CN115595360A - 用于生物分子的测量和测序的系统和方法 - Google Patents

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戈拉夫·戈亚尔
本藏俊彦
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Abstract

本发明提供了用于生物分子的测量和测序的系统和方法。核酸分子的序列可以使用包含传感器的芯片高准确度地识别，其中每个单个传感器可以包含被间隙隔开的至少两个电极。所述电极可以被构造成在和与核苷酸相结合的隧穿标记物结合后产生至少一个电信号。表观遗传信息也可以与核酸序列同时被确定。

Description

用于生物分子的测量和测序的系统和方法
本申请为国际申请日2017年4月27日、国际申请号PCT/US2017/029978于2018年12月11日进入中国国家阶段、申请号201780036219.9、发明名称“用于生物分子的测量和测序的系统和方法”的分案申请。
交叉引用
本申请要求2016年4月27日提交的美国临时专利申请号62/328,527、2016年9月9日提交的美国临时专利申请号62/385,782和2016年7月7日提交的美国临时专利申请号62/359,648的利益，每个所述美国临时专利申请都通过引用以整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于生物分子的测量和测序的系统和方法。
背景技术
新的研究持续不断地增加我们对遗传信息的了解，并对如何检测核酸序列和表观遗传学提出了挑战。
在快速数据测量和提取方面存在挑战。一些方法依赖于通过修饰碱基的光学信号测量。一些方法依赖于离子电流测量和对本源碱基的某些修饰。然而，这些方法可能缺乏速度和通量，并且可能具有误差例如相位误差、光毒性、缺失和重复碱基误差以及均聚物计数误差。此外，许多方法可能需要克隆或全基因组扩增，导致扩增偏倚。没有系统能够同时直接确定DNA和RNA序列和表观遗传学。
发明内容
在这里，认识到了对以高准确度和低成本进行高通量且快速地测量本源DNA碱基的需求。
本公开的某些方面提供了通过在芯片上的大规模并行系统中以高通量测量来自于带有隧穿标记物的碱基的隧穿电流的多核苷酸测序方法。
本公开的某些方面提供了用于测序多核苷酸分子例如DNA的系统。所述系统可以包含配置在衬底上的被非导电间隙隔开的两个电极。所述电极和间隙可以被构造成将聚合酶容纳在所述两个电极附近。所述电极和间隙可以被进一步构造成用于在至少一个包含隧穿标记物的核苷酸在所述聚合酶存在下被并入到多核苷酸的单链部分中或结合到所述单链部分旁边时检测电子或空穴隧穿电流。
本公开的某些方面提供了一种设备，其包含配置在衬底上的被非导电间隙隔开的至少两个电极。所述电极和间隙可以被构造成将聚合酶容纳在所述两个电极附近。所述电极和间隙可以被调整以适于在核苷酸在所述聚合酶存在下并入或结合到多核苷酸期间检测电子或空穴隧穿电流。所述核苷酸可以包含隧穿标记物。所述核苷酸可以被并入到所述多核苷酸的单链部分中或结合到所述单链部分。
在某些实施方式中，可以监测核苷酸的结合和释放动力学。所述结合动力学可用于提供关于例如靶核酸链的表观遗传组成的信息。
本公开的某些方面提供了一种用于在寡核苷酸中测定生物信息的方法。所述方法可以包括将所述寡核苷酸置于衬底上的两个电极之间，在所述两个电极之间施加偏压，测量所述两个电极之间的电流，计算所述寡核苷酸的电导或电阻，并在所述电导或电阻的基础上确定所述生物信息。
本公开的一个方面提供了一种用于测序核酸分子的方法，所述方法包括：(a)提供包含被间隙隔开的至少两个电极的衬底，其中所述衬底是固体；(b)将反应混合物导向间隙，所述反应混合物包含一种或多种标记的核苷酸类型和核酸扩增反应所必需的试剂；(c)在足以产生核酸分子的扩增产物的条件下使至少一部分反应混合物进行核酸扩增反应，所述扩增产物可以包括一种或多种标记的核苷酸类型中的至少一种；(d)使用至少两个电极来检测来自于扩增产物的至少一个电信号，所述电信号可以是扩增产物在间隙中延伸的结果，或者可以是扩增产物被引导通过间隙的结果，其中至少一个电信号包含隧穿电流；以及(e)在(d)中检测到的电信号的基础上鉴定核酸分子或其一部分的核酸序列。
在某些实施方式中，至少一个电信号至少部分是非法拉第电流。在某些实施方式中，至少一个信号包含多个信号。在某些实施方式中，至少一个信号可以包含隧穿电流，或隧穿电流和跳跃电流。在某些实施方式中，一种或多种标记的核苷酸类型可以用可促进隧穿电流和/或跳跃电流的形成的一种或多种分子和/或其他组成部分标记。在某些实施方式中，一种或多种分子和/或其他组成部分可以包含导电部分。在某些实施方式中，导电部分在一种或多种分子或其他组成部分经受电压时允许电流从所述导电部分通过。在某些实施方式中，电流可以是直流电流(DC)。在某些实施方式中，电流可以是交流电流(AC)。在某些实施方式中，分子可以包含隧穿标记物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸的碱基部分。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸类型的磷酸酯链。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被可逆地结合到一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸类型。在某些实施方式中，一种或多种标记的核苷酸类型包含至少两种不同类型的核苷酸类型或其修饰物。在某些实施方式中，至少两种类型的核苷酸或其修饰物中的每种类型可以用不同的隧穿标记物标记。在某些实施方式中，隧穿标记物可以包含两性离子化合物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以包含核酸序列。在某些实施方式中，核酸序列可以包含大于或等于约10个碱基。在某些实施方式中，核酸序列可以包含双链部分和单链部分。在某些实施方式中，所述一种或多种标记的核苷酸类型中的至少一种可以包含终止物。在某些实施方式中，方法还包括在检测电信号后从并入到扩增产物中的给定的标记的核苷酸除去终止物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到终止物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被可逆地结合到终止物。在某些实施方式中，至少一个电信号可以以大于或等于约100比1的信噪比被检测。在某些实施方式中，信噪比可以大于或等于约1000比1。在某些实施方式中，至少一个电信号可以被实时检测。在某些实施方式中，试剂可以包含酶。在某些实施方式中，酶可以具有核酸聚合酶活性。在某些实施方式中，酶可以是聚合酶。在某些实施方式中，聚合酶可以包含脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶。在某些实施方式中，聚合酶可以包含核糖核酸(RNA)聚合酶。在某些实施方式中，方法还可以包括将聚合酶配置在至少两个电极的流体环境中。在某些实施方式中，方法还可以包括将聚合酶配置在至少两个电极之间的电介质上。在某些实施方式中，方法还可以包括将聚合酶配置在至少两个电极中的至少一者的表面上。在某些实施方式中，方法还可以包括将聚合酶配置在至少两个电极的顶部。在某些实施方式中，聚合酶可以促进一种或多种标记的核苷酸类型中的至少一者并入到扩增产物中。在某些实施方式中，试剂可以包含离子。在某些实施方式中，离子可以包含阳离子。在某些实施方式中，阳离子可以包含Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+或其组合。在某些实施方式中，阳离子可以包含催化性阳离子、非催化性阳离子或其组合。在某些实施方式中，间隙宽度或间距可以大于或等于约1纳米(nm)。在某些实施方式中，间隙宽度或间距可以小于或等于约20nm。在某些实施方式中，间隙宽度或间距可以大于20nm。在某些实施方式中，流动通道可以具有大于或等于约100nm的深度。在某些实施方式中，具有至少两个电极的传感器可以具有第一部分和毗邻第一部分并在其下方的第二部分。在某些实施方式中，第一部分可以具有第一宽度，并且第二部分可以具有小于第一宽度的第二宽度。在某些实施方式中，传感器可以具有倒锥形的横截面形状。在某些实施方式中，核酸扩增反应可以包含聚合酶链反应(PCR)。在某些实施方式中，核酸扩增反应可以包含链置换扩增(SDA)反应。在某些实施方式中，核酸扩增反应可以包含核酸延伸反应。在某些实施方式中，方法还可以包括重复一组步骤直至鉴定样品核酸分子或其一部分的至少约5个碱基，所述一组步骤可以包括如步骤(c)-(e)中所述的标记的核苷酸的结合、检测和并入。在某些实施方式中，衬底可以包含多个电极对，每对被构造成用于鉴定不同样品核酸分子或其一部分的核酸序列。在某些实施方式中，核酸分子或其一部分的核酸序列可以以至少约90％的准确率被鉴定。在某些实施方式中，准确率可以为至少约95％。在某些实施方式中，核酸分子或其一部分的核酸序列可以在核酸分子的至少约100个连续核酸碱基的跨度上以至少约90％的准确率被鉴定。
本公开的另一个方面提供了一种用于测序核酸分子的系统，所述系统包含：衬底，其包含被作为流动通道的一部分的间隙隔开的至少两个电极，其中衬底可以是固体；以及计算机处理器，其可操作地偶联到衬底并被编程以：(a)将反应混合物导向电极对传感器或一组电极对传感器，所述反应混合物包含一种或多种标记的核苷酸类型和核酸扩增反应所必需的试剂；(b)在足以产生核酸分子的扩增产物的条件下使至少一部分反应混合物进行核酸扩增反应，所述扩增产物可以包含一种或多种标记的核苷酸类型中的至少一种；(c)使用至少两个电极来检测来自于被结合的标记的核苷酸或在扩增产物可以被产生和/或引导通过间隙时来自于扩增产物的至少一个电信号，其中至少一个电信号可以包含隧穿电流；以及(d)在(c)中检测到的电信号的基础上鉴定核酸分子或其一部分的核酸序列。
在某些实施方式中，至少一个电信号可以至少部分是非法拉第电流。在某些实施方式中，至少一个信号可以包含多个信号。在某些实施方式中，至少一个电信号可以包含隧穿电流。在某些实施方式中，一种或多种标记的核苷酸类型可以用可促进隧穿电流和跳跃电流形成的分子标记。在某些实施方式中，标记物可以包含导电部分。在某些实施方式中，导电部分可以在标记物可能经受电压时允许电流从所述导电部分通过。在某些实施方式中，电流可以是直流电流(DC)。在某些实施方式中，电流可以是交流电流(AC)。
在某些实施方式中，电流可以是直流电流与交流电流的组合。在某些实施方式中，分子可以包含隧穿标记物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸类型的碱基部分。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸的磷酸酯链。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到一组一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸的核糖或其他骨架分子的任何位置。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被可逆地结合到一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸。在某些实施方式中，一种或多种标记的核苷酸类型可以包含至少两种不同类型的核苷酸或其修饰物。在某些实施方式中，至少两种类型的核苷酸或其修饰物中的每一种类型可以用不同的隧穿标记物标记。
在某些实施方式中，隧穿标记物可以包含两性离子化合物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以包含核酸序列。在某些实施方式中，核酸序列可以包含大于或等于约10个碱基。在某些实施方式中，核酸序列可以包含双链部分和单链部分。在某些实施方式中，一种或多种标记的核苷酸类型可以包含终止物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到终止物。
在某些实施方式中，隧穿标记物可以被可逆地结合到终止物。在某些实施方式中，至少一个电信号可以以大于或等于约100比1的信噪比被检测。在某些实施方式中，信噪比可以大于或等于约1000比1。在某些实施方式中，至少一个电信号可以被实时检测。在某些实施方式中，试剂可以包含酶。在某些实施方式中，酶可以具有核酸聚合酶活性。在某些实施方式中，酶可以是聚合酶。在某些实施方式中，聚合酶可以包含DNA聚合酶。在某些实施方式中，聚合酶可以包含RNA聚合酶。在某些实施方式中，聚合酶可以被配置在至少两个电极的流体环境中。在某些实施方式中，聚合酶可以被配置在至少两个电极之间的电介质上。在某些实施方式中，聚合酶可以被配置在至少两个电极中的至少一者的表面上。在某些实施方式中，聚合酶可以被配置在至少两个电极的顶部。
在某些实施方式中，聚合酶可以促进一种或多种标记的核苷酸类型中的至少一者结合和/或并入到扩增产物中。在某些实施方式中，试剂可以包含离子。在某些实施方式中，离子可以包含阳离子。在某些实施方式中，阳离子可以包含Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+或其组合。在某些实施方式中，阳离子可以包含催化性阳离子、非催化性阳离子或其组合。在某些实施方式中，间隙可以大于或等于约1纳米(nm)。在某些实施方式中，间隙宽度或间距可以小于或等于约20nm。在某些实施方式中，流动通道具有大于或等于约100nm的深度。
在某些实施方式中，包含电极对的传感器可以具有第一部分和毗邻第一部分并在其下方的第二部分。在某些实施方式中，第一部分可以具有第一宽度，并且第二部分可以具有小于第一宽度的第二宽度。在某些实施方式中，聚合酶可以具有大于所述第二宽度并小于所述第一宽度的尺寸。在某些实施方式中，包含电极对的传感器可以具有倒锥形的横截面形状。
在某些实施方式中，核酸扩增反应可以包含聚合酶链反应(PCR)。在某些实施方式中，核酸扩增反应可以包含链置换扩增(SDA)反应。在某些实施方式中，核酸扩增反应可以包含引物延伸反应。
在某些实施方式中，核酸分子或其一部分的核酸序列可以以至少约90％的准确率被鉴定。在某些实施方式中，准确率可以为至少约95％。在某些实施方式中，核酸分子或其一部分的核酸序列可以在核酸分子的至少约100个连续核酸碱基的跨度上以至少约90％的准确率被鉴定。
在某些实施方式中，系统还可以包括含有传感器的芯片，所述传感器具有衬底。在某些实施方式中，至少两个电极可以被偶联到电路。在某些实施方式中，传感器可以偶联到处理至少一种电信号的电路。在某些实施方式中，芯片可以包含多个传感器，每个传感器包含单独的电极对。在某些实施方式中，芯片可以包含至少约10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、10,000,000,000或超过10,000,000,000个传感器。在某些实施方式中，多个传感器或多组传感器中的每一者可以被独立地寻址。
本公开的另一个方面提供了包含机器可执行代码的非临时性计算机可读介质，所述代码在被一个或多个计算机处理器执行后，实施用于测序核酸分子的方法，所述方法包括：(a)提供包含被流动通道区域内的间隙隔开的至少两个电极的衬底，其中所述衬底是固体；(b)将反应混合物导向至少两个电极，所述反应混合物包含一种或多种标记的核苷酸类型和核酸扩增反应所必需的试剂；(c)在足以产生核酸分子的扩增产物的条件下使至少一部分反应混合物进行核酸扩增反应，所述扩增产物可以包含一种或多种标记的核苷酸类型中的至少一者；(d)使用至少两个电极来检测扩增过程步骤期间的至少一个电信号，其中标记的核苷酸可以被结合在间隙中或扩增产物可以被结合在间隙或可以被引导通过间隙，其中至少一个电信号可以包含隧穿电流；以及(e)在(d)中检测到的电信号的基础上鉴定核酸分子或其一部分的核酸序列。
本公开的另一个方面提供了一种用于测序核酸分子的方法，所述方法包括：(a)提供衬底，所述衬底包含被流动通道区域内的间隙隔开的至少两个电极，其中衬底可以是固体；(b)将包含一种或多种标记的核苷酸类型的核酸分子引导通过电极之间的间隙；(c)使用至少两个电极来检测来自于包括一种或多种标记的核苷酸类型的核酸分子的至少一个电信号，其中至少一个电信号可以包含隧穿电流；以及(d)在(c)中检测到的电信号的基础上鉴定核酸分子或其一部分的核酸序列。
在某些实施方式中，至少一个电信号可以是非法拉第电流。在某些实施方式中，至少一个信号可以包含多个信号。在某些实施方式中，至少一个电信号可以包含隧穿电流。在某些实施方式中，一种或多种标记的核苷酸类型可以用可促进隧穿电流或隧穿和跳跃电流的形成的分子和/或其他组成部分标记。在某些实施方式中，分子和/或其他组成部分可以包含隧穿标记物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸的碱基部分。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸类型的磷酸酯链。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被可逆地结合到一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸类型。在某些实施方式中，一种或多种标记的核苷酸类型可以包含至少两种不同类型的核苷酸或其修饰物。在某些实施方式中，所述至少两种类型的核苷酸或其修饰物中的每一种类型可以用不同的隧穿标记物标记。在某些实施方式中，一种或多种标记的核苷酸类型可以包含终止物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到终止物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被可逆地结合到终止物。
本公开的另一个方面提供了一种用于测序核酸分子的系统，所述系统包含：衬底，所述衬底包含被流动通道区域内的间隙隔开的至少两个电极，其中衬底可以是固体；以及计算机处理器，其可操作偶联到衬底并被编程以：(a)将包含一种或多种标记的核苷酸类型的核酸分子通过所述流动通道导向所述至少两个电极；(b)使用至少两个电极来检测来自于包括一种或多种标记的核苷酸类型的核酸分子的至少一个电信号，其中至少一个电信号可以包含隧穿电流；以及(c)在(b)中检测到的电信号的基础上鉴定的核酸分子或其一部分的核酸序列。
在某些实施方式中，至少一个电信号可以至少部分是非法拉第电流。在某些实施方式中，至少一个信号可以包含多个信号。在某些实施方式中，至少一个电信号可以包含隧穿电流。在某些实施方式中，一种或多种标记的核苷酸类型可以用促进隧穿电流或隧穿和跳跃电流的形成的分子标记。在某些实施方式中，分子可以包含隧穿标记物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸类型的碱基部分。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸类型的磷酸酯链。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被可逆地结合到一种或多种标记的核苷酸类型的给定核苷酸。在某些实施方式中，一种或多种标记的核苷酸类型可以包含至少两种不同类型的核苷酸类型或其修饰物。在某些实施方式中，所述至少两种类型的核苷酸或其修饰物中的每一种类型可以用不同的隧穿标记物标记。在某些实施方式中，一种或多种标记的核苷酸类型可以包含终止物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被结合到终止物。在某些实施方式中，隧穿标记物可以被可逆地结合到终止物。
对于本领域技术人员来说，本公开的其他方面和优点将从下面的详细描述变得显而易见，在下面的描述中仅仅示出并描述了本公开的说明性实施方式。正如将会认识到的，本公开能够执行其他且不同的实施方式，并且它的几个细节能够在各种不同的显而易见的方面进行修改，而全都不背离本公开。因此，附图和描述应该在本质上被当作是说明性的而不是限制性的。
通过引用并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度等同于将每个单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地指明通过引用并入。
附图说明
本发明的新颖特征具体阐述在随附的权利要求书中。通过参考下述阐述了利用本发明原理的说明性实施方式的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在所述附图中：
图1A示出了聚合物的隧穿电导的图；
图1B、1C和1D示出了具有隧穿电导的几种不同的聚合物分子；
图1E示出了DNA链和通过它的隧穿电流；
图1F示出了含有均聚物的DNA序列的电导随长度的变化；
图1G示出了不同的含有GC的DNA序列的电导随长度的变化；
图1H示出了链跳跃隧穿电导通路；
图1I示出了用于合成标记物的方法；
图1J描绘了两性离子分子及其与两个电极的结合；
图1K示出了结合到核苷酸的导电标记物；
图1L、1M、1O和1N示出了用于形成和测量在电极上形成的SAM的密度的方法；
图2A示出了通过与两个电极结合的SAM而结合到两个电极的DNA标记物；
图2B、2C和2D示出了测量过程中的不同步骤；
图2E示出了聚合酶和相关测序方法的过程流程图；
图2F图示了表观遗传测序方法的几个步骤和得到的电流；
图3A-3D示出了制造纳米间隙传感器中的步骤；
图3E-3I示出了使用图3A-3D中示出的方法形成的传感器的SEM和TEM图像；
图3J和3K示出了用于形成纳米间隙传感器的另一种方法；
图3L-3N示出了用于形成纳米间隙传感器的另一种方法；
图3O-3V示出了用于形成纳米间隙传感器的另一种方法；
图3W描绘了具有较窄纳米间隙的纳米间隙传感器；
图3X示意描绘了集成传感器单元电路的简化原理图；
图3Y示出了具有用于传感器阵列的多个流体通路和相关电路的芯片；并且
图4示出了通用发夹引物。
具体实施方式
尽管在本文中已示出并描述了本发明的各种不同实施方式，但对于本领域技术人员来说，显然这些实施方式仅仅作为实例被提供。对于本领域技术人员来说，可以进行大量变动、改变和替换，而不背离本发明。应该理解，可以使用本文描述的发明的实施方式的各种不同替选方案。
本公开提供了与生物分子测序例如多核苷酸测序相关的系统和方法，以及隧穿标记物用于其他目的的用途，包括生物分子的检测和定量。示例性的系统和/或方法可以包括在由一对电极形成的间隙内测量来自于多核苷酸合成的隧穿电流并识别与每个碱基相关的隧穿信号。
当在本文中使用时，术语“间隙”通常是指在材料中或电极之间形成的或以其他方式提供的体积、空间、孔眼、通道或通路。所述材料可以是固态材料例如衬底，或者可以由衬底上形成的不同层形成。间隙可以被配置成邻近或接近传感电路或偶联到传感电路的电极。在某些实例中，间隙可以具有0.1纳米(nm)至约1,000nm量级的特征性宽度或直径。具有纳米量级宽度的间隙可以被称为“纳米间隙”。在某些情况下，纳米间隙可能具有可以为约0.1纳米(nm)至约50nm、0.5nm至30nm、或0.5nm至10nm、0.5nm至5nm、或0.5nm至2nm、5至30nm、10nm至20nm、5nm至20nm、15nm至25nm或不超过约2nm、1nm、0.9nm、0.8nm、0.7nm、0.6nm或0.5nm的宽度或间距。在某些情况下，纳米间隙具有至少约0.5nm、0.6nm、0.7nm、0.8nm、0.9nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、7.5nm、10nm、15nm、20nm、30nm或超过30nm的宽度。在某些情况下，纳米间隙的宽度或间距可以大于在测序反应中使用的生物分子的直径，或者可以小于样品生物分子或样品生物分子的子单位(例如单体)的直径。
