ES2877193T3

ES2877193T3 - Sistemas y métodos para la medición y secuenciación de biomoléculas

Info

Publication number: ES2877193T3
Application number: ES17790485T
Authority: ES
Inventors: Masoud Vakili; Hisao Kawasaki; Kazusuke Mihara; Mark F Oldham; Eric S Nordman; Timothy M Woudenberg; Gaurav Goyal; Toshihiko Honkura; Sam Woo
Original assignee: Quantum Biosystems Inc
Current assignee: Quantum Biosystems Inc
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2037-04-27
Also published as: CN109891233B; CN115595360A; WO2017189930A1; KR20190075010A; EP3449247A1; CN109891233A; EP3449247A4; EP3449247B1; CA3023577A1; JP2019515317A; US20190169684A1

Abstract

Un método que comprende: a. usar una polimerasa adyacente a dos electrodos en un sustrato para unir un nucleótido que es complementario de una base que se está interrogando de una muestra de ácido nucleico, teniendo el nucleótido un marcadores de efecto túnel unido al mismo, en donde el marcadores de efecto túnel es algo más grande que el tamaño de la separación entre los dos electrodos, b. medir una corriente de efecto túnel entre los dos electrodos producida por la localización del marcador de efecto túnel hacia los dos electrodos, c. identificar un nucleótido a partir de la unión de la base complementaria de la base que se está interrogando, en función de la medición de la corriente de efecto túnel.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistemas y métodos para la medición y secuenciación de biomoléculas

Referencia cruzada

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de patente de Estados Unidos n.° 62/328.527, presentada el 27 de abril de 2016, solicitud provisional de patente de Estados Unidos n.° 62/385.782, presentada el 9 de septiembre de 2016 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos n.° de 62/359.648, presentada el 7 de julio de 2016.

Antecedentes

Las nuevas investigaciones siguen aumentando nuestra comprensión de la información genética y suscita desafíos acerca de cómo detectar la secuencia del ácido nucleico y la epigenética.

Existen desafíos en términos de medición y extracción de datos rápidos. Algunos métodos se basan en la medición de la señal óptica a través de bases modificadas. Algunos métodos se basan en la medición de la corriente de iones y en determinadas modificaciones de las bases nativas. Sin embargo, estos métodos pueden carecer de velocidad y capacidad, y pueden tener errores tales como errores de fase, fototoxicidad, deleciones y repetidos errores en las bases, y errores de recuento de homopolímeros. Además, muchos métodos pueden requerir la amplificación clonal o del genoma completo, dando como resultado un sesgo en la amplificación. Ningún sistema puede determinar directamente de forma concurrente las secuencias de ADN y ARN y las epigenéticas. El documento EP3315461 A1 enseña un electrodo de micropocillo, que comprende uno o más primeros electrodos; uno o más segundos electrodos dispuestos cada uno opuestos a cada primer electrodo, en donde se proporciona un canal entre cada primer electrodo y el segundo electrodo opuesto al anterior, y el canal tiene al menos un extremo en comunicación con una cámara; y uno o más electrodos de guía localizados en la cámara para su uso en la secuenciación del ADN. El documento WO 2015/170784 A1 se refiere a dispositivos de nanoelectrodos para determinar, por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos, en donde los nanoelectrodos tienen diferentes niveles de Fermi y la medición se lleva a cabo mediante una nanoseparación de tamaño definido. El documento WO 2016/010975 describe un método para secuenciar ácido nucleico proporcionando una polimerasa ligada a un sensor de carga de un soporte sólido y proporcionando nucleótidos que pueden detectarse por el sensor de carga y a continuación detectar la incorporación de los nucleótidos a una hebra nascente complementaria del molde de ácido nucleico. Medir la corriente eléctrica que pasa a través del polímero de muestra tras el flujo del polímero de muestra a través del canal y la nanoseparación. D2 no usa una polimerasa.

Sumario

Se reconoce en el presente documento una necesidad de alto rendimiento y medición rápida de las bases de ADN nativas con una alta precisión y costes bajos.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan métodos de secuenciación de polinucleótidos midiendo la corriente de efecto túnel de las bases con marcadores del efecto túnel con alto rendimiento en un sistema masivamente paralelo en una microplaca.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan sistemas para la secuenciación de moléculas de polinucleótidos tales como ADN. Los sistemas pueden comprender dos electrodos dispuestos sobre un sustrato separado por una separación no conductora. Los electrodos y la separación pueden configurarse para acomodar una polimerasa en la proximidad de los dos electrodos. Los electrodos y la separación pueden configurarse además para detectar un electrón o la corriente de efecto túnel del hueco cuando al menos un nucleótido que comprende un marcador de efecto túnel se incorpora o se une a cerca de una porción monocatenaria de un polinucleótido en presencia de la polimerasa.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan un aparato que comprende al menos dos electrodos dispuestos sobre un sustrato separado por una separación no conductora como se detalla adicionalmente en las reivindicaciones adjuntas. Los electrodos y la separación pueden configurarse para acomodar una polimerasa en la proximidad de los dos electrodos. Los electrodos y la separación pueden adaptarse para detectar la corriente de efecto túnel de un electrón o hueco durante la incorporación y/o la unión de un nucleótido a un polinucleótido en presencia de la polimerasa. El nucleótido puede comprender un marcador del efecto túnel. El nucleótido puede incorporarse o unirse a la porción monocatenaria del polinucleótido.

En algunas realizaciones, se puede controlar la cinética de la unión y liberación de los nucleótidos. Se puede usar la cinética de unión para proporcionar información acerca de, por ejemplo, la composición epigenética de una hebra diana de ácidos nucleicos.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan un método para determinar información biológica en un oligonucleótido. El método puede comprender situar el oligonucleótido entre dos electrodos sobre un sustrato, aplicar una tensión de polarización entre los dos electrodos, medir una corriente entre los dos electrodos, calcular la conductancia o la resistencia del oligonucleótido, y determinar la información biológica basada en la conductancia o la resistencia.

Un aspecto de la presente divulgación proporciona un método para secuenciar una molécula de ácido nucleico, que comprende: (a) proporcionar un sustrato que comprende al menos dos electrodos separados por una separación, en donde el sustrato es sólido; (b) dirigir al hueco una mezcla de reacción que comprende uno o más tipos de nucleótidos marcados, y los reactivos necesarios para una reacción de amplificación del ácido nucleico; (c) someter al menos una porción de una mezcla de reacción a una reacción de amplificación del ácido nucleico en condiciones que sean suficientes para dar como resultado un producto de amplificación de una molécula de ácido nucleico, cuyo producto de amplificación puede incluir al menos uno de uno o más tipos de nucleótidos marcados; (d) usar al menos dos electrodos para detectar al menos una señal eléctrica procedente de un producto de amplificación, que puede ser resultado de que se está extendiendo un producto de amplificación en una separación, o puede ser que se dirige un producto de amplificación a través de la separación, en donde al menos una señal eléctrica comprende una corriente de efecto túnel; y (e) identificar una secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico o una porción de la misma basándose en una señal eléctrica detectada en (d).

En algunas realizaciones, al menos una señal eléctrica es al menos en parte una corriente no de Faraday. En algunas realizaciones, al menos una señal comprende una pluralidad de señales. En algunas realizaciones, al menos una señal puede comprender una corriente de efecto túnel, o una corriente de efecto túnel y una corriente de salto electrónico. En algunas realizaciones, se pueden marcar uno o más tipos de nucleótidos marcados con una o más moléculas y/u otros restos que pueden facilitar la formación de una corriente de efecto túnel o una corriente de salto electrónico. En algunas realizaciones, una o más moléculas y/u otros restos pueden comprender una porción conductora. En algunas realizaciones, la porción conductora permite el paso de una corriente eléctrica a su través cuando una o más moléculas u otros restos se someten a un potencial. En algunas realizaciones, una corriente eléctrica puede ser una corriente continua (CC). En algunas realizaciones, una corriente eléctrica puede ser una corriente alterna (CA). En algunas realizaciones, una molécula puede comprender un marcador de efecto túnel. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse a la porción de una base de un nucleótido dado uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse a una cadena de fosfato de un tipo de nucleótido dado de uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse de forma reversible a un tipo de nucleótido dado de uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, uno o más tipos de nucleótidos marcados comprenden al menos dos tipos diferentes de tipos de nucleótidos o modificaciones de los mismos. En algunas realizaciones, cada tipo de uno de al menos dos tipos de nucleótidos o modificaciones de los mismos puede estar marcado con un marcador de efecto túnel diferente. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel comprende un compuesto de un ion híbrido. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede comprender una secuencia de ácido nucleico. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico más de o igual a aproximadamente 10 bases. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico puede comprender una porción bicatenaria y una porción monocatenaria. En algunas realizaciones, al menos uno de los uno o más tipos de nucleótidos marcados puede comprender un terminador. En algunas realizaciones, un método comprende además eliminar un terminador de un nucleótido marcado dado incorporado en un producto de amplificación tras la detección de una señal eléctrica. En algunas realizaciones, el marcador de efecto túnel puede unirse a un terminador. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse de forma reversible a un terminador. En algunas realizaciones, se puede detectar al menos una señal eléctrica en una relación de señal a ruido mayor o igual a aproximadamente 100 a 1. En algunas realizaciones, una relación señal a ruido puede ser mayor o igual a aproximadamente 1000 a 1. En algunas realizaciones, al menos una señal eléctrica puede detectarse en tiempo real. En algunas realizaciones, los reactivos pueden comprender una enzima. En algunas realizaciones, una enzima puede tener actividad polimerasa de ácido nucleico. En algunas realizaciones, una enzima puede ser una polimerasa. En algunas realizaciones, una polimerasa puede comprender una polimerasa de un ácido desoxirribonucleico (ADN). En algunas realizaciones, una polimerasa puede comprender una polimerasa de un ácido ribonucleico (ARN). En algunas realizaciones, un método puede comprender además disponer una polimerasa en un entorno fluido de al menos dos electrodos. En algunas realizaciones, un método puede comprender además disponer una polimerasa en un dieléctrico entre al menos dos electrodos. En algunas realizaciones, un método puede comprender además disponer una polimerasa sobre una superficie de al menos uno de al menos dos electrodos. En algunas realizaciones, un método puede comprender además disponer una polimerasa sobre la parte superior de al menos dos electrodos. En algunas realizaciones, una polimerasa puede facilitar la incorporación de al menos uno de uno o más tipos de nucleótidos marcados en un producto de amplificación. En algunas realizaciones, los reactivos pueden comprender iones. En algunas realizaciones, los iones pueden comprender cationes. En algunas realizaciones, los cationes pueden comprender Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los cationes pueden comprender cationes catalíticos, cationes no catalíticos, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, una anchura de separación o distancia puede ser mayor o igual a aproximadamente 1 nanómetro (nm). En algunas realizaciones, una anchura de separación o distancia puede ser menor o igual a aproximadamente 20 nm. En algunas realizaciones, una anchura de separación o distancia puede ser mayor de 20 nm. En algunas realizaciones, un canal de flujo puede tener una profundidad mayor o igual a aproximadamente 100 nm. En algunas realizaciones, un sensor con al menos dos electrodos puede tener una primera porción y una segunda porción contiguas y debajo de una primera porción. En algunas realizaciones, una primera porción puede tener una primera anchura, y una segunda porción puede tener una segunda anchura más pequeña que la primera anchura. En algunas realizaciones, un sensor puede tener una forma de sección transversal de un cono invertido. En algunas realizaciones, una reacción de amplificación de un ácido nucleico puede comprender una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En algunas realizaciones, una reacción de amplificación de un ácido nucleico puede comprender una reacción de amplificación con desplazamiento de cadena (s Da ). En algunas realizaciones, una reacción de amplificación de un ácido nucleico puede comprender una reacción de extensión de un ácido nucleico. En algunas realizaciones, un método puede comprender además, repetir un conjunto de etapas que pueden incluir la unión, detección e incorporación de nucleótidos marcados como se describe en las etapas (c)-(e) hasta la identificación de al menos aproximadamente 5 bases de una muestra de una molécula de ácido nucleico o una porción de la misma. En algunas realizaciones, un sustrato puede comprender una pluralidad de pares de electrodos, configurado cada par para identificar secuencias de ácidos nucleicos de una muestra diferente de una molécula de ácido nucleico o una porción de la misma. En algunas realizaciones, se puede identificar una secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico o una porción de la misma con una precisión de al menos aproximadamente el 90 %. En algunas realizaciones, la precisión puede ser al menos de aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, se puede identificar una secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico o una porción de la misma con una precisión de al menos aproximadamente el 90 % sobre un intervalo de al menos aproximadamente 100 bases de ácidos nucleicos contiguos de una molécula de ácido nucleico.

Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un sistema para secuenciar una molécula de ácido nucleico que comprende: un sustrato que comprende al menos dos electrodos separados por una separación como parte de un canal de flujo, en donde el sustrato puede ser sólido; y un procesador informático acoplado operativamente a un sustrato y programado para: (a) dirigir a los sensores de un par de electrodos o a un conjunto de sensores de un par de electrodos una mezcla de reacción que comprende uno o más tipos de nucleótidos marcados, y los reactivos necesarios para una reacción de amplificación del ácido nucleico; (b) someter al menos una porción de una mezcla de reacción a una reacción de amplificación del ácido nucleico en condiciones que sean suficientes para dar como resultado un producto de amplificación de una molécula de ácido nucleico, cuyo producto de amplificación puede incluir al menos uno de uno o más tipos de nucleótidos marcados; (c) usar al menos dos electrodos para detectar al menos una señal eléctrica procedente de un nucleótido marcado unido o un producto de amplificación ya que un producto de amplificación puede generarse y/o dirigirse a través de una separación, en donde al menos una señal eléctrica puede comprender una corriente de efecto túnel; y (d) identificar una secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico o una porción de la misma basada en una señal eléctrica detectada en (c).

En algunas realizaciones, al menos una señal eléctrica puede ser al menos en parte una corriente no de Faraday. En algunas realizaciones, al menos una señal puede comprender una pluralidad de señales. En algunas realizaciones, al menos una señal eléctrica puede comprender una corriente de efecto túnel. En algunas realizaciones, se pueden marcar uno o más tipos de nucleótidos marcados con una molécula que puede facilitar la formación de una corriente de efecto túnel o una corriente de salto. En algunas realizaciones, un marcador puede comprender una porción conductora. En algunas realizaciones, la porción conductora puede permitir el paso de una corriente eléctrica a su través cuando un marcador puede someterse a un potencial. En algunas realizaciones, una corriente eléctrica puede ser una corriente continua (CC). En algunas realizaciones, una corriente eléctrica puede ser una corriente alterna (CA).

En algunas realizaciones, una corriente eléctrica puede ser una combinación de una corriente continua y una corriente alterna. En algunas realizaciones, una molécula puede comprender un marcador de efecto túnel. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse a la porción de una base de un tipo de nucleótido dado de uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse a una cadena de fosfato de un nucleótido dado de uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse a cualquier posición de una ribosa u otra molécula de estructura principal de un nucleótido dado de un conjunto de uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse de forma reversible a un nucleótido dado de uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, uno o más tipos de nucleótidos marcados pueden comprender al menos dos tipos diferentes de nucleótidos o modificaciones de los mismos. En algunas realizaciones, cada tipo de uno de al menos dos tipos de nucleótidos o modificaciones de los mismos puede estar marcado con un marcador de efecto túnel diferente.

En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel comprende un compuesto de un ion híbrido. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede comprender una secuencia de ácido nucleico. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico más de o igual a aproximadamente 10 bases. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico puede comprender una porción bicatenaria y una porción monocatenaria. En algunas realizaciones, uno o más tipos de nucleótidos marcados puede comprender un terminador. En algunas realizaciones, el marcador de efecto túnel puede unirse a un terminador.

En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse de forma reversible a un terminador. En algunas realizaciones, se puede detectar al menos una señal eléctrica con una relación señal a ruido mayor o igual a aproximadamente 100 a 1. En algunas realizaciones, una relación señal a ruido puede ser mayor o igual a aproximadamente 1000 a 1. En algunas realizaciones, al menos una señal eléctrica puede detectarse en tiempo real. En algunas realizaciones, un reactivo puede comprender una enzima. En algunas realizaciones, una enzima puede tener actividad polimerasa de ácido nucleico. En algunas realizaciones, una enzima puede ser una polimerasa. En algunas realizaciones, una polimerasa puede comprender una ADN polimerasa. En algunas realizaciones, una polimerasa puede comprender una ARN polimerasa. En algunas realizaciones, se puede disponer una polimerasa en un entorno fluido de al menos dos electrodos. En algunas realizaciones, se puede disponer una polimerasa en un dieléctrico entre al menos dos electrodos. En algunas realizaciones, se puede disponer una polimerasa sobre una superficie de al menos uno de al menos dos electrodos. En algunas realizaciones, se puede disponer una polimerasa sobre la parte superior de al menos dos electrodos.

En algunas realizaciones, una polimerasa puede facilitar la unión y/o la incorporación de al menos uno de uno o más tipos de nucleótidos marcados en un producto de amplificación. En algunas realizaciones, el reactivo puede comprender iones. En algunas realizaciones, los iones pueden comprender cationes. En algunas realizaciones, los cationes pueden comprender Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los cationes pueden comprender cationes catalíticos, cationes no catalíticos, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un hueco puede ser mayor o igual a aproximadamente 1 nanómetro (nm). En algunas realizaciones, una anchura de separación o distancia puede ser menor o igual a aproximadamente 20 nm. En algunas realizaciones, un canal de flujo tiene una profundidad mayor o igual a aproximadamente 100 nm.

En algunas realizaciones, un sensor que comprende un par de electrodos puede tener una primera porción y una segunda porción contiguas y por debajo de una primera porción. En algunas realizaciones, una primera porción puede tener una primera anchura, y una segunda porción puede tener una segunda anchura más pequeña que la primera anchura. En algunas realizaciones, una polimerasa puede tener un tamaño que sea mayor que la segunda anchura y más pequeño que la primera anchura. En algunas realizaciones, un sensor que comprende un par de electrodos puede tener una forma de la sección transversal de un cono invertido.

En algunas realizaciones, una reacción de amplificación de un ácido nucleico puede comprender una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En algunas realizaciones, una reacción de amplificación de un ácido nucleico puede comprender una reacción de amplificación con desplazamiento de cadena (SDA). En algunas realizaciones, la reacción de amplificación del ácido nucleico puede comprender una primera reacción de extensión.

En algunas realizaciones, se puede identificar una secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico o una porción de la misma con una precisión de al menos aproximadamente el 90 %. En algunas realizaciones, la precisión puede ser al menos de aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, se puede identificar una secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico o una porción de la misma con una precisión de al menos aproximadamente el 90 % sobre un intervalo de al menos aproximadamente 100 bases de ácidos nucleicos contiguos de una molécula de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, un sistema puede comprender además una microplaca que comprende un sensor, un sensor que tiene un sustrato. En algunas realizaciones, al menos dos electrodos pueden acoplarse a un circuito eléctrico. En algunas realizaciones, se puede acoplar un sensor a un circuito eléctrico que procesa al menos una señal eléctrica. En algunas realizaciones, una microplaca puede comprender una pluralidad de sensores, comprendiendo cada uno un par individual de electrodos. En algunas realizaciones, una microplaca puede comprender al menos aproximadamente 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000, 100.000.000, 1.000.000.000, 10.000.000.000 o más de 10.000.000.000 sensores. En algunas realizaciones, cada uno de una pluralidad de sensores o una pluralidad de conjuntos de sensores puede ser direccionable de forma independiente.

Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un medio legible por ordenador no transitorio que comprende un código ejecutable por máquina que, tras la ejecución por uno o más procesadores informáticos, implementa un método para secuenciar una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el método: (a) proporcionar un sustrato que comprende al menos dos electrodos separados por una separación dentro de un área de un canal de flujo, en donde el sustrato puede ser sólido; (b) dirigir a al menos dos electrodos una mezcla de reacción que comprende uno o más tipos de nucleótidos marcados, y los reactivos necesarios para una reacción de amplificación del ácido nucleico; (c) someter al menos una porción de la mezcla de reacción a una reacción de amplificación del ácido nucleico en condiciones que sean suficientes para dar como resultado un producto de amplificación de una molécula de ácido nucleico, cuyo producto de amplificación puede incluir al menos uno de uno o más tipos de nucleótidos marcados; (d) usar al menos dos electrodos para detectar al menos una señal eléctrica durante una etapa de un proceso de amplificación en donde un nucleótido marcado puede unirse o un producto de amplificación puede unirse en un hueco o puede dirigirse a través de un hueco, en donde al menos una señal eléctrica puede comprender una corriente de efecto túnel; y (e) identificar una secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico o una porción de la misma basándose en una señal eléctrica detectada en (d).

Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método para secuenciar una molécula de ácido nucleico, que comprende: (a) proporcionar un sustrato que comprende al menos dos electrodos separados por una separación como parte de un canal de flujo, en donde el sustrato puede ser sólido; (b) dirigir a través de una separación entre electrodos una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más tipos de nucleótidos marcados; (c) usar al menos dos electrodos para detectar al menos una señal eléctrica procedente de una molécula de ácido nucleico, que incluye uno o más tipos de nucleótidos marcados, en donde al menos una señal eléctrica puede comprender una corriente de efecto túnel; y (d) identificar una secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico o una porción de la misma basada en una señal eléctrica detectada en (c).

En algunas realizaciones, al menos una señal eléctrica puede ser una corriente no de Faraday. En algunas realizaciones, al menos una señal puede comprender una pluralidad de señales. En algunas realizaciones, al menos una señal eléctrica puede comprender una corriente de efecto túnel. En algunas realizaciones, se pueden marcar uno o más tipos de nucleótidos marcados con una molécula y/u otro resto que pueden facilitar la formación de una corriente de efecto túnel o una corriente de efecto túnel y de salto electrónico. En algunas realizaciones, una molécula y/u otro resto pueden comprender un marcador de efecto túnel. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse a la porción de una base de un nucleótido dado uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse a una cadena de fosfato de un tipo de nucleótido dado de uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse de forma reversible a un tipo de nucleótido dado de uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, uno o más tipos de nucleótidos marcados pueden comprender al menos dos tipos diferentes de nucleótidos o modificaciones de los mismos. En algunas realizaciones, cada tipo de uno de los al menos dos tipos de nucleótidos o modificaciones de los mismos puede estar marcado con un marcador de efecto túnel diferente. En algunas realizaciones, uno o más tipos de nucleótidos marcados puede comprender un terminador. En algunas realizaciones, el marcador de efecto túnel puede unirse a un terminador. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse de forma reversible a un terminador.

Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un sistema para secuenciar una molécula de ácido nucleico, que comprende: un sustrato que comprende al menos dos electrodos separados por una separación dentro de un área de un canal de flujo, en donde el sustrato puede ser sólido; y un procesador informático acoplado operativamente a un sustrato y programado para: (a) dirigir a través del canal de flujo a al menos dos electrodos de una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más tipos de nucleótidos marcados; (b) usar al menos dos electrodos para detectar al menos una señal eléctrica procedente de una molécula de ácido nucleico, incluyendo uno o más tipos de nucleótidos marcados, en donde al menos una señal eléctrica puede comprender una corriente de efecto túnel; y (c) identificar una secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico o una porción de la misma basándose en una señal eléctrica detectada en (b).

En algunas realizaciones, al menos una señal eléctrica puede ser al menos en parte una corriente no de Faraday. En algunas realizaciones, al menos una señal puede comprender una pluralidad de señales. En algunas realizaciones, al menos una señal eléctrica puede comprender una corriente de efecto túnel. En algunas realizaciones, se pueden marcar uno o más tipos de nucleótidos marcados con una molécula que facilite la formación de una corriente de efecto túnel o una corriente de efecto túnel y de salto electrónico. En algunas realizaciones, una molécula puede comprender un marcador de efecto túnel. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse a la porción de una base de un tipo de nucleótido dado de uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse a una cadena de fosfato de un tipo de nucleótido dado de uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse de forma reversible a un nucleótido dado de uno o más tipos de nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, uno o más tipos de nucleótidos marcados pueden comprender al menos dos tipos diferentes de tipos de nucleótidos o modificaciones de los mismos. En algunas realizaciones, cada tipo de uno de los al menos dos tipos de nucleótidos o modificaciones de los mismos puede estar marcado con un marcador de efecto túnel diferente. En algunas realizaciones, uno o más tipos de nucleótidos marcados puede comprender un terminador. En algunas realizaciones, el marcador de efecto túnel puede unirse a un terminador. En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede unirse de forma reversible a un terminador.

Los aspectos y ventajas adicionales de la presente divulgación serán muy evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada, en donde se muestran y describen las realizaciones ilustrativas de la presente divulgación. Como se observará, la presente divulgación permite realizaciones adicionales y diferentes, y sus diversos detalles pueden modificarse en diversos aspectos evidentes, todo sin apartarse de la divulgación. Por consiguiente, los dibujos y la descripción deben considerarse de naturaleza ilustrativa.

Breve descripción de los dibujos

Los rasgos novedosos de la invención se indican a continuación en particular, en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de los rasgos y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que muestra a continuación las realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención y los dibujos adjuntos de los cuales:

La Fig. 1A muestra un gráfico de la conductancia de efecto túnel del polímero;

Las Figs. 1B, 1C, y 1D muestran algunas moléculas poliméricas diferentes con una conductancia de efecto túnel;

La Fig. IE muestra una hebra de ADN y una corriente de efecto túnel a su través;

La Fig. IF muestra la conductancia como una función de la longitud de un homopolímero que contiene la secuencia de ADN;

La Fig. 1G muestra la conductancia en función de la longitud de diferentes secuencias de ADN que contienen GC;

La Fig. 1H muestra una ruta de conductancia de un efecto túnel y salto electrónico de la hebra;

La Fig. 1I muestra un método para sintetizar un marcador;

La Fig. 1J representa gráficamente una molécula de ion híbrido y su asociación con dos electrodos;

La Fig. 1K muestra un marcador conductor unido a un nucleótido;

Las Figs. 1L, 1M, 1O y 1N muestran un método para formar y medir la densidad de una SAM formada en un electrodo;

La Fig. 2A muestra un marcador de ADN unido a dos electrodos por las SAM unidas al anterior;

Las Figs. 2B, 2C y 2D muestran diferentes etapas en un proceso de medición;

La Fig. 2E muestra un diagrama de flujo de un proceso de una polimerasa y un método de secuenciación asociado;

La Fig. 2F muestra en imágenes las diversas etapas de un método de secuenciación epigenético y la corriente resultante;

Las Figs. 3A-3D muestra las etapas en la fabricación del sensor de nanoseparación;

Las Figs. 3E-3I muestras las imágenes SEM y TEM de los sensores formados usando el proceso que se muestra en las Figs. 3A-3D;

Las Figs.3J y 3K muestran otro método para formar un sensor de nanoseparación;

Las Figs. 3L-3N muestran otro método para formar un sensor de nanoseparación;

Las Figs.3O-3V muestran otro método para formar un sensor de nanoseparación;

La Fig. 3W representa gráficamente un sensor de nanoseparación con una nanoseparación más estrecha; La Fig. 3X representa esquemáticamente un esquema simplificado de un sensor de integración de un circuito de celdas;

La Fig. 3Y muestra una microplaca con múltiples rutas de fluidos para matrices de sensores y la circuitería asociada; y

La Fig.4 muestra un cebador de horquilla universal.

Descripción detallada

Aunque se han mostrado y descrito en el presente documento diversas realizaciones de la invención, será evidente para los expertos en la materia que dichas realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. Debe entenderse que se pueden emplear las diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en el presente documento.

La presente divulgación proporciona sistemas y métodos que se refieren a la secuenciación de biomoléculas, por ejemplo, la secuenciación de polinucleótidos, así como el uso de marcadores de efecto túnel para otros fines, que incluyen la detección y la cuantificación de biomoléculas como se define adicionalmente en las reivindicaciones. Los sistemas y/o métodos ilustrativos pueden incluir la medición de la corriente de efecto túnel procedente de la síntesis de polinucleótidos dentro de una separación formada por un par de electrones y la identificación de las señales de efecto túnel asociadas con cada base.

El término "separación", como se usa en el presente documento, generalmente se refiere a un volumen, espacio, poro, canal o paso formado o proporcionado de otra forma en un material, o entre electrodos. El material puede ser un material en estado sólido, tal como un sustrato, o puede estar formado por diferentes capas formadas sobre un sustrato. Una separación puede disponerse adyacente o en proximidad a un circuito de detección o a un electrodo acoplado a un circuito de detección. En algunos ejemplos, una separación puede tener una anchura o diámetro característico en el orden de 0,1 nanómetros (nm) a aproximadamente 1.000 nm. Una separación que tiene una anchura en el orden de los nanómetros puede denominarse como "nanoseparación" (denominado también "nano separación" en el presente documento). En algunas situaciones, una nano-separación puede tener una anchura o distancia que puede ser de aproximadamente 0,1 nanómetros (nm) a aproximadamente 50 nm, 0,5 nm a 30 nm, o 0,5 nm a 10 nm, 0,5 nm a 5 nm, o 0,5 nm a 2 nm, 5 a 30 nm, 10 nm a 20 nm, 5 nm a 20 nm, 15 nm a 25 nm, o no superior a aproximadamente 2 nm, 1 nm, 0,9 nm, 0,8 nm, 0,7 nm, 0,6 nm o 0,5 nm. En algunos casos, una nanoseparación tiene una anchura que es al menos aproximadamente de 0,5 nm, 0,6 nm, 0,7 nm, 0,8 nm, 0,9 nm, 1 nm, 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5 nm, 7,5 nm, 10 nm, 15 nm, 20 nm, 30 nm o más de 30 nm. En algunos casos, la anchura o distancia de una nanoseparación puede ser de más de un diámetro de una biomolécula usada en una reacción de secuenciación, o puede ser menor del diámetro de una biomolécula de muestra o una subunidad (por ejemplo, un monómero) de una biomolécula de muestra.

El término "biomolécula" o "biopolímero", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a cualquier material biológico que se puede interrogar en función de los parámetros eléctricos (por ejemplo, la corriente eléctrica, la tensión, el diferencial de impedancia, la corriente de efecto túnel, la corriente de efecto túnel o la corriente de salto, la resistencia, la capacitancia, y/o la conductancia) a través de un electrodo de nanoseparación. Una biomolécula puede ser una molécula de ácido nucleico, una proteína, o carbohidrato. Una biomolécula puede incluir una o más subunidades, tales como nucleótidos o aminoácidos.

La expresión "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una molécula que comprende una o más subunidades de ácidos nucleicos. Un ácido nucleico puede incluir una o más subunidades seleccionadas entre adenosina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) y uracilo (U), bases abásicas, o variantes de las mismas, incluyendo, por ejemplo, cualquiera de origen natural o de origen no natural (por ejemplo, modificada o diseñada mediante ingeniería genética), bases modificadas epigenéticamente, que pueden acoplarse con desoxirribosas, ribosas, PNA (Ácidos nucleicos de proteínas), L-ADN, ácidos nucleicos bloqueados, o cualquier otra estructura principal polimérica convencional o no convencional. Un nucleótido puede incluir A, C, G, T o U, o variantes de los mismos. Un nucleótido puede incluir cualquier subunidad que se puede incorporar a una hebra de ácido nucleico en crecimiento. Un nucleótido puede incluir cualquier subunidad que se puede unir pero no incorporar a una hebra de ácido nucleico en crecimiento. Dicha subunidad puede ser A, C, G, T, o U o cualquier otra subunidad que sea específica de una o más complementarias de A, C, G, T o U o complementarias de una purina (es decir, A o G o una variante de la misma) o una pirimidina (es decir, C, T o U, o una variante de la misma). Una subunidad puede permitir resolver bases o grupos de bases de ácidos nucleicos individuales (por ejemplo, AA, TA, AT, GC, CG, CT, ^tC, GT, TG, AC, CA, o sus análogos de uracilo). En algunos ejemplos, una ácido nucleico es el ácido desoxirribonucleico (ADN) o el ácido ribonucleico (ARN), o los derivados de los mismos. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, o parcialmente monocatenario y parcialmente bicatenario, y puede tener múltiples porciones monocatenarias, y puede tener múltiples porciones bicatenarias.

El término "proteína", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una molécula biológica, o macromolécula, que tiene uno o más monómeros de aminoácidos, subunidades o restos, o puede referirse a un complejo de macromoléculas en donde cada una puede tener uno o más monómeros de aminoácidos, subunidades 0 restos. Una proteína que contiene 50 o menos aminoácidos, por ejemplo, puede denominarse un "péptido". Se pueden seleccionar monómeros de aminoácidos procedentes de cualquier monómero de aminoácido de origen natural y/o sintetizado, tal como, por ejemplo, 20, 21 o 22 aminoácidos de origen natural. En algunos casos, están codificados 20 aminoácidos en el código genético de un sujeto. Algunas proteínas pueden incluir aminoácidos seleccionados entre aproximadamente 500 aminoácidos de origen natural y no natural. En algunas situaciones, una proteína puede incluir uno o más aminoácidos seleccionados entre isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina, arginina, histidina, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, prolina, serina y tirosina.

La expresión "adyacente" o "adyacente a" como se usa en el presente documento, incluye 'próximo a', 'contiguo', 'en contacto con', y 'en proximidad a'. En algunos casos, los adyacentes a componentes se separan entre sí por una o más capas intercaladas. Por ejemplo, la una o más capas intercaladas pueden tener un espesor menor de aproximadamente 10 micrómetros ("micrómetros"), 1 micrómetro, 500 nanómetros ("nm"), 100 nm, 50 nm, 10 nm, 1 nm o menos. En un ejemplo, una primera capa es adyacente a una segunda capa cuando la primera capa está en contacto directo con la segunda capa. En otro ejemplo, una primera capa es adyacente a una segunda capa cuando la primera capa se separa de la segunda capa por una tercera capa.

El término "efecto túnel", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a un movimiento de una partícula, tal como un electrón, a través de una barrera de potencial que la partícula no tiene suficiente energía para superar. Esto puede estar en contraste con la conductancia convencional, en donde una partícula puede tener suficiente energía para superar cualquier barrera de energía.

Un resto (tal como la expresión "marcador de efecto túnel", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a un resto (tal como un compuesto, una molécula, una partícula, y sus combinaciones) que puede facilitar el efecto túnel de los electrones o huecos dentro o a través del resto, o entre uno o más electrodos y el resto. En algunos casos, el efecto túnel puede medirse como una corriente de efecto túnel y/o corriente de salto electrónico.

