよびまたはクリーニングは、そのままではセンサー構造の濡れができない可能性のある水性溶媒に界面活性剤を添加することにより達成され得る。いくつかの場合、界面活性剤は、グリセロールエステルまたはｔｅｒ−ドデシルメルカプタンなどの非イオン性界面活性剤であり得る。他の場合、界面活性剤は、アルキルエステルスルフェートまたはドデシルベンゼンスホネートなどの陰イオン性界面活性剤であり得る。さらなる場合、界面活性剤は、ドデシルアミンまたはイミダゾールなどの陽イオン性界面活性剤であり得る。なおもさらなる場合、界面活性剤は、両性界面活性剤、シリコン界面活性剤、フッ素化界面活性剤、または高分子界面活性剤であり得る。
いくつかの場合、濡れおよびまたはクリーニングは、アルコールまたはエタノール性ＫＯＨ混合物を含み得るアルコールと水性試薬との混合物で達成され得る。たとえば、より高い有機含有率の試薬で交換または希釈を行った後にピニングまたはヒステリシスを生じるため、主に水性の溶媒による濡れを行い得るように、または主に水性試薬による濡れを行い得るように、センサー表面をクリーニングするためにアルコールまたはアルコールと水性試薬との混合物を利用し得る。いくつかの場合、主に水性の溶媒は、有機溶媒を含有しないものであり得る。いくつかの場合、主に水性の溶媒は、検出法の一部として利用される酵素の活性の阻害が約９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下となり得るように、十分に低いパーセント（たとえば、約２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下、０．０５％以下、０．０１％以下（ｗｔ％、ｖｏｌ％、またはｍｏｌ％）以下）の有機溶媒を含有し得る。
いくつかの場合、センサー構造の濡れは、センサーまたはチップ上のセンサーのすべてを含み得るセンサーのセットの１つ以上の電極に濡れポテンシャルを印加することにより、そのままではセンサー構造の全部または一部を濡らすことができない可能性のある溶媒を用いて達成され得る。いくつかの場合、バルク流体電位は、準参照電極、たとえば対向電極としても使用され得るＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極などを用いて達成され得る。いくつかの場合、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極であり得る参照電極に追加して、白金電極であり得る対向電極が使用され得る。
いくつかの場合、対向電極およびまたは参照電極もしくは準参照電極をチップに組み込み得る。チップ構造は、マイクロ、ナノ、またはマクロフルイディクスシステムを含み得る。フルイディクスシステムは、チップアセンブリーの一部として一体化され得る。フルイディクスシステムは、外部フルイディクスシステムの一部であり得る。フルイディクスシステムは、チップアセンブリーへの１つ以上の流体インターフェースの上流または下流であり得る。いくつかの場合、１つ以上の参照電極を利用し得る。水性または非水性の電極を含み得る参照電極を利用し得る。参照電極は、飽和カロメル参照電極、銅／硫酸銅ＩＩ電極または任意の他の適切な参照電極を含み得る。いくつかの場合、ステンレス鋼、ニッケル、金、または炭素をはじめとするさまざまなタイプの対向電極を利用し得る。
いくつかの場合、たとえば、参照電極に適した塩がセンサー電極の適正機能を妨害しないように、参照電極およびまたは対向電極をセンサー電極から分離するために塩橋を利用し得る。たとえば、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極の適正機能に必要とされる塩化物イオンは、センサー電極の一部であり得る金の除去をもたらし得る。かかる塩橋は、バルク流体移動の静圧または他の原因から生じる可能性のある流体移動を防止するためにポリマーを含んでもまたは含まなくてもよく、したがって、参照電極およびまたは対向電極間とセンサー電極対またはセンサー電極のセットとの経路を通る流体交換を可能にし得る。
いくつかの場合、濡れが起こったことを保証する方法を利用し得る。かかる方法は、レドックスサイクル部分、たとえばフェロセニウム／フェロセンもしくはフェロセン誘導体またはヘキサミンルテニウムを利用し得る。この場合、電気化学電流の変化を測定し得ると共に、観測された差は、特にポテンシャルおよびヒステリシスおよびピニングの関数として、電極およびまたはセンサー電極に関連付けられるナノギャップの濡れを表し得る。いくつかの場合、センサーの電極に関連付けられる二重層の容量測定を行い得ると共に、キャパシタンスの変化は、センサーの電極に関連付けられるキャパシタンスを決定するために利用され得るＡＣ波形として、および濡れポテンシャルまたはセンサー電極に関連付けられる電位を決定するために変化し得るＤＣ電位として測定され得る。
いくつかの場合、濡れポテンシャルは、参照電極を基準にしてセンサーの電極に印加され得る負電位により達成され得る。負電位は、センサー電極のセットの１つ以上の電極の電位を変化させることにより達成され得るか、またはセンサー電極のセットの１つ以上の電極を基準にして参照電極およびまたは対向電極の電位を変化させることにより達成され得るか、またはセンサー電極のセットの電位と参照電極およびまたは対向電極の電位との両方を互いに変化させ得る。いくつかの場合、濡れポテンシャルは、センサーの異なる部分で異なり得る。たとえば、１つの電極は、主に１つの結晶平面、たとえば１１１結晶平面で形成される一方、他の電極は、異なる結晶平面または結晶平面の混合物を有し得る。かかる場合、異なるエレクトロウェッティングポテンシャルが異なる結晶平面に存在するように、参照電極を基準にして異なる電極に異なる電圧を印加し得ると共に、それにより、異なる結晶平面に関連付けられる異なる濡れ角をオフセットし得る。
いくつかの場合、濡れポテンシャルと同様に、以上に記載される予想結晶平面にアライメントされ得る１つまたは複数の脱濡れポテンシャルを印加し得ると共に、これにより、電極または電極のセットに効果的に接触し得る流体のより急速な除去を可能にし得る。流体は、たとえば、１つ以上の電極に結合し得るＳＡＭに起因して１つ以上の電極との接触が少なくとも部分的にブロックされ得る。かかるＳＡＭに接触した状態の流体は、電極または電極のセットと効果的な接触状態にあるとみなされ得る。脱濡れポテンシャルはまた、１つの流体が他の流体と交換されるときに典型的に起こるように、交換時にセンサーまたはセンサーのセットが流体と効果的な接触状態でない可能性があるときに、センサーまたはセンサーのセットを流体の混合物に暴露することなく流体の交換を行えるようにし得る。たとえば、標識の１セットを標識の他のセットと交換し得るか、またはカルシウムなどのイオンの１セットをマグネシウムなどのイオンの他のセットと交換し得ると共に、湿度１００パーセントの環境から予想され得る水和のみを有してポリメラーゼなどの酵素に結合された伸長ＤＮＡ鎖を残存させ得る。いくつかの場合、正圧または負圧であり得る圧力を用いて、ナノギャップまたは他の電極構造を含み得る濡れ表面を助長し得る。いくつかの場合、正圧または負圧であり得る圧力は、他の濡れ助剤、たとえば界面活性剤、低表面エネルギー溶媒、または電位と共に使用され得る。
電極クリーニングおよび電極結合セルフアセンブル単層
いくつかの場合、セルフアセンブル単層（ＳＡＭ）は、チオール化ＤＮＡを含み得る。この場合、異なる電極上の単層は、ＤＮＡの同一の単層配列およびまたは配向であり得ると共に、３’末端または５’末端は、チオール基または他の結合基に結合し得る上に、さらに電極に結合し得る。いくつかの場合、異なる電極上の単層に対して異なる配列およびまたは配向を利用し得る。この場合、いくつかの電極上でチオール化が起こり、かつ他の電極上で起こらないように、しかも１つのタイプの単層化合物が電極の１セットへの結合に利用可能であるものとして、バルク流体電位およびまたは電極間バイアス電位を変化させた結果として、異なる電極を個別の基で官能基化し得る。バルク溶液およびまたはバイアス電極の電位は、電極の異なるセットのチオール化が起こり得るように変化させ得る。かかる変化は、すでに結合された単層を有する電極セットに新しいチオール基が結合しないようにして、または既存の単層による結合部位の完全占有に起因して追加のチオール化分子が実質的に結合しないようにして達成され得る。
いくつかの場合、改善されたトンネル路を提供するために他の結合機構を利用し得る。限定されるものではないが、結合機構の例は、タンパク質、抗体、アプタマー、他の有機ポリマー、またはそれらの組合せを含み得る。標識の結合部分と電極に関連付けられたＳＡＭとの間の結合は、電極間のトンネル電流またはトンネル電流およびホッピング電流を望ましく増加させ得る。
いくつかの場合、ＳＡＭは、電極表面に結合する単一チオールを利用し得る。いくつかの場合、カルボジチオラートリンカーなどのジチオールを利用してＳＡＭ化合物の少なくとも一部を形成し得る。他の場合、アミン、ジアミン、カルボキシレート、ホスフィン、アルキルシロキサン、トリクロロシラン、ペルフルオロアルキル、または任意の他の適切な結合基を利用して、電極にまたは電極間もしくはセンサーのセットに関連付けられる他の領域間の誘電体に結合させ得る。
いくつかの場合、ＳＡＭの装着法は、塩溶液を提供することを含み得るいくつかの工程を含み得る。塩溶液は、生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ、１Ｍ ＮａＣｌ＋１００ｍＭクエン酸ナトリウム）と、ＧＧＧＣＣＣＧＧＧの配列および塩基結合チオール基またはジチオール基であり得るチオール基を含み得る塩溶液中のハイブリダイズ核酸と、結合される残りの部分に相補的または十分に相補的であり得る他の核酸とを含み得る。本方法は、ピラニア溶液中で１５〜２０分間煮沸することにより金または他の貴金属を含み得る電極対セットを作製することと、１８Ｇオームのクリーン水を用いてピラニア溶液を除去することとをさらに含み得る。
その後、ハイブリダイズ核酸の溶液をある時間にわたり電極対セットに接触させることにより、チオール基またはジチオール基を利用してハイブリダイズ核酸を電極に結合させる。接触時間は、約１分間（ｍｉｎ）以上、１０ｍｉｎ以上、２０ｍｉｎ以上、３０ｍｉｎ以上、４０ｍｉｎ以上、５０ｍｉｎ以上、６０ｍｉｎ以上、１．５時間（ｈｒ）以上、２ｈｒ以上、３ｈｒ以上、４ｈｒ以上、５ｈｒ以上、６ｈｒ以上、７ｈｒ以上、８ｈｒ以上、９ｈｒ以上、１０ｈｒ以上、１２ｈｒ以上、１４ｈｒ以上、１６ｈｒ以上、１８ｈｒ以上、２０ｈｒ以上、２２ｈｒ以上、２４ｈｒ以上、２６ｈｒ以上、２８ｈｒ以上、２８ｈｒ以上、３０ｈｒ以上、３５ｈｒ以上、４０ｈｒ以上、４５ｈｒ以上、５０ｈｒ以上、またはそれを超え得る。いくつかの場合、接触時間は、約５日間以下、４日間以下、３日間以下、２日間以下、１日間以下、２０ｈｒ以下、１５ｈｒ以下、１０ｈｒ以下、８ｈｒ以下、６ｈｒ以下、４ｈｒ以下、２ｈｒ以下、１ｈｒ以下、４０ｍｉｎ以下、２０ｍｉｎ以下、１０ｍｉｎ以下、５ｍｉｎ以下、１ｍｉｎ以下、３０秒間（秒）以下、２０秒以下、１０秒以下、またはそれを下回り得る。いくつかの場合、接触時間は、本明細書に記載の任意の２つの値間、たとえば約１ｍｉｎ〜約１０ｍｉｎ、約１ｈｒ〜３ｈｒ、約３ｈｒ〜約１０ｈｒ、または約１０ｈｒ〜一晩であり得る。ハイブリダイズ核酸の溶液を除去し得ると共に、次いで、塩溶液を含み得るかまたは１８Ｇオームのクリーン水を含み得る洗浄液を用いて、いずれかの残りの未結合のハイブリダイズ核酸をさらに除去し得る。
いくつかの場合、バイアス電極およびセンス電極の酸化的または還元的クリーニングを利用し得る。このクリーニングは、０〜＋１．２Ｖ対Ａｇ／ＡｇＣｌで硫酸電位スイープを利用し得るか、またはＫＯＨの１０ｍＭ溶液を適用することと、０．０ボルト〜−１．３Ｖ対Ａｇ／ＡｇＣｌで電極のセットの電位をスイープすることと、電位およびその後ＫＯＨ溶液を除去することと、続いて脱イオン水で洗浄することとを含み得る電極のセットのクリーニング法を使用し得る。
核酸は、核酸の塩基と表面との間の望ましくないアミン結合を形成し得るため、メルカプトプロパノール、メルカプトエタノール、メルカプトヘキサノール、メチルメルカプタン、１−メルカプト１１−ウンデカノール、１−プロパンチオール、２−プロパンチオール、ブタンチオール、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン、ペンタンチオール、チオフェノール、ジメルカプトコハク酸、チオ酢酸、ジチオール、または貴金属に結合し得る他の硫黄基の溶液をバックフィルとして使用され得る。硫黄基は、塩基と電極表面との間のアミン結合を交換し得ると共に、電極表面に結合し得るいくつかのより大きい核酸をさらに交換し得る。
メルカプトプロパノールを含み得る硫黄基は、以上に記載の塩溶液と混合され得ると共に、試薬混合物は、硫黄基が結合し得るように電極に接触させ得る。結合は、約５ｈｒ以下、４ｈｒ以下、３ｈｒ以下、２ｈｒ以下、１ｈｒ以下、５０ｍｉｎ以下、４０ｍｉｎ以下、３０ｍｉｎ以下、２０ｍｉｎ以下、１０ｍｉｎ以下、９ｍｉｎ以下、８ｍｉｎ以下、７ｍｉｎ以下、６ｍｉｎ以下、５ｍｉｎ以下、４ｍｉｎ以下、３ｍｉｎ以下、２ｍｉｎ以下、１ｍｉｎ以下、またはそれを下回り得る。いくつかの場合、結合は、少なくとも約１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、５０ｍｉｎ、１ｈｒ、２ｈｒ、またはそれを超えて継続され得る。いくつかの場合、結合は、約１ｍｉｎ〜１０ｍｉｎ、約１０ｍｉｎ〜３０ｍｉｎ、約３０ｍｉｎ〜２ｈｒ、または２ｈｒ超継続され得る。いくつかの場合、センス電極またはバイアス電極であり得る電極へのＳＡＭの結合を加速するために電位を利用し得る。かかる電位は、金電極を用いた場合、すべて対Ａｇ／ＡｇＣｌで−０．５Ｖ〜−０．２Ｖ、−０．２Ｖ〜０．０Ｖ、０．０Ｖ〜０．２Ｖ、または０．２Ｖ〜０．５Ｖであり得る。いくつかの場合、適宜、両方ともＳＡＭ形成用の他の金属または参照に対して、および適宜、電位を記述し得る他のプロセスに対して電位を変更し得る。さらなる場合、ＳＡＭ結合部分の結合に最適な電位が、ＳＡＭの他の部分の静電引力に起因してＳＡＭの形成に十分に役立たないとき、電位スイープを利用し得る。そのため、いくつかの場合、結合に関してより最適な表面電位と、ＳＡＭ部分の他のパーツの表面引力に起因する立体障害を防止するのにより最適な電位との間で電位をスイープし得る。
その後、硫黄基含有試薬混合物を除去し得ると共に、電極を洗浄し得る。洗浄は、塩溶液およびまたは１８Ｇオームのクリーン水を用いて行い得る。
いくつかの場合、ＳＡＭ結合領域であり得る結合領域で異なるデンドリマーを利用し得る。いくつかの場合、単一デンドリマーは、たとえば、異なるＤＮＡ配列などの複数の結合部分を含み得る。いくつかの場合、異なる結合領域は、異なる結合部分を含み得る。いくつかの場合、単一結合領域で複数の結合部分を利用し得る。異なる結合部分のこれらの異なる局在化の結果として、領域を効果的にコードし得る。
いくつかの場合、酵素またはポリメラーゼの１つ以上の位置に結合するために、さまざまなリンカー、たとえば一方の末端がチオールで、かつ他方の末端が他の官能基で官能基化されたＰＥＧ、アルカン、または任意の他の適切なポリマーを使用し得る。いくつかの場合、酵素またはポリメラーゼを所定の位置に結合するために２つ以上のリンカーを使用し得る。
いくつかの場合、ヌクレオチドが正味の負電荷、正味の正電荷、または正味の中性電荷を有し得る標識ヌクレオチドを利用し得る。いくつかの場合、トンネル標識を通るトンネル電流を増加させるために利用されるＳＡＭおよびまたはトンネル標識は、さまざまなヌクレオ塩基上に負、正、中性、または任意の組合せの電荷を有するヌクレオ塩基を利用し得る。
いくつかの実施形態では、電極に関連付けられる構造は、特異的に適用されたＳＡＭを有し得る。最初に、両方の電極の金属に、さらにはバイアス電極とセンス電極との間にスペーサーを形成し得る誘電体などの関連誘電体表面に結合し得る官能基付きＳＡＭを添加することによりデバイスを処理し得ると共に、それによりナノギャップに底部を形成し得る。次いで、電極から官能基を除去するためにバルク溶液を基準にして電極のセットに電圧を印加し得ると共に、それにより官能基を関連誘電体表面上に残留させ得る。
いくつかの場合、アプタマーを用いてＳＡＭを形成することにより、タンパク質などの種々のタイプの分子の結合および検出を可能にし得る。さまざまなオリゴをＳＡＭに利用し得ると共に、タンパク質のさまざまな部分に結合させ得る。また、より多くの電流を生成し得るようにタンパク質の表面上に互いにごく近接して結合するように設計し得る。いくつかの場合、複数の異なるタイプのアプタマーを用いてＳＡＭを形成することにより、複数タイプのタンパク質の結合およびまたは単一タンパク質のより密な結合を可能にし得る。
いくつかの場合、ＳＡＭは抗体を含み得る。これにより、各種タンパク質を含む各種抗原だけでなく、さまざまな他のタイプの抗原の検出が可能になる。サンドイッチアッセイを形成し得るように、電極対の異なる電極上で異なる抗体を利用し得る。伝導路の一部として抗体を利用し得るため、標的抗原を含むようにし得る。いくつかの場合、抗体はまた、結合の最適化およびまたはコンダクタンスの最適化のいずれかのために、アプタマーと組み合わせ得る。ＳＡＭは、抗体を用いて形成され得るため、これにより各種抗原の検出が可能になり、また複数の抗体を用いて形成され得るため、これにより複数の抗原の検出または単一抗原のより特異的な結合が可能になる。
ＳＡＭは、異なるタイプの結合部分の混合物を含み得るため、１つ以上のタイプのハイブリダイズ核酸、１つ以上のタイプのアプタマー、１つ以上のタイプの抗体、および１つ以上のタイプの任意の他の適切な結合部分を含み得ると共に、異なるタイプの異なる結合部分間の任意の割合で形成され得る。
電極対は、１つの電極上にＳＡＭを有しているが、相接電極または対向電極上にＳＡＭを有していないように構成され得る。ＳＡＭは、さまざまなタイプの結合機構、たとえばチオール、アミン、および他の結合機構を利用して電極に結合し得る。さまざまな標的結合機構を利用し得る。たとえば、ＳＡＭは、アプタマーを含み得ると共に、対向／相接電極上のＳＡＭは、抗体を含み得る。
いくつかの場合、同一の標的結合分子で異なるタイプの結合機構の混合を利用し得る。たとえば、同一のアプタマータイプをアミンとチオールとで結合し得る。
いくつかの場合、同一の電極対を用いて複数の標的を標的とし得るように、単一電極上または相接／対向電極上のＳＡＭ内で複数の異なる標的化分子を利用し得る。たとえば、異なる結合分子を用いて、キャプチャー時に異なるコンダクタンスを有する異なるタンパク質を標的とし得るか、またはいずれの標的がキャプチャーされたかを異なるコンダクタンスにより決定し得る場合、ユニバーサル結合キャプチャー分子を用いてキャプチャーし得る。
いくつかの場合、ＳＡＭによる標的の結合およびまたは放出は、アミンＳＡＭまたはチオールＳＡＭの形成時に結合速度を向上させることに関して説明したように、電界を用いることにより、たとえば部分的に結晶平面の差に対応する異なる電位であり得、かつ結晶平面のゼロ電荷点および関連電位を電極間の所望のトンネル電位差にさらにマッチングさせ得る電極上の電位を変化させてハイブリダイズ結合を増加させることにより、およびまたは変性速度を増加させることにより支援され得る。
いくつかの場合、ＳＡＭは、ＳＡＭを構成する異なる部分間の異なる比を用いて形成され得る。いくつかの場合、ＳＡＭ結合比は、モル濃度比に一致し得ないが、異なる部分の異なるサイズおよび結合効率から生じ得る。いくつかの場合、ＳＡＭは、結合部分と非結合部分との混合物で形成され得るため、表面上のいくつかの結合部分は、動態および時間により駆動され得ないが、主に競合反応により駆動され得る。いくつかの場合、いくつかの異なるタイプの部分は、ＳＡＭを形成し得ると共に、主に競合により形成される異なる結合メンバー間の比で形成され得る。かかる部分は、スペーサー部分、標識結合部分、標的結合部分、酵素結合部分を含み得ると共にさまざまであり得、かつ１つ以上の表面上に異なる濃度においてまたは１つ以上の表面上に同一の濃度において配置され得る。
いくつかの場合、核酸または他のポリマーの鎖を装着するのではなく、核酸または他のポリマーは、局所的に合成され得る。合成は、異なる配列が異なるセンサーで生成され得るように望まれる個別の塩基の装着を制御するために電極対の電極に関連付けられる領域を使用し得る。これにより、たとえば、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲ反応、ハイブリダイゼーションアッセイ、またはいくつかの異なるタイプの部分、たとえば核酸ポリマーの異なる配列を検出することが望まれ得る他のタイプのアッセイからの異なる増幅産物を異なるセンサーにより検出できるようになる。
いくつかの場合、異なるプレ合成オリゴの結合を可能にするために、かつマルチプレックスリアルタイムＰＣＲ反応、ハイブリダイゼーションアッセイ、またはいくつかの異なるタイプの部分、たとえば核酸ポリマーの異なる配列を検出することが望まれ得る他のタイプのアッセイからの異なる増幅産物を異なるセンサーにより検出できるようにするために、電極対の電極に関連付けられる電界は、異なる時間で印加される電圧を有し得る。
いくつかの場合、ＳＡＭは、結合部分と非結合部分との混合物を用いて形成され得る。結合部分は、特定の配列を有する核酸ポリマーを含み得る。非結合部分は、電極表面上のいくつかの結合部分が動態および時間により駆動され得ないが、代わりに異なる部分間の競合により競合的に駆動され得るように、異なる配列を有する核酸ポリマー、異なるポリマー、たとえばＰＥＧポリマー、アルカンポリマー、もしくは結合部分に特異的に結合する部分に特異的にも非特異的にも結合し得ない他の適切なポリマーを含み得るか、または結合部分に特異的に結合する部分に特異的にも非特異的にも結合し得ないキメラポリマーを含み得るか、または結合部分に特異的に結合する部分に特異的にも非特異的にも結合し得ない非ポリマー部分を含み得る。