当在本文中使用时，术语“生物分子”或“生物聚合物”通常是指可以根据横跨纳米间隙电极的电参数(例如电流、电压、差分阻抗、隧穿电流、隧穿和/或跳跃电流、电阻、电容和/或电导)来查问(interrogate)的任何生物材料。生物分子可以是核酸分子、蛋白质或碳水化合物。生物分子可以包括一个或多个子单位例如核苷酸或氨基酸。
当在本文中使用时，术语“核酸”通常是指包含一个或多个核酸子单位的分子。核酸可以包括选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)、脱碱基(abasic base)或其变体的一个或多个子单位，包括例如任何天然存在的或非天然存在的(例如修饰或工程化改造的)、表观遗传修饰的碱基，其可以偶联有脱氧核糖、核糖、PNA(蛋白核酸)、L-DNA、锁核酸或任何其他标准或非标准的聚合物骨架。核苷酸可以包括A、C、G、T或U或其变体。核苷酸可以包括可以并入到正在生长的核酸链中的任何子单位。核苷酸可以包括可以结合到正在生长的核酸链但不并入其中的任何子单位。这些子单位可以是A、C、G、T或U，或对一个或多个互补的A、C、G、T或U具有特异性或与嘌呤(即A或G或其变体)或嘧啶(即C、T或U或其变体)互补的任何其他子单位。子单位可以使得能够分辨单个核酸碱基或碱基组(例如AA、TA、AT、GC、CG、CT、TC、GT、TG、AC、CA或其尿嘧啶-对应物)。在某些实例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其衍生物。核酸可以是单链或双链或部分单链和部分双链的，可以具有多个单链部分，并且可以具有多个双链部分。
当在本文中使用时，术语“蛋白质”通常是指具有一个或多个氨基酸单体、子单元或残基的生物分子或大分子，或者可以是指大分子的复合物，其中各个大分子可以具有一个或多个氨基酸单体、子单元或残基。含有例如50个或更少氨基酸的蛋白质可以被称为“肽”。氨基酸单体可以选自任何天然存在和/或合成的氨基酸单体，例如20、21或22种天然存在的氨基酸。在某些情况下，20种氨基酸被编码在对象的遗传密码中。某些蛋白质可以包含选自约500种天然和非天然存在的氨基酸的氨基酸。在某些情况下，蛋白质可以包含选自异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸的一种或多种氨基酸。
当在本文中使用时，术语“相邻的”或“邻近”包括“紧靠”“毗邻”“与……相接触”和“接近”。在某些情况下，邻近的组件被一个或多个居间层(intervening layer)彼此分隔开。例如，所述一个或多个居间层可以具有小于约10微米、1微米、500纳米(“nm”)、100nm、50nm、10nm、1nm或更小的厚度。在一个实例中，当第一层与第二层直接接触时，所述第一层邻近所述第二层。在另一个实例中，当第一层与第二层被第三层隔开时，所述第一层邻近所述第二层。
当在本文中使用时，术语“隧穿”通常是指粒子例如电子穿过所述粒子没有足够能量来克服的势垒的移动。这可能与标准的电导相反，在标准电导中粒子可以具有足够的能量来克服任何能垒。
当在本文中使用时，术语“隧穿标记物”通常是指组成部分(例如化合物、分子、粒子及其组合)，其可以促进电子或空穴在所述组成部分内或穿过所述组成部分或在一个或多个电极与所述组成部分之间的隧穿。在某些情况下，隧穿可以作为隧穿和/或跳跃电流来测量。
当在本文中使用时，术语“隧穿电流”通常是指与电子或空穴在施加有电压(例如偏压)的两个电极之间的隧穿相关的电流信号。所述隧穿可以进、出或穿过隧穿标记物或其任何组合。在某些情况下，隧穿可以与其中可以发生跳跃的传导通路的部分合并。
当在本文中使用时，术语“同步化学方法”通常是指其中循环时间确定的方法。同步化学方法可以只需要单次测量，因为用于适合的测量的时间可以是已知的，并且可以不需要多次测量来保证做出适合的测量。
当在本文中使用时，术语“非同步化学方法”通常是指其中循环时间不确定并且可能变化的方法。非同步化学方法可以特别需要多次测量，因为不可能确定何时可能需要进行测量，因此为了保证可以做出所需的测量，在一段时间内进行大量测量可以是必要的。
当在本文中使用时，术语“粘附末端(stuck end)”可以包含核酸序列，其可以是SAM的一部分并且可以至少部分是单链的，使得它可以结合或杂交到互补或至少部分互补的核酸，所述后一种核酸可以包含隧穿标记物的一部分，并且在可以与粘附末端互补的区域中可以至少部分是单链的。
当在本文中使用时，术语“粘性末端(sticky end)”通常是指核酸序列，其可以包含隧穿标记物的一部分，在可以与粘附末端互补并因此可以结合或杂交到粘附末端的区域中可以至少部分是单链的。
当在本文中使用时，术语“后填充物”通常是指SAM的名义上生物惰性的部分，因此它可以不与核酸例如样品核酸、可能包含标记物的一部分的核酸、核苷酸、蛋白质包括酶或其他生物分子结合或相互作用，并且可以被结合作为SAM的一部分来阻止生物分子与结合有SAM的表面之间的相互作用。
当在本文中使用时，术语“跳读方法”通常是指一种测序方法，其中可以将同步化学方法使用多个循环然后暂停，随后可以将非同步化学方法使用一段时间然后暂停，并且然后可以将同步化学方法使用多个循环。在其中使用所述非同步化学方法的时间可以被认为是“跳读期”。在使用非同步化学的一段时间内可以不进行测量。
当在本文中使用时，术语“物理阻断物”通常是指结合到第二组成部分的第一组成部分，其中所述第一组成部分是用作测量过程的一部分的组成部分，并且所述第二组成部分的大小使得第一组成部分可以根据第二组成部分的大小彼此分隔开。物理阻断物可用于允许第一组成部分相对于传感器单独定位，或者可用于将第一组成部分以相对规则的间距分隔开，所述间距可以大于在不存在第二组成部分的情况下第一组成部分原本可以被隔开的间距。因此，第二组成部分可以被当作是物理阻断物。
当在本文中使用时，术语“被查问碱基”通常是指一个碱基，其可以是不具有作为延伸引物的一部分被并入的互补碱基的第一个碱基，并且与将被聚合酶或其他酶并入的下一个碱基互补。因此，被并入的碱基可以是从具有作为延伸引物的一部分的互补碱基并且也可以被结合在酶例如聚合酶的活性位点处的最后一个碱基起在5'方向上的一个碱基。
当用于核苷酸的直接测量以用于多核苷酸测序时，量子隧穿装置可以存在几个问题。
在单分子测序中的另一个可能问题是器件生产，找到制造在芯片上具有数百万个或更多器件的大规模并行测序仪的方法。这可能对纳米器件提出极大的工艺和技术挑战。然后，出于例如全基因组单分子测序的目的，这可以是必需的。
例如，荧光分子可以产生～6000个光子，但仅有少部分(～10％)的光子可以被转换成电子。在某些情况下，背景引起的噪音意味着需要使用许多荧光分子才能获得足够的信噪比(S/N)。即使使用许多荧光分子，染料浓度可能也是低的，并且可能需要非常高的辐照度(光子/秒/单位面积)，这通常导致昂贵的激光照射系统。
pH检测可以也需要大量分子来产生信号。现有的系统可能需要超过100,000个分子才能获得足够的信噪比。
隧穿标记物
正如本文中提供的，隧穿标记物可以是下述化合物，隧穿电流可以通过所述化合物以低背景水平从单一聚合物分子提供大量电子。例如，在1秒内，1nA电流可以产生6.2M个电子。在5pA背景存在下，这可以产生>1000:1的散粒噪声极限S/N水平。
在某些情况下，隧穿标记物可以提供对应于小于10-11、10-11至10-10、10-10至10-9、10-9至10-8或10-8至10-7或更大西门子的电导的电流。因此，使用例如低于10mV、10mV至100mV、100mV至250mV或高于250mV的标称偏压，可以产生显著的电流，使得散粒噪声在许多系统中可以被认为是无关紧要的。
作为例如相干或不相干隧穿、不相干热诱导跳跃或其组合的结果，隧穿标记物可以导电。相反，更标准的导电通路不涉及隧穿的使用，不论是相干还是不相干的隧穿。在某些情况下，隧穿通路可以具有式R＝R0 e(βL)的电阻，其中L是电子、空穴或电流可以通过的隧穿通路的长度，β可以是依赖于分子和条件的常数，所述条件例如分子的水合；具有这种隧穿通路的分子的实例示出在图1A和1B中。在某些情况下，通过隧穿标记物的导电通路可以至少部分来自于跳跃电流。所述通路的发生跳跃的部分可以具有式R＝R0+αL＝R0+α∞Le(Ea/kT)的电阻，其中L是电子或电流可以通过的隧穿通路的长度，Ea是活化能，k是玻尔兹曼常数，并且T是温度。这些电流可能起因于电子或空穴通过隧穿标记物的数次相对小的运动，由此形成通过隧穿标记物的较长部分的电流。所述跳跃电流部分可以是或不是热依赖性的。所述隧穿电流部分可以是或不是温度依赖性的。在某些情况下，可以是相干或不相干的隧穿与跳跃两者，可以通过隧穿标记物的单个部分发生。
在某些情况下，隧穿可以作为π电子轨道或堆叠的π电子轨道的结果而出现。例如，作为存在交叠π电子轨道的结果可以帮助隧穿，正如双链DNA所发生的。其中交叠电子轨道可能以对隧穿有用的方式出现的其他结构包括苯环和其他类似的结构，例如在这些结构可以形成sp2杂化轨道或pz轨道之处。
如图1E中所示，隧穿电流可以在两个电极107A与107B之间通过，可以隧穿经过或通过接头109A和109B，并且可以隧穿或跳跃通过碱基的堆叠的π电子轨道，产生通过π轨道111的沿着核酸聚合物的长度的电流通路。所述电子的共享可以影响电子轨道的能级，例如作为这种共享的结果最高占据分子轨道(HOMO)能级可以提高，这可以允许所述共享轨道能级与电极能级之间更好的匹配，从而允许更高的电导和电流水平。
在某些情况下，隧穿标记物的长度可以使得代替主要发生通过隧穿标记物的隧穿，可以主要发生通过隧穿标记物的跳跃；这种情况的一些实例可以是在均聚物核酸、特别是G和A碱基中，它们可以具有更好的π轨道交叠。这种转变可以引起电导从主要具有反指数函数变为主要具有反线性函数。这种转变可以发生在均聚物A碱基对中当A均聚物序列的长度达到约3个碱基对时，如图1F中所示并且如Griese等人在Nature 2001,412 318中所描述，所述文献通过引用以整体并入本文。类似地，GC重复序列随着碱基对的GC对数目的增加可以主要具有跳跃导电，如图1G中所示并且如Xiang等人在Nature Chemistry2015 7 221中所描述，所述文献通过引用以整体并入本文，在所述图中，X轴是GC碱基对的数目，实心方框的是GC重复序列，三角形是G和C的重复均聚物，Y轴是兆欧姆。图1H示出了通过GC重复序列的电导通路。
在某些情况下，隧穿标记物可以包含聚合物，例如寡聚物。所述聚合物的非限制性实例可以包括寡聚噻吩、寡聚亚苯基亚胺、电子供体和电子受体例如分别为四硫富瓦烯和均苯四甲酸二酰亚胺的组合、碳纳米带、类胡萝卜素、烷烃、二苯乙炔类、寡肽、寡聚卟啉、苝四甲酸二酰亚胺、富勒烯、碳纳米管、单壁纳米管、石墨烯纳米带、不同类型的核酸、双链体核酸、三链体核酸或四链体核酸或其组合(例如串联组合、并联组合或串并联组合由此形成嵌合体)。
在某些实施方式中，取决于例如隧穿标记物的至少一部分的取向，所述标记物可以具有对称或不对称电导。在某些情况下，电导的对称性或不对称性可用于确定标记物的取向。
隧穿标记物的类型或构造可以显著影响所述隧穿标记物的电导。例如，如图1A中所示，描绘了不同聚合物类型的长度(单位为埃)与其电导(单位为西门子)的对应关系，并且潜在隧穿标记物的结构示出在图1B和1C中，其中101A示出了烷烃的各种不同长度和相关的电导，101B示出了烷烃的结构；102A类似地示出了寡肽的各种不同长度和相关的电导，102B示出了示例性寡肽的结构；103A类似地示出了类胡萝卜素聚合物的各种不同长度和相关的电导，103B示出了示例性类胡萝卜素聚合物的结构；104A类似地示出了寡聚噻吩的各种不同长度和相关的电导，104B示出了示例性寡聚噻吩的结构。图1C中示出了可能具有对称电导的9,10-二(2'-(对乙酰基巯基苯基)乙炔基)-蒽105和可能具有不对称电导的2,5-二(2'-(对乙酰基巯基苯基)乙炔基)-4-硝基-乙酰苯胺106的化学结构实例。在某些情况下，用作单一分子或有机晶体管的一部分的任何分子可能都适合用作隧穿标记物的至少一部分。
在某些情况下，金属可以被结合到聚合物的一部分，例如在如图1D中所示的卟啉的情形中，其中描绘了四苯基卟啉的化学结构。其他螯合分子例如血红素和二茂铁可用于结合金属离子，使得一个或多个金属离子可以构成隧穿标记物的一部分。
在某些情况下，隧穿标记物可以包含金属例如金属纳米粒子、纳米珠、纳米杆或任何其他形状的金属。在某些情况下，可以将聚合物例如核酸结合到纳米珠，并且所述核酸聚合物可以至少部分地与可以结合到传感器的电极上的核酸互补，使得所述核酸可以杂交，将所述纳米珠结合到所述传感器的电极。在某些情况下，可以使用夹心测定法来结合金属纳米粒子，其中靶核酸可以至少部分地与结合到至少一个电极并结合到所述金属纳米粒子的相应核酸互补，由此结合所述金属纳米粒子并在具有自由电子的导体之间提供隧穿和/或跳跃通路。在某些情况下，可以使用例如由Baigl等人在WO2008/035787中描述的技术将核酸链金属化，所述文献通过引用以整体并入本文。在某些情况下，这种金属化处理可以应用到核酸的可包含隧穿标记物部分的双链部分，而单链部分可以在核酸末端处，允许通过隧穿标记物的杂交进行结合。在某些情况下，使用例如化学计量方法，只有标记物的一些部分可以被金属化。在某些情况下，标记物可以包含寡核苷酸，并且某些所述寡核苷酸可以被金属化。所述标记物的剩余部分可以包含寡核苷酸或其他导电聚合物或金属粒子，并且可以使用连接、点击化学或其他共价或非共价结合技术被结合。
在某些情况下，寡核苷酸可以包含标记物的一部分。寡核苷酸可以使用各种不同的寡核苷酸合成方法来形成。在某些实例中，对于长的G均聚物或具有高GC含量的寡核苷酸来说，寡核苷酸合成可能是困难的。在这些情况下，寡核苷酸可以使用寡核苷酸合成和连接方法的组合来形成，允许获得比在仅仅使用寡核苷酸合成技术时可能获得的得率更高的得率。
隧穿标记物可以包含聚合物。所述聚合物可以使用任何适合的结合机制例如通过硫醇、二硫化物、胺、二胺或任何其他适合的结合组成部分结合到所述标记物中包含的金属粒子。聚合物可以是有助于提供隧穿和/或跳跃电导通路的任何类型的聚合物。聚合物可以包含核酸分子(例如聚合物)。核酸分子可以与可与电极缔合(例如结合到电极)的一个或多个核酸分子(例如聚合物)互补和/或部分互补。这可以允许比在所述核酸分子之间没有杂交结合的情况下所出现的隧穿电流更高的隧穿电流。
在某些情况下，可以将多个结合组成部分和/或不结合的组成部分结合到金属，例如金属纳米粒子、纳米珠、纳米杆或其他形状的金属。
在某些情况下，与核苷碱基缔合的标记物可以根据特定核酸聚合物隧穿标记物化合物的序列和/或长度，对不同的碱基类型使用不同的标记物。与特定隧穿标记物化合物相关的隧穿电流可以随着DNA的长度和AT含量的增加而减小。在某些情况下，可以使用富含GC的序列。富含GC的序列可以具有不同量级的G和C碱基，使得可以通过隧穿标记物化合物的电子或空穴可以利用不同量级的隧穿和/或跳跃。在某些情况下，可以使用富含AT的序列。在其他实施方式中，可以使用富含AT和富含GC的区段的混合物。
在某些情况下，标记物可以至少部分由G四链体(quadruplex)制成。例如，G均聚物的末端可以不是G均聚物，并因此可以不以四聚体方式结合，并且可以可用于结合到SAM，所述SAM可以包含与G四链体的不以四聚体方式结合的部分互补的DNA序列，并且可以结合到电极。
在某些情况下，在隧穿标记物中可以使用一个或多个错配或缺失碱基。错配或缺失碱基可以使用在其中隧穿标记物可以结合到自组装单层(SAM)的区域中。在某些情况下，错配或缺失碱基可以在隧穿标记物的至少一部分内，在所述部分中在与SAM发生任何相互作用之前隧穿标记物可以是双链的。在某些情况下，一个或多个脱碱基碱基或非天然核苷碱基可以以与碱基错配相似的方式被使用。在某些情况下，可以使用脱碱基、非天然碱基、天然存在的非标准碱基例如甲基化的C碱基、甲基化的A碱基或任何其他类型的天然存在或合成的核苷碱基及其修饰物中的一者或多者。
在某些情况下，修饰的碱基可以至少部分包含修饰的腺嘌呤。所述修饰的腺嘌呤可以在第7位具有从氮到C-H基团的替换，由此形成7-去氮杂腺嘌呤。以这种方式修饰的腺嘌呤的碱基配对可以不受影响，并且相关的隧穿电流可以增加(可能到与鸟嘌呤几乎相同的电流水平)。在某些情况下，鸟嘌呤核苷碱基可以以类似的方式修饰。修饰的鸟嘌呤可以潜在地从天然鸟嘌呤的隧穿电流增加隧穿电流，并且使用富含修饰的GC的隧穿标记物化合物，可以能够实现高得多的隧穿电流。
隧穿标记物(例如隧穿标记物化合物)可以包含双链核酸、单链核酸或其组合。在某些实例中，隧穿标记物包含部分双链和部分单链的核酸，其中所述核酸链可以具有两个“粘性末端”，其中粘性末端可以包含所述核酸的延伸超过标记物的双链区的3’或5’末端或两个单链区段，其中互补对的两条链可以延伸超过所述互补区段。在其他实施方式中，隧穿化合物可以具有单个较长的链，其延伸超过较短双链区段的两个末端，使得所述单个较长的链可以与电极对的两个电极上的自组装单层相互作用。
在某些情况下，可以使用锁核酸(LNA)和/或肽核酸(PNA)作为隧穿标记物的一部分，以便能够实现可以对任何靶ssDNA具有较低结合的较短的互补SAM。在某些情况下，包含SAM的互补部分和隧穿标记物的核酸可以至少部分包含左手螺旋DNA(L-DNA)，使得在所述SAM与隧穿标记物化合物之间可以发生杂交，而所述SAM由于相反的螺旋旋转而不能结合到靶ssDNA链。在某些情况下，可以使用锁DNA和L-DNA的组合来阻止靶ssDNA的结合，同时能够在所述SAM和隧穿标记物化合物上实现短的互补区。
在某些情况下，树枝状聚合物可以用作标记物和/或用作粘附末端。树枝状聚合物结构可以提供大量同时可替选的途径，允许单个树枝状聚合物结构有效减少可能由电极的晶体结构差异引起的变动和可能由此引起的电流变动。树枝状聚合物的多样化性质可以产生通用的隧穿/跳跃标记物，其可以以许多方式并通过许多位点结合到SAM。树枝状聚合物结构可以包含相同或不同的核酸序列。在某些情况下，树枝状聚合物的至少一部分(例如至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、805、85％、90％、95％或更多)包含相同或相近的核酸序列。在某些情况下，树枝状聚合物的至少一部分(例如至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、805、85％、90％、95％或更多)具有不同的序列。
在某些情况下，相同的树枝状聚合物组成部分可以用作所有核苷酸碱基的标记物。在某些情况下，可以使含有不同核苷酸碱基的流体进入流动池，使得与聚合酶的相互作用可以结合所述核苷酸作为测序循环中的子循环。可以使含有不同碱基的流体进入流动池，使得与聚合酶的相互作用可以为每个循环顺序结合具有相同树枝状聚合物标记物的核苷酸。在某些情况下，在子循环后，可以除去含有核苷酸碱基的流体，并且可以引入清洗缓冲液以分离不同类型的核苷碱基，并且可以使包含相同类型的树枝状聚合物标记物的含有不同核苷酸碱基的流体进入所述流动池，以使与聚合酶的相互作用可以结合标记的核苷碱基。因此，可以从通过由偏压引起的穿过所述树枝状聚合物的隧穿/跳跃电流检测到的核苷酸结合的模式，来确定样品核酸序列。
在某些情况下，单个标记物或具有多个标记物的树枝状聚合物结构也可以包含结合到所述单一结构的多个核苷酸。在某些情况下，所述多个核苷酸可以是相同类型的核苷碱基；在其他情况下不同的核苷酸可以包含不同类型的核苷碱基。在其他情况下，所述树枝状聚合物结构可以包含单一类型的标记物；在其他情况下，所述树枝状聚合物结构可以包含不同类型的标记物。在其中可能需要大量不同的结合组成部分的某些情况下，例如在试验大量不同类型的非标准或表观遗传修饰的核苷碱基时，可以通过可以结合树枝状聚合物结构的不同标记物的组合作为识别码，来识别所述树枝状聚合物结构。
在某些情况下，标记物和/或用于杂交或结合隧穿标记物以便提高通过隧穿标记物的隧穿电流的SAM，可以包含天然的未修饰的核苷碱基。在某些情况下，使用修饰的碱基(例如天然存在的碱基或非天然存在的碱基)。在某些情况下，骨架可以包含天然存在的带有核糖的磷酸酯骨架。在某些情况下，可以使用非天然存在的修饰例如硫修饰或任何其他修饰，包括通过例如使用PNA代替核糖或通过用不带电荷的基团代替磷酸酯上的OH基团来除去与所述骨架相关的电荷。也可以使用任何其他骨架修饰，例如用于适体的修饰，例如异种核酸(xeno nucleic acid)(XNA)骨架、L-DNA、锁DNA或A型DNA。
在某些情况下，为了改变标记物的电导，可以使用不同的溶剂条件。例如，在完全或主要为水性的溶剂中时可以具有B形式的标记物，在溶剂条件改变后可以采取A形式。例如，添加醇类例如乙醇或异丙醇可以引起所述标记物变为更短的更紧凑的结构，其中所述碱基可以主要不是相互垂直的，而可以是略微偏移(offset)。在这种B形式中，与标记物序列相关的电导可以高于所述标记物序列处于A形式下的情况，特别是当所述标记物序列不具有主要规则的序列例如GCGC或均聚物AAAA时。在某些情况下，采取从B形式修饰的形式的标记物可以与所述标记物序列处于B形式下的情况相比具有更高的跳跃水平。尽管在主要是B形式下，电导可以按主要是隧穿的方式通过所述标记物发生，但在非B形式例如A形式中，标记物电导可以主要通过跳跃方式发生。在某些情况下，标记物可以采取Z形式。不同形式之间的差异可以通过几种方式来表征，包括例如螺旋的直径(标准的B形式为20埃，A形式为23埃，Z形式为18埃)、每个碱基对的上升(标准的B形式为3.32埃，A形式为2.3埃，Z形式为3.8埃)、每一转或每一轮的碱基对数目(标准的B形式为10.5个碱基对，A形式为11个碱基对，Z形式为12个碱基对)和各种不同的其他特征。当所述不同特征中的一种或多种小于或等于对具体特征来说所述不同形式之间的差异的约50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％或更小时，聚合物可以被描述为主要采取一种形式。例如，在特定溶剂条件下的核酸链，当每个碱基对的上升大于2.81埃并小于3.56埃，因此大于A形式与B形式之间的差的一半并小于Z形式与B形式之间的差的一半时，可以被认为是主要采取B形式。
在某些情况下，可以使用核糖核苷酸。所述核糖核苷酸可以主要采取A形式。所述核糖核苷酸可以允许标记物序列具有更高电导率，所述标记物序列可以是可变的，可能是显著可变的，同时允许所述标记物在水性或主要是水性的溶剂中采取A形式。
在某些情况下，为了容许与杂交的标记物和SAM的更紧密和/或更均匀的结合和/或标记物内结合相关的更均匀和更高的电导，可以使用修饰的碱基。所述修饰的碱基可以具有更强或更弱的结合。修饰的碱基可以以下述模式使用，即作为所述SAM的“粘附末端”和/或所述标记物的“粘性末端”和/或在标记物和/或粘附末端的可以是双链部分的部分的末端处的碱基的一部分，使得磨损(fraying)的发生频率可以比名义上均匀的结合更低，并且可以将电导维持在较高平均值直至发生变性。
在某些情况下，隧穿标记物的一部分或多个部分可以包含三链体或四链体形式的核苷碱基聚合物，例如通过在单一链中具有4个彼此相对邻近的三聚体均聚物鸟嘌呤区域而天然形成的，由此Hoogsteen碱基配对将所述鸟嘌呤碱基结合成四链体，并且可以比标准的双链体结合更加稳定地做到这一点。这种复合体可以包含单一链、两条链、三条链或四条链。作为额外的π结合的结果，四链体复合体可以具有比天然双链体更高的电导率。
在其他情况下，可以使用7-脱氮杂鸟嘌呤碱基来防止不想要的或不利的四链体形成。在可能不希望四链体形成的情况下，可以使用7-脱氮杂腺嘌呤碱基，其中7-脱氮杂腺嘌呤碱基的隧穿电导率可以远高于标准腺嘌呤碱基的电导率，并且也可用于阻止原本可能在鸟嘌呤碱基之间发生的Hoogsteen结合。
