KR20230015928A - 중합체 가교를 이용한 서열분석을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

중합체 가교를 이용한 서열분석을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230015928A
KR20230015928A KR1020227042112A KR20227042112A KR20230015928A KR 20230015928 A KR20230015928 A KR 20230015928A KR 1020227042112 A KR1020227042112 A KR 1020227042112A KR 20227042112 A KR20227042112 A KR 20227042112A KR 20230015928 A KR20230015928 A KR 20230015928A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
region
label
polymer chain
universal
polynucleotide
Prior art date
Application number
KR1020227042112A
Other languages
English (en)
Inventor
제프리 맨델
Original Assignee
일루미나, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 일루미나, 인코포레이티드 filed Critical 일루미나, 인코포레이티드
Publication of KR20230015928A publication Critical patent/KR20230015928A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/117—Modifications characterised by incorporating modified base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/116—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties electrical properties of nucleic acids, e.g. impedance, conductivity or resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/179—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/107—Alteration in the property of hybridised versus free label oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/514—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the use of the arrayed oligonucleotides as identifier tags, e.g. universal addressable array, anti-tag or tag complement array
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/549—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the capture oligonucleotide being a reporter labelled capture oligonucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/607—Detection means characterised by use of a special device being a sensor, e.g. electrode

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

부분 이중 가닥 중합체 가교를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 전자적으로 서열분석하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 가교는 제1 및 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있을 수 있다. 복수의 뉴클레오티드가 상응하는 표지에 결합될 수 있다. 중합효소는 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지는 이중 가닥이 아닌 가교의 일부에 각각 혼성화될 수 있다. 검출 회로는 가교를 통한 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 중합효소가 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가한 서열을 검출할 수 있으며, 이러한 변화는 가교의 비이중 가닥 부분과 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지 사이의 각각의 혼성화에 반응하는 것이다.

Description

중합체 가교를 이용한 서열분석을 위한 조성물 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 "중합체 가교를 이용한 서열분석을 위한 조성물 및 방법"이란 명칭으로 2020년 5월 4일자로 출원된 미국 가출원 제63/019,882호의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2021년 4월 28일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 IP-1955-PCT_SL.txt이며, 크기는 1,503 바이트이다.
상당한 양의 학부 및 기업의 시간 및 에너지가 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드 서열분석에 투자되고 있다. 일부 서열분석 시스템은 "합성에 의한 서열분석(sequencing by synthesis, SBS)" 기술 및 형광 기반 검출법을 사용한다. 그러나, 형광 기반 검출법은 여기 광원, 이미징 장치 등과 같은 광학 구성요소를 필요로 할 수 있으며, 이는 복잡하고, 작동 시 시간 소모적이며, 비용이 많이 들 수 있다.
본원에 제공된 예는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 전자적으로 서열분석하는 것과 관련된 것이다. 이러한 전자 서열분석을 수행하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.
일부 예시에서, 가교는 제1 전극 및 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있을 수 있다. 복수의 뉴클레오티드가 상응하는 표지에 결합될 수 있다. 중합효소는 가교에 결합되거나 그에 근접할 수 있고, 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지는 이중 가닥이 아닌 가교의 일부에 각각 혼성화될 수 있다. 검출 회로는 가교를 통한 적어도 전기 신호, 예를 들어 전류 또는 전압의 변화를 사용하여 중합효소가 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가한 서열을 검출할 수 있으며, 이러한 변화는 가교의 비-이중 가닥 부분과 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지 사이의 각각의 혼성화에 반응한다.
본원의 일부 실시예에서, 공간에 의해 서로 분리된 제1 및 제2 전극, 및 제1 및 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 가교를 포함하는 조성물이 제공된다. 가교는 서로 혼성화된 제1 및 제2 중합체 사슬을 포함할 수 있다. 제1 중합체 사슬은 제1 길이를 가질 수 있고, 제2 중합체 사슬은 제1 길이보다 짧은 제2 길이를 가질 수 있어서, 제1 중합체 사슬의 갭 영역이 제2 중합체 사슬에 혼성화되지 않는다. 갭 영역은 제1 및 제2 범용 단량체를 포함할 수 있다. 조성물은 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 복수의 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있으며, 각각의 뉴클레오티드는 상응하는 표지에 결합된다. 조성물은 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 복수의 뉴클레오티드로부터의 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 첨가하기 위해 중합효소를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지는 각각 제1 및 제2 범용 단량체에 혼성화될 수 있다. 조성물은 가교를 통한 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 중합효소가 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가한 서열을 검출하는 검출 회로를 더 포함할 수 있고, 이러한 변화는 제1 및 제2 범용 단량체와 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지 사이의 각각의 혼성화에 반응한다.
일부 실시예에서, 제1 및 제2 중합체 사슬은 각각 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예시에서, 표지는 서로 상이한 서열을 갖는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 범용 단량체는 각각 제1 및 제2 범용 염기를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 올리고뉴클레오티드와 제1 및 제2 범용 염기 사이의 혼성화는 가교를 통한 전기 신호를 변화시킨다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 범용 염기는 이노신, 니트로인돌, 니트로피롤, 벤즈이미다졸, 5-플루오로인돌, 인돌 뉴클레오시드 유도체, 및 이소카르보스티릴 뉴클레오시드 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시예에서, 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드 및 표지의 올리고뉴클레오티드는 비천연 발생 DNA를 포함한다. 일부 실시예에서, 비천연 발생 DNA는 거울상이성질체 DNA를 포함한다.
일부 실시예에서, 갭 영역은 안정화 영역을 추가로 포함한다. 표지는 안정화 영역에 추가로 혼성화될 수 있다. 안정화 영역은 제1 및 제2 범용 단량체에 대한 표지의 혼성화를 안정화시킬 수 있다.
일부 실시예에서, 갭 영역은 제1 중합체 사슬의 말단 단부에 위치한다.
본원의 일부 실시예에서, 서열분석 방법이 제공된다. 이러한 방법은, 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 중합효소에 의해 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지를 제1 및 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 가교의 중합체 사슬의 갭 영역에 혼성화시키는 단계를 포함할 수 있되, 갭 영역은 제1 및 제2 범용 단량체를 포함한다. 이러한 방법은 범용 단량체와 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지 사이의 각각의 혼성화에 반응하는 가교를 통한 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 중합효소가 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가한 서열을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 중합체 사슬은 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 표지는 서로 상이한 서열을 갖는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 범용 단량체는 각각 제1 및 제2 범용 염기를 포함한다. 일부 실시예에서, 올리고뉴클레오티드와 제1 및 제2 범용 염기 사이의 혼성화는 가교를 통한 전기 신호를 변화시킨다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 범용 염기는 이노신, 니트로인돌, 니트로피롤, 벤즈이미다졸, 5-플루오로인돌, 인돌 뉴클레오시드 유도체, 및 이소카르보스티릴 뉴클레오시드 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시예에서, 제3 폴리뉴클레오티드 및 표지의 올리고뉴클레오티드는 비천연 발생 DNA를 포함한다. 일부 실시예에서, 비천연 발생 DNA는 거울상이성질체 DNA를 포함한다.
일부 실시예에서, 갭 영역은 안정화 영역을 추가로 포함하고, 본 방법은 안정화 영역에 의해, 제1 및 제2 범용 단량체에 대한 각각의 표지의 혼성화를 안정화 영영에 의해 안정화시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 갭 영역은 중합체 사슬의 말단 단부에 위치한다.
본원의 일부 실시예에서, 공간에 의해 서로 분리된 제1 및 제2 전극, 및 제1 및 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 가교를 포함하는 조성물이 제공된다. 가교는 제1 및 제2 중합체 사슬이 서로 혼성화되지 않은 제1 영역, 및 제1 및 제2 중합체 사슬이 서로 혼성화되는 제2 영역을 각각 갖는 제1 및 제2 중합체 사슬을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 복수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 각각의 뉴클레오티드는 상응하는 표지에 결합된다. 조성물은 또한 제2 중합체 사슬의 제1 영역에 결합된 중합효소를 포함할 수 있다. 중합효소는 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 복수의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 첨가할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지는 각각 제1 중합체 사슬의 제1 영역에 혼성화될 수 있다. 조성물은, 또한, 가교를 통한 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 중합효소가 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가한 서열을 검출하는 검출 회로를 포함할 수 있되, 이러한 변화는 제1 중합체 사슬의 제1 영역과 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지 사이의 각각의 혼성화에 반응한다.
일부 실시예에서, 제1 및 제2 중합체 사슬은 각각 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 표지는 서로 상이한 서열을 갖는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 각각 혼성화되는 제1 및 제2 범용 염기를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 올리고뉴클레오티드와 제1 및 제2 범용 염기 사이의 혼성화는 가교를 통한 전기 신호를 변화시킨다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 범용 염기는 이노신, 니트로인돌, 니트로피롤, 벤즈이미다졸, 5-플루오로인돌, 인돌 뉴클레오시드 유도체, 및 이소카르보스티릴 뉴클레오시드 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시예에서, 제2 중합체 사슬의 제1 영역은 올리고뉴클레오티드에 혼성화되지 않는 중합체를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드 및 표지의 올리고뉴클레오티드는 비천연 발생 DNA를 포함한다. 일부 실시예에서, 비천연 발생 DNA는 거울상 이성질체 DNA를 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 중합체 사슬은 각각의 표지의 제1 단량체 및 제2 단량체가 각각 혼성화되는 제1 및 제2 범용 단량체를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 범용 단량체는 제1 중합체 사슬의 말단부에 위치한다.
일부 실시예에서, 제2 중합체 사슬의 제1 영역은 비전도성이다.
본원의 일부 실시예에서, 서열분석 방법이 제공된다. 이러한 방법은, 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 중합효소에 의해 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지를 제1 및 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 가교의 제1 중합체 사슬의 제1 영역에 혼성화하는 단계를 포함할 수 있다. 가교는 제2 중합체 사슬을 추가로 포함할 수 있다. 중합효소는 제2 중합체 사슬의 제1 영역에 결합될 수 있고, 제1 중합체 사슬의 제2 영역은 제2 중합체 사슬의 제2 영역에 혼성화될 수 있다. 이러한 방법은 제1 중합체 사슬의 제1 영역과 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지 사이의 각각의 혼성화에 반응하는 가교를 통한 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 중합효소가 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가한 서열을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 제1 및 제2 중합체 사슬은 각각 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 표지는 서로 상이한 서열을 갖는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 각각 혼성화되는 제1 및 제2 범용 염기를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 올리고뉴클레오티드와 제1 및 제2 범용 염기 사이의 혼성화는 가교를 통한 전기 신호를 변화시킨다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 범용 염기는 이노신, 니트로인돌, 니트로피롤, 벤즈이미다졸, 5-플루오로인돌, 인돌 뉴클레오시드 유도체, 및 이소카르보스티릴 뉴클레오시드 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시예에서, 제2 중합체 사슬의 제1 영역은 올리고뉴클레오티드에 혼성화되지 않는 중합체를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드 및 표지의 올리고뉴클레오티드는 비천연 발생 DNA를 포함한다. 일부 실시예에서, 비천연 발생 DNA는 거울상 이성질체 DNA를 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 중합체 사슬은 각각의 표지의 제1 및 제2 단량체가 각각 혼성화되는 제1 및 제2 범용 단량체를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 범용 단량체는 제1 중합체 사슬의 말단 단부에 위치한다.
일부 실시예에서, 제2 중합체 사슬의 제1 영역은 비전도성이다.
본 명세서에서 설명되는 바와 같은 본 개시의 각각의 양태의 특징부/실시예는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 이익을 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있고, 이러한 양태 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징부/예는 여기에서 설명된 바와 같이 다른 양태(들)의 임의의 특징부와 함께 구현될 수 있음을 이해할 것이다.
도 1a 및 도 1b는 범용 단량체 및 선택적인 안정화 영역을 포함하는 갭 영역을 갖는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 포함하는 서열분석을 위한 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다.
도 2는 범용 단량체 및 선택적인 안정화 영역을 포함하는 갭 영역을 갖는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 포함하는 서열분석을 위한 다른 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다.
도 3a 및 도 3b는 범용 염기 및 선택적 안정화 영역을 포함하는 갭 영역을 갖는 부분 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 가교를 포함하는 서열분석을 위한 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다. 도 3a는 보이는 순서대로 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2를 개시한다.
도 4는 범용 단량체 및 선택적 안정화 영역을 포함하는 갭 영역을 갖는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 사용하는 서열분석을 위한 방법의 예시적인 작업 흐름을 도시한다.
도 5a 및 도 5b는 하나의 단일 가닥 영역에 부착된 중합효소를 갖는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 포함하는 서열분석을 위한 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다.
도 6은 하나의 단일 가닥 영역에 부착된 중합효소를 갖는 부분 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 가교를 포함하는 서열분석을 위한 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다. 도 6은 보이는 순서대로 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 개시한다.
도 7은 하나의 단일 가닥 영역에 부착된 중합효소를 갖는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 사용하여 서열분석하는 방법에서의 예시적인 작업 흐름을 도시한다.
도 8a 내지 도 8d는 범용 단량체 및 선택적인 안정화 영역을 포함하는 갭 영역을 갖는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 포함하는 서열분석을 위한 추가의 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다.
본원에 제공된 예는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 사용한 전자적 서열분석에 관한 것이다. 이러한 전자 서열분석을 수행하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 조성물 및 방법은 적합하게는, 강력하고 재현가능하고 민감하고 높은 처리량을 갖는 방식으로 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 제1 및 제2 전극 및 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 가교를 포함할 수 있다. 가교는 부분 이중 가닥 중합체를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 서열분석 공정 동안 표지된 뉴클레오티드의 표지가 혼성화될 수 있는 영역을 이용가능하도록 남겨두는 방식으로 서로 적어도 부분적으로 혼성화된 제1 및 제2 중합체 사슬을 포함할 수 있다. 표지와 영역의 혼성화는 가교의 전기적 특성, 예를 들어 가교의 전도도 또는 임피던스를 변조할 수 있고, 적어도 이러한 변조를 사용하여 뉴클레오티드를 식별할 수 있다. 일부 실시예에서, 표지가 혼성화될 수 있는 영역은 가교 내 갭을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 중합체 사슬은 서로 혼성화되지 않는데, 예를 들어 제2 중합체 사슬은 제1 중합체 사슬보다 짧다. 일부 실시예에서, 갭은 표지가 갭 내에서 혼성화될 때 가교의 전기 전도도 또는 임피던스의 변조를 향상시킬 수 있는 하나 이상의 범용 염기를 포함할 수 있고, 따라서 이러한 표지에 부착된 뉴클레오티드 식별의 정확도, 속도 또는 신뢰성을 향상시킬 수 있다.
다른 실시예에서, 표지가 혼성화될 수 있는 영역은 제1 및 제2 중합체 사슬이 하나의 영역에서 서로 부분적으로 혼성화되고 다른 영역에서는 서로 혼성화되지 않는 분기된 가교의 일부를 포함한다. 중합효소는 비혼성화 영역에서 중합체 사슬 중 하나에 결합될 수 있고, 표지는 비혼성화 영역에서 다른 중합체 사슬과 혼성화되어, 가교의 해당 부분의 전도도 또는 임피던스를 변조할 수 있다. 이러한 분기된 배열은 표지가 혼성화되는 중합체 사슬의 부분에 중합효소가 힘을 인가하는 것을 감소시키거나 억제할 수 있으며, 이러한 힘은 그렇지 않으면 표지로 인한 전도도 또는 임피던스 변화를 적어도 부분적으로 모호하게 하는 방식으로 그 자체가 전도도 또는 임피던스를 변조할 수 있다. 대안적으로, 다른 구현예에서, 이러한 힘이 유리할 수 있다. 가교를 통해 검출 가능한 전도도 또는 임피던스의 변조를 초래하는 중합효소에 의해 가해지는 힘은 중합효소 활성 부위에서 뉴클레오티드를 식별하는 정확도, 속도 또는 신뢰성을 향상시키는 유익한 정보를 보유할 수 있다.
