CN112442526A

CN112442526A - 使用固定的易位蛋白的edge测序

Info

Publication number: CN112442526A
Application number: CN202010895027.7A
Authority: CN
Inventors: N·福米纳; C·约翰逊; Y·S·辛; C·朗格
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2019-08-29
Filing date: 2020-08-31
Publication date: 2021-03-05
Also published as: US11814675B2; DE102020210883A1; US20210062255A1

Abstract

本公开涉及用于核酸测序的系统、装置和方法，其包括多核苷酸链，所述多核苷酸链具有由与其附接的氧化还原标记修饰的核苷酸或能够接收具有与其附接的氧化还原标记的修饰核苷酸。所述系统、装置和方法包括介电构件，所述介电构件具有位于氧化和还原电极之间的附接的易位蛋白。氧化和还原电极产生延伸到反应区域的电场，在所述反应区域发生多核苷酸链穿过蛋白的易位，从而通过氧化和还原电极中电流的变化来识别有与其附接的氧化还原标记的修饰核苷酸，其中当多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在反应区域时，所述变化识别出从还原电极至氧化还原标记以及至氧化电极的电子转移。

Description

使用固定的易位蛋白的EDGE测序

序列表

随此提交的2019年11月8日创建的大小为1 KB的文本文件edge_ST25在此通过引用并入。

技术领域

在至少一个方面，本公开涉及用于核酸测序的系统、装置和方法。

背景技术

单碱基分辨率DNA测序是生物技术领域的重要目标。迄今为止，大多数技术都需要从小读取大幅度重建序列或重复运行以获得保真度。

发明内容

本公开通过公开用于核酸测序的系统、装置和方法，解决了现有技术的一个或多个问题，该系统、装置和方法以单碱基对分辨率对多核苷酸链例如长读取进行测序。这种方式的优点是，易位蛋白充当受控的定位位点，以将多核苷酸链带入传感区，且同时在传感区内提供受控的易位速率。

在另一方面，提供了一种用于核酸测序的系统。该系统包括至少一个装置，该装置包括氧化电极、还原电极以及位于氧化电极和还原电极之间的介电构件。特征在于，介电构件将还原电极与氧化电极分开最多10nm的第一距离。蛋白附接到介电构件的表面。该蛋白能够易位具有被氧化还原标记修饰核苷酸的多核苷酸链，或者能够接收具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸。蛋白的附接使得多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在易位期间达到距介电构件表面最多10纳米(nm)的第二距离内。氧化和还原电极产生电场，该电场延伸到反应区域，在该反应区域发生多核苷酸链穿过蛋白的易位。有利地，当具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸位于反应区域时，空间尺寸允许从还原电极到氧化还原标记到氧化电极的快速电子转移(即几乎同时)。

在另一方面，提供了一种用于形成核酸测序装置的方法。该方法包括提供包括氧化电极、还原电极和介电构件的装置的第一步骤。特征在于，介电构件将还原电极与氧化电极分开最多10 nm的第一距离。该方法包括通过氧化电极、还原电极或两者产生电场的第二步骤。该方法还包括将蛋白附接到介电构件的表面的第三步骤。蛋白能够易位具有被氧化还原标记修饰的核苷酸的多核苷酸链，或者能够接收具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸到介电构件的表面。蛋白附接于介电构件的表面，使得多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在易位期间在距介电构件表面最多10 nm处经过。该方法允许制造包括具有易位蛋白的装置的阵列，所述易位蛋白至少部分地在介电构件的表面上对齐，并且任选地均匀分布。有利地，当检测到电流中的变化时，这允许更强的信号。

在仍另一方面，提供了一种用于核酸测序的方法。该方法包括提供至少一个装置的第一步骤，所述装置包括氧化电极、还原电极、介电构件和附接于介电构件的表面的蛋白。特征在于，介电构件将还原电极与氧化电极分开最多10 nm的第一距离。该蛋白能够易位具有被氧化还原标记修饰的核苷酸的多核苷酸链，或者能够接收具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸。蛋白的附接使得多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在易位期间达到距介电构件表面最多10 nm的第二距离内。该方法包括引导电流通过氧化和还原电极的第三步骤，其中氧化和还原电极产生电场，所述电场延伸到反应区域，在该反应区域发生多核苷酸链穿过蛋白的易位。该方法包括将所述蛋白暴露于包含多核苷酸链的样品的第四步骤，这允许多核苷酸链易位通过所述蛋白。该方法包括检测在氧化和还原电极中电流的变化的第五步骤。当多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸位于反应区域时，变化识别出从还原电极到氧化还原标记和到氧化电极的电子转移。有利地，当具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸位于反应区域时，空间尺寸允许从还原电极到氧化还原标记到氧化电极的快速电子转移(即几乎同时)。

附图说明

为了进一步理解本公开的性质、目的和优点，应参考以下结合附图进行阅读的详细描述，其中相似的参考数字表示相似的元件，并且其中：

图1A显示包括装置的用于核酸测序的系统的前视图。

图1B显示附接至介电构件的易位蛋白的前视图。

图1C显示包括装置的用于核酸测序的系统的顶视图。

图1D显示用于核酸测序的系统的顶视图，该系统包括来自还原电极和氧化电极的重叠。

图1E显示用于核酸测序的系统的侧视图，该系统包括来自还原电极和氧化电极的重叠。

图2A、2B和2C显示用于平面电极对的修饰的三种不同几何形状的示意图。

图3和图4显示非平面设计的两种不同几何形状的示意图，其中将电极对制造为孔形式的堆叠，且将孔在一侧填充。

图5显示用于制造装置的过程的示意图。

图6和图7显示包括装置阵列的系统。

图8A显示包括两个装置的系统。

图8B显示图8A的系统的蛋白的惯量主轴。

图9A显示包括装置的系统。

图9B显示图9A的系统的蛋白的惯量主轴。

图10显示包括三个装置的系统。

图11显示包括三个装置的系统。

图12显示用于制造装置的过程的示意图。

图13是用于聚合酶介导的氧化还原DNA测序的方法的示意图。聚合酶锚定在两个电极之间的纳米尺度电介质的表面。聚合酶可以与DNA和引物链结合，并通过聚合酶链反应开始掺入核苷酸。如图13所公开，阴影的C碱基代表氧化还原修饰的胞嘧啶核苷酸，其可与传感区内的相邻电极发生氧化和还原反应。随着它们被掺入，具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的氧化还原修饰的核苷酸的探测可用于确定链的DNA序列。

图14是用于聚合酶介导的氧化还原DNA测序的可选方法的示意图。聚合酶锚定在两个电极之间的纳米尺度电介质的表面。聚合酶可以与DNA和引物链结合，并通过聚合酶链反应开始掺入核苷酸。在该实例中，沿着链的阴影物质表示氧化还原修饰的胞嘧啶核苷酸，其可以与传感区内的相邻电极发生氧化和还原反应。具有共价键合至先前掺入DNA中的修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的氧化还原修饰的核苷酸的探测可用于确定链的DNA序列。