いくつかの場合、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、オスミウム、イリジウム、白金、金などの貴金属を含み得、および他の金属を含み得る電極と共に利用され得る非結合部分は、貴金属へのチオール装着を利用し得ると共に、メルカプトプロパノール、メルカプトエタノール、メルカプトヘキサノール、メチルメルカプタン、１−メルカプト１１−ウンデカノール、１−プロパンチオール、２−プロパンチオール、ブタンチオール、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン、ペンタンチオール、チオフェノール、ジメルカプトコハク酸、チオ酢酸、ジチオールの溶液などの部分または貴金属に結合し得る他の硫黄基を含み得る。かかる非結合部分は、アルカン、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、または他のポリマーをさらに含み得る。これらは、任意の所望の長さであり得ると共に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ユニット、または１０ユニット超の長さであり得る。
いくつかの場合、バックフィルを使用し得る。バックフィルは、以上に記載の非結合部分を含み得る。かかるプロセスの工程は、図１Ｌに示されるようにスタック末端を結合することと、続いて、図１Ｍに示されるようにスタック末端ＳＡＭが形成され得る後でバックフィルを結合することとを含み得る。さらなる場合、ＲＴＰＣＲ増幅プロセスに有用であり得る部分をハイブリダイズすることによりスタック末端の表面濃度を定量し得ると共に、次いで、図１Ｎに示されるように非ハイブリダイズＲＴＰＣＲ増幅可能部分を洗浄除去し、続いて、図１Ｏに示されるように増幅可能ＲＴＰＣＲ部分を変性およびキャプチャーし、続いて表面積およびハイブリダイゼーション効率に関して定量および規格化し得る。他の場合、バックフィルは、結合部分を含み得るＳＡＭと同時に形成され得る。いくつかの場合、ＳＡＭまたはＳＡＭを含む部分の少なくとも一部は、結合されたＳＡＭを有し得る表面が効果的により高いエネルギー表面を有し得るように、かつそれによりより容易に濡れ得るように親水性であり得る。
いくつかの場合、異なる結合メンバー間の比は、異なるスペーサー、標識結合部分、標的結合部分、酵素結合部分の使用の結果として結合優先度を含み得る競合により設定され得る。これらの部分は、異なり得ると共に、異なる表面濃度または同一の表面濃度を形成するように表面に関連付けられ得る。溶液の濃度は、同一であり得るまたは異なり得る。いくつかの場合、有効表面濃度は、異なる結合部分の異なるサイズまたは結合効率の結果として同一であり得るかまたは異なり得る。
いくつかの場合、同一の標的結合分子で異なるタイプの結合機構の混合を利用し得る。たとえば、同一タイプのアプタマーをアミンとチオールとで結合し得るか、または異なる結合法を用いて２つの異なるアプタマーを結合し得る。
いくつかの場合、同一の電極対を用いて複数の標的を標的とし得るように、単一電極上または相接／対向電極上のＳＡＭ内で複数の異なる標的化分子を利用し得る。たとえば、異なる結合分子を用いて、キャプチャー時に異なるコンダクタンスを有する異なるタンパク質を標的とし得るか、またはいずれの標的がキャプチャーされたかを異なるコンダクタンスにより決定し得る場合、ユニバーサル結合キャプチャー分子を用いてキャプチャーし得る。
いくつかの場合、電極は、単一分子または複合体をキャプチャーするように構成され得るか、または同一タイプの複数の標的をキャプチャーするように構成され得る。この場合、測定された電流レベルを利用して、キャプチャーされた分子の数を決定し得る。
いくつかの場合、電極のセットをクリーニングし得ると共に、電極のセット上にＳＡＭ層を形成し得る。電極のセットの少なくとも一部分を利用して各種測定を行い得ると共に、その後、クリーニングプロセスを利用してＳＡＭを除去し得る。同一の構成タイプまたは異なる構成タイプであり得る他のＳＡＭを適用して追加の測定を行い得る。かかるサイクルは、必要に応じて何回も繰り返され得る。サイクルは、チップセンサーのファウリングまたはエロージョンにより制限され得る。異なるサンプル間でクリーニングプロセスを利用し得る。これにより、前のサンプルが分解され得るか、除去され得るか、さもなければ後続の測定が特定の許容度で無影響であり得るかについて適切な確信が得られる。
いくつかの場合、ＳＡＭは、ハイブリダイゼーションオリゴを利用して形成され得る。ハイブリダイゼーションオリゴは、オリゴの３’末端または５’末端であり得るハイブリダイゼーションオリゴの一方の末端に結合されたアルカンまたはＰＥＧリンカーポリマーを用いて構成され得る。次いで、リンカーアルカン、ＰＥＧ、または他のより伝導性の鎖、たとえば以上に記載の他の伝導性ポリマーの末端にチオール基またはジチオール基を結合し得ると共に、その後、これを利用して電極表面に結合させ得る。アルカンまたはＰＥＧまたは他の伝導性リンカーポリマーの長さは、限定されず、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ユニット、または１０ユニット超の長さであり得る。いくつかの場合、リンカーポリマーの長さは、均一であり得る。いくつかの場合、異なる結合部分に対してまたは単一タイプの結合部分に対して異なる長さを使用し得る。さらなる実施形態では、バックフィルは、単一タイプまたは異なるタイプを含み得ると共に、単一の長さまたは異なる長さのリンカーを含み得る。いくつかの場合、結合部分に利用される長さは、非結合部分に利用される長さと同一であるかまたは主として同一であり得る。結合部分に利用される長さは、非結合部分に利用される長さよりも長いかまたは主として長いことができる。結合部分に利用される長さは、非結合部分に利用される長さより短いかまたは主として短いことができる。
いくつかの場合、ハイブリダイゼーションオリゴの３’末端に結合されたリンカーを利用し得るＳＡＭは、電極対の一方の電極に結合し得ると共に、ハイブリダイゼーションオリゴの５’末端に結合し得るリンカーは、電極対の他方の電極に結合し得る。いくつかの場合、電極対の一方の電極への１つのＳＡＭタイプの結合と電極対の第２の電極への第２のＳＡＭタイプの結合との差は、異なる電極に対して異なる時間で異なる電位を利用することにより達成され得る。
たとえば、第１のＳＡＭタイプを電極対の両方の電極に近接させた状態で１１１結晶平面金電極とＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極とを用いて、−０．４の電位を電極対の第１の電極に印加することにより、ＳＡＭを第１の電極に結合させ得ると共に、０．５Ｖを電極対の第２の電極に印加することにより、ＳＡＭを第２の電極に結合しないようにさせ得る。次いで、電極対の第１の電極の電位を０．５Ｖにすることにより、さらなる結合を防止し得ると共に、第２のタイプのＳＡＭを電極対の両方の電極に近接させ得る。その後、−０．４の電位を電極対の第２の電極に印加することにより、第２のＳＡＭを第２の電極に結合させ得ると共に、０．５Ｖを電極対の第１の電極に印加することにより、第２のＳＡＭを第１の電極に結合しないようにさせ得る。そのため、電極対の異なる電極に異なるＳＡＭが適用され得るため、ｓｓＤＮＡ一本鎖の両方の末端のハイブリダイゼーションが可能になり、このｓｓＤＮＡ一本鎖は、標識であり得ると共に部分的に二本鎖であり得る。
いくつかの場合、ＳＡＭは、外部で完全に合成され得るオリゴを用いて形成され得る。代替的または追加的に、高度にカスタマイズ可能な標的が望まれ得る場合、ＳＡＭは、電界を用いて少なくとも部分的に局所合成され得ると共に、たとえばＨｅｌｌｅｒらの米国特許第５，９２９，２０８号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されるように、異なる電極上で異なる時間でヌクレオ塩基を導入結合し得る。カスタム化は、センサーの異なるセットを利用して異なるタイプの試験を行うために利用され得るか、または標的化を用いて配列の異なる部分を局在化し結合するために利用され得る。この場合、標的化に利用し得るオリゴは、測定センサーに結合し得るか、または測定センサーに利用される電極とは別の追加の電極に結合し得る。この追加の電極は、標的化のみに利用され得るか、または他の目的にも使用され得る。カスタム化は、局所合成もしくは部分局所合成から、または特定のもしくはランダムな電極への外部合成オリゴの結合により行われ得る。
表面への酵素結合
いくつかの場合、センター誘電体領域は、チタンＴｉＯ２、ＳｉＯ２、ＧｅＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、または他の酸化物、炭化物もしくは窒化物を含み得る。いくつかの場合、リンカーまたは官能基をセンター誘電体領域、たとえばＳｉ３Ｎ４センター誘電体領域などに結合するためにアミドゲン基を利用し得る。アミドゲン基は、アルデヒド、エステル、ハロゲニド、エポキシド、イミン、イソシアネート、およびそれらの組合せの１つ以上を含み得る。アルカンホスホン酸およびＮａＮ３は、センター誘電体領域、特にＴｉＯ２誘電体構造上にアジド官能基を形成するために使用され得る。
いくつかの場合、アジド官能基は、デバイスへのポリメラーゼの結合前にポリメラーゼの本質的部分であり得るアミン基を利用して形成され得るか、またはポリメラーゼに結合される部分の一部であり得ると共に、リンカーを介して結合され得る。いくつかの場合、ポリメラーゼまたは他の酵素を誘電体に結合するために使用され得るリンカーの一部は、切断可能であり得る。他の場合、塩化物は、リンカーを官能基化するためにアジド基と交換され得ると共に、官能基化は、ランまたは方法の一部として機器内で達成され得る。
いくつかの場合、センター誘電体領域の結合または関連付けは、シラン化を含み得る。シラン化は、グルタルアルデヒドを用いた活性化と共にアミノプロピルトリエトキシシランを利用し得る。いくつかの場合、カルボン酸エステル基などのカルボン酸末端基は、酸化物または窒化物に結合するために利用され得る。いくつかの場合、アルキルまたはアルケニル官能基は、誘電体材料の水素末端表面に結合するために利用され得る。装着は、光活性化の使用により任意選択的に達成され得る。
いくつかの場合、酵素を修飾し得る。酵素は、機能性部が酵素またはポリメラーゼの元のサイズであり得ると共に全サイズが拡大され得るように修飾され得る。かかる修飾された酵素またはポリメラーゼは、トップ部分とセンシング部分との間が逆円錐または逆角錐の断面形状を有するセンサー内に配設され得る。標識を有するヌクレオチド塩基は、酵素またはポリメラーゼと相互作用するため、酵素またはポリメラーゼは、標的ＤＮＡまたはポリヌクレオチドの二本鎖部を１塩基伸長させ得る。センシング電極は、２つの電極間のギャップ内に結合されたまたは組み込まれたヌクレオチド塩基の標識の配置または効果的高局所濃度によって引き起こされるシグナルを生成し得る。
いくつかの場合、ポリメラーゼは、構造の側壁に関連付けられ得る（たとえば、結合され得る）。構造は、センサー構造の１つ以上の電極を含み得る。ポリメラーゼは、ハイブリダイゼーションまたはライゲーションを用いて構造に関連付けられ得る。ポリメラーゼは、ＳＡＭの一部であり得るオリゴにハイブリダイズまたはライゲートされ得る。オリゴは、たとえば、トンネル標識へのハイブリダイゼーションにより、より高いトンネル電流を促進するために利用され得る。いくつかの場合、ポリメラーゼは、より高いトンネル電流を促進するために使用され得ず、かつより高いトンネル電流を促進するために使用されるオリゴにより使用し得され配列と異なる配列を有し得るオリゴにハイブリダイズまたは結合され得る。
いくつかの場合、２つの電極は、標識結合モニタリングが望まれ得る酵素または他の部分に関連付けられる単一センサー用に対として使用され得る。いくつかの場合、２つ以上の電極対（たとえば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える電極対）は、標識結合が望まれ得る酵素または他の部分に関連付けて利用され得る。いくつかの場合、電極対の一部または全部は、その間に同一のまたは異なるギャップを有し得る。
いくつかの場合、システムは、単一センサーを含み得る。単一センサーは、単一酵素およびまたは標的アナライトをモニターまたは検出するように構成され得る。いくつかの場合、複数の酵素およびまたは標的アナライトは、単一センサーにより同時にまたは逐次的に検出またはモニターされ得る。いくつかの場合、システムは、複数のセンサー、たとえば約２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、またはそれを超えるセンサーを含み得る。各センサーは、１つ以上の酵素およびまたは標的アナライトをモニターまたは検出するように構成され得る。
いくつかの場合、本開示のシステムは、ブロッカー（たとえば、物理的ブロッカー）を含み得る。物理的ブロッカーは、ポアソン分布の代わりに関連付けられた単一の酵素または他の部分を有する電極対のより高いパーセント（たとえば、約３５％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、またはそれを超える）を達成するように構成され得る。限定されるものではないが、物理的ブロッカーの例としては、ナノビーズ、ナノロッド、タンパク質複合体、ＤＮＡ複合体、炭水化物ポリマーもしくは炭水化物複合体、ポリマー、脂肪細胞脂質小滴、非脂肪細胞脂質小滴、金ナノビーズ、セルロースナノビーズ、ポリスチレンナノビーズ、ラテックスナノビーズ、または任意の他の適切なサイズのナノ粒子、あるいは適切なサイズのナノ粒子を形成し得る部分の組合せが挙げられる。いくつかの場合、１つのみの物理的ブロッカーを電極対に関連付け得る。
いくつかの場合、物理的ブロッカーの少なくとも一部分は、キメラポリマーであり得、かつ物理的ブロッカーまたは物理的ブロッカーの有意部分を含むのに十分なサイズであり得るポリマーを含む。いくつかの場合、ポリマーは、第１の末端を官能基化し得ると共に、酵素は、官能基化された末端に結合し得る。
いくつかの場合、酵素と、電極対を構成し得る電極構造の表面とを結合するポリマーまたはキメラポリマーであり得るリンカーは、核酸ポリマーを含み得ると共に、核酸ポリマーは、二次構造が形成され得るような、かつ二次構造が、他に二次構造のないランダム配列が形成され得るときよりも大きくなり得る物理的ブロッカーを形成する役割を果たし得るような配列を含み得る。
いくつかの場合、酵素は、電極対を構成し得る電極構造の表面に１つのリンカーにより結合し得るか、または２つ以上のリンカーにより結合し得る。この際、酵素と物理的ブロッカーとの間に１対１の対応が存在し得る。
いくつかの場合、観測される部分は、ローディング化合物またはローディング試薬と一緒にデバイスにロードされ得る。次いで、ローディング化合物またはローディング試薬は、すでにロードされた部分と相互作用する部分を添加する前に除去され得る。いくつかの場合、ローディング化合物は、ポリヌクレオチドを含み得ると共に、プライマーに結合されたヌクレオチドをさらに含み得る。いくつかの場合、プライマーは、ローディング前に部分的に伸長され得る。いくつかの場合、ローディング化合物は、ヌクレオチドを提供することと、ポリメラーゼであり得る最初にロードされた部分で十分に伸長させてポリヌクレオチドであり得るローディング化合物を放出させることとにより除去され得る。その後、放出されたローディング化合物は、任意のヌクレオチドと共に、およびセンサー容積への導入前にプライムされ得るかまたはプライマーと共に導入され得る標的ポリヌクレオチドと共に除去され得、プライミングは、センサー容積内で行われる。その後、プライムされたポリヌクレオチドにポリメラーゼが結合し得ると共に、その後、本明細書に記載されるようにシーケンシングされ得る。いくつかの場合、ローディング化合物は、天然ＤＮＡを含み得る。他の場合、ローディング化合物は、ポリメラーゼに結合する非天然ＤＮＡを含み得る。
いくつかの場合、システムは、任意選択的に標的複合体を形成し得る。標的複合体は、ポリメラーゼによる核酸鎖の結合を可能にするために、ポリメラーゼまたは他の適切な酵素と、サンプル核酸鎖または試験核酸鎖またはローディング核酸鎖と、適切な非触媒または触媒の２価カチオンとを含み得る。標的複合体は、センサー電極対のアレイに導入され得ると共に、電極対の電極に結合され得る。いくつかの場合、標的複合体は、電極対の電極間のギャップの形成に使用される材料を含み得る誘電体に結合し得る。この材料は、窒化ケイ素、酸化ケイ素、酸化ゲルマニウム、または他の標準的半導体誘電体材料であり得る。
いくつかの場合、標的複合体に結合し得る部分は、他の残りの結合部位の除去を触媒し得ると共に、標的複合体の結合に使用された結合リガンドは、結合状態で残留し得る。たとえば、エキソヌクレアーゼ酵素またはニッキング酵素は、長いリンカー上の複合体の他の所望の部分に関連付けられ得る。エキソヌクレアーゼ酵素またはエンドヌクレアーゼ酵素は、他の複合体の結合を低減または防止し得るように分子（この例ではＤＮＡ）の一部分を切断し得る。たとえば、一本鎖核酸の末端からヌクレオ塩基を漸次切断し得る酵素、または一本鎖核酸鎖の末端以外の位置を切断するが、二本鎖核酸鎖を切断しない酵素は、標的複合体に結合された鎖を、実質的に相補的な核酸を含み得る結合部分にハイブリダイズさせることにより、したがって記載の酵素により分解されないと思われる二本鎖核酸を形成することにより、標的複合体に結合する鎖に関して効果的に不活性化され得る。
いくつかの場合、サンプル核酸鎖もしくは標的核酸鎖またはサンプル核酸鎖もしくは標的核酸鎖のセットは、少なくともポリメラーゼと２価カチオンとサンプル核酸または標的核酸とを含む複合体が複合体化により形成され得るように２価カチオンのセットと組み合わせてチップに導入され得る。２価カチオンは、触媒または非触媒であり得ると共に、サンプル核酸もしくは標的核酸の導入前、サンプル核酸もしくは標的核酸の導入後、サンプル核酸もしくは標的核酸と共に、またはそれらの任意の組合せで、２価カチオンがポリメラーゼの触媒活性部位に結合し得るようにポリメラーゼの流体環境に導入され得る。
いくつかの場合、サンプル核酸鎖または試験核酸鎖またはローディング核酸鎖は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素がサンプル核酸鎖または試験核酸鎖またはローディング核酸鎖を分解し得ないように相補的二本鎖末端を含み得る。サンプル核酸鎖または試験核酸鎖またはローディング核酸鎖は、鎖置換活性を有するポリメラーゼが結合し得る箇所にニック部位を有する完全二本鎖核酸鎖を利用することにより、エンドヌクレアーゼによる分解から保護され得る。
いくつかの場合、酵素は、サンプル核酸でも標的核酸でもなくてよい核酸を、酵素結合を用いて含み得る核酸ポリマーまたはキメラポリマーに結合し得る。いくつかの場合、核酸ポリマーは、ヘアピン構造を含み得るため、個別の核酸ポリマーまたは核酸を含むキメラポリマーへの個別の酵素のプライミング、したがって酵素結合が可能である。他の場合、プライムされた核酸構造を形成し得るように、かつたとえばポリメラーゼが酵素的に結合し得るように追加の核酸ポリマーを提供し得る。
いくつかの場合、各酵素が核酸ポリマーまたは核酸ポリマーを含むキメラに結合し得るように、酵素の数と比べて核酸ポリマーまたは核酸ポリマーを含むキメラのより多くのコピーを提供し得る。いくつかの場合、各核酸ポリマーまたは核酸ポリマーを含むキメラが酵素に結合することにより酵素結合を形成し得るように、酵素のより多くのコピーを提供し得る。その後、より低濃度で提供された部分に結合しないより低濃度で提供された部分と比べてより高濃度で提供された部分を、より低濃度で提供された部分から除去することにより、酵素結合を用いて結合された酵素と核酸ポリマーまたは核酸ポリマーを含むキメラとの複合体を提供するように分離工程を行い得る。
いくつかの場合、ポリマーの第２の末端は、磁性または常磁性のビーズまたは粒子に結合し得る。他の場合、第２の末端は、電極対を備えた電極構造の表面に第２の末端を結合し得るように官能基化され得る。
いくつかの場合、第２の末端は、磁性または常磁性のビーズまたは粒子に結合し得ると共に、第２のリンカーは、磁性のビーズもしくは粒子、酵素、または磁性もしくは常磁性のビーズもしくは粒子と酵素とを結合するリンカーの１つに結合し得る。一方の末端で第１のリンカーの特定のポリマーに結合し得る第２のリンカーは、電極対を構成し得る電極構造の表面に結合し得る。
いくつかの場合、他の酵素のポリメラーゼは、電極に結合され得るかもしくは関連付けられ得るか、またはＳＡＭを利用していることができる。この場合、電極または電極のセットに結合し得るＳＡＭは、部分の混合物を含み得ると共に、異なる核酸タイプの混合物を含み得る。その少なくとも１つのタイプは、スタック末端として利用され得ると共に、他のタイプは、ポリメラーゼまたは酵素に結合するために利用され得る。いくつかの場合、スタック末端を含み得る核酸とポリメラーゼまたは他の酵素に結合する部分を含み得る核酸との間で有効融解温度が異なることもある。この場合、スタック末端を含み得る核酸の融解温度は、ポリメラーゼまたは他の酵素に結合する部分を含み得る核酸の有効融解温度よりも低い温度であり得ると共に、塩濃度、温度、および溶媒を含み得る条件の所与の同一セットに対して、摂氏１度、摂氏２〜５度、摂氏５〜１０度、摂氏１０〜２０度、摂氏２０〜３０度だけ低いか、または摂氏３０度超であり得る。他の場合、酵素またはポリメラーゼに結合し得るＳＡＭは、電極対の電極を分離するスペーサーとして機能し得る誘電体であり得る誘電体に結合し得る。
いくつかの場合、スタック末端からのスティッキー末端の変性を可能にし得る操作温度は、ポリメラーゼまたは他の酵素をハイブリダイズ状態に維持し得るため、結合されたポリメラーゼまたは酵素を維持しながら標識タイプの交換または標識の除去を可能にし得る。
いくつかの場合、ポリメラーゼまたは酵素に結合し得る核酸に相補的であり得るＳＡＭの一部にハイブリダイズされ得ると共に、その後、ＳＡＭにライゲートされ得るポリメラーゼまたは酵素では、ポリメラーゼまたは酵素に結合された核酸がＳＡＭにライゲートされ得るように、またはポリメラーゼまたは酵素に結合し得る核酸が部分的に二本鎖および部分的に一本鎖であり得るように、ＳＡＭの一部を構成する核酸とポリメラーゼまたは酵素に結合された核酸とがライゲートにより一体化され得るように、ＳＡＭは、部分的に一本鎖および部分的に二本鎖であり得る核酸を含み得る。
核酸シーケンシングのためのトンネル標識の使用