La expresión "corriente de efecto túnel", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una señal de corriente asociada con el efecto túnel de los electrones o huecos entre dos electrodos con una tensión (por ejemplo, una tensión de polarización) aplicada a la anterior. El efecto túnel puede estar dentro, fuera, a través de un marcador de efecto túnel o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, el efecto túnel puede combinarse con porciones de una ruta de conducción en donde se puede producir el salto electrónico.

La expresión "método químico sincronizado", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a un método en donde un ciclo de tiempo está determinado. Un método químico sincronizado puede necesitar solo una única medición, puesto que el momento para realizar una medición apropiada es conocido, es posible que no sean necesarias múltiples mediciones para asegurar que se ha realizado una medición adecuada.

La expresión "método químico asíncrono", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a un método en donde un ciclo de tiempo es indeterminado, y puede variar. Un método químico asíncrono puede ser particularmente necesario para múltiples mediciones, ya que no es posible determinar cuando puede tenerse que realizar una medición, para asegurar que se ha realizado una medición deseada, pueden ser necesarias numerosas mediciones durante un periodo de tiempo.

La expresión "extremo adherido", como se usa en el presente documento, puede comprender una secuencia de ácido nucleico, que puede ser una parte de SAM, y puede ser, al menos parcialmente, monocatenaria, de tal manera que puede unirse o hibridarse con un ácido nucleico complementario o al menos parcialmente complementario, que puede comprender una porción de un marcador de efecto túnel, que puede ser al menos parcialmente monocatenario en una región que puede ser complementaria a un extremo adherido.

La expresión "extremo adherente", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una secuencia de ácido nucleico que puede comprender una porción de un marcador de efecto túnel, que puede ser al menos parcialmente monocatenario en una región que puede ser complementaria a un extremo adherente, y puede por tanto unirse o hibridarse a la anterior.

El término "relleno", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una parte de SAM que es nominalmente bioinerte, y por tanto puede no unirse ni interactuar con ácidos nucleicos tales como los ácidos nucleicos de la muestra, los ácidos nucleicos pueden comprender una porción de un marcador, nucleótidos, proteínas que incluyen enzimas, u otras biomoléculas, y puede unirse como una parte de una SAM para prevenir la interacción entre biomoléculas y una superficie a la cual se puede unir una SAM.

La expresión "método de salto de lectura", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a un método de secuenciación en donde un método químico sincronizado puede utilizarse durante numerosos ciclos y a continuación suspenderse, por consiguiente, se puede utilizar un método químico asíncrono durante un periodo de tiempo y a continuación suspenderse, y después se puede utilizar un método sincronizado durante numerosos ciclos. El tiempo durante el cual se utiliza el método químico asíncrono puede considerarse que es un "periodo de lectura". Pueden no realizarse las mediciones durante un periodo de tiempo utilizando una química asíncrona.

La expresión "bloqueante físico", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a un primer resto unido a un segundo resto, en donde el primer resto es un resto usado como parte de un proceso de medición, y el segundo resto es de un tamaño tal que los primeros restos pueden separarse entre sí en función del tamaño de un segundo resto. Se puede usar un bloqueante físico para permitir la localización individual de los primeros restos con respecto a sensores, o puede usarse para separar primeros restos en una separación relativamente regular que puede ser más grande que una separación en la cual un primer resto puede de otra forma separarse en ausencia de segundos restos. Un segundo resto puede por tanto considerarse como un bloqueante físico.

La expresión "base interrogada", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una base que puede ser una primera base que no tiene una base complementaria incorporada como parte de un cebador extendido, y que sería complementaria de la siguiente base que se incorporaría mediante una polimerasa u otra enzima. La base que se incorpora puede por tanto ser una base en la dirección 5' de una última base que tiene una base complementaria que forma parte de un cebador extendido, y que puede unirse adicionalmente a un sitio activo de una enzima tal como una polimerasa.

Los dispositivos de efecto túnel cuántico, cuando se usan para la medición directa de nucleótidos para secuenciar polinucleótidos, pueden sacar a la luz diversos problemas.

Otro posible problema en la secuenciación de una única molécula es la producción del dispositivo, encontrando una manera para fabricar un secuenciador masivamente en paralelo con millones o más de dispositivos en una microplaca. Esto puede suponer grandes desafíos técnicos y tecnológicos para los nanodispositivos. Esto sin embargo, puede ser necesario, por ejemplo, para el fin de secuenciar moléculas individuales del genoma completo. Por ejemplo, una molécula fluorescente puede crear quizás ~6000 fotones, pero solo un pequeño porcentaje (~10 %) de los fotones puede convertirse en electrones. En algunos casos, el ruido inducido por el fondo significa que se deben usar muchas moléculas fluorescentes para obtener una adecuada relación señal a ruido (S/N). Incluso con muchas moléculas fluorescentes, la concentración de colorante puede ser baja y puede requerirse una irradiación muy alta (fotones/s/unidad de área, dando como resultado a menudo sistemas de iluminación con láser caros.

La detección del pH puede requerir también un gran número de moléculas para generar una señal. Los sistemas existentes pueden necesitar más de 100.000 moléculas para obtener una relación señal a ruido adecuada.

Marcadores de efecto túnel

Como se proporciona en el presente documento, un marcador de efecto túnel puede ser un compuesto a través del cual una corriente de efecto túnel puede proporcionar un gran número de electrones a partir de una única molécula polimérica con un bajo nivel de fondo. Por ejemplo, en 1 segundo, 1 nA de corriente puede generar 6,2 M de electrones. En presencia de un fondo de 5 pA, esto puede dar como resultado un nivel S/N de límite de ruido de disparo > 1000:1.

En algunos casos, un marcador de efecto túnel puede proporcionar corrientes que corresponden a conductancias de menos de 10-11, 10-11 a 10-10, 10-10 a 10-9, 10-9 a 10-8, o 10-8 a 10-7 o más Siemens. Por tanto, con potenciales de polarización nominales tales como de menos de 10 mV, de 10 mV a 100 mV, de 100 mV a 250 mV o más de 250 mV, se pueden crear corrientes significativas tales que el ruido del disparo, puede considerarse insignificante en muchos sistemas.

Se puede iniciar un marcador de efecto túnel como resultado de, por ejemplo, un efecto túnel coherente o incoherente, un salto incoherente térmicamente inducido, o combinaciones de los mismos. Por el contrario, una ruta conductora más convencional no implica el uso del efecto túnel, tanto coherente como incoherente. En algunos casos, una ruta de efecto túnel puede tener una resistencia de fórmula R = R0 e(pL), donde L es la longitud de la ruta de efecto túnel a través de la cual puede pasar un electrón, hueco o corriente y p puede ser una constante dependiente de la molécula, y condiciones tales como la hidratación de la molécula; en las Figs. 1A y 1B se muestran ejemplos de moléculas con dichas rutas de efecto túnel. En algunos casos, una ruta conductora a través de un marcador de efecto túnel puede ser al menos parte de una corriente de salto electrónico. La porción de la ruta donde se produce el salto electrónico puede tener una resistencia de fórmula R = R0 aL = R0 a~Le(Ea/kT), donde L es la longitud de la ruta de efecto túnel a través de la cual puede pasar un electrón o corriente, Ea es la energía de activación, k es la constante de Boltzmann, y T es la temperatura. Dichas corrientes pueden ser el resultado de varios movimientos relativamente pequeños a través de un marcador de efecto túnel de un electrón o hueco, formando por tanto una corriente a través de una porción más larga de un marcador de efecto túnel. Las porciones de la corriente de salto electrónico pueden ser o no térmicamente dependientes. Las porciones de la corriente de efecto túnel pueden ser o no dependientes de la temperatura. En algunos casos, ambos efectos túnel, pueden ser tanto coherentes como incoherentes, y el salto electrónico se puede producir a través de una única porción de un marcador de efecto túnel.

En algunos casos, se puede producir el efecto túnel como resultado de orbitales de electrones n u orbitales de electrones n apilados. Por ejemplo, el efecto túnel puede recibir ayuda como resultado de la presencia de orbitales de electrones n solapantes, como se produce con el ADN bicatenario. Otras localizaciones donde se pueden producir orbitales de electrones solapantes de una manera útil para el efecto túnel incluyen anillos de benceno y otras estructuras similares, por ejemplo, donde dichas estructuras pueden formar orbitales sp2 hibridados, u orbitales pz.

Como se muestra en la Fig. IE, una corriente de efecto túnel puede pasar entre dos electrodos 107A y 107B, y puede pasar por un túnel o a través de enlazadores109A y 109^by puede pasar por un túnel o saltar a través de orbitales de electrones n apilados de bases, dando como resultado un paso de corriente a lo largo de la longitud de un polímero de ácido nucleico a través de orbitales n 111. El intercambio de electrones puede alterar los niveles de energía de los orbitales de electrones, por ejemplo, se pueden aumentar los niveles de orbitales moleculares ocupados (HOMO) con la energía más elevada como resultado de dicho intercambio, lo que puede permitir una mejor correspondencia entre los niveles de energía de los orbitales intercambiados y los niveles de energía de los electrodos, permitiendo por tanto niveles de corriente y una conductancia más elevados.

En algunos casos, la longitud de un marcador de efecto túnel puede ser tal que en vez de hacer un túnel principalmente a través de un marcador de efecto túnel, se puede producir principalmente un salto electrónico a través de un marcador de efecto túnel; algunos ejemplos de esto pueden estar en ácidos nucleicos de homopolímeros, particularmente bases G y A que pueden tener mejor solapamiento del orbital n. Dicha transición puede dar como resultado un cambio en la conductancia desde tener principalmente una función exponencial inversa a tener principalmente una función lineal inversa. Dicha transición puede producirse en pares de bases del homopolímero A cuando una longitud de una secuencia de homopolímero A alcanza aproximadamente tres pares de bases como se muestra en la Fig. IF y como se describe por Griese et. al. en Nature 2001, 412318, que se incluye por referencia en su totalidad. De manera similar, una secuencia de repetición GC puede tener principalmente una conducción de salto en función de mayores cantidades de pares GC de pares de bases como se muestra en la Fig. 1G y como se describe por Xiang et. al. en Nature Chemistry 2015 7 221 que se incluye por referencia en su totalidad, en donde el eje X es el número de pares de bases Gc , los cuadrados rellenos son repeticiones GC, los triángulos son repeticiones de homopolímeros de Gs y Cs, y el eje Y es Mohmios. La Fig. 1H muestra la ruta de la conductancia a través de una secuencia de repetición GC.

En algunos casos, un marcador de efecto túnel puede comprender polímeros, tales como oligómeros. Los ejemplos no limitantes de los polímeros pueden incluir oligotiofenos, oligofenileniminas, combinaciones de donantes de electrones y aceptores de electrones tales como tetratiafulvaleno y diimida piromelítica respectivamente, nanocintas de carbono, carotenoides, alcanos, tolanos, oligopéptidos, oligoporfirinas, diimidas de perileno tetracarboxílicas, fullerenos, nanotubos de carbono, nanotubos de pared simple, nanocintas de grafeno, diferentes tipos de ácidos nucleicos, ácidos nucleicos dupletes, ácidos nucleicos tripletes, o ácidos nucleicos cuadrupletes, o combinaciones (por ejemplo, una combinación en serie, una combinación en paralelo o una combinación en paralelo de una serie formando por tanto una quimera) de los mismos.

En algunas realizaciones, un marcador de efecto túnel puede tener conductancia simétrica o asimétrica, dependiendo de, por ejemplo, la orientación de al menos una porción del marcador. En algunos casos, las simetrías o asimetrías en la conductancia pueden utilizarse para determinar la orientación de un marcador.

El tipo o la configuración de un marcador de efecto túnel puede afectar significativamente la conductancia del marcador de efecto túnel. Por ejemplo, como se muestra en la Fig. 1A, las longitudes (en Angstroms) de diferentes tipos de polímeros que se representan gráficamente corresponden a la conductancia (en Siemens) de los mismos y las estructuras de potenciales marcadores de efecto túnel se muestran en la Fig 1B y 1C, en donde 101A muestra varias longitudes y las conductancias asociadas de alcanos, y 101B muestra la estructura del alcano; 102A muestra análogamente varias longitudes y las conductancias asociadas de oligopéptidos, y 102B muestra la estructura de un oligopéptido ilustrativo; 103A muestra análogamente varias longitudes y las conductancias asociadas de polímeros de carotenoides, y 103B muestra la estructura de polímeros de carotenoides ilustrativos; 104A muestra análogamente varias longitudes y las conductancias asociadas de oligotiofenos, y 104B muestra la estructura de un oligotiofeno ilustrativo. Se muestran en la Fig. 1C estructuras químicas ilustrativas del 9,10-di(2'-(paraacetilmercaptofenil)etinil)-antraceno 105 que puede tener conductancia simétrica, y de la 2,5-di(2'-(paraacetilmercaptofenil)etinil)-4-nitroacetianilina 106 que puede tener conductancia asimétrica. En algunos casos, cualquier molécula usada como parte de una única molécula o transistor orgánico puede ser adecuada para su uso como al menos una parte de un marcador de efecto túnel.

En algunos casos, un metal puede unirse a una porción de un polímero, tal como en el caso de una porfirina, como se muestra en la Fig. ID, en donde se representa gráficamente la estructura química de una tetrafenilporfirina. Se pueden utilizar otras moléculas quelantes tales como hemo y ferroceno para unir iones metálicos, de tal manera que uno o más iones metálicos pueden comprender una porción de un marcador de efecto túnel.

En algunos casos, un marcador de efecto túnel puede comprender un metal, tal como una nanopartícula metálica, una nanoperla, nanobarras, o cualquier otra forma de un metal. En algunos casos, los polímeros tales como ácidos nucleicos pueden estar unidos a una nanoperla, y el polímero de ácido nucleico puede ser al menos parcialmente complementario a un ácido nucleico que puede estar unido a los electrodos de un sensor, de tal manera que los ácidos nucleicos pueden hibridarse, uniéndose la nanoperla a los electrodos del sensor. En algunos casos, una nanopartícula metálica puede estar unida usando un ensayo de tipo sándwich, en donde un ácido nucleico diana puede ser al menos parcialmente complementario a los ácidos nucleicos correspondientes unidos a al menos un electrodo y a la nanopartícula metálica, uniendo por tanto la nanopartícula metálica y proporcionando un efecto túnel y/o una ruta de salto entre los conductores con electrones libres. En algunos casos, una hebra de ácido nucleico puede metalizarse usando una técnica tal como la que se describe por Baigl et al. en el documento WO2008/035787. En algunos casos, se puede aplicar dicho tratamiento de metalización a una porción bicatenaria de un ácido nucleico que puede comprender una porción de un marcador de efecto túnel, aunque las porciones monocatenarias, que pueden estar en los extremos de un ácido nucleico, permiten la unión mediante hibridación de un marcador de efecto túnel. En algunos casos, solo se pueden metalizar las porciones de un marcador, usando, por ejemplo, métodos estequiométricos. En algunos casos, un marcador puede comprender oligonucleótidos y algunos de los oligonucleótidos pueden metalizarse. Las porciones restantes del marcador pueden comprender oligonucleótidos, u otros polímeros conductores o partículas metálicas, y pueden unirse usando ligaduras, química de clic, u otras técnicas de unión covalente o no covalente.

En algunos casos, un oligonucleótido puede comprender una porción de un marcador. Un oligonucleótido puede formarse usando diversos métodos de síntesis de oligonucleótidos. En algunos ejemplos, la síntesis de oligonucleótidos puede ser difícil con homopolímeros G largos u oligonucleótidos con un alto contenido de GC. En dichos casos, un oligonucleótido puede formarse usando una combinación de síntesis de oligonucleótidos y un método de ligadura, permitiendo rendimientos mayores que pueden ser posibles cuando se utilizan solo técnicas de síntesis de oligonucleótidos.

Un marcador de efecto túnel puede comprender polímeros. Los polímeros pueden unirse a una partícula metálica comprendida en el marcador usando cualquier mecanismo de unión adecuado, tal como mediante tiol, disulfuro, amina, diamina, o cualquier otro resto de unión adecuado. Los polímeros pueden ser cualquier tipo de polímero que pueda ayudar a proporcionar un efecto túnel y/o una ruta de salto de conductancia. Los polímeros pueden comprender moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, polímeros). Las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser complementarias y/o parcialmente complementarias para una o más moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, polímeros) que pueden estar asociadas con (por ejemplo, unidas a) electrodos. Esto puede permitir corrientes de efecto túnel mayores que se producirían sin unión mediante hibridación entre las moléculas de ácidos nucleicos.

En algunos casos, los restos de uniones múltiples, y/o los restos que no se unen pueden estar unidos a un metal tal como una nanopartícula metálica, una nanoperla, nanobarras, u otra forma de metal.

En algunos casos, los marcadores asociados con nucleobases pueden utilizar diferentes marcadores para diferentes tipos de bases como una función de la secuencia y/o la longitud de un compuesto marcador de efecto túnel de un polímero de ácido nucleico concreto. Una corriente de efecto túnel asociada con un compuesto marcador de efecto túnel concreto puede disminuir con el aumento de la longitud y el contenido de AT en el ADN. En algunos casos, se puede utilizar una secuencia rica en GC. Una secuencia rica en GC puede tener un orden variado de bases G y C, de tal manera que se pueden utilizar diferentes órdenes de efecto túnel o salto por los electrones o huecos que pueden pasar a través de uno o más compuestos marcadores de efecto túnel. En algunos casos, se puede usar una secuencia rica en AT. En otras realizaciones, se puede usar una mezcla de secciones ricas en AT y GC.

En algunos casos, se puede preparar un marcador al menos en parte de una G cuadruplete. Por ejemplo, los extremos de un homopolímero G pueden no ser del homopolímero G, y por tanto, pueden no unirse de manera tetrámera, y pueden estar disponibles para la unión a una SAM que puede comprender una secuencia de ADN complementaria a una porción de una G cuadruplete que no se une de manera tetrámera, y que puede unirse a un electrodo.

En algunos casos, se pueden utilizar uno o más emparejamientos incorrectos, o bases desaparecidas en un marcador de efecto túnel. Se pueden utilizar los emparejamientos incorrectos o las bases desaparecidas en una región donde puede unirse un marcador de efecto túnel a una monocapa autoensamblada (SAM). En algunos casos, los emparejamientos incorrectos o las bases desaparecidas pueden estar dentro de al menos una porción de un marcador de efecto túnel donde un marcador de efecto túnel puede ser bicatenario antes de cualquier interacción con una SAM. En algunos casos, se pueden utilizar una o más bases abásicas, o nucleobases no naturales de una manera similar a un emparejamiento incorrecto de una base. En algunos casos, se pueden utilizar una o más bases abásicas bases no naturales, bases no convencionales de origen natural tales como bases C metiladas, bases A metiladas, o cualquier otro tipo de nucleobase de origen natural o sintético, y las modificaciones de las mismas.

En algunos casos, una base modificada puede comprender al menos en parte una adenina modificada. La adenina modificada puede tener una sustitución en la posición 7a de un nitrógeno a un grupo C-H, formando por tanto una 7-deazaadenina. El emparejamiento de bases de una adenina modificada de esta manera puede no verse afectado, y puede aumentarse una corriente de efecto túnel asociada (potencialmente a casi el mismo nivel de corriente que para la guanina). En algunos casos, una nucleobase de guanina puede estar modificada de una manera similar. Una guanina modificada puede aumentar potencialmente una corriente de efecto túnel procedente de una corriente de efecto túnel de una guanina natural, y puede ser capaz de conseguir una corriente de efecto túnel mucho mayor con los compuestos marcadores de efecto túnel ricos en GC modificada.

Un marcador de efecto túnel (por ejemplo, un compuesto marcador de efecto túnel) puede comprender ácidos nucleicos bicatenarios, ácidos nucleicos monocatenarios, o una combinación de los mismos. En algunos ejemplos, un marcador de efecto túnel comprende ácidos nucleicos parcialmente bicatenarios y parcialmente monocatenarios, en donde la hebra de ácido nucleico puede tener dos "extremos adherentes" en donde un extremo adherente puede comprender tanto extremos 3' como 5' o ambas secciones monocatenarias de los ácidos nucleicos que se extienden más allá de la región bicatenaria de un marcador, en donde ambas hebras de una par complementario pueden extenderse más allá de la sección complementaria. En otras realizaciones, un compuesto de efecto túnel puede tener una única hebra más larga que se extiende más allá de ambos extremos de una sección bicatenaria más corta de tal manera que la única hebra más larga puede interactuar con las monocapas autoensambladas sobre ambos electrodos de un par de electrodos.

En algunos casos, los ácidos nucleicos,bloqueados (LNA) y/o los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) pueden utilizarse como parte de un marcador de efecto túnel con el fin de permitir que una SAM complementaria más corta pueda tener menos unión a cualquier ADNmc diana. En algunos casos, los ácidos nucleicos que comprenden regiones complementarias de SAM y los marcadores de efecto túnel pueden comprender al menos en parte ADN de la hélice izquierda (L-ADN), de tal manera que se puede producir la hibridación entre las SAM y los compuestos marcadores de efecto túnel, aunque las SAM pueden no unirse a la hebra de ADNmc diana debido a la rotación de la hélice opuesta. En algunos casos, una combinación de ADN bloqueado y L-ADN puede utilizarse para prevenir la unión del ADNmc diana, permitiendo a la vez las regiones complementarias cortas sobre la SAM y el compuesto marcador de efecto túnel.

En algunos casos, se puede usar un dendrímero como un marcador, y/o como un extremo adherente. Una estructura dendrimérica puede proporcionar numerosas rutas alternativas simultáneas, permitiendo a una única estructura dendrimérica mitigar eficazmente las variaciones que pueden resultar de las diferencias en la estructura cristalina de los electrodos y las variaciones en las corrientes que pueden resultar de ese modo. Las diversas propiedades de los dendrímeros pueden dar como resultado un marcador de efecto túnel/salto versátil que se puede unir a una SAM de muchos modos y mediante muchos sitios. Una estructura dendrimérica puede comprender las mismas o diferentes secuencias de ácidos nucleicos. En algunos casos, al menos una porción (por ejemplo, al menos aproximadamente 1%, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o más) de un dendrímero comprende a misma o una similar secuencia de ácidos nucleicos. En algunos casos, al menos una porción (por ejemplo, al menos aproximadamente 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o más) de un dendrímero tienen diferentes secuencias.

En algunos casos, el mismo resto de dendrímero se puede usar como un marcador para todas las bases nucleotídicas. En algunos casos, un fluido que contiene diferentes bases nucleotídicas puede llevarse a una celda de flujo de tal manera que la interacción con las polimerasas puede unir los nucleótidos como un subciclo dentro de un ciclo de secuenciación. Los fluidos que contienen diferentes bases pueden llevarse a una celda de flujo de tal manera que la interacción con las polimerasas puede unir los nucleótidos secuencialmente con el mimo marcador dendrimérico durante cada ciclo. En algunos casos, tras un subciclo, puede eliminarse un fluido que contiene una base nucleotídica, y se puede introducir un tampón de lavado para separar diferentes tipos de nucleobases, y un fluido que contiene diferentes bases nucleotídicas que comprende el mismo tipo de marcador dendrimérico puede llevarse a una celda de flujo de tal manera que al permitir la interacción con las polimerasas pueden unirse las nucleobases marcadas. Se puede determinar por tanto la secuencia de ácidos nucleicos de la muestra a partir de modelos de uniones de nucleótidos detectados mediante corrientes de efecto túnel/salto a través del dendrímero producidas por una tensión de polarización.

En algunos casos, un único marcador o una estructura dendrimérica con múltiples marcadores puede comprender también múltiples nucleótidos unidos a una única estructura. En algunos casos, los múltiples nucleótidos pueden ser un mismo tipo de nucleobase; en otros casos, diferentes nucleótidos pueden comprender diferentes tipos de nucleobases. En casos adicionales, la estructura dendrimérica puede comprender un único tipo de marcador; en otros casos, la estructura dendrimérica puede comprender diferentes tipos de marcadores. En algunos casos, en donde se pueden desear numerosos restos de unión diferentes, tales como cuando se ensayan numerosos tipos diferentes de nucleobases no convencionales o modificadas epigenéticamente, se puede identificar una estructura dendrimérica mediante la combinación de diferentes marcadores que pueden unirse a la anterior como un código de identificación.

En algunos casos, un marcador y/o una SAM usada para hibridarse o unirse a un marcador de efecto túnel con el fin de aumentar la corriente de efecto túnel a través de un marcador de efecto túnel puede comprender nucleobases no modificadas naturales. En algunos casos, se utilizan bases modificadas (por ejemplo, bases de origen natural, o bases de origen no natural). En algunos casos, la estructura principal puede comprender una estructura principal de fosfato de origen natural con ribosa. En algunos casos, se pueden utilizar modificaciones de origen no natural, tales como modificaciones del azufre, o cualesquiera otras modificaciones, incluyendo eliminar la carga asociada con la estructura principal, por ejemplo, utilizando un PNA en vez de una ribosa, o sustituyendo el grupo OH en los fosfatos con un grupo sin cargar. Se puede utilizar también cualquier otra modificación de la estructura principal tal como las usadas por los aptámeros, tales como estructuras principales de ácido xenonucleico (XNA), L-ADN, ADN bloqueado, o ADN de forma A.

En algunos casos, a fin de cambiar la conductancia de un marcador, se pueden utilizar diferentes condiciones del disolvente. Por ejemplo, un marcador que puede tener una forma B cuando en un disolvente completamente o en última instancia acuoso, puede tomar una forma A tras el cambio de las condiciones del disolvente. Por ejemplo, añadiendo un alcohol, tal como etanol o isopropanol puede dar como resultado un cambio del marcador a una estructura más corta más compacta, en donde las bases pueden no ser principalmente perpendiculares entre sí, pero en cambio, pueden estar ligeramente compensadas. En dicha forma B, la conductancia asociada con una secuencia de marcador puede ser mayor que la situación donde la secuencia de marcador está en una forma A, particularmente cuando la secuencia del marcador no tiene una secuencia principalmente regular, tal como GCGC u el homopolímero AAAA. En algunos casos, un marcador que está en una forma modificada a partir de una forma B puede tener un nivel mayor de salto que en el caso en que la secuencia del marcador está en una forma B. Aunque principalmente en la forma B, se puede producir la conductancia a través del marcador principalmente en una manera de efecto túnel, y no en una forma B, tal como en una forma A, se puede producir la conductancia del marcador principalmente a través de una manera de salto. En algunos casos, un marcador puede estar en una forma Z. Las diferencias entre diferentes formas pueden caracterizarse de diversas maneras, incluyendo, por ejemplo, el diámetro de una hélice (20 angstroms de forma convencional, 23 angstroms para la forma A, y 18 angstroms para la forma Z), el aumento por par de bases (3,32 angstroms para la forma B convencional, 2,3 angstroms para la forma A, y 3,8 angstroms para la forma Z), el número de pares de bases por revolución o vuelta (10,5 pares de bases para la forma B convencional, 11 pares de bases para la forma A, y 12 pares de bases para la forma Z), y una variedad de características diferentes. Se puede describir un polímero como estando principalmente en una forma cuando una o más de las diferentes características son menores o iguales a aproximadamente 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 1 %, o menos de la diferencia entre las diferentes formas de la característica concreta. Por ejemplo, una hebra de ácido nucleico bajo una condición disolvente concreta puede considerarse que está principalmente en una forma B cuando el aumento por par de base es mayor que 2,81 angstroms, y menor de 3,56 angstroms, siendo por tanto mayor que la mitad de la diferencia entre la forma A y la forma B, menos de la mitad de la diferencia entre la forma Z y la forma B.

En algunos casos, se pueden utilizar ribonucleótidos. Los ribonucleótidos pueden tomar en última instancia una forma A. Los ribonucleótidos pueden permitir mayores conductividades para las secuencias del marcador que pueden ser variables, potencialmente variables de forma significativa, permitiendo a la vez una forma A para el marcador aunque en un disolvente acuoso o principalmente acuoso.

En algunos casos, a fin de permitir una conductancia más uniforme y mayor asociada con el título y/o una unión más uniforme de los marcadores hibridados y las SAM y/o la unión intramarcadores, se pueden utilizar bases modificadas. Las bases modificadas pueden tener una unión más fuerte o más débil. Las bases modificadas se pueden utilizar en un modelo como parte de los "extremos adheridos" de la SAM y/o los "extremos adherentes" del marcador, y/o de las bases en los extremos de las porciones de los marcadores y/o los extremos adheridos que pueden ser porciones bicatenarias, de tal manera que se puede producir un deshilachado con menor frecuencia que la unión nominalmente uniforme, y se puede mantener la conductancia en un valor promedio mayor hasta que se produce la desnaturalización.

En algunos casos, una porción o porciones de un marcador de efecto túnel puede comprender una forma triplete o cuadruplete de polímeros de la nucleobase, tal como se forman naturalmente teniendo cuatro regiones de guanina de un homopolímero trímero en estrecha proximidad entre sí en una única hebra, en donde las bases Hoogsteen emparejadas se unen a las bases de guanina en un cuadruplete, y pueden ser de esta manera más estables que una unión duplete convencional. Dicho complejo puede comprender una única hebra, dos hebras, tres hebras, o cuatro hebras. Un complejo de cuadruplete puede tener una mayor conductividad que un duplete natural, como resultado de la unión a pi adicional.

En otros casos, se pueden utilizar bases de 7-deazaguanina para evitar la formación de un cuadruplete indeseado o inadvertido. En casos donde la formación del cuadruplete puede ser indeseable, se pueden utilizar bases de 7-deazaadenina, en donde la conductividad de efecto túnel de las bases de 7-deazaadenina puede ser mucho mayor que la conductividad de las bases de adenina convencionales, y puede servir también para evitar la unión Hoogsteen que puede producirse de otra manera entre las bases de guanina.

En algunos casos, se pueden usar bases modificadas como parte de un marcador de efecto túnel y/o el conjunto de nucleobases usadas para determinar una base de muestra y/o una modificación de una base de muestra. Los ejemplos no limitantes de bases modificadas incluyen 5-metilcitosina, N6-metiladenosina, N3-metiladenosina, N7-metilguanosina, 5-hidroximetilcitosina, pseudouridina, tiouridina, isoguanosina, isocitosina, dihidrouridina, queuosina, wiosina, inosina, triazol, diaminopurina, p-D-glucopiranosiloximetiluracilo, 8-oxoguanosina o 2'-O-metil adenosina, 2'-O-metil citidina, 2'-O-metil guanosina o 2'-O-metil uridina, cualquiera de las 140 modificaciones epigenéticas del ARN conocidas, o las combinaciones de las mismas.

En algunos casos, un oligonucleótido usado para hibridarse a un oligonucleótido unido a una enzima o polimerasa puede tener una longitud más larga, o una unión más estrecha, por ejemplo, como resultado de usar PNA u otros oligonucleótidos sin cargar, o ADN bloqueado. La hibridación de un oligonucleótido unido a una enzima o polimerasa puede hibridarse a una temperatura superior que la hibridación entre un marcador de efecto túnel y un oligonucleótido unido como parte de una s Da M prevista para aumentar una corriente de efecto túnel de un marcador de efecto túnel.

En algunos casos, un marcador de la conductancia de efecto túnel puede comprender un polímero de ácido nucleico cuadruplete. Un polímero de un ácido nucleico cuadruplete puede formarse a partir de uno, dos, tres, o cuatro polímeros de ácido nucleico. Un polímero de ácido nucleico cuadruplete puede formarse con una unión Hoogsteen de bases de guanosina o nucleótidos de origen natural modificados epigenéticamente, o nucleótidos de origen no natural con el fin de formar un marcador de elevada conductancia, con una conductancia que puede ser mayor que un polímero de ácido nucleico duplete. En algunos casos, se pueden utilizar múltiples marcadores cuadrupletes. Se pueden usar los marcadores cudrupletes en combinación con marcadores dupletes y/u otros tipos de marcadores. Los marcadores cuadrupletes se pueden configurar para tener extremos adherentes. Los extremos adherentes pueden permitir la unión de marcadores a las SAM unidas a los electrodos de un par de electrodos. Los extremos adherentes pueden configurarse adicionalmente para tener un enlazador unido a un nucleótido que se va a ensayar para la unión y/o el comportamiento cinético.

En algunos casos, los marcadores de efecto túnel pueden unirse a una cadena de 5' fosfato de una nucleobase. Los marcadores pueden unirse a través de un enlazador de PEG o alcano u otra cadena flexible adecuada, que puede ser una cadena quimérica entre un marcador y una nucleobase como se muestra en la Fig. 1K, en donde se muestra un trifosfato, aunque se pueden utilizar otras longitudes de cadenas de fosfato, o se pueden utilizar otras cadenas como se describe a partir de ahora en el presente documento. En algunos casos, un marcador puede unirse a una nucleobase en la posición 3'. Un marcador puede unirse a través de un enlazador escindible, que puede ser un enlazador fotoescindible o un enlazador químicamente escindible. Un enlazador escindible puede dejar un marcador unido a un complejo enzimático hasta que se puede eliminar de forma intencionada el marcador.

En algunos casos, un marcador puede estar unido a una nucleobase, cuya nucleobase puede estar unida por una enzima. Una enzima puede comprenden una polimerasa. Pueden eliminarse otros marcadores y nucleobases asociadas que no están unidos por una enzima. Un marcador puede estar unido a una SAM. Se puede incorporar una nucleobase y se puede escindir por tanto un enlazador entre una nucleobase y su marcador asociado. A continuación puede medirse un marcador, aunque unido todavía por la SAM, permitiendo por tanto la medición con la localización de los marcadores a las hebras del ácido nucleico diana tras la escisión.

En algunos casos, en donde la síntesis de un marcador deseado puede ser difícil, particularmente cuando se combina con la unión, que puede ser una unión covalente de un enlazador a un nucleótido deseado, se puede construir un marcador de varias partes y de ahí ensamblarse más bien que sintetizarse como una pieza. Como se muestra en la Fig. 1I, un núcleo de oligonucleótido 120 principal, que puede tener un enlazador 121, puede combinarse con los oligonucleótidos no unidos 123A y 122B que pueden ser complementarios a los porciones del núcleo del oligonucleótido 120 y los extremos adheridos 124A y 124B. Los oligos previamente libres 122A y 123B, pero ahora ligados pueden unirse ahora usando ligadura a un núcleo de oligonucleótido 120 para formar a o un marcador más completo, en donde un nucleótido deseado puede haberse unido a un extremo terminal de un enlazador 121 tanto antes de la ligadura como después de la ligadura.