图15和16显示核酸测序的方法和系统。

图17显示产生具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的氧化还原修饰的核苷酸的合成路线。

图18显示用于单个核苷酸的“点击(Click)”介导的氧化还原修饰的合成路线。

图19显示掺入核苷酸的“点击”介导的氧化还原修饰的合成路线。

具体实施方式

根据需要，本文公开了本公开的详细实施方案；然而，应当理解，所公开的实施方案仅是示例性的，并且可以以各种和替代的形式来体现。附图不一定是按比例的；一些特征可能被放大或最小化以显示特定组件的细节。因此，本文公开的具体结构和功能细节都不应被解释为限制性的，而仅仅是作为指导本领域技术人员的代表性基础。

除了在实施例中或在明确另行指明之处外，本说明书中表示材料量或反应条件和/或使用条件的所有数值量应被理解为用词语“大约”修饰。首字母缩写词或其他缩写词的第一个定义适用于本文中该相同缩写词的所有后续使用，并在必要的修改后适用于最初定义的缩写词的常规语法变体；并且，除非有相反的明确说明，否则通过与之前或之后针对同一特性所引用的相同技术来确定该特性的测量结果。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

还应当理解的是本公开不限于下述的具体实施方案和方法，因为具体的组分和/或条件毫无疑问可以变化。此外，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案，而无意以任何方式进行限制。

还必须要注意的是，在说明书和所附权利要求中使用时，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数形式的指示物，除非上下文另有明确说明。例如，提及单数形式的组件意在包括多个组件。

术语“或”和“和”可以互换使用，并且可以理解为表示“和/或”。

术语“包含”与“包括”、“具有”、“含有”或“特征在于”同义。这些术语是包括性的且开放式的，并且不排除其他未记载的要素或方法步骤。

短语“由...组成”排除权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。当此短语出现在权利要求实体的一个从句中而不是紧接在前序部分之后时，它仅限制该从句中列出的要素；总体上，其他要素不排除在权利要求范围内。

短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制到指定的材料或步骤、以及不实质上影响所要求保护的主题的基本的和新的特征的那些。

可以替代地使用术语“包括/包含”、“由...组成”和“基本上由...组成”。当使用这三个术语中的一个时，当前公开和要求保护的主题可以包括使用其他两个术语中的任一个。

在本公开中，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行已知的或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA，cDNA，DNA-RNA杂合物，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的、或衍生的核苷酸碱基的聚合物。术语“多核苷酸”和“核酸”应理解为包括适用于所描述的实施方案的单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸。多核苷酸可以包含一个或多个修饰核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在聚合物装配之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸在聚合之后可进一步被修饰，诸如通过与标记组分缀合而被修饰。

术语“序列同一性”或“同一性”是指如通过序列比较算法或通过目测检查所测量的，当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应性时，两个核酸或氨基酸序列中相同的残基的指定百分比。在序列在保守取代中不同时，可以向上调整序列同一性百分比以对取代的保守性进行校正。通过这种保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的手段是本领域技术人员众所周知的。通常，这涉及将保守取代评分为部分不匹配而不是完全不匹配，从而增加序列同一性百分比。

术语“比较窗口”是指至少约20个连续位置的区段，其中在两个序列最佳地比对之后，可以将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。在一个改进方案中，比较窗口是从15到30个连续位置，其中在将两个序列最佳地比对之后，可以将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。在另一个改进方案中，比较窗口通常是约50至约200个连续位置，其中在将两个序列最佳地比对之后，可以将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。

术语“互补性”或“互补”是指核酸通过传统的Watson-Crick或其他非传统类型与另一核酸序列形成氢键的能力。互补性百分比表示核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(例如Watson-Crick碱基配对)的残基百分比(例如6个中的4个、5个和6个为66.67％、83.33％和100％互补)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基氢键键合。如本文所用，“基本上互补”是指至少40％、50％、60％、62.5％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补性程度，或在4、5、6、7和8个核苷酸区域上之间的百分比，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。

如本文所用，术语“易位蛋白(translocator)”、“易位蛋白(translocatingprotein)”、“酶”和“蛋白”是指能够易位多核苷酸链的任何肽、寡肽、多肽、基因产物、表达产物或蛋白。能够易位多核苷酸链的蛋白的实例括DNA聚合酶、RNA聚合酶、核糖体、单链结合蛋白、拓扑异构酶、解旋酶、核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、锌指核酸酶、RNA引导的DNA核酸内切酶、转录激活子样效应子核酸酶、CRISPR蛋白及其组合。

除非相反地明确说明，否则所有R基团(例如R_i，其中i为整数)包括氢、烷基、低级烷基、C_1-6烷基、C_6-10芳基、C_6-10杂芳基、-NO₂、-NH₂、-N(R'R'')₂、-N(R'R''R''')₃ ⁺L^-、Cl、F、BR、-CF_3、-CCl₃、-CN、-SO₃H、-PO₃H₂、-COOH、-CO₂R'、-COR'、-CHO、-OH、-OR'、-O^-M⁺、-SO₃ ^-M⁺、-PO₃ ^-M⁺、-COO^-M⁺、-CF₂H、-CF₂R'、-CFH₂和-CFR'R''，其中R'、R''和R'''是C_1-10烷基或C_6-18芳基；单个字母(例如“n”或“o”)为1、2、3、4或5；在本文公开的化合物中，CH键可被烷基、低级烷基、C_1-6烷基、C_6-10芳基、C_6-10杂芳基、-NO₂、-NH₂、-N(R'R'')₂、-N(R'R''R''')₃ ⁺L^-、Cl、F、BR、-CF₃、-CCl₃、-CN、-SO₃H、-PO₃H₂、-COOH、-CO₂R'、-COR'、-CHO、-OH、-OR'、-O^-M⁺、-SO₃ ^-M⁺、-PO₃ ^-M⁺、-COO^-M⁺、-CF₂H、-CF₂R'、-CFH₂和-CFR'R''取代，其中R'、R''和R'''是C_1-10烷基或C_6-18芳基；带有正电荷的部分或结构的指示表示存在一个或多个负平衡离子以平衡电荷，类似地，带有负电荷的部分或结构的指示表示存在一个或多个正平衡离子以平衡电荷；百分比，“的份数”和比率值按重量计；术语“聚合物”包括“寡聚物”、“共聚物”，“三元共聚物”等；除非另有说明，提供给任何聚合物的分子量是指重均分子量；关于与本发明有关的对给定目的适用的或优选的一组或一类材料的描述表示该组或类的任何两个或多个成员的混合物同样是适用或优选的；用化学术语对成分的描述是指添加到说明书中指定的任何组合时的成分，并且不一定排除一旦混合后混合物的成分之间的化学相互作用；首字母缩写词或其他缩写词的第一个定义适用于本文中该相同缩写词的所有后续使用，并且在必要的修改后适用于最初定义的缩写词的常规语法变体；并且，除非有相反的明确说明，否则通过与之前或之后针对同一特性所引用的相同技术来确定该特性的测量结果。

如本文所用的术语“烷基”是指C_1-20直链、支化、环状、饱和或至少部分不饱和和在一些情况下完全不饱和(即烯基和炔基)的烃链，包括例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、丁二烯基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基和丙二烯基(allenyl)。“低级烷基”是指具有1个至约8个碳原子(即C_1-8烷基)，例如1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的烷基。低级烷基也可以指上面列出的任何两个碳原子数之间的范围。“高级烷基”是指具有约10个至约20个碳原子，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的烷基。高级烷基还可以指上面列出的任何两个碳原子数之间的范围。