いくつかの場合、ヌクレオチド塩基同定法は、２つの電極間のギャップの近傍に存在するポリメラーゼにより２つの電極間で二本鎖ポリヌクレオチドを合成することと、ヌクレオチド塩基が２つの電極間に取り込まれたときまたは結合されたときに電極間のトンネル電流の増加を検出することとを含み得る。プライムされた標的核酸鎖をポリメラーゼに提供し得る。この場合、一本鎖部分は、トンネル標識を有するヌクレオチドであり得る相補的ヌクレオチドの取込み（付加）のための鋳型を提供し得る。
いくつかの場合、酵素またはポリメラーゼは、標識部分に結合された標識と両方の電極との相互作用の結果として測定可能なトンネル電流が検出され得るように、酵素またはポリメラーゼが結合した標識部分が両方の電極に結合し得るかまたはそれと相互作用し得るときに、２つの電極間のギャップの近傍に存在するとみなされ得る。
トンネル標識を有する塩基の取込みまたは結合は、一方の電極から他方の電極に流れるトンネル電流の増加を引き起こし得る。標識部分の局在化を引き起こし得る多くの他の方法が可能であり、非排他的例としては、標識ヌクレオチドの標識のハイブリダイゼーション、標識プローブ、標識プローブのライゲーション、標識プローブの三本鎖形成結合、リボソームにより標識し得るアミノ酸の結合が挙げられる。
トンネル標識は、図２Ａに示されるように、取り込まれ得るかまたは結合され得る塩基に可逆的に装着された部分もしくはは単一分子、またはハイブリダイズされた単一分子の部分相補的核酸ポリマーであり得る。この図では、トンネル標識２００は、電極２０２Ａおよび２０２Ｂにそれぞれ結合されたスタック末端２０１Ａおよび２０１Ｂにスティッキー末端を結合した状態で示されている。
いくつかの場合、異なる標識は、異なるヌクレオチド塩基およびまたは異なるヌクレオチド塩基タイプに結合し得る。ヌクレオチドが２つの電極の近傍のポリメラーゼにより結合され得るかまたは取り込まれ得る場合、トンネル標識で予想されるトンネル電流に関連付けられるトンネル電流は、インテロゲートされる塩基に相補的であり得る塩基に関連付けられ得る特定のタイプのトンネル標識の局在化の結果として、異なるヌクレオチド塩基で測定され得る。したがって、異なるトンネル標識は、異なるヌクレオチド塩基の結合または取込みから生じるトンネル電流の便利な分離を提供するように工学操作され得る。
図２Ｂに示されるいくつかの場合、標識に結合されたヌクレオチドのセット２０５は、電極２０２Ａおよび２０２Ｂにより部分的に形成されたギャップ内で部分伸長ＤＮＡ鎖２０７と複合体化され得るポリメラーゼまたは他の酵素２０６の流体環境に進入し得る。ヌクレオチドおよび関連標識２０５にポリメラーゼまたは他の酵素２０６が結合し得ないこの時間中、電極２０２Ａおよび２０２Ｂ間に本質的にまったく電流が流れ得ない。その後、図２Ｃに示されるように、ヌクレオチドのセット２０５のうち、部分伸長ＤＮＡ鎖２０７のインテロゲート塩基に相補的なヌクレオチドおよび相補的な関連標識部分２１０に、電極２０２Ａおよび２０２Ｂにより部分的に形成されたギャップ内のポリメラーゼまたは他の酵素２０６が結合し得るため、電極２０２Ａおよび２０２Ｂ間を流れる電流が生成される。図２Ｄに示されるように、標識を有するヌクレオチドのセットの非結合ヌクレオチドを除去した後、ヌクレオチドの取込みが相補的ヌクレオチド２１１の標識から切断され得るように、かつ相補的標識２１１のこの時点で非結合の標識がポリメラーゼまたは他の酵素２０６の流体環境から洗浄除去され得るように、２価触媒は、ポリメラーゼ２０６の流体環境に進入し得る。
他の場合、同一の標識を２つ以上のタイプのヌクレオ塩基に結合し得る。ヌクレオ塩基は、平均電流の識別可能な差を形成するようにヌクレオ塩基の結合時間が異なる非修飾ヌクレオ塩基または修飾ヌクレオ塩基であり得る。
いくつかの場合、セルフアセンブル単層（ＳＡＭ）に結合され得る標識は、ヌクレオチド塩基に結合され得るかまたは関連付けられ得る。標識は、ヌクレオチドの３’側、ヌクレオチドの５’側、ヌクレオチドの塩基、またはそれらの任意の組合せに結合され得るかまたは関連付けられ得る。結合または関連付けは、酵素プロセスの結果として、化学切断もしくは光化学切断などの化学工程の結果として、または動態もしくは温度変化の結果として破壊または解離され得る。
いくつかの場合、対応して異なる標識を有し得る異なるタイプの塩基をシステム内、たとえば水性溶液中に導入し得る。特定のセンサーでは、複合体化ポリメラーゼを介して１塩基を一本鎖に取り込み得るかまたは結合し得る場合、異なるヌクレオチド塩基または修飾ヌクレオ塩基に対応する異なる標識に関連付けられる異なるトンネル電流を用いて、いずれの塩基または修飾塩基が結合または付加されたかを同定するためにトンネル電流を使用し得る。
いくつかの場合、塩基と標識との結合を測定した後、３’ターミネーター、２’ターミネーター、または任意の他のタイプのターミネーターであり得るターミネーターを有する塩基をシステムに導入し得ると共に、これにより追加のヌクレオチド塩基のさらなる取込みを防止し得る。これはいずれのフェーズエラー課題も防止し得る。これは、したがって、フェーズエラーを心配せずにロングリードの利用を可能にする。
標識を有する塩基は、取込みに必要とされる適切な触媒カチオンを用いない緩衝液の利用の結果として取込みを防止し得るか、または取込み不能なヌクレオチド、たとえば（限定されるものではないが）リン酸鎖に置換を有するヌクレオチド、たとえばαリン酸、βリン酸、または両方のリン酸をヒ素、Ｓｎ、Ｂｉ、またはＮと交換したもの、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、ロックドＤＮＡヌクレオチド、リボヌクレオチド、アデニン一リン酸、アデニン二リン酸、アデノシン、デオキシアデノシン、グアニン一リン酸、グアニン二リン酸グアノシン、デオキシグアノシン、チミン一リン酸、チミン二リン酸５−メチルウリジン、チミジン、シトシン一リン酸、シトシン二リン酸シチジン、デオキシシチジン、ウラシル一リン酸、ウラシル二リン酸、ウリジン、およびデオキシウリジンの利用の結果として防止し得る。一般に、取込み不能なヌクレオチドは、ポリメラーゼが結合し得るが、ポリメラーゼにより成長中のポリヌクレオチド鎖に取り込まれ得ない。
他の場合、ポリメラーゼ取込みを起こすのに適した触媒カチオンを有していない緩衝液を用いて塩基と標識との結合を測定した後、触媒カチオンを用いない緩衝液を取込み可能なヌクレオ塩基を有していないが、マグネシウムおよびまたはマンガンなどの適切な触媒カチオンを有している緩衝液と交換し得る。いくつかの場合、ヌクレオ塩基に結合するがそれを取り込まないように使用される、ヌクレオ塩基を含有する緩衝液を、最初に、取込み可能なヌクレオ塩基を有しておらず、かつヌクレオ塩基の取込みに有用な触媒カチオンを有していない緩衝液と交換し得ると共に、続いて、依然として結合状態にあり得るヌクレオ塩基の取込みを可能にする目的で、触媒カチオンを有する緩衝液を導入し得る。
いくつかの場合、ヌクレオ塩基の取込み後、取込み可能なトンネル標識ヌクレオチドを有する触媒カチオンの欠如した新しい緩衝液を、触媒カチオンを有する緩衝液と交換し得る。いくつかの場合、交換は、２工程で行われ得る。この場合、取込み可能なヌクレオ塩基を用いず、かつ触媒カチオンの欠如した新しい緩衝液を流動させて触媒カチオンを有する緩衝液を交換し得ると共に、続いて、触媒カチオンが欠如しているが、ただしトンネル標識を有する取込み可能なヌクレオ塩基を有する緩衝液を導入し得る。
いくつかの場合、ポリメラーゼが適正ヌクレオ塩基の結合後に適正（標的鎖上のヌクレオ塩基に相補的）ヌクレオ塩基を効果的に放出しないように、ヌクレオ塩基を強固に結合する緩衝液をポリメラーゼと共に利用しつつ、測定プロセスを行い得る。かかる緩衝液は、少なくとも部分的にカルシウムイオンを含み得るが、触媒金属結合部位を占有可能な他の非触媒カチオンを含み得ない。いくつかの場合、ヌクレオ塩基を強固に結合する緩衝液は、ヌクレオ塩基を結合し得ると共に、ヌクレオ塩基の結合後、条件が変化するまで放出しない。他の場合、緩衝液は、カルシウムと、ポリメラーゼ触媒結合部位を占有するがポリメラーゼによる相補的結合ヌクレオ塩基の放出を可能にする他の金属とを含み得る。かかる他の金属は、少なくとも部分的に亜鉛、バリウム、ストロンチウム、または他の２価金属カチオンを含み得る。修飾塩基は、取込み可能または取込み不能であり得る。修飾塩基は、トンネル標識（または蛍光標識などの他の標識）された天然に存在するエピジェネティック修飾塩基を含み得るか、またはトンネル標識（または蛍光標識などの他の標識）された天然に存在しないヌクレオ塩基を含み得る。そのため、いくつかの場合には５つ以上の標識タイプを使用し得る。
いくつかの場合、ヌクレオチド結合の動態およびインテロゲート塩基の相補性は、関連トンネルタグにより達成される電流の関数として測定され得ると共に、相補的ヌクレオ塩基の修飾の差またはその欠如は、結合動態の関数として測定され得る。いくつかの場合、より長いまたはより短い時間にわたり非エピジェネティック修飾塩基またはエピジェネティック修飾塩基に結合し得る修飾標識ヌクレオ塩基を利用し得る。いくつかの場合、ＤＮＡグアニンまたはＲＮＡグアニンであり得るグアニンの酸化の検出は、グアニン塩基が８−ヒドロキシグアニンに酸化されるときにアデニンへの相対結合効率の変化により検出され得る。酸化時、アデニンへの結合動態は、シトシンへの結合動態に類似したものとなる。
いくつかの場合、単一ヌクレオチドタイプを取込みシステムに一度に添加し得る。この場合、異なるヌクレオチド塩基に対応する異なる標識は、異なるトンネル電流特性を有する必要性はない。代わりに、取込みまたは結合が行われたかを確認する。予想トンネル電流が記録されれば、その相補的塩基のタイプを同定し得ると共に、このようにしてポリヌクレオチドをシーケンシングし得る。他の場合、単一標識取込み可能ヌクレオチドを他のヌクレオ塩基と組み合わせ得ると共に、他のヌクレオ塩基は、すでに上述したように取込み不能であり得る。いくつかの場合、単一ヌクレオチドタイプを取込みシステムに一度に添加し得る。この場合、異なるヌクレオチド塩基に対応する異なる標識は、異なるトンネル電流特性を有する必要性はない。
いくつかの場合、４つ以上の異なるタイプのヌクレオ塩基を提供し得る。この場合、三リン酸に結合されたトンネル標識化合物を有するヌクレオ塩基の少なくともサブセットを提供し得ると共に、ヌクレオ塩基は、非末端であり得る。そのため、ヌクレオ塩基の濃度を補充する必要がある場合を除いて、ヌクレオ塩基の付加、洗浄工程などを必要とすることなく反応を行い得る。ヌクレオ塩基は、マグネシウムおよびマンガンなどの触媒金属カチオンと共に提供され得る。さらに、ポリメラーゼ結合および取込みの動態が遅くなるようにして、結合および取込みの動態をより容易に観測および測定し得るように、カルシウム、亜鉛、本明細書に記載の他の２価カチオンなどの非触媒カチオンと共に提供し得る。
他の場合、多工程法を利用し得る。この場合、提供されるヌクレオ塩基は、ヌクレオ塩基のリボース部分に結合する代わりにヌクレオ塩基の塩基部分に可逆結合されたトンネル標識化合物を有し得る。いくつかの場合、本明細書に記載のターミネーターを提供し得る。これは、ヌクレオ塩基のリボースの３’側に結合し得る。
いくつかの場合、一塩基伸長反応が達成されるように、トンネル標識化合物と３’ターミネーターとを結合したものであり得るヌクレオ塩基のセットを提供し得る。いくつかの場合、伸長反応の一部として異なるトンネル標識化合物のいずれが結合され得るかを決定するために、残留ヌクレオ塩基を電極対センサーの読取り前に除去し得る。他の場合、残留ヌクレオ塩基の存在によるバックグラウンドが、いずれのトンネル標識化合物が必要に応じて伸長鎖に結合され得るかの決定に有意な妨害を与得ないのであれば、ヌクレオ塩基の除去前に測定を行い得る。
いくつかの場合、トンネル標識は、ターミネーターに結合し得る。いくつかの場合、トンネル標識は、リン酸鎖に結合し得る。いくつかの場合、標識は、ターミネーターでない切断可能リンカーを用いて塩基に結合し得る。
いくつかの場合、ターミネーターおよび標識は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩切断工程などの単一化学工程を用いて伸長鎖から同時に除去され得る。他の場合、トンネル標識化合物およびターミネーターの切断は、個別の反応の結果として行われ得る。いくつかの場合、ヌクレオ塩基のいくつかのセットを利用してポリメラーゼ複合体への結合を可能にし得る。ヌクレオ塩基セットは、非修飾塩基、修飾塩基、または修飾塩基と非修飾塩基との組合せを含み得る。
いくつかの場合、セットの一部として揺らぎ塩基対合を利用し得る。この場合、揺らぎ対合は、揺らぎ塩基対合の中でも特に、グアニン−ウラシル（Ｇ−Ｕ）、ヒポキサンチン−ウラシル（Ｉ−Ｕ）、ヒポキサンチン−アデニン（Ｉ−Ａ）、およびヒポキサンチン−シトシン（Ｉ−Ｃ）を含み得る。いくつかの場合、以上に記載のヌクレオ塩基の導入前に洗浄工程を行い得ると共に、したがってシーケンシングの追加のサイクルを開始し得る。いくつかの場合、ターミネーターは、３’−ＯＮＨ３基、３’−Ｏ−アリル基、３’−Ｏ−アジドメチル基を含み得るか、またはHelicosにより使用されるような蛍光標識ヌクレオ塩基を利用するVirtual Terminator（商標）に類似してターミネーターとトンネル標識化合物との組合せを含み得るか、またはLaserGenにより使用されるような蛍光標識ヌクレオ塩基を利用するLightning Terminator（商標）に類似したターミネーターとトンネル標識化合物との組合せを利用し得る。
いくつかの場合、リン酸鎖に結合されたトンネル標識を有するヌクレオ塩基を提供し得る。この場合、リン酸鎖は、三リン酸鎖から四リン酸鎖、五リン酸鎖、六リン酸鎖、七リン酸鎖、またはより長いリン酸鎖に及び得ると共に、アルカンまたはポリ（エチレングリコール）またはアルカン鎖のように柔軟性になるように構成され得るかもしくはアルキエン鎖のように比較的不撓性になるように構成され得る他の適切なリンカー鎖を含み得るリンカーをさらに含み得る。
いくつかの場合、すべての塩基で単一トンネル標識を使用し得る。次いで、ヌクレオ塩基を導入し得る。この場合、１つ以上の塩基を標識し得ると共に、他の塩基は標識され得ない。一部または全部の塩基は、取込み不能であり得る。触媒２価金属カチオンが提供され得ないため、取込みが防止される。その後、ヌクレオ塩基の異なるタイプを標識し得ると共に、他の塩基が非標識であり得るようにして、ブール論理を利用して次に続く標的塩基に相補的な塩基を決定し得るように、ヌクレオ塩基の異なるセットを順に提供し得る。塩基のセットは、ヌクレオ塩基結合に適した十分量の２価カチオンを含有し得ない試薬溶液を用いて洗浄除去され得る。試薬溶液は、サンプルＤＮＡとプライマーまたは伸長プライマーとのハイブリダイゼーションの保持に有用であり得るカチオンを含み得る。その後、ヌクレオ塩基の後続セットがポリメラーゼ複合体と相互作用し得るようにかつそれに結合し得るように、試験対象のヌクレオ塩基の後続セットを導入し得る。ヌクレオ塩基の後続セットは、後続ヌクレオ塩基が２価カチオンの不在下で結合し得るときよりも実質的に長く後続ヌクレオ塩基が結合し得るように、１つ以上の２価カチオンをさらに含み得る。
次いで、単一塩基が結合され得るようにまたは取り込まれ得るように、取込み可能な末端または非末端のヌクレオ塩基の１つ以上のセットを、それぞれ触媒金属カチオンを伴ってまたは伴わずに提供し得ると共に、残留ヌクレオ塩基を除去し、結合塩基が必要に応じて取り込まれ得るように触媒金属カチオンを提供する。
いくつかの場合、単一分子の検出を使用し得るため、クローン増幅を必要としないことがあり得、他の場合、シグナルレベルを増加させるためにクローン集団を使用し得ると共に、ポリメラーゼのセットを１つ以上の電極対の近傍にあり得る１つ以上の局在クローン集団に関連付け得る。
いくつかの場合、本開示の方法は、
ａ）標識ヌクレオチドと２価カルシウムとを導入してからヌクレオチドを結合させることと、
ｂ）２価カルシウム洗浄溶液を用いて未結合標識ヌクレオチドを除去することと、
ｃ）結合ヌクレオチドの標識を読み取ることにより、各センサーでいずれのヌクレオチドが結合されるかを決定することと、
ｄ）マグネシウムおよびまたはマンガンの導入により、結合ヌクレオチドを取り込むことと、
ｅ）カルシウム洗浄溶液を用いてマグネシウムおよびまたはマンガンを除去することと
を含み得る。
いくつかの場合、本開示の方法は、
ａ）カルシウムカチオンと任意選択的に他の非触媒２価カチオンとを含む混合物に、エピジェネティック修飾ヌクレオチドをはじめとする天然に存在するヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドであり得る１つ以上の標識ヌクレオチドタイプと任意選択的に１つ以上の非標識ヌクレオチドとを導入することと、
ｂ）カルシウムおよび任意選択的に少なくとも１つの他の非触媒２価カチオン中で標識を測定して、標識タイプおよび任意選択的に標識動態を決定することと、
ｃ）カルシウム、マグネシウム、およびマンガンを除く少なくとも２価カチオンを用いて標識を洗浄除去し、かつ任意選択的に、他のタイプのヌクレオチドを含み得る異なる標識ヌクレオチド組合せ物を用いて工程ａ）、ｂ）、およびｃ）を繰り返すことと、
ｄ）ヌクレオチドを結合するために、カノニカル塩基、またはエピジェネティック修飾塩基、または合成塩基であり得る、カルシウム緩衝液に組み込まれる任意選択的な非標識ヌクレオチドのセットを導入することと、
ｅ）カルシウム緩衝洗浄液を用いて未結合ヌクレオチドを洗浄除去することと、
ｆ）マグネシウムおよびまたはマンガン緩衝液を導入して結合ヌクレオチドを取り込むことと、
ｇ）マグネシウムおよびまたはマンガンを含有しないが、他の２価カチオンを含み得る緩衝液を用いてマグネシウムおよびまたはマンガン緩衝液を除去することと
を含み得る。
かかるプロセスは、図２Ｅにプロセスフロー図で示される。図中、工程１では、ポリメラーゼをヌクレオチドのセットに導入し得ると共に、工程２では、それを結合し得る。工程３では、ポリメラーゼは、コンフォメーション変化を起こし得ると共に、サムおよびパーム間にヌクレオチドを閉じ込めて確実に結合し得る。その後、ポリメラーゼは、他のコンフォメーション変化を起こし得ると共に、工程４では、それを開放して結合ヌクレオチドを放出し、工程２に戻る。これらの工程１−２−３−４−１は、工程５前に複数回にわたり繰り返され得る。この際、付随するヌクレオチド取込みと共にホスホリル転移が起こり得る。続いて、工程６では、酵素によるコンフォメーション変化でパームからサムが開放された後、ピロリン酸および関連標識が放出される。工程７では、ポリメラーゼがインテロゲートされる隣の塩基に移動すると共に、ポリメラーゼの流体環境からピロリン酸および標識を拡散移動する。
この状況は、図２Ｆにも図示される。図中、標識ヌクレオチドは、図２Ｅの状態１および３に対応する２つの状態（関連ポリメラーゼを有する左側構造および中間構造）で示される。中心状態では、標識ヌクレオチドにポリメラーゼが結合し、電極に結合されたスタック末端に標識が結合してから放出され得る時間にわたり保持される。これは、少なくとも部分的に、ヌクレオチドを固定的に結合し得るカチオンと、ヌクレオチドの放出を可能にし得るカチオンとの間のポリメラーゼ中でのイオン交換の結果として起こる。所望の時間後、緩衝混合液を交換することにより、単一ヌクレオチドにポリメラーゼが結合した状態にし得る。ポリメラーゼの流体環境中の他のヌクレオチドには結合しない。また、ポリメラーゼによる結合ヌクレオチドの取込みを可能にする少なくとも２価カチオンを含むように緩衝液を変化させ得る。こうすると右側構造に示される状態に達する。こうして、生成する電流は、図２Ｆの下側に示されるトレースにより描かれ得る。図中、短パルスの集合が存在する。この集合は、ヌクレオチドにポリメラーゼが結合し得る時間に対応し得る。集合中の短パルスは、ヌクレオチドにポリメラーゼが結合し得ると共にスタック末端にハイブリダイズし得る時間に対応し得る。
いくつかの場合、ハイブリダイゼーションから生じる電流パルスの集合は、ヌクレオチドが結合されている間のみ生じ得る。各集合は、幅、集合間の時間、および集合の平均電流の大きさが異なり得る。他の場合、ヌクレオチド結合と同様に、パルスの幅およびパルス間の時間は、有意に異なり得る。平均電流の大きさはまた、同一の標識または標識タイプでも、単一センサー内または異なるセンサー間のいずれかで変化し得る。いくつかの場合、異なる結晶平面、電極間隔の異なる幅、および二本鎖セクション間、たとえばハイブリダイズされたスタック末端およびスティッキー末端間、および標識の二本鎖中心部分間の付随する角度、ならびに得られる電流は、アクセス可能なスティッキー末端のセットのうちのいずれのスティッキー末端を特定のハイブリダイゼーションが利用するかに依存して異なり得る。さらなる場合、ストレイパルスは、他のストレイヌクレオチドに起因し得る。これは、単一ストレイパルスを与え得るか、またはそれほど多くはないがパルスの小セットを与え得る。これは、関連する電流分布と共に平均バックグラウンド電流をもたらし得る。かかるバックグラウンド電流は、特徴付け、規格化、および測定シグナルからの除去を行い得る。かかる規格化は、グローバルベース、個別のセンサーベース、または規格化の適切な中間レベルで行い得る。
いくつかの場合、いくつかの異なる標識ヌクレオチドを用いて、同時検出ならびに複合体の形成および再構成を利用し得る。異なるヌクレオチドは、異なる酵素結合動態、異なるハイブリダイズ結合動態、異なる標識コンダクタンス、またはそれらの組合せを有し得る。
他の場合、シグナルのレベルによる定量は、動態からもたらされ得る。ある時間にわたる平均電流は、標識のタイプを表し得るため、標識を結合し得る関連ヌクレオチドタイプ、ポリメラーゼとプライムされた核酸と標識を含むヌクレオチドとを含み得る複合体などに標識を結合し得る平均時間を表し得る。電流レベルは、１つ以上の異なるヌクレオチドおよび関連標識のＫｏｎおよびｋｏｆｆの結果として異なり得る。
いくつかの場合、ホスファターゼ活性を有する１つ以上の酵素が加水分解塩基の数を低減するように、したがって標識されないポリメラーゼ酵素が結合する正常標識塩基の数またはトランケートリン酸鎖に起因して取込み可能でない取込み可能であるはずの塩基の数を防止または低減するように、ホスファターゼ活性を有する１つ以上のタイプの酵素を反応混合物と共に含み得る。他の場合、予想平均電流は、平均シグナルを追跡して加水分解レベルの増加を補償することにより、加水分解塩基に起因するシグナルの欠如を補償し得る。補償は、加水分解塩基の数またはパーセントの予想される増加の曲線または式を用いて行われ得るか、または測定電流レベルから導かれ得る。