En algunos casos, los marcadores pueden ajustarse a relaciones de conductancia fijas, que pueden estar en un conjunto de relaciones en un espacio lineal, en un espacio logarítmico, o en un espacio exponencial. En algunos casos, las diferencias en las conductancias del marcador pueden ajustarse como una función de los niveles de ruido de fondo. Por ejemplo, se puede ajustar una separación de los niveles de conductancia como una función de los niveles de ruido convolucionados con un nivel de conductancia definido, de tal manera que un solapamiento de la distribución de la conductancia puede corresponder a un solapamiento deseado entre diferentes marcadores.

En algunos casos, un nivel de ruido puede incluir la cinética de difusión de los nucleótidos que no están unidos por un complejo de polimerasa. En algunos casos, un nivel de ruido puede comprender la unión asociada de los extremos adherentes de los nucleótidos, que no están unidos por un complejo de polimerasa, a los extremos adheridos de una SAM que puede unirse a los electrodos de un par de electrodos. En algunos casos, un nivel de ruido puede estar dominado por un ruido asociado con la difusión y asociado con la unión de las extremos adherentes a los extremos adheridos de un marcador muy conductor. Esto puede requerir el al menos un marcador conductor que está significativamente más separado en la conductancia del siguiente marcador más conductor. En algunos casos, ambos extremos adherentes del marcador pueden comprender la misma secuencia, mientras que en otros casos, dos extremos adherentes de un marcador pueden comprender diferentes secuencias.

En algunos casos, una porción del marcador de una molécula, cuya molécula puede incluir un enlazador y una nucleobase, pueden seleccionarse como un compuesto de ion híbrido estando un lado positivamente cargado y estando el otro lado negativamente cargado. En algunos casos, una porción del marcador de una molécula puede tener una carga neta negativa, una carga neta positiva, o una carga neta neutra. En algunos casos, la porción del marcador puede tener dos extremos, teniendo cada uno una carga neta negativa y una carga neta positiva, respectivamente. Los extremos cargados positivamente de forma neta y negativamente de forma neta pueden cada uno atraerse a un electrodo diferente, como se muestra en la Fig 1J en donde se muestra un marcador de ion híbrido entre dos electrodos, en donde los extremos diferentemente cargados del marcador de ion híbrido pueden atraerse a dos diferentes electrodos con potenciales diferentes. En algunos casos, un marcador puede tener una carga neta neutra. Por ejemplo, cuando se puede formar un marcador usando bases de PNA o mediante modificaciones para unir grupos fosfato de tal manera que los grupos fosfato estén sin cargar.

En algunos casos, una porción de marcador puede tener un tamaño ligeramente más largo que una separación del electrodo o una localización de la unión. Por ejemplo, un ion híbrido o molécula similar con diferentes cargas netas en extremos opuestos de la porción del marcador de la molécula pueden estirarse a través de una separación de efecto túnel y pueden llevar a cabo una conexión de efecto túnel a los dos electrodos cuando se aplica un campo eléctrico.

Uso de los otros tipos de marcadores

En algunos casos, se pueden utilizar marcadores fluorescentes, por ejemplo, para detectar la cinética de la unión. Se pueden detectar marcadores fluorescentes usando un sistema que puede comprender un nanoporo guiado por onda en modo cero, un detector TIRF, o la detección de fluoróforos localizados por un nanoporo. Se puede detectar un fluoróforo antes de la entrada en un nanoporo en el lado cis de la estructura del nanoporo. En algunos casos, se detecta un fluoróforo justo después de la salida en el lado trans de la estructura del nanoporo. En dichos casos, se puede unir una polimerasa de forma fija a un nanoporo guiado por ondas en modo cero, de tal manera que puede observarse la unión transitoria de nucleótidos como resultado de la unión. Diferentes colores o longitudes de onda de marcadores fluorescentes pueden estar asociados con diferentes nucleótidos en un conjunto de nucleótidos, permitiendo por tanto la diferenciación entre ellos como se ha descrito anteriormente en el presente documento con respecto a los marcadores de efecto túnel o a los marcadores de salto electrónico.

En algunos casos, se pueden utilizar marcadores que bloquean la carga. Se pueden utilizar marcadores que bloquean la carga de tal manera que se puede reducir una diferencia en la corriente a través de un nanoporo como resultado de la presencia de un marcador que bloquea la carga, durante un periodo mientras está unido por una enzima. Una enzima puede ser una polimerasa. Una polimerasa puede unirse de forma fija o transitoria a un nanoporo. Diferentes tamaños de marcadores de carga pueden estar asociados con diferentes nucleótidos en un conjunto de nucleótidos, permitiendo por tanto la diferenciación entre tipos de nucleótidos, como se ha descrito anteriormente en el presente documento con respecto a los marcadores de efecto túnel o de salto electrónico.

En algunos casos, se pueden utilizar marcadores electroquímicos. Se pueden utilizar marcadores electroquímicos de tal manera que un nucleótido unido puede producir una corriente como resultado de oxidación y reducción en dos electrodos diferentes de un par de electrones, que puede mantenerse a una tensión adecuada para la oxidación y la reducción. En algunos casos, se puede utilizar un mismo marcador electroquímico para más de un tipo de nucleótido. Una diferencia en la difusión puede dar como resultado que se genere una corriente promedio diferente para los diferentes tipos de nucleótidos, como resultado, por ejemplo, de las diferentes velocidades de difusión de los diferentes nucleótidos. Las diferentes velocidades de difusión pueden ser el resultado de asociar un mismo marcador electroquímico con diferentes restos adicionales. Los diferentes restos adicionales pueden ser electroquímicamente inactivos. Los diferentes restos adicionales pueden retrasar la difusión de un marcador electroquímico que puede estar unido a un nucleótido.

En algunos casos, se pueden utilizar diferentes marcadores electroquímicos, y se puede medir la corriente asociada con un par de electrodos en diferentes momentos. Se puede utilizar un potencial diferente para uno o ambos electrodos con respecto al potencial de una solución a granel, de tal manera que las corrientes asociadas con diferentes pares de electrodos puede usarse para diferenciar diferentes marcadores electroquímicos.

En algunos casos, se puede utilizar más de un par de electrodos. Mas de unos pares de electrodos pueden estar asociados con un sitio de unión a enzima, de tal manera que más de un conjunto de un par de electrodos puede ser accesible por nucleótidos marcados. Los nucleótidos marcados (por ejemplo, marcadores asociados con nucleótidos) pueden estar unidos por una enzima. Los diferentes pares de electrodos pueden tener uno o ambos electrodos a diferentes potenciales con respecto a una solución a granel, de tal manera que las corrientes asociadas con diferentes pares de electrodos puede usarse para diferenciar diferentes marcadores electroquímicos.

En algunos casos, se puede usar una combinación de múltiples conjuntos de diferentes electrodos, de tal manera que dichas corrientes asociadas con diferentes pares de electrodos se pueden usar para diferenciar diferentes marcadores electroquímicos. Diferentes nucleótidos que pueden tener un mismo marcador electroquímico pueden comprender además uno o más restos adicionales, tales como proteínas. El uno o más restos adicionales pueden ser o no el mismo. En algunos casos, uno o más restos adicionales pueden ser diferentes, de tal manera que un mismo marcador electroquímico puede tener diferentes velocidades de difusión, y, por tanto, corrientes diferentes. En algunos casos, una única molécula de marcador puede comprender una nucleobase unida a través de un enlazador. En algunos casos, una única molécula de marcador puede comprender múltiples nucleobases unidas a través de uno o más enlazadores a un único marcador. En algunos casos, las múltiples nucleobases pueden ser de un mismo tipo de nucleobase. En algunos casos, algunas de las múltiples bases pueden comprender diferentes tipos de bases. Diferentes tipos de bases pueden comprender diferentes tipos de nucleobases, tales como adenosina o guanosina, o pueden ser nucleobases modificadas, por ejemplo, modificaciones epigenéticas o cualquier otro tipo de modificación, incluyendo modificaciones de la estructura principal. En algunos casos, una única molécula de marcador puede comprender una o más nucleobases, y uno o más marcadores, en donde los marcadores pueden ser el mismo o pueden ser diferentes, teniendo posiblemente diferentes mecanismos de unión, potencialmente con diferente cinética de unión, o diferentes conductancias.

En los casos donde múltiples marcadores se pueden unir juntos y asociarse con una o más nucleobases, se puede configurar un sistema tal que la cinética de unión pueda retrasarse con respecto a las capacidades de medición de la corriente de un sistema, y al menos una porción (por ejemplo, al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % o más) de los marcadores pueden identificarse como resultado de la cinética y/o la conductancia. Los marcadores pueden tener una conductancia diferente y/o una cinética de unión diferente. En algunos casos, para cada marcador, se pueden identificar alguna o todas las fracciones de los marcadores. En algunos casos, un resto unido a los marcadores puede identificarse como resultado de la identificación de los marcadores, permitiendo identificar un número más grande de diferentes tipos de restos de marcadores usando a la vez un número más pequeño de marcadores identificables individuales.

En algunos casos, se puede utilizar un mismo o diferentes restos de unión que puede ser un resto adherente. Se pueden utilizar restos de unión para diferentes tipos de bases. Diferentes tipos de bases pueden comprender modificaciones epigenéticas. Diferentes restos de unión pueden comprender diferentes secuencias. Diferentes secuencias pueden tener diferentes cinéticas, de tal manera que la conductancia promedio puede verse influenciada por la cinética. En algunos casos, pequeños cambios en una secuencia asociada con la unión a una SAM que comprende un polinucleótido pueden ocasionar solo pequeños cambios en la conductancia, pero pueden ocasionar sustanciales diferencias en el tiempo de unión promedio, haciendo por tanto una corriente promedio significativamente diferente.

En algunos casos, se pueden unir marcadores fluorescentes, marcadores de bloqueo de carga, o marcadores electroquímicos, unirse o asociarse con diferentes tipos de nucleótidos. En algunos casos, se pueden unir marcadores fluorescentes, marcadores de bloqueo de carga, o marcadores electroquímicos, unirse o asociarse con otros restos diferentes. Los ejemplos no limitantes de restos incluyen aminoácidos, sondas de oligonucleótidos, aptámeros, anticuerpos, o cualquier otro tipo de restos de unión o combinaciones de los mismos. En algunos casos, se puede efectuar la diferenciación entre diferentes restos diana mediante la unión o localización de un resto en un área de una región de detección, de tal manera que se puede detectar la interacción entre un resto y otro resto al cual se puede unir un marcador, y se pueden detectar diferentes restos diana detectando diferentes marcadores. En algunos casos, se pueden detectar diferentes restos usando ensayos similares a un ensayo de ligadura por proximidad. En un ensayo, dos diferentes restos de unión pueden unirse a un resto diana. Un aumento en la concentración local puede permitir una interacción adicional entre diferentes restos de unión, que pueden a continuación interactuar como resultado de la ligadura, hibridación u otra interacción de unión. La ligadura, la hibridación u otra interacción de unión pueden a continuación permitir la detección como resultado de la proximidad local de dos marcadores de restos de unión, como mediante por ejemplo, FRET entre dos fluoróforos diferentes; el emparejamiento electroquímico de dos restos electroquímicos en asociación con pares de electrodos en donde un potencial entre dos electrodos puede ser inapropiado para cualquiera de los restos electroquímicos individuales, pero puede ser apropiado para el par electroquímico; combinando dos marcadores de oligonucleótidos de efecto túnel y/o salto electrónico, en donde cualquier marcador puede ser demasiado corto para cubrir una separación entre dos electrodos de un par de electrodos o puede ser solo complementario a una SAM en un lado, pero una combinación hibridada o ligada de dos marcadores puede permitir la detección como resultado de extender la longitud de los marcadores combinados, que puede servir además para permitir la hibridación simultánea de las SAM en ambos electrodos de un par de electrodos.

En algunos casos, un bloqueante físico puede tener una carga neta, tal como una carga negativa o una carga positiva, o puede tener una carga neta neutra, o una carga positiva o negativa mínima, o puede tener un núcleo magnético o para magnético o un resto asociado, de tal manera que un bloqueante físico puede moverse en respuesta a una fuerza externa, tal como un campo eléctrico, un flujo electroendosmótico, una fuerza magnética o cualquier combinación de las mismas.

En algunos casos, un bloqueante físico puede unirse a una enzima, tal como una transcriptasa inversa o cualquier otro tipo deseado de enzima, y puede unirse a través de un enlazador adecuado, tal como un enlazador de alcano, un enlazador de PEG, o cualquier tipo de enlazador, que puede ser un polímero, un polímero quimérico, o un polímero combinado con otros restos. En algunos casos, se puede unir un bloqueante físico o unirse a un oligonucleótido complejado tras la complejación, por ejemplo, mediante ligadura; se puede proporcionar una porción no complejada de un bloqueante físico una concentración mayor, una concentración potencialmente mucho mayor que una concentración de porciones complejadas antes de la incorporación o la unión. En otros casos, un bloqueante físico puede alargarse antes o después de la complejación.

En algunos casos, un bloqueante físico puede comprender un ácido nucleico circular, que puede ser el ácido nucleico de una muestra circularizada, o puede ser un ácido nucleico sintético o natural copiado; un ácido nucleico circularizado puede complejarse y puede extenderse, creando por tanto una bola de ácido nucleico que puede actuar como un bloqueante físico, y puede extenderse tanto antes como después de la unión de una polimerasa u otra enzima a un sensor. Si un bloqueante físico que forma un ácido nucleico circular se extiende tras la unión o la incorporación de una polimerasa u otra enzima a un sensor, se puede proporcionar una polimerasa u otra enzima con una concentración suficientemente baja con respecto a una velocidad de unión que puede producir una extensión tal que un ácido nucleico circular extendido puede alargarse suficientemente con el fin de evitar la unión mediante otra polimerasa u otra enzima en un mismo sensor en donde se puede unir una polimerasa existente u otra enzima.

En algunos casos, la extensión de los ácidos nucleicos circulares puede evitarse en última instancia antes de la incorporación o unión a un sensor proporcionando un flujo continuo de polimerasas u otras enzimas adicionales, ácidos nucleicos circularizados, nucleótidos incorporables, y cationes divalentes catalíticos, en donde no todas las polimerasas u otras enzimas, ácidos nucleicos circularizados, nucleótidos incorporables, y cationes divalentes catalíticos pueden estar disponibles para la complejación y extensión antes de la introducción a un sensor.

En algunos casos, un bloqueante físico puede ser más grande que la anchura o espacio disponible de una separación entre los electrodos de un par de electrodos. Un bloqueante físico puede ser más largo que una longitud de los electrodos de un par de electrodos. En algunos casos, un bloqueante físico puede ser al menos de aproximadamente un 110%, 125%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200 % (o más) grande en anchura o longitud que los electrodos de un par de electrodos, de tal manera que incluso cuando se consideran factores que incluyen, por ejemplo, una longitud de enlazadores entre una enzima y una superficie de unión, las dimensiones de una enzima, y la longitud de cualquier enlazador desde una enzima a una superficie de unión en asociación con una estructura de electrodo que comprende un par de electrodos, más de una enzima y un par de bloqueantes físicos pueden no unirse a un mismo par de electrodos como resultado de interferir estéricamente un bloqueante físico con la unión de otra enzima y un par de bloqueantes físicos.

Limpieza de electrodos

En algunos casos, se puede efectuar la eliminación de una SAM mediante el uso de un campo eléctrico, como se ha descrito para la eliminación de la amina o el tiol de las SAM. En algunos casos, se puede eliminar una SAM y volverse a aplicar a los electrodos. En algunos casos, se puede eliminar una SAM y se puede aplicar un mismo tipo de SAM a un mismo electrodo(s) con el fin de renovar una SAM. En algunos casos, se puede eliminar una SAM, y se puede aplicar un tipo diferente de SAM a los electrodos.

En algunos casos, se puede limpiar una superficie de un par de electrodos. Se puede limpiar una superficie usando un proceso de limpieza electroquímica. Se puede combinar un proceso de limpieza electroquímica con una etapa de lavado para eliminar cualquier contaminante que pueda estar unido a la superficie de un electrodo antes de la introducción de los reactivos asociados con la formación de una SAM.

En algunos casos, se puede usar un proceso de limpieza electroquímica para eliminar contaminantes de la superficie de un electrodo tras aplicar una SAM. El proceso puede utilizar una tensión. La tensión puede ser suficiente para eliminar los contaminantes, pero insuficiente para eliminar la SAM.

En algunos casos, se puede utilizar la limpieza con plasma, al menos en parte para limpiar un sensor o conjunto de sensores. En algunos casos, se puede usar una limpieza oxidativa a alta temperatura para limpiar un sensor o conjunto de sensores. La temperatura puede ser mayor o igual a aproximadamente 500 °C, 600 °C, 700 °C, 800 °C, 900 °C, 1.000 °C, 1.100 °C, 1.200 °C, 1.300 °C, 1.400 °C, 1.500 °C, 1.600 °C, 1.700 °C, 1.800 °C, 1.900 °C, 2.000 °C o superior. En algunos casos, se puede utilizar una piraña, ácido sulfúrico, KOH, NaOH u otro método de limpieza oxidativa o reductiva para limpiar un sensor o conjunto de sensores.

En algunos casos, a fin de permitir la humectación de la estructura del sensor mediante un disolvente acuoso o principalmente acuoso, que puede utilizarse en un método con los sensores, la limpieza, que puede efectuarse antes de poner un disolvente principalmente acuoso en proximidad con sensores, o que puede efectuarse mediante el uso de disolventes miscibles, que no son principalmente acuosos, y que pueden sustituirse posteriormente con un disolvente principalmente acuoso, se pueden utilizar mezclas que reduzcan el ángulo de contacto, electrohumectación o una combinación de cualquiera de los anteriores. Por ejemplo, se pueden utilizar alcoholes para permitir la humectación cuando un disolvente principalmente acuoso puede ser incapaz de humectar completamente la estructura del sensor, que puede comprender una nanoseparación. En algunos casos, se puede usar un potencial de electrohumectación que puede tener -0,5V a -0,7V, -0,7V a -1,0V o menos de -1,0V con respecto a Ag/AgCl con el fin que se produzca una electrohumectación adecuada de la estructura de nanoseparación en donde se puede utilizar oro u otro metal noble en los electrodos de detección y de polarización. Se puede usar un potencial equivalente asociado con otros metales.

En algunos casos, la humectación y/o la limpieza de una estructura de sensor puede efectuarse usando una adición de un tensioactivo a un disolvente acuoso que puede, por otra parte ser incapaz de humectar la estructura del sensor. En algunos casos, un tensioactivo puede ser un tensioactivo no iónico tal como ésteres de glicerol o terdodecil mercaptano. En otros casos, un tensioactivo puede ser un tensioactivo aniónico tal como alquil éster sulfato o dodecil benceno sulfonato. En otros casos, un tensioactivo puede ser un tensioactivo catiónico tal como dodecil amina o imidazol. En otros casos más, un tensioactivo puede ser un tensioactivo anfótero, un tensioactivo de silicio, un tensioactivo fluorado, o un tensioactivo polimérico.

En algunos casos, la humectación y/o la limpieza pueden efectuarse con un alcohol, o una mezcla de alcohol y reactivos acuosos, que puede incluir una mezcla de KOH etanólica. Se puede utilizar un alcohol, o una mezcla de alcohol y reactivos acuosos, para limpiar las superficies del sensor de tal manera que se puede producir la humectación con un disolvente principalmente acuoso, o se puede producir la humectación con un reactivo principalmente acuoso debido a, por ejemplo, anclaje o histéresis tras la sustitución o dilución de un reactivo con un mayor contenido orgánico. En algunos casos, un disolvente principalmente acuoso puede contener disolventes no orgánicos. En algunos casos, un disolvente principalmente acuoso puede contener un porcentaje suficientemente bajo de disolvente orgánico (por ejemplo, menor o igual a aproximadamente 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 %, (% en peso, % en volumen, o % en moles) de tal manera que la actividad de una enzima utilizada como parte de un método de detección se puede inhibir en menos de o igual a aproximadamente 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, o menos.

En algunos casos, se puede efectuar la humectación de una estructura de sensor con un disolvente que puede no ser capaz por otra parte de humectar toda o parte de la estructura del sensor mediante la aplicación de un potencial de humectación a uno o más electrodos de un sensor o un conjunto de sensores, lo que puede incluir todos los sensores en una microplaca. En algunos casos, se puede efectuar el potencial del volumen del fluido usando electrodos de cuasi referencia, tal como, por ejemplo, un electrodo de referencia Ag/AgCl que puede usarse también como un contraelectrodo. En algunos casos, un contraelectrodo, que puede ser un electrodo de platino, se puede usar además de un electrodo de referencia, que puede ser un electrodo de Ag/AgCl.

En algunos casos, un contraelectrodo y/o un electrodo de referencia o un electrodo de cuasi referencia pueden incorporarse en una microplaca. Una estructura de microplaca puede incluir un sistema microfluídico, nanofluídico o macrofluídico. Un sistema fluídico puede integrarse como parte de un ensamblaje de microplaca. Un sistema fluídico puede ser una parte de un sistema fluídico externo. Un sistema fluídico puede estar corriente arriba o corriente abajo de una o más interfaces fluídicas en un ensamblaje de chip. En algunos casos, se pueden utilizar uno o más electrodos de referencia. Se pueden utilizar electrodos de referencia, que pueden incluir electrodos acuosos o no acuosos. Los electrodos de referencia pueden incluir un electro de referencia de calomelanos saturado, un electrodo de sulfato de cobre/cobreII, o cualquier otro electrodo de referencia adecuado. En algunos casos, se pueden utilizar diferentes tipos de contraelectrodos, incluyendo acero inoxidable, níquel, oro, o carbono.

En algunos casos, se puede utilizar un puente salino para separar los electrodos de referencia y/o los contraelectrodos de los electrodos del sensor, de tal manera que las sales adecuadas para, por ejemplo, un electrodo de referencia, no interfieran con el funcionamiento adecuado de los electrodos del sensor. Por ejemplo, los iones cloruro necesarios para la funcionalidad adecuada de un electrodo de referencia Ag/AgCl pueden dar como resultado la eliminación del oro, que puede ser una parte de un electrodo del sensor. Dicho puente salino puede incluir un polímero para evitar el movimiento fluídico que puede ser el resultado de presiones estáticas u otras fuentes de movimiento del volumen de fluido, o puede no incluir dicho polímero y puede por tanto permitir el intercambio fluídico a través de una ruta entre un electrodo de referencia y/o un contraelectrodo, y un par de electrodos del sensor o conjunto de electrodos del sensor.

En algunos casos, se puede utilizar un método para asegurar que se ha producido la humectación. Dicho método puede utilizar restos de ciclación rédox tales como ferrocenio/ferroceno, o derivados de ferroceno, o hexaminorutenio, en donde se pueden medir cambios en las corrientes electroquímicas, y las diferencias observadas pueden indicar la humectación de los electrodos y/o las nanoseparaciones asociadas con los electrodos del sensor, particularmente como una función de los potenciales y la histéresis y el anclaje. En algunos casos, se pueden medir las mediciones capacitivas de dobles capas asociadas con los electrodos de sensores, y se pueden medir cambios en la capacitancia como una forma de onda de CA, que se puede utilizar para determinar la capacitancia asociada con los electrodos de un sensor, y un potencial de CC, que se puede cambiar con el fin de determinar un potencial o los potenciales de humectación asociados con los electrodos de un sensor.

En algunos casos, se puede efectuar el potencial de humectación mediante un potencial negativo, que se puede aplicar a los electrodos de un sensor con respecto a un electrodo de referencia. Se puede efectuar un potencial negativo cambiando el potencial de uno o más electrodos de un conjunto de electrodos de un sensor, o puede efectuarse cambiando un potencial de un electrodo de referencia y/o un contraelectrodo con respecto a uno o más electrodos de un conjunto de electrodos de un sensor, o ambos potenciales de un conjunto de electrodos de un sensor y un potencial de referencia y/o los contraelectrodos se pueden cambiar uno respecto a otro. En algunos casos, un potencial de humectación puede variar para diferentes porciones de un sensor, por ejemplo, cuando se forma un electrodo con predominantemente un plano del cristal, por ejemplo, un plano del cristal 111, mientras que otro electrodo puede tener un plano del cristal diferente o una mezcla de planos de cristales. En dichos casos, se puede aplicar una tensión diferente para diferentes electrodos con respecto a un electrodo de referencia, de tal manera que diferentes potenciales de electrohumectación presenten diferentes planos de cristales y puedan por tanto desviarse de diferentes ángulos de humectación asociados con diferentes planos del cristal.

En algunos casos, un potencial o potenciales de deshumectación, que pueden alinearse con planos del cristal esperados como se ha descrito anteriormente en el presente documento, puede aplicarse de una manera similar a un potencial de humectación, lo que puede permitir una eliminación más rápida de fluidos que pueden estar efectivamente en contacto con un electrodo o conjunto de electrodos. Un fluido puede, por ejemplo, estar al menos parcialmente bloqueado para entrar en contacto con uno o más electrodos como resultado de una SAM que puede unirse a uno o más electrodos. Un fluido en contacto con dicha SAM puede considerarse que está en contacto eficaz con un electrodo o conjunto de electrodos. Un potencial de deshumectación puede permitir también que se produzca un intercambio de fluidos sin exponer un sensor o conjunto de sensores a una mezcla de fluidos como se produce normalmente cuando se sustituye un fluido por otro, como un sensor o conjunto de sensores pueden no estar en contacto eficaz con fluidos en el momento del intercambio. Por ejemplo, se puede intercambiar un conjunto de marcadores con otro conjunto de marcadores, o se puede intercambiar un conjunto de iones tales como calcio con otro conjunto de iones, tales como magnesio, y puede dejar una hebra de ADN extendida unida a una enzima, tal como una polimerasa solo con la hidratación que se esperaría de un entorno con una humedad del 100 por ciento. En algunos casos, una presión, que puede ser una presión positiva o negativa, puede utilizarse para ayudar a humectar las superficies, lo que puede incluir nanoseparaciones u otras estructuras de electrodos. En algunos casos, una presión, que puede ser una presión positiva o negativa, puede usarse con otros adyuvantes de la humectación tales como tensioactivos, disolventes de baja energía superficial, o electropotenciales.

Limpieza de los electrodos y monocapas autoensambladas unidas a los electrodos

En algunos casos, una monocapa autoensamblada (SAM) puede comprender ADN tiolado, en donde las monocapas en los diferentes electrodos pueden ser tener una misma secuencia de monocapa y/u orientación del ADN, en donde el extremo 3' o el extremo 5' puede estar unido a un grupo tiol u otro grupo enlazador y, por lo tanto, está unida a un electrodo. En algunos casos, se puede utilizar una secuencia y/u orientación diferentes para las monocapas de diferentes electrodos, en donde los diferentes electrodos pueden estar funcionalizados en grupos independientes como resultado de un cambio de potencial en el fluido volumétrico o de un potencial de polarización entre los electrodos, de modo que la tiolación se produce en algunos electrodos y no en otros electrodos aunque un tipo de compuesto monocapa esté disponible para su unión a un conjunto de electrodos. Los potenciales de un volumen de solución y/o los electrodos de polarización se pueden modificar de manera que puede producirse la tiolación de un conjunto de electrodos diferente. Dicha modificación se puede realizar de una forma que impida que nuevos grupos tiol se unan a un conjunto de electrodos sin que una monocapa se haya unido previamente, o se puede evitar sustancialmente que moléculas tioladas adicionales se unan como resultado de una ocupación completa de los sitios de unión mediante la monocapa existente.

En algunos casos, se pueden utilizar otros mecanismos de unión de manera que se mejoren las rutas de tunelación. Los ejemplos no limitantes de mecanismos de unión pueden incluir proteínas, anticuerpos, aptámeros, otros polímeros orgánicos o combinaciones de los mismos. La unión entre una porción de unión de un marcador y una SAM asociada con electrodos puede aumentar de forma deseable la corriente de efecto túnel o de efecto túnel y salto electrónico entre los electrodos.

En algunos casos, las SAM utilizan un único tiol para unirse a la superficie de electrodo. En algunos casos, un ditiol tal como un enlazador de carboditiolato se puede utilizar para formar al menos una parte de un compuesto SAM. En otros casos, aminas, diaminas, carboxilatos, fosfinas, alquilsiloxanos, triclorosilanos, perfluoroalquilos o cualesquiera otros grupos de unión adecuados se pueden utilizar para unirse a un electrodo o a un dieléctrico entre los electrodos u otras regiones asociadas con un conjunto de sensores.

En algunos casos, un método para unir una SAM puede comprender varias etapas, que pueden incluir: proporcionar una solución salina. La solución salina puede comprender: citrato de sodio salino (s Sc , NaCl 1 M citrato de sodio 100 mM); ácidos nucleicos hibridantes en la solución salina, que pueden comprender una secuencia GGG CCC GGG y un grupo tiol, que puede ser un grupo tiol o ditiol unido a una base, y otros ácidos nucleicos, que pueden ser complementarios o suficientemente complementarios para permanecer unidos. El método puede comprender además preparar conjuntos de pares de electrodos, que pueden comprender oro u otros metales nobles, mediante ebullición en solución piraña durante de 15 a 20 minutes, y después eliminar la solución piraña con agua limpia de 18 Gohm.

Una solución de ácidos nucleicos hibridados se puede poner por tanto en contacto con los conjuntos de pares de electrodos durante un periodo de tiempo que permita la unión de los ácidos nucleicos hibridados a los electrodos usando grupos tiol o ditiol. El tiempo de contacto puede ser mayor o igual a aproximadamente 1 minuto (min), 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min, 1,5 horas (h), 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 26 horas, 28 horas, 28 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, 45 horas, 50 h o más. En algunos casos, el tiempo de contacto puede ser menor o igual a aproximadamente 5 días, 4 días, 3 días, 2 días, 1 día, 20 horas, 15 horas, 10 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 2 horas, 1 h, 40 min, 20 min, 10 min, 5 min, 1 min, 30 segundos (s), 20 s, 10 s o menos. En algunos casos, el tiempo de contacto puede estar comprendido entre cualquiera dos de los valores descritos en el presente documento, por ejemplo, de aproximadamente 1 min a aproximadamente 10 min, de aproximadamente 1 h a 3 h, de aproximadamente 3 h a aproximadamente 10 h, o de aproximadamente 10 h a toda la noche. La solución de ácidos nucleicos hibridados se puede retirar y un lavado, que pueden comprender una solución salina o puede comprender agua limpia de 18 Gohm se puede usar a continuación para eliminar adicionalmente los posibles ácidos nucleicos hibridados no unidos.

En algunos casos, se puede utilizar una limpieza oxidante o reductora para limpiar los electrodos de polarización y de detección, que puede utilizar un barrido de potencial de ácido sulfúrico desde 0 hasta 1,2 V re Ag/AgCl, o puede usar un método para limpiar un conjunto de electrodos que puede comprender: aplicar una solución de KOH 10 mM; realizar un barrido de potencial del conjunto de electrodos desde 0,0 voltios hasta -1,3 V con respecto a Ag/AgCl; eliminar el potencial y, por lo tanto, la solución de KOH, seguido por un lavado con agua desionizada.

Como los ácidos nucleicos pueden formar enlaces de amina no deseados entre bases de ácidos nucleicos y una superficie, una solución de mercaptopropanol, mercaptoetanol, mercaptohexanol, metil mercaptano, 1-mercapto-llundecanol, 1-propanotiol, 2-propanotiol, Butanotiol, ferc-butil mercaptano, pentanotioles, tiofenol, ácido dimercaptosuccínico, ácido tioacético, ditioles u otros grupos sulfurosos que se puede unir a metales nobles se pueden usar como relleno. Los grupos sulfurosos pueden desplazar los enlaces de amina entre las bases y las superficies de los electrodos, y también pueden desplazar algunos ácidos nucleicos más grandes que pueden estar unidos a las superficies de los electrodos.

Los grupos sulfurosos, que pueden comprender mercaptopropanol, se pueden mezclar con una solución salina como se ha descrito anteriormente, y la mezcla de reactivos se puede poner en contacto con los electrodos, de manera que los grupos sulfurosos puedan unirse a los mismos. Una unión puede durar un tiempo menor o igual de aproximadamente 5 h, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 h, 50 min, 40 min, 30 min, 20 min, 10 min, 9 min, 8 min, 7 min, 6 min, 5 min, 4 min, 3 min, 2 min, 1 min o menos. En algunos casos, la unión puede durar al menos aproximadamente 1 min, 5 min, 10 min, 30 min, 50 min, 1 h, 2 h o más. En algunos casos, la unión puede durar de aproximadamente 1 min a 10 min, de aproximadamente 10 min a 30 min, de aproximadamente 30 min a 2h o durante más de 2 h. En algunos casos, se puede utilizar un potencial para acelerar la unión de una SAM a un electrodo, que puede ser un electrodo de detección o de polarización. Dicho potencial puede ser de -0,5 V a -0,2 V, de -0,2 V a 0,0 V, de 0,0 V a 0,2 V, o de 0,2 V a 0,5 V, todo relativo al Ag/AgCl cuando se utilizan electrodos de oro. En algunos casos, los potenciales se pueden modificar según sea apropiado para otros metales o referencias, tanto para la formación de las SAM como cuando sea apropiado para otros procesos en donde se pueden describir potenciales. En otros casos, se puede utilizar un barrido de potencial cuando un potencial óptimo para la unión de una SAM puede no conducir totalmente a la formación de una SAM debido a la atracción electrostática de otras porciones de una SAM; así, en algunos casos, n potencial puede alternar entre potenciales de superficie que pueden ser más óptimos para la unión y potenciales que pueden ser más óptimos para el impedimento estérico debido a la atracción de la superficie de otras partes de un resto SAM.

De este modo se puede eliminar una mezcla de reactivos que contiene un grupo sulfuroso, y los electrodos se pueden lavar, lo que puede ser con una solución salina y/o agua limpia de 18 Gohm.

En algunos casos, se pueden utilizar diferentes dendrímeros en las regiones de unión, que puede ser una región de unión a SAM. En algunos casos, un único dendrímero puede comprender múltiples restos de unión, tal como, por ejemplo, diferentes secuencias de ADN. En algunos casos, regiones de unión diferentes pueden comprender restos de unión diferentes. En algunos casos, múltiples restos de unión se pueden utilizar en una única región de unión. Como resultado de estas diferentes localizaciones de diferentes restos de unión, las regiones se pueden codificar eficazmente.

En algunos casos, un enlazador diferente, tal como un PEG, alcano o cualquier otro polímero adecuadamente funcionalizado con, por ejemplo, un tiol en un extremo, y otro grupo funcional en el otro extremo se puede utilizar para unirse a una o más ubicaciones de una enzima o polimerasa. En algunos casos, se puede usar más de un enlazador para unirse a una enzima o polimerasa en una posición.