如本文所用，术语“芳基”意指芳族取代基，其可以是单芳环或稠合在一起、共价连接或连接到共用基团(例如但不限于，亚甲基或亚乙基部分)的多芳环。共用连接基团也可以是羰基，如在二苯甲酮中，或氧，如在二苯基醚中。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、联苯和二苯醚等。芳基包括杂芳基，其中一个或多个芳环包括杂原子(例如，N、O、S或Se)。示例性的杂芳基基团包括但不限于呋喃基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、噻吩基等。芳基任选可被一个或多个可以是相同或不同的芳基取代基取代(“取代的芳基”)，其中“芳基取代基”包括烷基(饱和或不饱和)、取代的烷基(例如卤代烷基和全卤代烷基，例如但不限于–CF₃)、环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、卤素、硝基、羟基、酰基、羧基、烷氧基(例如甲氧基)、芳氧基、芳烷氧基、硫代烷基、硫代芳基、硫代芳烷基、氨基(例如，氨基烷基、氨基二烷基、氨基芳基等)、磺酰基和亚磺酰基。

还应当理解，整数范围明确地包括所有中间整数。例如，整数范围1-10明确包括1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。同样，范围1到100包括1、2、3、4 … 97、98、99、100。类似地，当要求任何范围时，可以将作为上限和下限之差除以10的增量的中间数字作为替代上限或下限。例如，如果范围是1.1至2.1，可以选择以下数字1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0作为下限或上限。在本文阐述的具体实例中，浓度、温度和反应条件(例如压力、pH等)可以以四舍五入为三位有效数字所示的值的正负50％进行实施。在一个改进方案中，浓度、温度和反应条件(例如压力、pH等)可以以四舍五入为实例中提供的值的三位有效数字所示的值的正负30％进行实施。在另一个改进方案中，浓度、温度和反应条件(例如pH等)可以以四舍五入为实例中提供的值的三位有效数字所示的值的正负10％进行实施。

在本文阐述的实施例中，浓度、温度和反应条件(例如，压力、pH、流速等)可以以表示约为或截短至实例中提供的值的两位有效数字的值的正负50％进行实施。在一个改进方案中，浓度、温度和反应条件(例如，压力、pH、流速等)可以以表示约为或截短至实例中提供的值的两位有效数字的值的正负30％进行实施。在另一个改进方案中，浓度、温度和反应条件(例如，压力、pH、流速等)可以以表示约为或截短至实例中提供的值的两位有效数字的值的正负10％进行实施。

在整个本申请中，在引用了出版物的情况下，这些出版物的公开内容以其整体通过引用并入本申请，以更充分地描述本发明所属领域的技术水平。

本公开公开了一种可以以单碱基对分辨率读取长读取的装置。本公开还并入添加易位蛋白(例如生物聚合酶)作为将DNA引入探测装置的方法，如描述于2018年6月15日提交的美国专利申请号16/009,766和于2017年11月3日提交的美国临时申请号62/581,366，其两者以其整体通过引用并入。这种方式的优点是易位蛋白充当将DNA带入传感区的受控定位位点，并同时在传感区内提供受控的易位速率，这是对单碱基分辨率测序要控制的两个参数。

为了实现将诸如DNA的多核苷酸链降低至传感区域内、控制易位速度并减少生产工作装置所需的制造步骤数的目的，将易位蛋白(例如DNA聚合酶)结合到氧化和还原电极之间的介电间隙或元件上的表面。

图1A示出了用于核酸测序的系统10。系统10包括至少一个装置12，装置12包括氧化电极18、还原电极20以及位于氧化电极18和还原电极20之间的介电构件16。特征在于，介电构件16将还原电极20与氧化电极16分隔开最多10 nm的第一距离28。蛋白22附接24到电介质的表面25。蛋白22能够易位具有被氧化还原标记修饰的核苷酸的多核苷酸链，或者能够接收具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸。众所周知，核苷酸包括核苷碱基，其有时被称为核碱基。在本上下文中，术语氧化还原标记包括完全功能性氧化还原标记或可以反应以形成功能性氧化还原标记的部分。此外，术语“共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基”是指包括氧化还原标记的部分与核苷酸共价键合。在至少一方面，修饰核苷酸由于与之结合的氧化还原标记而被修饰。蛋白22的附接24使得多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在易位期间达到距介电构件的表面最多10 nm的第二距离内。氧化和还原电极18,20产生延伸到反应区域的电场，在该反应区域发生多核苷酸链穿过蛋白的易位。有利地，当具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸位于反应区域时，空间尺寸允许从还原电极到氧化还原标记到氧化电极的快速电子转移(即几乎同时)。而且，空间尺寸使得扩散不是电子传递的重要贡献因素。

图1A还示出了包括电极对格式装置14的装置12，所述电极对格式装置14包括位于氧化偏压电极或氧化电极18与还原偏压电极或还原电极20之间的介电构件16。美国专利申请号16/009,766和美国临时申请号62/581,366公开了电极对格式装置14的示例实施方案以及制造电极对格式装置14的方法。美国专利申请号16/009,766和美国临时申请号62/581,366均公开了使用氧化还原标记和穿梭原理的DNA测序方法。简而言之，穿梭检测机制包括被纳米级厚电介质隔开的两个电极。电极保持在氧化和还原电势下，以实现氧化还原分子的可逆电化学反应。两个电极之间的小空间称为传感区，所述区域足够小以使氧化还原分子与两个电极相互作用并使电路完整。当氧化还原分子位于传感区时，电子可以在还原电极和氧化电极之间“穿梭”，产生放大的电流信号，该信号远高于单个电子转移事件所预期的信号。此机制与纳米间隙装置不同，在纳米间隙装置中，氧化还原分子必须在电极之间来回扩散以产生可测量的电信号。

各个实施方案的介电构件16包括具有介电常数的材料，使得氧化电极18和还原电极20之间的隧道电流的波动小于由从还原电极20到氧化还原标记并到氧化电极18的电子转移所导致的电流变化。材料的实例包括硅酸铪和硅酸锆，金属氧化物或氮化物，例如氧化铝、二氧化钛、氧化铪、氧化锆、氧化硅、氮化硅和六方氮化硼。

在各个实施方案中，介电构件16将还原电极20与氧化电极18分开最多10 nm的第一距离28。在各个实施方案中，介电构件16在氧化电极18与还原电极20之间具有范围在1nm至10 nm的宽度28，优选地范围在1 nm至4 nm。在各个实施方案中，在氧化电极18和还原电极20之间的介电构件16的宽度28是0.5nm、1 nm、1.25 nm、1.5 nm、1.75 nm、2 nm、2.25nm、2.5 nm、2.75 nm、3 nm、3.25 nm、3.5 nm、3.75 nm、4 nm、4.25 nm、4.5 nm、4.75 nm、5nm、5.25 nm、5.5 nm、5.75 nm、6 nm、6.25 nm、6.5 nm、6.75 nm、7 nm、7.25 nm、7.5 nm、7.75 nm、8 nm、8.25 nm、8.5 nm、8.75 nm、9 nm、9.25 nm、9.5 nm、9.75 nm或10 nm。在各个实施方案中，介电构件16的宽度28的范围在上述指定宽度的任何两个之间。