ＲＮＡシーケンシングのためのトンネル標識の使用
いくつかの場合、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをＲＮＡシーケンシング伸長実験に利用し得る。たとえば、ＲＮＡウイルスにより利用されるＲＮＡ依存性ポリメラーゼ、たとえばポリオウイルス３Ｄｐｏｌ、水疱性口内炎ウイルスＬ、およびＣ型肝炎ウイルス非構造ＮＳ５Ｂタンパク質、または真核生物ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを利用し得る。
サンプルＲＮＡ鎖がシーケンシングされ得るかまたは配列決定アッセイもしくは定量アッセイが行われ得るいくつかの場合、ユニバーサルプライマーまたはバーコードも含むプライマーを結合するためにＲＮＡリガーゼを使用し得る。たとえば、ｓｓＲＮＡプライマーもしくはバーコードを含み得るプライマーをサンプルｓｓＲＮＡ鎖に結合するのに有用であり得るＴ４ ＲＮＡリガーゼ１、またはヘアピンＲＮＡプライマーもしくはバーコードを含み得るかつプライマーがサンプルｓｓＲＮＡ鎖にライゲートされたＤＮＡをさらに含み得るようにキメラであり得るプライマーを結合するのに有用であり得るＴ４ ＲＮＡリガーゼ２である。
いくつかの場合、逆転写酵素を利用し得る。たとえば、ＨＩＶ逆転写酵素、たとえばＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２逆転写酵素、市販の逆転写酵素、たとえばAffinityscript（Agilent）（Arezi and Hogrefe 2009）、Maxima（ThermoScientific）、Rocketscript（商標）（Bioneer）、Thermoscript（商標）（Life Technologies）、およびMonsterscript（商標）（Illumina）、または（AccuScript; Stratagene）、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、またはグループＩＩイントロン逆転写酵素、たとえば、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）およびサーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongatus）に由来するもの、高精度逆転写酵素、たとえばRTX（逆転写酵素ゼノポリメラーゼ）またはPhi6 RNAポリメラーゼである。
いくつかの場合、シーケンシング工程時に逆転写酵素ストップを生じ得る。天然に存在する塩基であり得るかまたは以下に記載の結合から生じ得る逆転写酵素ストップを引き起こす塩基は、同定し得るかまたは結合部分の結果として塩基を同定できない逆転写酵素ストップ位置として単純に同定し得る。逆転写酵素ストップを有する同一位置の繰返しリードを生じ得る複数のシーケンシング工程を行い得る。その後、結合部分の除去または修飾塩基と塩基対合し得る塩基の提供の１つ以上による工程により、相補的塩基の取込みおよび伸長される相補鎖の後続のさらなる伸長を可能にする。
いくつかの場合、逆転写酵素ストップは、逆転写酵素により達成され得る。逆転写酵素ストップは、塩基修飾に起因してまたは逆転写酵素ストップを引き起こす塩基が結合部分に結合されることに起因して、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが相補的塩基を取り込むことができない不能性から生じ得る。
いくつかの場合、逆転写酵素ストップは、天然に存在する修飾塩基または酸化された塩基から生じ得る。後続のシーケンシング工程は、逆転写酵素ストップを引き起こした塩基と塩基対合し得る修飾塩基を利用し得る。
他の場合、逆転写酵素ストップは、１つ以上の修飾塩基と優先的に結合または相互作用する１つ以上の抗体、酵素、他の分子、またはそれらの組合せにより達成され得る。後続のシーケンシング工程は、塩基の取込みを可能にして相補鎖のさらなる伸長を可能にするために、逆転写酵素ストップを引き起こした修飾塩基と塩基対合し得る修飾塩基を利用し得る。いくつかの場合、抗体、酵素、または他の分子は、処理工程により除去され得るため、相補鎖のさらなる伸長を可能にする。
いくつかの場合、スキップリード法であり得るシーケンシング方法を利用し得る。この際、逆転写酵素ストップの結果として、スキップ時間にわたる追加のプライマー伸長を停止させ得る。後続工程では、逆転写酵素ストップを引き起こした修飾塩基を同定し得ると共に、続いて、逆転写酵素ストップの位置および原因修飾塩基を同定するのに十分なシーケンシング工程を行い得る。
いくつかの場合、特に、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ポリメラーゼが置換活性を有し得ないかまたは弱い鎖置換活性を有し得るとき、二次構造を介する読取りを支援するために、あるいは相補鎖、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、または標的ＤＮＡ鎖もしくは標的ＲＮＡ鎖に結合し得る他の部分を置き換えるために、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素と組み合わせてＲＮＡまたはＤＮＡヘリカーゼを使用し得る。
いくつかの場合、ＤＮＡまたはＲＮＡヘリカーゼは、共同作用の可能性を改善して二次構造をより良好に除去するために、リンカーを介して、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合し得る。いくつかの場合、ＤＮＡまたはＲＮＡヘリカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと無関係に提供され得る。いくつかの場合、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに関連するＤＮＡまたはＲＮＡヘリカーゼに加えて、一本鎖結合タンパク質などの追加のポリメラーゼヘルパータンパク質を添加し得る。いくつかの場合、ポリメラーゼの代わりにリボソームを利用し得る。この場合、標識ｔＲＮＡのセットは、コドンをデコードしてｍＲＮＡのコドンマップを与えるために、または翻訳の直接モニタリングを提供するために使用され得る。いくつかの場合、リボソームは、標識アミノ酸と共に利用され得る。これにより、翻訳の直接モニタリングが可能になる。
他のシーケンシング方法のためのトンネル標識の使用
いくつかの場合、トンネル検出システムおよびまたはホッピング検出システムは、第２の鎖を形成するために、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素の使用を含み得る方法を使用し得る。この場合、ヘアピンプライマーは、ポリメラーゼと標識とを用いて繰り返し読み取られ得る環状鎖を形成するためにＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかをライゲート可能なＲＮＡ依存性リガーゼ、およびまたはＤＮＡ依存性リガーゼ、およびまたは工学操作リガーゼを用いて、ＲＮＡ鎖の一方または両方の末端にライゲートされ得る。
いくつかの場合、修飾リボザイム、たとえばリボザイム２４−３または他の修飾リボザイムを含み得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしてリボザイムを利用し得る。いくつかの場合、ヌクレオ塩基を利用し得る取込み反応を触媒するために、Ｍｇ以外は、他のカチオン、たとえばマンガンまたは他の２価カチオンを使用し得る。ヌクレオ塩基は、リボース糖を含み得るかまたは本明細書に記載の任意の他の種類の骨格を含み得る、カノニカルヌクレオ塩基、エピジェネティック修飾ヌクレオ塩基、または合成ヌクレオ塩基を含み得る。いくつかの場合、カノニカルヌクレオ塩基、エピジェネティック修飾ヌクレオ塩基、または合成ヌクレオ塩基を含み得、かつリボース糖を含み得るかまたは本明細書に記載の任意の他の種類の骨格を有し得るヌクレオチドを保持するために、Ｃａ以外の非触媒カチオンを使用し得る。
他の場合、ユニバーサルプライマーまたはバーコードを含み得るプライマーをライゲートするために、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼを使用し得る。プライマーは、一本鎖プライマー、二本鎖プライマー、またはヘアピンプライマーであり得る。いくつかの場合、アッセイは、たとえば、同一サンプルからのＲＮＡおよびＤＮＡの両方のシーケンシングを可能にするために、たとえば同一サンプル中にＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含み得る単一サンプルに対してＲＮＡリガーゼおよびＤＮＡリガーゼの両方を利用し得る。ＲＮＡリガーゼおよびＤＮＡリガーゼは、さまざまな反応容積でサンプルのさまざまなアリコートと共に利用され得る。さまざまな反応容積は、チップ内のさまざまな領域、さまざまなチップ、または個別のフルイディクスデバイスに存在し得る。ＲＮＡリガーゼおよびＤＮＡリガーゼは、チップの領域、異なるチップ、または個別のフルイディクスデバイスに存在し得る１つまたは複数の通常の反応容積内の単一サンプルに対して利用され得る。
ロングリード
いくつかの実施形態では、他に不明確なシーケンスアセンブリーを形成する可能性のある反復配列領域をシーケンシングするときに、その間に分離を有するロングリードまたは複数のリードを利用することが望まれ得る。いくつかの場合、センサーのアレイは、１つまたは複数のチップの異なる部分で異なる速度で進行するスキップリード法のスキップ時間を可能にし得る。速度の差は、取込み可能なヌクレオチドの利用可能な濃度の差、取込み不能なヌクレオチドの濃度の差、温度、ポリメラーゼのタイプもしくは変異体、または取込みの動態に影響を及ぼす任意の他の方法から生じ得る。
ロングリードが望まれる場合、アッセイは、ある時間にわたりマグネシウムおよびまたはマンガンなどの触媒カチオンを提供しつつ、１つ以上の異なるタイプのヌクレオチドを提供し得る。データは、収集してもしなくてもよい。配列は、決定してもしなくてもよいか、または部分的に決定してもよい。ある時間にわたり、取込み速度は、他の方法で可能であり得るよりもかなり高くなり得るため、非触媒時間、触媒時間、および洗浄時間のサイクルが交替で利用され得る。
いくつかの場合、非標識ヌクレオチドまたは標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドとの混合物は、急速にプライマーを伸長し得る時間にわたり利用され得るが、高品質シーケンスデータを提供することもしないこともあり得る。いくつかの場合、代替的または追加的に、標識ヌクレオチドおよびまたは非標識ヌクレオチドは、ターミネート塩基と組み合わせて利用され得る。このターミネート塩基は、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止し得る。いくつかの場合、単一タイプのターミネート塩基と共に４つすべてのノンターミネート塩基タイプ（ＡＧＣＴ）を提供し得る。いくつかの場合、１つ以上のターミネート塩基タイプと共に約３つ以下のノンターミネート塩基タイプを提供し得る。ターミネート塩基タイプは、非末端塩基のセットに提供されない１つ以上の塩基タイプを含み得る。ターミネート塩基タイプは、非末端塩基のセットに提供される１つ以上の塩基タイプを含み得る。ターミネート塩基タイプは、非ターミネート塩基のセットに提供され得る塩基と、非ターミネート塩基のセットに提供されない塩基との組合せを含み得る。他の場合、ノンターミネート塩基およびまたはターミネート塩基の異なるセットを使用し得る。異なる塩基タイプは、塩基の異なるセットのターミネートまたは非ターミネートであり得る。
ターミネート塩基は、除去されたターミネーターを有し得ると共に、それから、塩基の同一セットまたは塩基の異なるセットが提供され得るか、または非触媒サイクル、触媒サイクル、および洗浄サイクルが利用され得る記載のサイクルのセットが提供され得る。ターミネート塩基は、リボース３’もしくは２’ターミネーターを含み得るか、または仮想ターミネーターもしくはLightning Terminators（商標）を含み得る。
いくつかの場合、非触媒２価カチオンは、カルシウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、ロジウム、もしくはストロンチウム、またはこれらの元素の混合物を含み得る。触媒カチオンは、２価カチオンとｄｓＤＮＡとの関連付けを可能にする濃度で提供され得る。ｄｓＤＮＡは、標識、伸長プライマー、またはフローセルに存在し得るｄｓＤＮＡの他の供給源を含み得ると共に、さらには、ポリメラーゼおよびまたは他の酵素に結合するための追加の触媒２価カチオンを提供する。
いくつかの場合、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡヌクレオチドと共に利用され得る。他の場合、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰもしくはＲＤＰ）またはＲＮＡレプリカーゼ、たとえばｐｈｉ６ ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡヌクレオチドと共に利用され得る。いくつかの場合、プライマーを提供し得る。ＲｄＲＰを利用する場合、プライマーを提供しないでもよく、ポリメラーゼは、セルフプライムされ得る。いくつかの場合、動態を用いたＲＮＡ二次構造の検出を行い得る。
いくつかの場合、核酸ポリマーまたは核酸ポリマーを含むキメラは、酵素ブロック部分として機能し得ると共に、電極対を構成し得る電極構造への酵素の結合後に除去され得る。酵素ブロック部分は、たとえば、鎖置換活性を有し得ないポリメラーゼにより、プライマーの伸長をブロックし得る。かかる酵素ブロック部分は、たとえば、標準的ホスホジエステル結合を利用しないように、およびポリメラーゼのエキソ活性により切断され得ない他の結合、たとえばスルホジエステル結合、チオジエステル結合、もしくはアルセノジエステル結合、またはホスホチオエート結合を利用し得るように合成され得ると共に、ポリメラーゼまたは他の酵素のエキソヌクレアーゼ活性により切断される可能性のある最初の塩基を含み得る、核酸ポリマー中の１つ以上の位置でエキソヌクレアーゼにより容易に分解され得ない結合を有し得るかまたは部分を含み得る。
いくつかの場合、温度、２価カチオン濃度、およびｐＨを含み得る条件を提供することにより、核酸ポリマーまたはキメラの除去を達成し得ると共に、こうして、酵素ブロッカーとして使用される核酸ポリマーまたは核酸ポリマーを含み得るキメラの酵素からの除去を促進し、後続複合体によるアクセスを防止する酵素ブロッカーとして機能し得る他のポリマーと組み合わせ得る。これにより、サンプル核酸の後続導入と、サンプル核酸のシーケンシングまたは配列同定とを可能にする。
いくつかの場合、電極構造への酵素ブロッカー酵素複合体の結合後、ヌクレオチドを提供し得ると共に、鎖置換能を有し得る酵素が、核酸ポリマーまたは核酸ポリマーを含み得るキメラを伸長させることにより、第２の鎖を置き換えて、核酸ポリマーまたは核酸ポリマーを含み得るキメラを放出し得るように、核酸ポリマーまたは核酸を含み得るキメラは、ニック部位にまたがる第２の鎖を有してニック部位を有し得る。
いくつかの場合、電極構造への酵素ブロッカー酵素複合体の結合後、温度および他の条件、たとえば塩濃度を変化させることにより、酵素の機能を維持しつつ第２の鎖を変性し得るように、核酸ポリマーまたは核酸を含み得るキメラは、ニック部位にまたがる第２の鎖を有してニック部位を有し得る。いくつかの場合、次いで、ヌクレオチドを提供し得ると共に、鎖置換能を有し得ない酵素は、核酸ポリマーまたは核酸ポリマーを含み得るキメラを伸長させることにより、核酸ポリマーまたは核酸ポリマーを含み得るキメラを放出し得る。
いくつかの場合、酵素ブロッカーまたはリンカーは、核酸ポリマーを含み得る。また、特定の位置で核酸ポリマーを切断して表面などから酵素ブロッカーまたはリンカーを放出させるために、ニッキング酵素を使用し得る。いくつかの場合、酵素ブロッカーまたはリンカーは、アミノ酸ポリマーを含み得る。また、特定の位置（または部位）でアミノ酸ポリマーを切断して表面などから酵素ブロッカーまたはリンカーを放出させるために、部位特異的エンドプロテイナーゼを使用し得る。いくつかの場合、酵素ブロッカーまたはリンカーは、生化学切断の代わりに化学切断を用いて選択的に切断し得る部分を含み得る。
いくつかの場合、有効カバレッジを増加させるために、ニッキングプロセスを繰り返すことにより、すでに伸長されたサンプル鎖の再読取りを可能にし得る。他の場合、ニックの形成を可能にするために、ニック部位に加えてまたはその代わりに化学切断可能な結合を利用し得る。
いくつかの場合、ホスファターゼ活性を有し得る１つ以上の部分を標識ヌクレオチドのセットと組み合わせて提供し得る。かかる部分としては、ホスファターゼ、たとえばシュリンプアルカリホスファターゼ、ヌクレオチダーゼ、ならびに各種の他の公知の酵素、さらには化学切断剤が挙げられ得る。ホスファターゼ活性を有するかかる部分は、非標識であり得るようにかつ潜在的に取り込まれ得るように加水分解された標識ヌクレオチドタイプの結合および潜在的取込みを防止し得る。
さらなる場合、特にインテロゲート塩基のタイプを決定するためにいくつかの異なるヌクレオチド結合速度を測定し得る方法（インテロゲート塩基のメチル化状態などの決定を含み得る）で、標識ヌクレオチドに対する非標識ヌクレオチドのパーセント変化を補償するために、既知塩基の測定およびまたはヒストグラムの測定を利用して、非標識ヌクレオチドのパーセントレベルの変化から生じ得る平均シグナルレベルの変化の補償ならびにまたは他の目的で動態およびもしくは測定のシグナルレベルに影響を及ぼし得る温度制御エラー、塩濃度、他の因子などの補償を行い得る。さらなる場合、すでに測定された、したがって推定されたシグナルレベル変化を利用して、ラン時間にわたるシグナルレベル変化を補償し得る。
いくつかの場合、ＲＮＡまたはＤＮＡのエピジェネティクスを決定し得る。他の場合、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方のエピジェネティクスを単一システムの一部により決定し得る。ＲＮＡおよびＤＮＡのエピジェネティクスは、異なるチップの異なる容積内、単一チップの異なる容積内、または１つ以上のチップの共通容積内で決定され得る。
いくつかの場合、ＲＮＡまたはＤＮＡのエピジェネティクスは、サイズ、粗さ、特異的結合部位（同定、分離、および分離のために抗体またはアプタマーが結合し得る）などの一貫性のある特徴を有してフローサイトメトリーなどにより単離された単一細胞または細胞のセットで決定され得る。
いくつかの場合、無制御であり得る一連の取込みイベントを所望の位置で停止させるためにまたはそのイベントの長さを限定するために、鎖置換または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性などのポリメラーゼ作用により除去できないプローブなどを用いて、ポリメラーゼ取込みを停止させ得る。かかるプローブは、標的化プローブであり得るかまたはランダムプローブであり得る。プローブは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を阻害し得るように硫黄基を含み得るか、または鎖置換活性によるプローブの置換えをできないようにするために非荷電ロックドＤＮＡを利用し得る。その後、ヌクレオ塩基およびまたは触媒２価カチオンを除去するために洗浄手順を利用し得る。たとえば、プローブの除去を可能にするために温度を上昇させ得、およびまたは塩濃度を低減し得る。次いで、本明細書に記載のシーケンシング方法を開始または再開し得る。
いくつかの場合、以上に記載の任意選択的に繰り返される工程ａ）およびｂ）において以上に記載のヌクレオチドの異なるセットの結合およびまた動態を観測するために使用される塩濃度およびまたは積算時間は、ヌクレオチドの異なるセットで同一であり得る。他の場合、塩濃度およびまたは積算時間は、たとえば、エピジェネティック修飾検出に関連付けられる所望の信頼レベルに達するために、必要に応じてヌクレオチドの異なるセットで異なり得る。
いくつかの場合、トンネリングおよびまたはホッピングの検出は、特定のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素を使用してプライマーを伸長させることによりＲＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖、またはｃＤＮＡ鎖であり得る第２の鎖を形成する場合、特定塩基または相接塩基のいずれかの組込みを考慮して、最も少ない取込みエラーを提供するように決定するとき、カノニカル塩基または他の塩基（天然に存在するエピジェネティック塩基もしくは合成塩基であり得る）のみを使用し得る方法を利用し得る。いくつかの場合、より少ない結合または立体障害をもたらし得るＮ１−アデノシン、Ｍ３−メチルシトシン、Ｎ１−メチルグアノシン、他の修飾塩基などのエピジェネティック修飾の結果としての逆転写酵素などの重合酵素のストーリングを防止するために追加の修飾塩基を利用し得る。
いくつかの場合、ｔＲＮＡのエピジェネティック修飾を利用し得るが、他の場合、異なるエピジェネティック修飾を有するｔＲＮＡを利用し得る。同様に、未修飾アミノ酸を利用し得るが、他の場合、エピジェネティック修飾アミノ酸を利用し得る。
いくつかの場合、修飾塩基特異的結合部分を利用し得る。修飾塩基特異的結合部分は、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＴＨＤＦ３、ＹＴＨＤＣ１などのｍ６Ａ結合タンパク質を含み得る。修飾塩基特異的結合部分は、塩基およびまたはそのエピジェネティック修飾体の決定の一部としてヌクレオチドの１つ以上のセットと組み合わされて利用され得る。修飾塩基特異的結合部分は、トンネル標識を含み得る。修飾塩基特異的結合部分は、非標識であり得るが、結合の動態およびまたは標識ヌクレオチドなどの他の標識部分の結合イベント間の時間に影響を及ぼし得る。他の場合、逆転写酵素ストップを防止するために修飾塩基または合成塩基を使用し得ると共に、それにより、ｃＤＮＡ産生の打切りを限定または排除するか、または完全もしくはより完全なＲＮＡ鎖の読取りを可能にし得る。