먼저, 본 명세서에서 사용되는 일부 용어들이 간략하게 설명될 것이다. 이어서, 일부 예시적인 조성물 및 전자적 서열분석을 위한 예시적인 방법이 설명될 것이다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 "포함하다", "포함한다", 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 용어 "갖는" 뿐만 아니라 "갖다", "갖는다", 및 "가진"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 청구항의 전제부에서든 또는 본문에서든, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 개방형(open-ended) 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 어구 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"과 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 공정과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 공정이 적어도 언급된 단계들을 포함하지만, 추가의 단계들을 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 언급된 특징부들 또는 구성요소들을 포함하지만, 또한 추가의 특징부들 또는 구성요소들을 포함할 수 있음을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "실질적으로", "대략", 및 "약"은, 예를 들어 가공에 있어서의 변수로 인한 작은 변동을 기재하고 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, 이들은 ±5% 이하, 예컨대 ±2% 이하, 예컨대 ±1% 이하, 예컨대 ±0.5% 이하, 예컨대 ±0.2% 이하, 예컨대 ±0.1% 이하, 예컨대 ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "전극"는 전기를 전도하는 고형 구조를 의미하도록 의도된다. 전극은 금, 팔라듐, 또는 백금, 또는 이들의 조합과 같은 임의의 적합한 전기 전도성 물질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "가교"는 2개의 다른 구조물 사이에서 연장되고 그에 부착되는 구조물을 의미하도록 의도된다. 가교는 두 전극 사이와 같은 다른 구조체들 사이의 공간에 걸쳐 있을 수 있다. 가교의 모든 요소가 반드시 두 구조에 부착될 필요는 없다. 예를 들어, 서로 연결되고 두 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 제1 및 제2 중합체 사슬을 포함하는 가교에서, 중합체 사슬 중 하나의 적어도 하나의 단부는 전극들 중 하나에 부착되고, 중합체 사슬 중 하나의 적어도 하나의 단부는 다른 전극에 부착된다. 그러나, 두 중합체 사슬 모두가 전극 둘 다에 연결될 필요가 없고, 실제로 중합체 사슬들 중 하나는 전극들 중 어느 하나와 접촉할 필요가 없다. 가교는 다른 구조체들 사이에서 연장되고 그에 집합적으로 연결되는 방식으로 서로 부착되는 다수의 구성요소들을 포함할 수 있다. 가교는 화학적 결합, 예를 들어, 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 쌍극자-쌍극자 결합, 런던 분산력, 또는 이들의 임의의 적합한 조합을 통해 전극과 같은 다른 구조에 부착될 수 있다.
본원에 사용된 "중합체"는, 서로 결합된, 단량체로 지칭될 수 있는 많은 서브유닛의 사슬을 포함하는 분자를 지칭한다. 서브유닛은 반복될 수 있거나, 서로 상이할 수 있다. 중합체 및 이들의 서브유닛은 생물학적 또는 합성일 수 있다. 가교 또는 표지 내에 적합하게 포함될 수 있는 예시적인 생물학적 중합체는 폴리뉴클레오티드(뉴클레오티드 서브유닛으로부터 제조됨), 폴리펩티드(아미노산 서브유닛으로부터 제조됨), 다당류, 폴리뉴클레오티드 유사체, 및 폴리펩티드 유사체를 포함한다. 가교 또는 표지에 사용하기에 적합한 예시적인 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 유사체는 DNA, 거울상이성질체 DNA, RNA, PNA(펩티드-핵산), 모르폴리노 및 LNA(잠금 핵산)를 포함한다. 중합체는 폴리뉴클레오티드에 결합될 수 있지만, 핵염기가 결여된 포스포라미다이트, 예컨대, Glen Research(Sterling, VA)로부터 상업적으로 입수 가능한, 예를 들어, 스페이서 포스포라미다이트 18(18-O-디메톡시트리틸헥사에틸렌글리콜 1,1-[(2-시아노에틸)-(N, N-디이소프로필)]-포스포라미다이트)로부터 유래된 스페이서 서브유닛을 포함할 수 있다. 예시적인 합성 폴리펩티드는 하전 아미노산, 친수성, 소수성 및 중성 아미노산 잔기와 같은 모든 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 가교 또는 표지 내에 적합하게 포함될 수 있는 예시적인 합성 중합체는 PEG(폴리에틸렌 글리콜), PPG(폴리프로필렌 글리콜), PVA(폴리비닐 알코올), PE(폴리에틸렌), LDPE(저밀도 폴리에틸렌), HDPE(고밀도 폴리에틸렌), 폴리프로필렌, PVC(폴리비닐 클로라이드), PS(폴리스티렌), 나일론(지방족 폴리아미드), TEFLON®(테트라플루오로에틸렌), 열가소성 폴리우레탄, 폴리알데하이드, 폴리올레핀, 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(ω-알켄산 에스테르), 폴리(알킬 메타크릴레이트),및 문헌[Hermanson, Bioconjugate Techniques, third edition, Academic Press, London (2013)]에 기재된 바와 같은 기타 중합체성 화학적 및 생물학적 링커를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "혼성화"는 이러한 중합체의 길이를 따라 제1 중합체를 제2 중합체에 비공유결합으로 결합시키는 것을 의미하고자 의도된다. 예를 들어, 2개의 DNA 폴리뉴클레오티드 가닥은 상보적 염기 쌍을 통해 결합할 수 있다. 제1 및 제2 중합체 사이의 결합의 강도는 이러한 중합체 내의 단량체 단위의 서열 사이의 상보성에 따라 증가한다. 예를 들어, 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 결합의 강도는 이러한 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 서열 사이의 상보성에 따라 증가한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "안정화 영역"은 제1 중합체와 제2 중합체 사이의 부착 강도를 향상시키는 중합체의 일부를 의미하도록 의도된다. 안정화는 제1 및 제2 중합체 사이의 상보성 영역, 및 중합체 내 닉에서 염기의 pi 적층을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 당 및 적어도 하나의 인산기, 그리고 일부 실시예에서, 핵염기도 또한 포함하는 분자를 의미하도록 의도된다. 핵염기가 결여된 뉴클레오티드는 "무염기"로 지칭될 수 있다 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 인산 당 골격 뉴클레오티드, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 뉴클레오티드의 예는 아데노신 모노포스페이트(AMP), 아데노신 디포스페이트(ADP), 아데노신 트리포스페이트(ATP), 티미딘 모노포스페이트(TMP), 티미딘 디포스페이트(TDP), 티미딘 트리포스페이트(TTP), 시티딘 모노포스페이트(CMP), 시티딘 디포스페이트(CDP), 시티딘 트리포스페이트(CTP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 구아노신 디포스페이트(GDP), 구아노신 트리포스페이트(GTP), 우리딘 모노포스페이트(UMP), 우리딘 디포스페이트(UDP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트(dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시티미딘 모노포스페이트(dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트(dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP), 데옥시시티딘 디포스페이트(dCDP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트(dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트(dUDP), 및 데옥시우리딘 트리포스페이트(dUTP)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 또한 자연 발생 뉴클레오티드와 비교하여 변형된 핵 염기, 당 및/또는 인산 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드의 유형인 임의의 뉴클레오티드 유사체를 포함하도록 의도된다. 예시적인 변형된 핵염기는 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소시토신, 이소구아닌, 2-아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸 시토신, 2-아미노아데닌, 6-메틸 아데닌, 6-메틸 구아닌, 2-프로필 구아닌, 2-프로필 아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 15-할로우라실, 15-할로시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌 또는 구아닌, 8-아미노 아데닌 또는 구아닌, 8-티올 아데닌 또는 구아닌, 8-티오알킬 아데닌 또는 구아닌, 8-하이드록실 아데닌 또는 구아닌, 5-할로 치환된 우라실 또는 시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌 등을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 특정 뉴클레오티드 유사체는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 아데노신 5'-포스포설페이트와 같은 뉴클레오티드 유사체에 혼입될 수 없다. 뉴클레오티드는 임의의 적합한 수의 인산염, 예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 6개 초과의 인산염을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 서로 결합된 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 중합체의 하나의 비제한적인 예이다. 폴리뉴클레오티드의 예는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 이들의 유사체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 단일 가닥 DNA와 같은 뉴클레오티드의 단일 가닥 서열, 이중 가닥 DNA와 같은 뉴클레오티드의 이중 가닥 서열일 수 있거나 뉴클레오티드의 단일 가닥과 이중 가닥 서열의 혼합물을 포함할 수 있다. 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 게놈 DNA, 및 PCR 및 증폭 생성물을 포함한다. 단일 가닥 DNA(ssDNA)는 dsDNA로 전환될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다. 폴리뉴클레오티드는 거울상이성질체 DNA와 같은 비천연 발생 DNA를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 정확한 서열은 공지되거나 알려지지 않을 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 예시적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, 발현된 서열 태그(EST) 또는 연속 분석 유전자 발현(SAGE) 태그), 게놈 DNA, 게놈 DNA 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보좀 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 합성 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 전술한 것 중 임의의 것의 프라이머 또는 증폭된 카피.
본원에 사용된 바와 같이, "범용 단량체"는 이러한 중합체의 하나 초과의 단위와 혼성화할 수 있는 중합체의 단량체 단위를 지칭한다. 일부 실시예에서, 범용 단량체는 이러한 중합체의 임의의 다른 단량체 단위와 혼성화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 "범용 단량체"의 예는 하나를 초과하는 염기 유형과 혼성화할 수 있고, 일부 실시예에서 임의의 다른 핵염기와 혼성화될 수 있는 핵염기를 지칭하는 "범용 염기"이다. 범용 염기의 예는 이노신, 니트로인돌, 니트로피롤, 벤즈이미다졸, 5-플루오로인돌, 인돌 뉴클레오시드 유도체, 및 이소카르보스티릴 뉴클레오시드 유도체와 같은 변형된 핵염기를 포함한다. 범용 염기에 관한 추가 세부 사항은, 문헌[Loakes, "The applications of universal DNA base analogues," Nucleic Acids Research 29(12): 2437-2447 (2001)]을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같이, "중합효소"는 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드로 중합시켜 폴리뉴클레오티드를 조립하는 활성 부위를 갖는 효소를 의미하는 것으로 의도된다. 중합효소는 프라이밍된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 주형에 결합할 수 있고, 성장하는 프라이머에 뉴클레오티드를 순차적으로 첨가하여 주형의 서열에 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머"는 뉴클레오티드가 유리 3'OH기를 통해 첨가되는 폴리뉴클레오티드로 정의된다. 프라이머는 블록이 제거될 때까지 중합을 방지하는 3'블록을 가질 수 있다. 프라이머는 또한, 커플링 반응을 허용하거나 프라이머를 또 다른 모이어티에 결합시키기 위해 5'말단에서 변형을 가질 수 있다. 프라이머 길이는 임의의 수의 염기 길이일 수 있으며, 다양한 비-천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표지"는 임피던스 또는 전도도와 같은 가교의 전기적 특성의 변화를 야기하는 방식으로 가교에 부착되는 구조물을 의미하도록 의도되며, 이에 기초하여 뉴클레오티드 변화를 식별할 수 있다. 예를 들어, 표지는 이러한 가교 내의 중합체 사슬에 혼성화될 수 있고, 혼성화는 가교의 전도도 또는 임피던스 변화를 야기할 수 있다. 본원에 제공된 실시예에서, 표지는 뉴클레오티드에 부착될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기판"은 본원에 기재된 조성물에 대한 지지체로서 사용되는 물질을 지칭한다. 예시적인 기판 재료는 유리, 실리카, 플라스틱, 석영, 금속, 금속 산화물, 유기-실리케이트(예를 들어, 다면체 유기 실세스퀴옥산(POSS)), 폴리아크릴레이트, 탄탈륨 옥사이드, 상보적 금속 산화물 반도체(CMOS), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. POSS의 예는 그 전체가 참조로서 포함된 문헌[Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778]에 기재된 것일 수 있다. 일부 실시예에서, 본 출원에 사용된 기판은 유리, 용융 실리카, 또는 다른 실리카-함유 물질과 같은 실리카계 기판을 포함한다. 일부 실시예에서, 기판은 실리콘, 실리콘 질화물, 또는 실리콘 수화물을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 출원에 사용된 기판은 플라스틱 물질 또는 구성요소, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 포함한다. 예시적인 플라스틱 물질은 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리스티렌, 및 환형 올레핀 중합체 기재를 포함한다. 일부 실시예에서, 기판은 실리카계 물질 또는 플라스틱 물질 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 실시예에서, 기판은 유리 또는 실리콘계 중합체를 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일부 실시예에서, 기판은 금속을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시예에서, 금속은 금이다. 일부 실시예에서, 기판은 금속 산화물을 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일 실시예에서, 표면은 산화탄탈룸 또는 산화주석을 포함한다. 아크릴아미드, 에논 또는 아크릴레이트도 또한 기판 물질 또는 성분으로서 사용될 수 있다. 다른 기판 물질은, 이에 제한되지는 않으나, 갈륨 비소, 인듐 포스파이드, 알루미늄, 세라믹, 폴리이미드, 석영, 수지, 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 기판 및/또는 기판 표면은 석영일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 다른 실시예에서, 기판 및/또는 기판 표면은 GaAs 또는 ITO와 같은 반도체이거나 이를 포함할 수 있다. 전술한 목록은 본 출원을 예시하는 것으로 의도되고, 이들로 제한되지 않는다. 기판은 단일 물질 또는 복수의 상이한 물질을 포함할 수 있다. 기판은 복합체 또는 라미네이트일 수 있다. 일부 실시예에서, 기판은 유기-실리케이트 물질을 포함한다.
기판은 편평한, 둥근, 구형, 막대 형상, 또는 임의의 다른 적합한 형상일 수 있다. 기판은 강성 또는 가요성일 수 있다. 일부 실시예에서, 기판은 비드 또는 플로 셀이다.
기판은 기판의 하나 이상의 표면 상에 비패턴화되거나, 텍스처화되거나, 또는 패턴화될 수 있다. 일부 실시예에서, 기판은 패턴화된다. 이러한 패턴은 포스트, 패드, 웰, 리지, 채널, 또는 다른 3차원 오목 또는 볼록한 구조를 포함할 수 있다. 패턴은 기판의 표면에 걸쳐 규칙적이거나 불규칙적일 수 있다. 패턴은, 예를 들어, 나노임프린트 리소그래피에 의해, 또는, 예를 들어, 비금속 표면 상에 특징부를 형성하는 금속 패드의 사용에 의해 형성될 수 있다.