一个参数是介电构件16的横截面面积，其由厚度35和氧化电极18和还原电极20之间的长度31、33限定。介电构件16的横截面面积优选地足够小以允许电子穿梭，同时在电极之间提供足够的绝缘以避免短路。

在如图1B所示的各个实施方案中，介电构件16具有厚度35，其范围为5 nm至5000nm，优选10 nm至1000 nm。在各个实施方案中，介电构件16的厚度35是5 nm、10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000nm、1500 nm、2000 nm、2500 nm、3000 nm、3500 nm、4000 nm、4500 nm或5000 nm。在各个实施方案中，介电构件16的厚度35的范围在上述指定厚度的任何两个之间。

在各个实施方案中，氧化电极18具有与样品或溶液接触的宽度30，其范围为5 nm至5000 nm，优选10 nm至1000 nm。在各个实施方案中，与样品或溶液接触的氧化电极18的宽度30是5 nm、10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850nm、900 nm、950 nm、1000 nm、1500 nm、2000 nm、2500 nm、3000 nm、3500 nm、4000 nm、4500nm或5000 nm。在各个实施方案中，与样品或溶液接触的氧化电极18的宽度30的范围在上述指定宽度的任何两个之间。

在图1C所示的各个实施方案中，氧化电极18具有与样品或溶液接触的长度31，其范围为10 nm至10000 nm，优选50 nm至5000 nm。在各个实施方案中，与样品或溶液接触的氧化电极18的长度31为10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000 nm、1500 nm、2000 nm、2500 nm、3000 nm、3500 nm、4000nm、4500 nm、5000 nm、6000 nm、7000 nm、8000 nm、9000 nm或10000 nm。在各个实施方案中，与样品或溶液接触的氧化电极18的长度31的范围在上述指定长度的任何两个之间。

在各个实施方案中，还原电极20具有与样品或溶液接触的宽度32，其范围为5 nm至5000 nm，优选为10 nm至1000 nm。在各个实施方案中，与样品或溶液接触的还原电极20的宽度32为5 nm、10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850nm、900 nm、950 nm、1000 nm、1500 nm、2000 nm、2500 nm、3000 nm、3500 nm、4000 nm、4500nm或5000 nm。在各个实施方案中，与样品或溶液接触的还原电极20的宽度32的范围在上述指定宽度的任何两个之间。

在图1C所示的各个实施方案中，还原电极20具有与样品或溶液接触的长度33，其范围为10 nm至10000 nm，优选50 nm至5000 nm。在各个实施方案中，与样品或溶液接触的还原电极20的长度33为10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000 nm、1500 nm、2000 nm、2500 nm、3000 nm、3500 nm、4000nm、4500 nm、5000 nm、6000 nm、7000 nm、8000 nm、9000 nm或10000 nm。在各个实施方案中，与样品或溶液接触的还原电极20的长度33的范围在上述指定长度中的任何两个之间。

在如图1D和1E所示的各个实施方案中，氧化电极18和还原电极20之间的重叠41具有：长度45，其范围为10 nm至10000 nm，优选为50 nm至5000 nm；和宽度43，其范围为1 nm至10 nm，优选为1 nm至4 nm。氧化电极18和还原电极20之间的重叠41可以理解为来自氧化电极18和还原电极20的电场的叠加。

各个实施方案的重叠41的长度45是10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000 nm、1500 nm、2000 nm、2500 nm、3000 nm、3500 nm、4000 nm、4500 nm、5000 nm、6000 nm、7000 nm、8000 nm、9000 nm或10000 nm。在各个实施方案中，长度45的范围在上述指定长度的任何两个之间。

各个实施方案的重叠41的宽度43是氧化电极18和还原电极20之间的介电构件16的宽度28，其为0.5nm、1 nm、1.25 nm、1.5 nm、1.75 nm、2 nm、2.25 nm、2.5 nm、2.75 nm、3nm、3.25 nm、3.5 nm、3.75 nm、4 nm、4.25 nm、4.5 nm、4.75 nm、5 nm、5.25 nm、5.5 nm、5.75 nm、6 nm、6.25 nm、6.5 nm、6.75 nm、7 nm、7.25 nm、7.5 nm、7.75 nm、8 nm、8.25 nm、8.5 nm、8.75 nm、9 nm、9.25 nm、9.5 nm、9.75 nm或10 nm。在各个实施方案中，宽度43的范围在上述指定宽度的任何两个之间。

在各个实施方案中，氧化电极18或还原电极20是平面电极。各个实施方案的氧化电极18或还原电极20包括诸如氮化钛、钯或铂的材料。用于各个实施方案的系统和装置中的电极的实例在美国专利申请公开号2017/0370870中公开，其以其整体通过引用并入。

易位蛋白22是能够结合多核苷酸链(例如双链或单链DNA和RNA)的蛋白并使多核苷酸链易位或穿梭通过所述蛋白。易位蛋白的实例包括DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)、RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)、核糖体、单链结合蛋白、拓扑异构酶、解旋酶、核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、锌指核酸酶，RNA引导的DNA核酸内切酶、转录激活子样效应子核酸酶和CRISPR蛋白。

例如，保持且扫描通过DNA链的其他潜在酶包括核酸酶，例如核酸外切酶、核酸内切酶、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶；解旋酶和CRISPR蛋白。CRISPR蛋白的实例是CRISPR-Cas型和CRISPR相关蛋白，包括但不限于Cas9和Csf1。在CRISPR相关的酶的情况下，各个实施方案的装置包括使用gRNA靶标作为引导，其可被设计为不识别被测序的DNA链的任何部分。所述酶控制整个靶标DNA在传感区内的易位和读出。

在各个实施方案中，蛋白22附接到介电构件16的表面25，使得多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在距所述介电构件表面最多10nm处经过。在各个实施方案中，蛋白附接到介电构件的表面，使得多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在距所述介电构件表面0nm、0.25nm、0.5nm、0.75nm、1 nm、1.25 nm、1.5 nm、1.75 nm、2 nm、2.25 nm、2.5 nm、2.75nm、3 nm、3.25 nm、3.5 nm、3.75 nm、4 nm、4.25 nm、4.5 nm、4.75 nm、5 nm、5.25 nm、5.5nm、5.75 nm、6 nm、6.25 nm、6.5 nm、6.75 nm、7 nm、7.25 nm、7.5 nm、7.75 nm、8 nm、8.25nm、8.5 nm、8.75 nm、9 nm、9.25 nm、9.5 nm、9.75 nm或10 nm处经过。在各个实施方案中，多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸经过所述介电构件表面的距离的范围在上述指定距离中任何两个之间。

图2A、2B、2C、3和4显示并入在不同结构内的装置12。

图2A显示装置12，其包括电极18,20和在结构100中具有附接的易位蛋白22的介电构件16，结构100将装置12或蛋白22暴露于可向其添加样品的开口101。图2B显示装置12，其包括电极18,20和并入在通道(纳米通道)的壁102内的具有附接的易位蛋白22的介电构件16，其中装置12或蛋白22暴露于可向其添加样品的通道103。附接在平面电极之间的介电构件上的蛋白(例如聚合酶)并不需要纳米通道，而是可以位于通道或开放溶液中，如图14所示(开放和通道)。