いくつかの場合、抗体を使用し得る。抗体は、ｍ６Ａヌクレオチドなどの特定のヌクレオ塩基に強くまたは弱く結合し得る。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドであり得ると共に、動態および電流は、ポリメラーゼ複合体によりインテロゲートされるサンプルポリヌクレオチド鎖を構成するサンプルヌクレオチドへの標識された相補的ヌクレオチドの結合に関連付けられ、サンプルヌクレオチドは、より良好に区別し得る異なるエピジェネティック修飾を有し得る。
いくつかの場合、インテロゲートされる塩基のアイデンティティーを決定するために、カノニカルＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドに加えて、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ３−メチルアデノシン、Ｎ７−メチルグアノシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、プソイドウリジン、チオウリジン、イソグアノシン、イソシトシン、ジヒドロウリジン、キューオシン、ワイオシン、イノシン、トリアゾール、ジアミノプリン、β−Ｄ−グルコピラノシルオキシメチルウラシル、８−オキソグアノシン、または２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、もしくは２’−Ｏ−メチルウリジンをはじめとする修飾塩基、および他の天然に存在しないヌクレオチドを利用し得る。この場合、同定される塩基のアイデンティティーは、任意のカノニカルＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドであり得るか、あるいは５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ３−メチルアデノシン、Ｎ７−メチルグアノシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、プソイドウリジン、チオウリジン、イソグアノシン、イソシトシン、ジヒドロウリジン、キューオシン、ワイオシン、イノシン、トリアゾール、ジアミノプリン、β−Ｄ−グルコピラノシルオキシメチルウラシル、８−オキソグアノシン、または２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、もしくは２’−Ｏ−メチルウリジンであり得る。
他の用途でのトンネル標識の使用
いくつかの場合、以上に記載のトンネル標識化合物およびトンネル電極対は、ＤＮＡシーケンシング以外の用途に利用され得る。いくつかの場合、多くの異なる標的に相補的なＳＡＭを形成する多くの異なる核酸鎖は、標的核酸の導入前に電極対の異なるセットに結合し得ると共に、トンネル電流の測定は、標的核酸のハイブリダイゼーションの結果として達成され得る。いくつかの場合、ＳＡＭを形成する核酸鎖は、ジップコードまたはバーコードを含み得るため、ＳＡＭを形成する多くの異なる核酸鎖タイプの標準セットを用いて、多くの異なるタイプの標的分子の検出が可能である。いくつかの場合、ＳＡＭを形成する多くの異なる核酸鎖タイプは、工場プロセスの一部として異なる電極セットに結合してからＳＡＭを形成する多くの異なる核酸鎖の完全セットとして輸送され得る。他の場合、ＳＡＭを形成する多くの異なる核酸鎖タイプは、現場で機器により行われる方法の一部として形成され得る。
いくつかの場合、ＳＡＭの少なくとも一部を形成し得る核酸鎖は、塩基修飾を含み得る。塩基修飾は、ヌクレオ塩基のαリン酸のチオール化であり得るため、前記核酸鎖は、増幅プロセスの一部として伸長し得ないが、代わりに標的またはアンプリコンにのみハイブリダイズ可能であり得る。いくつかの場合、核酸鎖は、伸長可能であってもなくてもよい。核酸鎖が伸長可能である場合、増幅プロセス時に二本鎖核酸を形成し得る。
いくつかの場合、平滑末端ライゲーションを行った結果としてユニバーサルプライマーが使用可能になり得る。ライゲーションは、機器で行われ得る。機器は、以上に記載のチップを備えたシステムを形成し得る。ライゲーションは、チップ内、たとえばシーケンシングに使用される電極対を収容する容積とは別の容積内で行われ得る。ライゲーションは、手動で行われ得るか、または本明細書の以上に記載のチップを備えたシステムを形成し得る装置とは別の他の装置で行われ得る。
他の場合、プライマーは、図４に関して以下に示され説明されるように、ハイブリダイゼーション、次いでライゲーションを用いてライゲートされ得る。ハイブリダイゼーションは、所望の領域に相補的なプローブを利用する特異的なものであり得る。いくつかの場合、ハイブリダイゼーションは、標的核酸の末端にオーバーラップし得るセクションに対してイノシンなどのユニバーサル塩基を用いて達成され得る。
いくつかの場合、ＳＡＭを用いてトンネル検出電極対を機能化し得る。ＳＡＭは、少なくとも部分的に核酸鎖を含み得る。ＳＡＭは、電極対の両方の電極で同一の核酸鎖を利用し得るため、ＳＡＭの作製プロセスをより容易にし得る。いくつかの場合、トンネル標識化合物は、たとえば、化合物を使用した分子デバイスのときによくあることであるが、非対称原子構成に起因して、異なる方向に電位を印加したときに異なるトンネル電流を生成し得る。
いくつかの場合、トンネル電流電極対は、定量ＰＣＲまたはデジタルＰＣＲの検出システムの一部として使用され得る。トンネル電流電極対は、ＳＡＭを含み得る。ＳＡＭは、核酸配列（たとえば、核酸鎖）を含み得る。核酸鎖は、溶液中に提供されたテール付きプローブに少なくとも部分相補的であり得る。テール付きプローブは、ＰＣＲ反応または等温反応（たとえば、鎖置換増幅（ＳＤＡ）またはループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ））などの増幅反応で消費され得る。電極対の１つの電極上のＳＡＭは、プローブのテールに少なくとも部分相補的であり得る。電極対の他の電極は、プローブの一部分に少なくとも部分相補的であり得る。プローブの一部分は、標的またはアンプリコン鎖に結合し得る。プローブの一部分は、鎖伸長時にポリメラーゼによる鎖伸長の一部として効果的に消費され得るため、電極対の両方の電極へのプローブの結合が防止される。増幅反応時のトンネル電流の低減は、プローブの消費の指標測定であり得るため、したがって前記増幅反応前に存在する特異的標的核酸の存在およびまたは量の指標測定であり得る。
いくつかの場合、ＳＡＭは、プライマーに少なくとも部分相補的である核酸鎖を含み得る。プライマーは、標的核酸またはその相補体に相補的であり得る。核酸鎖は、プライマーのテールに少なくとも部分相補的であり得ると共に、このテールは、標的核酸またはその相補体に相補的でなくてよい。増幅反応の開始時、プライマーは、電極対の一方の電極または他方の電極に結合し得るが、電極対をブリッジし得ないため、トンネル路を提供し得ない。増幅反応が進行した場合、アンプリコン産物は、電極対の両方の電極に少なくとも部分相補的であり得るため、電流増加を提供し得るトンネル経路を提供し得る。電流のかかる増加は、増幅反応からのアンプリコンの量の増加の存在の指標となり得る。
いくつかの場合、異なる電極対を使用し得る。異なる電極対は、ＳＡＭの異なるセットを有し得る。ＳＡＭは、異なる核酸標的に直接対応し得る。いくつかの場合、異なる電極対は、プライマーのテールに対応するＳＡＭの異なるセットを有し得ることから、これらを用いれば、プライマーテールの同一セットを有する異なるプライマーセットを利用するときのように、単一タイプのＳＡＭを多くの異なるタイプのアッセイに使用できるようになる。
いくつかの場合、リアルタイムＰＣＲ用の検出器としてまたは等温増幅（たとえば、ＳＤＡ）としてシステムを使用し得る。セルフアセンブル単層（ＳＡＭ）は、電極対の電極の表面上に配設され得る。電極対の電極上のＳＡＭは、同一のまたは異なるオリゴを含み得る。次いで、たとえば、増幅反応の結果として生成された相補的伸長増幅産物を検出するにより、少なくとも１つの電極上に配設されたＳＡＭにマッチするプライマーを増幅産物の検出に使用し得る。いくつかの場合、電極対の少なくとも１つの電極上のＳＡＭ層のオリゴに相補的であり得るプライマーを使用し得る。
いくつかの場合、非伸長プライマーは、電極間の幅または間隔にまたがるのに十分な程度に長くなり得ないが、伸長プライマー増幅産物は、電極間の幅または間隔にまたがるのに十分な程度に長くなり得る。いくつかの場合、１つの電極上のＳＡＭの少なくとも一部を構成するオリゴは、プライマー対の１つのプライマーに同一または実質的に同一であり得るが、対向電極ＳＡＭの少なくとも一部を構成するオリゴは、プライマー対の第２のプライマーと少なくとも実質的に同一であり得るため、両方の電極のＳＡＭに関連付けられたオリゴは、電極対への直接ハイブリダイゼーションが可能になる。いくつかの場合、プライマーは、標的核酸ポリマーに相補的でなくてよいテールを含み得る。ＳＡＭは、プライマーテールと同一の配列を利用し得る。この場合、プライマーテールは、両方のプライマーで同一であり得るか、またはＳＡＭはプライマー対の２つのプライマーに関連付けられた異なる配列を含み得る。プライマーテールは、標的配列または少なくともその一部分と相補的であり得るかまたはそれらと同一であり得る。
いくつかの場合、増幅産物鎖（または伸長鎖）は、２つの電極の１つに結合し得る。伸長鎖は、２つの電極に関連付けられたオリゴの１つのセットのみに相補的であり得るが、伸長鎖に相補的な核酸鎖は、電極対の第２の電極に関連付けられたオリゴに結合し得る。２つの鎖は、電極対の電極間のギャップを横切る部分的に一本鎖および部分的に二本鎖のＤＮＡとして伝導性を示す。２つの鎖は、表面結合オリゴと、電極対の第２の電極に関連付けられたオリゴに同様に結合し得る相補鎖との両方にハイブリダイズされ得る。
他の場合、伸長プライマーは、両方の電極上の異なるオリゴに結合し得ると共に、完全に二本鎖または部分的に一本鎖および部分的に二本鎖のいずれかとして伝導性を示す。いくつかの場合、標識は、ギャップの作製に関連付けられる任意の許容差を考慮した上で標識が十分な長さであり得ることを保証するために、ギャップ（たとえば、ナノギャップ）の幅または間隔よりもわずかに長いものであり得る。特定のセンサーのギャップまたはナノギャップは、公称の幅またはサイズよりも幅広くまたは長いことができると共に、標識が一方の側への第１の結合後に対向電極のより大きい領域に結合する可能性を有し得ることを保証するために、標識は、ギャップの公称の幅または間隔よりも長くする必要があり得る。標識が一方の電極に結合され、かつ標識の長さがギャップの幅と同一であった場合、標識が対向側に結合するために、結合部位は、標識が結合し得る結合部位に対向して完全にアライメントされる必要があるであろう。そのため、二本鎖ＤＮＡで起こり得るように比較的剛性の標識であり得る標識が、対向電極上のトーラス断面の形状をとり得る結合部分に結合し得るように、かつトーラス断面の内側リングおよび外側リングの直径の差が、少なくとも標識の柔軟性と結合部分の角度柔軟性との組合せから生じ得るように、標識をより長くし得る。
標識は、一方の電極への結合後に標識が対向電極の領域に結合可能になり得るように設計され得る。領域は、約１ｎｍ以上、２ｎｍ以上、３ｎｍ以上、４ｎｍ以上、５ｎｍ以上、６ｎｍ以上、７ｎｍ以上、８ｎｍ以上、９ｎｍ以上、１０ｎｍ以上の内径を有し得る。領域は、内径よりも少なくとも約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ以上大きいことができる外径を有し得る。かかる範囲内で結合可能であり得る標識は、ギャップ間隔よりもわずかに大きいとみなされ得る。
標識は、ギャップの幅または間隔よりも長いことができる。ギャップの幅は、金属表面間の距離であるとみなされ得る。ギャップの有効幅は、リンカーに結合するように構成され得る結合部分間の距離であるとみなされ得る。リンカーは、電極の金属表面に対する典型的な角度を有し得る。金属表面に対するリンカーの角度は、少なくとも結合機構のタイプ、ＳＡＭ密度、リンカータイプ、結合部分およびまたはリンカーの電荷の関数であり得る。長いリンカーをスタック末端ＳＡＭに利用する場合、または結合部分が、一本鎖および二本鎖の両方であり得るスタック末端を含み、かつ一本鎖および二本鎖の両方であり得るスタック末端の二本鎖部分をリンカーにより近くし得、したがって金属電極により近くし得る場合、ギャップ間隔または有効ギャップ間隔は、金属表面間の幅または間隔よりも狭くし得る。
いくつかの場合、単一タイプのオリゴ配列は、電極対の両方の電極に利用され得ると共に、一方のサンプル鎖にハイブリダイズされ得るが、サンプル鎖に相補的な鎖にハイブリダイズされ得ないため、一方の末端でのみ結合し得るトンネルおよびホッピングコンダクタンス用の部分的に一本鎖および部分的に二本鎖の核酸ポリマーを提供する。
いくつかの場合、統計的に信頼性のあるＣｔ値を提供し得ない少数の増幅産物に関連付けられる高いコンダクタンスの結果として電極対に関連付けられる検出電子部品を飽和させることがないように、コンダクタンスを最小限に抑えることが望まれ得る。そのため、たとえば、表面と、ＳＡＭの一部を構成するかつ増幅産物にハイブリダイズするように使用し得るオリゴとの間でより長いリンカーを利用することにより、個別の増幅産物のコンダクタンスを最小限に抑えることが望まれ得る。
いくつかの場合、電極は、単一分子または複合体をキャプチャーするように構成され得る。電極は、同一タイプの複数の標的をキャプチャーするように構成され得る。測定された電流レベルを利用して、キャプチャーされた分子の数を決定し得る。
単一の標的核酸ポリマーを標的とし得る場合、複数の酵素を単一の電極対または複数の電極対に結合または関連付け得る。シーケンシングプロセスまたは配列検出プロセスは、標的の配列を決定することを意図され得ないが、代わりに標的核酸ポリマーのコピー数の検出または定量に利用され得る。このプロセスは、増幅反応後、増幅反応の一部としてまたは増幅反応なしで行われ得る。
いくつかの場合、トンネル標識を用いてリボザイムに関連付けられる酵素活性を検出し得る。この場合、ｔＲＮＡ分子またはアミノ酸は、トンネル標識をさらに含み得る。また、タンパク質へのアミノ酸の結合および取込みの動態およびまたは配列をモニターし得る。
いくつかの場合、複数の電極対を利用して、以上に記載のように異なる関連相補体を有する異なる電極対により、異なる単一ヌクレオチド多型を標的とし得る。同一の標識または標的領域内のＳＮＰの相対数の指標となる異なるコンダクタンスレベルを有する異なる標識を用いて、異なるコンダクタンスを検出し得る。
いくつかの場合、トンネル検出器またはトンネルおよびホッピング検出器を利用して異なる電極上の異なるＳＡＭによりｍｉＲＮＡを直接検出し得る。それぞれの異なるＳＡＭは、異なる約半分のｍｉＲＮＡまたは他の極低分子ＲＮＡに相補的であり得る。競合ハイブリダイゼーション反応は、電極対に関連付けられたギャップを横切って効果的に伝導性を示し得ないｍｉＲＮＡまたは他の極低分子ＲＮＡと、ギャップにまたがり得るかつ電極対の両方の電極に関連付けられたＳＡＭにハイブリダイズ可能であり得る競合オリゴとの間の競合から生じ得る。
いくつかの場合、ｍｉＲＮＡまたは他の極低分子ＲＮＡの検出は、電極対の電極に関連付けられたＳＡＭのオリゴに相補的であり得るブリッジオリゴに相補的なオリゴを含むＳＡＭを有する電極対に関連付けられたギャップを形成することにより達成され得る。ブリッジオリゴは、標的ｍｉＲＮＡまたは他の極低分子ＲＮＡにさらに相補的であり得る。ブリッジオリゴを電極対の各電極のＳＡＭに導入してハイブリダイズさせることにより、サンプル導入前のベースライン電流を確立し得る。標的ｍｉＲＮＡまたは他の極低分子ＲＮＡを含み得るサンプルを導入することにより、ｍｉＲＮＡまたは他の極低分子ＲＮＡをブリッジオリゴにハイブリダイズさせ得る。ハイブリダイゼーションは、コンダクタンスの増加を引き起こし得る。次いで、それを定量することによりｍｉＲＮＡまたは他の極低分子ＲＮＡの数または濃度を表し得る。
核酸鎖などの標的分子が、電極対に関連付けられたギャップにまたがるのに十分な長さであり得るいくつかの場合、ブリッジオリゴを使用しないでもよい。標的分子は、電極対の電極に結合されたＳＡＭに関連付けられたオリゴに結合するように使用され得る。ＳＡＭに関連付けられたオリゴは、標的核酸鎖の一部または全部に相補的であり得るため、標的核酸鎖を導入してＳＡＭのオリゴにハイブリダイズさせたとき、コンダクタンスの増加を測定し得ると共に、標的核酸鎖の量を定量し得る。
いくつかの場合、標的核酸鎖は、電極対の電極に関連付けられたオリゴよりも長いことができると共に、電極対の電極に関連付けられたオリゴに相補的な領域間に追加のプローブオリゴのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さであり得る。検出プロセスは、組み合わされた標的核酸鎖と、電極対の電極に関連付けられたオリゴと、プローブオリゴとの検出を含み得る。
いくつかの場合、特異的長さのオリゴは、２つの電極間に配置され得ると共に、オリゴのコンダクタンスは、２つの電極間のバイアス電圧を用いてオリゴを通り抜ける電流を測定することにより測定され得る。電流シグナルは、トンネル電流またはトンネルおよびホッピング電流を含み得る。オリゴに関する特定の生物学情報または診断情報は、測定電流に基づいて決定され得る。いくつかの例では、メチル化を含むおよび含まないオリゴ間の差を決定し得る。この方法は、オリゴ上の特異的部位のメチル化が予想である場合に特に有用であり得る。２つ以上の可能なメチル化部位がオリゴに含まれ得る場合、３つ以上の異なる電流レベル、たとえばメチル化なしに対する第１の電流レベル、第１の部位の１つのメチル化に対する第２の電流レベル、第２の部位の１つのメチル化に対する第３の電流レベル、第１および第２の両方の部位のメチル化に対する第４の電流レベルを測定し得る。この方法は、オリゴの長さを２つの電極間のギャップの幅または間隔よりも大きくし得る場合に良好に機能し得る。たとえば、オリゴが１００塩基または塩基対であり、かつギャップサイズが約１５ナノメートルである場合、この方法は、非常に好適に使用され得る。
いくつかの場合、オリゴの長さは、ギャップサイズよりも大きいことができる。たとえば、１５ナノメートルのギャップで１００塩基または塩基対のオリゴを有し得るが、トンネル標識として使用されるオリゴの一部分は、６０塩基長または塩基対長であり得る。かかる場合、オリゴの一方または両方の末端は、ギャップにまたがる部分を有して両方の電極にハイブリダイズされ得る。ハイブリダイゼーションは、たとえば、両方の電極上に配設された相補的ＳＡＭを用いて行われ得る。この方法によれば、オリゴまたは他の生物学的サンプルの一部分のコンダクタンスのみを測定し得ると共に、コンダクタンスに基づく生物学的情報を同定し得る。たとえば、以上に記載のようにオリゴ上に１つ以上のメチル化部位が存在するかを同定可能である。
いくつかの場合、標的核酸鎖の検出の特異性は、電極対の電極に関連付けられたオリゴに類似した長さの単一オリゴのハイブリダイゼーションまたは電極対の電極に関連付けられたオリゴの組合せ長の長さであり得るより長いハイブリダイゼーションオリゴと比較して、電極対の電極に関連付けられた２つのオリゴのハイブリダイゼーションを利用することにより改善され得る。いくつかの場合、特異性は、電極対の電極に関連付けられた２つのオリゴの使用に加えて標的核酸鎖にハイブリダイズするプローブオリゴの使用によりさらに向上され得る。
高ＡＴ含有率に起因して正確な定量には低すぎる電流を有する配列を検出することが望まれ得る場合、標的核酸ポリマーに相補的であり得、かつそれに結合し得るヘアピンを利用し得る。ヘアピンは、高ＧＣ含有率を含み得る。ヘアピンは、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはテトラマーであり得る。標的の存在は、ヘアピン構造への標的の結合に起因して高ＧＣ部分間にもたらされるより高い近接度に起因する電流の増加により決定され得る。ヘアピンは、ＤＮＡを含み得ると共に、高ＧＣ含有率でない領域は、標的核酸に相補的であり得る。ヘアピンは、アプタマー、抗体、または任意の他の結合部分であり得る。高ＧＣ部分は、電極対の一方または両方の電極の伝導性電極に直接にまたは伝導性電極を覆い得る誘電体に結合し得る。いくつかの場合、高ＧＣ含有率は、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超のＧＣ含有率であり得る。
いくつかの場合、標的に結合するヘアピンの少なくとも一部分は、電極に直接にもしくはそれに関連付けられた誘電体に結合し得るか、またはＧＣリッチＤＮＡ領域の末端もしくは末端間に結合された個別の部分であり得る。他の場合、高ＧＣ領域として参照される領域は、核酸鎖でなくてもよいが、代わりに高いトンネル伝導率またはトンネルおよびホッピング伝導率を有する他の分子、たとえば本明細書に記載の他のポリマーまたは他の分子であり得る。かかる分子は、核酸と他のポリマーとのキメラであり得るか、または抗体と核酸とのキメラであり得るか、または抗体と、高いトンネル伝導率およびまたはホッピング伝導率を有する他の分子、たとえば本明細書に記載の他のポリマーまたは他の分子とのキメラであり得る。
いくつかの場合、特に連続センシングが望まれる場合、たとえば、チップまたはセンサーを水または空気のモニタリングセンサーとして利用し得る場合、あるいはチップまたはセンサーを液体もしくは気体クロマトグラフィーシステム、キャピラリー電気泳動システムとの関連で、または任意の他の適切な分離システム用の検出器として利用し得る場合、単一サンプルパーティションを使用し得る。単一サンプルパーティションは、連続した水系またはガス系のパーティションであり得る。単一サンプルパーティションは、トンネル検出器およびまたはホッピング検出器を使用し得ると共に、分離技術からの出力を連続的にモニターし得る。分離技術は、たとえば、より広いダイナミックレンジを可能にするために、または非特異的結合の影響を低減するために、または全ランにわたりシグナルを積算するために（これは、入力濃度が低い可能性がある場合に有利であり得る）、リセット方式で行われ得る。分離技術は、より容易およびまたはより正確な検出のために局所濃度を増加させ得る。