En algunos casos, se pueden utilizar nucleótidos marcados en donde un nucleótido puede tener una carga neta negativa, una carga neta positiva o una carga neta neutra. En algunos casos, las SAM utilizadas para aumentar las corrientes de efecto túnel a través de los marcadores de efecto túnel y/o los marcadores de efecto túnel pueden utilizar nucleobases con cargas negativas, positivas, neutras o cualquier combinación de cargas en diferentes nucleobases.

En algunas realizaciones, las estructuras asociadas a los electrodos pueden tener una SAM aplicada de una forma específica. En primer lugar, un dispositivo se puede tratar añadiendo una SAM con un grupo funcional que se puede unir a un metal en ambos electrodos así como a superficies dieléctricas asociadas tal como un dieléctrico que puede constituir un separador entre un electrodo de polarización y un electrodo de detección, y conformar de este modo la parte inferior de una nanoseparación. A continuación se puede aplicar una tensión a un conjunto de electrodos con respecto a la solución volumétrica, para eliminar los grupos funcionales de los electrodos y, de esta manera, los grupos funcionales pueden permanecer sobre las superficies dieléctricas asociadas.

En algunos casos, las SAM se pueden formar usando aptámeros, lo que permite la unión y la detección de diversos tipos de moléculas, tales como proteínas. Se pueden usar diferentes oligonucleótidos para las SAM, y se pueden unir a diferentes partes de una proteína, y también se pueden diseñar para unirse muy cerca, entre sí sobre la superficie de una proteína, de manera que se pueden generar cantidades mayores de corriente. En algunos casos, las SAM se pueden formar usando varios tipos diferentes de aptámeros, los que permite la unión de varios tipos de proteínas y/o la unión más estrecha de una sola proteína.

En algunos casos, las SAM pueden comprender anticuerpos, lo que permite la detección de varios antígenos, incluidas varias proteínas, pero también una variedad de otros tipos de antígenos. Se pueden utilizar diferentes anticuerpos en diferentes electrodos de un par de electrodos, de manera que se puede crear un ensayo de tipo sándwich. Los anticuerpos se pueden utilizar como parte de un ruta conductora, que puede incluir un antígeno diana. En algunos casos, los anticuerpos se pueden combinar con aptámeros, bien para optimizar la unión y/o para optimizar la conductancia. Las SAM se pueden formar usando anticuerpos, lo que permite la detección de varios antígenos y se pueden formar con múltiples anticuerpos, lo que permite la detección de múltiples antígenos o la unión más específica a un solo antígeno.

Las SAM pueden comprender un mezcla de diferentes tipos de moléculas de unión, que pueden incluir uno o más tipos de ácidos nucleicos hibridantes, uno o más tipos de aptámeros, uno o más tipos de anticuerpos y uno o más tipos de cualquier otro resto de unión adecuado, y se pueden formar en cualquier proporción entre diferentes tipos de diferentes restos de unión.

Un par de electrodos se puede configurar con una SAM en un electrodo y ninguna SAM en un electrodo adjunto u opuesto. Las SAM pueden utilizar diferentes tipos de mecanismos de unión para unirse a un electrodo, tales como tioles, aminas y otros mecanismos de unión. Se pueden utilizar diferentes mecanismos de unión a la diana, por ejemplo, una SAM puede comprender un aptámero, mientras que una SAM en un electrodo opuesto/adjunto puede comprender un anticuerpo.

En algunos casos, se pueden utilizar mezclas de diferentes tipos de mecanismos de unión con una misma molécula de unión a diana. Por ejemplo, un mismo tipo aptámero se puede unir con aminas y tioles.

En algunos casos, se pueden utilizar diferentes moléculas de direccionamiento dentro de una SAM en un mismo electrodo, o en electrodos adjuntos/opuestos, de manera que múltiples dianas pueden ser el objetivo usando un mismo par de electrodos. Por ejemplo, diferentes proteínas con diferentes conductancias cuando se capturan pueden constituir dianas usando diferentes moléculas de unión o se pueden capturar usando una molécula de captura universal por unión, en donde diferentes conductancias pueden permitir la determinación de qué diana se ha capturado.

En algunos casos, la unión y/o liberación de una diana de la SAM se puede asistir mediante el uso de un campo eléctrico, como se ha descrito para mejorar la velocidad de unión al formar la amina o el tiol de las SAM, por ejemplo, aumentando la unión con hibridación o aumentando la velocidad de desnaturalización cambiando un potencial de los electrodos, que pueden ser diferentes potenciales que podrían corresponder en partes a diferencias en el plano del cristal, y adicionalmente pueden permitir emparejar el punto del plano del cristal de carga cero y el potencial asociado a un potencial de efecto túnel deseado entre los electrodos.

En algunos casos, las SAM se pueden formar con diferentes proporciones entre diferentes restos que comprenden una SAM. En algunos casos, la relación de unión a SAM puede no corresponder a una relación de molaridad, sino que puede ser también el resultado de diferentes tamaños y eficacias de unión de diferentes restos. En algunos casos, se puede formar una SAM con una mezcla de restos de unión y no unión de manera que el número de restos de unión en una superficie no esté vinculado a la cinética y al tiempo, sino que sea principalmente una reacción de competición. En algunos casos, numerosos tipos diferentes de restos pueden conformar una SAM, y se puede formar con relaciones entre diferentes elementos de unión formados principalmente por competición. Dichos restos pueden comprenden separadores, unión a marcadores, unión a dianas, restos de unión a enzimas, y pueden ser diferentes e instalarse a diferentes concentraciones sobre una o más superficies, o en una misma concentración sobre una o más superficies.

En algunos casos, en lugar de añadir una hebra de ácido nucleico o de otro polímero, un ácido nucleico u otro polímero se pueden sintetizar localmente. Una síntesis puede usar campos asociados a los electrodos de un par de electrodos para controlar la unión de las bases individuales según se desee de manera que se pueden generar diferentes secuencias en diferentes sensores, permitiendo por tanto, por ejemplo, que diferentes sensores detecten diferentes productos de amplificación a partir de una reacción de la PCR multiplexada en tiempo real, ensayo de hibridación o cualquier otro tipo de ensayo que pueda desear la detección de numerosos tipos diferentes de restos, por ejemplo, diferentes secuencias de polímeros de ácidos nucleicos.

En algunos casos, los campos eléctricos asociados a los electrodos de un par de electrodos pueden tener tensiones aplicadas en diferentes momentos de manera que permitan la unión de diferentes oligonucleótidos presintetizados y permitir que diferentes sensores detecten diferentes productos de amplificación a partir de una reacción de la PCR multiplexada en tiempo real, ensayo de hibridación o cualquier otro tipo de ensayo que pueda desear la detección de numerosos tipos diferentes de restos, por ejemplo, diferentes secuencias de polímeros de ácidos nucleicos.

En algunos casos, se puede formar una SAM utilizando una mezcla de restos de unión y de no de unión. Un resto de unión pueden comprender un polímero de ácido nucleico con una secuencia específica. Un resto no de unión puede comprender un polímero de ácido nucleico con una secuencia diferente, un polímero diferente tal como un polímero PEG, polímero de alcano u otro polímero adecuado que puede no unirse específicamente o no específicamente a un resto que se une específicamente a un resto de unión, o puede comprender un polímero quimérico que puede no unirse específicamente o no específicamente a un resto de unión, o puede comprender un resto no polimérico, que puede no unirse específicamente o no específicamente a un resto que se une específicamente a un resto de unión, de manera que numerosos restos de unión en la superficie de un electrodo pueden no estar vinculado a la cinética y al tiempo, sino en su lugar vinculado por competición entre diferentes restos competitivamente.

En algunos casos, un resto no de unión, que se puede utilizar con un electrodo que comprende un metal noble, tal como rutenio, rodio, paladio, plata, osmio, iridio, platino y oro, y puede comprender otros metales, puede utilizar una unión de tiol a un metal noble, y puede comprender un resto tal como una solución de mercaptopropanol, mercaptoetanol, mercaptohexanol, metil mercaptano, 1-mercapto-ll-undecanol, 1-propanotiol, 2-propanotiol, butanotiol, ferc-butil mercaptano, pentanotioles, tiofenol, ácido dimercaptosuccínico, ácido tioacético, ditioles u otros grupos sulfurosos que se puede unir a metales nobles. Dicho resto no de unión puede comprender además un alcano, PEG (polietilenglicol) u otro polímero, que puede tener cualquier longitud deseada, y puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 unidades de longitud.

En algunos casos, se puede usar un relleno. Un relleno puede comprender un resto no de unión como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Las etapas de dicho proceso pueden comprender un extremo adherido como se muestra en la Fig 1L, posteriormente llenar un relleno después de que se pueda formar una SAM de extremo adherido como se muestra en la Fig 1M; en casos adicionales, la concentración superficial de extremos adheridos se puede cuantificar mediante hibridación de un resto que puede ser de utilidad en un proceso de amplificación RTPCR y a continuación eliminar por lavado los restos RTPCR amplificables no hibridados como se muestra en la Fig IN, seguido por desnaturalización y captura de restos RTPCR amplificables como se muestra en la Fig 1O, y posteriormente cuantificar y normalizar con referencia al área de superficie y la eficacia de hibridación. En otros casos, se puede formar un relleno a la vez que una SAM que puede comprender restos de unión. En algunos casos, una SAM o al menos una parte de los restos que comprenden una SAM pueden ser hidrófilos, de manera que una superficie que puede tener una SAM unida a la misma, puede tener efectivamente tienen una energía superficial mayor y por lo tanto se puede humedecer con más facilidad.

En algunos casos, las relaciones entre diferentes elementos de unión se pueden establecer por competición, que puede incluir preferencias de unión como resultado de la utilización de diferentes separadores, unión a marcadores, unión a dianas, restos de unión a enzimas, que pueden ser diferentes y pueden estar asociadas con una superficie para crear diferentes concentraciones en la superficie o a una misma concentración en la superficie. Una concentración en solución puede ser igual o diferente. En algunos casos, una concentración en superficie eficaz puede ser igual o diferente como resultado de diferencias en el tamaño o en las eficacias de unión de los diferentes restos de unión.

En algunos casos, se pueden utilizar mezclas de diferentes tipos de mecanismos de unión con una misma molécula de unión a diana. Por ejemplo, un mismo tipo de aptámero se puede unir con aminas y tioles, o dos aptámeros diferentes se pueden unir usando métodos de unión diferentes.

En algunos casos, se pueden utilizar diferentes moléculas de direccionamiento dentro de una SAM en un mismo electrodo, o en electrodos adjuntos/opuestos, de manera que múltiples dianas pueden ser el objetivo usando el mismo par de electrodos. Por ejemplo, diferentes proteínas con diferentes conductancias cuando se capturan pueden constituir dianas usando diferentes moléculas de unión o se pueden capturar usando una molécula de captura universal por unión, en donde diferentes conductancias pueden permitir la determinación de qué diana se ha capturado.

En algunos casos, los electrodos se pueden configurar para capturar una única molécula o complejo, o se pueden configurar para capturar múltiples dianas del mismo tipo, en donde un nivel de corriente medido se puede utilizar para determinar el número de moléculas capturadas.

En algunos casos, un conjunto de electrodos se puede limpiar, y se puede crear una capa SAM sobre un conjunto de electrodos. Se pueden realizar diversas mediciones utilizando al menos una parte de un conjunto de electrodos y, de esta manera, la SAM se puede eliminar usando un proceso de limpieza. Otra SAM, que puede tener el mismo tipo de configuración, o de un tipo de configuración diferente, se puede aplicar y se pueden realizar mediciones adicionales. Dicho ciclo se puede repetir todas las veces que se desee. Un ciclo puede estar limitado, por ejemplo, por ensuciamiento o erosión de los sensores de la microplaca. Se puede utilizar un proceso de limpieza entre diferentes muestras, lo que permite una certidumbre adecuada de que una muestra anterior se ha eliminado, degradado o que se ha convertido por otra parte en algo tal que la medición posterior no se ve afectada con cierta tolerancia.

En algunos casos, se puede formar una SAM utilizando oligonucleótidos de hibridación. Los oligonucleótidos de hibridación se pueden configurar con un polímero enlazador de alcano o PEG unido a un extremo de un oligonucleótido de hibridación, que puede ser un extremo 3' o 5' de un oligonucleótido. Un grupo tiol o ditiol se puede unir a continuación a un extremo final de un alcano enlazador, PEG y otra cadena más conductiva de manera que algunos de los otros polímeros conductores descritos anteriormente en el presente documento, que se pueden utilizar por tanto para unirse a la superficie del electrodo. La longitud de un alcano o PEG u otro polímero enlazador conductor no está limitada, y puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 unidades o más de 10 unidades de longitud. En algunos casos, la longitud del polímero enlazador puede ser uniforme. En algunos casos, se pueden usar diferentes longitudes para diferentes restos de unión, o para un único tipo de resto de unión. En realizaciones adicionales, un relleno, que puede comprender un único tipo o diferentes tipos y puede comprender, una única longitud de un enlazador o diferentes longitudes. En algunos casos, una longitud utilizada para un resto no de unión puede ser la misma, o predominantemente la misma, que la longitud utilizada para un resto no de unión. Una longitud utilizada para un resto de unión puede ser más larga, o predominantemente más larga, que una longitud utilizada para un resto no de unión. Una longitud utilizada para un resto de unión puede ser más corta, o predominantemente más corta, que una longitud utilizada para un resto no de unión.

En algunos casos, una SAM, que puede utilizar un enlazador unido a un extremo 3' de un oligonucleótido de hibridación, se puede unir a un electrodo de un par de electrodos, mientras que un enlazador que puede estar unido a un extremo 5' de un oligonucleótido de hibridación se puede unir a otro electrodo de un par de electrodos. En algunos casos, la unión diferencial de un tipo de SAM a un electrodo de un par de electrodos, y un segundo tipo de SAM a un segundo electrodo de un par de electrodos, se puede llevar a cabo utilizando diferentes potenciales en diferentes momentos para diferentes electrodos.

Por ejemplo, usando electrodos de oro con un plano 111 del cristal y un electrodo de referencia de Ag/AgCl, con un primer tipo de SAM en la proximidad de ambos electrodos de un par de electrodos, se puede aplicar un potencial de -0,4 a un primer electrodo de un par de electrodos, consiguiendo así que una SAM se una a un primer electrodo, mientras que se puede aplicar 0,5 V a un segundo electrodo de un par de electrodos consiguiendo así que una SAM no se una a un segundo electrodo. A continuación, el potencial del primer electrodo de un par de electrodos se puede llevar a 0,5 V, evitando así la unión adicional, y un segundo tipo de SAM se puede poner en proximidad de ambos electrodos de un par de electrodos, y así se puede aplicar un potencial de -0,4 a un segundo electrodo de un par de electrodos consiguiendo así que una segunda SAM se una a un segundo electrodo, mientras que se puede aplicar 0,5 V a un primer electrodo del par de electrodos consiguiendo así que una segunda SAM no se una a un primer electrodo. Así, se pueden aplicar diferentes SAM a diferentes electrodos de un par de electrodos, lo que permite la hibridación de ambos extremos de una única hebra de ADNmc, dicha hebra de ADNmc, que puede ser un marcador y puede ser parcialmente bicatenario.

En algunos casos, las SAM se pueden formar usando oligonucleótidos que pueden sintetizarse externamente en su totalidad. De forma alternativa o adicional, cuando se desean direccionamientos muy personalizables, las SAM se pueden sintetizar al menos parcialmente usando uno o más campos eléctricos locales, en donde diferentes nucleobases se pueden introducir y unir en diferentes momentos sobre diferentes electrodos, por ejemplo, como se describe en Heller et. al. en el documento US5.929.208. La personalización se puede utilizar para realizar diferentes tipos de análisis utilizando diferentes conjuntos de sensores, o bien se puede utilizar de manera que se localicen y se unan diferentes porciones de una secuencia usando el direccionamiento, en donde los oligonucleótidos, que se pueden utilizar en el direccionamiento, se pueden unir a sensores de medición, o bien se pueden unir a electrodos adicionales que están separados de dichos electrodos utilizados para los sensores de medición, en donde se pueden utilizar electrodos adicionales solamente para el direccionamiento, o también se pueden utilizar con otro fin. La personalización puede ser el resultado de la síntesis local, o de la síntesis parcial local, o de la unión de oligonucleótidos sintetizados externamente a electrodos específicos o aleatorios.

Unión enzimática a superficies

En algunos casos, las regiones dieléctricas centrales pueden comprender titanio TiO², SiO², GeO², Si³N⁴u otros óxidos, carburos o nitruros. En algunos casos, se puede utilizar un grupo amidógeno para unir un enlazador o grupo funcional a una región dieléctrica central, tal como, por ejemplo, una región dieléctrica central de Si³N⁴. Un grupo amidógeno puede comprender uno o más de aldehído, éster, halogenuro, epóxido, imina, isocianato y combinaciones de los mismos. El ácido alcanofosfónico y NaN³se pueden usar para crear grupos funcionales de azida en las regiones dieléctricas centrales, especialmente en estructuras dieléctricas de TiO².

En algunos casos, los grupos funcionales de azida se pueden crear antes de unir una polimerasa al dispositivo utilizando grupos amina que pueden formar parte intrínseca de una polimerasa, o bien formar parte de un resto que está unido a una polimerasa, y que puede estar unido mediante un enlazador. En algunos casos, una parte de un enlazador que se puede usar para unir una polimerasa u otra enzima a un dieléctrico puede estar preparado para escindirse. En otros casos, los cloruros se pueden sustituir por grupos azida para funcionalizar el enlazador, y la funcionalización se puede llevar a cabo con un instrumento como parte de un ciclo o método de análisis.

En algunos casos, la unión o asociación con las regiones dieléctricas centrales puede comprender la silanización. La silanización puede utilizar aminopropiltrietoxisilano con activación mediante glutaraldehído. En algunos casos, los grupos de ácido carboxílico de los extremos, tales como los grupos de ésteres de ácido carboxílico, se pueden utilizar para unir a óxidos o nitratos. En algunos casos, los grupos funcionales de alquilo o alquenilo se pueden utilizar para unirse a superficies acabadas en hidrógeno de materiales dieléctricos. La unión puede llevarse a cabo opcionalmente usando fotoactivación.

En algunos casos, una enzima se puede modificar. Una enzima se puede modificar de manera que una parte funcional pueda tener el tamaño original de una enzima o polimerasa, aunque el tamaño global pueda estar ampliado. Dicha enzima o polimerasa modificada se puede disponer en un sensor que tenga la forma de la sección transversal de un cono invertido o pirámide invertida entre una porción superior y una porción de detección. A medida que las bases nucleotídicas con marcadores interactúan con una enzima o polimerasa, la enzima o polimerasa puede extender una parte bicatenaria de un ADN o polinucleótido diana en una base. Los electrodos detectores pueden generar una señal causada por la colocación o una concentración local eficaz elevada de un marcador de un enlace o base nucleotídica incorporada en una separación entre dos electrodos.

En algunos casos, una polimerasa puede estar asociada (por ejemplo, unida) a las paredes laterales de la estructura. La estructura puede comprender uno o más electrodos de una estructura del sensor. Una polimerasa se puede asociar a la estructura usando hibridación y/o ligadura. Una polimerasa se puede hibridar o ligar a un oligonucleótido que puede formar parte de una SAM. Se puede utilizar un oligonucleótido para facilitar corrientes de efecto túnel más altas mediante, por ejemplo, hibridación a un marcador de efecto túnel. En algunos casos, una polimerasa se puede hibridar o ligar a un oligonucleótido que no se va a utilizar para facilitar corrientes de efecto túnel más altas y puede tener una secuencia diferente a una secuencia que se puede usar mediante un oligonucleótido usado para facilitar corrientes de efecto túnel más altas.

En algunos casos, se pueden usar dos electrodos como un par de un solo sensor asociado a una enzima u otro resto para el que se puede desear la monitorización de la unión. En algunos casos, se puede utilizar más de un par de electrodos (por ejemplo, al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más pares de electrodos) junto con una enzima u otro resto para el que se desea la unión del marcador. En algunos casos, parte o todos los pares de electrodos pueden tener una misma separación entre ellos, o una diferente.

En algunos casos, un sistema puede comprender un único sensor. Un único sensor se puede configurar para monitorizar o detectar una sola enzima y/o analitos diana. En algunos casos, se pueden detectar múltiples enzimas y/o analitos diana simultánea o secuencialmente con un único sensor. En algunos casos, un sistema puede comprender una pluralidad de sensores, por ejemplo, una cantidad mayor o igual a aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más sensores. Cada sensor se puede configurar para monitorizar o detectar una o más enzimas y/o analitos diana.

En algunos casos, los sistemas de la presente divulgación pueden comprender un bloqueador (por ejemplo, un bloqueador físico). Un bloqueador físico se puede configurar para conseguir un porcentaje mayor (por ejemplo, mayor o igual que a aproximadamente un 35 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más) de pares de electrodos con una sola enzima u otro resto asociado a la misma en lugar de una distribución de Poisson. Los ejemplos no limitantes de bloqueantes físicos incluyen una nanoperla, nanobarra, complejo de proteínas, complejo de ADN, polímero de carbohidrato o complejo de carbohidrato, polímero, una gotícula de lípido adipocito, una gotícula de lípido no adipocito, nanoperlas de oro, nanoperlas de celulosa, nanoperlas de poliestireno, nanoperlas de látex o cualquier nanopartícula de tamaño adecuado o combinación de moléculas que puedan crear una nanopartícula del tamaño adecuado. En algunos casos, solamente un bloqueante físico se puede asociar con un par de electrodos.

En algunos casos, al menos una porción de un bloqueante físico comprende un polímero, que puede ser un polímero quimérico y puede tener el tamaño suficiente para comprender un bloqueante físico o una parte significativa de un bloqueante físico. En algunos casos, un polímero se puede funcionalizar en un primer extremo, y la enzima se puede unir al extendido funcionalizado.

En algunos casos, un enlazador, que puede ser un polímero o polímero quimérico, que une una enzima a la superficie de una estructura de electrodo, que puede comprender un par de electrodos, puede comprender un polímero de ácido nucleico, y un polímero de ácido nucleico puede comprender una secuencia tal que se pueda formar una estructura secundaria, y una estructura secundaria puede servir para formar un bloqueante físico que puede ser más grande que una secuencia aleatoria, se podría formar por otra parte.

En algunos casos, una enzima se puede unir a la superficie de una estructura de electrodo que puede comprender un par de electrodos mediante un enlazador, o se puede unir mediante más de un enlazador, aunque puede haber más de una correspondencia entre enzimas y bloqueantes físicos.

En algunos casos, un resto a observar se puede cargar en un dispositivo junto con un compuesto de carga o un reactivo de carga. Un compuesto de carga o reactivo de carga se puede eliminar a continuación antes de añadir un resto que interactúa con un resto anteriormente cargado. En algunos casos, un compuesto de carga puede comprender un polinucleótido, y puede también comprender un nucleótido unido a un cebador. En algunos casos, el cebador puede estar parcialmente extendido antes de la carga. En algunos casos, un compuesto de carga se puede retirar antes de proporcionar los nucleótidos y permitir que un primer resto cargado, que puede ser una polimerasa, se extienda completamente y libere un compuesto de carga, que puede ser un polinucleótido; los compuestos de carga liberados se pueden eliminar por tanto con cualesquiera nucleótidos, y los nucleótidos diana, que pueden cebarse antes de su introducción en un volumen de detección, o que se pueden introducir con cebadores, en donde el cebado se produce dentro de un volumen de detección; por lo tanto, los polinucleótidos cebador se pueden unir a polimerasas y por lo tanto se pueden secuenciar como se describen en el presente documento. En algunos casos, un compuesto de carga puede comprender ADN natural; en otros casos, un compuesto de carga puede comprender ADN no natural que se une a una polimerasa.

En algunos casos, un sistema puede crear opcionalmente un complejo diana. Un complejo diana puede comprender una polimerasa u otra enzima adecuada, una hebra de ácido nucleico de muestra o de prueba o una hebra de ácido nucleico de carga, y cationes divalentes no catalíticos o catalíticos adecuados para permitir la unión de la hebra de ácido nucleico a una polimerasa. Un complejo diana se puede introducir en una matriz de pares de electrodos del sensor, y por lo tanto se pueden unir a los electrodos de un par de electrodos. En algunos casos, un complejo diana se puede unir a un dieléctrico que puede comprender un material utilizado para formar una separación entre los electrodos de un par de electrodos, que puede ser de nitruro de silicio, óxido de silicio, óxido de germanio u otros materiales dieléctricos semiconductor convencionales.

En algunos casos, un resto que se puede unir a un complejo diana puede catalizar la eliminación de otros sitios de unión remanentes, donde un ligando de unión se usa para unirse a un complejo diana que puede quedar unido. Por ejemplo, una exonucleasa o enzima de corte se puede asociar con otras porciones deseadas de un complejo en un enlazador largo. Una enzima exonucleasa y/o endonucleasa puede escindir porciones de moléculas (^aDⁿen este ejemplo), de manera que otros complejos se pueden reducir o evitar. Por ejemplo, una enzima puede escindir progresivamente nucleobases desde un extremo de un ácido nucleico monocatenario, o bien una enzima que escinde ubicaciones diferentes a un extremo de una hebra de ácido nucleico monocatenario, pero no una hebra de ácido nucleico bicatenario, puede inactivar eficazmente con respecto a una hebra que se une a un complejo diana por tener una hebra unida a un complejo diana que se hibrida a un resto de unión que puede comprender un ácido nucleico sustancialmente complementario, formando así un ácido nucleico bicatenario, que no se degrade con las enzimas descritas.

En algunos casos, una muestra o hebra de ácido nucleico diana o conjunto de muestras o hebras de ácido nucleico diana se pueden introducir en una microplaca junto con un conjunto de cationes divalentes de manera que un complejo que comprende al menos una polimerasa, un catión divalente y una muestra o ácido nucleico diana se puede formar mediante complejación. Los cationes divalentes pueden ser catalíticos o no catalíticos, y se pueden introducir en el entorno fluido de una polimerasa de tal forma que un catión divalente se puede unir a un sitio activo catalítico o a una polimerasa antes de introducir una muestra o diana o ácido nucleico diana, después de introducir una muestra o un ácido nucleico diana, con una muestra o ácido nucleico diana, o cualquier combinación de los mismos.

En algunos casos, una hebra de ácido nucleico de muestra o de ensayo o una hebra de ácido nucleico de carga, puede comprender un extremo bicatenario complementario, de manera que una enzima con actividad exonucleasa no puede degradar una hebra de ácido nucleico de muestra o de ensayo o una hebra de ácido nucleico de carga. Una hebra de ácido nucleico de muestra o de ensayo o una hebra de ácido nucleico de carga se puede proteger de la degradación producida por una endonucleasa utilizando una hebra de ácido nucleico totalmente bicatenaria con un sitio de corte en un punto en donde se puede unir una polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena.

En algunos casos, una enzima se puede unir a un polímero de ácidos nucleicos o polímero quimera que puede comprender ácidos nucleicos que usan unión enzimática, pero que no puede ser una muestra o un ácido nucleico diana. En algunos casos, un polímero de ácido nucleico puede comprender una estructura en horquilla, permitiendo así el cebado y, por lo tanto, la unión enzimática de enzimas individuales a polímeros de ácidos nucleicos o polímeros quiméricos individuales que comprenden ácido nucleico. En otros casos, se puede proporcionar un polímero de ácido nucleico adicional, de manera que se puede formar una estructuras de ácido nucleico cebada, y se puede unir enzimáticamente mediante, por ejemplo, una polimerasa.

En algunos casos, se pueden proporcionar más copias de polímeros de ácidos nucleicos o quimeras que comprenden polímeros de ácidos nucleicos con respecto a numerosas enzimas, de manera que cada enzima se puede unir a un polímero de ácidos nucleicos o quimera que comprende un polímero de ácido nucleico. En algunos casos, se pueden proporcionar más copias de enzimas, de manera que cada polímero de ácidos nucleicos o quimera que comprende un polímero de ácido nucleico se puede unir a una enzima, formando de este modo una unión enzimática. De esta manera se puede llevar a cabo una etapa de separación, de tal manera que el resto proporcionado con mayor concentración con respecto a un resto proporcionado con menor concentración que no se une a un resto proporcionado a una menor concentración se puede eliminar de aquellos restos proporcionados a menor concentración, proporcionando de este modo uno o más complejos de enzimas y polímeros de ácidos nucleicos o quimeras que comprenden polímeros de ácidos nucleicos unidos usando unión enzimática.

En algunos casos, un segundo extremo de un polímero se puede unir a una perla o partícula magnética o paramagnética. En otros casos, un segundo extremo se puede funcionalizar de manera que un segundo extremo se puede unir a una superficie de una estructura de electrodo con un par de electrodos.

En algunos casos, un segundo extremo se puede unir a una perla o partícula magnética o paramagnética, y un segundo enlazador se puede unir a uno de una perla o partícula magnética, una enzima, o un enlazador que se une a una perla magnética o paramagnética, y una enzima. Un segundo enlazador, que se puede unir a un polímero en particular de un primer enlazador en un extremo, se puede unir a una superficie de una estructura de electrodo que puede comprender un par de electrodos.

En algunos casos, una polimerasa u otra enzima se puede unir o asociar con un electrodo u usando una SAM, en donde una SAM, que se puede unir a un electrodo o conjunto de electrodos, puede comprender una mezcla de restos, y puede comprender una mezcla de diferentes tipos de ácidos nucleicos, al menos un tipo de los cuales se puede utilizar como extremo adherido, y otro se puede utilizar para enlazar una polimerasa o una enzima. En algunos casos, las temperaturas de fusión eficaces entre un ácido nucleico que puede comprender un extremo adherido y un ácido nucleico que puede comprender un resto que se une a una polimerasa u otra enzima pueden ser diferentes, en donde una temperatura de fusión de un ácido nucleico que puede comprender un extremo adherido puede ser menor que una temperatura de fusión eficaz de un ácido nucleico que puede comprender un resto que se une a una polimerasa u otra enzima, y puede ser menor de 1 grados centígrado, de 2 a 5 grados centígrados, de 5 a 10 grados centígrados, de 10 a 20 grados centígrados, de 20 a 30 grados centígrados, o más de 30 grados centígrados para el mismo conjunto de condiciones dadas, que puede incluir concentraciones de sal, temperatura y disolvente. En otros casos, una SAM que se puede unir a una enzima o una polimerasa se puede unir a un dieléctrico, que puede ser un dieléctrico que puede servir como separador para separar los electrodos de un par de electrodos.

En algunos casos, una temperatura de funcionamiento que puede permitir la desnaturalización de un extremo adherido puede permitir que una polimerasa u otra enzima sigan hibridadas, y por lo tanto puede permitir un intercambio de tipos de marcadores o la eliminación de marcadores reteniendo las polimerasas o enzimas unidas.

En algunos casos, una polimerasa o enzima que se puede hibridar a una parte de SAM que puede ser complementaria de un ácido nucleico que se puede unir a la polimerasa o enzima, y por lo tanto unirse a una SAM, en donde una SAM puede comprender un ácido nucleico que puede ser parcialmente monocatenario y parcialmente bicatenario, de manera que un ácido nucleico unido a una polimerasa o enzima se puede unir a una SAM, o un ácido nucleico que puede estar unido a una polimerasa o enzima puede ser parcialmente bicatenario y parcialmente monocatenario, de manera que un ácido nucleico que comprende una porción de una SAM y un ácido nucleico unido a una polimerasa o enzima se pueden unir entre sí.

Uso de marcadores de efecto túnel para la secuenciación de ácidos nucleicos

En algunos casos, un método para identificar bases de nucleótidos puede incluir sintetizar un polinucleótido bicatenario entre dos electrodos mediante una polimerasa presente cerca de una separación entre dos electrodos, y detectar un aumento de la corriente de efecto túnel entre los electrodos a medida que las bases nucleotídicas se incorporan o se enlazan entre los dos electrodos. Se puede proporcionar una polimerasa con una hebra de ácido nucleico diana cebada, en donde una porción monocatenaria puede proporcionar un molde para incorporar (adición) nucleótidos complementarios, que pueden ser nucleótidos con marcadores de efecto túnel.

En algunos casos, se puede considerar que una enzima o polimerasa están cerca de una separación entre dos electrodos cuando un resto marcador unido a una enzima o polimerasa tiene la capacidad de unirse o interactuar con ambos electrodos de manera que se puede detectar una corriente de efecto túnel mensurable como resultado de una interacción del marcador unido a un resto marcado con ambos electrodos.

La incorporación o unión de una base con un marcador de efecto túnel puede producir un aumento en la corriente de efecto túnel que va de un electrodo al otro. Son posibles muchos otros métodos que pueden dar como resultado la localización de restos marcados, entre los que se incluyen como ejemplos no excluyentes, la hibridación del marcador de un nucleótido marcado, sondas marcadas, ligadura de sondas marcadas, la unión en una formación catenaria triple de una sonda marcada, unión de aminoácidos, que pueden marcarse mediante un ribosoma.

Un marcador de efecto túnel puede ser un resto o una sola molécula, o una sola molécula y un polímero de ácido nucleico parcialmente complementario hibridado unido reversiblemente a una base que se puede incorporar o unir, como se muestra en la Fig. 2A en donde se muestra un marcador de efecto túnel 200 con su extremo adherente unido a los extremos adherentes 201A y 201B, que están unidos respectivamente a los electrodos 202A y 202B. En algunos casos, se pueden unir diferentes marcadores a diferentes bases nucleotídicas y/o a diferentes tipos de bases nucleotídicas. Cuando un nucleótido se puede unir o incorporar a una polimerasa cercana a dos electrodos, se puede medir una corriente de efecto túnel asociada con una corriente de efecto túnel esperada para un marcador de efecto túnel a partir de diferentes bases nucleotídicas, como resultado de la localización de un tipo concreto de marcador de efecto túnel, que se puede asociar con una base que puede ser complementaria de una base interrogada. Por lo tanto, se pueden utilizar diferentes marcadores de efecto túnel para proporcionar una separación cómoda entre corrientes de efecto túnel resultado de la unión o incorporación de diferentes bases nucleotídicas. En algunos casos, se muestra en la Fig. 2B, un conjunto de nucleótidos unidos a marcadores 205 se pueden llevar al entorno fluido de una polimerasa u otra enzima 206, que está complejada con una hebra 207 de ADN que se extiende parcialmente en una separación parcialmente formada por los electrodos 202A y 2.2B. Durante ese tiempo en donde ningún nucleótido y el marcador 205 asociado pueden estar unidos a la polimerasa u otra enzima 206, esencialmente no puede fluir corriente entre los electrodos 202A y 202B. Así, como se muestra en la Fig 2C, un nucleótido complementario y el marcador 210 complementario asociado de una base interrogada de una hebra 207 de ADN que se extiende parcialmente del conjunto de nucleótidos 205 puede unirse mediante la polimerasa u otra enzima 206 en una separación parcialmente formada por los electrodos 202A y 202B, provocando así que pueda fluir una corriente entre los electrodos 202A y 202B. Tal como se muestra en la Fig. 2D, tras la eliminación de los nucleótidos no unidos del conjunto de nucleótidos con marcadores, un divalente catalítico se puede llevar al entorno fluido de la polimerasa 206 de manera que una incorporación del nucleótido se puede escindir del marcador del nucleótido complementario 211, y el marcador ahora no unido del marcador complementario 211 se puede eliminar por lavado del entorno fluido de la polimerasa u otra enzima 206.