图2C显示装置12，其包括电极18,20和具有附接的易位蛋白22的介电构件16作为孔104的底板104。装置12或蛋白22暴露于可向其添加样品的通道105。

图3显示作为孔106的一部分的多个装置12。装置12包括电极18,20和具有附接的易位蛋白22的介电构件16。如图3所示，孔106具有相对的侧壁108,110，其附接至限定通道114的底板112。可以将装置12并入侧壁108,110或底板112中，以使蛋白22定位于通道114内。例如，在孔的边缘形成所述结构的情况下(如图3所示)，替代的制造方法是可能的。

图4显示侧壁116,118，其限定了与通道114相比尺寸减小的通道120，其中装置12可以并入侧壁116中，以使蛋白22定位于通道114内。装置12包括电极18,20和具有附接的易位蛋白22的介电构件16。

制造图2A、2B、2C、3和4中所示的装置12的电极对格式装置14的方法描述于美国专利申请号16/009,766和美国临时申请号62/581,366，并经过修改。

图5显示制造各个实施方案的装置12的方法的示意图。在步骤34中，介电构件16的表面25经修饰26以包括附接剂24。在步骤36和38中，易位蛋白22通过与附接剂24的附接40而附接至介电构件16。易位蛋白22的缀合可以通过使用双官能偶联剂24控制，所述双官能偶联剂24在一端与介电构件反应，例如硅烷化学反应或有机亚磷酸(organophosphorousacids)化学反应，而在另一端与生物分子反应，例如羧基、醛、磺酸、异硫氰酸酯、NHS酯、环氧化物或碳二亚胺化学。应当理解，步骤34、36和38 (例如34 >> 36,38)可以顺序地、同时地或以不同的顺序(例如36,38 >> 34)发生。所述化学反应优选相对于金属电极，是对介电材料(例如，氧化铝)是选择性的，使得共价结合发生在电极之间的介电构件上且不发生在金属电极的顶部上。在一个实例中，所述双官能偶联剂是3-氨基丙基三乙氧基硅烷。经由硅烷化学反应附接的实例由Sin、Eun Jung等人的"Surface modification of aluminumoxide for biosensing application." Biomedical Engineering: Applications、Basis and Communications 24.02 (2012): 111-116公开，其以其整体通过引用并入。经由有机亚磷酸化学反应附接的实例由Mutin、P. Hubert等人的"Selective surfacemodification of SiO2− TiO2 supports with phosphonic acids." Chemistry of materials 16.26 (2004): 5670-5675公开，其以其整体通过引用并入。可选地，易位蛋白可以物理吸附到介电层上，而不是共价连接。在一个实例中，结果是共价偶联在两个电极之间的聚合酶，其中结合口袋允许其中的化学物质与电极相互作用。这样，在DNA复制时，当氧化还原修饰的碱基进入酶活性位点时，其开始与电极发生电化学氧化和还原反应。这允许电子穿梭，其用于检测用于测序的修饰碱基的存在。

图6和7显示包括装置12的阵列42,44的系统1020,1040。在各个实施方案中，所述系统包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、10000或100000个装置。在各个实施方案中，装置的数量的范围在上述指定数量的装置中的任何两个之间。在一个改进方案中，每个阵列中的蛋白均匀分布。

图8A、8B、9A和9B显示蛋白22在介电构件16的表面上至少部分对齐。在此方面，对齐是指在多个装置12中每个蛋白的惯量主轴的定向不是随机的。

图8A显示包括具有附接的蛋白22、22'的两个装置12的系统。如图8A所示，蛋白22和22'对齐。为简单起见，在图8A中，仅描绘了相应的惯量主轴51和54且显示在蛋白之间对齐。图8B显示蛋白22和22'的定向，使得相应的惯量主轴51、54可以彼此偏离角度A₂。

图9A和图9B显示其中蛋白22和22'稍微未对齐的一般情况。蛋白22限定相关的惯量主轴l₁，l₂，l_3，而蛋白22'限定相关的惯量主轴l'₁，l'₂，l'₃。第一惯量主轴l₁，l'₁可彼此偏离最大角度A₁，第二惯量主轴l₂，l'₂可彼此偏离最大角度A₂，且第三惯量主轴l₃，l'₃可彼此偏离最大角度A₃，其中角度A₁，A₂和A₃中的每个角度最多为60度。由于蛋白22至少基本上均匀地定向在介电构件16的表面上，因此，蛋白之间的相应惯量主轴的偏差具有彼此相对较小的角度。在一个改进方案中，A₁，A₂和A₃最多为45度。在进一步的改进方案中，A₁，A₂和A₃最多为0°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°、30°、31°、32°、33°、34°、35°、36°、37°、38°、39°、40°、41°、42°、43°、44°、45°、46°、47°、48°、49°、50°、51°、52°、53°、54°、55°、56°、57°、58°、59°或60°。在各个实施方案中，偏差的范围在在上述指定度数的任何两个之间。

图10和11显示蛋白22在介电构件16的表面上至少部分对齐。在此方面，对齐是指蛋白均匀地分布在包括多个装置12的预定区域上。

图10显示包括三个装置12的系统1100。如图8所示，蛋白22附接在这样的位置，以使蛋白22内发生易位57的反应区域或用于氧化电极18和还原电极20的传感区57相对于介电构件16位于相同位置。

图11显示包括三个装置12的系统1120。如图9所示，蛋白22附接在不同的位置，以使在蛋白22内发生易位57,57',57''的反应区域或用于氧化电极18和还原电极20的传感区57,57',57''位于区域58内。在各个实施方案中，将蛋白附接到介电构件，以使蛋白的反应区域或传感区彼此的距离为0 nm、0.1 nm、0.2 nm、0.3 nm、0.4 nm、0.5 nm、0.6 nm、0.7nm、0.8 nm、0.9 nm、1 nm、1.1 nm、1.2 nm、1.3 nm、1.4 nm、1.5 nm、1.6 nm、1.7 nm、1.8nm、1.9 nm和2nm。在各个实施方案中，所述距离的范围在上述指定距离中的任何两个之间。

图12显示系统1020、1040、1100、1120的制造的示意图，包括用于形成核酸测序装置的方法。所述方法包括在步骤60之前，提供包括氧化电极18、还原电极20和介电构件16的装置14。特征在于，介电构件16将还原电极20与氧化电极20隔开最多10nm的第一距离。所述方法包括通过氧化电极18、还原电极16或两者产生电场66的第二步骤62。所述方法还包括将蛋白22附接24到介电构件16的表面25的第三步骤64。蛋白22能够将具有用氧化还原标记修饰的核苷酸的多核苷酸链易位，或者能够将具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸接收至介电构件的表面，从而使多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在易位期间，以距所述介电构件表面最多10nm的第二距离经过。在步骤64中，易位蛋白22 (例如聚合酶)被电场66引导至介电构件16，并被电场66诱导成至少基本均匀的定向。在不同的实例中，可以如下方式选择电压，使得它们通过电学方式以对称的力吸引带电的聚合酶，从而使聚合酶结合在电极之间。可选地，可以产生横向电场以控制聚合酶分子的定向，使得相对均匀的定向可以导致改善的传感器性能。控制蛋白定向的横向电场的实例公开在Emaminejad, Sam等人，"Tunablecontrol of antibody immobilization using electric field. "Proceedings of the National Academy of Sciences 112.7 (2015): 1995-1999，其以其整体通过引用并入。