いくつかの場合、トンネル検出器およびまたはホッピング検出器は、ガスクロマトグラフとの関連で利用され得る。この場合、結合部分は、電極対の電極に結合または関連付けられ得ると共に、その後、標的分子に特異的または非特異的に結合され得る。
液体クロマトグラフィー分離をトンネル検出と組み合わせて行い得るいくつかの場合、未知の大きさの流動電位が発生し得る。下側の電極電位に対して表面をフローティングさせることにより、適切なトンネル電位を印加し得る。これは、誘電体被覆電極と電極間に印加されたＡＣ電圧とを用いて達成し得る。
いくつかの場合、標識を抗体に結合し得る。抗体は、タンパク質抗原、エピジェネティック修飾ヌクレオチド、たとえば６−ｍＡ ＲＮＡ塩基、または他の修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡヌクレオチドを標的とし得る。
センサーチップ：一般的使用法
いくつかの場合、本開示のシステムおよび方法は、チップを利用し得る。チップは、再使用可能なチップを含み得る。チップは、標的アナライト、酵素、および異なるラン間で除去されるＳＡＭの少なくともいくつかを有し得る。除去は、たとえば、温度の上昇、イオン濃度の減少、化学クリーニング、プラズマクリーニング、酵素クリーニング、電位クリーニング、任意の他のタイプのクリーニング手順、またはそれらの組合せにより達成され得る。かかるクリーニングは、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、たとえば、プロテイナーゼＫを含み得る。クリーニングは、電極とバルク溶液との間の電圧変化（たとえば、チオール化ＳＡＭを除去し得る）または任意の他の方法を含み得る。いくつかの場合、どの程度多くのセンサーがアクティブで良品質なデータを生成しているかを決定するために、チップを各種センサー領域でモニターし得る。いくつかの場合、たとえば、特定数のランにわたるプログラム寿命を有するローカルフラッシュメモリーでチップをプログラムし得る。プログラムチップ寿命は、信頼性を維持しつつシーケンシングコストを有意に削減し得る。
いくつかの場合、トンネル標識と相互作用する電子または正孔は、トンネル標識内をトンネルし得るか、またはトンネル標識を介してトンネルおよびホッピングし得る。電子または正孔は、トンネル標識の一部を介してトンネルし、かつトンネル標識の他の部分を介してホッピングし得る。電子または正孔は、トンネリングが起こり得るトンネル標識のいくつかの領域と、ホッピングが起こり得る領域との間を繰返し移行し得る。
いくつかの場合、高いデータ密度を達成し得る。高いデータ密度は、１塩基当たりで生成される最小量の生データから生じ得る。高いデータ密度は、１塩基当たりで多くの読取りを必要とする電流センサーとは対照的に、センサーの単一リードアウトを用いて４つ以上の塩基タイプのいずれが存在し得るか決定する能力の結果として達成され得る。非同期化学法は、反応が起こる時間が不明であるため、頻繁な測定を必要とし得る。他の場合、異なる塩基タイプに関連付けられるフルオロフォアに関連した色を決定するために、複数のピクセルの読取りを必要とし得る。本明細書に提供されるように、シグナルの大きさが塩基の存在およびいずれのタイプの塩基であるかの両方を表し得るため、いずれのヌクレオ塩基タイプが結合されたかまたは取り込まれたかを決定するのに１回程度の少ない読取りで十分であり得る。そのため、限られたデータ出力能で高いデータ密度を生成するチップは、各色に対して複数のピクセルの読取りを必要とし得、かつ４つの標準塩基に対応する４つの色を必要とし得る既存のシステムよりも単位時間当たりで有意により多くの出力塩基を生成し得る。より高いデータ密度は、コンピューターハードウェアおよびまたはデータセット解析時間の低減を促進し得る。
いくつかの場合、本明細書に記載のシステムは、用途に依存しておよび特定の測定で全体的精度に役立つとみなされれば、各塩基を２回以上測定またはインテロゲートし得る。いくつかの場合、システムは、単一サンプルを用いて、ＤＮＡシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、化学修飾を含むまたは含まないＤＮＡのエピジェネティクスの決定、化学修飾を含むまたは含まないＲＮＡのエピジェネティクスの決定、異数性の決定を含むＤＮＡのコピー数の決定、異なる転写物の発現レベルの決定、異なるタンパク質の存在および量の決定、ならびに対象の他の生物学的分子の存在および量の決定をはじめとする１つ以上のタスクを行い得る。単一サンプルでかかる試験を行う際、システムは、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼとＤＮＡ依存性ポリメラーゼとの組合せを利用し得る。異なるチップで異なるタイプのポリメラーゼを利用し得る。単一チップの異なる容積内で異なるタイプのポリメラーゼを利用し得る。２つ以上のチップの異なる容積内で異なるタイプのポリメラーゼを利用し得るか、または１つ以上のチップの単一の容積内で利用し得る。
いくつかの場合、システムは、電極構造を備えたチップを含み得ると共に、増幅器または異なるセンサーに関連付けられた行および／もしくは列の選択を含んでいなくてもよい。測定に必要とされる回路は、チップの一部でなくてもよく、追加のチップまたは回路の一部であり得る。他の場合、ローカル増幅器ならびに任意選択的に列およびまたは行の選択は、チップの一部を構成し得ると共に、積算、二重相関、アナログ−デジタル変換ならびにデジタル入力および出力ポートは、チップの一部でなくてもよく、追加のチップまたは回路の一部であり得る。
センサー電極
本開示のシステムは、拡張性の高いシステムであり得る。たとえば、単一デバイス上に非常に小さいピッチでギャップによって分離された２つの電極を含む現在のＤＮＡシーケンシング電子センサーに類似したサイズの単一チップ上に何百万または何十億ものセンサーを配設し得る。いくつかの場合、チップは、極高密度のセンサーを有し得る。たとえば、単一チップは、約５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００、１０，０００，０００、２０，０００，０００、３０，０００，０００、４０，０００，０００、５０，０００，０００、６０，０００，０００、７０，０００，０００、８０，０００，０００、９０，０００，０００、１００，０００，０００、２００，０００，０００、３００，０００，０００、４００，０００，０００、５００，０００，０００、６００，０００，０００、７００，０００，０００、８００，０００，０００、９００，０００，０００、１，０００，０００，０００、２，０００，０００，０００、３，０００，０００，０００、４，０００，０００，０００、５，０００，０００，０００センサー／インチ２以上のセンサー密度を有し得る。いくつかの場合、１４ｎｍモードまたはまもなく達成される見込みの１０ｎｍモードなどの最新技術の高密度モードのコストをかけずに各種カスタムチップ設計を構築できるように、回路処理の旧来モードを利用し得る。いくつかの場合、センサーの密度は、光学クロストークまたは拡散クロストークにより制限され得ない。
いくつかの場合、リソグラフィー法を用いたチップの大規模並列設計によれば、基材上に多数のセンサーを配置し得る。各センサーは、ギャップによって分離された２つの電極を有し得る。個別のセンサーは、ピッチサイズによって分離され得る。ピッチサイズは、Ｘ軸およびＹ軸で同一であり得るかまたは異なり得る。各センサーは、電極対の電極間バイアス電圧を印加するためにおよびまたはトンネル電流を読み取るために、個別の電子路または多重電子路を有し得る。このため、各電極は、個別にアドレス指定可能かつ読取り可能であり得るか、または群、たとえばアナログ−デジタルコンバーターが各列に存在し得る状態において列で読み取られ得る。いくつかの場合、複数のアナログ−デジタルコンバーターは、各列に関連付けられて、たとえば列の対向端に存在し得るか、または列内に散在し得る。各センサー上の電極は、金、白金、銅、パラジウム、銀、または他の貨幣金属もしくは貴金属、あるいはグラフェンから作製され得る。貨幣金属または貴金属の使用は、電極へのチオール結合を促進し得る。
いくつかの場合、センサーに含まれる電極間のギャップサイズは、電極が平行にまたは平行から１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０度以内になり得るように設計され得る。電極はまた、電極上にＳＡＭが配置され得るように、かつギャップ内で電極に結合されたＳＡＭ層間に酵素が嵌設され得るように間隔を有して設計され得る。
図３Ｗに示されるように、いくつかの場合、電極または電極に関連付けられた構造は、互いに角度をなし得ると共に、逆角錐台を形成するようにＫＯＨエッチングを用いて形成され得る。関連付けられた電極対３４２Ａおよび３４２Ｂは、互いに角度をなして形成され得るか、または以上に記載のように対向側が平行もしくは本質的に平行になるように作製され得る。構造は、ポリメラーゼまたは他の酵素３３０の進入を可能にするのに十分な幅を有し得る入口を有し得ると共に、ポリメラーゼが嵌設されるように非常に狭くされ得る角度のある表面３４０を有し、しかもポリメラーゼまたは他の酵素の直径よりも短い標識を利用し得るようにポリメラーゼまたは他の酵素３３０よりも有意に狭くされ得る間隔を有し得る電極をさらに有し得る。
いくつかの場合、電極間のギャップサイズは、約１０ｎｍよりも狭くまたは小さいことができるため、約３０塩基対の核酸標識を用いてコンダクタンスの測定が可能である。いくつかの場合、ギャップは、ＴＬＦフォールスポジティブの生成を回避するためにかつ製造を容易にするために、約２〜３ｎｍよりも大きくまたは広くされ得る。
いくつかの場合、基材上にまたは基材に隣接して配設された電極対に試薬セット、酵素およびまたはポリメラーゼを分配させるために、流体チャネルのセットを利用し得る。いくつかの場合、流体チャネルは、チップの物理的リードアウト構成、たとえば行数／多重増幅器に対応する幅であり得る。流体チャネルは、試薬および酵素を容易に供給するのに十分な高さであり得る。この高さは、１００ｎｍ〜２００ｎｍ、２００ｎｍ〜５００ｎｍ、５００ｎｍ〜１μｍ、１μｍ〜５μｍ、５μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜５０μｍ、５０μｍ〜２５０μｍ、または２５０μｍ超であり得る。流体チャネルの幅は、何百または何千ものセンサーに対応し得る幅であり得るため、かなり狭く作製され得ると共に、そのため、高さの許容差は、流体チャネルが全チップをカバーする場合よりもかなり厳密であり得る。他の場合、センサーに関連付けられるギャップ（たとえば、ナノギャップ）は、酵素またはポリメラーゼの幅よりも広いことができる。酵素またはポリメラーゼの幅は、酵素またはポリメラーゼの最小寸法であるとみなされ得る。この場合、酵素またはポリメラーゼは、部分的に一本鎖および部分的に二本鎖の核酸と複合体化され得ると共に、酵素またはポリメラーゼのサムは、酵素またはポリメラーゼのパームに対してオープンであり得る。酵素もしくはポリメラーゼ内またはそれらに結合され、かつ酵素もしくはポリメラーゼ内に複合体化された核酸部分の長さに沿った核酸鎖の軸は、ギャップまたはナノギャップを構成する金属表面と平行であり得る。いくつかの場合、電極対の少なくとも１つの電極は、誘電体で被覆され得るか、または部分被覆され得るか、または被覆されなくてもよい。また、第２のメンバーの対は、誘電体で被覆され得るか、または部分被覆され得るか、または被覆されなくてもよい。
いくつかの場合、センサーは、電極対を含み得る。電極対は、トンネル標識もしくはトンネルおよびホッピング標識を検出するように構成され得るか、または標的部分を直接検出するように使用され得る。さらなる場合、以下に記載のギャップを利用するのではなく、電極対は、ギャップもナノギャップも形成することなく形成され得るが、ギャップを形成するＲＩＥ工程を行わないでもよいこと以外には同様の方法で形成され得る。かかる場合、電極の有効面積は、実質的に共平面上にあり得る。かかる場合、測定に利用されるポリメラーゼ、酵素、または他の部分がセンス電極とバイアス電極との間の間隔を形成し得る誘電体に結合し得るとき、標識に関連付けられたリンカーおよびまたは標識の長さは、測定に利用されるポリメラーゼ、酵素、または他の部分の結合位置および移動の許容差を考慮に入れて、ポリメラーゼ、酵素、または他の部分がセンス電極とバイアス電極との間の中点で結合される場合、必要とされるよりも長くなるように形成される必要があり得る。考慮し得る追加の許容差としては、たとえば、測定に利用されるポリメラーゼ、酵素、もしくは他の部分が許容し得るリンカーの長さに基づいて許容可能な拡散移動に起因する、測定に利用されるポリメラーゼ、酵素、もしくは他の部分の結合点を基準にした拡散、または測定に利用されるポリメラーゼ、酵素、もしくは他の部分の回転が挙げられ得る。
いくつかの場合、電極対の代わりに、トリプル電極、クワッド電極、またはアレイ（たとえば、線形アレイ）電極を使用し得る。電極は、電極が異なる電極間で同一のまたは異なる距離で実質的に共平面上にあり得るような配置で構成され得る。
いくつかの場合、ＤＣ電流を最小化し得るように、いくつかの場合には測定し得ないように、ただしＡＣ電界を印加し得るように、かつ任意の容量電流に加えてトンネル電流を決定し得るように、電極は、誘電体で被覆または部分被覆され得る。これは、電気泳動分離などの他の方法による分離と組み合わせてトンネルおよびまたはホッピング電流検出の利用を可能にし得る。この場合、電気泳動電界に関連付けられる電位は、良好に決定も制御もされなくてよく、または変動し得るため、電気泳動分離に関連付けられる電界は、そのままではトンネル電流およびまたはトンネル電極への結合に影響を及ぼし得る。
いくつかの場合、複数の分子の動態検出であり得る、以上に記載の動態検出を用いるかまたは固定的に結合し得るコピー数を検出するかのいずれかにより、検出および定量を達成し得る。いくつかの場合、電極対の数およびまたはサイズを増加させることにより、ダイナミックレンジを増加させ得る。
いくつかの場合、さまざまな標準的半導体処理法を用いて構造を作製し得る。この処理法は、たとえば、図３Ａ〜３Ｄに示されるように、
１）平坦化基材から出発することと、
２）化学気相堆積法を用いて適用し得る酸化ケイ素層を適用することと、
３）ＵＶ感光性マスクまたはｅビームマスクであり得るフォトレジストを適用することと、
４）フォトレジストを露光することであって、標準的フォトマスクを使用し得るかまたはｅビームなどの直接書込み法を使用し得る、を露光することと、
５）フォトレジストを現像することと、
６）図３Ａの上側図に示されるようにスパッタリング法を利用して適用し得る金属層を適用することと、
７）リフトオフ法を用いて除去し得る金属層の望ましくない部分を除去することと、
８）窒化シリコン層であり得、かつ図３Ａの下側図に示されるように所望の電極ギャップ間隔であり得る厚さで適用され得る誘電体層を適用することと、
９）ＵＶ感光性マスクまたはｅビームマスクであり得るフォトレジストを適用することと、
１０）フォトレジストを露光することであって、標準的フォトマスクを使用し得るかまたはｅビームなどの直接書込み法を使用し得る、露光することと、
１１）フォトレジストを現像することと、
１２）スパッタリング法を利用して適用し得る金属層を適用することと、
１３）図３Ｂに示されるようにリフトオフ法を用いて除去し得る金属層の望ましくない部分を除去することと、
１４）電極構造の所望の部分を露光し得、かつ図３Ｃに示されるＣＭＰ（化学的機械的ポリッシング）法を用いて達成され得る、表面を平坦化することと、
１５）化学気相堆積法を用いて適用し得る窒化ケイ素層または酸化ケイ素層であり得る誘電体を適用することと、
１６）ＵＶ感光性レジストまたはｅビームレジストであり得るフォトレジストを適用することと、
１７）フォトレジストを露光することであって、標準的フォトマスクを使用し得るかまたはｅビームなどの直接書込み法を使用し得る、露光することと、
１８）フォトレジストを現像することと、
１９）電極間にナノギャップを形成し得、かつ電極の上にウェル状構造を形成し得る、反応性イオンエッチングであり得る乾式エッチングを行うことと、
２０）ＳＰＭ（硫酸および過酸化水素）工程を含み得、かつ図３Ｄに示されるアッシング工程を含み得る、フォトレジストを除去することと
を含み得る。
かかる構造は、単一センサーの断面図を示す図３Ｅ、ナノギャップおよび２つの対向電極の拡大図を示す図３Ｆ、トップ酸化物層のトップウェル構造と、明らかな結晶粒子を含む電極間ナノギャップを備えた２つの電極とを示す図３Ｇ、いくつかのセンサーおよび金属インターコネクトを示す図３Ｈ、ならびに異なるズームレベルでかかる構造の断面図を示す図３Ｉに示される。
結晶粒子の配向を改善するために利用し得、かつ電極ギャップの電極の対向表面として対向１１１結晶平面を有する結果をもたらし得る他の場合、初期層は、誘電体層であり得ると共に、その上に第１の電極形成金属層、その後、ギャップ間隔誘電体、次いで第２の電極形成金属層を形成し得ると共に、結果として図３Ｊに示される断面図が得られ、両方の電極は、第１の電極のアクティブ表面に対向する面から第１の電極のアクティブ表面に、中間ギャップ間隔誘電体に、次いで第２の電極のアクティブ表面に、かつ最後に第２の電極の有効表面積に対向する第２の電極のインアクティブな第２の表面に同一堆積方向で形成される。次いで、誘電体が堆積され、構造が平坦化され、結果として図３Ｋに断面図で示される構造が得られる。
いくつかの場合、酵素、ポリメラーゼ、もしくは測定の一部として利用し得る他の部分、または測定の一部として使用される部分のサイズであり得る部分をより良好にセンタリングするために、および酵素、ポリメラーゼ、または他の部分の機能の立体障害を防止することが望まれ得る場合、後続の測定の一部として利用し得るＳＡＭよりも長く（厚く）し得る電極のアクティブ表面を覆う１つ以上の層を形成することが望まれ得る。電気メッキにより形成し得る金属層、誘電体層、またはＳＡＭ層であり得る層の長さ（または厚さ）は、酵素、ポリメラーゼ、または測定プロセスの一部として使用される他の部分の結合または装着前に形成され得る。その後、酵素、ポリメラーゼ、または他の部分を、たとえば、電極間のギャップ間隔を形成し得る誘電体層に結合または装着し得る。こうして、酵素、ポリメラーゼ、または他の部分を電極から離間させ得る。次いで、酵素、ポリメラーゼ、または他の部分を電極から離間させるために使用した層を除去し得ると共に、所望または必要に応じて、その後、ＳＡＭを電極に結合させ得る。
他の場合、以上に記載の水平電極構造ではなく、垂直電極構造を利用し得る構造を形成し得る。かかる構造では、図３Ｌに示されるように、最初に酸化物層、次いで第１の電極金属層、次いでギャップ間隔誘電体層、次いで第２の電極金属層、次いでカバー誘電体層を堆積し得る。
次いで、図３Ｍに示されるように、エッチングパターンを形成する。このパターンは、トップ誘電体、第２の電極金属層、ギャップ間隔誘電体層を垂直にカットし得ると共に、第２の電極金属層の一部または全部をカットし得る。このエッチングは、イオンミリングプロセスまたは任意の他の適切な異方性エッチングプロセスを用いて行われ得る。次いで、図３Ｎに示されるように、ギャップ間隔誘電体を優先的にエッチングする湿式エッチングを行い得ることから、対向１１１結晶平面を備えた電極構造が形成される。
他の場合、ダマシンまたはデュアルダマシンプロセスを利用し得る。平坦化基材から出発し、化学気相堆積法を用いて適用し得る酸化物層を適用し、所望の金属容積の開口を有するパターン化酸化物層を形成し、酸化物層の上に金属化層を形成し得る。ＣＭＰ工程を利用して余分な金属を除去し、図３Ｏに示される構造を残存させ得る。次いで、パターン化酸化物層を除去し、図３Ｐに示される構造を残存させ得る。次いで、窒化シリコン層であり得るスペーサー層を図３Ｑに示されるように構造の上に適用し得る。次いで、新しいパターン化酸化物層を形成し得ると共に、図３Ｒに示されるように第１の金属容積の隣かつその上に開口を形成する。次いで、第２のパターン化誘電体層に残存させる開口を含めて、図３Ｓに示されるように追加の金属層を形成し得る。次いで、図３Ｔに示されるように構造を平坦化し得る。次いで、化学気相堆積を用いて第３のパターン化酸化物層を形成し、次いでレジスト層を適用してレジスト層をパターニングし、その後、乾式エッチングを用いて図３Ｕに示される構造を残存させる。フォトレジストを再び適用し得ると共に、湿式または乾式エッチングを利用して図３Ｖに示される構造を形成し得る。
センサーエレクトロニクス
従来のアレイセンサーを本開示の集積半導体デバイスとして作製し得るため、精度、集積度、およびスケーリングに関して大きい利点が提示される。いくつかの場合、特に同期化学法を利用するシステムでは、高いデータバンド幅を必要としない可能性がある。システムチップは、大規模並列であり得ると共に、取り込まれたヌクレオチドを記録するセンサーのみがリードアウトし得る。チップは、最初にマッピングされて、いずれのセンサーが有用データを提供しているか、またマップがチップのフラッシュメモリーに存在し得るか、またはシステムの他の部分の一部として他の箇所に存在し得るかを決定し得る。これにより、データスループットを含めてシステムスループットが非常に高くなり、校正および精度の信頼性を非常に高めるのに役立ち得る。いくつかの場合、単一測定を使用し得る。いくつかの場合、取り込まれたまたは結合された標識ヌクレオチドは、所望の精度が達成されるまで複数回測定され得る。
いくつかの場合、シーケンシングプロセスの一部としてエピジェネティック情報を決定し得るように、センサーを利用して結合動態およびまたは取込み動態を測定し得る。この場合、複数回かつ他の方法で必要とされ得るよりも潜在的に高い頻度でセンサーを読み取る必要があり得る。かかる場合、チップの一部分のみを一度に利用し得るか、または最大データ出力能に応じてより小さいチップを利用し得る。