En otros casos, el mismo marcador se puede unir a más de un tipo de nucleobase. Una nucleobase puede ser una nucleobase no modificada o una nucleobase modificada, en donde el tiempo de unión de una nucleobase puede ser diferente, con el fin de crear una diferencia distinguible en una corriente promedio.

En algunos casos, un marcador que se puede unir a una monocapa autoensamblada (SAM) se puede unir o asociar con una base nucleotídica. Un marcador se puede unir o asociar en 3' de un nucleótido, en 5' de un nucleótido, a una base de un nucleótido o a cualquier combinación de los mismos. Una unión o asociación se puede romper o disociar como resultado de un proceso enzimático, como resultado de una etapa química, tal como una escisión química o fotoquímica, o como resultado de la cinética o de un cambio de temperatura.

En algunos casos, diferentes tipos de bases pueden tener, en correspondencia, diferentes marcadores que se pueden introducir en un sistema, por ejemplo, en una solución acuosa. En un sensor en particular, cuando una base se puede incorporar o unir a una sola hebra mediante una polimerasa complejada, se puede utilizar una corriente de efecto túnel para identificar qué base o base modificada se ha unido o añadido asociada con diferentes corrientes de efecto túnel asociadas con diferentes marcadores en correspondencia con diferentes bases de nucleótidos o nucleobases modificadas.

En algunos casos, una vez que se ha medido la unión de una base con un marcador, una base con un terminador, que puede ser un terminador en 3', un terminador en 2' o cualquier otro tipo de terminador, se puede introducir en un sistema que puede evitar la incorporación posterior de bases de nucleótidos adicionales. Esto puede evitar los posibles problemas de error de fase. Esto, a su vez, permite utilizar lecturas prolongadas sin preocuparse de los errores de fase.

Puede evitarse la incorporación de una base con un marcador como resultado de utilizar un tampón sin los cationes catalíticos adecuados necesarios para la incorporación, o puede evitarse como resultado de utilizar un nucleótido que no se puede incorporar, tal como (sin limitación) un nucleótido con sustituciones en la cadena de fosfato, tales como sustitución del fosfato alfa, fosfato beta o ambos fosfatos con arsénico, Sn, Bi o N, un nucleótido de PNA, un nucleótido de L-ADN, un nucleótidos de ADN bloqueado, un ribonucleótido, un monofosfato de adenina, un difosfato de adenina, una adenosina, una desoxiadenosina, un monofosfato de guanina, un difosfato de guanina, guanosina, una desoxiguanosina, un monofosfato de timina, un difosfato de timina, 5-Metiluridina, una timidina, un monofosfato de citosina, un difosfato de citosina, citidina, una desoxicitidina, un monofosfato de uracilo, un difosfato de uracilo, una uridina y una desoxiuridina. Generalmente, un nucleótido que no se puede incorporar se puede unir mediante una polimerasa, pero no se incorporará a la hebra de un polinucleótido en crecimiento mediante la polimerasa. En otros casos, una vez que se ha medido la unión de una base con un marcador con un tampón que no tiene los cationes catalíticos adecuados para que produzca la incorporación de la polimerasa, un tampón sin cationes catalíticos se puede sustituir por un tampón no tiene nucleobases que se puedan incorporar, pero que tenga los cationes catalíticos adecuados tales como magnesio y/o manganeso. En algunos casos, un tampón usado para unir pero no incorporar nucleobases que contienen nucleobases se puede sustituir en primer lugar por un tampón no tiene nucleobases que se puedan incorporar, y que no tiene cationes catalíticos útiles para incorporación de nucleobases, aunque posteriormente se puede introducir un tampón con cationes catalíticos con el fin de permitir la incorporación de nucleobases que pueden seguir unidas.

En algunos casos, después de la incorporación de nucleobases, un nuevo tampón que carece que cationes catalíticos con nucleótidos marcadores de efecto túnel que se pueden incorporar puede sustituir un tampón que tiene cationes catalíticos. En algunos casos, la sustitución se puede llevar a cabo en dos etapas, en donde un nuevo tampón sin nucleobases que se pueden incorporar y que carece de cationes catalíticos se puede hacer fluir para sustituir un tampón con cationes catalíticos y, posteriormente, se puede introducir un tampón que carece de cationes catalíticos pero con nucleobases que se pueden incorporar con marcadores de efecto túnel.

En algunos casos se puede producir un proceso de medición mientras un tapón fuertemente unido a nucleobases se utiliza con polimerasas de modo que la polimerasa no libera eficazmente una nucleobase correcta (complementaria de una nucleobase en la hebra diana) tras la unión de una nucleobase correcta. Dicho tampón puede comprender al menos en parte iones calcio, pero puede no comprender otros cationes no catalíticos con capacidad de ocupar un sitio de unión a metal catalítico, en algunos casos, un tampón fuertemente unido a nucleobases puede unirse y no liberar una nucleobase tras la unión de una nucleobase hasta que las condiciones hayan cambiado. En otros casos, un tampón puede comprender calcio y otros metales que pueden ocupar un sitio de unión catalítico de una polimerasa, pero que permite a una polimerasa liberar una nucleobase complementaria unida. Dichos otros metales pueden comprender al menos en parte cinc, bario, estroncio u otros cationes metálicos divalentes. Las bases modificadas pueden ser incorporables o no incorporables. Las bases modificadas pueden comprender bases marcadas epigenéticamente modificadas con efecto túnel (u otros marcadores tales como etiquetas fluorescentes) de origen natural, o bien pueden ser nucleobases marcadas no naturales con efecto túnel (u otros marcadores tales como etiquetas fluorescentes). Así, en algunos casos, se pueden usar más de cuatro tipos de marcadores.

En algunos casos, la cinética de unión de un nucleótido, y de la complementariedad con una base interrogada, se pueden medir en función de una corriente realizada por etiquetas de efecto túnel asociadas, donde diferencias en modificaciones o carencia de las mismas en nucleobases complementarias se pueden medir en función de la cinética de unión. En algunos casos, las nucleobases modificadas marcadas se pueden utilizar para unirse durante un periodo de tiempo más largo o más corto a bases modificadas no epigenéticamente o a bases modificadas epigenéticamente. En algunos casos, la detección de la oxidación de guanina, que puede ser una guanina de ADN o una guanina de ARN, se puede detectar cuando la base guanina se oxida a 8-hidroxiguanina por los cambios en las eficacias de unión relativa con adenina, donde, tras su oxidación, la citosina de unión a adenina se vuelve similar a la cinética de unión a citosina.

En algunos casos, un único tipo de nucleótidos se puede añadir a un sistema para su incorporación a un tiempo. En este caso, no se necesitan marcadores diferenciados correspondientes a diferentes bases de nucleótidos que tienen características diferentes en su corriente de efecto túnel. En cambio, se busca encontrar si se ha producido la incorporación o unión. Si se registra una corriente de efecto túnel esperada, se puede identificar un tipo de base complementaria y de esta manera se puede secuenciar un polinucleótido. En otros casos, un único nucleótido incorporable marcado se puede combinar con otras nucleobases, en donde el resto de nucleobases pueden ser no incorporables como se ha descrito anteriormente en el presente documento. En algunos casos, un único tipo de nucleótidos se puede añadir a un sistema para su incorporación a un tiempo. En este caso, no se necesitan marcadores diferenciados correspondientes a diferentes bases de nucleótidos que tienen características diferentes en su corriente de efecto túnel.

En algunos casos, se pueden proporcionar cuatro o más tipos de nucleobases diferentes, en el que se puede proporcionar un conjunto de nucleobases con compuestos marcadores de efecto túnel unidos a las mismas por trifosfato, y las nucleobases pueden estar no terminadas. Por lo tanto, se puede producir una reacción sin necesidad de añadir nucleobases, etapas de lavado, etcétera, salvo cuando sea necesarios para reponer las concentraciones de nucleobases. Se pueden proporcionar a las nucleobases cationes de metales catalíticos tales como magnesio y manganeso, y adicionalmente se les pueden proporcionar cationes no catalíticos tales como calcio, cinc y otros cationes divalentes como se describe en el presente documento, de manera que la cinética de unión e incorporación de polimerasa se puede ralentizar de manera que la cinética de unión e incorporación se puede observar y medir con más facilidad.

En otros casos, se puede usar un método multietapa, en donde las nucleobases provistas pueden tener compuestos marcadores de efecto túnel unidos de forma reversible a una porción de una base de una nucleobase en lugar de estar unido a una porción de ribosa de una nucleobase. En algunos casos, se puede proporcionar un terminador como se describe en el presente documento, que puede estar unido en 3' de la ribosa de las nucleobases.

En algunos casos, se puede proporcionar un conjunto de nucleobases que pueden tener unidos uno o varios compuestos marcadores de efecto túnel y terminadores en 3' de manera que se realice la reacción de extensión de una sola base. En algunos casos, las nucleobases restantes se eliminarán antes de la lectura del par de electrodos detectores para determinar si, y en qué medida, los diferentes compuestos marcadores de efecto túnel se pueden unir como parte de una reacción de extensión; en otros casos, la medición se puede llevar a cabo antes de eliminar las nucleobases, ya que el fondo debido a la presencia de las nucleobases restantes no interfiere significativamente con la determinación de qué y cuándo es adecuado que compuestos marcadores de efecto túnel se pueden unir a una hebra extendida.

En algunos casos, el marcador de efecto túnel puede unirse a un terminador. En algunos casos, un marcador de efecto túnel puede estar unido a una cadena de fosfato. En algunos casos, un marcador puede estar unido a una base usando un enlazador escindible que no sea un terminador.

En algunos casos, los terminadores y los marcadores se pueden eliminan simultáneamente de una hebra extendida usando una sola etapa química, tal como una etapa de escisión con clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina. En otros casos, la escisión de los compuestos marcadores de efecto túnel y de los terminadores se puede producir como resultado de reacciones independientes. En algunos casos, se pueden utilizar diversos conjuntos de nucleobases y dejar unir a los complejos de polimerasa. Los conjuntos de nucleobases pueden comprender bases no modificadas, bases modificadas o combinaciones de bases modificadas y no modificadas.

En algunos casos, se pueden usar parejas de bases oscilantes como parte de un conjunto, en donde las parejas oscilantes pueden incluir guanina-uracilo (G-U), hipoxantina-uracilo (I-U), hipoxantina-adenina (I-A) e hipoxantinacitosina (I-C), entre otras parejas de bases oscilantes. En algunos casos, se puede realizar una etapa de lavado antes de introducir las nucleobases como se ha descrito anteriormente en el presente documento y comenzar de esta forma un nuevo ciclo de secuenciación. En algunos casos, los terminadores pueden comprender grupos 3'-ONH3, grupos 3'-O-alilo, grupos 3'-O -azidometilo, o pueden comprender combinaciones de un terminador y un compuesto marcador de efecto túnel similar a un Virtual Terminator™ que utiliza nucleobases con marcaje fluorescente tales como las utilizadas por Helicos, o puede utilizar combinaciones de terminador y compuesto marcador de efecto túnel similar a un Lightning Terminator™ que utiliza nucleobases con marcaje fluorescente tales como las usadas por LaserGen.

En algunos casos, las nucleobases pueden estar provistas de marcadores de efecto túnel unidos a una cadena de fosfato, que se puede extender de un trifosfato a un tetrafosfato, pentafosfato, hexafosfato, septafosfato o cadenas de fosfato más prolongadas, y puede también comprender un enlazador que puede comprender un alcano o poli(etilenglicol) u otra cadena enlazadora adecuada, que se puede configurar para que sea tan flexible como una cadena de alcano, o bien se puede configurar para que sea comparativamente inflexible como una cadena de alquileno.

En algunos casos, se puede usar para todas las bases un marcador de efecto túnel. A continuación se pueden introducir las nucleobases, en donde una o más bases pueden estar marcadas, y otras bases pueden no estar marcadas. Algunas o todas las bases pueden ser no incorporables. Los cationes metálicos divalentes catalíticos pueden no proporcionarse evitando de esta manera su incorporación. De esta manera se pueden proporcionar diferentes conjuntos de nucleobases en turnos, de manera que se pueden marcar diferentes tipos de nucleobases, y otras bases pueden estar no marcadas a la vez, de manera que utilizando la lógica booleana, se puede determinar la base complementaria de la siguiente base diana. Los conjuntos de bases se pueden eliminar por lavado usando una solución de reactivo que puede no contener cantidades suficientes de cationes divalentes adecuadas para las nucleobases de unión. Una solución de reactivo puede comprender cationes, que puede ser útil para retener la hibridación de la muestra de ADN y los cebadores o cebadores extendidos. Un conjunto posterior de nucleobases a analizar puede aportarse de modo que dicho conjunto posterior de nucleobases puede interactuar y unirse con los complejos de polimerasa. Un conjunto posterior de nucleobases puede comprender además uno o más cationes divalentes, de modo que dichas nucleobases posteriores se pueden unir sustancialmente más tiempo que lo que se unirían las bases posteriores en ausencia de cationes divalentes.

A continuación se puede proporcionar uno o más conjuntos de nucleobases terminadas o no terminadas que se pueden incorporar, con o sin cationes metálicos catalíticos, respectivamente, de manera que una sola base puede por tanto unirse o incorporarse, eliminarse las nucleobases restantes, y los cationes metálicos catalíticos proporcionados de manera que una base unida se puede incorporar según necesidad.

En algunos casos, puede necesitarse una amplificación no clonal cuando se utiliza una sola molécula de detección; en otros casos, se puede usar una población clonal para aumentar los niveles de señal, y un conjunto de polimerasas se puede asociar con una o más poblaciones clonales localizadas que pueden estar cerca de uno o más pares de electrodos.

En algunos casos, un método de la presente divulgación puede incluir:

a) introducir nucleótidos marcados y calcio divalente y posterior unión de los nucleótidos;

b) eliminar los nucleótidos marcados no unidos, usando una solución de lavado de calcio divalente;

c) leer los marcadores de los nucleótidos unidos, determinando de esta manera qué nucleótido está unido a cada sensor;

d) incorporar los nucleótidos unidos mediante introducción de magnesio y/o manganeso; y

e) eliminar el magnesio o manganeso usando una solución de lavado de calcio.

En algunos casos, un método de la presente divulgación puede incluir:

a) introducir uno o más tipos de nucleótido marcado y opcionalmente uno o más nucleótidos no marcados, que pueden ser nucleótidos naturales que incluyen nucleótidos modificados epigenéticamente o bien nucleótidos sintéticos, en una mezcla que comprende calcio y opcionalmente otros cationes divalentes no catalíticos; b) medir uno o más marcadores en calcio y opcionalmente al menos otro catión divalente no catalítico; determinar el tipo de marcador y opcionalmente la cinética del marcador;

c) eliminar por lavado uno o más marcadores con al menos un catión divalente diferente del calcio, magnesio y manganeso; y repitiendo opcionalmente las etapas a), b) y c) usando diferentes combinaciones de nucleótidos marcados, que pueden incluir otros tipos de nucleótidos;

d) introducir un conjunto de nucleótidos opcionalmente no marcados a incorporar en un tampón de calcio, que pueden ser bases canónicas o pueden ser bases modificadas epigenéticamente o bases sintéticas, para unirse a los nucleótidos,

e) eliminar por lavado los nucleótidos no unidos con un tampón de lavado de calcio;

f) introducir un tampón de magnesio y/o de manganeso e incorporar los nucleótidos unidos; y

g) eliminar el tampón de magnesio y/o manganeso con un tampón que no contenga magnesio y/o manganeso, que puede comprender otros cationes divalentes

Dicho proceso se muestra en un diagrama de flujo de proceso en la Fig. 2E, en donde, en la etapa 1, se puede introducir una polimerasa en un conjunto de nucleótidos, que se pueden unir en la etapa 2, tras lo cual, en la etapa 3, la polimerasa puede experimentar un cambio conformacional y puede cerrarse entre el pulgar y la palma uniendo con seguridad un nucleótido; desde allí, la polimerasa puede experimentar otro cambio conformacional y se puede abrir en la etapa 4 en donde puede liberar el nucleótido unido, y volver a la etapa 2; estas etapas 1-2-3-4-1 se pueden repetir varias veces antes de la etapa 5 en donde se puede producir una transferencia de fosforilo con la incorporación concomitante del nucleótido, seguido en la etapa 6 por la liberación de pirofosfato después de un cambio conformacional de la enzima que abre el pulgar desde la palma y el marcador asociado, seguido en la etapa 7 por el desplazamiento de la polimerasa hasta la siguiente base a interrogar y la migración difusiva del pirofosfato y el marcador desde el entorno fluido de la polimerasa.

Esta situación también se muestra gráficamente en la Fig. 2F en donde un nucleótido marcado se muestra entre dos estados (estructuras izquierda y central con la polimerasa asociada) que corresponde a los estados 1 y 3 de la Fig. 2E, en donde en el estado central, el nucleótido marcado está unido a la polimerasa y se sujeta durante un tiempo mientras el marcador se puede unir y liberar de los extremos adherentes unidos a los electrodos, lo que puede ser al menos parcialmente resultado del intercambio iónico en la polimerasa entre un catión que puede enlazar de forma fija el nucleótido y uno que puede permitir la liberación del nucleótido; después de un periodo de tiempo deseado, la mezcla de tampón se puede intercambiar, dando como resultado un único nucleótido unido mediante la polimerasa, sin otros nucleótidos en el entorno fluido de la polimerasa, y el tampón se puede cambiar para incluir al menos un catión divalente que puede dejar que la polimerasa incorpore el nucleótido unido, alcanzando de esta forma el estado mostrado en la estructura de la derecha. Por lo tanto, el procedimiento actual se puede representar gráficamente en la traza mostrada en la parte inferior de la Fig. 2F, en donde hay grupos de pulsos cortos, en donde los grupos corresponden a periodos de tiempo en donde una polimerasa se puede unir a un nucleótido, y los pulsos cortos de los grupos pueden corresponder a los períodos de tiempo durante los cuales la polimerasa se puede unir al nucleótido y también se puede hibridar a los extremos adherentes.

En algunos casos, los grupos de pulsos de corriente que resultan de la hibridación puede aparecer solamente cuando se ha unido un nucleótido, y cada grupo puede variar en anchura, tiempo entre grupos y magnitud de corriente promedio de los grupos. En otros casos, de una forma similar a la unión de nucleótidos, una anchura de pulso y el tiempo entre pulsos puede variar significativamente. Una magnitud de corriente promedio también puede cambiar para un mismo tipo de marcador o tipo de marcador, tanto en un único sensor o entre diferentes sensores; en algunos casos diferentes planos del cristal, diferentes anchuras de separación entre electrodos y ángulos concomitantes entre secciones bicatenarias tales como extremos pegados hibridados y extremos adherentes y porciones centrales bicatenarias de los marcadores, y la corriente resultante puede ser diferente dependiendo de qué extremo adherente de un conjunto de extremos adherentes accesibles ha dado en utilizar un una hibridación en particular. En otros casos, pueden aparecer pulsos aislados de otros nucleótidos aislados. Estos pueden dar lugar a un único pulso aislado o, menos frecuentemente, a un pequeño conjunto de pulsos, que pueden dar como resultado una corriente de fondo promedio con una distribución de corriente asociada. Dichas corrientes de fondo se pueden caracterizar, normalizar y eliminar de las señales medidas, en donde dicha normalización se puede llevar a cabo sobre una base global, una base del sensor individual, o un nivel de normalización intermedio adecuado.

En algunos casos, la detección simultánea y la formación y reformación de complejos se pueden utilizar usando nucleótidos marcados de manera diferente. Diferentes nucleótidos pueden tener cinéticas de unión enzimática diferentes, cinéticas de unión de hibridación diferentes, conductancias del marcador diferentes, o combinaciones de los mismos.

En otros casos, la cuantificación de un nivel de señal puede ser el resultado de la cinética, en donde una corriente promedio durante un periodo de tiempo puede indicar un tipo de marcador, y así se puede indicar un tipo de nucleótidos asociado al que puede estar unido un marcador, y un periodo de tiempo promedio durante el cual puede estar unido un marcador, por ejemplo, a un complejo que puede comprender una polimerasa, ácido nucleico cebado y nucleótido que comprende un marcador. Un nivel de corriente puede variar como resultado de la Kon y Koff de uno o más nucleótidos diferentes y los marcadores asociados.

En algunos casos, uno o más tipos de enzimas con actividad fosfatasa se pueden incluir en una mezcla de reacción, de modo que una o más enzimas con actividad fosfatasa pueden reducir el número de bases hidrolizadas y prevenir de esta manera el número de bases marcadas normalmente unidas a una enzima polimerasa que no está marcada, o bases que deberían ser incorporables, que no se incorporan debido a las cadenas de fosfato truncadas. En otros casos, una corriente promedio anticipada puede compensar la falta de señal debido a bases hidrolizadas rastreando señales promedio y compensando niveles crecientes de hidrólisis; la compensación se puede realizar usando una curva o fórmula del aumento esperado en el número o porcentaje de bases hidrolizadas, o se puede derivar a partir de los niveles de corriente medidos.

El uso de marcadores de efecto túnel para la secuenciación del ARN

En algunos casos, se pueden utilizar ARN polimerasas dependientes de ARN para un experimento de extensión para secuenciación del ARN, tales como las polimerasas dependientes de ARN utilizadas por los virus de ARN, tales como el polioviral 3Dpol, el virus de la estomatitis vesicular L, y la proteína no estructural NS5B del virus de la hepatitis C, o las ARN polimerasas dependientes de ARN eucariota.

En algunos casos, cuando una hebra de ARN de muestra se puede secuencia o se puede llevar a cabo un ensayo de determinación o cuantificación de la secuencias, se puede usar una ARN ligasa para unir cebadores universales o cebadores que también comprenden un código de barras, tales como la ARN ligasa 1 de T4, que puede ser útil para unir cebadores de ARNmc o bien cebadores que pueden comprender un código de barras, a una hebra de ARNmc de muestra, o la ARN ligasa 2 de T4, que puede ser útil para unir cebadores de ARN de horquilla o cebadores que pueden comprender un código de barras y pueden ser quiméricos de manera que un cebador puede comprender además ADN ligado a una hebra de ARNmc de muestra.

En algunos casos, se puede usar una transcriptasa inversa, tal como una transcriptasa inversa del VIH tales como la transcriptasa inversa de VIH-1 o VIH-2, una transcriptasa inversa comercial tales como Affinityscript (Agilent) (Arezi y Hogrefe 2009), Maxima (ThermoScientific), Rocketscript™ (Bioneer), Thermoscript™ (Life Technologies) y Monsterscript™ (Illumina) o (AccuScript; Stratagene), un retrotransposón no LTR o una transcriptasa inversa de los intrones del grupo II tales como las de Lactococcus lactis y Thermosynechococcus elongatus, una transcriptasa inversa de alta precisión tal como RTX (transcriptasa inversa xenopolimerasa), o la ADN polimerasa Phi6.

En algunos casos, puede producirse una detención de la transcriptasa inversa durante una etapa de secuenciación. Una base que produce una detención de la transcriptasa inversa, que puede ser una base natural o puede ser el resultado de una unión como se describe a continuación en el presente documento, se puede identificar, o simplemente se puede identificar como una posición de detención de la transcriptasa inversa, en donde no se puede identificar una base como resultado de un resto de unión. Se pueden producir múltiples etapas de secuenciación en donde se pueden producir lecturas repetidas de una misma ubicación con una detención de la transcriptasa inversa antes de una etapa de eliminación de un resto de unión o provisión de una base que puede ser un par de bases con una base modificada, permitiendo así la incorporación de una base complementaria y la posterior extensión adicional de una hebra complementaria en extensión.

En algunos casos, la detención de la transcriptasa inversa se puede llevar a cabo mediante una transcriptasa inversa. Una detención de la transcriptasa inversa puede ser el resultado de la incapacidad de una ARN polimerasa dependiente de ARN o de una ADN polimerasa dependiente de ADN para incorporar una base complementaria, bien debido a modificaciones en las bases o bien debido a restos de unión que se han unido a una base ocasionando una detención de la transcriptasa inversa.

En algunos casos, una detención de la transcriptasa inversa puede ser el resultado de una base modificada natural o de una base oxidada. Una etapa de secuenciación posterior puede utilizar una base modificada que puede tener la capacidad de emparejarse con una base que ha ocasionado una detención de la transcriptasa inversa.

En otros casos, la detención de la transcriptasa inversa se puede llevar a cabo mediante uno o más anticuerpos, enzimas u otras moléculas, o combinaciones de los mismos, preferentemente por unión o interacción con una o más bases modificadas. Una etapa de secuenciación posterior puede utilizar una base modificada, que se puede emparejar con una base modificada que ha ocasionado una detención de la transcriptasa inversa para permitir la incorporación de una base y permitir la extensión adicional de una hebra complementaria. En algunos casos, anticuerpos, enzimas u otras moléculas se pueden eliminar mediante una etapa de procesamiento, permitiendo así una extensión adicional de una hebra complementaria.

En algunos casos, se puede usar un método de secuenciación que puede ser un método de salto de lectura, de modo que se pueda detener la extensión adicional del cebador durante un periodo de salto como resultado de una detención de la transcriptasa inversa. Una etapa posterior puede identificar la base modificada que ha ocasionado una detención de la transcriptasa inversa, seguido por suficientes etapas de secuenciación para identificar una ubicación de detención de la transcriptasa inversa y la base modificada causante.

En algunos casos, especialmente cuando una polimerasa dependiente de ARN o ADN puede no tener actividad de desplazamiento, o puede tener una actividad de desplazamiento de cadena débil, se puede utilizar una ARN o ADN helicasa junto con polimerasa dependiente de ADN, ARN polimerasa dependiente de ARN o transcriptasa inversa para ayudar a leer a través de la estructura secundaria o para desplazar hebras complementarias, miARN, ARNinc u otros restos que puedan estar unidos a una hebra de ADN o ARN diana.

En algunos casos, una ARN o ADN helicasa se pueden unir mediante un enlazador a una ADN polimerasa, transcriptasa inversa o ARN polimerasa dependiente de ARN para mejorar la probabilidad de una operación conjunta, eliminando mejor la estructura secundaria. En algunos casos, se puede proporcionar una ARN o ADN helicasa no asociada a una ADN polimerasa, transcriptasa inversa o ARN polimerasa dependiente de ARN. En algunos casos, además de una ADN o ARN helicasa asociadas a una ADN polimerasa, transcriptasa inversa o ARN polimerasa dependiente de ARN, se pueden agregar proteínas auxiliares de polimerasa adicionales, tales como proteínas de unión monocatenarias. En algunos casos, se pueden utilizar ribosomas en lugar de polimerasas, de modo que conjuntos de ARNt marcados se pueden usar para descodificar los codones y proporcionar de este modo un mapa de codones de un ARNm, y/o proporcionar la supervisión directa de la traducción. En algunos casos, se pueden usar ribosomas con aminoácidos marcados, permitiendo de este modo la supervisión directa de la traducción.

El uso de marcadores de efecto túnel para otros métodos de secuenciación

En algunos casos, un sistema de detección por efecto túnel y/o salto electrónico puede usar un método que comprende el uso de ARN polimerasa dependiente de ARN, ADN polimerasa dependiente de ADN o transcriptasa inversa para crear una segunda hebra, en donde un cebador de horquilla se puede ligar a uno o ambos extremos de una hebra de ARN utilizando ligasas dependientes de ARN y/o dependientes de ADN y/o una ligasa genomanipulada que puede ligarse tanto al a Rn como al ADN para crear una hebra de forma circular que se puede leer repetidamente usando la polimerasa y los marcadores.

En algunos casos, se puede utilizar una ribozima como ARN polimerasa dependiente de ARN, que puede incluir ribozimas modificadas tales como la ribozima 24-3 u otras ribozimas modificadas. En algunos casos, se pueden usar otros cationes distintos a Mg, tales como manganeso u otros cationes divalentes para catalizar una reacción de incorporación que puede utilizar una nucleobase. Una nucleobase puede comprender nucleobases canónicas, epigenéticamente modificadas o sintéticas, que pueden comprender un azúcar ribosa o pueden comprender una cadena principal de cualquier otro tipo como se describe en el presente documento. En algunos casos, cationes no catalíticos, diferentes al Ca, se pueden usar para contener un nucleótido, que puede comprender nucleobases canónicas, epigenéticamente modificadas o sintéticas, y que pueden comprender un azúcar ribosa o puede tener una cadena principal de cualquier otro tipo, como se describe en el presente documento.

En otros casos, se puede usar una ADN o ARN ligasa para unir cebadores universales o cebadores que también pueden comprender un código de barras. Los cebadores pueden ser un cebador monocatenario, un cebador bicatenario o un cebador en horquilla. En algunos casos, un ensayo puede utilizar tanto ARN ligasa como ADN ligasa, por ejemplo, para una sola muestra, que comprende tanto ARN como ADN en la misma muestra, por ejemplo, para permitir la secuenciación tanto ARN como ADN de la misma muestra. Las ARN y ADN ligasas se pueden utilizar con diferentes alícuotas de una muestra en diferentes volúmenes de reacción. Los diferentes volúmenes de reacción pueden estar en diferentes áreas de una microplaca, en diferentes microplacas o en dispositivo fluídicos independientes. Las ARN y ADN ligasas se pueden utilizar para una sola muestra en un volumen o volúmenes de reacción común, que pueden estar en un área de una microplaca, en diferentes microplacas o en dispositivo fluídicos independientes.

Lecturas prolongadas

En algunas realizaciones, puede ser deseable realizar lecturas prolongadas o múltiples lecturas con separaciones entre medias cuando la secuenciación de regiones de secuencia repetitivas crearían, por otra parte, conjuntos de secuencias ambiguos. En algunos casos, una matriz de sensores puede permitir que un periodo de salto en un método de salto de lectura progrese a velocidades diferentes en diferentes porciones de una microplaca o microplacas. Una diferencia de velocidad puede ser el resultado de las diferencias en las concentraciones disponibles de los nucleótidos incorporados, diferencias de concentración de nucleótidos no incorporados, temperatura, tipos o variantes de la polimerasa o cualesquiera otros métodos que alteren la cinética de incorporación.

Cuando se desea una lectura prolongada, un ensayo puede proporcionar uno o más tipos de nucleótidos diferentes a la vez que proporciona cationes catalíticos tales como magnesio y/o manganeso durante un periodo de tiempo. Los datos se pueden recoger o no. Una secuencia puede estar determinada o no determinada, o puede estar parcialmente determinada. Durante un periodo de tiempo, una velocidad de incorporación puede ser mucho mayor de lo que sería posible por otros métodos, de modo que ciclos de periodos no catalíticos, periodos catalíticos y periodos de lavado se pueden utilizar de forma alternante.

En algunos casos, se pueden utilizar nucleótidos no marcados, o una mezcla de nucleótidos marcados y no marcados durante un periodo de tiempo que puede extender rápidamente un cebador, pero puede proporcionar o no datos de la secuencia de alta calidad. En algunos casos, de forma alternativa o adicional, se pueden utilizar nucleótidos marcados y/o no marcados junto con bases terminadas, donde las bases terminadas pueden dar como resultado evitar una extensión de la polimerasa adicional. En algunos casos, se pueden proporcionar los cuatro tipos de base sin terminar (AGCT), con un único tipo de base terminada. En algunos casos, se puede proporcionar menos o igual a aproximadamente tres tipos de bases no terminadas con uno o más tipos de bases terminadas. Uno o más tipos de bases terminadas puede comprender uno o más tipos de bases que no se proporcionan en un conjunto de bases no terminadas. Los uno o más tipos de bases terminadas pueden comprender uno o más tipos de bases que se proporcionan en un conjunto de bases no terminadas. Los uno o más tipos de bases terminadas pueden comprender una combinación de bases que se pueden proporcionar en un conjunto de bases no terminadas y bases que no se han proporcionado en un conjunto de bases no terminadas. En otros casos, se pueden usar diferentes conjuntos de bases no terminadas y/o terminadas, donde diferentes tipos de bases pueden estar terminadas o no terminadas en diferentes conjuntos de bases.

Las bases terminadas pueden tener los terminadores eliminados, y un mismo conjunto de bases, o un conjunto de bases diferente, se puede proporcionar de este modo, o un conjunto de ciclos como se describe en donde se pueden utilizar ciclos no catalíticos, catalíticos y de lavado. Las bases terminadas pueden comprenden ribosa en 3', o terminadores en 2', o pueden comprender terminadores virtuales, o Lightning Terminators™.

En algunos casos, los cationes divalentes no catalíticos pueden incluir calcio, escandio, titanio, vanadio, cromo, hierro, cobalto, níquel, cobre, cinc, galio, germanio, arsénico, selenio, rodio o estroncio, o mezclas de estos elementos. Los cationes catalíticos se pueden proporcionar en una concentración que permita la asociación de los cationes divalentes con ADNbc. Un ADNbc puede comprender marcadores, cebadores extendidos u otras fuentes de ADNbc que pueden estar en una celda de flujo, así como proporcionar cationes divalentes catalíticos adicionales para su unión a la polimerasa y/u otras enzimas.

En algunos casos, una ADN polimerasa se puede utilizar con nucleótidos de ADN. En otros casos, una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP o r Dp ) o ARNA replicasa tal como la ADN polimerasa phi6 se pueden utilizar con nucleótidos de ARN. En algunos casos, se puede proporcionar un cebador. Cuando se utilizar un RdRP, es posible que no se proporcione cebador, y la polimerasa se autoceba. En algunos casos, se puede llevar a cabo la detección de la estructura secundaria del ARN usando la cinética.