例如，在聚合酶固定过程中由电极产生的电场可用于将生物分子引导至介电层并诱导在表面上的均匀定向。例如，可以如下方式选择电压，使得它们通过电学方式以对称的力吸引带电的聚合酶，从而使聚合酶结合在电极之间。在需要将聚合酶选择性吸附到介电层上的情况下，可以设置电极上的电压以产生不利于聚合酶附接到电极上的表面电荷(当表面电荷与聚合酶的等电点匹配时，吸附减少)。可选地，可以产生横向电场来控制聚合酶分子的定向，因为均匀定向可以提高传感器的性能(参见Emaminejad等人)。

图13、14、15和16显示了核酸测序的方法。所述方法包括提供至少一个装置的第一步骤，所述装置包括氧化电极18、还原电极20、介电构件16和附接24到介电构件16的表面25的蛋白22。特征在于，介电构件16将还原电极20与氧化电极18隔开最多10nm的第一距离。蛋白22能够将具有用氧化还原标记修饰的核苷酸的多核苷酸链易位，或者能够接收具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸。蛋白22的附接64使得多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在易位期间达到距介电构件16的表面25最多10 nm的第二距离内。所述方法包括引导电流通过氧化电极18和还原电极20的第三步骤，其中氧化电极18和还原电极20产生延伸到反应区域的电场，在所述反应区域发生多核苷酸链穿过蛋白22的易位。所述方法包括使蛋白22暴露于包含多核苷酸链的样品的第三步骤，其允许多核苷酸链穿过蛋白22易位。所述方法包括检测氧化电极18和还原电极20中的电流变化的第四步骤。当多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在反应区域时，所述变化识别出从还原电极20至氧化还原标记以及至氧化电极18的电子转移。

图13显示装置12，其包括在氧化电极18和还原电极20之间的介电构件16，其中DNA聚合酶22,68附接24到介电构件16。当电流被引导通过电极18,20，被引导到包括DNA聚合酶68的活性位点72的传感区70时，由氧化电极18和还原电极20产生电场66。使用引物74，DNA聚合酶68通过掺入游离的脱氧核苷酸(dNTP) 80和经修饰82以包含氧化还原标记83的dNTP，而产生碱基链78的互补链76。当修饰的dNTP 82或氧化还原标记在DNA复制期间进入活性位点72和传感区70时，发生从还原电极20到氧化还原标记83以及到氧化电极18的电子转移84。在图13举例说明的实施方案中，在通过聚合酶68的DNA复制期间，氧化还原标记83可进入活性位点72或与活性位点72相邻，使得具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸82的每次掺入，都产生碱基特异性信号。在不同的实例中，可以在没有氧化还原标记83扩散的情况下发生电子转移。由于可以确定聚合酶的掺入速度，所以可以将碱基作为信号对时间的函数分配。可以操作所述装置，以使在复制过程中一次对一个碱基进行氧化还原修饰。多个装置可以并行运行，以实现同时检测不同的碱基。在溶液中具有氧化还原物质的情况下，存在如下的可能性，即在溶液中自由扩散的氧化还原标记物质也可在电极内相互作用。然而，自由扩散穿过传感区的分子的时间常数与在掺入期间被限制在传感区中的分子的时间常数将是不同的。因此，查看信号的频域可允许区分扩散信号与易位信号。在不同的实例中，聚合酶68锚定在2个电极18,20之间的纳米级介电构件16的表面上。聚合酶68可与DNA 78和引物74结合，并通过聚合酶链反应开始掺入核苷酸80,82。传感区70在氧化电极18和还原电极20之间的重叠内。

在各个实施方案中，从还原电极20到氧化还原标记83以及到氧化电极18的电子转移84发生的速率(即电子转移速率)在＃x 10⁶ s^-1到＃x 10¹² s^-1的范围，其中＃是范围1到10的任何值。在各个实施方案中，电子转移速率是＃x 10⁶ s^-1、＃x 10⁷ s^-1、＃x 10⁸ s^-1、＃x 10⁹ s^-1、＃x 10¹⁰ s^-1、＃x 10¹¹ s^-1、＃x 10¹² s^-1，其中＃是范围1到10的任何值。在各个实施方案中，电子转移速率是在上述指定速率的任何两个之间选择的速率。例如，从还原电极20到氧化还原标记83以及到氧化电极18的电子转移的速率以＃x 10⁶ s^-1的速率发生，其中＃为范围1到10的任何值。

在各个实施方案中，在引导步骤中氧化电极18和还原电极20的电压彼此不同。

在可选的实施方案中，电子设备的前端可以以全差分的方式布置。当电流流入前端的一个电极时，具有相同幅度但极性不同的电流流入前端的第二输入电极。这避免了耦合到两个电极的干扰通过信号路径传输。这个实施方案的实例公开在，描述于美国专利申请号16/009,766和美国临时申请号62/581,366中。

在另一个实施方案中，在前端最前的第一阶段中使用高通特性，这避免了会导致前端信号路径过载的差分DC电流(来自隧道效应或来自流经聚合酶的电流)。这样避免信号由于“寄生的(parasitic)”DC电流而被推到测量范围的极限。来自检测的碱基的电流变化将经由高通传输并在电子信号链中处理。

各个实施方案的氧化还原标记83是能够被氧化电极18氧化并被还原电极20还原的化合物。氧化还原标记的实例包括二茂铁(环戊-1,3-二烯；铁(2+))及其衍生物、蒽醌(蒽-9,10-二酮)、亚甲基蓝([7-(二甲基氨基)吩噻嗪-3-亚基]-二甲基氮杂鎓；氯化物)和吩噻嗪(10H-吩噻嗪)、锇和钌络合物、四硫富瓦烯、氨基酚、硝基酚、赤藓红B、ATTO MB2等。在所应用的电势下，氧化还原物质经历可逆的氧化-还原反应，以实现穿梭检测原理。

在各个实施方案中，所述方法和系统包括用不同的氧化还原标记修饰的dNTP 82，其中每个氧化还原标记具有不同的氧化还原电势。在实例中，所述方法包括具有不同氧化还原标记的两种、三种或四种核苷酸dNTP。例如，可以修饰腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以包括氧化还原标记，并且可以修饰胞嘧啶或鸟嘌呤以包括不同的氧化还原标记。如何复制DNA链以掺入氧化还原修饰的核苷酸的实例公开在美国专利申请号16/009,766和美国临时申请号62/581,366中。

在各个实施方案中，具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸82具有下式：

其中：

X是

或

是单键、双键、三键，

Lk不存在或是含烃的连接基团，包括烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基或含杂原子的环系统，