일부 실시예에서, 본원에 설명된 기판은 플로 셀의 적어도 일부를 형성하거나 플로우 셀에 위치하거나 또는 그에 결합된다. 플로우 셀은 복수의 레인 또는 복수의 섹터로 분할되는 유동 챔버를 포함할 수 있다. 본원에 제시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 플로우 셀의 제조를 위한 예시적인 플로우 셀 및 기판은 Illumina, inc.(San Diego, CA)로부터 상업적으로 입수 가능한 것들을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
폴리뉴클레오티드 서열분석을 위한 예시적인 조성물 및 방법
도 1a 및 도 1b는, 범용 단량체 및 선택적인 안정화 영역을 포함하는 갭 영역을 갖는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 포함하는 서열분석을 위한 예시적인 조성물(100)을 도시한다. 이제 도 1a를 참조하면, 조성물(100)은 기판(101), 제1 전극(102), 제2 전극(103), 중합효소(104), 가교(110), 뉴클레오티드(121, 122, 123, 및 124), 이러한 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지(131, 132, 133, 및 134), 제1 폴리뉴클레오티드(140), 제2 폴리뉴클레오티드(150) 및 검출 회로(160)를 포함한다. 중합효소(105)는 가교(110)에 근접하고, 일부 실시예에서, 당업계에 공지된 바와 같은 방식으로 링커(106)를 통해 가교(110)에 결합될 수 있다. 이러한 링커 화학은 시스테인 잔기 상의 반응성 티올에 대한 말레이미드 화학, 리신 잔기 상의 반응성 아민에 대한 NHS 에스테르 화학, 비오틴-스트렙트아비딘, 및 예를 들어, Spytag-SpyCatcher를 포함한다. 도 1a 및 도 1b에 도시된 예시에서, 조성물(100)의 구성요소는 유체(120)가 충전된 플로우 셀(예를 들어, 벽(161, 162, 162)을 가짐) 내에 둘러싸일 수 있으며, 여기에 뉴클레오티드(121, 122, 123, 및 124)(연관된 표지), 폴리뉴클레오티드(140, 150), 및 적합한 시약이 담겨질 수 있다.
기판(101)은 제1 전극(102) 및 제2 전극(103)을 지지할 수 있다. 제1 전극(102) 및 제2 전극(103)은 공간, 예를 들어, 도 1a에 도시된 바와 같이 길이 L의 공간에 의해 서로 분리될 수 있다. L의 값은, 일부 실시예에서, 약 1 nm 내지 약 1 마이크론, 예를 들어, 약 1 nm 내지 약 100 nm, 예를 들어, 약 1 nm 내지 약 10 nm, 예를 들어, 약 10 nm 내지 약 25 nm, 예를 들어, 약 25 nm 내지 약 50 nm일 수 있다. 제1 전극(102) 및 제2 전극(103)은 임의의 적합한 형상 및 배열을 가질 수 있고, 도 1a에 제시된 대략적인 직사각형 형상으로 제한되지 않는다. 도 1a에 도시된 제1 전극(102) 및 제2 전극(103)의 측벽은, 반드시 그럴 필요는 없지만, 서로 수직이거나 평행할 수 있고, 이러한 전극의 상단 표면이 반드시 직각을 만족시켜야 할 필요는 없다. 예를 들어, 제1 전극(102) 및 제2 전극(103)은 불규칙하게 형상화될 수 있거나, 만곡될 수 있거나, 또는 임의의 적합한 수의 둔각 또는 예각을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 전극(102) 및 제2 전극(103)은 서로에 대해 수직으로 배열될 수 있다. 값 L은 제1 전극(102)과 제2 전극(103)의 서로 가장 가까운 지점들 사이의 간격을 지칭할 수 있다.
가교(110)는 제1 전극(102) 및 제2 전극(103) 사이의 공간에 걸쳐 있을 수 있고, 서로 혼성화된 제1 중합체 사슬(111) 및 제2 중합체 사슬(112)(각각의 중합체 사슬 내의 원은 중합체 사슬의 길이를 따라 서로 결합된 단량체 단위를 제안하는 것으로 의도됨)을 포함할 수 있다. 제1 중합체 사슬(111) 및 제2 중합체 사슬(112)은 각각의 중합체 사슬 내의 단량체 단위의 서열이 서로 상이할 수 있지만, 서로 동일한 유형의 중합체를 포함할 수 있다. 실제로, 도 1a에 도시된 비제한적인 예시에서, 제1 중합체 사슬(111)은 제1 길이를 갖고, 제2 중합체 사슬(112)은 제1 길이보다 짧은 제2 길이를 가져서, 제1 중합체 사슬(111)의 갭 영역(113)은 제2 중합체 사슬(112)과 혼성화되지 않는다. 예를 들어, 제1 중합체 사슬(111)은 제1 전극(102) 및 제2 전극(103) 사이의 공간의 길이 L과 대략 동일한 길이를 가질 수 있어서, 예를 들어, 일부 실시예에서 제1 중합체 클레임(111)이 제1 전극(102) 및 제2 전극(103) 각각에 (예를 들어, 각각의 공유 결합을 통해) 직접 부착될 수 있다. 제2 중합체 사슬(112)은 (예를 들어, 공유 결합을 통해) 제2 전극(103)에 직접 부착될 수 있지만, 제2 전극(102)에 도달하여 갭 영역(113)을 제공하기에 충분히 길지 않을 수 있다. 일부 구성에서, 제1 중합체 사슬(111) 및 제2 중합체 사슬(112) 중 어느 것도 제1 전극(102) 또는 제2 전극(103) 중 하나 또는 둘 모두에 반드시 직접 부착되어야 하는 것은 아니라는 점이 이해되어야 한다. 대신에, 제1 중합체 사슬(111) 및 제2 중합체 사슬(112) 중 어느 하나 또는 둘 모두는 제1 전극(102) 및 제2 전극(103) 중 하나 또는 둘 모두에 각각 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 하나 이상의 다른 구조에 직접 부착될 수 있다. 추가의 선택사항으로서, 제2 중합체 사슬(112)은 갭 영역(113)의 반대측에 있는 제1 중합체 사슬(111)에 혼성화되는 제2 부분(117)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 갭 영역(113)은 도 2를 참조하여 아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같은 방식으로 제1 중합체 사슬(111) 말단 단부에 위치할 수 있으며, 이 경우 제2 부분(117)은 생략될 수 있다.
도 1b를 참조하여 아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 표지(131, 132, 133, 및 134)는 가교(110)의 전기 전도도 또는 임피던스를 변조하는 방식으로 갭 영역(113)에서 제1 중합체 사슬(111)에 혼성화될 수 있고, 이러한 변조에 기반하여 상응하는 뉴클레오티드(121, 122, 123, 및 124)의 식별이 결정될 수 있다. 도 1a에 도시된 비제한적인 구성에서, 제1 중합체 사슬(111)의 갭 영역(113)은 제1 범용 단량체(114), 제2 범용 단량체(115), 및 일부 실시예에서는 또한 안정화 영역(116)도 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 갭 영역(113)은 임의의 적합한 수의 범용 단량체 및 선택적인 안정화 영역으로 구성될 수 있다. 도 1b를 참조하여 아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같은 방식으로, 제1 범용 단량체(114) 및 제2 범용 단량체(115)는 표지(131, 132, 133, 및 134)에 각각 부착된 뉴클레오티드(121, 122, 123, 및 124)의 정확하고 신뢰할 만한 식별을 제공한다. 선택적인 안정화 영역(116)은 이러한 혼성화 중 갭 영역(113) 내 제1 중합체 사슬(111)과 표지(131, 132, 133, 및 134) 각각의 부착 강도를 향상시킬 수 있으며, 따라서 각각의 뉴클레오티드를 식별하는 신뢰성을 추가로 향상시킬 수 있다.
도 1a에 도시된 조성물(100)은 상응하는 표지에 결합된 임의의 적합한 수의 뉴클레오티드, 예를 들어 1개 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 3개 이상의 뉴클레오티드 또는 4개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드(121)(예시적으로, G)는, 일부 실시예에서, 링커(135)를 통해 상응하는 표지(131)에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(122)(예시적으로, T)는, 일부 실시예에서, 링커(136)를 통해 상응하는 표지(132)에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(123)(예시적으로, A)는, 일부 실시예에서, 링커(136)를 통해 상응하는 표지(133)에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(124)(예시적으로, C)는, 일부 실시예에서, 링커(137)를 통해 상응하는 표지(134)에 결합될 수 있다. 일부 실시예에서, 표지와 동일하거나 상이한 중합체를 포함할 수 있는, 링커를 통한, 뉴클레오티드와 표지 사이의 결합은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대 n-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르 화학 또는 클릭 화학을 사용하여 제공될 수 있다. 표지(131, 132, 133, 및134)는 서로 동일한 유형의 중합체를 포함할 수 있지만, 적어도 하나의 관점에서 서로 상이할 수 있으며, 예를 들어, 서로 상이한 서열의 단량체 단위를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 표지(131, 132, 133 및 134)는 갭 영역(113)에서 동일한 유형의 중합체를 포함할 수 있고, 추가적인 선택사항은 중합체 사슬(111)의 나머지 부분에서와 동일한 유형의 중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1a에서, 각각의 표지(131, 132, 133, 및 134) 내의 원은 표지 내의 중합체의 단량체 단위가 중합체 사슬(111 및 112)에 포함된 단량체와 유사함을 시사하는 것으로 의도된다. 도 1b를 참조하여 더 상세히 설명되는 바와 같은 방식으로, 각각의 표지(131, 132, 133, 및 134) 내의 단량체 단위의 서열은 이러한 표지가 갭 영역(113) 내에 혼성화될 때 가교(110)를 통한 전류 또는 전압과 같은 구별 가능한 전기 신호의 생성을 용이하게 하도록 각각 선택될 수 있다.
도 1a에 도시된 조성물(100)은 제1 폴리뉴클레오티드(140), 및 제2 폴리뉴클레오티드(150), 및 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(150)의 서열을 사용하여 복수의 뉴클레오티드(121, 122, 123 및 124)의 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 첨가할 수 있는 중합효소(105)를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지(131, 132, 133, 및 134)는 각각 도 1b를 참조하여 아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같은 방식으로 갭 영역(113)에 혼성화될 수 있다. 일부 실시예에서, 안정화 영역(116)은 각각의 표지(131, 132, 133, 및 134)와 제1 및 제2 범용 단량체(114, 115)의 혼성화를 안정화시킨다. 검출 회로(160)는 가교(110)를 통한 적어도 전류의 변화를 사용하여 중합효소(105)가 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 뉴클레오티드(121, 122, 123 및 124)(반드시 이러한 순서일 필요는 없음)를 첨가한 서열을 검출하도록 구성되며, 이러한 변화는 갭 영역(113)과 이들 뉴클레오티드에 상응하는 표지(131, 132, 133, 및 134) 사이의 혼성화에 반응한다. 예를 들어, 검출 회로(160)는 제1 전극(102) 및 제2 전극(103)에 걸쳐 전압을 인가할 수 있고, 그러한 전압에 응답하여 가교(110)를 통해 흐르는 임의의 전류를 검출할 수 있다. 또는, 예를 들어, 검출 회로(160)는 가교(110) 통해 일정한 전류를 유동시키고, 제1 전극(102) 및 제2 전극(103) 사이의 전압 차이를 검출할 수 있다.
도 1a에 예시된 특정 시간에, 표지(131, 132, 133, 및 134) 중 어느 것도 갭 영역(113)에 혼성화되지 않고, 따라서 비교적 낮은 전류(또는 전류 없음)가 가교(110)를 통해 흐를 수 있다. 뉴클레오티드(121, 122, 123, 124)가 유체(120)를 통해 자유롭게 확산될 수 있고, 각각의 표지(131, 132, 133, 134)는 이러한 확산의 결과로서 갭 영역(113)에 간략하게 혼성화될 수 있고, 표지가 빠르게 탈혼성화될 수 있기 때문에, 가교(110)의 전기 전도도 또는 임피던스에 대한 임의의 결과적인 변화는 너무 짧아서 검출가능하지 않거나, 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 대한 뉴클레오티드의 첨가에 해당하지 않는 것으로 명확하게 식별가능한 것으로 예상된다. 예를 들어, 확산의 결과로서 또는 중합효소-지향성 뉴클레오티드 혼입으로 인하여 혼성화하는 표지는 (통계적으로 말해) 동일한 혼성화 수명을 가질 수 있다. 수명은 상호작용의 오프 속도에 의해 결정된다. 오프 속도는 상호 작용의 특성, 온도, 염도, 완충액 및 기타 요인에 의해 제어되는 상수이다. 확산성 신호로부터의 참 신호를 구별하는 것은 표지가 결합되는 시간의 백분율 및 온 속도에 의해 결정된다. 온 속도는 (오프 속도와 대조적으로) 표지의 농도에 따라 증가한다. 예를 들어, 농도는 주어진 부피에서 분자를 찾을 확률에 해당한다. 뉴클레오티드가 활성 부위에 고정되어 있기 때문에, 표지의 농도는 확산성 것과 비교하여 결합된 뉴클레오티드에 대해 더 큰 크기일 수 있다. 따라서, 온 속도가 훨씬 더 크다. 표지는 확산 및 특이적 상태에서 동등하게 빠르게 탈혼성화될 수 있지만, 특이적 상태는 표지가 매우 빠르게 재결합하게 한다. 뉴클레오티드가 혼입된 후, 표지와 폴리뉴클레오티드 사이의 링커가 절단된다. 따라서, 표지가 탈혼성화된 다음에, 이는 확산 표지와 동일한 부유 확률을 갖는다.
이에 비해, 도 1b는 중합효소(105)가 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(150)의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 뉴클레오티드(121)(예시적으로, G)를 첨가(예를 들어, 그 서열에서 C에 상보적이 되도록)하는 시간을 예시한다. (일부 실시예에서, 링커(137)를 통해) 표지(131)가 부착되는 뉴클레오티드(121)에 중합효소(105)가 작용하기 때문에, 이러한 작용은 갭 영역(113)과 충분한 혼성화를 유지하기에 충분한 시간 동안 표지(131)를 갭 영역(113)에 충분히 가까운 위치에 유지하여 검출 회로(160)에 의해 검출될 수 있도록 가교(110)의 전기 전도도 또는 임피던스의 충분히 긴 변화를 야기하여 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 첨가된 뉴클레오티드(121)의 식별을 가능하게 한다. 또한, 표지(131)는, 갭 영역(113)에 혼성화될 때, 가교(110)에 전기 전도도 또는 임피던스를 부가하는 성질을 가질 수 있어서, 이를 통해 검출 회로(160)가 다른 뉴클레오티드 중 하나와 비교하여 첨가된 뉴클레오티드를 121(예시적으로 G)로서 고유하게 식별할 수 있다. 유사하게, 표지(132)는, 갭 영역(113)에 혼성화될 때, 가교(110)에 전기 전도도 또는 임피던스를 부가하는 성질을 가질 수 있어서, 이를 통해 검출 회로(160)가 다른 뉴클레오티드 중 하나와 비교하여 첨가된 뉴클레오티드를 122(예시적으로 T)로서 고유하게 식별할 수 있다. 유사하게, 표지(133)는, 갭 영역(113)에 혼성화될 때, 가교(110)에 전기 전도도 또는 임피던스를 부가하는 성질을 가질 수 있어서, 이를 통해 검출 회로(160)가 다른 뉴클레오티드 중 하나와 비교하여 첨가된 뉴클레오티드를 123(예시적으로 C)로서 고유하게 식별할 수 있다. 유사하게, 표지(134)는, 갭 영역(113)에 혼성화될 때, 가교(110)에 전기 전도도 또는 임피던스를 부가하는 성질을 가질 수 있어서, 이를 통해 검출 회로(160)가 다른 뉴클레오티드 중 하나와 비교하여 첨가된 뉴클레오티드를 124(예시적으로 C)로서 고유하게 식별할 수 있다.