En algunos casos, los polímeros de ácidos nucleicos o las quimeras que comprenden polímeros de ácidos nucleicos pueden servir como restos de bloqueo enzimático, y se pueden eliminar tras la unión de las enzimas a las estructuras de los electrodos, que pueden comprender un par de electrodos. Un resto de bloqueo enzimático puede bloquear la extensión de un cebador, por ejemplo, mediante una polimerasa que puede no tener actividad de desplazamiento de cadena. Dicho resto de bloqueo enzimático se puede sintetizar, por ejemplo, de modo que no se utilicen enlaces fosfodiéster convencionales, y se pueden utilizar otros enlaces que no se escindan mediante la exoactividad de la polimerasa, tal como un enlace sulfodiéster, tiodiéster o arsenodiéster, o un fosfotioato, y puede tener un enlace o puede comprender un resto que no se degrade fácilmente mediante una exonucleasa en uno o más sitios de un polímero de ácidos nucleicos, lo que puede incluir una primera base que podría escindirse mediante la actividad exonucleasa de una polimerasa u otra enzima.

En algunos casos, la eliminación de los polímeros de ácidos nucleicos o quimeras se puede llevar a cabo proporcionando condiciones, que pueden incluir temperaturas, concentraciones de cationes divalentes, y pH, facilitando de esta manera la eliminación de los polímeros de ácidos nucleicos o quimeras que pueden comprender polímeros de ácidos nucleicos usados como bloqueadores enzimáticos procedentes de enzimas, y se pueden combinar con otros polímeros, que pueden servir como bloqueantes enzimáticos para impedir el acceso de un complejo posterior, permitiendo de esta manera la posterior introducción de una muestra de ácidos nucleicos, y la posterior secuenciación o identificación de la secuencia de la muestra de ácidos nucleicos.

En algunos casos, los polímeros de ácidos nucleicos o quimeras, que pueden comprender ácidos nucleicos, pueden tener un sitio de corte con una segunda cadena ampliando el sitio de corte, de manera que, tras la unión de un complejo de enzima bloqueador enzimático a una estructura de electrodo, se pueden proporcionar los nucleótidos, y una enzima, que pueden tener capacidades de desplazamiento de cadena, puede extender el polímero de ácidos nucleicos o quimera que pueden comprender un polímero de ácidos nucleicos, desplazando una segunda hebra, y liberando así el polímero de ácidos nucleicos o quimera que puede comprender un polímero de ácidos nucleicos. En algunos casos, los polímeros de ácidos nucleicos o quimera que pueden comprender ácidos nucleicos pueden tener un sitio de corte con una segunda cadena ampliando un sitio de corte, de manera que, tras la unión de un complejo de enzima bloqueador enzimático a una estructura de electrodo, temperatura y otras condiciones, tales como las concentraciones de sal pueden variar, de manera que se puede desnaturalizar una segunda hebra, pero reteniendo la funcionalidad de una enzima. En algunos casos, a continuación se pueden proporcionar nucleótidos, y una enzima, que puede no tener capacidades de desplazamiento de cadena, puede extender un polímero de ácidos nucleicos o quimera que pueden comprender un polímero de ácidos nucleicos, liberando así el polímero de ácidos nucleicos o quimera que pueden comprender un polímero de ácidos nucleicos.

En algunos casos, un bloqueador enzimático o enlazador puede comprender un polímero de ácidos nucleicos, y se puede usar una enzima de corte para escindir un polímero de ácidos nucleicos en una ubicación específica y liberar el bloqueador enzimático o el enlazador de, por ejemplo, una superficie. En algunos casos, un bloqueador enzimático o enlazador puede comprender un polímero de aminoácidos, y se puede usar una endoproteinasa específica de sitio para escindir el polímero de aminoácidos en una ubicación específica (o sitio) y liberar el bloqueador enzimático o el enlazador de, por ejemplo, una superficie. En algunos casos, un bloqueador enzimático o enlazador pueden comprender una parte de los mismos que se puede escindir selectivamente usando una escisión química en lugar de una escisión bioquímica.

En algunos casos, para aumentar la cobertura eficaz, se puede repetir el proceso de corte, lo que permite volver a leer una hebra de muestra previamente extendida. En otros casos, se puede utilizar una unión químicamente escindible, bien además de, o en lugar de, un sitio de corte para permitir que se forme un corte.

En algunos casos, se pueden proporcionar uno o más restos, que pueden tener actividad fosfatasa, junto con un conjunto de nucleótidos marcados; dichos restos pueden incluir fosfatasas tales como la fosfatasa alcalina de gamba, nucleotideasas y otras diversas enzimas y agentes de escisión química conocidos. Dicho resto con actividad fosfatasa puede evitar la unión y potencial incorporación de un tipo de nucleótido marcado que se ha hidrolizado de manera que puede estar no marcado y que potencialmente se puede incorporar.

En otros casos, para compensar el cambio en los porcentajes de nucleótidos no marcados con respecto a los nucleótidos marcados, especialmente en un método que puede medir numerosas velocidades de unión de nucleótidos diferentes para determinar un tipo de base interrogada, que puede incluir la determinación de, por ejemplo, el estado de metilación de una base interrogada, mediciones de bases conocidas o mediciones de histogramas se puede utilizar para compensar los niveles de señal promedio variables que pueden ser el resultado de un cambio en el nivel porcentual de nucleótidos no marcados, y/o para otros fines tales como errores en el control de la temperatura, concentración de sal u otros factores que podrían afectar la cinética y/o el nivel de la señal de una medición. En otros casos, cambios previamente medidos y por tanto asumidos en el nivel de señal se pueden utilizar para compensar los cambios esperados en el nivel de la señal durante la totalidad de un ciclo de análisis.

En algunos casos, se puede determinar la epigenética del ARN o ADN. En otros casos, se puede determinar la epigenética tanto del ARN como del ADN mediante una parte de un solo sistema. La epigenética del ARN y ADN se puede determinar en diferentes volúmenes o diferentes microplacas, en diferentes volúmenes de una misma microplaca, o en un volumen común en una o más microplacas.

En algunos casos, la epigenética del ARN y ADN se puede determinar a partir de una sola célula o conjunto de células que se han aislado, por ejemplo, mediante citometría de flujo, por tener características consistentes, tal como el tamaño, rugosidad o sitios de unión específicos, a los que se puede unir un anticuerpo o aptámero para su identificación, separación y aislamiento.

En algunos casos, para detener en una ubicación deseada, o para limitar la longitud de una serie de eventos de incorporación que no están regulados de otro modo, la incorporación de polimerasa se puede detener mediante el uso de, por ejemplo, sondas que no se pueden eliminar mediante la acción de la polimerasa, tales como el desplazamiento de cadena o la actividad exonucleasa 3' a 5'. Dicha sonda puede ser una sonda dirigida o puede ser una sonda aleatoria. Una sonda puede comprender un grupo sulfuro, de manera que la actividad exonucleasa 3' a 5' se puede inhibir, o se puede utilizar un ADN bloqueado no cargado para evitar que la actividad de desplazamiento de cadena pueda desplazar la sonda. De este modo, se puede utilizar un procedimiento de lavado para eliminar las nucleobases y/o los cationes divalentes catalíticos. Por ejemplo, la temperatura se puede aumentar y/o la concentración de sal se puede reducir para permitir la eliminación de la una o más sondas. Un método de secuenciación como se describe en el presente documento puede comenzarse o recomenzarse a continuación.

En algunos casos, las concentraciones de sal y/o los tiempos de integración utilizados para observar la unión y/o la cinética de los diferentes conjuntos de nucleótidos como se ha descrito anteriormente en el presente documento en etapas a) y b) opcionalmente repetidas como se ha descrito anteriormente en el presente documento pueden ser iguales para diferentes conjuntos de nucleótidos. En otros casos, la concentración de sal y/o el tiempo de integración pueden ser diferentes para diferentes conjuntos de nucleótidos si se desea, por ejemplo, para alcanzar un nivel de confianza deseado asociado con la detección de la modificación epigenética.

En algunos casos, un sistema de detección por efecto túnel y/o salto electrónico puede utilizar un método que solamente utiliza bases canónicas, u otras bases, que pueden ser bases epigenéticas naturales o bases sintéticas, según se determine que proporciona los menores errores de incorporación al considerar bien una incorporación de una base en particular o adjuntar una base cuando se utiliza en particular una ARN polimerasa dependiente de ARN, ADN polimerasa dependiente de ADN o transcriptasa inversa para extender un cebador u conformar de este modo una segunda hebra, que puede ser una hebra de ARN, ADN o ADNc. En algunos casos, se pueden utilizar bases modificadas adicionales para evitar la detención de la enzima de polimerización, tal como la transcriptasa inversa, como resultado de modificaciones epigenéticas tales como N1-adenosina, M3-metilcitosina, N1-metilguanosina u otras bases modificadas que pueden dar como resultado una menor unión o impedimento estérico.

En algunos casos, se pueden utilizar modificaciones epigenéticas para los ARNt, mientras que en otros casos, se puede utilizar un ARNt con diferentes modificaciones epigenéticas. De manera similar, se pueden utilizar aminoácidos no modificados, mientras que en otros casos, se pueden utilizar aminoácidos no epigenéticamente modificados.

En algunos casos, se puede usar un resto de unión específica a una base modificada. Un resto de unión específica a una base modificada puede comprender una proteína de unión a m6A tales como YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3 o YTHDC1. Un resto de unión específica a una base modificada se puede utilizar junto con uno o más conjuntos de nucleótidos como parte de determinar una base y/o modificaciones epigenéticas de la misma. Un resto de unión específica a una base modificada puede comprender un marcador de efecto túnel. Un resto de unión específica a una base modificada puede estar no marcado, pero puede alterar la cinética de unión y/o los tiempos entre eventos de unión de otros restos marcados tales como nucleótidos marcados. En otros casos, se pueden usar bases modificadas o sintéticas para evitar que la transcriptasa inversa se detenga, limitando o eliminando de este modo el truncamiento de la producción de ADNc y, por lo tanto, permitiendo la lectura de una hebra de ARN completa o más completa.

En algunos casos, se pueden utilizar anticuerpos. Los anticuerpos se pueden unir fuerte o débilmente a una nucleobase en particular, tales como los nucleótidos m6A. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, en donde la cinética y la corriente asociada con la unión de nucleótidos complementarios marcados a los nucleótidos de la muestra, que comprende una hebra de polinucleótido de la muestra que se está interrogado mediante un complejo de polimerasa, en donde los nucleótidos de la muestra pueden tener diversas modificaciones epigenéticas que pueden diferenciarse mejor de este modo.

En algunos casos, las bases "modificadas" incluyen: 5-metilcitosina, N6-metiladenosina, N3-metiladenosina, N7-metilguanosina, 5-hidroximetilcitosina, pseudouridina, tiouridina, isoguanosina, isocitosina, dihidrouridina, queuosina, wiosina, inosina, triazol, diaminopurina, p-D-glucopiranosiloximetiluracilo, 8-oxoguanosina o 2'-O-metil adenosina, 2'-O-metil citidina, 2'-O-metil guanosina o 2'-O-metil uridina además de los nucleótidos de ADN y ARN canónicos y otros nucleótidos no naturales se pueden utilizar para determinar la identidad de una bases en interrogación, en donde la identidad de una base que se está identificando puede ser cualquier nucleótido de ADN y ARN canónico, o puede ser 5-metilcitosina, N6-metiladenosina, N3-metiladenosina, N7-metilguanosina, 5-hidroximetilcitosina, pseudouridina, tiouridina, isoguanosina, isocitosina, dihidrouridina, queuosina, wiosina, inosina, triazol, diaminopurina, p-D-glucopiranosiloximetiluracilo, 8-oxoguanosina o 2'-O-metil adenosina, 2'-O-metil citidina, 2'-O-metil guanosina o 2'-O-metil uridina.

El uso de marcadores de efecto túnel para otras aplicaciones

En algunos casos, los compuestos marcadores de efecto túnel y pares de electrodos de efecto túnel que se han descrito anteriormente en el presente documento se pueden utilizar para aplicaciones diferentes a la secuenciación de ADN. En algunos casos, muchas hebras de ácido nucleico diferentes que conforman una SAM complementaria de muchas dianas diferentes pueden unirse a diferentes conjuntos de pares de electrodos antes de introducir los ácidos nucleicos diana, y se pueden llevar a cabo mediciones de corrientes de efecto túnel como resultado de la hibridación de ácidos nucleicos diana. En algunos casos, las hebras de ácido nucleico que conforman una SAM pueden comprender cremalleras o códigos de barras, que permiten la detección de muchos tipos diferentes de moléculas diana, con un conjunto normalizado de muchos tipos de hebras de ácido nucleico diferentes que conforman un SAM. En algunos casos, los muchos tipos de hebras de ácido nucleico diferentes que conforman una SAM se pueden unir a diferentes conjuntos de electrodos como parte de un proceso fabril, y enviarse como un conjunto completo de muchas hebras de ácido nucleico diferentes que conforman una SAM. En otros casos, los muchos tipos de hebras de ácido nucleico diferentes que conforman las SAM pueden estar formados como parte de un método realizado por un instrumento de campo.

En algunos casos, las hebras de ácido nucleico que conforman al menos parte de una SAM pueden comprender una modificación de la base. Una modificación de la base puede ser una tiolación de un alfa-fosfato de una nucleobase, de modo que dichas hebras de ácido nucleico pueden no extenderse como parte de un proceso de amplificación, sino en su lugar, solamente pueden hibridarse con una diana o amplicón. En algunos casos, las hebras de ácido nucleico pueden ser extensibles o no. Cuando las hebras de ácido nucleico son extensibles, se puede formar un ácido nucleico bicatenario durante el proceso de amplificación.

En algunos casos, se pueden permitir cebadores universales como resultado de realizar una ligadura de extremo enromado. La ligadura se puede llevar a cabo en un instrumento. Un instrumento puede formar un sistema con una microplaca como se ha descrito anteriormente en el presente documento. La ligadura se puede llevar a cabo dentro de una microplaca, por ejemplo, en volúmenes separados de los volúmenes que contienen los pares de electrodos usados para la secuenciación. La ligadura se puede llevar a cabo bien manualmente o en otro equipo separado del equipo que puede formar un sistema con una microplaca como se describe anteriormente en el presente documento.

En otros casos, los cebadores se pueden ligar usando hibridación y, a continuación, la ligadura se representa como se describe a continuación en el presente documento con respecto a la Fig. 4. La hibridación puede ser específica, usando sondas complementarias de las regiones deseadas. En algunos casos, la hibridación se puede llevar a cabo usando bases universales tales como inosina para una sección que puede solapar con un extremo de un ácido nucleico diana.

En algunos casos, un par de electrodos de detección por efecto túnel se puede funcionalizar con una SAM. Una SAM puede comprender al menos parcialmente una hebra de ácido nucleico. Una SAM puede utilizar la misma hebra de ácido nucleico en ambos electrodos de un par de electrodos, facilitando así el proceso de fabricación de las SAM. En algunos casos, un compuesto marcador de efecto túnel puede producir corrientes de efecto túnel diferentes cuando se aplica un potencial en distintas direcciones, debido a, por ejemplo, una construcción con asimetría atómica, como es frecuentemente el caso de los compuestos utilizados en dispositivos moleculares.

En algunos casos, un par de electrodos de corriente de efecto túnel se puede usar como parte de un sistema para detectar PCR cuantitativa o PCR digital. El par de electrodos de corriente con efecto túnel puede comprender SAM. Las SAM pueden comprender secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, hebras de ácido nucleico). Las hebras de ácido nucleico pueden ser al menos parcialmente complementarias de una sonda de cola proporcionada en solución. Una sonda de cola se puede consumir en una reacción de amplificación, tal como una reacción de la PCR o una reacción isotérmica (por ejemplo, amplificación por de desplazamiento de cadena (SDA) o amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). La una o más SAM en un electrodo de un par de electrodos puede ser al menos parcialmente complementario de la cola de una sonda. Otro electrodo de un par de electrodos puede ser al menos parcialmente complementario de una parte de la sonda. Una parte de una sonda se puede unir a hebra de la diana o el amplicón. Una parte de una sonda se puede unir consumir eficazmente como parte de la extensión de la hebra mediante una polimerasa durante la extensión de la hebra, evitando de este modo la unión de sondas a ambos electrodos de un par de electrodos. Una reducción de la corriente de efecto túnel durante una reacción de amplificación puede ser una medición indicativa del consumo de una sonda y, por lo tanto, ser una medición indicativa de la presencia y/o la cantidad de ácido nucleico diana específico presente antes de dicha reacción de amplificación.

En algunos casos, las SAM comprenden hebras de ácido nucleico que son al menos parcialmente complementarias de cebadores. Los cebadores pueden ser complementarios de un ácido nucleico diana o de su complemento. Las hebras de ácido nucleico pueden ser al menos parcialmente complementarias de colas de cebadores cuyas colas pueden no ser complementarias de un ácido nucleico diana o su complemento. Al principio de la reacción de amplificación, los cebadores se pueden unir a un electrodo o al otro del pareja de electrodos, pero no pueden hacer un puente en un par de electrodos y, de este modo, pueden no proporcionar una ruta de efecto túnel. A medida que avanza la reacción de amplificación, el producto amplicón puede ser al menos parcialmente complementario de ambos electrodos de un par de electrodos, y puede proporcionar una ruta de efecto túnel que puede proporcionar un aumento de corriente. Dicho aumento de corriente puede ser indicativo de la presencia de cantidades crecientes de amplicón a partir de la reacción de amplificación.

En algunos casos, se pueden usar pares de electrodos diferentes. Pares de electrodos diferentes pueden tener diferentes conjuntos de SAM. Las ^sA^mse pueden corresponder directamente a ácidos nucleicos diana diferentes. En algunos casos, pares de electrodos diferentes pueden tener diferentes conjuntos de SAM correspondientes a colas de cebadores, que se pueden usar para permitir que se utilice un único tipo de SAM en muchos tipos de ensayos diferentes, como cuando se utilizan diferentes conjuntos de cebadores con el mismo conjunto de colas de cebadores.

En algunos casos, se puede usar un sistema como detector para PCR en tiempo real o en una amplificación isotérmica (por ejemplo, SDA). Se pueden disponer monocapas autoensambladas (SAM) sobre una superficie de los electrodos de un par de electrodos. Las SAM sobre una superficie de los electrodos de un par de electrodos pueden comprender los mismos oligos, u otros diferentes. Los cebadores que se emparejan con una SAM dispuesta sobre al menos un electrodo se pueden utilizar a continuación para detectar productos de amplificación, mediante por ejemplo, detección del producto de amplificación extendido complementario producido como resultado de una reacción de amplificación. En algunos casos, se pueden usar cebadores que pueden ser complementarios de los oligos de una capa SAM sobre al menos un electrodo de un par de electrodos.

En algunos casos, los cebadores no extendidos pueden no ser lo suficientemente largo para abarcar una anchura o una separación entre electrodos, pero un producto amplificado de cebador extendido puede ser lo suficientemente largo para abarcar una anchura o separación entre electrodos. En algunos casos, un oligo que comprende al menos una parte de una SAM en un electrodo puede ser idéntico o sustancialmente idéntico a un cebador de un par de cebadores, donde oligos que comprenden al menos una parte de una SAM del electrodo opuesto pueden ser al menos sustancialmente idénticos a un segundo cebador de un par de cebadores, lo que permite de esta manera la hibridación directa a oligos asociados a las SAM de ambos electrodos de un par de electrodos. En algunos casos, los cebadores pueden comprender colas que pueden no ser complementarias de un polímero de ácido nucleico diana. Las SAM pueden utilizar la misma secuencia como cola del cebador, en donde las colas del cebador pueden ser idénticas para ambos cebadores, o bien las SAM pueden comprender diferentes secuencias asociadas a dos cebadores de un par de cebadores. Una cola de cebador puede ser complementaria o idéntica de una secuencia diana, o al menos a una porción de la misma.

En algunos casos, una hebra del producto de amplificación (o hebra extendida) se puede unir a uno de los dos electrodos. Una hebra extendida puede ser complementaria de solamente un conjunto de oligos asociados con los dos electrodos, mientras que una hebra de ácido nucleico complementaria de una hebra extendida puede unirse a oligos asociados con un segundo electrodo de un par de electrodos. Las dos hebras pueden comportarse como ADN parcialmente monocatenario y parcialmente bicatenario a través de una separación entre los electrodos de un par de electrodos. Dos hebras se pueden hibridar con ambos oligos unidos a la superficie y a una hebra complementaria que también puede estar unida a oligos asociados a un segundo electrodo de un par de electrodos.

En otros casos, un cebador extendido se puede unir a diferentes oligos en ambos electrodos, y se puede conducir tanto como completamente bicatenario o parcialmente monocatenario y parcialmente bicatenario. En algunos casos, un marcador puede ser algo más largo que la anchura o la separación de una separación (por ejemplo, un nanoseparación), para garantizar que un marcador puede tener la longitud suficiente después de considerar las posibles tolerancias asociadas con la fabricación de una separación. Una separación o nanoseparación de un sensor en particular puede ser más ancha o más grande que una anchura o tamaño nominal, y para garantizar que un marcador pueda tener oportunidad de unirse con una región más grande de un electrodo opuesto después de la primera unión a un lado, el marcador debe ser más grande que una anchura o separación de distancia nominal. Si un marcador se va a unir a un electrodo, y la longitud del marcador es la misma que la anchura de una separación, para que el marcador se una al lado opuesto, se necesitaría un sitio de unión que esté perfectamente alineado opuesto al sitio de unión en donde se va a unir el marcador. Por lo tanto, se puede hacer que un marcador sea más grande, de modo que dicho marcador, que puede ser un marcador relativamente rígido como sucede con un ADN bicatenario, puede unirse con restos de unión que pueden tener la forma la sección transversal de un toro en un electrodo opuesto, y una diferencia entre el diámetro del círculo interno y externo del toro puede ser el resultado de al menos una combinación de la flexibilidad de un marcador y la flexibilidad angular de los restos de unión.

Se puede diseñar un marcador de modo que tras la unió a un electrodo, el marcador pueda unirse a una zona del electrodo opuesto. Una zona puede tener un diámetro interior mayor o igual que a aproximadamente 1 nm, 2nm, 3nm, 4nm, 5nm, 6nm, 7nm, 8nm, 9nm, 10 nm o más. Una zona puede tener un diámetro exterior que puede tener al menos aproximadamente 1 nm, 2nm, 3nm, 4nm, 5nm, 6nm, 7nm, 8nm, 9nm, 10 nm o mayor que un diámetro interior. Un marcador que pueda tener la capacidad de unión en dicha región se puede considerar como algo más grande que una distancia de separación.

Un marcador puede ser más largo que una anchura o distancia de separación. Se puede considerar que la anchura de una separación es la distancia entre superficies metálicas. Se puede considerar que la anchura eficaz de una separación es la distancia entre los restos de unión, que se pueden configurar para unirse a enlazadores. Los enlazadores pueden tener un ángulo típico con respecto a la superficie metálica de un electrodo. Un ángulo de los enlazadores con respecto a una superficie metálica puede ser función de al menos un tipo de mecanismo de unión, densidad de SAM, tipo de enlazador, carga del resto de unión y/o del enlazador. Cuando se utiliza un enlazador largo para un SAM de extremo adherido, o cuando un resto de unión comprende un extremo adherido que puede ser tanto monocatenario como bicatenario, y cuando una porción bicatenaria de un extremo adherido, que puede ser tanto monocatenario como bicatenario, puede estar cercano a un enlazador y por lo tanto puede estar más cerca de un electrodo metálico, una distancia de separación o distancia de separación eficaz puede ser más estrecha que una anchura o separación entre superficies metálicas.

En algunos casos, se puede utilizar un único tipo de secuencia de oligo para ambos electrodos de un par de electrodos, y se puede hibridar con una hebra de muestra y no con una hebra complementaria de una hebra de la muestra, proporcionando así polímeros de ácidos nucleicos parcialmente monocatenarios y parcialmente bicatenarios para conductancia de efecto túnel y salto electrónico, que pueden estar unidos solo por un extremo. En algunos casos, puede ser deseable minimizar la conductancia para no saturar la electrónica del detector asociado con un par de electrodos como resultado de las elevadas conductancias asociadas con un pequeño número de productos amplificados, que puede no proporcionar un valor Ct estadísticamente fiable. Puede ser por tanto deseable minimizar la conductancia de un producto amplificado individual, por ejemplo, utilizando enlazadores más largos entre la superficie y los oligos que comprenden una parte de una SAM y se pueden usar para hibridar el producto amplificado.

En algunos casos, los electrodos se pueden configurar para capturar una única molécula o complejo. Los electrodos se pueden configurar para capturar múltiples dianas de un mismo tipo. El nivel de corriente medida se puede utilizar para determinar el número de moléculas capturadas.

Cuando hay un único polímero de ácido nucleico diana al que dirigirse, se pueden unir o asociar múltiples enzimas con un único par de electrodos o con múltiples pares de electrodos. Una secuenciación o proceso de detección de secuencia puede no estar previsto para determinar la secuencia de una diana, sino en su lugar, puede utilizarse para detectar y cuantificar el número de copias de un polímero de ácido nucleico diana. Este proceso se puede llevar a cabo después de una reacción de amplificación, como parte de una reacción de amplificación o sin una reacción de amplificación.

En algunos casos, los marcadores de efecto túnel se pueden usar para detectar la actividad enzimática asociada con una ribozima, en donde las moléculas de ARNt o los aminoácidos puede comprender además marcadores de efecto túnel, y se puede monitorizar la cinética y/o secuencia de unión e incorporación de los aminoácidos para formar una proteína.

En algunos casos,

se pueden utilizar múltiples pares de electrodos para dirigirse a diferentes polimorfismos de nucleótido único, utilizando diferentes pares de electrodos con diferentes complementos asociados, como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Se pueden detectar diferentes conductancias usando el mismo marcador o marcadores diferentes con diferentes niveles de conductancia que son indicativos de un número relativo de SNP en la región diana.

En algunos casos, se puede utilizar un sistema de detección por efecto túnel y/o salto electrónico para detectar directamente el miARN, usando diferentes SAM en diferentes electrodos en donde cada SAM diferente puede ser complementaria de aproximadamente una mitad diferente de un miARN u otro ARN muy corto. Una reacción de hibridación competitiva puede ser el resultado de la competencia entre un miARN u otro ARN muy corto, que pueden no conducir eficazmente a través de una separación asociada a un par de electrodos, y un oligo competidor que puede abarcar una separación, y puede tener capacidad de hibridarse a las SAM asociadas con ambos electrodos de un par de electrodos.

En algunos casos, la detección de un miARN u otro ARN muy corto se puede llevar a cabo formando una separación asociada a un par de electrodos con una SAM que comprende oligos complementarios de un oligo puente, que puede ser complementario de los oligos de las ^sA^masociadas a los electrodos de un par de electrodos. Un oligo puente puede ser adicionalmente complementario de un miARN diana u otro ARN muy corto. Un oligo puente se puede introducir y dejar hibridarse con las SAM de los respectivos electrodos de un par de electrodos estabilizando de este modo una corriente de base antes de introducir una muestra. La introducción de una muestra, que puede comprender un miARN diana u otro ARN muy corto, puede permitir que un miARN diana u otro ARN muy corto se hibriden con un oligo puente. La hibridación puede producir un aumento en la conductancia, que a su vez se puede cuantificar para indicar el número o concentración de miARN diana u otro ARN muy corto.

En algunos casos, cuando una molécula diana, tal como una hebra de ácido nucleico, puede tener la longitud suficiente para abarcar una separación asociada a un par de electrodos, un puente oligo puede no ser de utilidad. Se puede usar una molécula diana para unir los oligos asociados a las SAM unidas a los electrodos de un par de electrodos. Los oligos asociados a las SAM pueden ser complementarios de una parte o de toda la hebra de ácido nucleico diana, de manera que cuando una hebra de ácido nucleico diana se introduce y se permite hibridar con los oligos de las SAM, se puede medir un aumento de la conductancia, y se puede cuantificar la cantidad de hebra de ácido nucleico diana.

En algunos casos, una hebra de ácido nucleico diana puede ser más larga que los oligos asociados a los electrodos de un par de electrodos, y puede tener longitud suficiente para permitir la hibridación de una sonda de oligo adicional entre zonas complementarias a los oligos asociados a los electrodos de un par de electrodos, un proceso de detección puede comprender la detección de una hebra de ácido nucleico diana combinada, los oligos asociados con los electrodos de un par de electrodos, y una sonda de oligo.

En algunos casos, un oligo de una longitud específica se puede colocar entre dos electrodos y se puede medir la conductancia de un oligo, usando una tensión de polarización entre los dos electrodos y midiendo la corriente que atraviesa un oligo. Una señal de corriente puede comprender una corriente de efecto túnel o una corriente de efecto túnel y de salto electrónico. Se puede determinar alguna información biológica o de diagnóstico acerca del oligo basándose en las corrientes medidas. En algunos ejemplos, se puede determinar alguna diferencia entre un oligo con y sin metilación. Este método puede ser especialmente útil si se espera la metilación de sitios específico de un oligo. Si el oligo comprende más de un sitio de metilación posible, se pueden medir más de dos niveles de corriente diferentes, por ejemplo, un primer nivel de corriente si no hay metilación, un segundo nivel de corriente para una metilación en un primer sitio, un tercer nivel de corriente para una metilación en un segundo sitio, y un cuarto nivel de corriente para una metilación tanto en el primer como en el segundo sitio. Este método puede funcionar bien cuando la longitud de un oligo es mayor que la anchura de una separación o que la separación entre dos electrodos. Por ejemplo, si un oligo tiene 100 bases o pares de bases y el tamaño de separación es de aproximadamente 15 nanómetros, este método se puede usar de forma muy adecuada.

En algunos casos, la longitud de un oligo podría ser mayor que el tamaño del separación. Por ejemplo, se podría tener un oligo de 100 bases o pares de bases con una separación de 15 nanómetros pero una parte de un oligo utilizado como marcador de efecto túnel debería tener 60 bases o pares de bases de longitud. En ese caso, uno o ambos extremos de un oligo se puede hibridar con ambos electrodos con una porción que abarca la separación. La hibridación se podría realizar, por ejemplo, usando SAM complementarias dispuestas en ambos electrodos. De acuerdo con este método, solamente se puede medir la conductancia de una porción de un oligo u otra muestra biológica y se puede identificar información biológica basándose en la conductancia. Por ejemplo, se puede identificar si hay uno o más sitios de metilación en un oligo, como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

En algunos casos, la especificidad de detección de una hebra de ácido nucleico diana se puede mejorar usando la hibridación de dos oligos asociados a los electrodos de un par de electrodos, en comparación con la hibridación de un único oligo de similar longitud a los oligos asociados con los electrodos de un par de electrodos, o un oligo de hibridación más largo que puede tener una longitud de una longitud combinada de oligos asociados a los electrodos de un par de electrodos. En algunos casos, la especificidad se puede potenciar adicionalmente mediante el uso de sondas de oligo para hibridarse a una hebra de ácido nucleico diana además de usar dos oligos asociados a los electrodos de un par de electrodos.

Cuando es deseable detectar secuencias que tienen corrientes que son demasiado bajas para una cuantificación precisa debido a su alto contenido en AT, se puede utilizar una horquilla, que puede ser complementaria y se puede unir a un polímero de ácido nucleico diana. Una horquilla un elevado contenido de GC. Una horquilla puede ADNmc, ADNbc o tetramérico. Se puede determinar la presencia de una diana por un aumento en la corriente debido a una mayor proximidad realizada entre porciones con alto contenido en GC debido a la unión de la diana a las estructuras en horquilla. Una horquilla puede comprenden ADN, donde una región que no tiene alto contenido en GC puede ser complementaria de un ácido nucleico diana. Una horquilla puede ser un aptámero, un anticuerpo o cualquier otro resto de unión. Una porción con alto contenido en GC se puede unir a uno o ambos electrodos de un par de electrodos, bien directamente a los uno o más electrodos conductores o a un dieléctrico que puede cubrir el uno o más electrodos conductores. En algunos casos, un alto contenido en GC puede ser un contenido de GC mayor del 50 %, mayor del 60 %, mayor del 70 % o mayor del 80 %.

En algunos casos, al menos una parte de la horquilla que se une a una diana se puede unir directamente a los electrodos o dieléctrico asociado a los anteriores, o puede ser un resto independiente unido a u extremo o entre los extremos de una región del ADN rica en GC. En otros casos, una región que se cita como una región de alto contenido en GC puede no ser una hebra de ácido nucleico, sino en su lugar, ser otra molécula con elevada conductividad de efecto túnel o conductividad de efecto túnel y salto electrónico, tal como otros polímeros u otras moléculas como se describe en el presente documento. Dicha molécula puede ser una quimera de ácidos nucleicos y otros polímeros, o puede ser una quimera de anticuerpos y ácidos nucleicos, o puede ser una quimera de anticuerpos y otras moléculas con elevada conductividad de efecto túnel o conductividad de efecto túnel y salto electrónico, como se describe en el presente documento.

En algunos casos, especialmente cuando se desea la detección continua, por ejemplo, cuando una microplaca o sensor se puede utilizar como sensor de control de aire o agua, o en donde una microplaca o sensor se puede utilizar junto con un sistema de cromatografía de líquidos o gases, sistema de electroforesis capilar o como detector para cualquier otro sistema de separación adecuado, se puede usar una única partición de la muestra. Una única partición de la muestra puede ser una partición continua acuosa o gaseosa. Una única partición de la muestra puede usar un detector de efecto túnel y/o salto electrónico y puede controlar continuamente la salida de una técnica de separación. Una técnica de separación se puede realizar con restablecimientos, por ejemplo, para permitir un rango dinámico más amplio o para reducir el efecto de la unión no específica, o durante un ciclo de análisis completo como para integrar la señal, lo que puede ser ventajoso cuando la concentración de entrada puede ser baja. Una técnica de separación puede aumentar la concentración local para facilitar la detección y/o que esta sea más precisa.

En algunos casos, se puede utilizar un detector de efecto túnel y/o salto electrónico asociado a un cromatógrafo de gases, en donde los restos de unión pueden estar unidos o asociados a los electrodos de un par de electrodos, y por lo tanto se pueden unir específicamente o no específicamente a una molécula diana.

En algunos casos, cuando una separación mediante cromatografía líquida se puede llevar a cabo junto con detección por efecto túnel, se puede generar un potencial de transmisión de magnitud desconocida. Dejar que una superficie flote con respecto a un potencial de electrodo subyacente puede la aplicación de un potencial de efecto túnel adecuado, lo que se puede llevar a cabo usando electrodos recubiertos de dieléctrico y un potencial CC aplicado entre los electrodos.

En algunos casos, un marcador puede estar unido a un anticuerpo. Un anticuerpo puede dirigirse a un antígeno de proteína, un nucleótido epigenéticamente modificado tal como una base de ARN 6-mA u otros nucleótidos del ARN o ADN modificados.