R₁是H或OH，并且

R₂是氧化还原标记。

具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸82的实例包括具有下式的化合物：

或

。

具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的前体的修饰核苷酸82的实例包括具有下式的化合物：

或

m是1-12，

n是1-100，并且

o是3-12。

图14类似于图13，但是不同之处在于，碱基链78'包括具有与其附接的氧化还原标记的氧化还原修饰的核苷酸86。使用引物74，DNA聚合酶22,68通过掺入游离dNTP 80而产生碱基链78'的互补链76'。在DNA复制期间，碱基链78'的修饰核苷酸86或氧化还原标记83进入活性位点70或传感区72时，发生从还原电极20到氧化还原标记83以及到氧化电极18的电子转移84，其改变流过电极18,20的电流，并产生碱基特异性信号。掺入方法可以包括已经具有如图14中举例说明的、用氧化还原掺入物质修饰的单链的DNA，其描述于美国专利申请号16/009,766和美国临时申请号62/581,366。可选地，使用未修饰的DNA，并且氧化还原修饰的碱基在溶液中。

图15类似于图13和14，但是不同之处在于使用附接24到介电构件16的核酸酶22,88，而不是DNA聚合酶68。核酸酶88结合多核苷酸链90，多核苷酸链90具有带有与其附接的氧化还原标记的氧化还原修饰的核苷酸86。在将多核苷酸链90消化成片段92期间，核酸酶88使多核苷酸链90易位，以使多核苷酸链90的氧化还原修饰的核苷酸86或氧化还原标记83进入传感区70。然后，发生从还原电极20到氧化还原标记83以及到氧化电极18的电子转移84，其改变流过电极18,20的电流，并产生碱基特异性信号。

图16与图13、14和15相似，但不同之处在于使用附接24至介电构件16的CRISPR相关蛋白-9核酸酶22,94。包含恒定区96和靶向区98的CRISPR单引导RNA (sgRNA)或CRISPR靶向RNA(crRNA)位于CRISPR相关蛋白-9核酸酶94内。靶向区域98的多核苷酸序列具有这样的序列，使得CRISPR相关蛋白-9核酸酶94使具有氧化还原修饰的核苷酸86,83的多核苷酸链90易位而不产生双链断裂。在易位期间，多核苷酸链90的修饰核苷酸86或氧化还原标记83进入传感区70。然后，发生从还原电极20到氧化还原标记83以及到氧化电极18的电子转移84，其改变流过电极18,20的电流，并产生碱基特异性信号。

各个实施方案的氧化还原标记83是能够被氧化电极氧化并被还原电极还原的化合物。氧化还原标记的实例包括二茂铁(环戊-1,3-二烯；铁(2+))及其衍生物、蒽醌(蒽-9,10-二酮)、亚甲基蓝([7-(二甲基氨基)吩噻嗪-3-亚基]-二甲基氮杂鎓；氯化物)和吩噻嗪(10H-吩噻嗪)、锇和钌络合物、四硫富瓦烯、氨基酚、硝基酚、赤藓红B、ATTO MB2等。在所应用的电势下，氧化还原物质经历可逆的氧化-还原反应，以实现穿梭检测原理。

在各个实施方案中，所述方法和系统包括用不同的氧化还原标记修饰的核苷酸86，每个所述氧化还原标记具有不同的电势。在实例中，所述方法包括具有不同氧化还原标记的两种、三种或四种核苷酸。例如，可以修饰腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以包括氧化还原标记，并且可以修饰胞嘧啶或鸟嘌呤以包括不同的氧化还原标记。如何复制DNA链以掺入氧化还原修饰的核苷酸的实例公开在美国专利申请号16/009,766和美国临时申请号62/581,366的图4和5以及[0017]-[0019]段中。

在各个实施方案中，修饰的核苷酸86具有下式：

其中：

Y是核糖、脱氧核糖或氢(H)，

Z是磷酸或氢，

X是

是单键、双键、三键，

R₁是H或OH，并且

R₂是氧化还原标记。

具有与其附接的氧化还原标记的修饰核苷酸86的实例包括具有下式的化合物：

。

具有与其附接的氧化还原标记前体的修饰核苷酸86的实例包括具有下式的化合物：

其中

Y是核糖、脱氧核糖或氢(H)，

Z是磷酸或氢，

m是1-12，

n是1-100，并且

o是3-12。

下文提供了合成修饰的dNTP 82或形成具有与其附接的氧化还原标记的氧化还原修饰的核苷酸86的dNTP的方法的实例。

可以通过合成包含标记的核苷酸，将氧化还原标记直接引入靶标DNA，所述包含标记的核苷酸可以在PCR期间掺入DNA链中(图17和18)。可选地，可以使用两步方法(图19)：可以通过PCR将包含化学“手柄”的核苷酸引入DNA链，然后进行另一个化学修饰步骤，在此步骤期间，电化学标记附接至“手柄”。对于此策略，主要的要求是所选的化学反应与DNA分子中存在的任何其他反应性基团正交，与水溶液相容，并是定量的。“点击”化学满足上述所有要求，并且已成为用于修饰DNA和蛋白的通用工具。点击化学是叠氮化物与炔烃之间的反应，产生共价产物 - 1,5-二取代的1,2,3-三唑，其通常由铜(I)催化。对于无铜的“点击”反应，可将空间应变炔烃与叠氮化物反应，或将反式环辛烯与四嗪偶联(“第三代点击化学”)。可以通过PCR步骤，将炔烃、反式环辛烯、叠氮化物或四嗪手柄引入DNA中，在所述PCR步骤中引入相应的修饰核苷酸(参见化合物1-8)，然后与含有其他相应反应性基团的电化学标记进行点击反应。反应性基团可通过碳链或环氧乙烷(PEG)链连接至氧化还原标记(化合物9-12)。

反应性基团可以通过碳链或环氧乙烷(PEG)链连接至氧化还原标记(参见下文“点击”修饰的氧化还原标记的实例)。

尽管上文提供的实例显示了在碱基上修饰的核苷酸，但是氧化还原标记或手柄也可以附接到戊糖。这些实例也显示在Verma, Sandeep, and Fritz Eckstein. "Modifiedoligonucleotides: synthesis and strategy for users." (1998): 99-134，其以其整体通过引用并入。

在可选的实施方案中，通过监测偏置电极之间的隧道电流的变化，核苷酸本身是报道子。进入聚合酶的核苷酸的化学性质以及核苷酸进入结合口袋后酶结构的变化，将导致隧道效应效率的化学变化，从而产生可以区分存在的碱基的隧道电流变化。可以使用增强隧道效应效率变化的可选DNA修饰来增强信号，例如通过使用聚合物主链(PNA)而不是脱氧核糖主链(DNA)，因为与标准碱基相比，不带电的主链将是对电场更显著的改变。也可以使用其他化学物质，其最终目的是使碱基进入传感区时对隧道电流的破坏最大化。

在其他实施方案中，电子设备的前端可以以全差分的方式布置。当电流流入前端的一个电极时，具有相同幅度但极性不同的电流流入前端的第二输入电极。这避免了耦合到两个电极的干扰通过信号路径传输。其次，可以将高通特性整合在前端最前的第一阶段中。这将避免差分DC电流(来自隧道效应或来自流经聚合酶的电流)使前端信号路径过载。换言之，这将避免信号由于“寄生的”DC电流而被推到测量范围的极限。来自需要检测的碱基的电流变化，将经由高通传输并在电子信号链中处理。

各个实施方案的方法还包括测序RNA。可以使用逆转录酶(RT)酶在上游加工RNA，以生成随后可以使用固定的DNA聚合酶来读取的cDNA。可选地，可以将RT酶固定至表面，并且随着RNA序列的复制，通过RT酶的氧化还原修饰的dNTP的掺入将用于确定原始RNA模板。