도 1b에 도시된 예시에서, 표지(131)는 갭 영역(113)의 범용 단량체(114, 115)와 각각 혼성화하는 제1 및 제2 신호 단량체(171, 172)를 포함한다. 제1 및 제2 신호 단량체(171, 172)는 표지(131) 내 임의의 적합한 위치에 위치할 수 있고, 일부 실시예에서, 표지(131)의 단부에 위치할 수 있다. 각각의 표지(132, 133 및 134)는 유사하게 제1 및 제2 신호 단량체(구체적으로 표지되지 않음)를 포함하지만, 이들 단량체의 특정한 유형 및 서열은 단량체를 나타내는 원의 상이한 채워짐이 시사하는 것으로 의도된 바와 같이 표지 간 다르다. 표지의 단량체 유형 및 서열의 이러한 변이는, 이러한 단량체가 범용 염기(114, 115)와 혼성화될 때, 가교(110)를 통해 전류 또는 전압과 같은 상이하고 구별 가능한 전기 신호를 제공하고, 이에 기반하여, 상응하는 뉴클레오티드가 식별될 수 있다. 일부 실시예에서, 표지(131)는 또한 갭 영역(113)의 안정화 영역(116)에 혼성화하는 안정화 상보성 영역(173)을 포함하고, 표지(132, 133, 및 134)는 각각의 표지 내의 점선으로 채워진 단량체에 의해 제안되도록 의도된 바와 같이, 유사한 안정화 상보성 영역(구체적으로 표지되지 않음)을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상이한 표지의 안정화 상보성 영역은 서로 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 신호 단량체 및 안정화 상보성 영역은, 반드시 그럴 필요는 없지만, 서로 인접할 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 표지는 임의의 적합한 수의 신호 단량체 및 임의의 적합한 길이의 안정화 상보성 영역으로 구성된다.
하나의 비제한적인 예시에서, 표지(131, 132, 133, 134)는 서로 적어도 부분적으로 상이한 서열을 갖는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 갭 영역(113)은, 일부 실시예에서, 이러한 올리고뉴클레오티드와 동일한 길이를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하여 갭 영역(113)에 대한 표지의 혼성화가 가교(110)의 길이를 따라 완전한 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하도록 한다. 표지의 각각의 올리고뉴클레오티드 서열은 갭 영역(113) 내 중합체 사슬(111)의 서열과 상이하게 혼성화될 수 있다. 예를 들어, 표지(131)의 제1 및 제2 신호 단량체(171, 172)는 서로 동일하거나 상이한 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 표지의 제1 및 제2 신호 단량체는 다른 표지의 제1 및 제2 신호 단량체와 서열 또는 유형, 또는 둘 모두가 상이한 뉴클레오티드일 수 있으므로, 각 표지(131, 132, 133, 및 134)는 고유한 서열의 제1 및 신호 단량체를 가진다. 각 표지에 대한 제1 및 제2 신호 단량체와 제1 및 제2 범용 염기(114, 115) 사이의 각각의 혼성화는 가교(110)를 통해 특정한 전기 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 표지(131)는 제1 및 제2 범용 염기(114, 115)와 혼성화하는 특정한 염기 쌍을 갖는 서열을 가져서 가교(110)의 전기 전도도 또는 임피던스를 제1 레벨로 변조할 수 있다; 표지(132)는 제1 및 제2 범용 염기(114, 115)와 혼성화하는 특정한 염기 쌍을 갖는 서열을 가져서 가교(110)의 전기 전도도 또는 임피던스를 제1 레벨(제2 레벨과는 상이함)로 변조할 수 있다; 표지(133)는 제1 및 제2 범용 염기(114, 115)와 혼성화하는 특정한 염기 쌍을 갖는 서열을 가져서 가교(110)의 전기 전도도 또는 임피던스를 제3 레벨(제1 레벨 및 제2 레벨과는 상이함)로 변조할 수 있다; 그리고 표지(134)는 제1 및 제2 범용 염기(114, 115)와 혼성화하는 특정한 염기 쌍을 갖는 서열을 가져서 가교(110)의 전기 전도도 또는 임피던스를 제4 레벨(제1, 제2 및 레벨과는 상이함)로 변조할 수 있다; 상이한 신호를 제공하는 상이한 표지에 대한 제1 및 제2 신호 단량체의 차이에 더하여, 이들 표지의 다른 단량체는 가교(110)를 통해 전기 신호를 변조하는 방식이 서로 상이할 수 있음을 주목한다. 일례로서, 이러한 단량체는 혼성화 특이성을 변화시키지 않지만 전기적 특성을 변화시킬 수 있는 메틸화와 같은 하나 이상의 염기 변형을 포함할 수 있다.
특히, 제1 및 제2 범용 염기(114, 115)는 표지가 갭 영역(113)에 혼성화될 때 다른 유형의 핵염기보다 가교(110)에 표지가 혼성화될 때 전도도 향상 뿐 아니라 전기 신호의 더 큰 변조를 제공할 것으로 예상될 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 중합체 사슬(111, 112)이 각각 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 표지(131, 132, 133, 134)가 각각 올리고뉴클레오티드를 포함하는 예시적인 구성에서, 표지 내의 뉴클레오티드는 제1 중합체 사슬(111)의 갭 영역(113) 내 핵염기와 각각 혼성화된다. 표지(131, 132, 133 및 134)는 서로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하여, 가교(110)를 통해 서로 상이한 전기 전도도 또는 임피던스를 제공하고, 이에 기반하여 표지가 결합되는 상응하는 뉴클레오티드가 검출 회로(160)를 사용하여 식별될 수 있다. 그러나, 표지 서열은 서로 상이하고 갭 영역(113)의 서열은 동일하게 유지되기 때문에, 표지 서열의 모든 뉴클레오티드가 갭 영역 내 모든 뉴클레오티드에 대해 상보적일 필요는 없다. 일부 실시예에서, 갭 영역(113)에 대한 표지의 혼성화가 가교(110)의 길이를 따라 완전한 이중 가닥 중합체를 제공하여 잠재적으로 더 낮은 전체 전류 및 상이한 전기 신호를 서로 구분하는 것의 어려움을 초래하는 경우에도 염기쌍 간의 임의의 불일치는 가교(110)를 통해 흐르는 전류를 상당히 감소시킬 수 있다. 범용 염기(114, 115)는 표지 내 2개 이상의 뉴클레오티드와 혼성화될 수 있고, 일부 실시예에서, 표지 내 모든 뉴클레오티드와 혼성화될 수 있기 때문에, 표지 내 뉴클레오티드와 갭 영역(113) 내 뉴클레오티드 간 미스매치의 발생을 감소시키거나 회피할 수 있음으로서, 표지(131, 132, 133, 및 134) 중 상이한 하나가 갭 영역에 혼성화되는 것에 반응하는 가교(110)를 통한 상이한 (그리고 구별가능한) 전기 신호를 여전히 허용하면서 가교(110)를 통해 유동하는 전류를 증가킨다. 하나의 비제한적인 예시에서, 제1 및 제2 범용 염기(114, 115)는 이노신, 니트로인돌, 니트로피롤, 벤즈이미다졸, 5-플루오로인돌, 인돌 뉴클레오시드 유도체, 및 이소카르보시리늄 뉴클레오시드 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
그러나, 제1 및 제2 범용 염기(114, 115)와 표지(131, 132, 133, 및 134) 내의 상응하는 염기 사이의 혼성화의 강도는, 그 자체로, 이들 표지를 검출 회로(160)가 전기 신호에서 결과적인 변조를 신뢰성 있게 검출하기에 충분한 시간 동안 유지하기에 충분히 강하지 않을 수 있다. 선택적인 안정화 영역(116)은 표지(131, 132, 133, 및 134)의 갭 영역(113)에 대한 각각의 혼성화를 안정화시키는 것을 도울 수 있다. 예를 들어, 표지의 안정화 상보성 영역은 안정화 영역(116)에 상대적으로 강하게 혼성화될 수 있어서, 검출 회로(160)가 전기 신호에서 결과적인 변조를 신뢰성 있게 검출하기에 충분한 시간 동안 갭 영역(113)에 대한 표지의 혼성화를 유지한다. 안정화 영역(116)의 길이(예를 들어, 안정화 영역(116)을 제공하는 단량체 단위의 수)는 표지와 갭 영역(113) 사이에 충분한 강도의 혼성화를 제공하도록 선택될 수 있으며, 이때 표지는 갭 영역(113)에 혼성화된 상태로 유지될 수 있는 한편, 중합효소(105)는 상응하는 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 첨가하고, 그 후에 갭 영역(113)으로부터 탈혼성화되어, 그 후 서열 내의 다음 뉴클레오티드의 표지가 갭 영역에 혼성화될 수 있다. 제1 및 제2 중합체 사슬이 올리고뉴클레오티드를 포함하는 실시예에서, 안정화는 추가적으로 또는 대안적으로 제2 중합체 사슬의 3' 뉴클레오티드(도 1a에서, 화살표(112)가 가리키는 뉴클레오티드)와 표지의 5' 뉴클레오티드 사이의 염기 적층에 의해 제공될 수 있다. 도 1a에서 화살표(117)가 가리키는 뉴클레오티드로 표지의 3'말단이 적층되도록 갭이 제2 중합체 사슬의 중간에 있는 경우, 추가적인 안정성이 제공될 수 있다.
갭 영역(113)은 임의의 적합한 조합, 순서 및 유형의 단량체 단위(예를 들어, 뉴클레오티드)를 포함할 수 있어서, 표지와 갭 영역 사이의 혼성화를 충분히 안정화하면서, 상이한 표지로부터 전기 신호가 검출되고 서로 구별될 수 있도록 한다. 예를 들어, 갭 영역은 임의의 적합한 수의 범용 단량체(예를 들어, 범용 염기), 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 4개 초과의 범용 단량체를 포함할 수 있다. 범용 단량체는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 서로 인접하게 위치할 수 있다. 예를 들어, 범용 단량체는 범용이 아닌 하나 이상의 단량체에 의해 서로 이격될 수 있다. 일부 실시예에서 갭 영역은 또한 표지와 범용 단량체 사이의 혼성화를 충분히 안정화시키는 임의의 적합한 수의 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 갭 영역은 임의의 적합한 수의 안정화 단량체(예를 들어, 뉴클레오티드), 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 초과의 안정화 단량체를 포함할 수 있다. 안정화 단량체는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 서로 인접하게 위치할 수 있다. 예를 들어, 안정화 단량체는 하나 이상의 범용 단량체에 의해 서로 이격될 수 있다. 일부 실시예에서, 갭 영역에서의 서열은 AT-풍부 영역과 비교하여 안정성을 향상시키는 상대적으로 GC-풍부 영역을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 선택적 안정화 영역은, PNA, LNA, 2,6-디아미노퓨린(2-아미노-dA), 또는 5-하이드록시부티늘-2'-데옥시유리딘과 같은 안정성을 증가시키는 것으로 알려진 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
유사하게, 표지(131, 132, 133, 및 134)는 각각 표지와 갭 영역(113) 사이의 혼성화를 충분히 안정화시키면서 상이한 표지로부터의 전기 신호가 서로 검출되고 구별되도록 하는 임의의 적합한 조합, 순서 및 유형의 단량체 단위(예를 들어, 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표지는 갭 영역의 범용 단량체(예를 들어, 범용 염기)와 각각 혼성화할 수 있는 임의의 적합한 수의 단량체, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 4개 초과의 범용 단량체를 포함할 수 있다. 이러한 단량체는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 서로 인접하게 위치할 수 있다. 예를 들어, 이러한 단량체는 범용 단량체와 혼성화하지 않을 수 있는 하나 이상의 단량체에 의해 서로 이격될 수 있다. 일부 실시예에서 표지는 또한 표지와 범용 단량체 사이의 혼성화를 충분히 안정화시키는 임의의 적합한 수의 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표지는 임의의 적합한 수의 안정화 상보성 단량체(예를 들어, 뉴클레오티드), 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 초과의 안정화 상보성 단량체를 포함할 수 있다. 안정화 상보성 단량체는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 서로 인접하게 위치할 수 있다. 예를 들어, 안정화 상보성 단량체는 범용 단량체와 각각 혼성화할 수 있는 하나 이상의 단량체에 의해 서로 이격될 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 표지 내의 단량체 단위(예를 들어, 뉴클레오티드)의 수는 갭 영역(113) 내 단량체 단위의 수와 동일하거나 대략 동일하다.
예시적으로, 도 8a 내지 도 8d는 범용 단량체 및 선택적인 안정화 영역을 포함하는 갭 영역을 갖는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 포함하는 서열분석을 위한 추가의 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다. 도 8a 내지 도 8d는 상이한 예시적인 갭 영역(113) 내 제1 중합체 사슬(111)에 혼성화된 상이한 예시적인 표지(131)를 포함하는 가교(110)를 도시한다; 단순화를 위해, 전극(102 및 103), 폴리뉴클레오티드(121), 링커(137), 중합효소(105) 및 조성물(100)의 다른 성분은 도면에 도시되지 않지만, 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 도 8a에 도시된 비제한적인 예시에서, 갭 영역(113)은 단일 범용 단량체(114)를 포함할 수 있고, 표지(131)는 단일 신호 단량체(171)를 포함할 수 있고, 안정화 영역(116) 및 안정화 상보성 영역(173)은 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다. 도 8b에 도시된 비제한적인 예시에서, 갭 영역(113)은, 예를 들어, 임의의 적합한 길이의 안정화 영역(116)에 의해 서로 분리되는, 서로 이격되어 위치한 2개 이상의 범용 단량체(114, 115)를 포함할 수 있고; 표지(131)는, 예를 들어, 임의의 적합한 길이의 안정화 상보성 영역(173)에 의해 서로 분리되는, 서로 이격되어 위치한 2개 이상의 신호 단량체(171, 172)를 포함할 수 있다. 도 8c에 도시된 비제한적인 예시에서, 갭 영역(113)은, 예를 들어, 안정화 영역(116)을 각각이 임의의 적합한 길이인 2개 이상의 부분으로 분리하는, 갭 영역의 단부 이외의 위치에서 서로 다음에 위치하는 2개 이상의 범용 단량체(114, 115)를 포함할 수 있고; 표지(131)는, 예를 들어, 안정화 상보성 영역(173)을 각각이 임의의 적합한 길이인 2개 이상의 부분으로 분리하는, 표지의 단부 이외의 위치에서 서로 다음에 위치하는 2개 이상의 신호 단량체(171, 172)를 포함할 수 있다. 도 8d에 도시된 비제한적인 예시에서, 갭 영역(113)은, 예를 들어, 안정화 영역(116)을 각각이 임의의 적합한 길이인 3개 이상의 부분으로 분리하는, 갭 영역의 단부 이외의 각각의 위치에서 서로 이격되어 위치하는 2개 이상의 범용 단량체(114, 115)를 포함할 수 있고; 표지(131)는, 예를 들어, 안정화 상보성 영역(116)을 각각이 임의의 적합한 길이인 3개 이상의 부분으로 분리하는, 표지의 단부 이외의 각각의 위치에서 서로 이격되어 위치하는 2개 이상의 신호 단량체(171, 172)를 포함할 수 있다. 각각의 범용 단량체, 신호 단량체, 안정화 영역의 부분, 및 안정화 상보성 영역의 부분의 위치의 다른 조합이 쉽게 구상될 수 있고, 본 개시내용에 포함된다.