在某些情况下，修饰的碱基可以用作隧穿标记物和/或核苷碱基组的一部分，用于确定样品碱基和/或对样品碱基的修饰。修饰的碱基的非限制性实例包括5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺苷、N3-甲基腺苷、N7-甲基鸟苷、5-羟基甲基胞嘧啶、假尿苷、硫代尿苷、异鸟苷、异胞嘧啶、二氢尿苷、Q苷、怀俄苷、肌苷、三唑、二氨基嘌呤、β-D-吡喃葡萄糖基氧基甲基尿嘧啶、8-酮基鸟苷或2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-甲基鸟苷或2'-O-甲基尿苷、已知的140种表观遗传RNA修饰中的任一种、或其组合。
在某些情况下，例如作为使用PNA或其他不带电荷的寡核苷酸或锁DNA的结果，用于与结合到酶或聚合酶的寡核苷酸杂交的寡核苷酸可以具有更长的长度或更紧密的结合。与隧穿标记物和作为旨在提高隧穿标记物的隧穿电流的SAM的一部分结合的寡核苷酸之间的杂交相比，结合到酶或聚合酶的寡核苷酸的杂交可以在更高温度下退火。
在某些情况下，隧穿电导标记物可以包含四链体核酸聚合物。四链体核酸聚合物可以由1、2、3或4种核酸聚合物形成。四链体核酸聚合物可以使用鸟苷碱基或天然存在的表观遗传修饰的核苷酸或非天然存在的核苷酸的Hoogsteen结合来形成，以便形成高电导标记物，其具有的电导可以比双链体核酸聚合物更高。在某些情况下，可以使用多个四链体标记物。四链体标记物可以与双链体标记物和/或其他类型的标记物组合使用。四链体标记物可以被构造成具有粘性末端。粘性末端可以能够使标记物与结合到电极对的电极的SAM结合。粘性末端可以被进一步构造成具有接头，所述接头被结合到将要测试结合和/或动力学行为的核苷酸。
在某些情况下，隧穿标记物可以被结合到核苷碱基的5’磷酸酯链。标记物可以通过PEG或烷烃接头或其他适合的柔性链结合，所述柔性链可以是如图1K中所示的标记物与核苷碱基之间的嵌合链，在所述图中示出了三磷酸酯，尽管可以使用其他长度的磷酸酯链，或者如后文中所述可以使用其他链。在某些情况下，标记物可以结合到核苷碱基的3'位置。标记物可以通过可切割的接头结合，所述接头可以是可光切割或可化学切割的接头。可切割的接头可以留下结合到酶复合体的标记物，直至标记物被故意除去。
在某些情况下，标记物可以被结合到核苷碱基，所述核苷碱基可以被酶结合。酶可以包含聚合酶。不被酶结合的其他标记物和相关的核苷碱基可以被除去。标记物可以被结合到SAM。核苷碱基可以被掺入，并因此可以在核苷碱基和与其缔合的标记物之间切开接头。然后可以测量此时仍被所述SAM结合的标记物，从而允许在切割后利用标记物向靶核酸链的定位进行测量。
在某些情况下，其中所需标记物的合成可能是困难的，特别是当与结合相组合时，所述结合可以是接头与所需核苷酸的共价结合，此时标记物可以由几个部分构造并由此组装而不是作为一个整体被合成。如图1I中所示，可以具有接头121的主要核心寡核苷酸120，可以与未结合的寡核苷酸123A和122B组合，所述未结合的寡核苷酸123A和122B可以与核心寡核苷酸120的部分和粘附末端124A和124B互补。以前游离但现在被连接的寡核苷酸122A和123B，现在可以使用连接被结合到核心寡核苷酸120以形成一个或多个完整的标记物，其中所需核苷酸可以在连接前或连接后已被结合到接头121的末端。
在某些情况下，标记物可以设定为固定的电导比，其可以在线性空间、对数空间或指数空间中处于设定电导比下。在某些情况下，标记物电导之差可以被设定为背景噪音水平的函数。例如，电导水平的间隔可以被设定为用确定的电导水平卷积的噪音水平的函数，使得电导分布的交叠可以对应于不同标记物之间的所需交叠。
在某些情况下，噪音水平可以包括未被聚合酶复合体结合的扩散的核苷酸的动力学。在某些情况下，噪音水平可以包含未被聚合酶复合体结合的核苷酸的粘性末端与可能结合到电极对的电极的SAM的粘附末端的相关结合。在某些情况下，噪音水平可以被扩散和粘性末端与高度导电的标记物的粘附末端的相关结合主导。这可能需要导电性最低的标记物与导电性第二低的标记物在电导上显著分离。在某些情况下，标记物的两个粘性末端可以包含相同的序列，而在其他情况下，标记物的两个粘性末端可以包含不同的序列。
在某些情况下，可以包括接头和核苷碱基的分子的标记物部分，可以被选择为一侧带有正电荷、另一侧带有负电荷的两性离子化合物。在某些情况下，分子的标记物部分可以具有净负电荷、净正电荷或净中性电荷。在某些情况下，所述标记物部分可以具有两个末端，其各自分别具有净负电荷和净正电荷。所述带有净正电荷和净负电荷的末端可以各自被吸引到不同电极，如图1J中所示，其中在两个电极之间示出了两性离子标记物，其中所述两性离子标记物的带有不同电荷的末端可以被吸引到具有不同电位的两个不同电极。在某些情况下，标记物可以具有净中性电荷。例如，当标记物可以使用PNA碱基或通过对连接性磷酸酯基团进行修饰以使所述磷酸酯基团不带电荷来形成的时候。
在某些情况下，标记物部分可以具有比电极间隙或结合位置略长的尺寸。例如，在分子的标记物部分的相反末端处具有不同净电荷的两性离子或类似分子，可以跨过隧穿间隙伸展，并且在施加电场时可以制造向所述两个电极的隧穿连接。
其他类型的标记物的使用
在某些情况下，可以使用荧光标记物以例如检测结合的动力学。荧光标记物可以使用下述系统来检测，所述系统可以包含零模波导纳米孔、TIRF检测器或通过纳米孔定位的荧光团的检测。荧光团可以在进入纳米孔之前在纳米孔结构的顺侧被检测。在某些情况下，荧光团在刚刚离开后在纳米孔结构的反侧被检测。在这些情况下，聚合酶可以被固定结合到零模波导或纳米孔，使得作为结合的结果可以观察到核苷酸的瞬时结合。可以将不同颜色或波长的荧光标记物缔合到一组核苷酸中的不同核苷酸，从而允许如上文对隧穿和/或跳跃标记物所描述的在不同核苷酸之间进行区分。
在某些情况下，可以使用电荷阻挡标记物。可以使用电荷阻挡标记物，使得在被酶结合期间，作为电荷阻挡标记物存在的结果，通过纳米孔的电流差减小。酶可以是聚合酶。聚合酶可以被固定性地或瞬时性地结合到纳米孔。不同尺寸的电荷标记物可以与一组核苷酸中的不同核苷酸缔合，从而允许如上文对隧穿和/或跳跃标记物所描述的在核苷酸类型之间进行区分。
在某些情况下，可以使用电化学标记物。可以使用电化学标记物，使得作为在电极对的两个不同电极处的氧化和还原的结果，被结合的核苷酸可以产生电流，所述电极对可以被维持在适合于所述氧化和还原的电压下。在某些情况下，相同的电化学标记物可用于超过一种类型的核苷酸。作为例如不同核苷酸的不同扩散速率的结果，扩散的差异可以导致对所述不同核苷酸类型来说产生不同的平均电流。不同的扩散速率可以由将相同的电化学标记物与不同的附加组成部分结合产生。不同的附加组成部分可以是电化学上无活性的。不同的附加组成部分可以减缓电化学标记物的扩散，所述电化学标记物可以与核苷酸连接。
在某些情况下，可以使用不同的电化学标记物，并且可以在不同时间测量测量与电极对相关的电流。对于一个或两个电极来说，可以使用相对于本体溶液电位的不同电位，使得可以使用与不同电极对相关的电流来区分不同的电化学标记物。
在某些情况下，可以使用超过一个电极对。超过一个电极对可以与酶结合位点缔合，使得超过一组电极对可以被标记的核苷酸接近。标记的核苷酸(例如与核苷酸结合的标记物)可以被酶结合。不同电极对可以具有相对于本体溶液处于不同电位下的一个或两个电极，使得可以使用与不同电极对相关的电流来区分不同的电化学标记物。
在某些情况下，可以使用多组不同电极的组合，使得可以使用与不同电极对相关的电流来区分不同的电化学标记物。可以具有相同电化学标记物的不同核苷酸可以进一步包含一个或多个附加组成部分例如蛋白质。所述一个或多个附加组成部分可以相同或者可以不同。在某些情况下，一个或多个附加组成部分可以不同，使得相同的电化学标记物可以具有不同的扩散速率以及因此不同的电流。
在某些情况下，单个标记物分子可以包含通过接头结合的一个核苷碱基。在某些情况下，单个标记物分子可以包含通过一个或多个接头结合到单个标记物的多个核苷碱基。在某些情况下，所有所述多个核苷碱基可以是相同类型的核苷碱基。在某些情况下，某些所述多个碱基可以包含不同类型的碱基。不同类型的碱基可以包含不同类型的核苷碱基例如腺苷或鸟苷，或者可以是修饰的核苷碱基，例如表观遗传修饰或任何其他类型的修饰，包括骨架修饰。在某些情况下，单个标记物分子可以包含一个或多个核苷碱基和一个或多个标记物，其中标记物可以相同或者可以不同，可能具有不同的结合机制，可能具有不同的结合动力学或不同的电导。
在多个标记物可以结合在一起并与一个或多个核苷碱基结合的情况下，系统可以被构造成使得结合的动力学相对于系统的电流测量能力来说可以是慢的，并且至少一部分(例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多)的所述标记物可以作为所述动力学和/或电导的结果被鉴定。标记物可以具有不同的电导和/或不同的结合动力学。在某些情况下，对于每种标记物来说，可以鉴定一些或全部的标记物。在某些情况下，作为标记物鉴定的结果可以鉴定结合到所述标记物的组成部分，从而允许鉴定大量不同类型的标记的组成部分，同时使用较少数目的单独的可识别标记物。
在某些情况下，可以使用相同或不同的结合组成部分，其可以是粘性末端。结合组成部分可用于不同的碱基类型。不同的碱基类型可以包含表观遗传修饰。不同的结合组成部分可以包含不同序列。不同序列可以具有不同的动力学，例如平均电导可以受到动力学影响。在某些情况下，与结合到包含多核苷酸的SAM相关的序列的小的变化可能仅仅造成电导的小的变化，但可能造成平均结合时间的实质性差异，从而使平均电流显著不同。
在某些情况下，荧光标记物、电荷阻挡标记物或电化学标记物可以结合、连接或缔合有不同的核苷酸类型。在某些情况下，荧光标记物、电荷阻挡标记物或电化学标记物可以结合、连接或缔合有其他不同的组成部分。组成部分的非限制性实例包括氨基酸、寡核苷酸探针、适体、抗体或任何其他类型的结合组成部分或其组合。在某些情况下，不同靶组成部分之间的区分可以如下实现，即通过将一个组成部分结合或定位到检测区的区域中，使得一个组成部分与可以结合到标记物的其他组成部分之间的相互作用可以被检测，并且可以通过检测不同的标记物来检测不同的靶组成部分。
在某些情况下，可以通过使用与邻近连接测定法相似的测定法来检测不同的组成部分。在测定法中，两种不同的结合组成部分可以都结合到靶组成部分。局部浓度的提高可以允许不同结合组成部分之间的其他相互作用，它们因此可以作为连接、杂交或其他结合相互作用的结果而相互作用。连接、杂交或其他结合相互作用然后可以允许作为两个结合组成部分标记物的局部接近的结果，通过例如下述方式来检测：两个不同荧光团之间的FRET；与电极对相结合的两个电化学组成部分的电化学配对，其中两个电极之间的电位可能不适合于任一所述单个电化学组成部分，但可以适合于所述电化学对；组合两种隧穿和/或跳跃寡核苷酸标记物，其中任一标记物可能太短而不能跨越电极对的两个电极之间的间隙，或者可能仅与一侧上的SAM互补，但两种标记物的杂交或连接的组合可以作为延长所述组合标记物的长度的结果而允许检测，其可进一步用于允许同时与电极对的两个电极上的SAM杂交。
在某些情况下，物理阻断物可以具有净电荷，例如负电荷或正电荷，或者可以具有净中性电荷或极小的正或负电荷，或者可以具有磁性或顺磁性核心或相关的组成部分，使得物理阻断物可以对外力例如电场、电渗流、磁力或其任何组合做出响应而移动。
在某些情况下，物理阻断物可以被结合到酶例如反转录酶或任何其他所需类型的酶，并且可以通过适合的接头结合，例如烷烃接头、PEG接头或任何类型的接头，其可以是聚合物、嵌合聚合物或与其他组成部分组合的聚合物。在某些情况下，物理阻断物可以例如通过连接被结合或附连到经复合后的复合寡核苷酸；在附连或结合之前，物理阻断物的非复合部分可以以比复合部分的浓度更高并且可能高得多的浓度提供。在其他情况下，可以在复合之前或之后将物理阻断物延长。
在某些情况下，物理阻断物可以包含环状核酸，其可以是环化的样品核酸，或者可以是合成或复制的天然核酸；环化的核酸可以被复合并且可以被延伸，从而产生核酸球，其可以充当物理阻断物，并且可以在聚合酶或其他酶结合到传感器之前或之后被延伸。如果形成环状核酸的物理阻断物在聚合酶或其他酶结合或附连到传感器之后被延伸，则聚合酶或其他酶可以以相对于延伸可以发生的结合速率来说足够低的浓度提供，使得延伸的环状核酸可以被充分扩大，以便防止被其中可能结合有现有聚合酶或其他酶的同一个传感器上的另一个聚合酶或其他酶结合。
在某些情况下，在附连或结合到传感器之前，环状核酸的延伸可以主要通过提供另外的聚合酶或其他酶、环化核酸、不可掺入的核苷酸和催化性二价阳离子的连续流来阻止，其中在导向传感器之前，不是所有的聚合酶或其他酶、环化核酸、不可掺入的核苷酸和催化性二价阳离子都可用于复合和延伸。
在某些情况下，物理阻断物可以大于电极对的电极之间的间隙的宽度或间距。物理阻断物可以比电极对的电极的长度更长。在某些情况下，物理阻断物在宽度或长度上可以比所述电极对的电极大至少约110％、125％、150％、160％、170％、180％、190％、200％(或更大)，使得即使在考虑到多种因素包括例如酶与结合表面之间的接头的长度、酶的尺寸和从酶到与包含电极对的电极结构相结合的结合表面的任何接头的长度时，作为物理阻断物在空间上干扰另一对酶和物理阻断物的结合的结果，超过一对酶和物理阻断物不能被结合到同一电极对。
电极的清洁
在某些情况下，SAM的去除可以利用电场来实现，正如对胺或硫醇SAM的去除已描述的。在某些情况下，SAM可以被去除并重新施加到所述电极。在某些情况下，SAM可以被去除，并且可以将相同类型的SAM施加到相同电极以便更新SAM。在某些情况下，SAM可以被去除，并且可以将不同类型的SAM施加到电极。
在某些情况下，可以对电极对的表面进行清洁。表面可以使用电化学清洁方法来清洁。电化学清洁方法可以合并有清洗步骤，以在引入与SAM的形成相关的试剂之前除去可能结合到电极表面的任何污染物。
在某些情况下，电化学清洁方法可用于在施加SAM后从电极表面除去污染物。方法可以利用电压。电压可以足以除去污染物，但不足以除去SAM。
在某些情况下，可以使用等离子体清洁，以至少部分清洁传感器或传感器组。在某些情况下，高温氧化清洁可用于清洁传感器或传感器组。温度可以高于或等于约500℃、600℃、700℃、800℃、900℃、1,000℃、1,100℃、1,200℃、1,300℃、1,400℃、1,500℃、1,600℃、1,700℃、1,800℃、1,900℃、2,000℃或更高。在某些情况下，可以使用piranha、硫酸、KOH、NaOH或其他氧化或还原清洁方法来清洁传感器或传感器组。
在某些情况下，为了允许传感器结构被水性或主要是水性的溶剂润湿，所述溶剂可以被用于使用所述传感器的方法中，可以利用清洁、可以降低接触角的混合物、电润湿或任何上述的组合，所述清洁可以在将主要是水性的溶剂带到传感器附近之前实现，或者可以利用主要不是水性的并且可以随后用主要是水性的溶剂替换的可混溶溶剂来实现。例如，可以使用醇类，以在主要是水性的溶剂或许不能完全润湿可能包含纳米间隙的传感器结构时允许润湿。在某些情况下，可以使用电润湿电位，其可以是相对于Ag/AgCl为-0.5V至-0.7V、-0.7V至-1.0V或低于-1.0V，以便发生其中可以使用金或其他贵金属感应和偏压电极的纳米间隙结构的适当电润湿。可以使用与其它金属相关的等价电位。
在某些情况下，传感器结构的润湿和/或清洁，可以使用向原本或许不能润湿传感器结构的水性溶剂添加表面活性剂来实现。在某些情况下，表面活性剂可以是非离子型表面活性剂例如甘油酯或叔十二烷基硫醇。在其他情况下，表面活性剂可以是阴离子型表面活性剂例如烷基硫酸酯或十二烷基苯磺酸盐。在其他情况下，表面活性剂可以是阳离子型表面活性剂例如十二烷基胺或咪唑。在又其他情况下，表面活性剂可以是两性表面活性剂、硅表面活性剂、含氟表面活性剂或聚合物表面活性剂。
在某些情况下，润湿和/或清洁可以使用醇或醇与水性溶剂的混合物来实施，所述混合物可以包括乙醇KOH混合物。醇或醇与水性试剂的混合物可用于清洁传感器表面，使得可以用主要是水性的溶剂进行润湿，或者在用具有更高有机含量的试剂更换或稀释之后，由于例如阻塞(pinning)或滞后，可以用主要是水性的试剂进行润湿。在某些情况下，主要是水性的溶剂可以不含有机溶剂。在某些情况下，主要是水性的溶剂可以含有足够低百分率的有机溶剂(例如小于或等于约20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％(重量％、体积％或摩尔％)或更低)，使得用做检测方法的一部分的酶的活性可以被抑制少于或等于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少。
在某些情况下，传感器结构的润湿可以使用原本或许不能润湿所有或一部分传感器结构的溶剂，通过向传感器或传感器组的一个或多个电极施加润湿电位来实现，所述传感器组可以包括芯片上的所有传感器。在某些情况下，本体流体电位可以使用准参比电极例如Ag/AgCl参比电极来实现，所述电极也可以用作对电极。在某些情况下，在可以是Ag/AgCl电极的参比电极之外，可以使用可以是铂电极的对电极。
在某些情况下，对电极和/或参比电极或准参比电极可以被并入在芯片中。芯片结构可以包括微流体、纳流体或宏观流体系统。流体系统可以被集成作为芯片总成的一部分。流体系统可以是外部流体系统的一部分。流体系统可以在通往芯片总成的一个或多个流体接口的上游或下游。在某些情况下，可以使用一个或多个参比电极。可以利用可能包括水性或非水性电极的参比电极。参比电极可以包括饱和甘汞参比电极、铜/硫酸铜II电极或任何其他适合的参比电极。在某些情况下，可以使用不同类型的对电极，包括不锈钢、镍、金或碳。
在某些情况下，可以使用盐桥将参比和/或对电极与传感器电极分隔开，使得适用于例如参比电极的盐不干扰传感器电极的正常功能。例如，Ag/AgCl参比电极的正常功能所需的氯离子可能导致可以作为传感器电极的一部分的金的去除。这种盐桥可以包括聚合物以阻止可能由静态压力或本体流体移动的其他来源引起的流体移动，或者可以不包括这种聚合物，并因此可以允许通过参比和/或对电极与传感器电极对或传感器组电极之间的通路进行流体交换。
在某些情况下，可以使用确保润湿已经发生的方法。这种方法可以利用氧化还原循环组成部分例如二茂铁盐/二茂铁或二茂铁衍生物或六亚甲基四胺合钌，其中可以测量电化学电流的变化，并且观察到的差异可以指示电极和/或与传感器电极相关的纳米间隙的润湿，特别是作为电位与滞后和阻塞的函数。在某些情况下，可以测量与传感器的电极相关的双层的电容测量值，并且可以将电容的变化测量为可用于确定与传感器的电极相关的电容的AC波形以及DC电位，所述DC电位可以被改变以便确定润湿电位或与传感器电极相关的电位。
在某些情况下，润湿电位可以通过可以相对于参比电极施加到传感器的电极的负电位来实现。负电位可以通过改变一组传感器电极的一个或多个电极的电位来实现，或者可以通过改变参比和/或对电极相对于一组传感器电极的一个或多个电极的电位来实现，或者可以将一组传感器电极的电位和参比和/或对电极的电位两者相对于彼此进行改变。在某些情况下，对于传感器的不同部分来说润湿电位可以变化，例如当一个电极被形成为主要具有一个晶体平面例如111晶体平面，而另一个电极可能具有不同的晶体平面或晶体平面的混合物时。在这些情况下，可以相对于参比电极为不同电极施加不同电压，使得对于不同晶体平面来说存在不同的电润湿电位，并因此可以补偿与不同晶体平面相关的不同润湿角。
在某些情况下，可以以与润湿电位相似的方式施加一个或多个去润湿电位，其可以与上文中所描述的预期晶体平面对齐，这可以允许更快地除去可能有效地与电极或电极组相接触的流体。作为可以结合到一个或多个电极的SAM的结果，可以例如至少部分阻断流体接触一个或多个电极。与这种SAM相接触的流体可以被认为是与电极或电极组有效接触。去润湿电位也可以允许发生流体交换，而不需将传感器或传感器组暴露于流体的混合物，如同在将一种流体用另一种流体替换时，由于传感器或传感器组在交换时可能不与流体有效接触而通常发生的那样。例如，可以将一组标记物与另一组标记物交换，或者可以将一组离子例如钙与另一组离子例如镁交换，并且可以留下结合到酶例如聚合酶的延伸的DNA链，所述DNA链从100％的湿度环境预期将只具有水合。在某些情况下，可以使用可以是正压或负压的压力来帮助润湿表面，所述表面可以包括纳米间隙或其他电极结构。在某些情况下，可以是正压或负压的压力可以与其他润湿辅助手段一起使用，例如表面活性剂、低表面能溶剂或电位。
电极清洁和结合到电极的自组装单层
在某些情况下，自组装单层(SAM)可以包含巯基化DNA，其中不同电极上的单层可以具有相同的单层DNA序列和/或取向，其中3’末端或5’末端可以被结合到巯基或其他结合基团，并因此可以被结合到电极。在某些情况下，对于不同电极上的单层可以使用不同的序列和/或取向，其中作为改变本体流体电位和/或电极之间的偏电位的结果，不同电极可以在不同的基团中被功能化，使得当一种类型的单层化合物可用于结合到一组电极时，在某些电极上发生巯基化，并且在其他电极上不发生。本体溶液和/或偏电极的电位可以被修改，以便可以发生不同组电极的巯基化。这些修改可以以下述方式实现，即阻止新的巯基结合到之前结合有单层的电极组，或者作为结合位点被现有的单层完全占据的结果，可以实质性阻止其他巯基化分子结合。
在某些情况下，可以使用其他结合机制以便提供改进的隧穿通路。结合机制的非限制性实例可以包括蛋白质、抗体、适体、其他有机聚合物或其组合。标记物的结合部分和与电极结合的SAM之间的结合，可以有希望提高电极之间的隧穿或隧穿和跳跃电流。
在某些情况下，SAM可以使用单个巯基结合到电极表面。在某些情况下，二巯基化合物例如碳二硫醇接头可用于形成SAM化合物的至少一部分。在其他情况下，胺、二胺、羧酸酯、膦、烷基硅氧烷、三氯硅烷、全氟代烷基或任何其他适合的结合基团，可用于结合到电极或电极之间的电介质或与传感器组相关的其他区域。
在某些情况下，用于附连SAM的方法可以包含多个步骤，其可以包括：提供盐溶液。所述盐溶液可以包含：柠檬酸钠盐水(SSC，1M NaCl+100mM柠檬酸钠)；在所述盐溶液中杂交核酸，所述核酸可以包含序列GGG CCC GGG和巯基，所述巯基可以是结合碱基的巯基或二巯基，以及其他核酸，其可以是互补的或对于保持结合来说足够互补的。所述方法还可以包括制备电极对组，所述电极对组可以包含金或其他贵金属，所述制备通过在洗液(piranhasolution)中煮沸15至20分钟，然后使用18Gohm的干净水除去所述洗液来进行。
然后，可以使杂交核酸的溶液与所述电极对组发生一段时间的接触，以允许杂交的核酸利用巯基或二巯基结合到电极。接触时间可以大于或等于约1分钟(min)、10min、20min、30min、40min、50min、60min、1.5小时(hrs)、2hrs、3hrs、4hrs、5hrs、6hrs、7hrs、8hrs、9hrs、10hrs、12hrs、14hrs、16hrs、18hrs、20hrs、22hrs、24hrs、26hrs、28hrs、28hrs、30hrs、35hrs、40hrs、45hrs、50hrs或更长。在某些情况下，接触时间可以小于或等于约5天、4天、3天、2天、1天、20hrs、15hrs、10hrs、8hrs、6hrs、4hrs、2hrs、1hr、40min、20min、10min、5min、1min、30秒(sec)、20sec、10sec或更短。在某些情况下，接触时间可以在本文中描述的任两个值之间，例如约1min至约10min、约1hr至3hrs、约3hrs至约10hrs或约10hrs至过夜。可以除去杂交核酸的溶液，然后可以使用可以包含盐溶液或可以包含18Gohm的干净水的清洗液进一步除去任何剩余的未结合的杂交核酸。