Microplaca detectora: uso general

En algunos casos, los sistemas y métodos de la presente divulgación pueden utilizar una microplaca. Una microplaca puede comprender una microplaca reutilizable. Una microplaca puede tener al menos algo de los analitos diana, enzimas y SAM retiradas entre diferentes ciclos de análisis. La eliminación se puede realizar mediante, por ejemplo, aumento de la temperatura, disminución de la concentración de iones, limpieza química, limpieza con plasma, limpieza enzimática, limpieza con electropotencial, cualquier otro tipo de procedimiento de limpieza o combinaciones de los mismos. Dicha limpieza puede incluir nucleasas, proteinasas tales como la proteinasa K. La limpieza puede comprender cambios de potencial entre los electrodos y el volumen de solución de manera que las SAM tioladas se pueden eliminar, o cualesquiera otros métodos. En algunos casos, una microplaca se puede controlar en diversas regiones detectoras para determinar cuántos sensores están activos y producen datos de buena calidad. En algunos casos, una microplaca se puede programar, por ejemplo, en una memoria flash local con una vida programada para un determinado número de ciclos de análisis. Una microplaca con una vida programada puede reducir significativamente los costes de secuenciación, pero manteniendo la fiabilidad.

En algunos casos, los electrones o huecos que interactúan con un marcador de efecto túnel pueden crear un túnel dentro de un marcador de efecto túnel o pueden crear un túnel a su través, y pueden saltar a través de un marcador de efecto túnel. Los electrones o huecos pueden crear un túnel a través de una parte de un marcador de efecto túnel, y saltar a través de otras partes del marcador de efecto túnel. Los electrones o huecos pueden transitar repetidamente entre algunas regiones de un marcador de efecto túnel en donde se ha creado un túnel, y regiones donde se puede producir el salto electrónico.

En algunos casos, se puede conseguir una elevada densidad de datos. Una elevada densidad de datos puede ser el resultado de una cantidad mínima de datos sin procesar producidos por base. Una elevada densidad de datos se puede conseguir como resultado de la capacidad para determinar qué base entre cuatro tipos o más de bases puede estar presente en una sola lectura del sensor, en oposición a los sensores de corriente que requieren muchas lecturas por base. Un método de química asíncrona puede necesitar mediciones frecuentes porque el momento en que se produce la reacción es desconocido. En otros casos puede ser necesaria la lectura de múltiples píxeles para determinar un color asociado a los fluoróforos asociados con diferentes tipos de bases. Como se proporciona en el presente documento, incluso usa sola lectura puede ser suficientes para determinar qué tipo de nucleobase se ha unido o incorporado, ya que la magnitud de una señal puede indicar tanto la presencia de una base como el tipo de la base. Así, una microplaca que produce una elevada densidad de datos con una capacidad de salida de datos limitada puede producir significativamente más bases de salida por unidad de tiempo que los sistemas existentes anteriores, que pueden requerir la lectura de múltiples píxeles para cada color, y pueden necesitar cuatro colores correspondientes a las cuatro bases normalizadas. Una densidad de datos más alta puede facilitar la reducción del hardware informático y/o el tiempo para analizar un conjunto de datos.

En algunos casos, un sistema como el que se describe en el presente documento puede medir o interrogar cada base más de una vez dependiendo de la aplicación y si se considera de utilidad para la precisión global de una medición en particular. En algunos casos, un sistema puede usar una única muestra para realizar una o más tareas, que incluyen la secuenciación de ADN, la secuenciación de ARN, la determinación de la epigenética del ADN con o sin modificación química, la determinación de la epigenética de ARN con o sin modificación química, la determinación del número de copias de ADN que incluye la determinación de la aneuploidia, la determinación del nivel de expresión de diversos transcritos, la determinación de la presencia y la cantidad de diferentes proteínas y determinar la presencia y la cantidad de otras moléculas biológicas de interés. Al realizar estas pruebas en una sola muestra, un sistema puede utilizar una combinación de polimerasas dependientes de ARN y polimerasas dependientes de ADN. Se pueden utilizar diferentes tipos de polimerasas en diferentes microplacas. Se pueden utilizar diferentes tipos de polimerasas en diferentes volúmenes de la misma microplaca. Se pueden utilizar diferentes tipos de polimerasas en diferentes volúmenes de dos o más microplacas o se pueden utilizar conjuntamente en un único volumen de una o más microplacas.

En algunos casos, un sistema puede comprender una microplaca con estructuras de electrodo, y puede no comprender un amplificador o filas y/o columnas seleccionadas asociadas con diferentes sensores. Los circuitos necesarios para la medición pueden no formar parte de la microplaca, sino que pueden formar parte de una microplaca o circuito adicionales. En otros casos, los amplificadores locales y, opcionalmente, circuitos de selección de filas y/o columnas, pueden comprender una parte de la microplaca, mientras que la integración, la doble correlación, la conversión de analógico a digital y los puertos de entrada y salida digital pueden no formar parte de la microplaca, sino que pueden formar parte de una microplaca o circuito adicionales.

Electrodos detectores

Un sistema de la presente divulgación puede ser un sistema altamente escalable. Por ejemplo, millones o miles de millones de sensores se pueden disponer en una única microplaca de tamaño similar a los actuales sensores electrónicos para secuenciación de ADN, incluyendo dos electrodos separados por una separación, con una separación muy pequeña en un único dispositivo. En algunos casos, una microplaca puede tener una densidad muy alta de sensores. Por ejemplo, una única microplaca puede tener una densidad de sensores mayor o igual a aproximadamente 5.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, 1.000.000, 2.000.000, 3.000.000, 4.000.000, 5.000. 000, 6.000.000, 7.000.000, 8.000.000, 9.000.000, 10.000.000, 20.000.000, 30.000.000, 40.000.000, 50.000.000, 60.000.000, 70.000.000, 80.000.000, 90.000.000, 100.000.000, 200.000.000, 300.000.000, 400.000.000, 500.000.000, 600.000.000, 700.000.000, 800.000.000, 900.000.000, 1.000.000.000, 2.000.000.000, 3.000. 000.000, 4.000.000.000, 5.000.000.000 o más sensores/pulgada2. En algunos casos, se pueden utilizar modos antiguos de procesamiento de circuitos, de modo que se pueden fabricar varios diseños de microplaca personalizados sin el coste de un modo de alta densidad del estado de la técnica tal como de 14 nm o los modos pronto disponibles de 10 nm. En algunos casos, la densidad de los sensores puede no restringirse a interferencias ópticas o de difusión.

En algunos casos, se puede utilizar un diseño paralelo masivo de una microplaca usando procesos litográficos para situar un gran número de sensores sobre un sustrato. Cada sensor puede tener dos electrodos separados por una separación. Los sensores individuales pueden estar separados por un tamaño de paso. El tamaño de paso puede ser igual o diferentes en los ejes X e Y. Cada sensor puede tener una ruta electrónica individual o multiplexada para situar una tensión de polarización entre los electrodos de un par de electrodos y/o leer una corriente de efecto túnel. Así, cada electrodo se puede dirigir y leer de manera individual, o se puede leer en grupos, por ejemplo en filas, en donde puede estar presente un convertidor de analógico a digital en cada columna. En algunos casos, pueden estar presentes múltiples convertidores de analógico a digital asociados a cada columna, por ejemplo, en los extremos opuestos de una columna, o pueden estar intercalados por la columna. Los electrodos de cada sensor pueden estar hechos de oro, platino, cobre, paladio, plata, u otros metales de acuñación o nobles, o de grafeno. El uso de metales de acuñación o nobles puede facilitar la unión del tiol a los electrodos.

En algunos casos, el tamaño de la separación entre los electrodos comprendidos en los sensores se puede diseñar para que los electrodos puedan ser paralelos o en un valor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 grados de paralelo. Los electrodos también se pueden diseñar para tener una separación tal que las SAM puedan colocarse sobre los electrodos y una enzima pueda encajar entre las capas de SAM unidas a los electrodos en una separación entre medias.

En algunos casos, como se muestra en la Fig. 3W, los electrodos o una estructura asociada a los electrodos pueden formar un ángulo entre sí, y se puede conformar usando un grabado con KOH para crear pirámides truncadas invertidas. Los pares de electrodos 342A y 342B asociados al anterior se pueden conformar en ángulo entre sí, o se pueden fabricar con caras enfrentadas paralelas o esencialmente paralelas como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Una estructura puede tener una entrada con una anchura suficiente para permitir la entrada de una polimerasa u otra enzima 330, aunque teniendo superficies 340 anguladas que pueden ser demasiado estrechas para que una polimerasa encaje entre las mismas, y puede tener además electrodos que pueden tener una separación que puede ser significativamente más estrecha que una polimerasa u otra enzima 330, de tal forma que se puede utilizar un marcador más corto que el diámetro de una polimerasa u otra enzima.

En algunos casos, un tamaño de separación entre los sensores puede ser más estrecho o más pequeño de aproximadamente 10 nm, lo que permiten la medición de la conductancia usando un marcador de ácido nucleico con aproximadamente 30 pares de bases. En algunos casos, una separación puede ser más larga o más ancha de aproximadamente 2-3 nm para evitar la creación de TLF falsos positivos y facilitar la fabricación.

En algunos casos, se puede utilizar un conjunto de canales de fluidos para distribuir conjuntos de reactivos, enzimas y/o polimerasas a los pares de electrodos dispuestos sobre o junto a un sustrato. En algunos casos, un canal de fluido puede tener una anchura correspondiente a una configuración de lectura física de una microplaca, tal como un número de filas por amplificador multiplexado. Un canal de fluido puede tener una altura suficiente para suministrar fácilmente reactivos y enzimas, que puede ser una altura de 100 nm a 200 nm, de 200 nm a 500 nm, de 500 nm a 1 |jm, de 1 |jm a 5 pm, de 5 pm a 10 pm, de 10 pm a 50 pm, de 50 pm a 250 pm o mayor de 250 pm.

Se puede hacer que la anchura de un canal de fluido sea bastante estrecha, de manera que una anchura puede corresponder a cientos o miles de sensores y, por lo tanto, una tolerancia de altura puede ser significativamente más estricta de lo que sería si el canal de fluidos fuera a cubrir toda la microplaca. En otros casos, una separación (por ejemplo, nanoseparación) asociada con un sensor puede ser más ancha que la anchura de una enzima o polimerasa. Una anchura de una enzima o polimerasa se puede considerar como una dimensión mínima de una enzima o polimerasa en donde una enzima o polimerasa puede estar complejada con un ácido nucleico parcialmente monocatenario y parcialmente bicatenario, y el pulgar de una enzima o polimerasa puede estar abierto con respecto a la palma de una enzima o polimerasa. Un eje de una hebra de ácido nucleico a lo largo de la longitud de una porción de ácido nucleico unida en el interior o a una enzima o polimerasa y complejada dentro de una enzima o polimerasa puede ser paralelo a las superficies metálicas que comprenden una separación o nanoseparación.

En algunos casos, al menos un electrodo de un par de electrodos puede estar cubierto, parcialmente cubierto o no cubierto de dieléctrico, y un segundo elemento del par puede estar cubierto, parcialmente cubierto o no cubierto con un dieléctrico.

En algunos casos, un sensor puede comprender un par de electrodos. Un par de electrodos se puede configurar para detectar marcadores de efecto túnel o marcadores de efecto túnel y salto electrónico, o se pueden configurar para detectar directamente restos diana. En otros casos, en lugar de utilizar una separación como se describe a continuación en el presente documento, un par de electrones puede formarse sin crear una separación o nanoseparación, sino que pueden estar formados de manera similar, salvo que no se lleva a cabo una etapa de RIE para formar la separación. En dichos casos, las zonas activas de los sensores puede ser sustancialmente coplanares. En esos casos en donde una polimerasa, enzima u otro resto utilizado en una medición se puede unir a un dieléctrico que puede formar una separación entre un electrodo de detección y un electrodo de polarización, es posible que sea necesario formar un enlazador asociado con un marcador de manera que sea más largo de lo que sería necesario y la polimerasa, enzima u otro resto estuvieran unidos en el punto central entre un electrodo de detección y un electrodo de polarización para tener en cuenta las tolerancias en la colocación de la unión y el movimiento de la polimerasa, enzima u otro resto utilizado en la medición. Las tolerancias adicionales que se pueden considerar pueden incluir, por ejemplo, la difusión con respecto al punto de unión de una polimerasa, enzima u otro resto utilizado en la medición debido al movimiento difusivo permisible debido a la longitud de un enlazador al que la polimerasa, enzima u otro resto utilizado en la medición puede permitir, o la rotación de una polimerasa, enzima u otro resto utilizado en la medición.

En algunos casos, en lugar de un par de electrodos, se pueden usar triples, cuadruples o matrices (por ejemplo, matrices lineales) de electrodos. Los electrodos se pueden configurar en disposiciones tales que los electrodos pueden ser sustancialmente coplanares con la misma o con diferentes distancias entre diferentes electrodos.

En algunos casos, los electrodos pueden estar cubiertos o parcialmente cubiertos con un dieléctrico, de manera que la corriente CC puede ser mínima, y es posible que en algunos casos no se pueda medir, pero se puede aplicar un campo CA y se puede determinar una corriente de efecto túnel además de cualesquiera corrientes capacitivas. Esto puede permitir el uso de la detección de corriente de efecto túnel y/o de salto electrónico junto con la separación por otros métodos, tales como la separación electroforética, donde los campos asociados con la separación electroforética pueden verse afectados, por otra parte, por la influencia de las corrientes de efecto túnel y/o por la unión a electrodos de efecto túnel ya que los potenciales asociados con un campo electroforético pueden no estar bien determinados o controlados, o pueden ser variables.

En algunos casos, se puede conseguir la detección y cuantificación bien usando la detección cinética, como se ha descrito anteriormente en el presente documento, que puede ser una detección cinética de múltiples moléculas, o bien detectando un número de copias que pueden estar unidas de forma fija. En algunos casos, se puede aumentar el intervalo dinámico aumentando el número y/o el tamaño de los pares de electrodos.

En algunos casos, se puede fabricar una estructura usando una diversidad de metodologías convencionales para el procesamiento de semiconductores, que puede incluir, por ejemplo, y como se muestra en las Figs. 3A a 3D: 12 1) comenzar con un sustrato aplanado;

2) aplicar una capa de óxido de silicio, que se puede aplicar usando un método de deposición química en fase vapor;

3) aplicar una resina fotosensible, que puede ser una máscara sensible a UV o una máscara para haz de electrones;

4) exponer la resina fotosensible, en donde la exposición puede usar una fotomáscara convencional o puede usar un método de escritura directa tal como un haz de electrones;

5) revelar la resina fotosensible;

6) aplicar una capa metálica, que se puede aplicar utilizando un método de procedimiento catódica, como se muestra en la vista superior de la Fig 3A;

7) eliminar las porciones no deseables de la capa metálica, que se pueden eliminar utilizando un método de despegado;

8) aplicar una capa dieléctrica, que puede ser una capa de nitruro de silicio y que se puede aplicar con un espesor que puede ser la distancia de separación deseada del electrodo como se muestra en la vista inferior de la Fig. 3A;

9) aplicar una resina fotosensible, que puede ser una máscara sensible a UV o una máscara para haz de electrones;

10) exponer la resina fotosensible, en donde la exposición puede usar una fotomáscara convencional o puede usar un método de escritura directa tal como un haz de electrones;

11) revelar la resina fotosensible;

12) aplicar una capa metálica, que se puede aplicar utilizando un método de procedimiento catódica;

13) eliminar las porciones no deseables de la capa metálica, que se pueden eliminar utilizando un método de despegado como se muestra en la Fig. 3B;

14) aplanar la superficie, lo que puede exponer las partes deseadas de la estructura del electrodo, y se puede realizar usando un método CMP (pulido mecánico-químico) como se muestra en la Fig 3C;

15) aplicar un dieléctrico, que puede ser una capa de nitruro de silicio o de óxido de silicio, que se puede aplicar usando un método de deposición química en fase vapor;

16) aplicar una resina fotosensible, que puede ser una resina sensible a UV o que resiste un haz de electrones; 17) exponer la resina fotosensible, en donde la exposición puede usar una fotomáscara convencional o puede usar un método de escritura directa tal como un haz de electrones;

18) revelar la resina fotosensible;

19) realizar un grabado por vía seca, que puede ser un grabado con iones reactivos, que puede formar una nanoseparación entre los electrodos y puede formar una estructura de tipo hueco por encima de los electrodos; y 20) retirar la resina fotosensible, lo que puede comprender una etapa SPM (ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno), y puede comprender una etapa de calcinación como se muestra en la Fig. 3D.

Dicha estructura se muestra en la Fig. 3E, que muestra una sección transversal de un único sensor, en la Fig. 3F que muestra una vista ampliada de una separación y dos electrodos opuestos, en la Fig. 3G que muestra una estructura de pocillo superior en la capa de óxido superior y dos electrodos con una nanoseparación entre granos de cristal que es evidente en los electrodos, la Fig. 3H que muestra un número de sensores e interconexiones metálicas, y en la Fig. 3I que muestra la sección transversal de una estructura de este tipo con diferentes niveles de ampliación.

En otros casos, que se pueden utilizar para mejorar la orientación de los granos del cristal y que pueden dar como resultado planos 111 del cristal opuestos como superficies opuestas de los electrodos en las separaciones de los electrodos, en donde una capa inicial puede ser una capa dieléctrica, sobre la que se puede formar la capa metálica que conforma el electrodo y por lo tanto el dieléctrico que es la distancia de separación, y a continuación la segunda capa metálica que conforma el electrodo, dando como resultado la vista en sección transversal mostrada en la Fig. 3J, en donde ambos electrodos están conformados en la misma dirección de deposición desde la cara opuesta a la sustancia activa del primer electrodo, hasta la sustancia activa del primer electrodo, hasta el dieléctrico intermedio de separación, y a continuación la sustancia activa del segundo electrodo y finalmente la segunda superficie inactiva del segundo electrodo opuesta al área de superficie activa del segundo electrodo. A continuación se deposita un dieléctrico y la estructura se aplana, dando como resultado la estructura que se muestra en sección transversal en la Fig. 3K.

En algunos casos, para centrar mejor la enzima, polimerasa u otro resto que se puede utilizar como parte de una medición o un resto que puede tener un tamaño de un resto usado como parte de una medición, y en donde puede ser deseable evitar el impedimento estérico dependiendo de la enzima, polimerasa u otro resto, puede ser deseable crear una o más capas sobre las superficies activas de los electrodos, que pueden ser más largas (espesas) que una SAM que se puede utilizar como parte de una medición posterior. La longitud (o espesor) de una capa, que puede ser una capa metálica que se puede conformar por electrodeposición, o una capa dieléctrica o una capa de SAM, se puede conformar antes de unir o fijar una enzima, polimerasa u otra molécula como parte de un proceso de medición; una enzima, polimerasa u otro resto puede por lo tanto estar uno o fijado, por ejemplo, a una capa dieléctrica que puede formar una distancia de separación entre electrodos, y una enzima, polimerasa u otro resto puede por lo tanto estar separado de los electrodos; la capa usada para separar una enzima, polimerasa u otro resto de los electrodos se puede eliminar a continuación, si esto se desea o se necesita, por lo tanto, una SAM puede estar unida a los electrodos.

En otros casos, se puede formar una estructura que puede utilizar un estructura de electrodos vertical, en lugar de una estructura de electrodo horizontal como se ha descrito hasta este momento. Para ese tipo de estructura, y como se muestra en la Fig. 3L, en primer lugar se puede depositar una capa de óxido, a continuación, una primera capa metálica del electrodo, a continuación una capa dieléctrica de separación, a continuación una segunda capa metálica del electrodo, y a continuación una capa dieléctrica de cobertura.

A continuación, como se muestra en la Fig 3M, se forma el diseño de grabado que puede cortarse verticalmente a través del dieléctrico superior, la segunda capa metálica del electrodo, la capa dieléctrica de separación y puede cortarse a través de una parte o de la totalidad de la segunda capa metálica del electrodo, cuyo grabado se puede llevar a cabo usando un proceso de molienda de iones o cualquier otro proceso de grabado anisotrópico. A continuación, como se ilustra en la Fig. 3N, se puede llevar a cabo un grabado por vía húmeda que puede grabar preferentemente un dieléctrico de separación, formando así estructuras de electrodo con planos de cristales 111 opuestos.

En otros casos, se puede utilizar un proceso de damasquinado o damasquinado doble; partiendo de un sustrato aplanado; aplicar una capa de óxido, que se puede aplicar usando un método de deposición química en fase vapor; conformando una capa de óxido diseñada con una abertura para un volumen de metal deseado que se puede conformar y una capa de metalización formada sobre la capa de óxido. Se puede utilizar un proceso CMP para eliminar el exceso de metal, dejando una estructura como se muestra en la Fig. 3O. La capa de óxido diseñada puede eliminarse a continuación, dejando la estructura que se muestra en la Fig. 3P. Una capa separadora, que puede ser una capa de nitruro de silicio, se puede aplicar a continuación sobre la estructura como se muestra en la Fig. 3Q. A continuación se puede formar una nueva capa de óxido diseñada, en donde se forma una abertura cerca y sobre el primer volumen de metal como se muestra en la Fig. 3R. A continuación se puede formar una capa de metal adicional, incluyendo la abertura practicada en la segunda capa dieléctrica diseñada como se muestra en la Fig. 3S. A continuación la estructura se puede aplanar como se muestra en la Fig. 3T. A continuación se puede formar una tercera capa de óxido diseñada usando deposición química en fase vapor seguida por la aplicación de una capa de resistencia y el diseño de la capa de resistencia y por lo tanto usando un grabado por vía seca dejando una estructura como se muestra en la Fig. 3U. A continuación se puede aplicar una capa fotorresistente, se puede utilizar un grabado por vía seca o húmeda para formar una estructura como se muestra en la Fig. 3V.

Electrónica del sensor

Puesto que se puede fabricar una matriz de sensores en un dispositivo semiconductor integrado de la presente divulgación, esto supone grandes ventajas en términos de precisión, integración y escalado. En algunos casos, es posible que no se necesite un elevado ancho de banda de datos, especialmente en un sistema que utiliza un método químico sincronizado. Una microplaca del sistema puede ser masivamente paralele y solamente se leen los sensores que registran un nucleótido incorporado. Inicialmente se puede cartografiar una microplaca para determinar qué sensores proporcionan datos útiles, y un mapa, que puede existir en una memoria flash de una microplaca, o que puede existir en otra parte de otras regiones del sistema. Esto hace que la capacidad del sistema, incluyendo la capacidad de datos del sistema, sea mucho mayor, y pueda ayudar a que la calibración y la precisión sean muy fiables. En algunos casos, se puede utilizar una única medición. En algunos casos, un nucleótido marcado o unido se puede medir varias veces hasta conseguir la precisión deseada.

En algunos casos, se puede utilizar un sensor para medir la cinética de unión y/o incorporación, de manera que la información epigenética se pueda determinar como parte de un proceso de secuenciación, que puede requerir leer el sensor varias veces, y potencialmente a mayor frecuencia de lo que se necesitaría en otro caso. En dichos casos, solamente una parte de la microplaca se puede utilizar a la vez, o se puede utilizar una microplaca más pequeña de acuerdo con una capacidad de salida de datos máxima.

En algunos casos, se puede asociar un sensor con un amplificador local, tal como un circuito 4T, similar al usado en el sensor de obtención de imágenes CMOS. En algunos casos, se puede usar un condensador para integrar una corriente producida por un par de electrodos de efecto túnel. Un condensador puede servir para promediar variaciones debido a la unión y liberación de un marcador desde un par de electrodos. Un condensador puede servir para promediar variaciones en ubicaciones de unión que pueden producir variaciones en la magnitud de una corriente producida por un par de electrodos, así como para promediar un fondo, que puede ser el resultado de la creación de un túnel directo entre electrodos, y/o entre los componentes de la SAM, y/o como resultado de otros restos que se pueden unir transitoriamente tales como un ADN diana, nucleótidos no unidos u otras moléculas que pueden ser partes previstas de un sistema, u otros contaminantes. Dicho condensador de promediado puede ser de utilidad para mejorar la señal a ruido, y/o para permitir un mayor tiempo entre mediciones, que no sería posible de otra forma sin un condensador, reteniendo a la vez la carga de la corriente de efecto túnel.

Cuando una corriente combinada con un tiempo de integración puede ser mayor de lo que sería deseable para un tamaño y tensión asociados con la carga del condensador de integración, se puede utilizar una ganancia negativa como parte de un amplificador asociado con cada sensor o con un condensador. La ganancia negativa puede ser de utilidad si, por ejemplo, se desea una variación significativa en el tiempo de unión, la posición puede ser parte de la medición, o si se desea un tiempo prolongado por otros motivos entre las mediciones. Como no se espera que el ruido de disparo tenga un papel significativo en la medición, un aumento en el ruido de disparo, que puede resultar de una ganancia negativa, puede producir una disminución no significativa en la señal a ruido de un sensor. Dicho diseño se muestra esquemáticamente en la Fig. 3X, en donde se muestra un potencial aplicado a un electrodo de polarización, donde la salida de un electrodo de detección se alimenta a un transistor de la fila seleccionada que derivaría toda la corriente del electrodo de detección de entrada a tierra si un sensor está deshabilitado, aunque pasa a abierto si está habilitado permitiendo a la corriente fluir hasta un espejo de corriente configurado para ganancia negativa. La salida del espejo de corriente se muestra conectada a un condensador de integración con un transistor de restablecimiento asociado que puede restablecer el condensador descargando completamente el condensador cuando el nodo RD está configurado para tener un potencial de conexión a tierra.

En algunos casos, la distancia de separación puede ser mayor o igual de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más nm o nanómetros. Dicha distancia de separación puede proporcionar ventajas adicionales tales como facilidad de fabricación y mayor tolerancia al tamaño de la separación. En dichos casos, un marcador de efecto túnel o marcador de efecto túnel y salto electrónico se puede configurar para que sea mayor que la distancia de separación de manera que el ángulo de un marcador de efecto túnel unido con respecto a la superficie del primer electrodo opuesta al segundo electrodo, puede ser de 5-10 grados, 11-20 grados, 21-30 grados, 31-40 grados, 41-50 grados o más de 51 grados. Por ejemplo, se puede usar una separación de 9 nm con un marcador de ADN bicatenario de aproximadamente 30 pares de bases o mayor. Se puede usar una separación de 12 nm con un marcador de ADN bicatenario de aproximadamente 40 pares. Se puede usar una separación de 20 nm con un marcador de ADN bicatenario de aproximadamente 60 pares de bases. La distancia de separación se puede configurar para que encajen oligonucleótidos de ADN comercialmente disponibles o que se puedan construir con facilidad que tengan longitudes específicas.

En algunos casos, se puede desactivar la tensión de polarización durante más de un ciclo mientras se secuencia un polinucleótido. Esto ayuda a minimizar la adherencia de las moléculas o la adsorción en los electrodos debido a la electrostática, lo que a su vez puede producir artefactos. En algunos casos, se puede modificar el potencial del volumen de solución durante parte de un ciclo para minimizar la adherencia de las moléculas o la adsorción en los electrodos. En algunos casos, se puede minimizar una señal de fondo (que puede deberse a una corriente iónica) debido a la pequeña área de superficie metálica expuesta de un electrodo. En algunos casos, el área de superficie metálica expuesta de cada sensor puede ser menos de 1.000.000 nm2, menos de 400.000 nm2, menos de 100.000 nm2, menos de 40.000 nm2 o menos de 10.000 nm2. Esto puede mejorar una señal a ruido asociada con la medición de la corriente de efecto túnel. La señal de fondo se puede determinar a partir de sensores que pueden no tener unidas enzimas y, por lo tanto, que no tienen señales. En algunos casos, se puede seleccionar una etiqueta electrónica de una forma que optimice la corriente de efecto túnel. El tamaño de la molécula se puede seleccionar para que sea algo más larga que la separación entre dos electrodos de efecto túnel, que puede incluir la tolerancia asociada con la fabricación de la separación, o se puede seleccionar para que sea algo más grande que una posición de unión asociada a una o más SAM unidas a los electrodos de efecto túnel, lo que puede tener en cuenta la variación en las posición de unión de una o más SAM en los electrodos y/o la variación en el tamaño de la separación entre los electrodos.

En algunos casos, los niveles de corriente se pueden seleccionar para un conjunto de marcadores de modo que una relación de corrientes puede estar en un niveles fijado en un espacio registrado entre diferentes marcadores, tal como tener un marcador de conductancia más alta cuando se aplica una polarización de 0,1 V puede producir 1n A de corriente a un ciclo de trabajo del 100 por ciento, y puede producir una corriente promedio de 250 pA a un ciclo de trabajo del 25 por ciento correspondiente a un ciclo de trabajo del 50 por ciento para eventos de unión de nucleótidos y un ciclo de trabajo del 50 por ciento para eventos de hibridación durante los eventos de unión de nucleótidos; por lo tanto, utilizando un factor de cuatro entre diferentes marcadores, el marcador más conductor siguiente puede producir una corriente de aproximadamente 64 pA, el marcador más conductor siguiente una corriente promedio de aproximadamente 16 pA, y el menos conductor de un conjunto de cuatro (se utiliza cuatro en este punto de una forma ilustrativa no limitante) puede tener una corriente de aproximadamente 4 pA.

En algunos casos, se puede usar una tensión de polarización entre dos electrodos de efecto túnel de un par de electrodos de efecto túnel en donde un electrodo del par puede tener una tensión positiva y el otro electrodo del par de electrodos puede tener una tensión negativa con respecto al anterior.

En algunos casos, la unión y/o el efecto túnel asociados a los compuestos marcadores de efecto túnel pueden ser sensibles a la temperatura. Así, en algunos casos, una microplaca con sensores de pares de electrodos puede utilizar un control de temperatura. El control de temperatura puede utilizar una temperatura fija durante la totalidad de la medición de una nucleobase y/o en el ciclo de incorporación, o puede utilizar temperaturas diferentes para diferentes partes de un ciclo.

En algunos casos, compuestos que tienen cadenas principales naturales se pueden utilizar como parte de un nucleótido asociado a una SAM y/o a un compuesto marcador de efecto túnel. En algunos casos, se pueden utilizar otro tipo de cadenas principales, y/o azúcares o sustitutos de azúcares, tales como ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos bloqueados, bases resistentes a hidrólisis tales como bases de morfolino, bases de dideóxido, L-ADN, ácidos nucleicos de glicol, ácidos nucleicos de treosa, o cualquier otro tipo de ácido nucleico.

En algunos casos, diferentes corrientes de efecto túnel pueden surgir a partir de diferentes tipos de compuestos marcadores de efecto túnel asociados con diferentes nucleobases. En algunos casos, una corriente de efecto túnel puede verse alterada por la longitud o la rigidez de un enlazador entre una nucleobase unida a una polimerasa y unida a través de un enlazador a un compuesto marcador de efecto túnel que puede comprender al menos en parte nucleobases.

En algunos casos, la unión a las SAM puede ser la misma para un conjunto de compuestos marcadores de efecto túnel. En otros casos, la unión a una SAM puede variar como resultado de las diferencias de carga asociadas a un compuesto marcador de efecto túnel. En algunos casos, la unión a un SAM puede variar debido a la secuencia de nucleobases o el tipo de nucleobases de manera que la cinética de unión y las corrientes de efecto túnel promedio pueden verse afectadas, aunque las corrientes de efecto túnel promedio pueden no verse afectadas.

En algunos casos, los ácidos nucleicos diana se pueden complejar con las polimerasas antes de su introducción en un volumen con pares de electrodos. Una polimerasa puede unirse en la proximidad o en un entorno fluido de los pares de electrodos. Las polimerasas pueden estar unidad en la proximidad de los pares de electrodos antes de introducir los ácidos nucleicos diana, y a continuación los ácidos nucleicos diana se pueden presentar a una polimerasa para formar un complejo. En algunos casos, después de completar un conjunto de ciclos de secuenciación, se pueden modificar las condiciones del tampón de manera que los ácidos nucleicos se puedan liberar de las polimerasas, lavar de un entorno fluido, y se puede dirigir un nuevo de ácidos nucleicos al entorno fluido y complejarse con las polimerasas. Los ácidos nucleicos se pueden concentrar usando un campo CC, campo magnético, dielectroforesis o ambos.

En algunos casos, se puede usar un único volumen como parte de un misma microplaca, de manera que cualesquiera fluidos de entrada puedan interactuar con cualesquiera pares de electrodos de una microplaca. En otros casos, se pueden proporcionar varios volúmenes pueden estar fluídicamente separados, de manera que diferentes fluidos, que pueden comprender diferentes muestras, se pueden introducir en o a través de cualesquiera volúmenes fluídicamente separados. Se pueden proporcionar válvulas integradas como parte del diseño de una microplaca, o bien se pueden proporcionar múltiples puertos de entrada y salida. En algunos casos, diferentes partes de una química se pueden llevar a cabo en diferentes volúmenes, de manera que una sola microplaca puede adquirir datos durante un mayor porcentaje de tiempo. Por ejemplo, si se requieren cuatro etapas de fluidos, donde cada una requiere un minuto, y el tiempo necesario para leer el volumen es de un minuto, entonces se pueden proporcionar cinco volúmenes de fluido, de manera que un volumen adquiere datos, y cada uno de los otros cuatro volúmenes puede estar realizando diferentes entregas de fluido. Transcurrido un minuto, cada volumen puede comenzar a continuación una tarea diferente. Así, los datos se pueden producir continuamente.

En algunos casos, la misma química se puede realizar en todos los volúmenes de una microplaca. En otros casos, diferentes químicas se pueden realizar en diferentes volúmenes. Por ejemplo, un volumen puede realizar un método epigenético de baja cobertura, mientras que otro volumen puede realizar un método que proporciona lecturas prolongadas, y por lo tanto estructura, mientras que otro volumen puede realizar un método que maximiza la capacidad cuando se mide en nucleobases leídas por bytes transmitidos desde la microplaca. Los diferentes volúmenes pueden ser de un mismo tamaño o pueden ser de diferentes tamaños. Una única muestra o único conjunto de muestras se puede utilizar en uno o más volúmenes, o bien diferentes muestras o diferentes conjuntos de muestras se pueden utilizar en diferentes volúmenes. Como parte de la unión de cebadores, que pueden ser cebadores universales, se pueden usar códigos de barras o códigos de cremallera para una sola muestra, o se pueden usar para un conjunto de muestras.

En algunos casos, se pueden suministrar uno o más electrodos de referencia como parte de una microplaca para que el potencial de fluido volumétrico se pueda controlar con respecto a un potencial de electrodos de los pares de electrodos. Los electrodos de referencia pueden ser electrodos de referencia auténticos, electrodos casi de referencia, contraelectrodos, electrodos auxiliares o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, uno o más electrodos se pueden colocar fuera de la microplaca, por ejemplo, a mediante una línea de fluido que interactúa con un volumen de fluido con pares de electrodos.