도 2는 범용 단량체 및 선택적인 안정화 영역을 포함하는 갭 영역을 갖는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 포함하는 서열분석을 위한 다른 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다. 도 2에 도시된 예시에서, 조성물(200)은 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된 조성물(100)과 유사하게 구성될 수 있고, 예를 들어, 기판(201), 제1 전극(202), 제2 전극(203), 중합효소(205), 제1 중합체 사슬(211) 및 제2 중합체 사슬(212)을 포함하는 가교(210), 및 표지(231)에 결합된 뉴클레오티드(221)를 포함할 수 있다. 조성물(200)은 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된 바와 같은 다른 구성요소를 포함할 수 있으며, 여기에서 생략된다.
도 2에 도시된 예시에서, 제2 중합체 사슬(212)은 제1 중합체 사슬(211)의 갭 영역(213)이 제2 중합체 사슬(212)과 혼성화되지 않도록 제1 중합체 사슬(211)의 길이보다 짧은 길이를 가질 수 있다. 갭 영역(213)은 임의의 적합한 수의 범용 단량체, 예를 들어, 제1 및 제2 범용 단량체(214, 215), 및 예를 들어 도 2에 예시된 바와 같은 4개의 단량체 단위를 갖는 임의의 적합한 크기의 선택적 안정화 영역(216)을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드(221)의 표지(231)는 갭 영역(213)의 범용 단량체(214, 215)와 각각 혼성화되는 제1 및 제2 신호 단량체(271, 272), 및 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된 것과 유사한 방식으로 안정화 영역(216)과 혼성화되는 선택적인 안정화 상보성 영역(273)을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 갭 영역(213)은 도 1a 및 도 1b에 도시된 예시에 도시된 바와 같이 제1 중합체 사슬 내의 내부 위치와 반대인 제1 중합체 사슬(211)의 말단 단부에 위치할 수 있다. 갭 영역(213)의 이러한 말단 단부 위치는 갭 영역(213)과 표지(231) 사이의 혼성화 강도를 감소시킬 수 있으며, 이는 중합효소(205)가 성장하는 폴리뉴클레오티드 서열에 뉴클레오티드(221)를 첨가하는 것을 완료할 때 갭 영역(213)으로부터 표지(231)의 탈혼성화를 촉진할 수 있어, 서열에서 다음 뉴클레오티드의 표지가 갭 영역에 혼성화될 수 있다. 예를 들어, 표지(231)가 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제1 및 제2 중합체 사슬(210, 211)이 각각 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구성에서, 갭 영역(213)의 말단 단부 위치는 2개가 아닌 단일 염기-적층 말단만을 제공할 수 있으므로, 갭 영역(213)으로부터 표지(231)의 오프 속도를 증가시킬 수 있다. 도 1a 및 도 1b 및 도 8a 내지 도 8d를 참조하여 설명된 바와 같은 갭 영역과 표지의 예시적인 구성들이 도 2를 참조하여 설명된 예시에서 유사하게 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
전극들 사이의 가교 내에 그리고 뉴클레오티드에 결합된 표지 내에 포함된 중합체는 본원에 예시된 바와 같은 임의의 적합한 물질을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 이들 중합체는 각각 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 도 3a 및 도 3b는 범용 염기 및 안정화 영역을 포함하는 갭 영역을 갖는 부분 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 가교를 포함하는 서열분석을 위한 예시적인 조성물(300)을 개략적으로 도시한다. 도 3a에 도시된 예시에서, 조성물(300)은 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된 조성물(100) 또는 도 2를 참조하여 설명된 조성물(200)과 유사하게 구성될 수 있으며, 예를 들어 제1 전극(302), 제2 전극(303), 중합효소(305), 제3 폴리뉴클레오티드 사슬(311) 및 제4 폴리뉴클레오티드 사슬(312)을 포함하는 가교(310), 및 올리고뉴클레오티드 표지(331)에 결합된 뉴클레오티드 사슬(321)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 사슬과 전극 사이의 예시적인 결합은 삼각형으로 표시된다. 일부 실시예에서, 중합효소(305)는 단단할 수 있는 링커(306)를 통해 제3 폴리뉴클레오티드 사슬(311)에 결합될 수 있고, 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(350)의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드(340)에 뉴클레오티드(321)와 같은 뉴클레오티드를 첨가할 수 있다. 조성물(300)은, 여기에서 생략된, 도 1a 및 도 1b 및 도 2를 참조하여 설명된 바와 같은 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 도 3a에 예시된 특정 뉴클레오티드 서열은 순수하게 예시이며 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다.
도 3a에 도시된 예시에서, 제4 폴리뉴클레오티드 사슬(312)은 제3 폴리뉴클레오티드 사슬(311)의 갭 영역(313)이 제4 폴리뉴클레오티드 사슬(312)에 혼성화되지 않도록, 제3 폴리뉴클레오티드 사슬(311)의 길이보다 짧은 길이를 가질 수 있다. 갭 영역(313)은, 도 3a에 예시된 바와 같이, 임의의 적합한 수의 범용 염기(예시적으로, 이노신(I)), 예를 들어, 제1 및 제2 범용 염기(314, 315) 및 임의의 적합한 크기의 안정화 영역(316)(예를 들어, 4개의 뉴클레오티드 단위를 가짐, 예시적으로, AAAA)을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드(321)의 표지(331)는 갭 영역(313)의 범용 단량체(314, 315)와 각각 혼성화하는 제1 및 제2 신호 뉴클레오티드(371, 372) 및 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된 것과 유사한 방식으로 안정화 영역(316)과 혼성화하는 안정화 상보성 영역(373)(예시적으로, TTTT)을 포함할 수 있다. 제1 및 제2 신호 뉴클레오티드(371, 372)는 도 3a에서 NN으로 표시되어, 이들이 도 3b에 예시된 임의의 뉴클레오티드 쌍과 같은 임의의 적합한 유형 및 서열의 뉴클레오티드를 포함할 수 있음을 나타낸다. 상이한 표지들은 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된 바와 같은 방식으로 가교(310)를 통해 서로 구별 가능한 각각의 전기 신호들을 제공하도록 선택된 이러한 뉴클레오티드 쌍 중 상이한 뉴클레오티드 쌍을 가질 수 있다. 도 1a 및 도 1b 및 도 8a 내지 도 8d를 참조하여 설명된 바와 같은 갭 영역과 표지의 예시적인 구성들이 도 3a 및 도 3b를 참조하여 설명된 예시에서 유사하게 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
도 1a 및 도 1b, 도 2, 도 3a 및 도 3b, 및 도 8a 및 도 8b를 참조하여 설명된 바와 같은 조성물은 서열분석을 위한 임의의 적합한 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 4는 범용 단량체 및 선택적 안정화 영역을 포함하는 갭 영역을 갖는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 사용하여 서열분석하기 위한 방법(400)에서의 작업의 예시적인 흐름을 예시한다. 방법(400)은 중합효소에 의해, 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드에, 뉴클레오티드를 첨가하는 단계(작업(410))를 포함한다. 예를 들어, 도 1a 및 도 1b를 참조하여 기술된 중합효소(105)는 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(150)의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 뉴클레오티드(121, 122, 123 및 124) 각각을 첨가할 수 있다. 또는, 예를 들어, 도 2를 참조하여 기술된 중합효소(205)는 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드(221) 및 다른 뉴클레오티드를 첨가할 수 있다(다른 뉴클레오티드 및 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 구체적으로 도시되지 않음). 또는, 예를 들어, 도 3a 및 도 3b를 참조하여 기술된 중합효소(305)는 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(350)의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드(340)에 뉴클레오티드(321) 및 다른 뉴클레오티드를 첨가할 수 있다(다른 뉴클레오티드는 구체적으로 도시되지 않음).
도 4에 도시된 방법(400)은 뉴클레오티드에 결합된 표지를 제1 및 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 가교의 제1 중합체 사슬의 갭 영역에 혼성화시키는 단계(작업(420))를 포함할 수 있으며, 갭 영역은 제1 및 제2 범용 단량체를 포함한다. 예를 들어, 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된 표지(131, 132, 133, 134)는 뉴클레오티드(121, 122, 123, 및 124)에 각각 결합될 수 있다. 중합효소(105)가 이러한 뉴클레오티드를 각각 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 첨가하기 때문에, 이러한 뉴클레오티드에 결합된 표지는 제1 전극(102) 및 제2 전극(103) 사이의 공간에 걸쳐 있는 제1 중합체 사슬(111)의 갭 영역(113)에 각각 혼성화될 수 있다. 갭 영역(113)은 제1 및 제2 범용 단량체(114, 115)를 포함할 수 있고, 일부 실시예에서 또한 안정화 영역(116)도 포함한다. 또는, 예를 들어, 도 2를 참조하여 설명된 표지(231)는 뉴클레오티드(221)에 결합될 수 있고, 다른 표지가 다른 뉴클레오티드에 결합될 수 있다(다른 표지 및 다른 뉴클레오티드는 구체적으로 도시되지 않음) . 중합효소(205)가 이러한 뉴클레오티드를 각각 제1 폴리뉴클레오티드에 첨가하기 때문에, 이들 뉴클레오티드에 결합된 표지는 제1 전극(202) 및 제2 전극(203) 사이의 공간에 걸쳐 있는 제1 중합체 사슬(211)의 갭 영역(213)에 각각 혼성화될 수 있다. 갭 영역(213)은 제1 및 제2 범용 단량체(214, 215)를 포함할 수 있고, 일부 실시예에서 또한 안정화 영역(216)을 포함한다. 또는, 예를 들어, 도 3a 및 도 3b를 참조하여 설명된 표지(331)는 뉴클레오티드(221)에 결합될 수 있고, 다른 표지는 다른 뉴클레오티드에 결합될 수 있다(다른 표지 및 다른 뉴클레오티드는 구체적으로 도시되지 않음). 중합효소(305)가 이러한 뉴클레오티드를 각각 제1 폴리뉴클레오티드(340)에 첨가하기 때문에, 이러한 뉴클레오티드에 결합된 표지는 제1 전극(302) 및 제2 전극(303) 사이의 공간에 걸쳐 있는 제3 중합체 사슬(311)의 갭 영역(313)에 각각 혼성화될 수 있다. 갭 영역(313)은 제1 및 제2 범용 염기(314, 315)를 포함할 수 있고, 일부 실시예에서 안정화 영역(316)을 포함한다. 또는, 예를 들어, 도 8a 내지 도 8d를 참조하여 설명된 표지(131)는 뉴클레오티드에 결합될 수 있고, 다른 표지는 다른 뉴클레오티드에 결합될 수 있다(다른 표지 및 뉴클레오티드는 구체적으로 도시되지 않음). 중합효소(105)가 이러한 뉴클레오티드를 각각 제1 폴리뉴클레오티드(140)에 첨가하기 때문에, 이러한 뉴클레오티드에 결합된 표지는 제1 전극(102) 및 제2 전극(103) 사이의 공간에 걸쳐 있는 폴리뉴클레오티드 사슬(111)의 갭 영역(113)에 각각 혼성화될 수 있다. 갭 영역(113)은 임의의 적합한 수의 범용 단량체를 포함할 수 있고, 일부 실시예에서 안정화 영역(116)을 포함한다. 안정화 영역의 범용 단량체(들) 및 부분(들)은 각각 갭 영역(113) 내 임의의 적합한 위치에 배열될 수 있다. 표지(131)는 임의의 적합한 수의 신호 단량체를 포함할 수 있고, 일부 실시예에서 안정화 상보성 영역(173)을 포함한다. 안정화 상보성 영역의 신호 단량체(들) 및 부분(들)은 각각 표지(131) 내 임의의 적합한 위치에 배열될 수 있다.
다시 도 4를 참조하면, 일부 실시예에서 방법(400)은 제공된다면 안정화 영역에 의해 제1 및 제2 범용 단량체에 대한 각각의 표지의 혼성화를 안정화하는 단계(작업(430))를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된 표지(131, 132, 133, 134)는 갭 영역(113)의 범용 단량체(114, 115)와 각각 혼성화되는 제1 및 제2 신호 단량체(예를 들어, 표지(131)의 신호 단량체(171, 172))를 포함할 수 있고, 또한, 갭 영역(113)의 안정화 영역(116)과 혼성화되어 제1 및 제2 범용 단량체와의 혼성화를 안정화시키는 안정화 상보성 영역(예를 들어, 표지(131)의 안정화 상보성 영역(173))을 포함할 수 있다. 또는, 예를 들어, 도 2를 참조하여 설명된 표지(231)(및 다른 유사한 표지)는 갭 영역(213)의 범용 단량체(214, 215)와 각각 혼성화되는 제1 및 제2 신호 단량체(271, 272)(또는 다른 유사한 신호 단량체)를 포함할 수 있고, 또한, 갭 영역(213)의 안정화 영역(216)과 혼성화되어 제1 및 제2 범용 단량체와의 혼성화를 안정화시키는 안정화 상보성 영역(273)(또는 다른 유사한 안정화 상보성 영역)을 포함할 수 있다. 또는, 예를 들어, 도 3a 및 도 3b를 참조하여 설명된 표지(331)(및 다른 유사한 표지)는 갭 영역(313)의 범용 염기(314, 315)와 각각 혼성화되는 제1 및 제2 신호 뉴클레오티드(371, 372)(또는 다른 유사한 신호 뉴클레오티드)를 포함할 수 있고, 또한, 갭 영역(313)의 안정화 영역(316)과 혼성화되어 제1 및 제2 범용 염기와의 혼성화를 안정화시키는 안정화 상보성 영역(373)(또는 다른 유사한 안정화 상보성 영역)을 포함할 수 있다. 또는, 예를 들어, 도 8a 내지 도 8d를 참조하여 설명된 표지(131)(및 다른 유사한 표지)는 갭 영역(113)의 범용 단량체(들)과 각각 혼성화되는 임의의 적합한 수 및 배열의 신호 단량체(들)를 포함할 수 있고, 또한 안정화 영역(116)의 부분(들)과 각각 혼성화되는 임의의 적합한 수 및 배열의 안정화 상보성 영역(173)의 부분(들)을 포함할 수 있다.
다시 도 4을 참조하면, 방법(400)은 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지와 범용 단량체 사이의 각각의 혼성화에 반응하는 가교를 통한 적어도 전기적 신호의 변화를 사용하여 중합효소가 제1 폴리폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가한 서열을 검출하는 단계(작업(440))를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된 검출 회로(160)는 표지(131, 132, 133, 및 134)와 갭 영역(113) 사이, 특히 제1 및 제2 신호 단량체(171, 172)와 제1 및 제2 범용 단량체(114, 115) 사이의 각각의 혼성화에 반응한 가교(110)를 통한 전류 또는 전압의 변화를 검출할 수 있다. 유사한 검출 회로(구체적으로 도시되지 않음)는, 도 2에 예시된, 표지(231)(및 다른 유사한 표지)와 갭 영역(213) 사이, 특히 제1 및 제2 신호 단량체(271, 272)(및 다른 유사한 신호 단량체)와 제1 및 제2 범용 단량체(214, 215) 사이의 각각의 혼성화에 반응한 가교(210)를 통한 전류 또는 전압의 변화를 검출할 수 있다. 유사한 검출 회로(구체적으로 도시되지 않음)는, 도 3a 및 3b에 예시된, 표지(331)(및 다른 유사한 표지)와 갭 영역(313) 사이, 특히 제1 및 제2 신호 뉴클레오티드(371, 372)(및 다른 유사한 신호 뉴클레오티드)와 제1 및 제2 범용 염기(314, 315) 사이의 각각의 혼성화에 반응한 가교(310)를 통한 전류 또는 전압의 변화를 검출할 수 있다. 유사한 검출 회로(구체적으로 도시되지 않음)는, 도 8a 내지 8d에 예시된, 표지(131)(및 다른 유사한 표지)와 갭 영역(113) 사이, 특히 신호 단량체(들)와 각각의 범용 단량체(들) 사이의 각각의 혼성화에 반응한 가교(110)를 통한 전류 또는 전압의 변화를 검출할 수 있다.