在某些情况下，可以使用偏压和感应电极的氧化或还原清洁，其可以利用硫酸和相对于Ag/AgCl为0至+1.2V的电位扫描，或者可以使用用于清洁电极组的方法，所述方法可以包括：施加10mM KOH溶液，从相对于Ag/AgCl为0.0伏特至-1.3V扫描所述电极组的电位；移除所述电位，然后除去KOH溶液，随后用去离子水清洗。
由于核酸可能在核酸的碱基与表面之间形成不想要的胺键，因此可以使用巯基丙醇、巯基乙醇、巯基己醇、甲硫醇、1-巯基-11-十一烷醇、1-丙硫醇、2-丙硫醇、丁硫醇、叔丁基硫醇、戊硫醇、苯硫酚、二巯基琥珀酸、硫代乙酸、二巯基化物或可以结合到贵金属的其他含硫基团的溶液作为后填充物。含硫基团可以置换碱基与电极表面之间的胺结合，并且可以进一步置换可能结合到电极表面的一些较大核酸。
可以包含巯基丙醇的含硫基团，可以与如前所述的盐溶液混合，并且可以使所述试剂混合物与电极发生接触，使得所述含硫基团可以结合到电极。结合可以进行小于或等于约5hrs、4hrs、3hrs、2hrs、1hr、50min、40min、30min、20min、10min、9min、8min、7min、6min、5min、4min、3min、2min、1min或更短时间。在某些情况下，所述结合可以持续至少约1min、5min、10min、30min、50min、1hr、2hr或更长时间。在某些情况下，所述结合可以持续约1min至10min、约10min至30min、约30min至2hrs或超过2hrs。在某些情况下，可以利用电位来加速SAM与电极的结合，所述电极可以是感应或偏压电极。当使用金电极时，这种电位可以为-0.5V至-0.2V、-0.2V至0.0V、0.0V至0.2V或0.2V至0.5V，都相对于Ag/AgCl。在某些情况下，对用于SAM形成的其他金属或参比来说，以及对于其中可以描述电位的其他过程来说，可以酌情修改电位。在其他情况下，当最适合于SAM结合组成部分的结合的电位由于SAM的其他部分的静电吸引而不能充分有助于SAM形成时，可以使用电位扫描；因此在某些情况下，电位可以在可能更加适合于结合的表面电位与可能更适合于阻止由SAM组成部分的其他部分的表面吸引造成的空间位阻的电位之间扫描。
然后可以除去含有含硫基团的试剂混合物，并且可以对电极进行清洗，所述清洗可以使用盐溶液和/或18Gohm的干净水。
在某些情况下，在结合区中可以使用不同的树枝状聚合物，所述结合区可以是SAM结合区。在某些情况下，单个树枝状聚合物可以包含多个结合组成部分，例如不同的DNA序列。在某些情况下，不同的结合区可以包含不同的结合组成部分。在某些情况下，可以在单个结合区中使用多个结合组成部分。作为这些不同结合组成部分的不同定位的结果，结合区可以被有效地编码。
在某些情况下，不同的接头例如PEG、烷烃或例如在一端用巯基并且在另一端用另一种官能团功能化的任何其他适合的聚合物，可用于结合酶或聚合酶上的一个或多个位置。在某些情况下，可以使用超过一个接头将酶或聚合酶结合到位置。
在某些情况下，可以使用标记的核苷酸，其中核苷酸可以具有净负电荷、净正电荷或净中性电荷。在某些情况下，用于提高通过隧穿标记物的隧穿电流的SAM和/或隧穿标记物，可以使用具有负、正、中性电荷或在不同核苷碱基上电荷的任何组合的核苷碱基。
在某些实施方式中，与电极相关的结构可以具有以特定方式施加的SAM。首先，可以通过向纳米间隙添加具有官能团的SAM来处理装置，所述官能团可以结合到两个电极的金属以及相关的电介质表面，例如可以形成偏压电极与感应电极之间的间隔物的电介质，并由此形成底面。然后可以针对本体溶液向电极组施加电压，以便从电极除去官能团，由此官能团可以保留在相关的电介质表面上。
在某些情况下，SAM可以使用适体来形成，允许结合并检测各种不同类型的分子例如蛋白质。不同的寡核苷酸可用于SAM，并且可以结合到蛋白质的不同部分，并且也可以被设计成在蛋白质的表面上彼此紧密结合，以便可以产生更大量的电流。在某些情况下，SAM可以使用多种不同类型的适体来形成，允许多种类型蛋白质的结合和/或单一蛋白质的更紧密结合。
在某些情况下，SAM可以包含抗体，允许检测各种不同的抗原，包括各种不同的蛋白质，但也包括各种不同的其他类型的抗原。可以在电极对的不同电极上使用不同的抗体，以便可以产生夹心测定。抗体可以被用作导电通路的一部分，所述导电通路可以包括靶抗原。在某些情况下，抗体可以与适体组合，以优化结合和/或优化电导。SAM可以使用抗体来形成，允许检测各种不同的抗原，并且可以使用多种抗体来形成，允许检测多种抗原或单一抗原的更特异性结合。
SAM可以包含不同类型的结合组成部分的混合物，其可以包括一种或多种类型的杂交核酸、一种或多种类型的适体、一种或多种类型的抗体和一种或多种类型的任何其他适合的结合组成部分，并且可以以不同类型的不同结合组成部分之间的任何比例形成。
电极对可以被构造成在一个电极上具有SAM并且在邻近或相反的电极上没有SAM。可以利用不同类型的结合机制将SAM结合到电极，例如硫醇、胺和其他结合机制。可以利用不同的靶结合机制，例如，SAM可以包含适体，而相反/邻近电极上的SAM可以包含抗体。
在某些情况下，不同类型的结合机制的混合物可以与同一靶结合分子一起使用。例如，同一适体类型可以使用胺和硫醇来结合。
在某些情况下，在单一电极上或邻近/相反电极上的SAM中可以使用多个不同的靶向分子，使得可以使用同一电极对靶向多个靶。例如，被捕获时具有不同电导的不同蛋白质可以使用不同的结合分子来靶向，或者可以使用通用结合捕获分子来捕获，其中不同的电导可以允许确定哪个靶已被捕获。
在某些情况下，可以使用电场来协助靶被SAM的结合和/或释放，正如在形成胺或巯基SAM中为提高结合速度所描述的，例如通过改变电极上的电位来增加杂交结合和/或提高变性速率，所述电位可以是不同电位，其可以部分对应于晶体平面的差异，并且可以进一步允许零电荷的晶体平面点和相关电位匹配到电极之间的所需隧穿电位
在某些情况下，SAM可以被形成为在构成SAM的不同组成部分之间具有不同比率。在某些情况下，SAM结合比率可以不匹配摩尔比率，而是可以也由不同组成部分的不同尺寸和结合效率引起。在某些情况下，SAM可以用结合和非结合组成部分的混合物形成，使得表面上的大量结合组成部分可以不被动力学和时间驱动，而可以主要是竞争性反应。在某些情况下，许多不同类型的组成部分可以形成SAM，并且其可以被形成为具有主要通过竞争形成的不同结合元件之间的多种比率。这些组成部分可以包含间隔物、标记物结合、靶结合、酶结合组成部分，并且可以是不同的并以不同浓度放置在一个或多个表面上，或以相同浓度放置在一个或多个表面上。
在某些情况下，不是附连核酸或其他聚合物的链，而是可以在本地合成核酸或其他聚合物。合成可以使用与电极对的电极相关的场，根据需要来控制各个碱基的附连，以便可以在不同传感器处产生不同的序列，从而允许例如不同传感器检测不同的扩增产物，所述扩增产物来自多路实时PCR反应、杂交测定法或可能希望检测大量不同类型的组成部分例如不同序列的核酸聚合物的其他类型的测定法。
在某些情况下，与电极对的电极相关的电场可以具有在不同时间施加的电压，以便允许不同的预先合成的寡核苷酸的结合并且能够使不同传感器检测不同的扩增产物，所述扩增产物来自多路实时PCR反应、杂交测定法或可能希望检测大量不同类型的组成部分例如不同序列的核酸聚合物的其他类型的测定法。
在某些情况下，SAM可以使用结合和非结合组成部分的混合物来形成。结合组成部分可以包含具有特定序列的核酸聚合物。非结合组成部分可以包含具有不同序列的核酸聚合物、不同聚合物例如PEG聚合物、烷烃聚合物或不能特异性或非特异性地结合到与结合组成部分特异性结合的组成部分的其他适合的聚合物，或者可以包含不能特异性或非特异性地结合到与结合组成部分特异性结合的组成部分的嵌合聚合物，或者可以包含不能特异性或非特异性地结合到与结合组成部分特异性结合的组成部分的非聚合物组成部分，使得电极表面上的大量结合组成部分可以不被动力学和时间驱动，而是相反可以被不同组成部分之间的竞争竞争性地驱动。
在某些情况下，非结合组成部分可以与可包含贵金属例如钌、铑、钯、银、锇、铱、铂和金并且可包含其他金属的电极一起使用，它们可以利用巯基附连到贵金属，并且可以包含组成部分例如巯基丙醇、巯基乙醇、巯基己醇、甲硫醇、1-巯基-11-十一烷醇、1-丙硫醇、2-丙硫醇、丁硫醇、叔丁基硫醇、戊硫醇、苯硫酚、二巯基琥珀酸、硫代乙酸、二巯基化物或可以结合到贵金属的其他含硫基团的溶液。这种非结合组成部分还可以包含烷烃、PEG(聚乙二醇)或其他聚合物，它们可以具有任何所需的长度，并且长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个单元。
在某些情况下，可以使用后填充物。后填充物可以包含上文中所述的非结合组成部分。这种方法中的步骤可以包括如图1L中所示结合粘附末端，在粘附末端后随后结合后填充物，可以如图1M中所示形成SAM；在其他情况下，粘附末端的表面浓度可以如下定量：如图1N中所示对可用于RTPCR扩增过程的组成部分进行杂交，然后洗掉未杂交的RTPCR可扩增组成部分，然后如图1O中所示将RTPCR可扩增组成部分变性并捕获，随后针对表面积和杂交效率进行定量和归一化。在其他情况下，后填充物可以与可以包含结合组成部分的SAM同时形成。在某些情况下，SAM或构成SAM的组成部分的至少一部分可以是亲水的，使得可以结合有SAM的表面可以有效地具有较高能量的表面，并因此可以更容易地润湿。
在某些情况下，不同结合元件之间的比率可以通过竞争来设定，所述竞争可以包括作为使用不同间隔物、标记物结合、靶结合、酶结合组成部分的结果的结合偏好性，这些组成部分可以是不同的并且可以与表面结合，以便产生不同的表面浓度或处于相同表面浓度下。溶液中的浓度可以是相同或不同的。在某些情况下，作为不同结合组成部分的不同尺寸或结合效率的结果，有效的表面浓度可以是相同或不同的。
在某些情况下，不同类型的结合机制的混合物可以与相同的靶结合分子一起使用。例如，同一类型的适体可以用胺或硫醇结合，或者两种不同的适体可以使用不同的结合方法来结合。
在某些情况下，可以在单个电极上或邻近/相反电极上的SAM内使用多种不同的靶向分子，使得可以使用同一电极对靶向多个靶。例如，被捕获时具有不同电导的不同蛋白质可以使用不同的结合分子来靶向，或者可以使用通用结合捕获分子来捕获，其中不同电导可以允许确定哪个靶已被捕获。
在某些情况下，电极可以被构造成用于捕获单个分子或复合物，或者可以被构造成用于捕获相同类型的多个靶，其中测量到的电流水平可用于确定大量被捕获的分子。
在某些情况下，可以清洁成组电极，并且可以在一组电极上产生SAM层。可以利用一组电极的至少一部分做出各种不同测量，然后可以利用清洁过程除去SAM。可以施加另一个SAM，其可以具有相同构造类型或不同构造类型，并且可以做出另外的测量。如果需要，这种循环可以重复许多次。循环可以例如受到所述芯片传感器的污染或腐蚀的限制。在不同样品之间可以使用清洁过程，这可以允许适合地确定前一个样品可以已被除去、降解或以其他方式处理(render)，使得后续测量可以在一定容许度内不受影响。
在某些情况下，SAM可以利用杂交寡核苷酸来形成。杂交寡核苷酸可以被构造成具有结合到杂交寡核苷酸的一个末端的烷烃或PEG接头聚合物，所述末端可以是寡核苷酸的3’或5’末端。然后可以将巯基或二巯基结合到接头烷烃、PEG或其他更加导电的链例如上文中描述的其他导电性聚合物中的某些的末端，其然后可用于结合到电极表面。烷烃或PEG或其他导电性接头聚合物的长度不受限制，并且长度可以为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个单元或超过10个单元。在某些情况下，接头聚合物的长度可以是均一的。在某些情况下，对不同的结合组成部分或对单一类型的结合组成部分可以使用不同的长度。在其他实施方式中，后填充物可以包含单一类型或不同类型并且可以包含单一长度的接头或不同长度。在某些情况下，用于结合组成部分的长度可以与用于非结合组成部分的长度相同或大部分相同。用于结合组成部分的长度可以长于或大部分长于用于非结合组成部分的长度。用于结合组成部分的长度可以短于或大部分短于用于非结合组成部分的长度。
在某些情况下，可以使用结合到杂交寡核苷酸的3'末端的接头的SAM，可以被结合到电极对的一个电极，而可以被结合到杂交寡核苷酸的5'末端的接头，可以被结合到电极对的另一个电极。在某些情况下，一种SAM类型与电极对的一个电极以及第二种SAM类型与电极对的第二个电极的差异结合，可以通过在不同时间对不同电极使用不同电位来实现。
例如，使用111晶体平面金电极和Ag/AgCl参比电极，使第一种类型的SEM接近电极对的两个电极，可以向电极对的第一电极施加-0.4的电位，由此使SAM结合到第一电极，同时可以向电极对的第二电极施加0.5V，由此使SAM不结合到第二电极。然后可以将电极对的第一电极的电位改变到0.5V，从而阻止进一步结合，并且可以将第二种类型的SAM带到电极对的两个电极附近，然后可以向电极对的第二电极施加-0.4的电位，由此使第二SAM结合到第二电极，同时可以向电极对的第一电极施加0.5V，由此使第二SAM不结合到第一电极。因此，可以向电极对的不同电极施用不同的SAM，允许单一ssDNA链的两个末端杂交，所述单一ssDNA链可以是标记物，并且可是是部分双链的。
在某些情况下，SAM可以使用可以完全外部合成的寡核苷酸来形成。可替选地或另外地，当可能需要高度可定制的靶向时，SAM可以至少部分使用电场在本地合成，其中不同的核苷碱基可以在不同时间导入并结合在不同电极上，例如由Heller等人在US5,929,208中所描述的，所述文献通过引用以整体并入本文。可以使用定制化以便进行利用不同传感器组的不同类型的试验，或者可以使用定制化以便使用靶向来定位和结合序列的不同部分，其中可用于靶向的寡核苷酸可以被结合到测量传感器，或者可以被结合到与那些用于测量传感器的电极分开的另外的电极，其中另外的电极可以只用于靶向，或者也可用于另一种目的。定制化可以由本地合成或部分本地合成引起，或者由外部合成的寡核苷酸与特定或随机电极的结合引起。
酶与表面的结合
在某些情况下，中央电介质区可以包含钛、TiO2、SiO2、GeO2、Si3N4或其他氧化物、碳化物或氮化物。在某些情况下，可以利用产酰胺基团将接头或官能团结合到中央电介质区例如Si3N4中央电介质区。产酰胺基团可以包含一种或多种醛、酯、卤化物、环氧化物、亚胺、异氰酸酯及其组合。烷烃膦酸和NaN3可用于在中央电介质区上、特别是TiO2电介质结构上产生叠氮化物官能团。
在某些情况下，叠氮化物官能团可以在利用胺基将聚合酶结合到装置之前产生，所述胺基可以是聚合酶的固有部分，或者可以是结合到聚合酶的组成部分的一部分，并且可以通过接头结合。在某些情况下，可用于将聚合酶或其他酶结合到电介质的接头的部分可以被制造成可切割的。在其他情况下，可以将氯化物用叠氮化物基团替代来官能化接头，并且所述官能化可以在仪器内作为运行或方法的一部分来实现。
在某些情况下，与中央电介质区的结合或缔合可以包括硅烷化。硅烷化可以利用氨基丙基三乙氧基硅烷，其使用戊二醛活化。在某些情况下，可以使用羧酸末端基团例如羧酸酯基团结合到氧化物或氮化物。在某些情况下，可以使用烷基或烯基官能团结合到电介质材料的氢封端的表面。附连可以任选地利用光活化来实现。
在某些情况下，酶可以被修饰。可以对酶进行修饰，使得有功能部分可以具有酶或聚合酶的原始尺寸，而整体尺寸可以被扩大。这些修饰的酶或聚合酶可以被配置在传感器中，所述传感器在顶部部分与感应部分之间具有倒圆锥或角锥形横截面形状。当带有标记物的核苷酸碱基与酶或聚合酶相互作用时，酶或聚合酶可以将靶DNA或多核苷酸的双链部分延长一个碱基。感应电极可以产生由结合或掺入的核苷酸碱基的标记物在两个电极之间的间隙中的放置或有效的高局部浓度所引起的信号。
在某些情况下，聚合酶可以与结构的侧壁缔合(例如结合)。结构可以包含传感器结构的一个或多个电极。可以使用杂交和/或连接将聚合酶与结构缔合。聚合酶可以被杂交或连接到可作为SAM的一部分的寡核苷酸。寡核苷酸可用于通过例如杂交到隧穿标记物来促进更高的隧穿电流。在某些情况下，可以将聚合酶杂交或结合到可以不用于促进更高隧穿电流的寡核苷酸，并且所述寡核苷酸可以具有与可以被用于促进更高隧穿电流的寡核苷酸所使用的序列不同的序列。
在某些情况下，两个电极可以作为一对用于单个传感器，所述传感器缔合有酶或标记物结合监测可能需要的其他组成部分。在某些情况下，可以使用与酶或标记物结合可能需要的其他组成部分缔合的超过一个电极对(例如至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个电极对)。在某些情况下，一些或所有所述电极对可以在其间具有相同或不同的间隙。
在某些情况下，系统可以包含单个传感器。单个传感器可以被构造成用于监测或检测单个酶和/或靶分析物。在某些情况下，可以通过单个传感器同时或顺序检测或监测多种酶和/或靶分析物。在某些情况下，系统可以包含多个传感器，例如大于或等于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个传感器。每个传感器可以被构造成用于监测或检测一种或多种酶和/或靶分析物。
在某些情况下，本公开的系统可以包含阻断物(例如物理阻断物)。物理阻断物可以被构造成用于获得缔合有单个酶或其他组成部分的电极对的更高的百分率(例如大于或等于约35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高)而不是泊松分布。物理阻断物的非限制性实例包括纳米珠、纳米杆、蛋白质复合物、DNA复合物、碳水化合物聚合物或碳水化合物复合物、聚合物、脂肪细胞脂质小滴、非脂肪细胞脂质小滴、金纳米珠、纤维素纳米珠、聚苯乙烯纳米珠、乳胶纳米珠或任何其他尺寸适合的纳米粒子或可以产生尺寸适合的纳米粒子的组成部分的组合。在某些情况下，可以将仅仅一种物理阻断物与电极对缔合。
在某些情况下，物理阻断物的至少一部分包含聚合物，其可以是嵌合聚合物，并且可以具有足够的尺寸以便包含物理阻断物或物理阻断物的有效部分。在某些情况下，可以将聚合物在第一末端官能化，并且可以将酶结合到所述官能化的末端。
在某些情况下，将酶与可以包含电极对的电极结构的表面相结合的、可以是聚合物或嵌合聚合物的接头，可以包含核酸聚合物，并且核酸聚合物可以包含可形成二级结构的序列，并且二级结构可用于形成可以比没有二级结构的随机序列原本可能形成的物理阻断物更大的物理阻断物。
在某些情况下，酶可以通过一个接头结合到可以包含电极对的电极结构的表面，或者可以通过超过一个接头来结合，同时在酶与物理阻断物之间可以存在一对一对应关系。
在某些情况下，待观察的组成部分可以与载样化合物或载样试剂一起装载到装置中。然后可以在添加与之前装载的组成部分相互作用的组成部分之前除去载样化合物或载样试剂。在某些情况下，载样化合物可以包含多核苷酸，并且还可以包含结合有引物的核苷酸。在某些情况下，可以在装载之前将引物部分延伸。在某些情况下，载样化合物可以通过提供核苷酸并允许可以是聚合酶的第一种装载的组成部分完全延伸并释放可以是多核苷酸的载样化合物来除去；然后可以将释放的载样化合物与任何核苷酸和靶多核苷酸一起除去，所述靶多核苷酸可以在引入传感器容积之前引发(prime)或者可以与引物一起引入，其中引发发生在传感器容积内；然后可以将引发的多核苷酸用聚合酶结合，然后可以如本文中所述进行测序。在某些情况下，载样化合物可以包含天然DNA；在其他情况下，载样化合物可以包含结合到聚合酶的非天然DNA。
在某些情况下，系统可以任选地产生靶复合物。靶复合物可以包含聚合酶或其他适合的酶、样品核酸链或试样或载样核酸链以及适合的非催化性或催化性二价阳离子，以便允许所述核酸链被聚合酶结合。靶复合物可以被引入到传感器电极对阵列，然后可以被结合到电极对的电极。在某些情况下，靶复合物可以被结合到电介质，所述电介质可以包含用于在电极对的电极之间形成间隙的材料，其可以是氮化硅、氧化硅、氧化锗或其他标准的半导体电介质材料。
在某些情况下，可以结合到靶复合物的组成部分可以催化其他剩余结合位点的移除，同时可以使用于结合靶复合物的结合配体保持被结合。例如，可以将外切核酸酶或切口酶与长接头上复合物的其他所需部分缔合。外切核酸酶和/或内切核酸酶可以切割分子(在这个实例中是DNA)的多个部分，以便可以减少或阻止其他复合物的结合。例如，可以从单链核酸的末端渐进性切割核苷碱基的酶，或切割单链核酸链而不是双链核酸链的末端之外的位置的酶，可以通过使结合到靶复合物的链杂交到可以包含基本上互补的核酸的结合组成部分，由此形成不被所描述的酶降解的双链核酸，从而针对结合靶复合物的链有效地失活。
在某些情况下，样品或靶核酸链或成组样品或靶核酸链可以与一组二价阳离子相组合引入到芯片，使得可以通过复合形成至少包含聚合酶、二价阳离子和样品或靶核酸的复合物。二价阳离子可以是催化性或非催化性的，并且可以被引入到聚合酶的流体环境，使得二价阳离子可以在引入样品或靶核酸之前、引入样品或靶核酸之后、与样品或靶核酸一起或其任何组合，结合到聚合酶的催化活性位点。
在某些情况下，样品核酸链或试样或载样核酸链可以包含互补的双链末端，使得具有外切核酸酶活性的酶可以不降解样品核酸链或试样或载样核酸链。通过利用在可以结合具有链置换活性的聚合酶的点处具有缺刻位点的完全双链的核酸链，可以保护样品核酸链或试样或载样核酸链免受内切核酸酶降解。
在某些情况下，可以使用酶法结合将酶结合到核酸聚合物或可以包含核酸的嵌合聚合物，所述核酸可以不是样品或靶核酸。在某些情况下，核酸聚合物可以包含发夹结构，从而允许引发和因此各个酶的酶法结合到各个核酸聚合物或包含核酸的嵌合聚合物。在其他情况下，可以提供另外的核酸聚合物，以便可以形成引发的核酸结构，并且所述核酸结构可以被例如聚合酶酶法结合。
在某些情况下，相对于酶的数目，可以提供更多拷贝的核酸聚合物或包含核酸聚合物的嵌合体，使得每个酶可以结合到核酸聚合物或包含核酸聚合物的嵌合体。在某些情况下，可以提供更多拷贝的酶，使得每个核酸聚合物或包含核酸聚合物的嵌合体可以与酶结合，从而形成酶法结合。然后可以进行分离步骤，以便可以从以较低浓度提供的组成部分中除去没有结合到那些以较低浓度提供的组成部分的相对于所述以较低浓度提供的组成部分以较高浓度提供的组成部分，从而提供使用酶法结合来结合的酶与核酸聚合物或包含核酸聚合物的嵌合体的复合物。
在某些情况下，聚合物的第二个末端可以被结合到磁性或顺磁性珠子或粒子。在其他情况下，第二个末端可以被官能化，使得第二个末端可以结合到具有电极对的电极结构的表面。
在某些情况下，第二个末端可以被结合到磁性或顺磁性珠子或粒子，并且第二个接头可以被结合到磁性珠子或粒子、酶或结合磁性或顺磁性珠子或粒子和酶的接头中的一者。第二个接头可以在一个末端处结合到第一个接头的特定聚合物，并且可以被结合到可以包含电极对的电极结构的表面。
在某些情况下，聚合酶或其他酶可以利用SAM与电极结合或缔合，其中可以被结合到电极或电极组的SAM可以包含组成部分的混合物，并且可以包含不同核酸类型的混合物，至少一种类型的所述核酸可用作粘附末端，并且另一种类型的所述核酸可用于结合聚合酶或酶。在某些情况下，在可以包含粘附末端的核酸与可以包含结合聚合酶或其他酶的组成部分的核酸之间有效解链温度可以不同，其中可以包含粘附末端的核酸的解链温度可以低于可以包含结合聚合酶或其他酶的组成部分的核酸的有效解链温度，并且对于可以包括盐浓度、温度和溶剂的给定的同一组条件来说，可以低1摄氏度、2至5摄氏度、5至10摄氏度、10至20摄氏度、20至30摄氏度或超过30摄氏度。在其他情况下，可以结合酶或聚合酶的SAM可以被结合到电介质，所述电介质可以是可作为间隔物用于隔开电极对的电极的电介质。
在某些情况下，可以允许粘性末端从粘附末端变性的操作温度，可以允许聚合酶或其他酶保持杂交，并因此可以允许在保留结合的聚合酶或酶的同时交换标记物类型或除去标记物。