いくつかの場合、センサーは、ＣＭＯＳイメージングセンサーで使用されるものに類似した４Ｔ回路などのローカル増幅器に関連付けられ得る。いくつかの場合、トンネル電極対により生成された電流を積分するために、キャパシターを使用し得る。キャパシターは、電極対に対する標識の結合および放出に起因する変動を平均する役割を担い得る。キャパシターは、電極対により生成される電流の大きさの変動を引き起こし得る結合位置の変動を平均し、さらには電極間およびまたはＳＡＭ成分間の直接トンネリングから、ならびにまたは一過的に結合され得る他の部分、たとえば標的ＤＮＡ、未結合ヌクレオチド、またはシステムの目的物もしくは他の汚染物質であり得る他の分子の結果として生じ得るバックグラウンドを平均する役割を果たし得る。かかる平均化キャパシターは、シグナル対ノイズを改善し、およびまたはトンネル電流からの電荷を維持しながらキャパシターなしで他の方法で可能なよりも長い測定間の時間を可能にするのに有用であり得る。
積分時間と組み合わされた電流が、電荷積分キャパシターに関連付けられたサイズおよび電圧で望まれ得るよりも大きくなり得る場合、各センサーまたはキャパシターに関連付けられた増幅器の一部として負のゲインを利用し得る。結合時間、位置の有意な変動が測定の一部であり得るか、または測定間の他の理由で長時間が望まれる場合、負のゲインが有用であり得る。ショットノイズは、測定に重要な役割を果たすと予想されないであろうから、負のゲインから生じ得るショットノイズの増加は、センサーのシグナル対ノイズの有意な減少を引き起こさないであろう。かかる設計は、図３Ｘに概略的に示される。図中、電位は、バイアス電極に印加されるものとして示され、センス電極の出力は、ｒｏｗ選択トランジスターに供給され、このトランジスターは、入力センス電極からのすべての電流をシャントして、センサーがディセーブル状態のときはグラウンドし、一方、イネーブル状態のときにオープンになり、負のゲイン用として構成された電流ミラーに電流を流す。電流ミラーからの出力は、関連リセットトランジスターを備えた積分キャパシターに接続されるものとして示される。この関連リセットトランジスターは、ＲＤノードがグラウンド電位にあるように構成されたとき、キャパシターを完全放電することによりキャパシターをリセットする。
いくつかの場合、ギャップサイズは、約５ｎｍ以上、６ｎｍ以上、７ｎｍ以上、８ｎｍ以上、９ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、１５ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上であり得る。かかるギャップサイズは、追加の利点、たとえば製造の容易性およびより大きいギャップサイズ許容差を提供し得る。かかる場合、トンネル標識またはトンネルおよびホッピング標識は、第２の電極に対向する第１の電極の表面に対する結合トンネル標識の角度が５〜１０度、１１〜２０度、２１〜３０度、３１〜４０度、４１〜５０度、または５１度超であり得るように、ギャップサイズよりも大きくするように構成され得る。たとえば、９ｎｍのギャップは、約３０塩基対以上の二本鎖ＤＮＡの標識と共に使用され得る。１２ｎｍのギャップは、約４０塩基対の二本鎖ＤＮＡの標識と共に使用され得る。２０ｎｍのギャップは、約６０塩基対の二本鎖ＤＮＡの標識と共に使用され得る。ギャップサイズは、特異的長さの、市販であるか、または容易に組み立てられるＤＮＡオリゴを当てはめるように構成され得る。
いくつかの場合、バイアス電圧は、ポリヌクレオチドをシーケンシングする間のランのほとんどでオフにされ得る。これは、静電学に起因する電極への分子の固着または吸着、したがってアーチファクトの発生を最小限に抑えるのに役立ち得る。いくつかの場合、電極への分子の固着または吸着を最小限に抑えるためにラン時間の一部でバルク溶液電位を変更し得る。いくつかの場合、バックグラウンドシグナル（イオン電流に起因し得る）は、小さい露出電極金属表面積に起因して最小限に抑えられ得る。いくつかの場合、各センサーの露出金属表面積は、１，０００，０００ｎｍ２未満、４００，０００ｎｍ２未満、１００，０００ｎｍ２未満、４０，０００ｎｍ２未満または１０，０００ｎｍ２未満であり得る。これは、トンネル電流の測定に関連付けられるシグナル対ノイズを改善し得る。バックグラウンドシグナルは、結合酵素を有し得ず、したがってシグナルを有し得ないセンサーから決定され得る。いくつかの場合、トンネル電流を最適化するように電子タグを選択し得る。分子のサイズは、ギャップの作製に関連付けられる許容差を含み得る２つのトンネル電極間のギャップよりもわずかに長くなるように選択され得るか、または電極上のＳＡＭの結合位置の変動およびまたは電極間ギャップサイズの変動を考慮し得るトンネル電極に結合されたＳＡＭに関連付けられる結合位置よりもわずかに長く選択され得る。
いくつかの場合、電流レベルは、異なる標識間の電流比がｌｏｇ空間内で固定レベルであり得るような標識のセットで選択され得る。たとえば、最も高いコンダクタンスの標識は、０．１Ｖの印加バイアスを用いて１００パーセントのデューティーサイクルで１ｎＡの電流を生成し、２５パーセントのデューティーサイクルで２５０ｐＡの平均電流を生成し、これは、５０パーセントのデューティーサイクルのヌクレオチド結合イベントおよび５０パーセントのデューティーサイクルのヌクレオチド結合イベント時のハイブリダイズイベントに対応し、したがって異なる標識間でファクター４を利用すると、次に最も伝導性の標識は、約６４ｐＡの平均電流を生成し、その次に最も伝導性の標識は、約１６ｐＡの平均電流を生成し、４つからなるセットの最も低い伝導性のもの（本明細書では４が用いられているが、これに限定されるものではない）は、約４ｐＡの電流を有し得る。いくつかの場合、トンネル電極対の２つのトンネル電極間のバイアス電圧を使用し得る。この場合、一方の電極の対は、正電圧を有し得る共に、電極対の他方の電極は相手に対して負電圧を有し得る。
いくつかの場合、トンネル標識化合物に関連付けられて、結合およびまたはトンネリングは、温度感受性であり得る。そのため、いくつかの場合、電極対センサーを備えたチップは、温度制御を利用し得る。温度制御は、ヌクレオ塩基測定およびもしくは取込みサイクルの全体にわたり固定温度を利用し得るか、またはサイクルの異なる部分で異なる温度を利用し得る。
いくつかの場合、ＳＡＭおよびまたはトンネル標識化合物に関連付けられるヌクレオチドの一部として、天然骨格を有する化合物を利用し得る。いくつかの場合、他のタイプの骨格およびまたは糖または糖代替物、たとえばペプチド核酸、ロックド核酸、耐加水分解性塩基、たとえばモルホリノ塩基、ジデオキシド塩基、Ｌ−ＤＮＡ、グリコール核酸、トレオース核酸、または任意の他のタイプの核酸を利用し得る。
いくつかの場合、トンネル電流の差は、異なるヌクレオ塩基に関連付けられる異なるタイプのトンネル標識化合物から生じ得る。いくつかの場合、トンネル電流は、ポリメラーゼが結合し、かつ少なくとも部分的にヌクレオ塩基を含むトンネル標識化合物にリンカーを介して結合されたヌクレオ塩基間のリンカーの長さまたは剛性による影響を受け得る。
いくつかの場合、ＳＡＭへの結合は、トンネル標識化合物のセットに対して同一であり得る。他の場合、ＳＡＭへの結合は、トンネル標識化合物に関連付けられる電荷の差の結果として異なり得る。いくつかの場合、ＳＡＭへの結合は、ヌクレオ塩基配列またはヌクレオ塩基タイプに起因して異なり得るため、結合動態および平均トンネル電流は、影響を受け得るが、平均トンネル電流は、影響を受け得ない。
いくつかの場合、標的核酸は、電極対を備えた容積内への導入前にポリメラーゼと複合体化され得る。ポリメラーゼは、電極対の近傍または流体環境に結合され得る。次いで、ポリメラーゼは、標的核酸の導入前に電極対の近傍に結合され得る共に、標的核酸は、ポリメラーゼに導入されて複合体を形成し得る。いくつかの場合、シーケンシングサイクルのセットが終了した後、核酸がポリメラーゼから放出され得ると共に、流体環境から洗浄され、核酸の新しいセットが流体環境内に方向付けられてポリメラーゼと複合体化されるように、緩衝液条件を変更し得る。核酸は、ＤＣ電界、磁界、誘電泳動、または両方を用いて濃縮され得る。
いくつかの場合、いずれかの入力流体がチップ上の電極対のいずれかと相互作用し得るように、単一チップの一部として単一容積を利用し得る。他の場合、異なるサンプルを含み得る異なる流体を、流体的に分離された容積に導入または導入貫通し得るように、流体的に分離され得るいくつかの容積を提供し得る。チップ設計の一部として一体的にバルブを提供し得るか、または複数の入力および出力ポートを提供し得る。いくつかの場合、単一チップが時間のより多くのパーセントでデータを収集し得るように、化学の異なる部分を異なる容積内で行い得る。たとえば、４つの流体工程が必要とされ、それぞれ１分間を要し、容積のリードアウトに必要とされる時間が１分間である場合、１つの容積がデータを収集し、４つの他の容積がそれぞれ異なる流体送達を行うように、５つの流体容積を提供し得る。次いで、１分後、各容積は、異なるタスクを開始し得る。
そのため、データは、連続的に生成され得る。
いくつかの場合、チップのすべての容積で同一の化学を行い得る。他の場合、異なる容積で異なる化学を行い得る。たとえば、１つの容積は、低カバレッジエピジェネティック法を行い得ると共に、他の容積はロングリード、したがって構造を提供する方法を行い得るものとし、一方、他の容積は、チップから伝送されるヌクレオ塩基リード／バイトで測定されるスループットを最大化する方法を行い得る。異なる容積は、同一サイズであり得るかまたは異なるサイズであり得る。１つ以上の容積内で単一サンプルまたはサンプルの単一セットを利用し得るか、または異なる容積内では異なるサンプルまたはサンプルの異なるセットを利用し得る。ユニバーサルプライマーであり得るプライマーの装着の一部として、バーコードまたはジップコードを単一サンプルで使用し得るか、またはサンプルセットで使用し得る。
いくつかの場合、電極対の電極の電位を基準にしてバルク流体電位を制御し得るように、１つ以上の参照電極をチップの一部として供給し得る。参照電極は、真参照電極、準参照電極、対向電極、補助電極、またはそれらの任意の組合せであり得る。いくつかの場合、たとえば、電極対を備えた流体容積と相互作用する流体ラインを介して１つ以上の電極をチップの外側に配置し得る。
いくつかの場合、ゲート電極として効果的に作用するように、参照電極およびまたは対向電極または擬似参照電極を利用し得る。たとえば、酸化状態に依存して異なるコンダクタンスを有し得るトンネル標識と、参照電極およびまたは対向電極または擬似電極とを利用して、標識、特にバイアス電極またはセンス電極に結合し得る標識の一部分を酸化または還元し得ると共に、標識の酸化または還元は、トンネル電流の大きさの変化をもたらし得る。
いくつかの場合、いくつかの電極対が２つ以上のポリメラーゼまたはごく近接して結合されたポリメラーゼ複合体を有し得るように、ポアソン分布を用いてランダムにポリメラーゼまたはポリメラーゼ複合体を配置し得る。より高い電流または提供されたトンネル標識のセットに関連付けられる予想分布に当てはまらないマルチレベル電流分布の結果としていずれの電極対が２つ以上のポリメラーゼを有し得るかを決定するために、ソフトウェア、ファームウェア、アナログコンパレーター、またはビルトインロジックを使用し得る。トンネル標識化合物の提供されたセットに関連付けられる予想分布にマッチし得ない低いシグナルおよびまたは分布により決定し得るように、いくつかの電極対は、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ複合体の欠如に合致する電流を有し得る。トンネル標識化合物のかかる予想分布は、１、２、３、４つ、またはそれを超える異なるタイプのトンネル化合物標識を含み得る。
いくつかの場合、取込み可能なヌクレオチドと取込み不能なヌクレオチドとの混合物を使用し得る。取込み可能なヌクレオチドおよび取込み不能なヌクレオチドは、両方とも標識され得ると共に、試薬混合物と共に利用され得る。試薬混合物は、触媒２価カチオンなどの触媒カチオンを含んでいてもいなくてもよい。触媒２価カチオンが混合物に含まれない場合、ヌクレオチドの取込みは行われなくてもよい。いくつかの場合、すべてまたは実質的にすべてのヌクレオチドは、標識を含み得ると共に、取込み不能であり得る。
チップフルイディクス
いくつかの場合、入力サンプルを含み得る単一入力流体がチップのすべてのセンサーと相互作用し得るように、チップは、単一の通常サンプル容積を有し得る。代替的に、異なる入力サンプルを含み得る異なる入力流体がサンプルの異なるセットと相互作用し得るように、チップは、センサーの異なるセットに関連付けられた複数の容積を有し得ると共に、バルブ機構または複数の入力ポートを有し得る。
いくつかの場合、単一入力流体は、複数の異なるサンプルを含み得る。異なるサンプルは、それに関連付けられた異なるバーコードを有する結果として区別され得るか、またはそれに固着された異なる切断可能トンネル標識を有し得る。いくつかの場合、異なるサンプルは、異なる時間で導入され得る。異なるサンプルは、より後の時点で導入され得るサンプルに利用可能な他のセンサーを残して、異なるチップ領域の一部分を占有し得る。異なるサンプルは、核酸ポリマーで複合体化された酵素であり得る結合部分に結合または関連付けられた標識を測定することにより、したがっていつ結合部分が結合されたか、およびいずれの位置に結合部分が結合されたかを表すことにより区別され得る。後続のサンプルを導入した後、結合部分に結合または関連付けられた標識を測定するために追加の測定を行い得る。結合部分を有する追加のセンサーは、新たに導入されたサンプルに関連付けられ得ると共に、すでに前のサンプルに関連付けられたセンサーは、依然として前のセンサーが関連付けられた同一のサンプルに関連付けられ得る。いくつかの場合、チップに関連付けられたセンサーは、すべて同一の時間または異なる時間で異なる工程を行い得る。いくつかの場合、サンプルは、異なる時間で導入され得るが、他の流体は、同一の時間ですべてのセンサーに導入され得る。
いくつかの場合、チップは、異なる内部容積に関連付けられた複数の入力ポートを有し得ると共に、システムは、複数のチップを同時に収容し得る。異なる流体は、異なる時間で異なる容積に導入され得る。異なる容積は、単一チップの異なる容積であり得ると共に、異なる容積は、異なるチップ上に存在し得る。異なる容積は、複数のチップに関連付けられた異なる容積であり得るため、プロセスの異なる工程を異なる容積で異なる時間で行い得る。そのため、たとえば、異なる容積で異なる時間において測定を行い得ると共に、他の容積で他の異なる工程を測定しながら行い得る。そうすることにより、測定を効果的に連続的に行い得るため、それによらなければシステムのスループットの完全利用に対する制限因子となり得るアナログ−デジタルコンバーター、インテグレーター、デジタル通信チャネル、またはエレクトロニクスの任意の他の部分が可能になり、待ち時間の制限なく、化学工程、生化学工程、洗浄工程、または他の１つ以上の工程が行えるようになる。いくつかの場合、測定の協調セットを達成し得るため、測定が効果的で連続的でないことがあり得るが、化学工程、生化学工程、洗浄工程、または測定工程以外の任意の工程であり得る異なる工程に進む前に、すべての測定を異なる領域で行った場合と比較して向上したパーセントまたはデューティーサイクルで実施し得るようになる。
図３Ｙに示されるいくつかの場合、チップは、単一サンプルを利用し得るように相互接続され得る複数の流体チャネル３７０を有し得るか、または異なるサンプルをチップの異なるセクションで利用し得るように個別の流体ポート（図示せず）を有し得る。積分キャパシター、電流ミラー、およびアナログ−デジタルコンバーターを含み得るセンス回路３６０は、流体チャネル間の各領域が流体チャネルのカバーを支持し得るように、かつかなり少ない流体容積を利用可能にするように、１００ｒｏｗの２セットまたはｒｏｗのなんらかの他の適切な数を有し得る流体領域間のセクションに位置決めされ得る。ｒｏｗ選択回路３８０を一方の側に位置決めし得ると共に、１つ以上のＬＶＤＳ（低電圧微分シグナル）インターフェースを含み得るデジタル入力および出力回路３９０を利用し得る。
いくつかの場合、チップ内の単一物理的容積は、エレクトロウェッティングまたはオプトエレクトロウェッティングを用いて個別の流体容積に分離され得ることから、固定容積を用いて達成可能なものよりも大きい柔軟性が可能になる。センサーの異なる領域を規定するためにエレクトロウェッティングを使用し得る。センサーの異なる領域は、異なる時間でチップの異なる部分への異なる試薬のフローを可能にするために、異なるサンプルに関連付けられ得、およびまたは流体フロー領域を規定するため使用され得る。このチップの異なる部分は、異なるサンプルに関連付けられ得るか、または最適チップスループットのサイズ領域に関連付けられ得るため、任意選択的に最大スループットを可能にしつつ異なるサンプルサイズを可能にする。
いくつかの場合、標的、サンプル、または標識分子は、電極とバルク溶液との間に印加された電界を用いて除去し得る。使用される電界は、標的結合部分を除去するのに必要とされる電界強度未満であり得る。たとえば、チオール結合オリゴは、チオール結合オリゴよりも低い電界強度で変性されるその相補体を有し得る。そのため、ＳＡＭに影響を及ぼすことなく変性が可能である。
センサーリードの詳細
いくつかの場合、より正確なバックグラウンドレベルを達成するために、非触媒２価カチオンの結合を用いることなくバックグラウンドレベルを測定し得る。真のシグナル値を見出すために、このバックグラウンドレベルを用いてバックグラウンドからシグナルを分離し得る。いくつかの場合、１つまたは複数の標識に由来し得るシグナルの定量は、ある時間にわたる測定から得られ得る。この場合、１つまたは複数の標識は、電極対の電極に関連付けられたＳＡＭに効果的に固定的に結合し得ると共に、固定的に結合し得る１つまたは複数の標識の測定に他の方法では結合して影響を及ぼし得るバックグラウンド分子は、本質的にまったく存在しない。バックグラウンド分子は、たとえば、センサーチップ領域の洗浄により、電極対の電極を含有する容積から除去され得るか、または電極対の電極に関連付けられた電界の結果として電極対と相互作用を防止し得る。いくつかの場合、シグナルレベルは、標識タイプのアイデンティティーを表し得る。この場合、異なるトンネルコンダクタンスおよびホッピングコンダクタンスを有するいくつかの異なる標識タイプを利用し得るが、１つのタイプのみが結合し得る。電流レベルは、結合し得る標識の数を表し得る。この場合、単一のトンネルコンダクタンスまたはホッピングコンダクタンスを有し得る単一タイプの標識を利用し得ると共に、結合し得る標識の数の差から変動を生じ得る。電流は、異なるトンネルコンダクタンスまたはホッピングコンダクタンスを有し得る異なるタイプの標識の組合せから生じ得ると共に、特に標識の数が繰返し測定される場合、結合標識の異なる数から生じ得る。また、標識の数は、時間と共に増加し、電極対の表面積が固定サイズである結果として固定数になる。
いくつかの場合、トンネルノイズおよびまたはホッピングノイズ、増幅器ノイズ、アナログ−デジタル変換ノイズ、標識ヌクレオ塩基のポリメラーゼ結合の動態、ならびにＳＡＭのスタック末端に結合するポリメラーゼが結合するヌクレオチド標識のスティッキー末端の動態を含むノイズレベルを考慮し得る。
いくつかの場合、核酸配列の配列およびまたはエピジェネティクスを決定する方法において検出のためにトンネル標識およびまたはホッピング標識を利用し得るシステムは、配列およびまたはエピジェネティクスの決定に固定時間を利用し得る。他の場合、ヌクレオチドの異なるセットに対して固定し得るかまたは所望の精度レベルに対して必要に応じてユーザーにより設定可能であり得る異なる時間を使用し得る。いくつかの場合、異なる時間は、単一チップの異なる容積もしくは面積に対してシステムにより同時に使用され得るか、または異なるチップに対してシステムにより同時に、もしくは異なるチップの異なるチップの異なる領域の組合せに対して同時に使用され得る。
いくつかの場合、ヌクレオチドの異なるセットは、一貫性のあるレベルの塩濃度、ｐＨ、温度を有し得る。また、ヌクレオチドのセットを含有する緩衝液を含む他の条件または他の要素は、ヌクレオチドの異なるセットに対して同一であり得る。他の場合、ヌクレオチドの異なるセットは、異なるレベルの塩濃度、ｐＨ、温度、およびヌクレオチドの異なるセットに対してヌクレオチドのセットを含有する緩衝液を含む他の条件または他の要素を有し得ると共に、これらは、ヌクレオ塩基の異なるタイプをより良好に分離およびより良好に同定するために、結合動態の差を増加させるのに有用であり得る。
センサーリード構成可能性
いくつかの場合、単一測定を固定時間で利用し得る。この場合、電極対に関連付けられた電子センサー回路は、電極対から生じた電流を連続的に積分し得る。いくつかの場合、何回かの測定を行い得る。この場合、各測定に関連付けられる時間は、たとえば、異なるヌクレオチドの結合に関連付けられる異なる標識およびまたは異なる動態に関連付けられるより広いダイナミックレンジを可能にするために同一であり得るかまたは異なり得る。
いくつかの場合、システムおよび関連化学は、比較的より遅いがより正確な検出を行えるように構成され得る。かかるシステムは、同期化学法を利用し得る。この場合、単一塩基または単一塩基タイプの取込みに関連して、種々の異なる試薬を送達し得る。この場合のシステムは、１０百万（Ｍ）、２０Ｍ、３０Ｍ、４０Ｍ、５０Ｍ、６０Ｍ、７０Ｍ、８０Ｍ、９０Ｍ、１００Ｍ、２００Ｍ、３００Ｍ、４００Ｍ、５００Ｍ、６００Ｍ、７００Ｍ、８００Ｍ、９００Ｍ、１０億（Ｂ）、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ、１０Ｂ、１５Ｂ、２０Ｂ、またはそれを超えるセンサーを備えたチップを利用するなどにより、スループットを向上させるために大規模並列方式で作製し得る。
本明細書に提供されるように、システムおよび関連化学は、たとえば、非同期化学法を用いて、長いオリゴマーの高速検出を行うように構成され得る。いくつかまたはすべての適切な取込み可能なヌクレオチドは、ポリメラーゼ複合体に提供され得ると共に、検出器は、ヌクレオ塩基の非結合時間に関連付けられるシグナル後に結合時間に関連付けられるシグナルが続くように、かつこれらのシグナルをモニターおよび解析することにより取込み程度を決定し得るように、平均取込み速度よりも高速でデータをサンプリングし得る。いくつかの場合、取込みの速度は、触媒および非触媒の両方のカチオンを含み得る２価カチオンの混合物を用いて調整され得る。