전자적 서열분석을 위한 부분 이중 가닥 가교의 사용은 도 1a 및 도 1b, 도 2, 도 3a 및 도 3b, 도 4, 및 도 8a 내지 도 8d를 참조하여 설명된 특정 예들로 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 도 5a 및 도 5b는 하나의 단일 가닥 영역에 부착된 중합효소를 갖는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 포함하는 서열분석을 위한 예시적인 조성물(500)을 개략적으로 도시한다. 도 5a 및 도 5b에 도시된 조성물(500)은 기판(501), 제1 전극(502), 제2 전극(503), 중합효소(504), 가교(510), 뉴클레오티드(521, 522, 523, 및 524), 및 이러한 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지(531, 532, 533, 및 534), 제1 폴리뉴클레오티드(540), 제2 폴리뉴클레오티드(550) 및 검출 회로(560)를 포함한다. 도 5a 및 도 5b에 도시된 예시에서, 조성물(500)의 구성요소는 뉴클레오티드(521, 522, 523, 524)(연결된 표지를 가짐), 폴리뉴클레오티드(540, 550), 및 적합한 시약이 담길 수 있는, 유체(520)가 충전된 (예를 들어, 벽(561, 562, 562)을 갖는) 플로우 셀 내에 둘러싸일 수 있다.
기판(501)은 제1 전극(502) 및 제2 전극(503)을 지지할 수 있다. 제1 전극(502) 및 제2 전극(503)은, 도 5a에 도시된 바와 같이, 공간, 예를 들어, 길이 L의 공간에 의해 서로 분리될 수 있다. 가교(510)는 제1 전극(502)과 제2 전극(503) 사이의 공간에 걸쳐 있을 수 있고, 제1 중합체 사슬(511) 및 제2 중합체 사슬(512) 각각의 중합체 사슬 내의 원은 중합체 사슬의 길이를 따라 서로 결합하는 단량체 단위를 제안하는 것으로 의도됨)을 포함할 수 있다. 제1 및 제2 중합체 사슬(511, 512) 각각은 제1 및 제2 중합체 사슬이 서로 혼성화되지 않은 제1 영역(518), 및 제1 및 제2 중합체 사슬이 서로 혼성화되는 제2 영역(519)을 갖는다.
제1 중합체 사슬(511) 및 제2 중합체 사슬(512)은 각각의 중합체 사슬 내의 단량체 단위의 서열이 서로 상이할 수 있지만, 서로 동일한 유형의 중합체를 포함할 수 있다. 도 5a에 도시된 비제한적인 예에서, 제1 중합체 사슬(511)은 제1 길이를 갖고, 제2 중합체 사슬(512)은 제1 길이와 대략 동일할 수 있는 제2 길이를 갖는다. 예를 들어, 제1 중합체 사슬(511) 및 제2 중합체 사슬(512) 각각은 제1 전극(502) 및 제2 전극(503) 사이의 공간의 길이 L과 대략적으로 동일한 길이를 가질 수 있으며, 예를 들어, 제1 중합체 클레임(511) 및 제2 중합체 사슬(512) 각각이, 일부 실시예에서, 제1 전극(502) 및 제2 전극(503) 각각에 (예를 들어, 각각의 공유 결합을 통해) 직접 부착될 수 있다. 일부 구성에서, 제1 중합체 사슬(511) 및 제2 중합체 사슬(512) 중 어느 하나도 반드시 제1 전극(502) 또는 제2 전극(503) 중 하나 또는 둘 모두에 직접 부착되는 것은 아니다라는 것이 이해되어야 한다. 대신에, 제1 중합체 사슬(511) 및 제2 중합체 사슬(512) 중 어느 하나 또는 둘 모두는 제1 전극(502) 및 제2 전극(503) 중 하나 또는 둘 모두에 직접적으로 또는 간접적으로 각각 부착되는 하나 이상의 다른 구조체에 직접 부착될 수 있다.
도 5b를 참조하여 아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 표지(531, 532, 533, 및 534)는 가교(510)의 전기 전도도 또는 임피던스를 변조하는 방식으로 제1 영역(518)의 제1 중합체 사슬(511)에 혼성화될 수 있는데, 이러한 변조에 기초하여 상응하는 뉴클레오티드(521, 522, 523, 및 524)의 식별이 결정될 수 있다. 도 5a에 예시된 비제한적인 구성에서, 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)은, 일부 실시예에서, 제1 범용 단량체(514) 및 제2 범용 단량체(515)를 포함할 수 있다. 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)의 나머지는 임의의 적합한 단량체의 서열을 포함할 수 있다. 도 5b를 참조하여 아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같은 방식으로, 제1 범용 단량체(514) 및 제2 범용 단량체(515)는 가교(510)의 전기 전도도 또는 임피던스를 향상시킬 수 있고, 일부 실시예에서, 표지(531, 532, 533, 및 534)가 각각 제1 중합체(511)에 혼성화될 때, 이러한 전기 전도도 또는 임피던스의 변조가, 또한, 이러한 표지에 각각 부착된 뉴클레오티드(521, 522, 523 및 524)를 식별하는 속도 또는 신뢰성을 향상시킬 수 있다.
도 5a에 예시된 조성물(500)은 상응하는 표지, 예를 들어, 1개 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 3개 이상의 뉴클레오티드, 4개의 뉴클레오티드, 또는 5개 이상의 뉴클레오티드에 결합된 임의의 적합한 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드(521)(예시적으로, G)는, 일부 실시예에서, 링커(535)를 통해 상응하는 표지(531)에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(522)(예시적으로, T)는 일부 실시예에서 링커(536)를 통해 상응하는 표지(532)에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(523)(예시적으로, A)는 일부 실시예에서 링커(536)를 통해 상응하는 표지(533)에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(524)(예시적으로, C)는, 일부 실시예에서, 링커(537)를 통해 상응하는 표지(534)에 결합될 수 있다. 일부 실시예에서, 표지과 동일하거나 상이한 중합체를 포함할 수 있는 링커를 통한 뉴클레오티드와 표지 사이의 결합은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 표지(531, 532, 533, 및 534)는 서로 동일한 유형의 중합체를 포함할 수 있지만, 적어도 하나의 관점에서 서로 상이할 수 있으며, 예를 들어, 서로 상이한 서열의 단량체 단위를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 표지(531, 532, 533, 및 534)는 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에서와 동일한 유형의 중합체를 포함할 수 있고, 추가적인 선택사항은 중합체 사슬(511)의 나머지 부분에서와 동일한 유형의 중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 5a에서, 각각의 표지(531, 532, 533, 및 534) 내의 원은 표지 내의 중합체의 단량체 단위가 중합체 사슬(511 및 512)에 포함된 단량체와 유사함을 시사하도록 의도된다. 도 5b를 참조하여 더 상세히 설명되는 바와 같은 방식으로, 각각의 표지(531, 532, 533, 및 534) 내의 단량체 단위의 서열은 이러한 표지가 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 혼성화될 때 가교(510)를 통한 구별 가능한 전기 신호의 생성을 촉진하도록 각각 선택될 수 있다.
도 5a에 예시된 조성물(500)은 제1 폴리뉴클레오티드(540) 및 제2 폴리뉴클레오티드(550)를 포함한다. 중합효소(505)는, 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된 것과 유사한 방식으로, 제2 중합체 사슬(512)의 제1 영역(518)에, 예를 들어, 링커(506)를 통해 결합될 수 있고, 복수의 뉴클레오티드(521, 522, 523, 및 524)의 뉴클레오티드를 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(550)의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 첨가할 수 있다. 이들 뉴클레오티드에 상응하는 표지(531, 532, 533, 및 534)는, 각각 도 5b를 참조하여 아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같은 방식으로 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 혼성화될 수 있다. 검출 회로(560)는 가교(510)을 통한 전류 또는 전압과 같은 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 중합효소(505)가 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 뉴클레오티드(521, 522, 523 및 524)를 각각 첨가한 서열(반드시 이러한 순서는 아님)을 검출할 수 있으며, 이러한 변화는 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)과 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지(531, 532, 533, 및 534) 사이의 혼성화에 반응하는 것이다. 예를 들어, 검출 회로(560)는 제1 전극(502) 및 제2 전극(503)에 걸쳐 전압을 인가할 수 있고, 이러한 전압에 반응하여 가교(510)를 통해 흐르는 임의의 전류를 검출할 수 있다. 또는, 예를 들어, 검출 회로(560)는 가교(510)를 통해 일정한 전류를 유동시키고, 제1 전극(502)과 제2 전극(503) 간의 전압 차이를 검출할 수 있다. 도 5a에 예시된 특정 시간에, 표지(531, 532, 533, 및 534) 중 어느 것도 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 혼성화되지 않고, 따라서 비교적 낮은 전류(또는 전류 없음)가 가교(510)를 통해 흐를 수 있다. 뉴클레오티드(521, 522, 523, 524)는 유체(520)를 통해 자유롭게 확산될 수 있고, 이러한 확산의 결과로서 각각의 표지(531, 532, 533, 534)는 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 간략하게 혼성화될 수 있지만, 표지가 빠르게 탈혼성화될 수 있어서, 가교(510)의 전기 전도도 또는 임피던스에 대한 임의의 결과적인 변화는 너무 짧아서 검출될 수 없거나 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 대한 뉴클레오티드의 첨가에 상응하지 않는 것으로 명확하게 식별될 수 있는 것으로 예상된다.
비교하면, 도 5b는 중합효소(505)가 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(550)의 서열(예를 들어, 해당 서열에서 C에 상보적임)을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 뉴클레오티드(521)(예시적으로, G)를 첨가하는 시간을 예시한다. 중합효소(505)는 표지(531)가 (일부 실시예에서 링커(537)를 통해) 부착되는 뉴클레오티드(521)에 작용하기 때문에, 이러한 작용은 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 첨가된 뉴클레오티드(521)의 식별을 허용하는 검출 회로(560)에 의해 검출될 수 있는 가교(510)을 통한 전기 전도도 또는 임피던스에서의 충분히 긴 변화를 야기하기에 충분한 시간 동안 제1 영역과의 혼성화를 유지하도록 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 충분히 가까운 위치에 표지(531)를 유지한다. 또한, 표지(531)는 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 혼성화될 때, 가교(510)에 전기 전도도 또는 임피던스를 부여하는 성질을 가질 수 있어서, 이를 통해 검출 회로(560)가 다른 뉴클레오티드 중 하나와 비교하여 첨가된 뉴클레오티드(521)(예시적으로, G)로서 고유하게 식별할 수 있다. 유사하게, 표지(532)는 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 혼성화될 때, 가교(510)에 전기 전도도 또는 임피던스를 부여하는 성질을 가질 수 있어서, 이를 통해 검출 회로(560)가 다른 뉴클레오티드 중 하나와 비교하여 첨가된 뉴클레오티드(522)(예시적으로, T)로서 고유하게 식별할 수 있다. 유사하게, 표지(533)는 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 혼성화될 때, 가교(510)에 전기 전도도 또는 임피던스를 부여하는 성질을 가질 수 있어서, 이를 통해 검출 회로(560)가 다른 뉴클레오티드 중 하나와 비교하여 첨가된 뉴클레오티드(523)(예시적으로, C)로서 고유하게 식별할 수 있다. 유사하게, 표지(534)는 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 혼성화될 때, 가교(510)에 전기 전도도 또는 임피던스를 부여하는 성질을 가질 수 있어서, 이를 통해 검출 회로(560)가 다른 뉴클레오티드 중 하나와 비교하여 첨가된 뉴클레오티드(524)(예시적으로, G)로서 고유하게 식별할 수 있다.
도 5b에 도시된 예시에서, 표지(531)는 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)의 범용 단량체(514, 515)와 각각 혼성화되는 제1 및 제2 신호 단량체(571, 572)를 포함한다. 제1 및 제2 신호 단량체(571, 572)는 표지(531) 내 임의의 적합한 위치에 위치할 수 있고, 일부 실시예에서, 표지(531)의 단부에 위치할 수 있다. 각각의 표지(532, 533, 및 534)는 유사하게 제1 및 제2 신호 단량체(구체적으로 표지되지 않음)를 포함하지만, 이들 단량체의 특정 유형 및 서열은 신호 단량체를 나타내는 원의 상이한 채워짐에 의해 제안되는 것으로 의도된 바와 같이 표지 간 상이하다. 표지 단량체 유형 및 서열의 이러한 차이는, 이러한 단량체가 범용 염기(514, 515)와 혼성화될 때, 가교(510)을 통해 상이하고 구별 가능한 전기 신호를 제공하고, 이에 기초하여 상응하는 뉴클레오티드가 식별될 수 있다. 각각의 표지(531, 532, 533, 및 534)의 나머지는 임의의 적합한 단량체 서열, 예를 들어 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)의 나머지에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상이한 표지의 나머지 서열은 서로 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 신호 단량체는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 서로 인접할 수 있다.