在某些情况下，聚合酶或酶可以被杂交到SAM的可以与可结合到所述聚合酶或酶的核酸互补的部分，并因此可以被连接到SAM，其中SAM可以包含可以是部分单链和部分双链的核酸，使得结合到聚合酶或酶的核酸可以被连接到SAM，或者可以被结合到聚合酶或酶的核酸可以是部分双链和部分单链的，使得包含SAM的一部分的核酸和结合到聚合酶或酶的核酸可以被连接在一起。
将隧穿标记物用于核酸测序
在某些情况下，核苷酸碱基鉴定方法可以包括利用存在于两个电极之间的间隙附近的聚合酶在两个电极之间合成双链多核苷酸，并且检测当核苷酸碱基在两个电极之间被并入或结合时电极之间的隧穿电流的增加。聚合酶可以被提供有引发的靶核酸链，其中单链部分可以提供用于掺入(添加)互补核苷酸的模板，所述互补核苷酸可以是具有隧穿标记物的核苷酸。
在某些情况下，当被酶或聚合酶结合的标记的组成部分可以能够与两个电极结合或相互作用，使得作为所述结合到标记的组成部分的标记物与两个电极的相互作用的结果可以检测到可测量的隧穿电流时，酶或聚合酶可以被认为是在两个电极之间的间隙附近。
带有隧穿标记物的碱基的掺入或结合，可以引起从一个电极向另一个电极的隧穿电流的增加。可以导致标记的组成部分的定位的许多其他方法是可能的，作为非排他性实例，包括标记的核苷酸、标记的探针的标记物的杂交、标记的探针的连接、标记的探针在三链形成中的结合、可以被核糖体标记的氨基酸的结合。
隧穿标记物可以是组成部分或单一分子，或可逆地附连到可以被并入或结合的碱基的单一分子和杂交的部分互补的核酸聚合物，如图2A中所示，其中示出了隧穿标记物200，它的粘性末端结合到粘附末端201A和201B，所述粘附末端被分别结合到电极202A和202B。
在某些情况下，可以将不同标记物结合到不同核苷酸碱基和/或不同核苷酸碱基类型。在核苷酸可以在两个电极附近被聚合酶结合或掺入的情况下，作为可以结合有可与被查问碱基互补的碱基的特定类型的隧穿标记物的定位的结果，可以为不同核苷酸碱基测量与隧穿标记物的预期隧穿电流相关的隧穿电流。因此可以对不同隧穿标记物进行工程化设计，以提供由不同核苷酸碱基的结合或掺入引起的隧穿电流的方便的分离。
在某些情况下，如图2B中所示，可以将结合到标记物的一组核苷酸205带入到聚合酶或其他酶206的流体环境中，所述酶可以在由电极202A和202B部分形成的间隙中与部分延伸的DNA链207复合。在没有核苷酸和结合的标记物205可以被聚合酶或其他酶206结合的时间期间，基本上没有电流可以在电极202A与202B之间流动。然后如图2C中所示，所述成组核苷酸205的与部分延伸的DNA链207的被查问碱基互补的互补核苷酸和结合的标记物210，可以在由电极202A和202B部分形成的间隙中被聚合酶或其他酶206结合，由此引起电流在电极202A与202B之间流动。如图2D中所示，在除去成组的带有标记物的核苷酸的未结合核苷酸后，可以将催化性二价阳离子带入到聚合酶206的流体环境中，使得可以从所述互补核苷酸的标记物211切下所述并入的核苷酸，并且可以从所述聚合酶或其他酶206的流体环境洗掉所述互补标记物的现在未结合的标记物211。
在其他情况下，可以将相同的标记物结合到超过一种类型的核苷碱基。核苷碱基可以是未修饰的核苷碱基或修饰的核苷碱基，其中核苷碱基的结合时间可以不同，以便产生平均电流的可辨别的差异。
在某些情况下，可以将可结合到自组装单层(SAM)的标记物与核苷酸碱基结合或缔合。标记物可以结合或缔合到核苷酸的3’、核苷酸的5’、核苷酸的碱基或其任何组合。结合或缔合可以作为酶过程的结果、作为化学步骤例如化学或光化学切割的结果或作为动力学或温度变化的结果而被破坏或解离。
在某些情况下，可以将可以具有相应的不同标记物的不同类型的碱基引入到系统中，例如水性溶液中。在特定传感器处，当一个碱基可以通过复合的聚合酶掺入或结合到单链时，利用与对应于不同核苷酸碱基或修饰的核苷碱基的不同标记物相关的不同隧穿电流，可以使用隧穿电流来鉴定哪个碱基或修饰的碱基已被结合或添加。
在某些情况下，在已经测量到带有标记物的碱基的结合后，可以将带有终止物的碱基引入到系统，这可以阻止其他核苷酸碱基的进一步掺入，所述终止物可以是3’终止物、2’终止物或任何其他类型的终止物。这可以防止任何相位误差问题。这进而使得能够利用长读段而不需担心相位误差。
带有标记物的碱基的掺入，可以作为使用不含掺入所需的适合的催化性阳离子的缓冲液的结果而被阻止，或者可以作为使用不可掺入的核苷酸的结果而被阻止，所述不可掺入的核苷酸例如(但不限于)在磷酸酯链中具有取代例如用砷、Sn、Bi或N取代α、β或两种磷酸酯的核苷酸、PNA核苷酸、L-DNA核苷酸、锁DNA核苷酸、核糖核苷酸、腺嘌呤单磷酸、腺嘌呤二磷酸、腺苷、脱氧腺苷、鸟嘌呤单磷酸、鸟嘌呤二磷酸、鸟苷、脱氧鸟苷、胸腺嘧啶单磷酸、胸腺嘧啶二磷酸、5-甲基尿苷、胸苷、胞嘧啶单磷酸、胞嘧啶二磷酸、胞苷、脱氧胞苷、尿嘧啶单磷酸、尿嘧啶二磷酸、尿苷和脱氧尿苷。通常，不可掺入的核苷酸可以被聚合酶结合，但不被聚合酶掺入到正在生长的多核苷酸链中。
在其他情况下，在使用不具有适合于发生聚合酶掺入的催化性阳离子的缓冲液测量带有标记物的碱基的结合后，可以将没有催化性阳离子的缓冲液用不具有可掺入的核苷碱基但具有适合的催化性阳离子例如镁和/或锰的缓冲液代替。在某些情况下，用于结合但不掺入核苷碱基的含有核苷碱基的缓冲液，可以首先用不具有可掺入的核苷碱基并且不具有可用于核苷碱基掺入的催化性阳离子的缓冲液代替，随后可以引入具有催化性阳离子的缓冲液，用于允许可以仍被结合的核苷碱基的掺入的目的。
在某些情况下，在核苷碱基掺入之后，可以用缺少催化性阳离子但具有可掺入的隧穿标记的核苷酸的缓冲液代替具有催化性阳离子的缓冲液。在某些情况下，替换可以分两步进行，其中可以流动添加没有可掺入的核苷碱基并且缺少催化性阳离子的新的缓冲液来替换具有催化性阳离子的缓冲液，随后可以引入缺少催化性阳离子但具有可掺入的带有隧穿标记物的核苷碱基的缓冲液。
在某些情况下，测量过程可以在紧密结合核苷碱基的缓冲液与聚合酶一起使用，使得在正确的(与靶链上的核苷碱基互补的)核苷碱基结合后聚合酶有效地不释放出正确的核苷碱基时进行。这种缓冲液可以至少部分包含钙离子，但不可以包含能够占据催化性金属结合位点的其他非催化性阳离子。在某些情况下，紧密结合核苷碱基的缓冲液可以结合核苷碱基并且在核苷碱基结合后不释放核苷碱基，直至条件改变。在其他情况下，缓冲液可以包含钙和可以占据聚合酶催化结合位点，但允许聚合酶释放出结合的互补核苷碱基的其他金属。这种其他金属可以至少部分包含锌、钡、锶或其他二价金属阳离子。修饰的碱基可以是可掺入或可以是不可掺入的。修饰的碱基可以包含隧穿(或其他标记物例如荧光标记物)标记的天然存在的表观遗传修饰的碱基，或者可以是隧穿(或其他标记物例如荧光标记物)标记的非天然存在的核苷碱基。因此，在某些情况下，可以使用超过4种标记物类型。
在某些情况下，核苷酸结合的动力学和与被查问碱基的互补性，可以根据由相关隧穿标签实现的电流来测量，由此可以根据结合动力学来测量互补的核苷碱基的修饰差异或是否存在修饰。在某些情况下，可以使用标记的修饰核苷碱基，其可以更长或更短时间结合到非表观遗传修饰的碱基或表观遗传修饰的碱基。在某些情况下，可以是DNA鸟嘌呤或RNA鸟嘌呤的鸟嘌呤的氧化的检测，可以在所述鸟嘌呤碱基被氧化成8-羟基鸟嘌呤时通过与腺嘌呤的相对结合效率的变化来检测，由此在被氧化后，结合到腺嘌呤的动力学变得与结合到胞嘧啶的动力学相似。
在某些情况下，每次可以向系统添加单一核苷酸类型用于掺入。在这种情况下，对应于不同核苷酸碱基的不同标记物不需具有不同的隧穿电流特征。相反，人们检查是否已发生掺入或结合。如果记录到预期的隧穿电流，则可以鉴定所述互补碱基的类型并且可以以这种方式对多核苷酸进行测序。在其他情况下，可以将单一标记的可掺入核苷酸与其他核苷碱基合并，其中所述其他核苷碱基可以如之前在上文中描述的是不可掺入的。在某些情况下，每次可以向系统添加单一核苷酸类型用于掺入。在这种情况下，对应于不同核苷酸碱基的不同标记物不需具有不同的隧穿电流特征。
在某些情况下，可以提供4种或更多种不同类型的核苷碱基，其中至少一部分核苷碱基可以被提供有结合到三磷酸酯的隧穿标记物化合物，并且核苷碱基可以是未封端的。因此，除了根据需要补充核苷碱基浓度之外，反应的发生可以不需要添加核苷碱基、清洗步骤等等。核苷碱基可以被提供有催化性金属阳离子例如镁和锰，并且还可以提供有非催化性阳离子例如钙、锌和本文中所描述的其他二价阳离子，使得聚合酶结合和掺入的动力学可以被减缓，以便可以更容易地观察和测量结合和掺入动力学。
在其他情况下，可以使用多步方法，其中提供的核苷碱基可以具有可逆地结合到核苷碱基的碱基部分而不是结合到核苷碱基的核糖部分的隧穿标记物化合物。在某些情况下，可以提供本文中所描述的终止物，其可以结合到核苷碱基的核糖的3’。
在某些情况下，可以提供可以具有结合的隧穿标记物化合物和3’终止物的一组核苷碱基，以便实现单碱基延伸反应。在某些情况下，可以除去剩余的核苷碱基，然后读取电极对传感器以确定是否和哪些不同的隧穿标记物化合物可以作为延伸反应的一部分被结合；在其他情况下，测量可以在除去核苷碱基之前实施，因为来自于剩余核苷碱基的存在的背景不显著干扰确定是否和适合时哪些隧穿标记物化合物可能被结合到延伸的链。
在某些情况下，隧穿标记物可以被结合到终止物。在某些情况下，隧穿标记物可以被结合到磷酸酯链。在某些情况下，可以使用不是终止物的可切割接头将标记物结合到碱基。
在某些情况下，终止物和标记物可以使用单一化学步骤从延伸的链同时除去，例如使用三(2-羧基乙基)膦盐酸盐切割步骤。在其他情况下，隧穿标记物化合物和终止物的切割可以作为分开的反应的结果发生。在某些情况下，可以使用几组核苷碱基并允许它们结合到聚合酶复合物。核苷碱基组可以包含未修饰的碱基、修饰的碱基或修饰和未修饰的碱基的组合。
在某些情况下，可以使用摆动碱基配对作为碱基组的一部分，其中摆动配对可以包括鸟嘌呤-尿嘧啶(G-U)、次黄嘌呤-尿嘧啶(I-U)、次黄嘌呤-腺嘌呤(I-A)和次黄嘌呤-胞嘧啶(I-C)以及其他摆动碱基配对。在某些情况下，可以在引入上文中所描述的核苷碱基并因此开始另外的测序循环之前实施清洗步骤。在某些情况下，终止物可以包含3’-ONH3基团、3’-O-烯丙基、3’-O-叠氮基甲基，或者可以包含与利用荧光标记的核苷碱基例如由Helicos所使用的核苷碱基的Virtual TerminatorTM相似的组合的终止物和隧穿标记物化合物，或者可以使用与利用荧光标记的核苷碱基例如由LaserGen所使用的核苷碱基的Lightning TerminatorTM相似的组合的终止物和隧穿标记物化合物。
在某些情况下，核苷碱基可以被提供成具有结合到磷酸酯链的隧穿标记物，所述磷酸酯链可以从三磷酸酯延长到四磷酸酯、五磷酸酯、六磷酸酯、七磷酸酯或更长的磷酸酯链，并且还可以包含接头，所述接头可以包含烷烃或聚乙二醇或其他适合的接头链，所述接头链可以被构造成像烷烃链那样是柔性的，或者可以被构造成像烯烃(alkyene)链那样是相对不柔性的。
在某些情况下，单一隧穿标记物可用于所有碱基。然后可以引入核苷碱基，其中一种或多种碱基可以被标记，并且其他碱基可以不被标记。一些或所有碱基可以是不可掺入的。可以不提供催化性二价金属阳离子，从而阻止掺入。然后可以轮流提供不同的核苷碱基组，使得不同类型的核苷碱基可以被标记，并且其他碱基在此时可以是不被标记的，以便可以利用布尔逻辑确定与下一个靶碱基互补的碱基。可以使用试剂溶液洗掉碱基组，所述溶液可以不含足够量的适用于结合核苷碱基的二价阳离子。试剂溶液可以包含可用于保持样品DNA与引物或延伸的引物的杂交的阳离子。然后可以带入待试验的后一组核苷碱基，使得后一组核苷碱基可以与聚合酶复合物相互作用并结合。后一组核苷碱基还可以包含一种或多种二价阳离子，使得后续的核苷碱基可以结合的时间比所述后续的核苷碱基在不存在二价阳离子的情况下将结合的时间明显更长。
然后可以将一组或多组可掺入的封端或未封端的核苷碱基分别与或不与催化性金属阳离子一起提供，使得随后可以结合或掺入单个碱基，除去剩余的核苷碱基，并在需要时提供催化性金属阳离子使得结合的碱基可以被掺入。
在某些情况下，由于可以使用单分子检测，因此可以不需要克隆扩增；在其他情况下，可以使用克隆群体来提高信号水平，并且可以将一组聚合酶与可以在一个或多个电极对附近的一个或多个局部化的克隆群体相缔合。
在某些情况下，本公开的方法可以包括：
a)引入标记的核苷酸和二价钙，随后进行核苷酸的结合；
b)使用二价钙清洗溶液除去未结合的标记的核苷酸；
c)读取结合的核苷酸的标记物，由此确定在每个传感器处结合何种核苷酸；
d)通过引入镁和/或锰来掺入结合的核苷酸；以及
e)使用钙清洗溶液除去镁和/或锰。
在某些情况下，本公开的方法可以包括：
a)在包含钙和任选地其他非催化性二价阳离子的混合物中引入一种或多种标记的核苷酸类型和任选地一种或多种未标记的核苷酸，其可以是天然存在的核苷酸包括表观遗传修饰的核苷酸或合成的核苷酸；
b)在钙和任选地至少一种其他非催化性二价阳离子中测量标记物；确定标记物类型和任选地标记物动力学；
c)用除了钙、镁和锰之外的至少一种二价阳离子洗掉标记物；并且使用不同的标记物核苷酸组合任选地重复步骤a)、b)和c)，所述组合可以包括其他类型的核苷酸；
d)引入被并入在钙缓冲液中的一组任选地未标记的核苷酸，所述核苷酸可以是标准的碱基或者可以是表观遗传修饰的碱基或合成的碱基，以便结合所述核苷酸；
e)用钙缓冲液清洗液洗掉未结合的核苷酸；
f)引入镁和/或锰缓冲液并且掺入结合的核苷酸；以及
g)使用不含镁和/或锰且可以包含其他二价阳离子的缓冲液除去镁和/或锰缓冲液。
这一过程被示出在图2E的过程流程图中，其中在步骤1中可以向一组核苷酸引入聚合酶，所述核苷酸可以在步骤2中被结合，然后在步骤3中所述聚合酶可以经历构象变化并且可以在拇指与手掌之间闭合以牢固结合核苷酸；随后所述聚合酶可以在步骤4中经历另一次构象变化并且可以打开，其中允许所述被结合的核苷酸释放，然后移回到步骤2；这些步骤1-2-3-4-1可以被重复几次，然后进行步骤5，其中可以发生磷酰基转移并同时发生核苷酸掺入，随后在步骤6中在所述酶从手掌打开拇指的构象变化后释放出焦磷酸酯和结合的标记物，然后在步骤7中所述聚合酶移动到被查问的下一个碱基，并且所述焦磷酸酯和标记物从所述聚合酶的流体环境扩散迁移出去。
这种情况也用绘画方式示出在图2F中，其中标记的核苷酸被显示为在在对应于图2E的状态1和3的两种状态之间(左侧和中间的结构带有结合的聚合酶)，其中在中央的状态下，所述标记的核苷酸被所述聚合酶结合并保持一段时间，此时所述标记物可以与结合到电极的粘附末端结合并从其释放，这可以至少部分是所述聚合酶中可以固定结合所述核苷酸的阳离子与可以允许所述核苷酸释放的阳离子之间的离子交换的结果；在一段所需时间后，所述缓冲液混合物可以被更换，导致单个核苷酸被所述聚合酶结合，而在所述聚合酶的流体环境中没有其他核苷酸，并且所述缓冲液可以被改变成包括至少一种二价阳离子，所述二价阳离子可以允许所述聚合酶掺入所述结合的核苷酸，从而达到在右侧结构中示出的状态。因此，产生的电流可以通过在图2F的底部中示出的迹线来描绘，其中可以存在成簇的短脉冲，其中所述簇对应于核苷酸可以被聚合酶结合的时段，并且所述簇中的短脉冲可以对应于所述核苷酸可以被所述聚合酶结合并且也可以杂交到所述粘附末端的时段。
在某些情况下，由杂交引起的成簇电流脉冲可以只在核苷酸被结合时出现，并且每个簇在宽度、簇之间的时间和簇的平均电流幅度方面可以不同。在其他情况下，以与核苷酸结合相似的方式，脉冲的宽度和脉冲之间的时间可以显著变化。在单个传感器中或不同传感器之间，相同标记物或标记物类型的平均电流幅度也可以变化；在某些情况下，不同的晶体平面、不同的电极间距的宽度和伴随的双链区段例如杂交的粘附和粘性末端与标记物的双链中央部分之间的角度以及得到的电流，可以随着发生特定杂交所利用的一组可接近的粘性末端中的不同粘性末端而不同。在其他情况下，杂散脉冲可以由其他杂散核苷酸产生。这可以给出单个杂散脉冲或不太常见情况下一小组脉冲，这可以导致伴随着相关电流分布的平均背景电流。这些背景电流可以被表征、归一化并从测量到的信号中除去，其中这种归一化可以在全局基础上、单独的传感器基础上或适合的归一化的中间水平上进行。
在某些情况下，可以使用几种不同的标记的核苷酸来利用复合物的同时检测以及形成和重新形成。不同的核苷酸可以具有不同的酶结合动力学、不同的杂交结合动力学、不同的标记物电导或其组合。
在其他情况下，通过信号水平进行的定量可以从动力学产生，其中在一段时间内的平均电流可以指示标记物的类型，并因此可以指示标记物可能结合到的相关核苷酸类型，以及标记物可以结合到例如可以包含聚合酶、引发的核酸和包含标记物的核酸的复合物的平均时间长度。作为一种或多种不同核苷酸和相关标记物的Kon和Koff的结果，电流水平可以变化。
在某些情况下，一种或多种类型的具有磷酸酶活性的酶可以被反应混合物包含，使得一种或多种具有磷酸酶活性的酶可以减少被水解的碱基的数目，并因此阻止或减少被未标记的聚合酶结合的正常标记的碱基或本应可掺入但由于磷酸酯链截短而变得不可掺入的碱基的数目。在其他情况下，通过追踪平均信号并对增加的水解水平进行补偿，预期的平均电流可以补偿由水解碱基造成的信号缺失；补偿可以使用水解碱基的预期数目或百分率增加的曲线或公式来进行，或者可以从测量到的电流水平推演。
将隧穿标记物用于RNA测序
在某些情况下，可以将RNA依赖性RNA聚合酶用于RNA测序延伸实验，例如被RNA病毒利用的RNA依赖性聚合酶，例如脊髓灰质炎病毒3Dpol、水疱性口炎病毒L和丙型肝炎病毒非结构性NS5B蛋白或真核生物的RNA依赖性RNA聚合酶。
在其中样品RNA链可以被测序或可以进行序列测定或定量测定法的某些情况下，可以使用RNA连接酶来结合通用引物或还包含条形码的引物，例如T4 RNA连接酶1，其可用于将ssRNA引物或可以包含条形码的引物结合到样品ssRNA链，或T4 RNA连接酶2，其可用于结合发夹RNA引物或可以包含条形码并且可以是嵌合体的引物，使得引物可以进一步包含连接到样品ssRNA链的DNA。
在某些情况下，可以使用反转录酶，例如HIV反转录酶例如HIV-1或HIV-2反转录酶、商品化的反转录酶例如Affinityscript(Agilent)(Arezi和Hogrefe 2009)、Maxima(ThermoScientific)、RocketscriptTM(Bioneer)、ThermoscriptTM(Life Technologies)和MonsterscriptTM(Illumina)或(AccuScript；Stratagene)、非LTR-反转录转座子或II类内含子反转录酶例如来自于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)的反转录酶、高准确度反转录酶例如RTX(反转录酶异种聚合酶)或Phi6 RNA聚合酶。
在某些情况下，在测序步骤期间可以引起反转录酶终止。引起反转录酶终止的碱基可以是天然存在的碱基或者可以从后文中所描述的结合产生，其可以被鉴定为或者可以被简单地鉴定为反转录酶终止位置，在所述位置中结合组成部分导致碱基不能被识别。可以进行多个测序步骤，其中可以进行具有反转录酶终止的同一个位置的重复读取，然后进行除去结合组成部分或提供可以与修饰的碱基进行碱基配对的碱基中的一者或多者的步骤，由此允许互补碱基的掺入和随后被延伸互补链的进一步延伸。
在某些情况下，反转录酶终止可以通过反转录酶来实现。反转录酶终止可以由RNA依赖性RNA聚合酶或DNA依赖性DNA聚合酶由于碱基修饰或者由于结合组成部分被结合到引起反转录酶终止的碱基而不能掺入互补碱基的这种无能性引起。
在某些情况下，反转录酶终止可以由天然存在的修饰碱基或由氧化的碱基引起。随后的测序步骤可以使用能够与引起反转录酶终止的碱基进行碱基配对的修饰碱基。
在其他情况下，反转录酶终止可以由优先与一种或多种修饰碱基结合或相互作用的一种或多种抗体、酶、其他分子或其组合来实现。随后的测序步骤可以使用可以与引起反转录酶终止的修饰碱基进行碱基配对的修饰碱基，以便允许碱基的掺入并允许互补链的进一步延伸。在某些情况下，可以通过处理步骤除去抗体、酶或其他分子，从而允许互补链的进一步延伸。
在某些情况下，可以使用可以是跳读方法的测序方法，由此作为反转录酶终止的结果，可以使跳读期间额外的引物延伸停止。随后的步骤可以鉴定引起反转录酶终止的修饰碱基，然后进行足够的测序步骤以便鉴定反转录酶终止的位置和诱发性修饰碱基。
在某些情况下，特别是在RNA或DNA依赖性聚合酶可能不具有置换活性或者可能具有弱的链置换活性的情况下，可以与DNA依赖性聚合酶、RNA依赖性RNA聚合酶或反转录酶相组合使用RNA或DNA解旋酶，以帮助读段通过二级结构，或置换可能被结合到靶DNA或RNA链的互补链、miRNA、lncRNA或其他组成部分。
在某些情况下，可以将DNA或RNA解旋酶通过接头结合到DNA聚合酶、反转录酶或RNA依赖性RNA聚合酶，以便提高联合操作的可能性，从而更好地除去二级结构。在某些情况下，DNA或RNA解旋酶可以被提供成不与DNA聚合酶、反转录酶或RNA依赖性RNA聚合酶结合。在某些情况下，除了与DNA聚合酶、反转录酶或RNA依赖性RNA聚合酶相结合的DNA或RNA解旋酶之外，还可以添加其他聚合酶辅助蛋白例如单链结合蛋白。在某些情况下，可以使用核糖体代替聚合酶，由此可以使用成组的标记的tRNA来解码密码子，并由此给出mRNA的密码子图谱和/或提供翻译的直接监测。在某些情况下，核糖体可以与标记的氨基酸一起使用，从而允许翻译的直接监测。
将隧穿标记物用于其他测序方法
在某些情况下，用于隧穿和/或跳跃检测的系统可以使用下述方法，所述方法可以包括使用RNA依赖性RNA聚合酶、DNA依赖性DNA聚合酶或反转录酶来产生第二链，其中可以使用RNA依赖性和/或DNA依赖性连接酶和/或工程化改造的连接酶将发夹引物连接在RNA链的一个或两个末端处，所述连接酶可以连接RNA或DNA，以产生可以使用所述聚合酶和标记物重复读取的环化的链。
在某些情况下，可以使用核酶作为RNA依赖性RNA聚合酶，其可以包括修饰的核酶例如核酶24-3或其他修饰的核酶。在某些情况下，可以使用除了Mg之外的其他阳离子例如锰或其他二价阳离子来催化可以利用核苷碱基的掺入反应。核苷碱基可以包括标准的、表观遗传修饰的或合成的核苷碱基，其可以包含核糖或者可以包含本文中所描述的任何其他种类的骨架。在某些情况下，可以使用除了Ca之外的其他非催化性阳离子来留住核苷酸，所述核苷酸可以包含标准的、表观遗传修饰的或合成的核苷碱基，并且可以包含核糖或者可以具有本文中所描述的任何其他种类的骨架。
在其他情况下，可以使用DNA或RNA连接酶来连接通用引物或可以包含条形码的引物。引物可以是单链引物、双链引物或发夹引物。在某些情况下，对于例如可以在同一样品中包含RNA和DNA两者的单一样品来说，测定法可以利用RNA和DNA连接酶两者，以便例如允许从同一样品对RNA和DNA两者进行测序。RNA和DNA连接酶可以与不同的样品等分试样一起用于不同反应体积中。不同的反应体积可以在芯片的不同区域中、不同芯片中或分开的流体装置中。RNA和DNA连接酶可用于一个或多个共同反应体积中的单一样品，所述反应体积可以在芯片的区域中、不同芯片中或分开的流体装置中。
长读段
在某些实施方式中，在对以其他方式可能产生不确定的序列组装的重复序列区进行测序时，可能希望利用长读段或中间具有间隔的多个读段。在某些情况下，传感器阵列可以允许在芯片的不同部分或多个芯片中跳读方法的跳读期以不同的速率进行。速率的差异可以由可掺入的核苷酸的可用浓度的差异、不可掺入的核苷酸的浓度差异、温度、聚合酶的类型或变体或影响掺入动力学的任何其他方法引起。
在需要长读段的情况下，测定法可以提供一种或多种不同类型的核苷酸，同时提供一段时间的催化性阳离子例如镁和/或锰。数据可以被收集或不被收集。序列可以被确定或不被确定，或者可以被部分确定。在一段时间内，掺入速率可以远高于使用其他方法可能获得的速率，由此，可以轮流使用非催化时段、催化时段和清洗时段的循环。