En algunos casos, se puede utilizar un electrodo de referencia o un contraelectrodo o un electrodo de pseudorreferencia de modo que actúe eficazmente como electrodo de clasificación, en donde, por ejemplo un marcador de efecto túnel que puede tener diferentes conductancias dependiendo del estado de oxidación, y un electrodo de referencia o un contraelectrodo o un electrodo de pseudorreferencia se puede utilizar para oxidar o reducir un marcador, especialmente una porción de un marcador que puede estar unido a un electrodo de polarización o de detección; una oxidación o reducción de un marcador puede dar como resultado un cambio en la amplitud de la corriente de efecto túnel.

En algunos casos, las polimerasas o complejos de polimerasa se pueden colocar aleatoriamente usando una distribución de Poisson, de modo que algunos pares de electrodos tengan más de una polimerasa o complejo de polimerasa unido muy cerca de los mismos. Se puede usar software, firmware, comparadores analógicos o lógica integrada para determinar qué pares de electrodos pueden tener más de una polimerasa como resultado de una corriente mayor, o una distribución de corriente multinivel que no se ajusta a una distribución esperada asociada con un conjunto de marcadores de efecto túnel proporcionados. Algunos pares de electrodos pueden tener corrientes consistentes con una falta de polimerasa o complejo de polimerasa, como se puede determinar por una señal baja y/o por una distribución que no se corresponde a una distribución esperada asociada a un conjunto de compuestos marcadores de efecto túnel proporcionados. Dicha distribución esperada de compuestos marcadores de efecto túnel puede incluir uno, dos, tres, cuatro o más de cuatro tipos diferentes de compuestos marcadores de efecto túnel.

En algunos casos se puede usar una mezcla de nucleótidos incorporables y no incorporables. Tanto los nucleótidos incorporables como los no incorporables pueden estar marcados, y se pueden utilizar con una mezcla de reactivos. Una mezcla de reactivos puede comprender o no cationes catalíticos tales como cationes divalentes catalíticos. Cuando los cationes divalentes catalíticos no están comprendidos en la mezcla, no es posible incorporar los nucleótidos. En algunos casos, todos o sustancialmente todos los nucleótidos pueden comprender marcadores, y pueden ser no incorporables.

Mecánica de fluidos de la microplaca

En algunos casos, una microplaca puede tener un único volumen de muestra común, de manera que hay una única entrada de fluido, que pueden comprender muestras de entrada, pueden interactuar con todos los sensores de una microplaca. Como alternativa, una microplaca puede tener múltiples volúmenes asociados con diferentes conjuntos de sensores, y es posible que tengan un mecanismo de valvulería o múltiples puertos de entrada, por tanto diferentes fluidos de entrada, que pueden comprender diferentes muestras de entrada, pueden interactuar con diferentes conjuntos de muestras.

En algunos casos, un único fluido de entrada puede comprender múltiples muestras diferentes. Las muestras diferentes pueden diferenciarse como resultado de tener diferentes códigos de barras asociados con las anteriores, o pueden tener diferentes marcadores de efecto túnel escindibles fijados a las mismas. En algunos casos, se pueden introducir diferentes muestras en momentos diferentes. Diferentes muestras pueden ocupar una porción de una zona diferente de la microplaca dejando otros sensores disponibles para una muestra que se pueda introducir posteriormente. Diferentes muestras pueden diferenciarse midiendo un marcador unido o asociado a un resto unido, que puede ser una enzima complejada a un polímero de ácido nucleico, indicando así cuando se ha unido un resto unido y en qué ubicaciones se han unido los restos unidos. Tras introducir una muestra posterior, se pueden hacer una o más medidas adicionales para medir los marcadores unidos o asociados con los restos unidos. Sensores adicionales con restos unidos se pueden asociar con las muestras recientemente introducidas y sensores que previamente se habían asociado con una muestra anterior pueden seguir asociados con la misma muestra a la que se había asociado un sensor anterior. En algunos casos, todos los sensores asociados a una microplaca pueden experimentar diferentes etapas en el mismo momento o en momentos diferentes. En algunos casos, las muestras se pueden introducir en momentos diferentes, pero otros fluidos se pueden introducir a la vez en todos los sensores.

En algunos casos, una microplaca puede tener múltiples puertos de entrada asociados con diferentes volúmenes internos, y un sistema se puede adaptar a múltiples microplacas simultáneamente. Se pueden introducir diferentes fluidos en diferentes volúmenes en diferentes momentos. Diferentes volúmenes pueden ser diferentes volúmenes de la misma microplaca, diferentes volúmenes pueden estar en diferentes microplacas. Diferentes volúmenes pueden ser diferentes volúmenes asociados con múltiples microplacas, permitiendo dejar que diferentes etapas de un proceso se lleven a cabo en momentos diferentes en los diferentes volúmenes, que por ejemplo, puede permitir que diferentes volúmenes tengan medidas realizadas en diferentes momentos, mientras que otros volúmenes pueden permitir que se realicen diferentes etapas mientras están teniendo lugar las mediciones. Al hacerlo así, las mediciones se pueden realizar eficazmente de forma continua, permitiendo de este modo que los convertidores de analógico a digital, los integradores, los canales de comunicaciones digitales o cualquier otra porción de la electrónica, que puede ser en otros casos un factor limitante para utilizar completamente la capacidad del sistema, y no limitada por esperar a que se produzcan otras etapas de química, bioquímica o lavado. En algunos casos, se puede llevar a cabo un conjunto coordinado de mediciones, donde las mediciones pueden no ser eficazmente continuas, sino que pueden producirse durante un porcentaje creciente o ciclo de trabajo en comparación con cuando se realizaron todas las mediciones en zonas diferentes, antes de proceder a una etapa diferente, que puede ser una etapa química, una etapa bioquímica, una etapa de lavado o cualquier etapa que no sea una etapa de medición.

En algunos casos, como se muestra en la Fig. 3Y, una microplaca puede tener múltiples canales de fluidos 370, que pueden estar interconectados de manera que se puede utilizar una sola muestra, o puede tener puertos de fluidos independientes (no se muestra) de manera que se pueden utilizar diferentes muestras en diferentes secciones de la microplaca. La circuitería 360 del detector, que puede incluir condensadores de integración, espejos de corrientes y convertidores de analógico a digital se pueden colocar en secciones entre regiones fluídicas que pueden tener dos conjuntos de 100 filas o cualquier otro número adecuado de filas, de manera que cada región entre los canales de fluido puede soportar una cubierta del canal de fluidos, y permitir el uso de un volumen de fluido mucho menor. La circuitería de la fila seleccionada 380 se puede colocar en un lado, mientras que se puede utilizar la circuitería en entrada/salida digital 390, que puede comprender una o más interfaces LVDS (señales diferenciales de baja tensión).

En algunos casos, el único volumen físico dentro de una microplaca se puede separar en volúmenes de fluido individuales usando electrohumectación u optoelectrohumectación, permitiendo de esta manera mayor flexibilidad de lo que se podría conseguir usando volúmenes fijos. La electrohumectación se puede utilizar para definir diferentes regiones de los sensores. Diferentes regiones de los sensores se pueden asociar con diferentes muestras y/o se pueden usar para definir regiones de flujo de fluidos, para permitir el flujo de diferentes reactivos a diferentes porciones de la microplaca en diferentes momentos, que pueden estar asociados a diferentes muestras o pueden asociarse a regiones dimensionadas para un rendimiento óptimo de la microplaca, permitiendo así diferentes tamaños de muestras pero permitiendo opcionalmente el máximo rendimiento.

En algunos casos, se pueden retirar moléculas diana, de muestra o de marcador usando campos eléctricos aplicados entre un electrodo y un volumen de solución. El campo usado puede ser menor que la intensidad del campo necesaria para retirar un fragmento de unión a diana, por ejemplo, los oligonucleótidos unidos a tiol pueden tener su complemento desnaturalizado a menor intensidad del campo que un oligonucleótido unido a tiol, permitiendo así la desnaturalización sin afectar a la SAM.

Detalles de la lectura del sensor

En algunos casos, para conseguir un nivel de fondo más preciso, el nivel de fondo se puede medir sin unir los cationes divalentes no catalíticos. El nivel de fondo se puede usar para encontrar los valores verdaderos de la señal y separar la señal del fondo. En algunos casos, la cuantificación de la señal, que puede ser a partir de un marcador o marcadores, puede ser el resultado de una medición durante un periodo de tiempo en donde un marcador o marcadores pueden estar fijados eficazmente unidos a una o más SAM asociadas a los electrodos de un par de electrodos, aunque esencialmente no hay moléculas de fondo que puedan por otra parte unirse y alterar la medición de un marcador o marcadores que pueden estar unidos de forma fija. Las moléculas de fondo se pueden eliminar, por ejemplo, lavando la zona del sensor de la microplaca, a partir de un volumen que contiene los electrodos de un par de electrodos, o se puede evitar que interactúe con un par de electrodos como resultado de los campos asociados con los electrodos de un par de electrodos. En algunos casos, un nivel de señal puede indicar la identidad de un tipo de marcador, en donde se pueden utilizar varios tipos de marcadores diferentes con diferentes conductancias de efecto túnel y salto electrónico, pero solamente te puede unir un tipo. Un nivel de corriente puede indicar un número de marcadores que pueden estar unidos, en donde se puede utilizar un único tipo de marcador que puede tener una única conductancia de efecto túnel o salto electrónico, y pueden resultar variaciones de la diferencia entre el número de marcadores que pueden estar unidos. Una corriente puede ser el resultado de combinar diferentes tipos de marcadores, que pueden tener diferentes conductancias del efecto túnel o salto electrónico, y pueden resultar de diferencias entre el número de marcadores que pueden estar unidos, especialmente si el número de marcadores se mide repetidamente, y con el tiempo, el número de marcadores puede aumentar hasta un número fijo como resultado de un tamaño fijo del área de superficie de un par de electrodos.

En algunos casos, se puede considerar que un nivel de ruido comprende ruido de efecto túnel y/o salto electrónico, ruido amplificado, ruido por conversión de analógico a digital, cinética de la unión de la polimerasa a nucleobases marcadas, y la cinética de extremos adherentes unidos a la polimerasa que se une a los extremos adheridos de una o más SAM.

En algunos casos, un sistema que puede utilizar marcadores de efecto túnel y/o de salto electrónico para la detección en un método para determinar la secuencia y/o la epigenética de una secuencia de ácidos nucleicos puede utilizar periodos de tiempo fijo para determinar la secuencia y/o la epigenética. En otros casos, se pueden usar períodos de tiempo diferentes, que pueden ser fijos para diferentes conjuntos de nucleótidos o bien el usuario puede configurarlos según desee para el nivel de precisión deseado. En algunos casos, se pueden usar períodos de tiempo diferentes en un sistema para diferentes volúmenes o áreas de una única microplaca concurrentemente, o se puede usar mediante un sistema de diferentes microplacas concurrentemente, o una combinación de diferentes regiones de diferentes microplacas concurrentemente.

En algunos casos, diferentes conjuntos de nucleótidos pueden tener niveles consistentes de concentraciones de sal, pH, temperatura y otras condiciones u otros elementos que comprenden un tampón que contiene un conjunto de nucleótidos pueden ser iguales para diferentes conjuntos de nucleótidos. En otros casos, diferentes conjuntos de nucleótidos pueden tener niveles diferentes de concentraciones de sal, pH, temperatura y otras condiciones u otros elementos que comprenden un tampón que contiene un conjunto de nucleótidos para diferentes conjuntos de nucleótidos, que puede ser útil para aumentar la diferencia en la cinética de unión para separar mejor e identificar mejor diferentes tipos de nucleobases.

Configuración de la lectura del sensor

En algunos casos, una sola medición se puede utilizar con un tiempo fijo, en donde la circuitería electrónica del sensor asociada a un par de electrodos puede integrar continuamente una corriente procedente de un par de electrodos. En algunos casos, se puede llevar a cabo un número de mediciones, donde el tiempo asociado a cada medición puede ser igual o diferente, por ejemplo, para permitir un intervalo dinámico más amplio asociado con diferentes marcadores y/o con diferentes cinéticas asociadas a la unión de diferentes nucleótidos.

En algunos casos, un sistema y la química asociada se pueden configurar para ser comparativamente más lentos pero con una detección más precisa. Dicho sistema puede utilizar un método químico sincronizado, en donde diversos reactivos diferentes se pueden suministrar junto con la incorporación de una sola base o de un único tipo de base. Un sistema de este caso se puede fabricar para que sea masivamente paralelo para mejorar el rendimiento, tal como mediante el uso de una microplaca con 10 millones (M), 20 M, 30 M, 40 M, 50 M, 60 M, 70 M, 80 M, 90 M, 100 M, 200 M, 300 M, 400 M, 500 M, 600 M, 700 M, 800 M, 900 M, 1.000 millones (B), 2 B, 3 B, 4 B, 5 B, 6 B, 7 B, 8 B, 9 B, 10 B, 15 B, 20 B o más sensores.

Como se proporciona en el presente documento, un sistema y la química asociada se pueden configurar para una detección rápida de oligómeros largos, por ejemplo, usando un método de química asíncrona. Algunos o todos los nucleótidos incorporables adecuados se pueden proporcionar a complejos de polimerasa, y los detectores pueden obtener datos a una velocidad superior que la velocidad de incorporación promedio, de manera que las señales asociadas a tiempos no de unión puedan ir seguidas por señales asociadas a tiempos de unión de nucleobases, y se puede determinar el orden de incorporación monitorizando y analizando dichas señales. En algunos casos, la velocidad de incorporación se puede ajustar usando una mezcla de cationes divalentes que puede incluir cationes tanto catalíticos como no catalíticos.

En algunos casos, una o más partes de un sistema puede utilizar una bioquímica más lenta con una parte de alto rendimiento masivamente paralela, y algunas otras partes del sistema puede utilizar una bioquímica que puede estar configurada para una detección rápida de oligómeros largos, proporcionando de este modo un sistema que proporciona tanto grandes cantidades de lecturas cortas y menos cantidad de lecturas prolongadas, de manera que la estructura y los datos que completan la estructura se pueden producir de forma simultánea.

En algunos casos, una o más partes de un sistema puede utilizar una bioquímica más lenta con una parte de alto rendimiento masivamente paralela, y algunas otras partes del sistema puede utilizar una bioquímica que puede estar configurada para una detección multisegmento o un método de secuenciación por salto de lectura múltiple, donde una porción de un oligo se puede leer usando una bioquímica "lenta" y a continuación se puede proporcionar un conjunto de nucleobases adecuado, tales como cientos o miles de bases que se puede incorporar en un periodo de segundos o minutos y, por lo tanto, ir seguido de un periodo de bioquímica "lenta", proporcionando así lecturas que pueden estar separadas por cientos o miles de bases en el mismo oligo, proporcionando de este modo un sistema que proporciona tanto grandes cantidades de lecturas cortas y menos cantidad de ácidos nucleicos pueden un método de salto de lectura, de manera que la estructura y los datos que completan la estructura se pueden producir de forma simultánea.

En algunos casos, se puede usar una combinación de secuenciación y detección de la epigenética en diferentes porciones o en diferentes momentos de un sistema, con retroalimentación opcional para determinar la epigenética en ubicaciones específicas utilizando secuenciación dirigida, o usando secuenciación shotgun. En particular, algunas porciones de una muestra diana se pueden separar de otras porciones de una muestra diana tales como regiones promotoras de un gen, y otras regiones diana específicas que pueden ser intrones o exones u otras porciones de un genoma, y se puede llevar a cabo sin determinación epigenética.

En algunos casos, se pueden emplear diferentes sistemas de lectura para diferentes regiones de un dispositivo, o en diferentes momentos o en una o más regiones de un dispositivo. En algunos casos, se puede usar la lectura de un solo punto y la cinética simultáneas en una o más regiones o en uno o más momentos, donde se puede determinar una secuencia y/o un tipo de epigenética. En algunos casos, se puede usar la detección multipunto usando conjuntos de múltiples nucleótidos en una o más regiones o en uno o más momentos. La detección multipunto se puede usar junto con un método de lectura de química asíncrona que se puede usar en una o más regiones o en uno o más momentos en un dispositivo.

En algunos casos, se puede usar una matriz de clasificación de campo programable (FPGA) u otra lógica programable dentro de una microplaca para permitir cambios en el patrón y/o la temporalización de la lectura.

En algunos casos, se puede usar un dispositivo de almacenamiento para almacenar posiciones de sitios activos, donde se puede usar la memoria como parte del proceso de lectura para determinar qué ubicaciones están activas. El dispositivo de almacenamiento se puede seleccionar de una memoria flash o una ram. El dispositivo de almacenamiento se puede usar en un microprocesador incorporado o se puede usar junto con una FPGA u otra lógica programable para determinar un patrón de ubicación de sensores para lectura y/o un patrón de ubicaciones de no lectura. En algunas realizaciones, se pueden utilizar diferentes patrones en diferentes regiones, por lo que, se pueden utilizar diferentes temporalizaciones entre lecturas, por ejemplo, cuando una región se utiliza para lecturas con un método de química sincronizada y otra región se utiliza para lecturas con un método de química asíncrona. En algunos casos, la recogida de datos a partir de sensores de efecto túnel se puede recoger a una velocidad que puede ser demasiado lenta para determinar los tiempos de unión de nucleótidos, y puede promediar además niveles de corriente de numerosos eventos de unión de nucleótidos y periodos de tiempo intercalados entre eventos de unión. Las corrientes durante este tiempo se pueden promediar con un hardware, que utiliza, por ejemplo, un amplificador integrador. Se pueden producir múltiples adquisiciones de datos para proporcionar promediando adicional, y, por lo tanto, mejor señal a ruido. Se puede determinar una velocidad cinética parcialmente conociendo kon y koff, y por lo tanto se puede determinar el tipo de nucleobase que se une y que se ha unido a partir de un nivel de corriente promedio, combinado con un conjunto de nucleobases y marcadores asociados proporcionados. Dicho método puede permitir una generación mínima de datos y seguir permitiendo la identificación de las bases y opcionalmente de las modificaciones epigenéticas de las bases de un polinucleótido de muestra.

Cuando la velocidad de recogida de datos puede ser más rápida que la cinética de unión de los nucleótidos, se pueden producir numerosas adquisiciones de datos para cada evento de unión, y se puede observar uno o más eventos de unión para cada posición de la base antes de que se produzca la incorporación de una nucleobase. Esto puede permitir directamente determinar mejor la información cinética. En algunos casos, el sistema se puede configurar para adquirir datos continuamente, lo que pueden comprender la adquisición de datos durante los eventos de unión, entre los eventos de unión y durante los eventos de incorporación.

En algunos casos y como ejemplo, puede ser deseable tener un ciclo de química de secuenciación de aproximadamente tres minutos. Este ciclo puede incluir los lavados, adición de nucleótidos, adición de Mg y tiempos de lectura. En algunos casos, puede ser deseable un ciclo más rápido, que se puede alcanzar debido a la falta de susceptibilidad del sistema al desfasado.

En algunos casos, para conseguir un tiempo de ciclo deseado, se puede ajustar tanto el tiempos entre eventos como el tiempo hasta la unión tb, y la duración de un evento de unión o el tiempo de disociación td; tb principalmente mediante el ajuste de la concentración de nucleótidos, y td ajustando la relación entre Ca y el resto de cationes divalentes. Así, en algunos casos en donde se puede seleccionar un tiempo de aproximadamente un segundo como tiempo de integración, este tiempo, cuando se combina con un nivel de multiplexado de cien, que corresponde a cien filas del sensor, puede dar un tiempo de lectura total de aproximadamente cien segundos, dejando una cantidad similar de tiempo para el resto de las partes del tiempos del ciclo químico, cuando se utiliza un tiempo de ciclo químico de aproximadamente tres minutos.

En algunos casos, puede ser deseable tener una precisión especificada para una lectura, donde puede ser deseable, en algunos casos, promediar las mediciones de varios periodos de unión de nucleótidos, en donde dicho número deseado puede ser diez con un 50 por ciento del ciclo de trabajo, resultando así una velocidad de unión de 10 Hz. En otros casos, si se necesita o se desea una mejor precisión, la cinética de unión del nucleótido se puede aumentar mediante el uso de una unión con hibridación más rápida, tomando varias lecturas o ampliando el tiempo de integración.

En algunos casos, la unión del nucleótido puede no medirse directamente; en su lugar, las mediciones se pueden realizar sobre la unión con hibridación de un marcador de efecto túnel. La longitud del tiempo de unión con hibridación se puede ver alterada por la temperatura, concentración de sal, pH, potenciales de electrodo, longitud del extremo adherente y la secuencia del extremo adherente (GC vs. 7-deazaadenina). En otros casos, el tiempo entre eventos de hibridación también se puede ver afectado por todos los elementos anteriores, aunque en menor medida, y también se puede ver afectado por la densidad de la SAM y la longitud y la rigidez del enlazador. En algunos casos, el tiempo de unión con hibridación y el tiempo entre eventos de hibridación con unión se puede ajustar de este modo.

En algunos casos se puede usar un ciclo de temporalización con múltiples eventos de unión con hibridación promediados (por evento de unión de nucleótido). Por ejemplo, el número de eventos de unión con hibridación puede ser 10, con un ciclo de trabajo del 50 %, dando como resultado 10 eventos dentro de cada período de tiempo de 50 ms asociado a un evento de unión de nucleótido promedio, dando como resultado que un evento de hibridación tarda un promedio de 2,5 ms. Así, cuando se usa con un marcador que tiene una conductancia de efecto túnel que puede dar como resultado una corriente de efecto túnel continua de InA, la señal durante el período de tiempo de integración de un segundo puede ser de 250 pC.

Preparación de muestra

En algunos casos, antes de cualesquiera etapas de preparación de secuenciación, un sistema que puede incluir un detector de efecto túnel y/o de salto electrónico puede aislar y separar una o más células de una muestra, usando, por ejemplo, citometría de flujo. Una o más células pueden comprender células tumorales circulantes, células vivas, células teñidas específicamente o combinaciones de las mismas. Las células teñidas pueden comprender una tinción que puede ser una tinción fluorescente. Una tinción puede comprender un marcador de efecto túnel y/o salto electrónico. Una tinción puede comprender un marcador electroquímico. En algunos casos, un método de extracción que utiliza métodos de extracción específicos de diana, tal como aislamiento con perlas magnéticas o métodos de aislamiento de aptámeros, se pueden usar para aislar las células diana. Las células individuales o los conjuntos de células se pueden secuenciar a continuación, en donde se pueden secuenciar uno o más ARN genómicos y/o uno o más transcriptomas de ARN.

En algunos casos, el enriquecimiento se puede llevar a cabo bien para secuencias específicas de ARN y/o ADN, o para tipos específicos de ARN o ADN, tales como ARNm o ARNt. Las dianas específicas se pueden aislar a partir de células aisladas. Se puede realizar el enriquecimiento de secuencias específicas de ARN y/o ADN, o de tipos específicos de ARN o ADN tales como ARNm o ARNt. Las hebras de ácido nucleico aisladas se pueden secuenciar a continuación. Los transcritos específicos, tales como AR-V7, se pueden aislar y cuantificar, permitiendo la confirmación del transcrito diana, así como la cuantificación y detección de cualesquiera modificaciones epigenéticas, mutaciones o variantes de corte y empalme, que pueden permitir la determinación adicional de un tipo de tejido origen de una célula tumoral. Dicha etapa de cuantificación puede ser el resultado de la secuenciación, PCR digital, qPCR, amplificación isotérmica o cualquier otro proceso de cuantificación de diana adecuado.

En algunos casos, después del aislamiento de células, se puede realizar una etapa de enriquecimiento o de concentración para todo el ADN, todas las hebras de ácido nucleico o todo el ARN. La etapa de enriquecimiento o de concentración se puede llevar a cabo en lugar de una etapa específica de aislamiento. La etapa de enriquecimiento o de concentración se puede llevar a cabo además de una etapa específica de aislamiento. Una etapa de enriquecimiento o concentración puede permitir, por ejemplo, una sensibilidad muy elevada para dianas específicas, permitiendo al mismo tiempo completar un genoma completo o transcriptoma, lo que puede permitir una mejor cobertura que la secuenciación de una diana específica. En algunos casos, la secuenciación del genoma y/o el transcriptoma se pueden combinar con otra técnica de cuantificación, potencialmente en la misma microplaca.

De manera similar, se puede usar una extracción del ADN libre circulante para capturar mutaciones de direccionamiento para secuenciación posterior tales como mutaciones BRAF asociadas con el melanoma, u otras mutaciones dirigidas como resultado de la asociación con otras enfermedades genéticas.

En algunos casos, para garantizar mejor una correspondencia unívoca entre enzimas y enlazadores durante un proceso durante el cual las enzimas y los enlazadores estén unidos entre sí, un enlazador puede estar unido a un primer extremo de una proteína que comprende al menos una parte de una enzima, permitiendo así una correspondencia unívoca entre enlazadores y enzimas.

En algunos casos, los enlazadores, perlas magnéticas o paramagnéticas o enlazadores se pueden unir de forma reversible a una superficie en una distancia promedio de manera que solamente un resto correspondiente se pueda unir a la misma como resultado de la distancia física entre medias. Esto puede proporcionar una relación de unión unívoca que puede superar una distribución de Poisson, proporcionando un número igual de restos unidos y no unidos, o proporcionando más restos no unidos para eliminar a continuación los restos no unidos. La unión se puede producir en solución, donde un resto puede estar presentes a una concentración mayor, de manera que la mayoría del resto con una concentración menor puede unirse a un único resto de restos a una concentración mayor. A continuación, los restos de menor concentración pueden unirse de manera reversible a una superficie. Una superficie puede ser una superficie de una perla magnética, y se puede separar de restos no unidos de concentración mayor.

En algunos casos, los restos, que pueden comprender enzimas, partículas o perlas magnéticas y paramagnéticas, o enlazadores, pueden estar conformando emulsiones. Las emulsiones se pueden formar en condiciones que no permiten la actividad enzimática antes de la formación de las emulsiones. Por ejemplo, círculos de ácido nucleico cebado o círculos de ácido nucleico bicatenario con sitios de corte se pueden proporcionar previamente unidos a una enzima o a una partícula magnética o paramagnética, en donde la unión unívoca no es necesaria, sino que se puede utilizar una distribución de Poisson que favorece los restos individuales con polímero de ácido nucleico circular. La emulsión, que puede ser una emulsión de agua en aceite, puede comprender además, en las emulsiones acuosas, nucleótidos, un tampón adecuado para la actividad enzimática y enzimas útiles para la extensión de un cebador o una hebra cortada de una hebra de polímero de ácido nucleico. Si se va a unir una enzima a uno o más polímeros de ácidos nucleicos circulares, se puede proporcionar a una concentración tal que una distribución de Poisson favorezca una única enzima en cada emulsión. A continuación se pueden cambiar las condiciones, que pueden incluir la temperatura, de manera que pueda continuar la extensión. Una enzima puede realizar una amplificación de círculo rodante hasta el momento en que los nucleótidos contenidos en las emulsiones se hayan usado completamente de forma eficaz durante la amplificación de círculo rodante, proporcionando de este modo un bloqueador físico unido a una emulsión, independientemente del número de polímeros de ácidos nucleicos circulares proporcionados a las emulsiones. El tamaño de los bloqueantes físicos puede variar dependiendo de las variaciones en los tamaños de la emulsión y las variaciones en la concentración de nucleótidos en cada emulsión.

En otros casos, un método de preparación de bibliotecas puede incluir un proceso de producir un ADNc complementario, hebra de ADN o ARN, para minimizar la creación de estructura secundaria. Un método de preparación de bibliotecas puede incluir un proceso que liga una región de cebador universal, que puede ser una estructura en horquilla 420 tal como se representa en la Fig. 4 que puede tener un sitio de corte 450, donde se puede crear un corte en la estructura de horquilla 420 mediante una nicasa o enzima similar, lo que puede permitir de este modo unir una ARN polimerasa dependiente de ARN, una ADN polimerasa dependiente de ADN o una transcriptasa inversa que se une al sitio de corte 450 y puede, bien como resultado de un desplazamiento de cadena inherente o como resultado de la acción de una helicasa, que puede estar unida o puede funcionar por separado, permitir la incorporación de bases y la translocación a lo largo de un polímero de ácido nucleico no cortado, permitiendo así la resecuenciación de una hebra 410 de la muestra sin circularización. En algunos casos, una estructura en horquilla 420 puede comprender una o más inosinas 460, para permitir la unión de diferentes secuencias diana sin requerir un conjunto o mayor conjunto de cebadores universales. En algunos casos, en donde una polimerasa o ligasa puede tener una actividad menor y/o una especificidad menor cuando se une a una inosina, una parte de la estructura en horquilla puede comprender un conjunto de cebadores universales, de manera que una base inmediatamente en un sitio activo de una enzima puede ser una de un conjunto de bases naturales 440A y 440B. En otros casos, un cebador universal de horquilla puede tener una longitud de bases complementarias que puede ser lo suficientemente larga para que una ligasa actúe sin actividad reducida debido al impedimento estérico debido a la curvatura de la porción en horquilla de un cebador universal de horquilla, y análogamente puede ser lo suficientemente larga para que una polimerasa extienda un cebador universal sin actividad reducida debido a la curvatura de un cebador universal de horquilla.

Componentes adicionales del sistema

En algunos casos, se puede usar una bomba u otra fuente de presión positiva o negativa para desplazar una solución que contiene la polimerasa hasta las separaciones de los electrodos. Una vez que la polimerasa ha quedado inmovilizada o atrapada en el canal con estrechamiento, se puede añadir ADN u otras soluciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método que comprende:

a. usar una polimerasa adyacente a dos electrodos en un sustrato para unir un nucleótido que es complementario de una base que se está interrogando de una muestra de ácido nucleico, teniendo el nucleótido un marcadores de efecto túnel unido al mismo, en donde el marcadores de efecto túnel es algo más grande que el tamaño de la separación entre los dos electrodos,

b. medir una corriente de efecto túnel entre los dos electrodos producida por la localización del marcador de efecto túnel hacia los dos electrodos,

c. identificar un nucleótido a partir de la unión de la base complementaria de la base que se está interrogando, en función de la medición de la corriente de efecto túnel.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el marcador de efecto túnel comprende un compuesto de un ion híbrido.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el marcador de efecto túnel comprende una hebra de ácido nucleico, preferentemente con una longitud mayor de 10 bases.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la hebra de ácido nucleico tiene una porción bicatenaria y una porción monocatenaria.

5. El método de la reivindicación 1, uniendo además la polimerasa a un dieléctrico situado entre los dos electrodos o en uno de los dos electrodos.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la separación tiene una porción más ancha que es mayor que la anchura de la polimerasa y una porción más pequeña que es más pequeña que el tamaño de la polimerasa.

7. El método de la reivindicación 1, en el que una monocapa autoensamblada (SAM) está unida a los electrodos, preferentemente, la SAM está unida por un tiol a los electrodos.

8. El método de las reivindicaciones 3 y 7, en donde la SAM comprende al menos en parte un ácido nucleico que puede unirse a al menos una parte de la hebra de ácido nucleico con el marcador de efecto túnel, preferentemente dicha unión es transitoria y de forma adicionalmente preferida puede producirse más frecuentemente de lo que se produciría sin la elevada concentración local debido a la unión de dicha nucleobase con un marcador de efecto túnel unido a la anterior.

9. El método de la reivindicación 1, en donde dicho marcador de efecto túnel está unido en 5' de la ribosa de la nucleobase o a la base de la nucleobase.

10. El método de la reivindicación 1, en donde dicha nucleobase además comprende un terminador, preferentemente dicho terminador está unido en 3' de la ribosa.

11. El método de la reivindicación 9, en donde dicho método es un método químico sincronizado.

12. Un aparato que comprende:

a. dos electrodos dispuestos sobre un sustrato separado por una separación no conductora, en donde una monocapa autoensamblada (SAM) está unida a los electrodos, comprendiendo la SAM extremos adherentes b. los dos electrodos y la separación pueden configurarse para acomodar una polimerasa en la proximidad de los dos electrodos,

c. los dos electrodos y la separación adicionalmente configurada para detectar una corriente de efecto túnel debido a al menos uno de incorporación y unión de un nucleótido con un marcador de efecto túnel complementario de una base interrogada de una muestra de ácido nucleico, en donde el marcador de efecto túnel comprende una región monocatenaria complementaria de un extremo adherido.

13. El aparato de la reivindicación 12, adicionalmente configurado para que la polimerasa se disponga en la separación no conductora, en donde dicha separación está químicamente atacada entre dichos electrodos hasta una profundidad de 10 nm o más.

14. El aparato de la reivindicación 12, configurado además de manera que el tamaño de la separación no conductora sea menor que el tamaño de la polimerasa y configurado para que la polimerasa se disponga sobre la separación no conductora, en donde dicha separación no conductora puede estar químicamente atacada hasta una profundidad de 10 nm o menos.

15. El aparato de la reivindicación 12, donde la separación no conductora tiene una porción más ancha y una porción más estrecha.

16. Un método que comprende:

a. usar una polimerasa adyacente a dos electrodos en un sustrato para unirse a una nucleobase que tiene un marcador de efecto túnel unido al anterior, complementario de una base interrogada de una muestra de ácido nucleico,

b. medir na combinación de al menos una corriente de efecto túnel y una corriente de salto electrónico entre los dos electrodos producida por la localización del marcador de efecto túnel hacia los dos electrodos,

c. identificar una nucleobase correspondiente en la porción monocatenaria del polinucleótido basándose en la medición de la corriente de electrones.

17. Un método para la detección y la cuantificación de las biomoléculas que comprenden un compuesto marcador de efecto túnel, en donde el compuesto marcador de efecto túnel comprende un polímero de ácido nucleico, comprendiendo el método:

a. localizar el polímero de ácido nucleico entre dos electrodos sobre un sustrato, en donde la localización se realiza hibridando una porción del polímero de ácido nucleico sobre cualquiera o ambos de los electrodos, b. aplicar una tensión de polarización entre los dos electrodos,

c. medir una corriente de efecto túnel entre los dos electrodos,

d. determinar la presencia y la cantidad de biomoléculas basándose en la conductancia,

en donde la longitud del polímero de ácido nucleico es mayor que el tamaño de una separación entre los dos electrodos, y en donde una porción del polímero de ácido nucleico abarca la separación entre los dos electrodos.

18. El método de la reivindicación 17, en donde a cierta conductancia medida indica la metilación de un cierto sitio en el polímero de ácido nucleico.