하나의 비제한적인 예시에서, 표지(531, 532, 533, 534)는 적어도 서로 부분적으로 상이한 서열을 갖는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)은, 일부 실시예에서, 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 대한 표지의 혼성화가 가교(510)의 길이를 따라 완전한 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하도록 이러한 올리고뉴클레오티드의 길이와 동일한 길이를 갖는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 표지의 각각의 올리고뉴클레오티드 서열은 제1 영역(518) 내 중합체 사슬(511) 서열과 다르게 혼성화될 수 있다. 예를 들어, 표지(531)의 제1 및 제2 신호 단량체(571, 572)는 서로 동일하거나 상이한 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 표지의 제1 및 제2 신호 단량체는 다른 표지의 제1 및 제2 신호 단량체로부터 서열 또는 유형에서 또는 둘 다가 상이한 뉴클레오티드일 수 있어서 각각의 표지(531, 532, 533, 534)가 고유한 서열의 제1 및 신호 단량체를 갖는다. 각각의 표지에 대한 제1 및 제2 신호 단량체와 제1 및 제2 범용 염기(514, 515) 간의 각각의 혼성화는 가교(510)를 통해 특정 전기 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 표지(531)는 제1 및 제2 범용 염기(514, 515)와 혼성화하는 특정 쌍의 염기를 갖는 서열을 가질 수 있어서, 가교(510)의 전기 전도도 또는 임피던스를 제1 수준으로 변조한다; 표지(532)는 제1 및 제2 범용 염기(514, 515)와 혼성화하는 특정 쌍의 염기를 갖는 서열을 가질 수 있어서, 가교(510)의 전기 전도도 또는 임피던스를 제1 수준과는 상이한 제1 수준으로 변조한다; 표지(533)는 제1 및 제2 범용 염기(514, 515)와 혼성화하는 특정 쌍의 염기를 갖는 서열을 가질 수 있어서, 가교(510)의 전기 전도도 또는 임피던스를 제1 및 제2 수준과는 상이한 제3 수준으로 변조한다; 그리고 표지(534)는 제1 및 제2 범용 염기(514, 515)와 혼성화하는 특정 쌍의 염기를 갖는 서열을 가질 수 있어서, 가교(510)의 전기 전도도 또는 임피던스를 제1, 제2 및 수준과는 상이한 제4 수준으로 변조한다
특히, 제1 및 제2 범용 염기(514, 515)는 표지가 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 혼성화될 때 다른 유형의 핵염기보다 가교(510)에 증가된 전도도 뿐 아니라 표지가 혼성화될 때 전기 신호에서의 더 큰 변조를 제공하는 것으로 예상될 수 있다. 예를 들어, 제1 중합체 사슬(511)이 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 표지(531, 532, 533, 534)가 올리고뉴클레오티드를 각각 포함하는 예시적인 구성에서, 표지 내의 뉴클레오티드는 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518) 내 핵염기와 각각 혼성화된다. 표지(531, 532, 533, 및 534)는 서로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하여, 서로 상이한 가교(510)를 통한 전기 전도도 또는 임피던스를 제공하는데 이에 기초하여, 표지가 결합하는 상응하는 뉴클레오티드가 검출 회로(560)를 사용하여 식별될 수 있다. 그러나, 표지 서열은 서로 상이한 반면, 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)의 서열은 동일하게 유지되기 때문에, 표지 서열의 모든 뉴클레오티드가 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)의 모든 뉴클레오티드에 상보적이어야 할 필요는 없다. 염기 쌍 사이의 임의의 미스매치는, 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 대한 표지의 혼성화가 가교(510)의 길이를 따르는 완전 이중 가닥 중합체를 제공하는 경우에도, 가교(510)를 통해 흐르는 전류를 유의하게 감소시킬 수 있어서, 잠재적으로 더 낮은 전체 전류 및 서로 상이한 전기 신호를 구별하는 데 있어서의 어려움을 초래한다. 범용 염기(514, 515)는 표지 내 2개 이상의 뉴클레오티드와 혼성화할 수 있고, 일부 실시예에서, 표지 내 임의의 또는 전체 뉴클레오티드와 혼성화할 수 있기 때문에, 표지 내 뉴클레오티드와 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518) 내 뉴클레오티드 사이의 미스매치의 발생이 감소되거나 회피되어, 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 혼성화된 표지(531, 532, 533, 및 534) 중 상이한 하나에 반응한 가교(510)를 통한 상이한 (그리고 구별가능한) 전기 신호를 여전히 허용하면서 가교(510)을 통해 흐르는 전류를 증가시킬 수 있다. 하나의 비제한적인 예시에서, 제1 및 제2 범용 염기(514, 515)는 이노신, 니트로인돌, 니트로피롤, 벤즈이미다졸, 5-플루오로인돌, 인돌 뉴클레오시드 유도체, 및 이소카르보스티릴 뉴클레오시드 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시예에서 범용 염기(514, 515)는 제1 중합체 사슬 내의 내부 위치와는 반대로 제1 중합체 사슬(511)의 말단 단부에 위치할 수 있다(도 1a 및 도 1b에 도시된 실시예에 도시된 바와 유사함). 범용 염기(514, 515)의 이러한 말단 단부 위치는 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)과 표지(531)의 혼성화 강도를 감소시킬 있는데, 이는 중합효소(205)가 성장하는 폴리뉴클레오티드 서열에 뉴클레오티드(521)의 첨가를 수행할 때 제1 중합체 사슬(511)로부터의 표지(531)의 탈혼성화를 용이하게 할 수 있어서, 서열의 다음 뉴클레오티드의 표지가 차후에 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 혼성화될 수 있다. 예를 들어, 표지(531)가 올리고뉴클레오티드를 포함하고 제1 중합체 사슬(511)이 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구성에서, 범용 염기(514, 515)의 말단 단부 위치는 2개 대신에 오직 단일 염기 적층 단부만을 제공하여, 제1 중합체 사슬(511)로부터의 표지(531)의 오프 속도를 증가시킬 수 있다.
제2 중합체 사슬(512)의 제1 영역(518)에 결합된 중합효소(505)를 제공하는 것은 가교(510)를 통해 흐르는 전류를 더 안정화시킬 수 있고, 따라서 서로 상이한 전기 신호를 구별하는 능력을 더 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 중합효소(505)가 뉴클레오티드(521, 522, 523 및 524)를 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 혼입함에 따라, 중합효소는 그렇지 않으면 가교(510)의 전도도 또는 임피던스에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 가교(510)를 통한 신호의 변화의 측정에 신호 성분(예를 들어, 노이즈)을 추가할 수 있는 입체구조 변화를 겪는다. 제2 중합체 사슬(512)의 제1 영역(518)에 결합된 중합효소(505)를 제공하는 것은 전류가 흐르는 가교(510)의 부분, 즉, 제1 중합체 사슬(511)로부터 중합효소를 적어도 부분적으로 분리할 수 있고, 그렇지 않으면 중합효소의 입체구조 변화로부터 발생할 수 있는 신호 성분을 적어도 부분적으로 억제할 수 있다. 추가적인 옵션으로서, 제2 중합체 사슬(512)은 임의의 표지(531, 532, 533, 534)와 혼성화하지 않을 수 있는 비전도성 중합체를 포함할 수 있어서, 표지(531, 532, 533, 또는 534) 중 하나가 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 혼성화될 때만 또는 실질적으로 표지(531, 532, 533, 또는 534) 중 하나가 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 혼성화될 때만 제 1 중합체 사슬(511)을 통해 전류가 흐르는 반면, 제2 중합체 사슬(512)을 통해서는 항상 전류가 흐르지 않거나 실질적으로 전혀 흐를 수 없다. 예시적으로, 제1 중합체 사슬(511)은 제3 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 표지는 제3 폴리뉴클레오티드의 제1 부분(518)에 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제2 중합체 사슬(512)의 제1 부분(518)은 중합효소(505)가 결합될 수 있는 스페이서 포스포르아미다이트를 포함하는 중합체와 같은 올리고뉴클레오티드 표지에 혼성화되지 않을 비전도성 중합체를 포함할 수 있는 반면, 제2 중합체 사슬(512)의 제2 부분(519)은 폴리뉴클레오티드와 같은 제1 중합체 사슬(511)의 제2 부분(519)이 혼성화될 수 있는 중합체를 포함할 수 있다. 제2 중합체 사슬(512)용으로 제공될 수 있는 것과 같은 스페이서 포스포르아미다이트 및 폴리뉴클레오티드 둘 모두를 포함하는 중합체 사슬은 예를 들어, Glen Research(Sterling, vA)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)은 임의의 적합한 조합, 순서 및 유형의 단량체 단위(예를 들어, 뉴클레오티드)를 포함하여, 표지와 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518) 사이의 혼성화를 충분히 안정화하며, 상이한 표지로부터의 신호가 검출되고 서로 구별되도록 함을 이해할 것이다. 예를 들어, 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)은 임의의 적합한 수의 범용 단량체(예를 들어, 범용 염기), 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 4개 초과의 범용 단량체를 포함할 수 있다. 범용 단량체는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 서로 인접하게 위치할 수 있다. 예를 들어, 범용 단량체는 범용이 아닌 하나 이상의 단량체에 의해 서로 이격될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518) 또한 표지와 범용 단량체 사이의 혼성화를 충분히 안정화시키는 임의의 적합한 수의 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)은 임의의 적합한 수의 안정화 단량체(예를 들어, 뉴클레오티드), 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 초과의 안정화 단량체를 포함할 수 있다. 안정화 단량체는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 서로 인접하게 위치할 수 있다. 예를 들어, 안정화 단량체는 하나 이상의 범용 단량체에 의해 서로 이격될 수 있다.
유사하게, 표지(531, 532, 533, 534)는 각각 임의의 적합한 조합, 순서 및 유형의 단량체 단위(예를 들어, 뉴클레오티드)를 포함하여, 표지와 제1 중합체(511)의 제1 영역(518) 사이의 혼성화를 충분히 안정화하면서, 상이한 표지로부터의 신호가 검출되고 서로 구별되도록 할 수 있다. 예를 들어, 표지는 제1 중합체의 범용 단량체(예를 들어, 범용 염기), 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 4개 초과의 범용 단량체와 각각 혼성화할 수 있는 임의의 적합한 수의 단량체를 포함할 수 있다. 이러한 단량체는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 서로 인접하게 위치할 수 있다. 예를 들어, 이러한 단량체는 범용 단량체와 혼성화하지 않을 수 있는 하나 이상의 단량체에 의해 서로 이격될 수 있다. 일부 실시예에서 표지는 또한 표지와 범용 단량체 사이의 혼성화를 충분히 안정화시키는 임의의 적합한 수의 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표지는 제1 중합체 사슬의 다른 단량체(예를 들어, 뉴클레오티드)와 혼성화하는 임의의 적합한 수의 추가의 단량체(예를 들어, 뉴클레오티드), 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 초과의 추가 단량체를 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 단량체는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 서로 인접하게 위치할 수 있다. 예를 들어, 추가 단량체는 범용 단량체와 각각 혼성화할 수 있는 하나 이상의 단량체에 의해 서로 이격될 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 표지 내의 단량체 단위(예를 들어, 뉴클레오티드)의 수는 제1 중합체(511)의 제1 영역(518)의 단량체 단위의 수와 동일하거나 대략 동일하다.
전극들 사이의 가교 내에 그리고 뉴클레오티드에 결합된 표지 내에 포함된 중합체는 본원에 예시된 바와 같은 임의의 적합한 물질을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 이들 중합체는 각각 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 도 6은 하나의 단일 가닥 영역에 부착된 중합효소를 갖는 부분 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 가교를 포함하는 서열분석을 위한 예시적인 조성물(600)을 개략적으로 예시한다. 도 6에 도시된 예시에서, 조성물(600)은 도 5a 및 도 5b를 참조하여 설명된 조성물(500)과 유사하게 구성될 수 있고, 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된 조성물(100), 도 2를 참조하여 설명된 조성물(200), 또는 도 3a 및 도 3b를 참조하여 설명된 조성물(300)의 임의의 적합한 특징부들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물(600)은 제1 전극(602), 제2 전극(603), 중합효소(605), 각각 제1 영역(618) 및 제2 영역(619)을 갖는 제1 폴리뉴클레오티드 사슬(611) 및 제2 폴리뉴클레오티드 사슬(612)을 포함하는 가교(610), 및 올리고뉴클레오티드 표지(631)에 결합된 뉴클레오티드(621)를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 사슬과 전극 사이의 예시적인 결합은 삼각형으로 표시된다. 중합효소(605)는 단단할 수 있는 링커(606)를 통해 제2 폴리뉴클레오티드 사슬(612)의 제1 영역(618)에 결합될 수 있으며, 뉴클레오티드(621)와 같은 뉴클레오티드를 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(650)의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드(640)에 첨가할 수 있다. 조성물(600)은 본원에 기재된 다른 조성물을 참조하여 기술되지만 여기에서 생략된 것과 같은 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 도 6에 예시된 특정 뉴클레오티드 서열은 순수하게 예시이며 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다.
도 6에 도시된 예시에서, 제1 폴리뉴클레오티드 사슬(611)은 제2 영역(619)에서만 제2 폴리뉴클레오티드 사슬(612)에 혼성화될 수 있는 반면, 제1 폴리뉴클레오티드 사슬(611)은 제1 영역(618)에서 제2 폴리뉴클레오티드 사슬(612)에 혼성화되지 않는다. 제2 폴리뉴클레오티드 사슬(618)의 제1 영역(618)은 표지가 혼성화되지 않을 수 있는 중합체를 포함할 수 있고, 제2 폴리뉴클레오티드 사슬(612)의 제2 영역(619)은 해당 영역에서 제1 폴리뉴클레오티드 사슬(611)에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 폴리뉴클레오티드 사슬(612)은 제1 영역(618)에서 Sp-18(Glen Research(Sterling, vA)로부터 상업적으로 입수 가능함)과 같은 스페이서 포스포르아미다이트를 포함할 수 있고, 제2 영역(619)에서 제1 폴리뉴클레오티드 사슬(611)과 혼성화할 수 있는 임의의 적합한 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있다. 제1 영역(618)에서, 제2 폴리뉴클레오티드 사슬(612)은 반드시 전도성이 아닐 수 있는 반면, 제2 영역(619)에서, 제1 폴리뉴클레오티드 사슬(611) 및 제2 폴리뉴클레오티드 사슬(612) 은 함께 가교(610)의 제1 전도도 부분을 제공할 수 있다는 것에 유의한다.
제1 폴리뉴클레오티드 사슬(611)의 제1 영역(618)은 임의의 적합한 수의 범용 염기(예시적으로, 이노신(I)), 예를 들어, 제1, 제2 및 제3 범용 염기(614, 615, 616) 및 나머지 뉴클레오티드 단위의 임의의 적합한 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드(621)의 표지(631)는 제1 폴리뉴클레오티드 사슬(611)의 범용 단량체(614, 615, 616)와 각각 혼성화되는 제1, 제2 및 제3 신호 뉴클레오티드(671, 672, 673) 및 제1 폴리뉴클레오티드 사슬(611)의 제1 영역(618)의 나머지 뉴클레오티드 단위와 혼성화되는 임의의 적합한 서열의 남은 뉴클레오티드 단위를 포함할 수 있어서, 가교(610)의 제2 전도성 부분을 제공한다. 제1, 제2 및 제3 신호 뉴클레오티드(671, 672, 673)는 도 6에서 NNN으로 표시되어, 도 3b에 도시된 뉴클레오티드 쌍과 유사하게 임의의 적합한 유형 및 서열의 뉴클레오티드를 포함할 수 있음을 나타낸다. 상이한 표지들은 이러한 신호 뉴클레오티드들 중 상이한 하나를 가질 수 있는데, 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된 바와 같은 방식으로 서로 구별 가능한 가교(610)를 통한 각각의 전기 신호, 예를 들어 전류 또는 전압을 제공하도록 선택된다.
도 5a 및 도 5B 및 도 6을 참조하여 기술된 바와 같은 조성물은 서열분석을 위한 임의의 적합한 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 7은 하나의 단일 가닥 영역에 부착된 중합효소를 갖는 부분 이중 가닥 중합체 가교를 사용하여 서열분석하는 방법에서의 작업의 예시적인 흐름을 도시한다. 방법(700)은 적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 중합효소에 의해, 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 첨가하는 단계(작업(710))를 포함한다. 예를 들어, 도 5a 및 도 5b를 참조하여 설명된 중합효소(505)는 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(550)의 서열을 사용하여 각각의 뉴클레오티드(521, 522, 523, 및 524)를 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 첨가할 수 있다. 또는, 예를 들어, 도 6을 참조하여 기술된 중합효소(605)는 적어도 제2 폴리뉴클레오티드(650)의 서열을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드(640)에 뉴클레오티드(621) 및 다른 뉴클레오티드를 첨가할 수 있다(다른 뉴클레오티드는 구체적으로 도시되지 않음).
도 7에 도시된 방법(700)은 또한 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지를 제1 및 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 가교의 제1 중합체 사슬의 제1 영역에 혼성화시키는 단계(작업(720))를 포함할 수 있다. 가교는 제2 중합체 사슬을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 중합효소는 제2 중합체 사슬의 제1 영역에 결합되고, 제1 중합체 사슬의 제2 영역은 제2 중합체 사슬의 제2 영역에 혼성화된다. 예를 들어, 도 5a 및 도 5b를 참조하여 설명된 표지(531, 532, 533, 534)는 뉴클레오티드(521, 522, 523 및 524)에 각각 결합될 수 있다. 중합효소(505)는 이러한 뉴클레오티드를 각각 제1 폴리뉴클레오티드(540)에 첨가하기 때문에, 이러한 뉴클레오티드에 결합된 표지는 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)에 각각 혼성화될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 중합체 사슬(511)의 제1 영역(518)은 제1 및 제2 범용 단량체(514, 515) 및 복수의 나머지 단량체를 포함할 수 있다. 또는, 예를 들어, 도 6을 참조하여 설명된 표지(631)는 뉴클레오티드(621)에 결합될 수 있고, 다른 표지는 다른 뉴클레오티드에 결합될 수 있다(다른 표지 및 다른 뉴클레오티드는 구체적으로 도시되지 않음). 중합효소(605)는 이러한 뉴클레오티드를 각각 제1 폴리뉴클레오티드(640)에 첨가하기 때문에, 이러한 뉴클레오티드에 결합된 표지는 제1 중합체 사슬(611)의 제1 영역(618)에 각각 혼성화될 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 중합체 사슬(611)의 제1 영역(618)은 제1, 제2 및 제3 범용 염기(614, 615, 616) 및 복수의 나머지 단량체를 포함할 수 있다.