在某些情况下，在可以快速延伸引物但可以提供或不提供高质量序列数据的时间段中，可以使用未标记的核苷酸或标记和未标记的核苷酸的混合物。在某些情况下，可替选地或另外地，可以将标记和/或未标记的核苷酸与封端的碱基相组合使用，其中封端的碱基可以导致阻止聚合酶进一步延伸。在某些情况下，可以提供所有4种未封端的碱基类型(AGCT)和单一类型的封端碱基。在某些情况下，可以提供少于或等于约3种未封端的碱基类型和一种或多种封端的碱基类型。封端的碱基类型可以包含没有提供在一组未封端的碱基中的一种或多种碱基类型。封端的碱基类型可以包含提供在一组未封端的碱基中的一种或多种碱基类型。封端的碱基类型可以包含提供在一组未封端的碱基中的碱基与没有提供在一组未封端的碱基中的碱基的组合。在其他情况下，可以使用不同的成组的未封端和/或封端的碱基，其中在不同的成组的碱基中不同的碱基类型可以是封端或未封端的。
可以将封端的碱基的终止物除去，然后可以提供同一组碱基或不同组的碱基，或者所述的使用非催化、催化和清洗循环的一组循环。封端的碱基可以包含核糖3’或2’终止物，或者可以包含虚拟终止物或Lightning TerminatorsTM。
在某些情况下，非催化性二价阳离子可以包括钙、钪、钛、钒、铬、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、砷、硒、铑或锶，或这些元素的混合物。催化性阳离子可以以允许二价阳离子与dsDNA缔合的浓度提供。dsDNA可以包含标记物、延伸的引物或可以存在于流动池中的其他dsDNA来源，并且提供用于结合到聚合酶和/或其他酶的另外的催化性二价阳离子。
在某些情况下，DNA聚合酶可以与DNA核苷酸一起使用。在其他情况下，RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP或RDP)或RNA复制酶例如phi6 RNA聚合酶可以与RNA核苷酸一起使用。在某些情况下，可以提供引物。在使用RdRP的情况下，可以不提供引物，并且所述聚合酶可以自我引发。在某些情况下，可以使用动力学进行RNA二级结构的检测。
在某些情况下，核酸聚合物或包含核酸聚合物的嵌合体可以用作酶阻断组成部分，并且在酶结合到可以包含电极对的电极结构之后可以被除去。酶阻断组成部分可以阻断例如可能不具有链置换活性的聚合酶进行的引物延伸。这种酶阻断组成部分可以例如被合成，使得不使用标准的磷酸二酯键，并且可以使用不能被聚合酶的外切活性切开的另一种连键例如硫酸二酯(sulphodiester)、硫代二酯或砷代二酯键或硫代磷酸酯，并且可以具有键，或者可以包含不可被外切核酸酶在核酸聚合物的一个或多个位置处容易地降解的组成部分，所述核酸聚合物可以包括可以被聚合酶或其他酶的外切核酸酶活性切开的第一个碱基。
在某些情况下，核酸聚合物或嵌合体的去除可以通过提供下述条件来实现，所述条件可以包括温度、二价阳离子浓度和pH，从而促进从酶除去用作酶阻断剂的核酸聚合物或可以包含核酸聚合物的嵌合体，并且可以与其他聚合物组合，所述其他聚合物可用作酶阻断剂以阻止随后的复合物接近，从而允许随后的样品核酸引入和样品核酸的进一步测序或序列鉴定。
在某些情况下，核酸聚合物或可以包含核酸聚合物的嵌合体，可以具有切口位点和跨越所述切口位点的第二链，使得在酶阻断物酶复合物结合到电极结构后，可以提供核苷酸，并且可以具有链置换能力的酶可以延伸所述核酸聚合物或可以包含核酸聚合物的嵌合体，置换第二链，然后释放出所述核酸聚合物或可以包含核酸聚合物的嵌合体。
在某些情况下，核酸聚合物或可以包含核酸的嵌合体，可以具有切口位点和跨越切口位点的第二链，使得在酶阻断物酶复合物结合到电极结构后，可以改变温度和其他条件例如盐浓度，使得第二链可以被变性，同时保留酶的功能。在某些情况下，然后可以提供核苷酸，并且可以不具有链置换能力的酶可以延伸核酸聚合物或可以包含核酸聚合物的嵌合体，从而释放出所述核酸聚合物或可以包含核酸聚合物的嵌合体。
在某些情况下，酶阻断物或接头可以包含核酸聚合物，并且可以使用切口酶在特定位置处切开核酸聚合物并从例如表面释放出所述酶阻断物或接头。在某些情况下，酶阻断物或接头可以包含氨基酸聚合物，并且可以使用位点特异性蛋白内切酶在特定位置(或位点)处切开所述氨基酸聚合物并从例如表面释放出所述酶阻断物或接头。在某些情况下，酶阻断物或接头可以包含可以使用化学切割而不是生物化学切割选择性切开的部分。
在某些情况下，为了提高有效覆盖度，可以重复切口过程，允许重新读取之前延伸的样品链。在其他情况下，除了切口位点之外或代替切口位点，可以使用可化学切割的连接，以便允许切口形成。
在某些情况下，可以具有磷酸酶活性的一个或多个组成部分，可以与一组标记的核苷酸联合提供；这些组成部分可以包括磷酸酶例如虾碱性磷酸酶、核苷酸酶和各种不同的其他已知的酶和化学切割试剂。这些具有磷酸酶活性的组成部分可以阻止已被水解而可能未标记并且可能被掺入的标记的核苷酸类型的结合和可能的掺入。
在其他情况下，为了补偿未标记的核苷酸相对于标记的核苷酸的百分率的变化，特别是在可以测量大量不同核苷酸结合速率以便确定被查问碱基的类型、可以包括确定例如被查问碱基的甲基化状态的方法中，可以使用已知碱基的测量值和/或直方图的测量值来补偿平均信号水平的变化，所述变化可能由未标记的核苷酸的百分率水平的变化引起，和/或出于其他原因例如温度控制、盐浓度或可能影响测量的动力学和/或信号水平的其他因素的误差。在其他情况下，可以使用以前测量到并因此推测的信号水平的变化来补偿在运行的长度内预期的信号水平变化。
在某些情况下，可以确定RNA或DNA表观遗传学。在其他情况下，RNA和DNA表观遗传学两者可以通过单个系统的一部分被确定。RNA和DNA表观遗传学可以在不同芯片的不同体积中、单一芯片的不同体积中或一个或多个芯片中的共同体积中被确定。
在某些情况下，可以为单个细胞或一组细胞确定RNA和/或DNA表观遗传学，所述一组细胞已例如通过流式细胞术分离以具有一致的特征，例如尺寸、粗糙度或者抗体或适体可以结合到其上以用于鉴定、分离和隔离的特异性结合位点。
在某些情况下，为了在所需位置停止或限制否则可能不受调控的一系列掺入事件的长度，可以利用例如不能被聚合酶作用例如链置换或3'至5'外切核酸酶活性除去的探针来停止聚合酶掺入。这种探针可以是定向探针或者可以是随机探针。探针可以包括含硫基团，以便可以抑制3’至5’外切核酸酶活性，或者可以利用空载的锁DNA，以便防止链置换活性能够置换探针。然后可以利用清洗程序除去核苷碱基和/或催化性二价阳离子。例如，可以升高温度和/或可以降低盐浓度以允许除去探针。然后可以开始或重新开始本文中所描述的测序方法。
在某些情况下，在上文中所描述的任选地重复的步骤a)和b)中，盐浓度和/或用于观察上文中所述的不同的成组核苷酸的结合和/或动力学的积分时间，对于不同的成组的核苷酸来说可以相同。在其他情况下，如果需要，对于不同的成组的核苷酸来说盐浓度和/或积分时间可以不同，以例如达到与表观遗传修饰检测相关的所需置信水平。
在某些情况下，隧穿和/或跳跃检测可以使用可能仅利用标准碱基或其他碱基的方法，所述其他碱基可以是天然存在的表观遗传碱基或合成的碱基，这些碱基被确定为在使用特定的RNA依赖性RNA聚合酶、DNA依赖性DNA聚合酶或反转录酶来延伸引物并由此形成可以是RNA、DNA或cDNA链的第二链时，在考虑特定碱基或邻近碱基的掺入时提供最低的掺入错误。在某些情况下，可以使用另外的修饰碱基来防止聚合酶例如反转录酶作为表观遗传修饰例如N1-腺苷、M3-甲基胞嘧啶、N1-甲基鸟苷或可以引起较低结合或空间位阻的其他修饰的碱基的结果而暂停。
在某些情况下，可以使用对tRNA的表观遗传修饰，而在其他情况下，可以使用具有不同表观遗传修饰的tRNA。同样地，可以使用未修饰的氨基酸，而在其他情况下，可以使用表观遗传修饰的氨基酸。
在某些情况下，可以使用修饰碱基特异性的结合组成部分。修饰碱基特异性的结合组成部分可以包括m6A结合蛋白例如YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3或YTHDC1。修饰碱基特异性的结合组成部分可以与一组或更多组核苷酸相组合使用，作为确定碱基和/或其表观遗传修饰物的一部分。修饰碱基特异性的结合组成部分可以包含隧穿标记物。修饰碱基特异性的结合组成部分可以是未标记的，但是可以影响结合的动力学和/或其他标记的组成部分例如标记的核苷酸的结合事件之间的时间。在其他情况下，可以使用修饰或合成的碱基以便防止反转录酶停止，由此限制或消除cDNA的生产的截短，并因此允许读取完整或更加完整的RNA链。
在某些情况下，可以使用抗体。抗体可以强或弱结合到特定核苷碱基例如m6A核苷酸。核苷酸可以是核糖核苷酸，由此和标记的互补核苷酸与样品核苷酸的结合相关的动力学和电流可以被更好地区分，所述样品核苷酸包含被聚合酶复合物查问的样品多核苷酸链，其中所述样品核苷酸可以具有不同的表观遗传修饰。
在某些情况下，除了标准的DNA和RNA核苷酸和其他非天然存在的核苷酸之外，可以使用包括5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺苷、N3-甲基腺苷、N7-甲基鸟苷、5-羟基甲基胞嘧啶、假尿苷、硫代尿苷、异鸟苷、异胞嘧啶、二氢尿苷、Q苷、怀俄苷、肌苷、三唑、二氨基嘌呤、β-D-吡喃葡萄糖基氧基甲基尿嘧啶、8-酮基鸟苷或2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-甲基鸟苷或2'-O-甲基尿苷的修饰碱基来确定被查问碱基的身份，其中待鉴定的碱基的身份可以是任何标准的DNA和RNA核苷酸，或者可以是5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺苷、N3-甲基腺苷、N7-甲基鸟苷、5-羟基甲基胞嘧啶、假尿苷、硫代尿苷、异鸟苷、异胞嘧啶、二氢尿苷、Q苷、怀俄苷、肌苷、三唑、二氨基嘌呤、β-D-吡喃葡萄糖基氧基甲基尿嘧啶、8-酮基鸟苷或2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基胞苷、2'-O-甲基鸟苷或2'-O-甲基尿苷。
将隧穿标记物用于其他应用
在某些情况下，可以将上文中所描述的隧穿标记物化合物和隧穿电极对用于除了DNA测序之外的其他应用。在某些情况下，可以将与许多不同靶互补的形成SAM的许多不同的核酸链结合到不同的成组的电极对，然后引入靶核酸，并且作为靶核酸杂交的结果，可以实施隧穿电流的测量。在某些情况下，形成SAM的核酸链可以包含拉链或条形码，能够使用标准的一组许多不同的形成SAM的核酸链类型检测许多不同类型的靶分子。在某些情况下，所述许多不同的形成SAM的核酸链类型可以作为工厂加工的一部分结合到不同电极组，并作为许多不同的形成SAM的核酸链的完整套件运输。在其他情况下，所述许多不同的形成SAM的核酸链类型可以被形成为在野外通过仪器执行的方法的一部分。
在某些情况下，可以形成SAM的至少一部分的核酸链可以包含碱基修饰。碱基修饰可以是核苷碱基的α磷酸酯的硫醇化，使得所述核酸链不能作为扩增过程的一部分延伸，而是代之以只能杂交到靶或扩增子。在某些情况下，核酸链可以是或不是可延伸的。在核酸链是可延伸的情况下，在扩增过程中可以形成双链核酸。
在某些情况下，作为进行平端连接的结果可以使用通用引物。连接可以在仪器中进行。仪器可以形成上文中所描述的具有芯片的系统。连接可以在芯片内进行，例如在与含有用于测序的电极对的体积分开的体积中。连接可以手动进行，或者在与可形成上文中所描述的带有芯片的系统的设备分开的其他设备中进行。
在其他情况下，引物可以如后文中针对图4所描绘和描述的，使用杂交和随后的连接来连接。杂交可以是特异性的，利用与所需区域互补的探针。在某些情况下，对于可能与靶核酸的末端交叠的区段来说，杂交可以使用通用碱基例如肌苷来实施。
在某些情况下，隧穿检测电极对可以用SAM功能化。SAM可以至少部分包含核酸链。SAM可以在电极对的两个电极上使用相同的核酸链，由此使SAM的制造过程更加容易。在某些情况下，当在不同方向上施加电位时，由于例如对于用于分子装置的化合物来说是通常情况的不对称的原子结构，隧穿标记物化合物可以产生不同的隧穿电流。
在某些情况下，隧穿电流电极对可用作系统的一部分以检测定量PCR或数字PCR。所述隧穿电流电极对可以包含SAM。SAM可以包含核酸序列(例如核酸链)。核酸链可以至少部分地与提供在溶液中的加尾探针互补。加尾探针可以在扩增反应例如PCR反应或等温反应(例如链置换扩增(SDA)或环介导的等温扩增(LAMP))中被消耗。电极对的一个电极上的SAM可以至少部分地与探针的尾部互补。电极对的另一个电极可以至少部分地与探针的一部分互补。探针的一部分可以结合到靶或扩增子链。探针的一部分可以在链延伸期间作为链延伸的一部分被聚合酶有效地消耗，由此防止探针与电极对的两个电极的结合。在扩增反应期间隧穿电流的降低可以是探针消耗的指示性度量，并因此是所述扩增反应之前存在的特定靶核酸的存在和/或量的指示性度量。
在某些情况下，SAM可以包含至少部分与引物互补的核酸链。引物可以与靶核酸或其互补体互补。所述核酸链可以至少部分与引物的尾部互补，所述尾部可以不与靶核酸或其互补体互补。在扩增反应开始时，引物可以结合到电极对的一个电极或另一个电极，但是不可以桥接电极对并因此不可以提供隧穿通路。当扩增反应进行时，扩增子产物可以至少部分与电极对的两个电极互补，并且可以提供隧穿通路，所述通路可以提供增加的电流。这种电流的增加可以指示来自于扩增反应的增加量的扩增子的存在。
在某些情况下，可以使用不同的电极对。不同的电极对可以具有不同的SAM组。SAM可以直接对应于不同的核酸靶。在某些情况下，不同电极对可以具有对应于引物尾部的不同的SAM组，所述引物尾部可用于在使用具有同一套引物尾部的不同引物组时允许单一类型的SAM与许多不同类型的测定法一起使用。
在某些情况下，系统可用作实时PCR或等温扩增(例如SDA)的检测器。可以将自组装单层(SAM)配置在电极对的电极的表面上。电极对的电极上的SAM可以包含相同或不同的寡核苷酸。然后可以使用与配置在至少一个电极上的SAM匹配的引物，通过例如检测作为扩增反应的结果产生的互补的延伸扩增产物来检测扩增产物。在某些情况下，可以使用可以与电极对的至少一个电极上的SAM层的寡核苷酸互补的引物。
在某些情况下，未延伸的引物的长度可能不足以跨越电极之间的宽度或间距，但延伸的引物扩增产物的长度可以足以跨越电极之间的宽度或间距。在某些情况下，包含一个电极上的SAM的至少一部分的寡核苷酸可以与引物对的一个引物一致或基本上一致，而包含相反电极SAM的至少一部分的寡核苷酸可以与引物对的第二个引物至少基本上一致，从而允许直接杂交到与电极对的两个电极的SAM缔合的寡核苷酸。在某些情况下，引物可以包含可能不与靶核酸聚合物互补的尾部。SAM可以利用相同的序列作为引物尾部，其中对于两种引物来说引物尾部可以一致，或者SAM可以包含与引物对的两个引物相关的不同序列。引物尾部可以与靶序列或其至少一部分互补或一致。
在某些情况下，扩增产物链(或延伸链)可以结合到两个电极之一。延伸链可以与和所述两个电极缔合的仅仅一组寡核苷酸互补，而与延伸链互补的核酸链可以结合到与电极对的第二个电极缔合的寡核苷酸。所述两条链可以作为横跨电极对的两个电极之间的间隙的部分单链和部分双链的DNA导电。两条链可以杂交到表面结合的寡核苷酸和互补链两者，所述互补链也可以被结合到与电极对的第二个电极缔合的寡核苷酸。
在其他情况下，延伸的引物可以结合到两个电极上的不同寡核苷酸，并且可以作为完全双链或部分单链和部分双链导电。在某些情况下，标记物可以略微长于间隙(例如纳米间隙)的宽度或间距，以确保在考虑到与间隙制造相关的任何公差之后标记物可以具有足够的长度。特定传感器的间隙或纳米间隙可以宽于或大于标称宽度或尺寸，并且为了确保标记物在首先结合到一侧后有机会与相反电极的更大区域结合，标记物可能需要比标称间隙宽度或间距更长。如果标记物将被结合到一个电极，并且标记物的长度与间隙的宽度相同，则为了使所述标记物结合到相反一侧，需要结合位点与标记物可以结合到的相反的结合位点完美对齐。因此，标记物可以被制造得更大，使得标记物，其正如使用双链DNA时可能发生的那样可能是相对刚性的标记物，可以与相反电极上可以采取圆环横截面形状的结合组成部分结合，并且圆环横截面的内环与外环直径之差可以至少由标记物的柔性和结合组成部分的角度柔性的组合导致。
标记物可以被设计成使得在结合到一个电极后，标记物可以能够与相反电极的区域结合。区域可以具有大于或等于约1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm或更大的内直径。区域可以具有可以比内直径大至少约1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm或更多的外直径。可以能够在这种区域中结合的标记物可以被认为是略微大于间隙间距。
标记物可以比间隙的宽度或间距更长。间隙的宽度可以被认为是金属表面之间的距离。间隙的有效宽度可以被认为是结合组成部分之间的距离，所述结合组成部分可以被构造成结合到接头。接头相对于电极的金属表面可以具有典型的角度。接头相对于金属表面的角度可以至少随着结合机制的类型、SAM密度、接头类型、结合组成部分和/或接头的电荷而变化。在将长接头用于粘附末端SAM的情况下，或者在结合组成部分包含可以是单链和双链两者的粘附末端的情况下，以及在可以是单链和双链两者的粘附末端的双链部分可能更接近于接头并因此可能更接近于金属电极的情况下，间隙间距或有效间隙间距可以比金属表面之间的宽度或间距更窄。
在某些情况下，可以将单一类型的寡核苷酸序列用于电极对的两个电极，并且可以将所述单一类型的寡核苷酸序列杂交到一条样品链而不是与样品链互补的链，从而提供用于隧穿和跳跃电导的部分单链和部分双链的核酸聚合物，其可以仅仅在一个末端被结合。
在某些情况下，可能希望电导最小化，以便不会作为与少量扩增产物相关的高电导的结果而饱和与电极对相关的检测器电子器件，所述饱和不可以提供统计上可靠的Ct值。因此，可能希望最小化各个扩增产物的电导，例如通过在表面与包含SAM的一部分并且可用于杂交所述扩增产物的寡核苷酸之间使用更长的接头。
在某些情况下，电极可以被构造成用于捕获单个分子或复合物。电极可以被构造成用于捕获同一类型的多个靶。测量到的电流水平可用于确定被捕获的分子的数目。
在可以靶向单个靶核酸聚合物的情况下，可以将多个酶与单个电极对或与多个电极对结合或缔合。测序或序列检测过程可以不旨在确定靶的序列，而是可以用于检测和定量靶核酸聚合物的拷贝数。这一过程可以在扩增反应后、作为扩增反应的一部分或在不使用扩增反应的情况下进行。
在某些情况下，隧穿标记物可用于检测与核酶相关的酶活性，其中tRNA分子或氨基酸可以进一步包含隧穿标记物，并且可以监测氨基酸的结合和向蛋白质掺入的动力学和/或顺序。
在某些情况下，多个电极对可用于靶向不同的单核苷酸多态性，使用具有上文中所描述的不同缔合互补体的不同电极对。可以使用同一标记物或不同标记物检测不同的电导，其中不同的电导水平指示了靶区域中SNP的相对数目。
在某些情况下，隧穿或隧穿和跳跃检测器可用于直接检测miRNA，使用不同电极上的不同SAM，其中每个不同的SAM可以与不同的大约一半的miRNA或其他非常短的RNA互补。竞争性杂交反应可以由不可以跨过与电极对相关的间隙有效地导电的miRNA或另一种非常短的RNA与竞争性寡核苷酸之间的竞争引起，所述竞争性寡核苷酸可以跨越间隙，并且能够杂交到与电极对的两个电极缔合的SAM。
在某些情况下，miRNA或其他非常短的RNA的检测可以通过形成与带有SAM的电极对相关的间隙来实施，所述SAM包含与桥接寡核苷酸互补的寡核苷酸，所述桥接寡核苷酸可以与缔合到电极对的电极的SAM的寡核苷酸互补。桥接寡核苷酸还可以与靶向的miRNA或其他非常短的RNA互补。桥接寡核苷酸可以被引入到电极对的相应电极的SAM并被允许与所述SAM杂交，由此建立样品引入之前的基线电流。可以包含靶miRNA或其他非常短的RNA的样品的引入，可以允许miRNA或其他非常短的RNA杂交到桥接寡核苷酸。杂交可以引起电导增加，其随后可以被定量以指示miRNA或其他非常短的RNA的数目或浓度。
在靶分子例如核酸链可能具有足够长度以跨越与电极对相关的间隙的某些情况下，可以不使用桥接寡核苷酸。靶分子可用于结合到与结合到电极对的电极的SAM缔合的寡核苷酸。与SAM缔合的寡核苷酸可以与靶核酸链的一部分或全部互补，使得当靶核酸链被引入并允许与所述SAM的寡核苷酸杂交时，可以测量电导的增加，并且可以对靶核酸链的数量进行定量。
在某些情况下，靶核酸链可以长于与电极对的电极缔合的寡核苷酸，并且可以具有足够的长度以允许其他探针寡核苷酸在与缔合到电极对的电极的寡核苷酸互补的区域之间进行的杂交，检测过程可以包含组合的靶核酸链、与电极对的电极缔合的寡核苷酸和探针寡核苷酸的检测。
在某些情况下，可以将特定长度的寡核苷酸置于两个电极之间，并且可以使用所述两个电极之间的偏压并测量通过寡核苷酸的电流，来测量寡核苷酸的电导。电流信号可以包含隧穿或隧穿和跳跃电流。在测量到的电流的基础上，可以确定关于所述寡核苷酸的某些生物或诊断信息。在某些实例中，可以确定具有和不具有甲基化的寡核苷酸之间的差异。在预期寡核苷酸上的特定位点具有甲基化的情况下，这种方法可以是特别有用的。如果在所述寡核苷酸中可以包含超过一个可能的甲基化位点，则可能测量到超过两个不同的电流水平，例如第一电流水平对应于无甲基化，第二电流水平对应于第一位点上的一个甲基化，第三电流水平对应于第二位点上的一个甲基化，第四电流水平对应于第一和第二位点两者上的甲基化。在寡核苷酸的长度可能大于两个电极之间的间隙宽度或间距时，这种方法可以良好地工作。例如，如果寡核苷酸为100个碱基或碱基对并且间隙尺寸为约15纳米，则这种方法可以非常适合地被使用。
在某些情况下，寡核苷酸的长度可能大于所述间隙尺寸。例如，人们可能使用100个碱基或碱基对的寡核苷酸和15纳米的间隙，但寡核苷酸的用作隧穿标记物的部分的长度可能为60个碱基或碱基对。在这种情况下，寡核苷酸的一个或两个末端可以被杂交到两个电极，并有一部分跨越所述间隙。杂交可以例如使用配置在两个电极上的互补SAM来进行。根据这种方法，只能测量到寡核苷酸或其他生物样品的一部分的电导，并且可以鉴定基于所述电导的生物信息。例如，人们可以鉴定在寡核苷酸上是否存在如上文中所述的一个或多个甲基化位点。
在某些情况下，相比于长度与缔合到电极对的电极的寡核苷酸相近的单一寡核苷酸的杂交，或者长度为缔合到电极对的电极的寡核苷酸的合并长度的更长的寡核苷酸的杂交，靶核酸链的检测特异性可以利用与电极对的电极缔合的两个寡核苷酸的杂交来提高。在某些情况下，在使用与电极对的电极缔合的两个寡核苷酸之外还使用杂交到靶核酸链的探针寡核苷酸，可以进一步提高特异性。
在可能希望检测由于AT含量高而使电流对准确定量来说过低的序列的情况下，可以使用可以与靶核酸聚合物互补并且可以结合到靶核酸聚合物的发夹。发夹可以包含高GC含量。发夹可以是ssDNA、dsDNA或四聚体。靶的存在可以由靶与发夹结构的结合导致的使高GC部分更接近所造成的电流增加来确定。发夹可以包含DNA，其中不具有高GC含量的区域可以与靶核酸互补。发夹可以是适体、抗体或任何其他的结合组成部分。高GC部分可以被结合到电极对的一个或两个电极，直接结合到导电电极或结合到可以覆盖导电电极的电介质。在某些情况下，高GC含量可以是高于50％、高于60％、高于70％或高于80％的GC含量。
在某些情况下，与靶结合的发夹的至少一部分可以直接结合到电极或与电极相关的电介质，或者可以是结合到富含GC的DNA区域的末端或末端之间的独立的组成部分。在其他情况下，被称为高GC区的区域可以不是核酸链，而是可以是具有高隧穿或隧穿和跳跃电导率的其他分子，例如本文中所描述的其他聚合物或其他分子。这种分子可以是核酸和其他聚合物的嵌合体，或者可以是抗体和核酸的嵌合体，或者可以是抗体和具有高隧穿和/或跳跃电导率的其他分子例如本文中所描述的其他聚合物或其他分子的嵌合体。