いくつかの場合、システムの１つ以上の部分は、大規模並列高スループット部分を備えたより低速のバイオ化学を利用し得ると共に、システムのいくつかの他の部分は、長いオリゴマーの高速検出を行えるように構成され得るバイオ化学を利用し得る。これにより、スキャフォールドおよびスキャフォールドに書き込むデータを同時に生成し得るように、多数のショートリードおよび少数のロングリードの両方を提供するシステムが提供される。
いくつかの場合、システムの１つ以上の部分は、大規模並列高スループット部分を備えたより低速のバイオ化学を利用し得ると共に、システムのいくつかの他の部分は、マルチセグメント検出またはマルチプルスキップリード法シーケンシングを行えるように構成され得るバイオ化学を利用し得る。それにより、何百または何千もの塩基を何秒または何分かの時間で取り込み得るように、およびその後、「低速の」バイオ化学の時間が続くように、オリゴの部分を「低速の」バイオ化学を用いて読み取り得ると共に、次いで適切なヌクレオ塩基のセットを提供し得る。こうして、同一オリゴ上の何百または何千もの塩基によって分離され得るリードを提供することにより、スキャフォールドおよびスキャフォールドに書き込むデータを同時に生成し得るように、スキップリード法を利用し得る多数のショートリードおよび少数の核酸の両方を提供するシステムが提供される。
いくつかの場合、標的化シーケンシングを用いてまたはショットガンシーケンシングを用いて、特定位置でエピジェネティクスを決定する任意選択的なフィードバックを行って、システムの異なる部分または異なる時間でシーケンシングとエピジェネティクス検出との組合せを利用し得る。特に、標的サンプルのいくつかの部分は、標的サンプルの他の部分、たとえば遺伝子プロモータ領域、またはイントロンもしくはエキソンもしくはゲノムの他の部分であり得る他の特異的標的領域から分離され得ると共に、エピジェネティック決定を用いることなく行われ得る。
いくつかの場合、デバイスの異なる領域またはデバイスの１つ以上の領域において異なる時間で異なるリードアウトスキームを使用し得る。いくつかの場合、１つ以上の領域でまたは１回以上で同時シングルポイントリードアウトおよび動態を使用し得る。これにより、配列およびまたは１つのタイプのエピジェネティクスを決定し得る。いくつかの場合、複数のヌクレオチドセットを用いたマルチポイント検出を１つ以上の領域でまたは１回以上で使用し得る。マルチポイント検出は、デバイスの１つ以上の領域でまたは１回以上で使用し得る非同期化学法リードアウトと組み合わせて使用し得る。
いくつかの場合、リードアウトパターンおよびまたはタイミングの変化を可能にするために、チップ内のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または他のプログラマブルロジックを使用し得る。
いくつかの場合、活性部位の位置を記憶するために記憶デバイスを使用し得る。この場合、メモリーは、いずれの位置がアクティブであるか決定するためにリードアウトプロセスの一部として使用され得る。記憶デバイスは、フラッシュメモリーまたはラムとして選択され得る。記憶デバイスは、オンボードマイクロプロセッサーにより使用され得るか、または読み取るセンサー位置のパターンおよびもしくは読み取らない位置のパターンを決定するためにＦＰＧＡもしくは他のプログラマブルロジックと組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、異なるパターンは、異なる領域で利用され得る。この場合、たとえば、一領域を同期化学法リードに利用し、他の領域を非同期化学法リードに使用するとき、異なるタイミングをリード間で利用し得る。
いくつかの場合、トンネルセンサーからのデータ収集は、遅すぎてヌクレオチド結合時間を決定し得ない速度で収集され得ると共に、いくつかのヌクレオチド結合イベントおよび結合イベント間の介在時間からの電流レベルをさらに平均化し得る。この時間にわたる電流は、たとえば、積分増幅器を用いてハードウェアで平均化され得る。さらなる平均化、したがってより良好なシグナル対ノイズを提供するために、多重データ取得を行い得る。動態速度は、部分的にｋｏｎおよびｋｏｆｆが分かれば決定され得るため、結合されたおよび結合したヌクレオ塩基のタイプは、提供されたヌクレオ塩基のセットおよび関連標識と組み合わせて平均電流レベルにより決定され得る。かかる方法は、塩基の同定および任意選択的にサンプルポリヌクレオチドの塩基のエピジェネティック修飾の同定を可能にしつつ、データの最小限の生成を可能にし得る。
データ収集速度をヌクレオチド結合動態よりも速いことができる場合、各結合イベントで何回かのデータ取得を行って、ヌクレオ塩基の取込みが行われる前に各塩基位置で１つ以上の結合イベントを観測し得る。これは、動態情報のより良好な決定を直接可能し得る。いくつかの場合、データを連続的に取得するようにシステムを構成し得る。このシステムは、結合イベント時、結合イベント間、および取込みイベント時のデータ取得を含み得る。
いくつかの場合、例として、約３分間のシーケンシング化学サイクル時間を有することが望まれ得る。このサイクルは、洗浄、ヌクレオチド添加、Ｍｇ添加、およびリード時間を含み得る。いくつかの場合、ディフェージングに対するシステムの感受性の欠如に起因して、より速いサイクル時間が望まれかつ達成され得る。
いくつかの場合、所望のサイクル時間を達成するために、結合イベント間の時間もしく結合時間ｔｂの両方、結合イベントの長さ、または解離時間ｔｄを調整し得る。ｔｂは、主にヌクレオチド濃度を調整することにより、ｔｄは、Ｃａと他の２価カチオンとの比を調整することによる。したがって、約１秒の時間を積分時間に選択し得るいくつかの場合、この時間をセンサー上の１００ｒｏｗに対応するマルチプレックスレベル１００と組み合わせたとき、全リードアウト時間は、約１００秒となり得るため、約３分間の全化学サイクル時間の利用時、化学サイクル時間の他の部分の類似量が残る。
いくつかの場合、リードに対して特定の精度を有することが望まれ得る。いくつかの場合、いくつかのヌクレオチド結合時間からの測定を平均化することが望まれ得る。かかる所望の数は、５０パーセントのデューティーサイクルで１０であり得るため、１０Ｈｚの結合速度となる。他の場合、より良好な精度が必要とされるかまたは望まれるとき、ヌクレオチド結合動態は、より速いハイブリダイズ結合を利用することにより、数回の読取りを行うことにより、または積分時間を延長することにより増加させ得る。
いくつかの場合、ヌクレオチド結合は、直接測定され得ない。代わりに、測定は、トンネル標識ハイブリダイズ結合により行われ得る。ハイブリダイズ結合時間の長さは、温度、塩濃度、ｐＨ、電極電位、スティッキー末端長さ、およびスティッキー末端配列（ＧＣ対７−デアザアデニン）の影響を受け得る。さらなる場合、ハイブリダイズイベント間の時間も、それほどでもないが、前の項目のすべてによる影響を受け得ると共に、ＳＡＭ密度およびリンカー長および剛性による影響も受け得る。いくつかの場合、それにより、ハイブリダイズ結合時間およびハイブリダイズ結合イベント間の時間を調整し得る。
いくつかの場合、複数のハイブリダイズ結合イベント（１ヌクレオチド結合イベント当たり）を平均化し得るタイミングサイクルを利用し得る。たとえば、５０％のデューティーサイクルでハイブリダイズ結合イベントの数を１０とすると、平均ヌクレオチド結合イベントに関連付けられる各５０ｍｓの時間内に１０イベントが行われることになり、ハイブリダイズイベントは、平均２．５ｍｓを要することになる。したがって、１ｎＡの連続トンネル電流をもたらし得るトンネルコンダクタンスを有する標識を使用したとき、１秒間の積分時間のシグナルは、２５０ｐＣになり得る。
サンプル調製
いくつかの場合、任意のシーケンシング調製ステップ前に、トンネル検出器およびまたはホッピング検出器を含み得るシステムは、たとえば、フローサイトメトリーを用いて、サンプルから１つ以上の細胞を単離および分離し得る。１つ以上の細胞は、循環腫瘍細胞、生細胞、特異的染色細胞、またはそれらの組合せを含み得る。染色細胞は、蛍光染色であり得る染色を含み得る。染色液は、トンネル標識およびまたはホッピング標識を含み得る。染色液は、電気化学標識を含み得る。いくつかの場合、標的特異的プルアウト法を使用するプルアウト法、たとえば抗体磁性ビーズ分離法またはアプタマー単離法を用いて、標的細胞を単離し得る。次いで、個別の細胞または細胞のセットをシーケンシングし得る。この場合、ＤＮＡゲノムおよびまたはＲＮＡトランスクリプトームをシーケンシングし得る。
いくつかの場合、ＲＮＡおよびもしくはＤＮＡの特異的配列またはＤＮＡもしくはＲＮＡの特異的タイプ、たとえばｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡのいずれかの富化を行い得る。特異的標的は、単離された細胞から単離され得る。ＲＮＡおよびもしくはＤＮＡの特異的配列、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの特定のタイプ、たとえば、ｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡの富化を行い得る。次いで、単離された核酸鎖をシーケンシングし得る。ＡＲ−Ｖ７などの特異的転写物を単離および定量し得るため、標的転写物の確認、さらには任意のエピジェネティック修飾、突然変異、またはスプライス変異の定量および検出が可能であり、これにより、腫瘍細胞の組織源タイプの決定が可能である。かかる定量工程は、シーケンシング、デジタルＰＣＲ、ｑＰＣＲ、等温増幅、または任意の他の適切な標的定量プロセスから得られ得る。
いくつかの場合、細胞分離後、すべてのＤＮＡ、すべての核酸鎖、またはすべてのＲＮＡに対して富化工程または濃縮工程を行い得る。富化工程または濃縮工程は、特異的標的単離工程の代わりに行い得る。富化工程または濃縮工程は、特異的単離工程に加えて行われ得る。富化工程または濃縮工程は、たとえば、特異的標的に対して非常に高い感度を可能にし、一方、完全ゲノムおよびまたは完全トランスクリプトームは、特異的標的のシーケンシングよりも低いカバレッジであり得る。いくつかの場合、ゲノムシーケンシングおよびまたはトランスクリプトームは、同一のチップで他の定量技術と潜在的に組み合わされ得る。
同様に、後続のシーケンシング標的化突然変異、たとえば黒色腫に関連付けられたＢＲＡＦ、または他の遺伝病との関連の結果として標的とされる他の突然変異をキャプチャーするために、循環遊離ＤＮＡのプルアウトを使用し得る。
いくつかの場合、酵素とリンカーとが結合一体化されるプロセス時の酵素とリンカーとの間の１対１対応をより良好に保証するために、酵素の少なくとも一部を含むタンパク質の第１の末端にリンカーを結合させることにより、リンカーと酵素との間の１対１対応を可能にし得る。
いくつかの場合、リンカー、磁性または常磁性のビーズまたはリンカーは、物理的距離の結果として１つのみの対応する部分のみが結合し得るように平均間隔で表面に可逆結合され得る。これは、等しい数の結合部分および非結合部分を提供することにより、またはより多くの非結合部分を提供した後に非結合部分を除去することにより、ポアソン分布を超え得る１対１の結合比を提供し得る。結合は、溶液中で起こり得る。この場合、より低い濃度を有する部分のほとんどがより高い濃度で部分の単一部分に結合し得るように、１つの部分は、より高い濃度で存在し得る。次いで、より低い濃度の部分は、表面に可逆結合され得る。表面は、磁性ビーズの表面であり得ると共に、非結合のより高い濃度の部分から分離された状態であり得る。
いくつかの場合、酵素、磁性、常磁性の粒子またはビーズまたはリンカーを含み得る部分は、エマルジョン状態に形成され得る。エマルジョンは、エマルジョンの形成前に酵素活性を可能にしない条件下で形成され得る。たとえば、ニック部位を有するプライムされた核酸環状体または二本鎖核酸環状体は、酵素または磁性もしくは常磁性の粒子にあらかじめ結合された状態で提供され得る。この場合、１対１の結合は必要とされないが、環状核酸ポリマーを有する単一部分に有利であるポアソン分布を利用し得る。油中水型エマルジョンであり得るエマルジョンは、水性エマルジョン中に、ヌクレオチド、酵素活性に適した緩衝液、およびプライマーまたは核酸ポリマー鎖のニック鎖の伸長に有用な酵素をさらに含み得る。酵素を１つ以上の環状核酸ポリマーの１つに結合する場合、それは、ポアソン分布が各エマルジョンで単一酵素に有利になるような濃度で提供され得る。次いで、伸長が進行するように、温度を含み得る条件を変更し得る。酵素は、ローリングサークル増幅時にエマルジョン内のヌクレオチドが効果的に十分に利用され得る時間まで、ローリングサークル増幅を行い得る。そのため、エマルジョンに提供された環状核酸ポリマーの数にかかわらず、エマルジョンに結合された物理的ブロッカーが提供される。物理的ブロッカーのサイズは、各エマルジョン中のエマルジョンサイズの変動およびヌクレオチド濃度変動に依存して異なり得る。
さらなる場合、ライブラリー調製法は、二次構造の形成を最小限に抑えるために、相補的ｃＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖、またはＤＮＡ鎖を生成するプロセスを含み得る。ライブラリー調製法は、ユニバーサルプライマー領域をライゲートするプロセスを含み得る。この領域は、ニック部位４５０を有し得る図４に示されるようなヘアピン構造４２０であり得ると共に、ニックは、ニッカーゼまたは類似の酵素によりヘアピン構造４２０中に形成され得る。これにより、ニック部位４５０に結合するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素の結合が可能になり、また結合し得るかまたは個別に作用し得る固有鎖置換の結果としてまたはヘリカーゼの作用の結果として、塩基の取込みおよび非ニック核酸ポリマーに沿った転座が可能になるため、環化を用いることなくサンプル鎖４１０の再シーケンシングが可能になる。いくつかの場合、ヘアピン構造４２０は、ユニバーサルプライマーのセットまたはより大きいセットを必要とすることなく異なる標的配列への結合を可能にするために１つ以上のイノシン４６０を含み得る。いくつかの場合、ポリメラーゼまたはリガーゼがイノシンに結合するより低い活性およびまたはより低い特異性を有し得るとき、ヘアピン構造の一部分は、まさに酵素の活性部位の塩基が天然塩基のセット４４０Ａおよび４４０Ｂの１つになり得るように、ユニバーサルプライマーのセットを含み得る。さらなる場合、ヘアピンユニバーサルプライマーは、ヘアピンユニバーサルプライマーのヘアピン部分の湾曲による立体障害に起因した活性低下を伴うことなくリガーゼが機能するのに十分な程度に長いことができ、かつポリメラーゼがヘアピンユニバーサルプライマーの湾曲に起因した活性低下を伴うことなくユニバーサルプライマーを伸長させるのにも同様に十分な程度に長くいことができる相補的塩基の長さを有し得る。
追加のシステムコンポーネント
いくつかの場合、ポンプまたは他の正圧源もしくは負圧源を用いて、ポリメラーゼを含有する溶液を電極ギャップに移動させ得る。ポリメラーゼを狭いチャネルに固定またはトラップした後、ＤＮＡまたは他の溶液を添加し得る。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、かかる実施形態が例として提供されているにすぎないことは当業者に明らかであろう。現時点では、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多くの変形形態、変更形態、および置換形態が考えられよう。本発明を実施する際、本明細書に記載される本発明の実施形態の各種の代替形態を利用し得ることを理解すべきである。以下の請求項が本発明の範囲を規定すること、かつこれらの請求項およびそれらの均等物の範囲内の方法および構造がそれらにより包含されることが意図される。

Claims (28)

  1. ａ．基材上の２つの電極に隣接するポリメラーゼを用いて、サンプル核酸のインテロゲートされる塩基に相補的なヌクレオチドを結合させることであって、前記ヌクレオチドは、それに装着されたトンネル標識を有する、前記ヌクレオチドを結合すること、
    ｂ．前記２つの電極への前記トンネル標識の局在化によって引き起こされる前記２つの電極間のトンネル電流を測定すること、
    ｃ．前記トンネル電流の測定の関数として、インテロゲートされる前記塩基への前記相補的塩基の前記結合からヌクレオチドを同定すること
    を含む方法。
  2. 前記トンネル標識は、前記２つの電極間のギャップのサイズよりもわずかに大きい、請求項１に記載の方法。
  3. 前記トンネル標識は、双性イオン性化合物を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記トンネル標識は、核酸鎖を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記核酸鎖は、１０塩基を超える長さである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記核酸鎖は、二本鎖部分と一本鎖部分とを有する、請求項４に記載の方法。
  7. 前記ポリメラーゼを前記２つの電極間の誘電体に結合することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記ポリメラーゼを前記２つの電極の１つに結合することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ギャップは、前記ポリメラーゼの幅よりも大きいより広い部分と、前記ポリメラーゼのサイズよりも小さいより小さい部分とを有する、請求項１に記載の方法。
  10. セルフアセンブル単層は、前記電極に結合される、請求項１に記載の方法。
  11. 前記セルフアセンブル単層は、チオールによって前記電極に結合される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記セルフアセンブル単層は、少なくとも部分的に、前記トンネル標識核酸鎖の少なくとも一部に結合し得る核酸を含む、請求項４または１０に記載の方法。
  13. 前記結合は、一過性である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記一過性結合は、トンネル標識が装着された前記ヌクレオ塩基の結合に起因して、そうでないときに高い局所濃度なしで起こるであろうよりも頻繁に起こり得る、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記トンネル標識は、前記ヌクレオ塩基のリボースの５’位に結合される、請求項１に記載の方法。
  16. 前記トンネル標識は、前記ヌクレオ塩基の塩基に結合される、請求項１に記載の方法。
  17. 前記ヌクレオ塩基は、ターミネーターをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  18. 前記ターミネーターは、リボースの３’位に結合される、請求項１８に記載の方法。
  19. 同期化学法である、請求項１５に記載の方法。
  20. ａ．２つの電極は、非伝導性ギャップによって分離されて基材上に配設されていること、
    ｂ．前記２つの電極および前記ギャップは、前記２つの電極の近傍にポリメラーゼを収容するように構成されていること、
    ｃ．前記２つの電極および前記ギャップは、サンプル核酸のインテロゲートされる塩基に相補的である、トンネル標識を有するヌクレオチドの取込みおよび結合の少なくとも１つに起因するトンネル電流を検出するようにさらに構成されていること
    を含む機器。
  21. 前記ポリメラーゼが前記非伝導性ギャップ内に配設されるようにさらに構成されており、前記ギャップは、前記電極間において１０ｎｍ以上の深さで下方エッチングされている、請求項２０に記載の機器。
  22. 非伝導性ギャップサイズが前記ポリメラーゼのサイズよりも小さいようにさらに構成され、かつ前記ポリメラーゼが前記非伝導性ギャップの上に配設されるように構成されており、前記非伝導性ギャップは、１０ｎｍ以下の深さにエッチングされ得る、請求項２１に記載の機器。
  23. 前記非伝導性ギャップは、より広い部分とより狭い部分とを有する、請求項２０に記載の機器。
  24. ａ．基材上の２つの電極に隣接するポリメラーゼを用いて、ヌクレオ塩基であって、それに装着されたトンネル標識を有し、サンプル核酸のインテロゲートされる塩基に相補的であるヌクレオ塩基を結合すること、
    ｂ．前記２つの電極への前記トンネル標識の局在化によって引き起こされる前記２つの電極間のトンネル電流およびホッピング電流の少なくとも１つの組合せを測定すること、
    ｃ．電子電流測定に基づいて前記ポリヌクレオチドの一本鎖部分のマッチングヌクレオ塩基を同定すること
    を含む方法。
  25. 核酸ポリマーに関連付けられた生物学的情報を見出す方法であって、
    ａ．基材上の２つの電極間に前記核酸ポリマーを局在化することであって、水素結合によって達成される、局在化すること、
    ｂ．前記２つの電極間にバイアス電圧を印加すること、
    ｃ．前記２つの電極間のトンネル電流を測定すること、
    ｄ．コンダクタンスに基づいて前記生物学的情報を決定すること
    を含む方法。
  26. 前記核酸ポリマーの長さは、前記２つの電極間のギャップのサイズ以下である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記核酸ポリマーの長さは、前記２つの電極間のギャップのサイズより大きく、前記オリゴの一部分は、前記電極の一方または両方にハイブリダイズされ、前記オリゴの一部分は、前記２つの電極間のギャップにまたがる、請求項２５に記載の方法。
  28. 特定の測定されたコンダクタンスは、前記オリゴの特定の部位のメチル化を表す、請求項２５に記載の方法。
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