다시 도 7을 참조하면, 방법(700)은 제1 중합체 사슬의 제1 영역과 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지 사이의 각각의 혼성화에 반응하는 가교를 통한 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 중합효소가 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가한 서열을 검출하는 단계(작업(730))를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 5a 및 도 5b를 참조하여 설명된 검출 회로(560)는 표지(531, 532, 533, 및 534)와 제1 중합체 사슬(511) 제1 영역(518), 일부 실시예에서, 제1 및 제2 신호 단량체(571, 572)와 제1 및 제2 범용 단량체(514, 515) 사이의 각각의 혼성화에 반응한 가교(510)를 통한 전기 신호의 변화를 검출할 수 있다. 유사한 검출 회로(구체적으로 도시되지 않음)는 도 6에 예시된 가교(610)를 통한 전기 신호의 변화를 검출할 수 있으며, 이는 표지(631)(및 다른 유사한 표지)와 제1 중합체 사슬(611),의 제1 영역(618), 특히 제1, 제2 및 제3 신호 뉴클레오티드(671, 672, 673)(및 다른 유사한 신호 뉴클레오티드)와 제1, 제2 및 제3 범용 염기(614, 615, 616) 사이의 각각의 혼성화에 반응한 것이다.
본원에 제공된 임의의 조성물 및 방법에 적합한 임의의 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 조성물(100, 200, 300, 500 또는 600) 중 임의의 것은 비천연 발생 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 거울상이성질체 DNA와 같은 비천연 발생 DNA를 각각 포함하도록 변형될 수 있다. 이러한 비천연 발생 폴리뉴클레오티드는 조성물 내의 임의의 천연 발생 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 중합효소에 의해 작용하는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드에 혼성화되지 않을 수 있으며, 따라서 그렇지 않으면 이러한 혼성화로부터 야기될 수 있는 임의의 간섭을 억제한다.
다양한 예시적인 예가 위에서 설명되어 있지만, 본 발명을 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 및 범위 내에 속하는 이러한 모든 변경 및 수정을 포함하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ILLUMINA, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR SEQUENCING USING POLYMER BRIDGES <130> IP-1955-PCT <140> <141> <150> 63/019,882 <151> 2020-05-04 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (21)..(22) <223> Inosine <400> 1 gggaaaaaaa aaaaaaaaaa nnggg 25 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 tttttttttt tttccc 16 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> Inosine <400> 3 nnncccacca ccaccacccc ctcc 24 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (16)..(18) <223> a, c, t, g, other, or unknown <400> 4 ggtggtggtg gtgggnnn 18

Claims (44)

  1. 조성물로서,
    공간에 의해 서로 분리된 제1 및 제2 전극;
    상기 제1 및 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 가교,
    (상기 가교는 서로 혼성화된 제1 및 제2 중합체 사슬을 포함하고,
    상기 제1 중합체 사슬은 제1 길이를 갖고,
    상기 제2 중합체 사슬은 상기 제1 중합체 사슬의 갭 영역이 상기 제2 중합체 사슬에 혼성화되지 않도록 상기 제1 길이보다 짧은 제2 길이를 갖고,
    상기 갭 영역은 제1 및 제2 범용 단량체를 포함하는 것임);
    제1 및 제2 폴리뉴클레오티드;
    각각의 뉴클레오티드가 상응하는 표지에 결합된, 복수의 뉴클레오티드;
    적어도 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 상기 복수의 뉴클레오티드로부터의 뉴클레오티드를 첨가하는 중합효소,
    (이러한 뉴클레오티드에 상응하는 표지는 상기 제1 및 제2 범용 단량체에 각각 혼성화되되, 상기 제1 및 제2 범용 단량체는 상기 표지 내 임의의 단량체에 혼성화되는 것임); 및
    상기 가교를 통한 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 상기 중합효소가 뉴클레오티드를 첨가한 서열을 검출하는 검출 회로로서, 상기 변화는 상기 제1 및 제2 범용 단량체와 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 상기 표지 사이의 각각의 혼성화에 반응하는 것인, 검출 회로를 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중합체 사슬은 각각 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표지는 서로 상이한 서열을 갖는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 범용 단량체는 각각 제1 및 제2 범용 염기를 포함하는, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드와 상기 제1 및 제2 범용 염기 사이의 혼성화가 상기 가교를 통한 전기 신호를 변화시키는, 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 제1 및 제2 범용 염기는 이노신, 니트로인돌, 니트로피롤, 벤즈이미다졸, 5-플루오로인돌, 인돌 뉴클레오시드 유도체, 및 이소카르보스티릴 뉴클레오시드 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 갭 영역은 안정화 영역을 더 포함하고, 상기 표지는 상기 안정화 영역에 추가로 혼성화되고, 상기 안정화 영역은 상기 제1 및 제2 범용 단량체에 대한 상기 표지의 혼성화를 안정화시키는, 조성물.
  8. 제3항에 있어서, 상기 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드 및 상기 표지의 올리고뉴클레오티드는 비천연 발생 DNA를 포함하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 비천연 발생 DNA는 거울상이성질체 DNA를 포함하는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 갭 영역은 상기 제1 중합체 사슬의 말단 단부에 위치하는, 조성물.
  11. 서열분석 방법으로서,
    적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 중합효소에 의해 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 첨가하는 단계;
    상기 뉴클레오티드에 각각 결합된 표지를 제1 전극 및 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 가교의 중합체 사슬의 갭 영역에 혼성화시키는 단계로서, 상기 갭 영역은 제1 및 제2 범용 단량체를 포함하는 것인, 단계; 및
    상기 범용 단량체와 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 상기 표지 사이의 각각의 혼성화에 반응한 상기 가교를 통한 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 상기 중합효소가 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 상기 뉴클레오티드를 첨가한 서열을 검출하는 단계로서, 상기 범용 단량체는 상기 표지 내 임의의 단량체에 혼성화되는 것인 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 중합체 사슬은 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 표지는 서로 상이한 서열을 갖는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 범용 단량체는 각각 제1 및 제2 범용 염기를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드와 상기 제1 및 제2 범용 염기 사이의 혼성화가 상기 가교를 통한 전기 신호를 변화시키는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 제1 및 제2 범용 염기는 이노신, 니트로인돌, 니트로피롤, 벤즈이미다졸, 5-플루오로인돌, 인돌 뉴클레오시드 유도체, 및 이소카르보스티릴 뉴클레오시드 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 갭 영역은 안정화 영역을 더 포함하고, 상기 방법은 상기 안정화 영역에 의해, 상기 각각의 표지의 제1 및 제2 범용 단량체에 대한 혼성화를 안정화시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 제3 폴리뉴클레오티드 및 상기 표지의 올리고뉴클레오티드는 비천연 발생 DNA를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 비천연 발생 DNA는 거울상이성질체 DNA를 포함하는, 방법.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 갭 영역은 상기 중합체 사슬의 말단 단부에 위치하는, 방법.
  21. 조성물로서,
    공간에 의해 서로 분리된 제1 및 제2 전극;
    상기 제1 및 제2 전극 사이의 공간에 걸친 가교(상기 가교는:
    각각이 제1 및 제2 중합체 사슬이 서로 혼성화되지 않는 제1 영역을 갖는 제1 및 제2 중합체 사슬; 및
    상기 제1 및 제2 중합체 사슬이 서로 혼성화되는 제2 영역을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 중합체 사슬은 각각 상기 제1 및 제2 전극 사이의 공간의 길이와 대략 동일한 길이를 갖음);
    제1 및 제2 폴리뉴클레오티드;
    각각의 뉴클레오티드가 상응하는 표지에 결합된, 복수의 뉴클레오티드;
    상기 제2 중합체 사슬의 제1 영역에 결합된 중합효소로서, 상기 중합효소는 적어도 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 상기 복수의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드를 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 첨가하고,
    이러한 뉴클레오티드에 상응하는 상기 표지는 상기 제1 중합체 사슬의 제1 영역에 각각 혼성화하는 것인, 중합효소; 및
    상기 가교를 통한 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 상기 중합효소가 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 첨가한 서열을 검출하는 검출회로로서, 상기 변화는 상기 제1 중합체 사슬의 제1 영역과 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 상기 표지 사이의 각각의 혼성화에 반응하는 것인, 검출 회로를 포함하는, 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중합체 사슬은 각각 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 표지는 서로 상이한 서열을 갖는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중합체 사슬의 폴리뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드가 각각 혼성화되는 제1 및 제2 범용 염기를 추가로 포함하는, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드와 제1 및 제2 범용 염기 사이의 혼성화가 상기 가교를 통한 전기 신호를 변화시키는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제1 및 제2 범용 염기는 이노신, 니트로인돌, 니트로피롤, 벤즈이미다졸, 5-플루오로인돌, 인돌 뉴클레오시드 유도체, 및 이소카르보스티릴 뉴클레오시드 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조성물.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 중합체 사슬의 제1 영역이 상기 올리고뉴클레오티드에 혼성화하지 않는 중합체를 포함하는, 조성물.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드 및 상기 표지의 올리고뉴클레오티드가 비천연 발생 DNA를 포함하는, 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 비천연 발생 DNA는 거울상이성질체 DNA를 포함하는, 조성물.
  30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중합체 사슬은 각각의 표지의 제1 및 제2 단량체가 각각 혼성화되는 제1 및 제2 범용 단량체를 추가로 포함하는, 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제1 및 제2 범용 단량체는 상기 제1 중합체 사슬의 말단 단부에 위치하는, 조성물.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 중합체 사슬의 제1 영역은 비전도성인, 조성물.
  33. 서열분석 방법으로서,
    적어도 제2 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 중합효소에 의해 뉴클레오티드를 제1 폴리뉴클레오티드에 첨가하는 단계;
    상기 뉴클레오티드에 결합된 표지를 제1 전극 및 제2 전극 사이의 공간에 걸쳐 있는 가교의 제1 중합체 사슬의 제1 영역에 각각 혼성화시키는 단계로서,
    상기 가교는 제2 중합체 사슬을 추가로 포함하되, 상기 중합효소는 상기 제2 중합체 사슬의 제1 영역에 결합되고, 상기 제1 중합체 사슬의 제2 영역은 상기 제2 중합체 사슬의 제2 영역에 혼성화되고;
    상기 제1 및 제2 중합체 사슬은 각각 상기 제1 및 제2 전극 사이의 공간의 길이와 대략 동일한 길이를 갖는 것인, 단계;
    상기 제1 중합체 사슬의 제1 영역과 이러한 뉴클레오티드에 상응하는 상기 표지 사이의 각각의 혼성화에 반응한 가교를 통한 적어도 전기 신호의 변화를 사용하여 상기 중합효소가 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 상기 뉴클레오티드를 첨가한 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 제1 및 제2 중합체 사슬은 각각 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 표지는 서로 상이한 서열을 갖는 각각의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 폴리뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드가 각각 혼성화되는 제1 및 제2 범용 염기를 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드와 제1 및 제2 범용 염기 사이의 혼성화가 상기 가교를 통한 전기 신호를 변화시키는, 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 제1 및 제2 범용 염기는 이노신, 니트로인돌, 니트로피롤, 벤즈이미다졸, 5-플루오로인돌, 인돌 뉴클레오시드 유도체, 및 이소카르보스티릴 뉴클레오시드 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 중합체 사슬의 제1 영역은 상기 올리고뉴클레오티드에 혼성화되지 않는 중합체를 포함하는, 방법.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드 및 상기 표지의 올리고뉴클레오티드는 비천연 발생 DNA를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 비천연 발생 DNA는 거울상이성질체 DNA를 포함하는, 방법.
  42. 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중합체 사슬은 각각의 표지의 제1 및 제2 단량체가 각각 혼성화되는 제1 및 제2 범용 단량체를 추가로 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 제1 및 제2 범용 단량체는 상기 제1 중합체 사슬의 말단 단부에 위치하는, 방법.
  44. 제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 중합체 사슬의 제1 영역은 비전도성인, 방법.
KR1020227042112A 2020-05-04 2021-05-03 중합체 가교를 이용한 서열분석을 위한 조성물 및 방법 KR20230015928A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063019882P 2020-05-04 2020-05-04
US63/019,882 2020-05-04
PCT/US2021/030453 WO2021225953A1 (en) 2020-05-04 2021-05-03 Compositions and methods for sequencing using polymer bridges

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230015928A true KR20230015928A (ko) 2023-01-31

Family

ID=76076493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227042112A KR20230015928A (ko) 2020-05-04 2021-05-03 중합체 가교를 이용한 서열분석을 위한 조성물 및 방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230175059A1 (ko)
EP (1) EP4146823A1 (ko)
JP (1) JP2023524292A (ko)
KR (1) KR20230015928A (ko)
CN (1) CN115968409A (ko)
AU (1) AU2021268603A1 (ko)
CA (1) CA3174116A1 (ko)
WO (1) WO2021225953A1 (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3169805T5 (en) * 2014-07-15 2018-12-03 Illumina Inc Biochemically activated electronic device
WO2017189930A1 (en) * 2016-04-27 2017-11-02 Quantum Biosystems Inc. Systems and methods for measurement and sequencing of bio-molecules
NL2021376B1 (en) * 2018-06-29 2020-01-06 Illumina Inc Sensor and sensing system

Also Published As

Publication number Publication date
US20230175059A1 (en) 2023-06-08
WO2021225953A1 (en) 2021-11-11
WO2021225953A4 (en) 2021-12-30
AU2021268603A1 (en) 2022-10-27
CA3174116A1 (en) 2021-11-11
CN115968409A (zh) 2023-04-14
EP4146823A1 (en) 2023-03-15
JP2023524292A (ja) 2023-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107835858B (zh) 使用锚定至邻近纳米孔的聚合酶的系链对多核苷酸测序的组合物、系统和方法
US8372585B2 (en) Electronic sensing for nucleic acid sequencing
KR20180026668A (ko) 전계-효과 장치 및 핵산 서열결정 방법
US20230090867A1 (en) Sequencing polynucleotides using nanopores
CN115916994A (zh) 使用S-腺苷-L-甲硫氨酸类似物（xSAM）检测甲基胞嘧啶及其衍生物
US20230175059A1 (en) Compositions and methods for sequencing using polymer bridges
US20230313273A1 (en) Selecting aptamers using sequencing
US20070065834A1 (en) Method and sequences for determinate nucleic acid hybridization
US20230295711A1 (en) Compositions and methods for sequencing using at least electrical characteristics
US20240158849A1 (en) Compositions and methods for sequencing using polymers with metal-coated regions and exposed regions
US20230175055A1 (en) Devices including particles coupled to electrodes, and methods of making and using the same
EP1399588B1 (en) Method and sequences for determinate nucleic acid hybridization