在某些情况下，特别是在需要进行连续传感的情况下，例如在可以使用芯片或传感器作为水或空气监测传感器，或者可以将芯片或传感器与液相或气相色谱系统、毛细管电泳系统联合使用或作为检测器用于任何其他适合的分离系统的情况下，可以使用单样品分配。单样品分配可以是连续的水相或气相分配。单样品分配可以使用隧穿和/或跳跃检测器，并且可以连续监测来自于分离技术的输出。分离技术可以使用重置来进行，以例如允许更宽的动态范围或减少非特异性结合的影响，或者在整个运行上进行以便将信号积分，这在输入浓度可能是低的时可以是有利的。分离技术可以提高局部浓度，用于更容易和/或更准确的检测。
在某些情况下，隧穿和/或跳跃检测器可以与气相色谱联合使用，其中结合组成部分可以与电极对的电极结合或缔合，然后可以特异性或非特异性地与靶分子结合。
在在液相色谱分离可以与隧穿检测联合进行的某些情况下，可以产生未知幅度的流动电位。允许表面相对于底层电极电位漂浮，可以允许施加适合的隧穿电位，这可以使用电介质覆盖的电极和在电极之间施加的AC电位来实现。
在某些情况下，可以将标记物结合到抗体。抗体可以靶向蛋白质抗原、表观遗传修饰的核苷酸例如6-mA RNA碱基或其他修饰的RNA或DNA核苷酸。
传感器芯片：一般用法
在某些情况下，本公开的系统和方法可以使用芯片。芯片可以包含可重复使用的芯片。芯片可以在不同运行之间移除至少一些靶被分析物、酶和SAM。移除可以通过例如升高温度、降低离子浓度、化学清洁、等离子体清洁、酶法清洁、电位清洁、任何其他类型的清洁程序或其组合来实现。这些清洁可以包括核酸酶、蛋白酶例如蛋白酶K。清洁可以包括改变电极与本体溶液之间的电位使得可以除去硫醇化的SAM，或任何其他方法。在某些情况下，可以监测各种不同传感器区域处的芯片，以确定多少传感器是活动的并产生良好质量的数据。在某些情况下，芯片可以被编程，例如在具有编程的寿命以用于一定数目的运行的本地闪存中。编程的芯片寿命可以显著降低测序费用并同时维持可靠性。
在某些情况下，与隧穿标记物相互作用的电子或空穴可以隧穿到隧穿标记物中，或者可以隧穿通过并可以跳跃通过隧穿标记物。电子或空穴可以隧穿通过隧穿标记物的一部分并跳跃通过所述隧穿标记物的其他部分。电子或空穴可以在隧穿标记物的可以发生隧穿的一些区域与可以发生跳跃的区域之间反复地转移。
在某些情况下，可以获得高数据密度。高数据密度可以由每个碱基产生的极少量原始数据产生。高数据密度可以作为使用传感器的单次读取来确定可能存在4种或更多种碱基类型中的哪种类型的能力的结果而获得，与需要对每个碱基进行多次读取的现有传感器相反。由于反应发生的时间是未知的，非同步化学方法可能需要频繁测量。在其他情况下，可能需要多个像素的读取以便确定与缔合至不同碱基类型的荧光团相关的颜色。正如本文中提供的，少至单次读取可以足以确定哪种核苷碱基类型已被结合或掺入，因为信号的幅度可以指示碱基的存在和碱基的类型两者。因此，使用有限的数据输出能力产生高数据密度的芯片，与可能需要为每种颜色读取多个像素并且可能需要对应于4种标准碱基的4种颜色的现有系统相比，每单位时间可以产生明显更多的输出碱基。更高的数据密度可以便于减少分析数据集的计算硬件和/或时间。
在某些情况下，取决于应用并且如果被视为对特定测量中的总体准确率有帮助，本文中所描述的系统可以对每个碱基测量或查问超过一次。在某些情况下，系统可以使用单一样品进行一项或多项任务，包括测序DNA，测序RNA，确定具有或不具有化学修饰的DNA的表观遗传学，确定具有或不具有化学修饰的RNA的表观遗传学，确定DNA的拷贝数包括非整倍体的确定，确定不同转录本的表达水平，确定不同蛋白质的存在和数量，以及确定感兴趣的其他生物分子的存在和数量。在为单一样品执行这些测试时，系统可以利用RNA依赖性聚合酶与DNA依赖性聚合酶的组合。不同类型的聚合酶可用于不同芯片中。不同类型的聚合酶可用于单一芯片的不同体积中。不同类型的聚合酶可用于两个或更多个芯片的不同体积中，或者可以在一个或多个芯片的单一体积中一起使用。
在某些情况下，系统可以包含具有电极结构的芯片，并且可以不包含与不同传感器相关的放大器或行和/或列选择。测量所需的电路可以不是芯片的一部分，而是可以是其他芯片或电路的一部分。在其他情况下，本地放大器和任选地行和/或列选择电路可以包含芯片的一部分，而积分、双重相关、模数转换和数字输入输出端口可以不是芯片的一部分，而是可以是其他芯片或电路的一部分。
传感器电极
本公开的系统可以是高度可缩放的系统。例如，数百万或数十亿传感器可以被配置在尺寸与当前的DNA测序电子传感器相近的单一芯片上，包括被间隙隔开的两个电极，在单一器件上具有非常小的间距(pitch)。在某些情况下，芯片可以具有非常高的传感器密度。例如，单个芯片可以具有大于或等于约5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000、10,000,000、20,000,000、30,000,000、40,000,000、50,000,000、60,000,000、70,000,000、80,000,000、90,000,000、100,000,000、200,000,000、300,000,000、400,000,000、500,000,000、600,000,000、700,000,000、800,000,000、900,000,000、1,000,000,000、2,000,000,000、3,000,000,000、4,000,000,000、5,000,000,000个或更多个传感器/平方英寸的传感器密度。在某些情况下，可以使用较老的电路加工模式，以便可以制造各种不同的定制芯片设计而没有最先进的高密度模式例如14nm或不久将实施的10nm模式的花费。在某些情况下，传感器的密度可以不受光或扩散串扰限制。
在某些情况下，使用光刻法的芯片的大规模并行设计可用于在衬底上放置大量传感器。每个传感器可以具有被间隙隔开的两个电极。各个传感器可以以间距尺寸隔开。间距尺寸在X和Y轴上可以相同或不同。每个传感器可以具有单独的或多路复用的电子通路，以在电极对的电极之间配置偏压和/或读出隧穿电流。因此，每个电极可以是单独地可寻址并可读的，或者可以成组例如成行读出，其中每一列可以存在模数转换器。在某些情况下，与每一列相伴可以存在多个模数转换器，例如在列的相反末端，或者可以散布在列内。每个传感器上的电极可以从金、铂、铜、钯、银或其他货币或贵金属或石墨烯制造。货币或贵金属的使用可以促进巯基键合到电极。
在某些情况下，包含在传感器中的电极之间的间隙尺寸可以被设计成使得电极平行或在平行的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10度之内。所述电极也可以被设计成具有一定间距，使得SAM可以被设置在电极上，并且酶可以契合在电极之间的间隙中结合到电极的SAM层之间。
在某些情况下，如图3W中所示，电极或与电极相关的结构可以相对于彼此成一定角度，并且可以使用KOH蚀刻以产生倒截棱锥。与其相关的电极对342A和342B可以被形成为相对于彼此成一定角度，或者可以被制造成如上文中所述正面平行或基本上平行。结构可以具有宽度足以允许聚合酶或其他酶330进入的入口，同时具有对于聚合酶契合在其间来说过窄的成一定角度的表面340，并且还可以具有间距可以明显窄于聚合酶或其他酶330的电极，以便可以利用比聚合酶或其他酶的直径更短的标记物。
在某些情况下，电极之间的间隙尺寸可以窄于或小于约10nm，允许使用具有约30个碱基对的核酸标记物来测量电导。在某些情况下，间隙可以大于或宽于约2-3nm，以避免产生TLF假阳性并易于制造。
在某些情况下，可以利用一套流体通道以向配置在衬底上或靠近衬底的电极对分配试剂组、酶和/或聚合酶。在某些情况下，流体通道可以具有对应于芯片的物理读数配置例如每个多路复用放大器多行的宽度。流体通道可以具有足以容易供应试剂和酶的高度，其可以是100nm至200nm、200nm至500nm、500nm至1μm、1μm至5μm、5μm至10μm、10μm至50μm、50μm至250μm或大于250μm的高度。流体通道的宽度可以被制造成相当窄，因为它可以具有可能对应于数百或数千个传感器的宽度，因此高度的公差可以明显比假如流体通道覆盖整个芯片的情况下更严格。在其他情况下，与传感器相关的间隙(例如纳米间隙)可以比酶或聚合酶的宽度更宽。酶或聚合酶的宽度可以被认为是酶或聚合酶的最小维度，其中酶或聚合酶可以与部分单链且部分双链的核酸复合，并且酶或聚合酶的拇指可以相对于酶或聚合酶的手掌打开。核酸链的沿着结合在酶或聚合酶内或结合到酶或聚合酶以及复合在酶或聚合酶内的核酸部分的长度的轴，可以与包含间隙或纳米间隙的金属表面平行。在某些情况下，电极对的至少一个电极可以被电介质覆盖、部分覆盖或不被覆盖，并且电极对的第二个元件可以被电介质覆盖、部分覆盖或不被覆盖。
在某些情况下，传感器可以包含电极对。电极对可以被构造成用于检测隧穿或隧穿和跳跃标记物，或者可用于直接检测靶组成部分。在其他情况下，不使用下文中所描述的间隙，电极对可以被形成为不产生间隙或纳米间隙，但是除了不可以进行形成所述间隙的RIE步骤之外，在其他方面可以以相似的方式形成。在这些情况下，所述电极的活性区域可以基本上共平面。在其中测量中使用的聚合酶、酶或其他组成部分可以被结合到可形成感应和偏压电极之间的间距的电介质的这些情况下，与标记物缔合的接头和/或标记物的长度可以被形成得比在聚合酶、酶或其他组成部分被结合在感应和偏压电极之间的中点处的情况下所需的更长，以便将测量中使用的所述聚合酶、酶或其他组成部分的定位结合和移动的公差考虑在内。可以考虑的其他公差可以包括例如由扩散运动造成的在测量中使用的聚合酶、酶或其他组成部分相对于结合点的扩散，所述扩散运动由于在测量中使用的聚合酶、酶或其他组成部分可以容许的接头长度或在测量中使用的聚合酶、酶或其他组成部分的旋转而是可允许的。
在某些情况下，代替一对电极，可以使用电极的三元组、四元组或阵列(例如线性阵列)。电极可以被构造成某种排列方式，使得电极可以基本上共平面，并且在不同电极之间具有相同或不同的距离。
在某些情况下，电极可以被电介质覆盖或部分覆盖，使得DC电流可能极小并且在某些情况下可能不可测量，但可以施加AC场，并且除了任何电容电流之外还可以确定隧穿电流。这可以允许将隧穿和/或跳跃电流检测与通过另一种方法的分离例如电泳分离联合使用，其中当与电泳场相关的电位可能不被良好地确定或控制或可以变化时，与电泳分离相关的电场可能因此影响隧穿电流和/或与隧穿电极的结合。
在某些情况下，检测和定量可以使用如上文中所描述的动力学检测来实现，其可以是多个分子的动力学检测，或检测可以被固定结合的多个拷贝。在某些情况下，通过增加电极对的数目和/或尺寸，可以提高动态范围。
在某些情况下，结构可以使用各种不同的标准半导体加工方法来制造，其可以包括例如下述步骤并且如图3A至3D中所示：
1)从平面化衬底开始；
2)施加氧化硅层，其可以使用化学气相沉积法来施加；
3)施加光刻胶，其可以是UV敏感的掩膜或电子束掩膜；
4)暴露所述光刻胶，其中所述暴露可以使用标准的光掩模，或者可以使用直写方法例如电子束；
5)显影所述光刻胶；
6)施加金属层，其可以使用溅射方法来施加，如图3A的上图中所示；
7)除去所述金属层的不想要的部分，其可以使剥离法除去；
8)施加电介质层，其可以是氮化硅层，并且可以以可以是所需电极间隙间距的厚度施加，如图3A的下图中所示；
9)施加光刻胶，其可以是UV敏感的掩膜或电子束掩膜；
10)暴露所述光刻胶，其中所述暴露可以使用标准的光掩模，或者可以使用直写方法例如电子束；
11)显影所述光刻胶；
12)施加金属层，其可以使用溅射方法来施加；
13)除去所述金属层的不想要的部分，其可以使剥离法除去，如图3B中所示；
14)将所述表面平面化，这可以暴露出所述电极结构的所需部分，并且可以使用CMP(化学机械抛光)法来实现，如图3C中所示；
15)施加电介质，其可以是氮化硅或氧化硅层，其可以使用化学气相沉积法来施加；
16)施加光刻胶，其可以是UV敏感的抗蚀剂或电子束抗蚀剂；
17)暴露所述光刻胶，其中所述暴露可以使用标准的光掩模，或者可以使用直写方法例如电子束；
18)显影所述光刻胶；
19)进行干法蚀刻，其可以是反应性离子蚀刻，这可以在电极之间形成纳米间隙，并且可以在所述电极上方形成井点样结构；以及
20)除去所述光刻胶，这可以包含SPM(硫酸和过氧化氢)步骤，并且可以包含灰化步骤，如图3D中所示。
这种结构显示在下述图中：图3E，其示出了单个传感器的横截面；图3F，其示出了纳米间隙和两个相反电极的特写图；图3G，其示出了顶部氧化物层中的顶部井点结构和其间具有纳米间隙的两个电极，在所述电极中可以明显看到晶粒；图3H，其示出了大量传感器和金属连接；以及图3I，其示出了在不同缩放水平下的这种结构的横截面。
在可用于改进晶粒的取向，并且可以在电极间隙中产生与电极的相反表面相反的111晶体平面的其他情况下，初始层可以是电介质层，在其上可以形成用于形成第一电极的金属层，然后是所述间隙间隔电介质，然后是形成第二电极的金属层，产生图3J中示出的横截面图，其中两个电极在相同沉积方向上形成，从与所述第一电极的与活性表面相反的面到所述第一电极的活性表面，到所述中间间隙间隔电介质，然后是所述第二电极的活性表面，最后是所述第二电极的与第二电极的活性表面区域相反的无活性第二表面。然后沉积电介质并将所述结构平面化，产生横截面示出在图3K中的结构。
在某些情况下，为了更好地使酶、聚合酶或可用作测量的一部分的其他组成部分或可以具有用作测量的一部分的组成部分的尺寸的组成部分居中，并且其中可能希望在酶、聚合酶或其他组成部分的功能中防止空间位阻，可能希望在电极的活性表面上产生一个或多个层，其可以比可用作较晚时候的测量的一部分的SAM更长(更厚)。可以是可通过电镀形成的金属层或电介质层或SAM层的层的长度(或厚度)，可以在酶、聚合酶、或用作测量方法的一部分的其他组成部分的结合或附连之前形成；然后可以将酶、聚合酶或其他组成部分结合或附连到例如可以在电极之间形成间隙间隔的电介质层，并因此将酶、聚合酶或其他组成部分与电极隔开；然后可以除去用于将酶、聚合酶或其他组成部分与电极隔开的层，并且如果需要或希望，然后可以将SAM结合到电极。
在其他情况下，可以形成其中可利用竖直电极结构而不是如前文中所述的水平电极结构的结构。对于这种结构来说，并且如图3L中所示，可以首先沉积氧化物层，然后是第一电极金属层，然后是间隙间隔电介质层，然后是第二电极金属层，然后是覆盖电介质层。
然后如图3M中所示形成蚀刻图案，其可以竖直地切通所述顶部电介质、第二电极金属层、间隙间隔电介质层，并且可以切通所述第二电极金属层的一部分或全部，所述蚀刻可以使用离子铣削方法或任何其他适合的各向异性蚀刻方法来进行。然后如图3N中所示，可以进行湿法蚀刻，其可以优先地蚀刻间隙间隔电介质，由此形成具有相反的111晶体平面的电极结构。
在其他情况下，可以使用镶嵌或双重镶嵌法；从平面化衬底开始；施加氧化物层，其可以使用化学气相沉积法来施加；形成图案化的氧化物层，其具有用于所需金属体积的开口，并在所述氧化物层上形成金属化层。可以利用CMP方法除去过量金属，留下如图3O中所示的结构。然后可以除去所述图案化的氧化物层，留下图3P中示出的结构。然后可以如图3Q中所示，在所述结构上施加间隔层，其可以是氮化硅层。然后可以形成新的图案化的氧化物层，其中开口紧靠第一金属体积并在其上方形成，如图3R中所示。然后可以形成另外的金属层，包括在所述第二个图案化的电介质层中留下的开口中，如图3S中所示。然后如图3T中所示，可以将所述结构平面化。然后可以形成第三个图案化的氧化物层，其使用化学气相沉积，然后施加光刻胶层并对所述光刻胶层进行图案化，然后使用干法蚀刻，留下如图3U中所示的结构。可以再次施加光刻胶，可以使用湿法或干法蚀刻来形成如图3V中所示的结构。
传感器电子学
由于在本公开中可以将传感器阵列制造成集成半导体器件，它在准确率、整体性和可缩放性方面表现出极大优势。在某些情况下，可能不需要高数据带宽，特别是对于利用同步化学方法的系统来说。系统芯片可以是大规模并行的，并且只有记录掺入核苷酸的传感器可以被读出。可以首先对芯片进行作图，以确定哪个传感器正提供有用的数据和图谱，其可以存在于芯片上的闪存中，或者可以作为系统的其他部分的一部分存在于别处。这使得系统通量包括数据通量有效地大大提高，并且可以有助于使校准和准确率非常可靠。在某些情况下，可以使用单次测量。在某些情况下，可以对掺入或结合的标记的核苷酸进行多次测量，直至达到所需的准确率。
在某些情况下，可以使用传感器来测量结合和/或掺入动力学，以便可以作为测序过程的一部分确定表观遗传信息，这可能需要多次并且可能以比原本需要的更高的频率读取传感器。在这些情况下，可以一次只使用芯片的一部分，或者可以根据最大数据输出能力使用较小的芯片。
在某些情况下，传感器可以与本地放大器相结合，例如与在CMOS成像传感器中使用的相似的4T电路。在某些情况下，可以使用电容器来整合由隧穿电极对产生的电流。电容器可用于平均由标记物结合到电极对和从电极对释放所造成的变动。电容器可用于平均结合位置的变动，所述变动可能引起由电极对产生的电流幅度的变动，以及用于平均背景，所述背景可能由电极之间和/或SAM组成成分之间的直接隧穿引起，和/或作为可能瞬时结合的其他组成部分例如靶DNA、未结合的核苷酸或可能打算作为系统的部分的其他分子或其他污染物的结果。这种平均电容器可用于提高信噪比，和/或允许测量之间的时间比没有电容器的情况下原本可能的时间更长，同时保留来自于隧穿电流的电荷。
在与积分时间相组合的电流可能比与电荷积分电容器相关的尺寸和电压可能需要的更大的情况下，可以使用负增益作为与每个传感器或与电容器相关的放大器的一部分。如果例如结合时间、位置的显著变动可能是测量的一部分，或者出于其他原因在测量之间需要长的时间，负增益可以是有用的。当预期散粒噪声可能不在测量中发挥显著作用时，可以由负增益产生的散粒噪声的增加，可能造成传感器信噪比的无关紧要的降低。这种设计被示意性显示在图3X中，其中电位被显示为施加到偏压电极，感应电极的输出被馈送到行选择晶体管，所述晶体管在传感器处于禁止状态时将来自于输入感应电极的所有电流分流到地，而在允许状态下变为打开，允许电流流向被配置用于负增益的电流镜。来自于所述电流镜的输出被显示为连接到具有相伴的重置晶体管的积分电容器，所述重置晶体管可以在RD结被配置成处于接地电位时通过将所述电容器完全放电来重置所述电容器。
在某些情况下，间隙尺寸可以大于或等于约5、6、7、8、9、10、15、20、30nm或更大。这种间隙尺寸可以提供另外的优点，例如易于制造和对间隙尺寸更大的容忍度。在这些情况下，隧穿标记物或隧穿和跳跃标记物可以被构造成大于所述间隙尺寸，使得结合的隧穿标记物相对于所述第一电极的与第二电极相对的表面的角度可以为5-10度、11-20度、21-30度、31-40度、41-50度或大于51度。例如，9nm的间隙可以与约30个碱基对或更大的双链DNA的标记物一起使用。12nm的间隙可以与约40个碱基对的双链DNA的标记物一起使用。20nm的间隙可以与约60个碱基对的双链DNA的标记物一起使用。间隙尺寸可以被构造成适合于特定长度的可商购或可容易地构建的DNA寡核苷酸。
在某些情况下，在测序多核苷酸时对于运行的大部分时间来说可以将偏压关闭。这可以有助于最小化由静电造成的分子向电极的粘附或吸附，所述粘附或吸附进而可能造成假象。在某些情况下，在运行的一部分时间内可以调整本体溶液电位，以最小化分子向电极的粘附或吸附。在某些情况下，由于暴露的电极金属表面积小，背景信号(其可能由离子电流造成)可以被最小化。在某些情况下，每个传感器的暴露的金属表面积可以小于1,000,000nm2、小于400,000nm2、小于100,000nm2、小于40,000nm2或小于10,000nm2。这可以提高与隧穿电流的测量相关的信噪比。背景信号可以从可能不具有结合的酶并因此可能不具有信号的传感器确定。在某些情况下，可以以某种方式选择电子标签以优化隧穿电流。所述分子的尺寸可以被选择成略微大于两个隧穿电极之间的间隙，这可以包括与所述间隙的制造相关的公差，或者可以被选择成略微长于与结合到隧穿电极的SAM相关的结合位置，这可以将所述SAM在电极上的结合位置的变动和/或电极之间的间隙尺寸的变动考虑在内。
在某些情况下，可以为一组标记物选择电流水平，使得在不同标记物之间的电流比在对数空间中可以处于固定水平，例如最高电导的标记物在施加0.1V偏压时，在100％占空度(duty cycle)下可以产生1nA电流，并且在25％占空度下可以产生250pA的平均电流，后一种情况对应于核苷酸结合事件的占空度为50％，并且核苷酸结合事件期间的杂交事件的占空度为50％；因此，在不同标记物之间使用4倍的因子，下一最导电的标记物可以产生约64pA的平均电流，下一最导电的标记物产生约16pA的平均电流，并且一组4个(4个在这里以非限制性的示例方式使用)中导电性最低的标记物可以具有约4pA的电流。在某些情况下，可以在一对隧穿电极的两个隧穿电极之间使用偏压，其中相对于彼此，一对电极中的一个电极可以具有正电压，并且一对电极中的另一个电极可以具有负电压。
在某些情况下，与隧穿标记物化合物相关的结合和/或隧穿可以是温度敏感的。因此，在某些情况下，具有电极对传感器的芯片可以使用温度控制。温度控制可以在整个核苷碱基测量和/或掺入循环中使用固定的温度，或者可以对循环的不同部分使用不同的温度。
在某些情况下，可以使用具有天然骨架的化合物作为与SAM和/或隧穿标记物化合物缔合的核苷酸的一部分。在某些情况下，可以使用其他类型的骨架和/或糖或糖替代物，例如肽核酸、锁核酸、抗水解碱基例如吗啉代碱基、双脱氧碱基、L-DNA、二元醇核酸、苏阿糖核酸或任何其他类型的核酸。
在某些情况下，隧穿电流的差异可能由于与不同核苷碱基缔合的不同类型的隧穿标记物化合物产生。在某些情况下，隧穿电流可能受到通过聚合酶结合的核苷碱基与通过接头结合到隧穿标记物化合物的核苷碱基之间的接头的长度或刚性影响，所述隧穿标记物化合物可以至少部分包含核苷碱基。
在某些情况下，对于一组隧穿标记物化合物来说，与SAM的结合可以是相同的。在其他情况下，作为与隧穿标记物化合物相关的电荷差异的结果，与SAM的结合可以不同。在某些情况下，与SAM的结合可以由于核苷碱基序列或核苷碱基类型而不同，使得结合动力学和平均隧穿电流可能受到影响，而平均隧穿电流可能不受影响。
在某些情况下，可以在引入到具有电极对的体积中之前将靶核酸与聚合酶复合。可以将聚合酶结合在所述电极对的附近或流体环境中。可以在引入靶核酸之前将聚合酶结合在电极对附近，然后可以将靶核酸导向聚合酶以形成复合物。在某些情况下，在一组测序循环完成之后，可以调整缓冲液条件，使得核酸可以从聚合酶释放，从流体环境中洗掉，并且可以将新的一组核酸导入到流体环境中并与聚合酶复合。核酸可以使用DC场、磁场、介电电泳或两者进行浓缩。
在某些情况下，可以使用单一体积作为单个芯片的一部分，使得任何输入的流体可以与芯片上的任何电极对相互作用。在其他情况下，可以提供可能流体分隔的几个体积，使得可能包含不同样品的不同流体可以被引入到或通过任何流体分隔的体积。可以提供集成为芯片设计的一部分的阀门，或者可以提供多个输入和输出端口。在某些情况下，可以在不同体积中执行化学反应的不同部分，使得单个芯片可以在更高比例的时间中获取数据。例如，如果需要4个流体步骤，每个步骤花费1分钟，并且读取一个体积所需的时间是1分钟，则可以提供5个流体体积，使得一个体积可以获取数据，并且其他4个体积可以各自执行不同的流体递送。在1分钟过后，则每个体积可以开始不同的任务。因此数据可以连续产生。
在某些情况下，可以在芯片的所有体积中进行相同的化学反应。在其他情况下，可以在不同体积中进行不同的化学反应。例如，一个体积可以执行低覆盖率表观遗传方法，而另一个体积可以执行提供长读段以及因此结构的方法，同时另一个体积可以执行最大化通量的方法，所述通量用传输出芯片的每个字节的核苷碱基读出量来度量。不同的体积可以具有相同尺寸或者可以具有不同尺寸。单一样品或单组样品可用于一个或多个体积中，或者不同样品或不同组样品可用于不同体积中。作为可以是通用引物的引物附连的一部分，条形码或压缩码(zip code)可用于单一样品，或者可用于样品组。
在某些情况下，可以提供一个或多个参比电极作为芯片的一部分，以便可以相对于电极对的电极的电位控制本体流体电位。参比电极可以是真参比电极、准参比电极、对电极、辅助电极或其任何组合。在某些情况下，一个或多个电极可以放置在芯片外部，例如通过与含有电极对的流体体积相互作用的流体线路。
在某些情况下，可以以某种方式使用参比和/或对电极或假参比电极，使得它有效地充当栅电极，其中例如可以取决于氧化态而具有不同电导的隧穿标记物，并且参比和/或对电极或假电极可用于氧化或还原标记物，特别是标记物的可以结合到偏压或感应电极的部分；标记物的氧化或还原可以引起隧穿电流幅度的变化。
在某些情况下，聚合酶或聚合酶复合体可以使用泊松分布随机放置，使得某些电极对可能具有超过一个聚合酶或聚合酶复合体与其紧密结合。可以使用软件、固件、模拟比较器或内置逻辑电路，作为电流较高或不符合与一组提供的隧穿标记物相关的预期分布的多水平电流分布的结果来确定哪些电极对可能具有超过一个聚合酶。某些电极对可能具有与缺少聚合酶或聚合酶复合体相符的电流，正如可以通过低信号和/或可能不匹配与提供的一组隧穿标记物化合物相关的预期分布的分布来确定的。隧穿标记物化合物的这种预期分布可以包括1、2、3、4或超过4种不同类型的隧穿化合物标记物。
在某些情况下，可以使用可掺入和不可掺入的核苷酸的混合物。可掺入和不可掺入的核苷酸两者可以都被标记，并且可以与试剂混合物一起使用。试剂混合物可以包含或不包含催化性阳离子例如催化性二价阳离子。在所述混合物中不包含催化性二价阳离子的情况下，核苷酸的掺入是不可能的。在某些情况下，所有或基本上所有的核苷酸可以包含标记物，并且可以是不可掺入的。
芯片流体学
在某些情况下，芯片可以具有单个共同的样品体积，使得可以包含输入样品的单个输入流体可以与芯片的所有传感器相互作用。或者，芯片可以具有与多组传感器相关的多个体积，并且可以具有阀机构或多个输入端口，使得可以包含不同输入样品的不同输入流体可以与不同组的样品相互作用。
在某些情况下，单个输入流体可以包含多种不同样品。所述不同样品可以作为具有与其相结合的不同条形码的结果而被区分，或者可以具有与其附连的不同的可切割隧穿标记物。在某些情况下，不同样品可以在不同时间引入。不同样品可以占据不同芯片区域的一部分，而留下其他传感器可用于可能在较晚时间引入的样品。不同样品可以如下区分：测量与被结合的组成部分结合或缔合的标记物，所述被结合的组成部分可以是与核酸聚合物复合的酶，由此指示被结合的组成部分何时被结合以及被结合的组成部分被结合在哪个位置中。在引入后续样品后，可以进行另外的测量，以测量与被结合的组成部分结合或缔合的标记物。具有被结合的组成部分的其他传感器可以与新引入的样品缔合，并且之前与前面的样品缔合的传感器仍可以与前面的传感器所缔合的同一样品缔合。在某些情况下，与芯片相关的所有传感器可以在同一时间或在不同时间经历不同步骤。在某些情况下，样品可以在不同时间引入，但其他流体可以在同一时间引入到所有传感器。
在某些情况下，芯片可以具有与不同内部体积相连的多个输入端口，并且系统可以同时容纳多个芯片。不同流体可以在不同时间引入到不同体积。不同体积可以是单个芯片的不同体积，不同体积可以在不同芯片上。不同体积可以是与多个芯片相连的不同体积，从而允许过程中的不同步骤在不同时间发生在所述不同体积中，其可以例如允许不同体积在不同时间进行测量，而在测量发生时其他体积可以发生其他不同的步骤。这样做，测量可以有效地连续进行，从而允许原本可能是所述系统通量的限制因素的模数转换器、积分器、数字通讯通道或电子装置的任何其他部分被充分利用，而不受限于等待化学、生物化学、清洗或其他一个或多个步骤发生。在某些情况下，可以实施一组协调的测量，由此所述测量可以不是有效地连续的，而是可以与在推进到不同步骤之前执行不同区域的所有测量的情况相比以更高的百分率或占空度进行，所述不同步骤可以是化学步骤、生物化学步骤、清洗步骤或除了测量步骤之外的任何步骤。
在某些情况下，如图3Y中所示，芯片可以具有多个流体通道370，其可以是互连的以便可以利用单一样品，或者可以具有分开的流体端口(未示出)以便可以在芯片的不同区段中利用不同样品。可以包括积分电容器、电流镜和模数转换器的传感电路360，可以被放置在流体区域之间的区段中，所述流体区域可以具有两组100行或某些其他适合的行数，使得流体通道之间的每个区域可以支持所述流体通道的盖子，并允许使用低得多的流体体积。行选择电路380可以被放置到一侧，同时可以使用数字输入输出电路390，其可以包含一个或多个LVDS(低电压差分信号)接口。
在某些情况下，芯片内的单个物理体积可以使用电润湿或光电润湿分成单独的流体体积，由此允许实现比使用固定体积可以实现的更大的灵活性。电润湿可用于限定传感器的不同区域。传感器的不同区域可以与不同样品相连，和/或可用于限定流体流动区域以便允许不同试剂在不同时间流向芯片的不同部分，所述流体流动区域可以与不同样品相连，或者可以与大小适合于最佳芯片通量的区域相连，从而允许不同样品尺寸并同时任选地允许最大通量。
在某些情况下，靶、样品或标记物分子可以使用施加在电极与本体溶液之间的电场来移除。使用的场可以低于移除靶结合组成部分所需的场强，例如，巯基结合的寡核苷酸的互补体可以在比巯基结合的寡核苷酸更低的场强下变性，从而允许变性而不影响SAM。
传感器读取详情
在某些情况下，为了获得更准确的背景水平，背景水平可以在没有非催化性二价阳离子结合的情况下测量。这个背景水平可用于寻找真正的信号值，并将信号与背景分开。在某些情况下，可以来自于一种或多种标记物的信号的定量，可以从一段时间内的测量产生，在所述一段时间中一种或多种标记物可以被有效地固定结合到与电极对的电极缔合的SAM，同时可以基本上不存在原本可能结合并影响可以被固定结合的一种或多种标记物的测量的背景分子。背景分子可以例如通过清洗所述传感器芯片，从含有电极对的电极的体积移除，或者可以作为与电极对的电极相关的场的结果而被阻止与电极对相互作用。在某些情况下，信号水平可以指示标记物类型的身份，其中可以使用具有不同隧穿和跳跃电导的几种不同标记物类型，但只有一种类型可以被结合。电流水平可以指示可以被结合的标记物的数量，其中可以使用可具有单一隧穿或跳跃电导的单一类型的标记物，并且变动可能由可以被结合的标记物的数量差异产生。电流可以由可能具有不同隧穿或跳跃电导的不同类型的标记物的组合产生，并且可以由被结合的不同数目的标记物产生，特别是如果标记物的数目被重复测量，并且作为电极对表面积的尺寸固定的结果标记物的数目随时间可以增加到固定数目的话。
在某些情况下，噪音水平可以被认为包含隧穿和/或跳跃噪音、放大器噪音、模数转换噪音、标记的核苷碱基与聚合酶结合的动力学和被聚合酶结合的核苷酸标记物的粘性末端结合到SAM的粘附末端的动力学。
在某些情况下，可以在用于确定核酸序列的序列和/或表观遗传学的方法中利用隧穿和/或跳跃标记物进行检测的系统，可以使用固定的时间长度进行序列和/或表观遗传学的确定。在其他情况下，可以使用不同的时间长度，其对于不同组的核苷酸可以是固定的，或者可以由用户根据需要进行设置以获得所需的准确率水平。在某些情况下，不同的时间长度可以被系统同时用于单一芯片的不同空间体积或区域，或者可以被系统同时用于不同芯片，或者同时用于不同芯片中不同芯片的不同区域的组合。
在某些情况下，不同组的核苷酸可以具有一致的盐浓度、pH、温度和其他条件或其他要素的水平，包括对于不同组的核苷酸来说含有一组核苷酸的缓冲液可以是相同的。在其他情况下，不同组的核苷酸可以具有不同的盐浓度、pH、温度和其他条件或其他要素的水平，包括对于不同组的核苷酸来说含有一组核苷酸的缓冲液，其可用于提高结合动力学的差异，以更好地分离并更好地鉴定不同类型的核苷碱基。
传感器读取可配置性
在某些情况下，单次测量可以使用固定的时间，其中与电极对相关的电子传感器电路可以连续地积分源自于电极对的电流。在某些情况下，可以进行多次测量，其中与每次测量相关的时间可以是相同或不同的，以例如能够获得与不同标记物相关的更宽的动态范围和/或与不同核苷酸的结合相关的不同动力学。
在某些情况下，系统和相关的化学可以被配置成用于相对较慢但更准确的检测。这种系统可以使用同步化学方法，其中与单一碱基或单一碱基类型的掺入相伴可以递送各种不同的试剂。这种情况的系统可以被制造成大规模并行的以提高通量，例如使用具有10百万(M)、20M、30M、40M、50M、60M、70M、80M、90M、100M、200M、300M、400M、500M、600M、700M、800M、900M、1十亿(B)、2B、3B、4B、5B、6B、7B、8B、9B、10B、15B、20B或更多个传感器的芯片。
正如本文中提供的，系统和相关的化学可以被配置成用于长寡聚物的快速检测，例如使用非同步化学方法。可以向聚合酶复合体提供一些或所有适合的可掺入核苷酸，并且检测器可以以比平均掺入速率更高的速率对数据进行采样，使得在与非结合时间相关的信号后可以跟随与核苷碱基的结合时间相关的信号，并且可以通过这些信号的监测和分析来确定掺入次序。在某些情况下，掺入速率可以通过使用包含催化性和非催化性阳离子两者的二价阳离子的混合物来调整。
在某些情况下，系统的一个或多个部分可以在大规模并行的高通量部分中使用较慢的生物化学，并且系统的一些其他部分可以使用可以被配置以用于长寡聚物的快速检测的生物化学，由此提供一种系统，其提供大量短读段和较少量的长读段两者，以便可以同时产生骨架和填充在骨架中的数据。
在某些情况下，系统的一个或多个部分可以在大规模并行的高通量部分中使用较慢的生物化学，并且系统的一些其他部分可以使用可以被配置以用于多区段检测或多次跳读法测序的生物化学，由此可以使用“慢”生物化学读出一部分寡核苷酸，然后可以提供一组适合的核苷碱基，使得可以在数秒或数分钟的一段时间内掺入数百或数千个碱基，然后可以跟随一段时间的“慢”生物化学，从而提供在同一寡核苷酸上相隔数百或数千个碱基的读段，由此提供了一种系统，其提供大量短读段和较少量的可以利用跳读方法的核酸两者，以便可以同时产生骨架和填充在骨架中的数据。
在某些情况下，测序和表观遗传学检测的组合可以在系统的不同部分中或在不同时间使用，并任选地反馈以使用定点测序或使用鸟枪法测序确定特定位置处的表观遗传学。具体来说，靶样品的某些部分可以与靶样品的其他部分例如基因启动子区和可能是内含子或外显子或基因组的其他部分的其他特异性靶向的区域分开，并且可以在不进行表观遗传学测定的情况下进行。
在某些情况下，对于装置的不同区域或在装置的一个或多个区域中的不同时间，可以使用不同的读出方案。在某些情况下，同时的单点读出和动力学可用于一个或多个区域中或一个或多个时间，由此可以确定序列和/或一种表观遗传学类型。在某些情况下，使用多个核苷酸组的多点检测可用于一个或多个区域中或一个或多个时间。多点检测可以与非同步化学方法读出联合使用，后者可用于装置中的一个或多个区域中或一个或多个时间。
在某些情况下，芯片内的电场可编程门阵列(FPGA)或其他可编程逻辑电路可用于允许读出模式和/或时间安排的变化。
在某些情况下，可以使用存储设备来储存活性位点的位置，其中内存可用作读出过程的一部分以确定哪些位置是有活性的。存储设备可以被选择为闪存或随机存取存储器。存储设备可以被板载微处理器使用，或者可以与FPGA或其他可编程逻辑电路联合使用，以便确定进行读取的传感器位置的模式和/或不进行读取的位置的模式。在某些实施方式中，不同模式可用于不同区域中，由此可以在读出之间使用不同的时间安排，例如当一个区域用于同步化学方法读出，并且另一个区域用于非同步化学方法读出时。
在某些情况下，来自于隧穿传感器的数据收集可以以对于确定核苷酸结合时间来说过慢的速率收集，并且可以进一步平均来自于大量核苷酸结合事件和结合事件之间的中间时间段的电流水平。在这个时间内的电流可以在硬件中，使用例如积分放大器来平均。可以进行多次数据获取以便提供进一步的平均以及因此更好的信噪比。动力学速率可以部分通过知道kon和koff来确定，因此待结合和待结合到的核苷碱基的类型可以通过平均电流水平与一组提供的核苷碱基和缔合的标记物的组合来确定。这种方法可以允许极少的数据生成，同时仍能鉴定样品多核苷酸的碱基和任选地鉴定碱基的表观遗传修饰。
在数据收集速率可以比核苷酸结合动力学更快的情况下，对于每个结合事件可以发生大量数据获取，并且在核苷碱基的掺入发生之前对每个碱基位置可以观察到一个或多个结合事件。这可以直接允许更好地确定动力学信息。在某些情况下，系统可以被配置成用于连续获取数据，其可以包含结合事件期间、结合事件之间和掺入事件期间的数据获取。
在作为实例的某些情况下，可能希望使测序的化学循环时间为大约3分钟。这个循环可以包括清洗、添加核苷酸、添加Mg和读出时间。在某些情况下，由于系统对移相缺少易感性，因此更快的循环时间可以是合乎需要的和可获得的。
在某些情况下，为了获得所需的循环时间，可以调整结合事件之间的时间或结合时间tb以及结合事件的长度或解离时间td两者；tb主要通过调整核苷酸浓度，td通过调整Ca与其他二价阳离子的比率。因此，在某些情况下，可以选择约1秒的时间作为积分时间，这个时间当与对应于传感器上的100行的100的多路复用水平相组合时，可以给出约100秒的总读出时间，在使用约3分钟的总化学循环时间时，为化学循环时间的其他部分留下了相近的时间量。
在某些情况下，可能希望读取具有特定的准确率，因此在某些情况下可能希望对来自于几个核苷酸结合时间段的测量进行平均，其中这种所需的数目对于50％的占空度来说可以是10，因此产生10Hz的结合率。在其他情况下，如果需要或希望更好的准确率，可以通过使用更快的杂交结合、通过使用几次读取或通过延长积分时间来提高核苷酸结合动力学。
在某些情况下，核苷酸结合不可被直接测量；相反，测量可以通过隧穿标记物杂交结合来进行。杂交结合时间的长度可以受到温度、盐浓度、pH、电极电位、粘性末端长度和粘性末端序列(GC相比于7-脱氮杂腺嘌呤)影响。在其他情况下，杂交事件之间的时间也可能受到所有上述事项影响，尽管程度较低，并且也可能受到SAM密度和接头长度和刚性影响。在某些情况下，可以由此调整杂交结合时间和杂交结合事件之间的时间。
在某些情况下，可以使用定时循环，其可以平均(每个核苷酸结合事件的)多个杂交结合事件。例如，杂交结合事件的数目可以为10，使用50％占空度，得出与平均核苷酸结合事件相关的每50ms时间段内10个事件，得出杂交事件平均花费2.5ms。因此，当与具有可以产生1nA的连续隧穿电流的隧穿电导的标记物一起使用时，在1秒的积分时间段内的信号可以是250pC。
样品制备
在某些情况下，在任何测序准备步骤之前，可以包括隧穿和/或跳跃检测器的系统可以例如使用流式细胞术从样品分离并分开一个或多个细胞。一个或多个细胞可以包含循环肿瘤细胞、活细胞、特别是染色的细胞或其组合。染色的细胞可以包含可以是荧光染色剂的染色剂。染色剂可以包含隧穿和/或跳跃标记物。染色剂可以包含电化学标记物。在某些情况下，使用靶特异性拔出法例如抗体磁珠分离或适体分离方法的拔出法，可用于分离靶细胞。然后可以对单独的细胞或成组细胞进行测序，其中DNA基因组和/或RNA转录组可以被测序。
在某些情况下，可以对特定序列的RNA和/或DNA或特定类型的DNA或RNA例如mRNA或tRNA进行富集。可以从所述分离的细胞分离特定的靶。可以进行特定序列的RNA和/或DNA或特定类型的DNA或RNA例如mRNA或tRNA的富集。然后可以对分离的核酸链进行测序。可以对特定转录本例如AR-V7进行分离和定量，允许靶转录本的确认以及任何表观遗传修饰、突变或剪接变体的定量和检测，其可以进一步允许确定肿瘤细胞的源组织类型。这种定量步骤可以从测序、数字PCR、qPCR、等温扩增或任何其他适合的靶定量方法产生。
在某些情况下，在细胞分离后，可以对所有DNA、所有核酸链或所有RNA进行富集或浓缩步骤。可以进行富集和浓缩步骤以代替特异性靶分离步骤。可以在除了特异性分离步骤之外还进行富集或浓缩步骤。富集或浓缩步骤可以允许例如针对特定靶的非常高的灵敏度，同时允许可以以比特定靶的测序更低的覆盖率完成完整的基因组和/或转录组。在某些情况下，基因组测序和/或转录组可以与可能在同一芯片中的另一种定量技术组合。
同样地，可以使用循环游离DNA的拔出(pullout)来捕获随后的测序靶向突变，例如与黑素瘤相关的BRAF突变或作为与其他遗传疾病关联的结果而靶向的其他突变。
在某些情况下，为了在酶和接头被结合在一起的过程中更好地确保所述酶与接头之间的一一对应关系，可以将接头结合到包含酶的至少一部分的蛋白质的第一末端，从而允许接头与酶之间的一一对应关系。
在某些情况下，接头、磁性或顺磁性珠子或接头可以以一定的平均间距可逆地结合到表面，使得作为其间的物理距离的结果，只有一个对应的组成部分可以与其结合。通过提供相等数目的结合和未结合的组成部分，或通过提供更多未结合的组成部分然后除去未结合的组成部分，这样可以提供可以超过泊松分布的一对一结合比率。结合可以在溶液中发生，由此一种组成部分可以以较高浓度存在，使得大部分具有较低浓度的组成部分可以结合到具有较高浓度的组成部分的单个组成部分。较低浓度的组成部分然后可以可逆地结合到表面。表面可以是磁性珠子的表面，并且可以与未结合的较高浓度的组成部分分离。
在某些情况下，可以包含酶、磁性、顺磁性粒子或珠子或接头的组成部分，可以被形成为乳液。乳液可以在乳液形成之前不允许酶活性的条件下形成。例如，可以提供预先结合到酶或磁性或顺磁性粒子的具有切口位点的引发的核酸环或双链核酸环，其中不需要一对一结合，而是可以使用有利于具有环状核酸聚合物的单个组成部分的泊松分布。所述乳液可以是油包水乳液，它可以在水性溶乳液中进一步包含核苷酸、适合于酶活性的缓冲剂和可用于引物或核酸聚合物链的切口链的延伸的酶。如果酶将要结合到所述一个或多个环状核酸聚合物之一，则它可以以一定浓度被提供，使得泊松分布有利于每个乳液中单个酶。然后可以改变可包括温度的条件，使得延伸可以进行。酶可以进行滚环扩增，直至所述乳液内的核苷酸可以在所述滚环扩增期间被有效地充分利用之时，由此提供结合到乳液的物理阻断物，而不论向所述乳液提供的环状核酸聚合物的数目。物理阻断物的尺寸可以随着乳液尺寸的变化和每个乳液中核苷酸浓度的变化而不同。
在其他情况下，文库制备方法可以包括产生互补cDNA、RNA或DNA链的过程，以便最小化二级结构的产生。文库制备方法可以包括连接通用引物区的过程，所述通用引物区可以是例如在图4中描绘的发夹结构420，其可以具有切口位点450，由此可以通过切口酶或类似的酶在发夹结构420中产生切口，从而可以允许RNA依赖性RNA聚合酶、DNA依赖性DNA聚合酶或反转录酶结合在切口位点450处，并且可以作为内在链置换的结果或作为解旋酶作用的结果，所述解旋酶可以被结合或可以分开地起作用，所述切口允许碱基的掺入和沿着无切口的核酸聚合物移动，从而允许无环化的情况下重新测序样品链410。在某些情况下，发夹结构420可以包含一个或多个肌苷460，以便允许结合到不同靶序列而不需一组或更大的一组通用引物。在聚合酶或连接酶在结合到肌苷时可能具有较低活性和/或较低特异性的某些情况下，所述发夹结构的一部分可以包含一组通用引物，使得正好在酶的活性位点处的碱基可以是一组天然碱基440A和440B之一。在其他情况下，发夹通用引物可以具有一定长度的互补碱基，其对于连接酶发挥作用来说可以足够长，而没有因为来自于发夹通用引物的发夹部分的弯曲的空间位阻而造成的活性降低，并且同样地对于聚合酶延伸通用引物来说可以足够长，而没有因为发夹通用引物的弯曲而造成的活性降低。
其他系统组件
在某些情况下，可以使用泵或其他正压或负压源将含有所述聚合酶的溶液移动到所述电极间隙中。在聚合酶被固定或捕获在所述变窄的通道处之后，可以添加DNA或其他溶液。
尽管在本文中已示出并描述了本发明的优选实施方式，但对于本领域技术人员来说，显然这些实施方式仅仅以举例的方式提供。对于本领域技术人员来说可以发生大量变动、改变和替换而不背离本发明。应该理解，在实践本发明时可以使用本文描述的本发明的实施方式的各种不同的替选方式。下面的权利要求书旨在定义本发明的范围，并且由此涵盖在这些权利要求项的范围之内的方法和结构及其等同物。

Claims (20)

1.一种核酸测序方法，其包括：
使用与衬底上的两个电极附连的聚合酶来结合与样品核酸的被查问碱基互补的核苷酸，所述聚合酶通过两个接头与所述两个电极附连；
测量由所述核苷酸的结合期间所述聚合酶的构象变化引起的所述两个电极之间的隧穿电流；
根据所述隧穿电流测量值，从互补碱基与所述被查问碱基的结合来鉴定核苷酸。
2.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中所述接头是肽接头。
3.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中在使用所述聚合酶之前，所述方法还包括将所述聚合酶配置在非导电间隙中，其中所述间隙在所述电极之间被蚀刻到10nm或更大的深度。
4.根据权利要求3所述的核酸测序方法，其中所述间隙具有比所述聚合酶的宽度更大的较宽部分和比所述聚合酶的尺寸更小的较小部分。
5.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中在使用所述聚合酶之前，所述方法还包括将将所述聚合酶配置在非导电间隙上方，其中所述非导电间隙小于所述聚合酶的尺寸，并且其中所述非导电间隙被蚀刻到10nm或更小的深度。
6.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中在使用所述聚合酶之前，所述方法还包括分别将所述接头结合到在所述两个电极上的自组装单层。
7.根据权利要求6所述的核酸测序方法，其中各个所述自组装单层通过硫醇结合到所述两个电极中的对应电极。
8.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中所述核苷酸还包含终止物。
9.根据权利要求8所述的核酸测序方法，其中所述终止物被结合到核糖的3’。
10.根据权利要求1所述的核酸测序方法，其中核苷酸是未标记的。
11.一种核酸测序设备，其包含：
a.配置在衬底上的被非导电间隙隔开的两个电极；
b.所述两个电极和间隙被构造成容纳聚合酶，具有两个接头以将所述聚合酶与所述两个电极附连；以及
c.所述两个电极和间隙还被构造成用于检测用于鉴定核苷酸的所述聚合酶的构象变化。
12.根据权利要求11所述的核酸测序设备，其中所述接头是多肽接头。
13.根据权利要求11所述的核酸测序设备，其中所述设备被构造成经由测量通过所述聚合酶和与所述聚合酶附连的所述两个接头的遂穿电流来检测所述构象变化。
14.根据权利要求11所述的核酸测序设备，其还被构造成用于将所述聚合酶配置在所述非导电间隙中，其中所述间隙在所述电极之间被蚀刻到10nm或更大的深度。
15.根据权利要求11所述的核酸测序设备，其还被构造成使得所述非导电间隙的尺寸小于所述聚合酶的尺寸，并被构造成用于将所述聚合酶配置在所述非导电间隙上方，其中所述非导电间隙可以被蚀刻到10nm或更小的深度。
16.根据权利要求11所述的核酸测序设备，其中所述非导电间隙具有较宽部分和较窄部分。
17.一种核酸测序方法，其包括：
使用与衬底上的两个电极附连的聚合酶来结合与样品核酸的被查问碱基互补的核苷碱基，所述聚合酶通过两个接头与所述两个电极附连；
测量由所述核苷碱基的结合期间所述聚合酶的构象变化引起的所述两个电极之间的隧穿电流和跳跃电流中的至少一者；
根据电子电流测量值，鉴定所述样品核酸的单链部分上的匹配核苷碱基。
18.根据权利要求17所述的核酸测序方法，其中所述接头是多肽接头。
19.根据权利要求17所述的核酸测序设备，其还被构造成用于将所述聚合酶配置在非导电间隙中，其中所述间隙在所述电极之间被蚀刻到10nm或更大的深度。
20.根据权利要求17所述的核酸测序设备，其还被构造成使得非导电间隙的尺寸小于所述聚合酶的尺寸，并被构造成用于将所述聚合酶配置在所述非导电间隙上方，其中所述非导电间隙可以被蚀刻到10nm或更小的深度。
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