本文公开的过程、方法或算法可以传递给处理设备、控制器或计算机或由其实现，所述处理设备、控制器或计算机可包括任何现有的可编程电子控制单元或专用电子控制单元。类似地，可以将所述过程、方法或算法作为可由控制器或计算机执行的多种形式的数据和指令储存，其包括但不限于永久地存储在不可写存储介质(诸如ROM设备)上的信息，以及可变地存储在可写存储介质(例如软盘、磁带、CD、RAM设备以及其他磁性和光学介质)上的信息。所述过程、方法或算法也可以在可执行软件对象中实现。可选地，可以使用适当的硬件组件(例如专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、状态机、控制器或其他硬件组件或装置)或硬件、软件和固件组件的组合，来全部或部分地实现所述过程、方法或算法。

虽然上文描述了示例性实施方案，但是并没有期望这些实施方案描述权利要求书所涵盖的的所有可能形式。在说明书中使用的措辞是描述性的而非限制性的措辞，并且应理解在不脱离本公开的精神和范围的情况下可以进行各种变化。如先前所描述，各个实施方案的特征可以被组合以形成可能未明确描述或举例说明的本公开的进一步实施方案。尽管可以将各个实施方案描述为就一个或多个期望的特征而言，提供优点或优于其他实施方案或现有技术的实现方式，但是本领域普通技术人员认识到可以折衷一个或多个特征或特点，来实现期望的整体系统属性，这取决于特定的应用和实现。这些属性可以包括但不限于成本、强度、耐用性、生命周期成本、可销售性、外观、包装、尺寸、可维修性、重量、可制造性、易于组装等。因此，就一个或多个特征而言，在所描述的任何实施方案不如其他实施方案或现有技术的实现方式理想的程度上，这些实施方案并没有在本公开的范围以外，并且对于特定应用而言会是理想的。

序列表

<110> ROBERT BOSCH GMBH

<120> 使用固定的易位蛋白的EDGE测序

<130> RBPA0131PUS

<140> 16555924

<141> 2019-08-29

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 本发明实施方案的说明性实施例

<400> 1

atcccggctt aagagaccgt tggtgacctg aacgctaa 38

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 本发明实施方案的说明性实施例

<400> 2

ttagcgttca ggtcaccaac ggtctc 26

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 本发明实施方案的说明性实施例

<400> 3

atcccggctt ccgagaccgt tggtgacctg aacgctaa 38

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 本发明实施方案的说明性实施例

<400> 4

ttagcgttca ggtcaccaac ggtctcg 27

Claims

1.核酸测序的方法，所述方法包括以下步骤：

提供至少一个装置，其包括：

氧化电极，

还原电极，

位于氧化电极和还原电极之间的介电构件，其中介电构件将还原电极与氧化电极分开最多10 nm的第一距离，和

附接在所述介电构件的表面的蛋白，所述蛋白能够易位具有用共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记修饰的核苷酸的多核苷酸链，或者能够接收具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸通过所述蛋白，使得具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在距所述介电构件的表面最多10 nm处经过，

其中所述氧化电极和还原电极产生电场，所述电场延伸到发生多核苷酸链通过所述蛋白的易位的反应区域；

引导电流通过氧化电极和还原电极；

将所述蛋白暴露于包含多核苷酸链的样品，其中所述多核苷酸链易位通过所述蛋白；和

检测在氧化电极和还原电极中电流的变化，其中当多核苷酸链的具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸位于反应区域时，所述变化识别出从还原电极到氧化还原标记和到氧化电极的电子转移。

2.权利要求1的方法，其中所述蛋白是DNA聚合酶、RNA聚合酶、核糖体、单链结合蛋白、拓扑异构酶、解旋酶、核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、锌指核酸酶、RNA指导的DNA核酸内切酶、转录激活子样效应子核酸酶和CRISPR蛋白之一。

3.权利要求1的方法，其中所述至少一个装置是多个装置。

4.权利要求3的方法，其中所述多个装置中的蛋白在所述多个装置中的蛋白中的介电构件的表面上至少部分地对齐。

5.权利要求3的方法，其中所述多个装置中的蛋白选自DNA聚合酶、RNA聚合酶、核糖体、单链结合蛋白、拓扑异构酶、解旋酶、核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、锌指核酸酶、RNA指导的DNA核酸内切酶、转录激活子样效应子核酸酶、CRISPR蛋白及其组合。

6.权利要求1的方法，其中所述介电构件包括具有介电常数的材料，使得所述氧化电极和所述还原电极之间的隧道电流的波动小于由从所述还原电极到氧化还原标记和到氧化电极的电子转移所导致的电流中的变化。

7.权利要求6的方法，其中所述材料是氧化铝、二氧化钛、氧化铪、氧化锆、二氧化硅、氮化硅和六方氮化硼中的至少一种。

8.权利要求1的方法，其中所述介电构件具有在所述氧化电极和所述还原电极之间的范围为1 nm至10 nm的宽度。

9.权利要求1的方法，其中在引导步骤中所述氧化电极和还原电极的电压彼此不同。

10.权利要求1的方法，其中具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸具有下式：

其中：

X是

是单键、双键、三键，

R₁是H或OH，并且

R₂是氧化还原标记。

11.权利要求1的方法，其中具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸具有下式：

其中：

Y是核糖、脱氧核糖或H，

Z是磷酸或氢，

X是

是单键、双键、三键，

R₁是H或OH，并且

R₂是氧化还原标记。

12.核酸测序系统，所述系统包括：

至少一个装置，其包括

氧化电极，

还原电极，

附接在所述介电构件的表面的蛋白，所述蛋白能够易位具有用共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记修饰的核苷酸的多核苷酸链，或者能够接收具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸通过所述蛋白，使得具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在易位期间在距所述介电构件的表面最多10 nm处经过，

其中当具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸位于反应区域时，发生从还原电极到氧化还原标记和到氧化电极的电子转移。

13.权利要求12的系统，其中所述蛋白是DNA聚合酶、RNA聚合酶、核糖体、单链结合蛋白、拓扑异构酶、解旋酶、核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、锌指核酸酶、RNA指导的DNA核酸内切酶、转录激活子样效应子核酸酶和CRISPR蛋白之一。

14.权利要求12的系统，其中所述介电构件包括二氧化硅、氮化硅和氧化铝中的至少一种。

15.权利要求12的系统，其中所述介电构件具有在所述氧化电极和所述还原电极之间的范围为1 nm至10 nm的宽度。

16.权利要求12的系统，其中具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸具有下式：

其中：

X是

是单键、双键、三键，

R₁是H或OH，并且

R₂是氧化还原标记。

17.权利要求12的系统，其中具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸具有下式：

其中：

Y是核糖、脱氧核糖或H，

Z是磷酸或氢，

X是

是单键、双键、三键，

R₁是H或OH，并且

R₂是氧化还原标记。

18.权利要求12的系统，其还包括多个所述装置的阵列。

19.权利要求18的系统，其中所述多个装置中的蛋白在所述多个装置中的介电构件的表面上至少部分地对齐。

20.权利要求18的系统，其中所述多个装置中的蛋白选自DNA聚合酶、RNA聚合酶、核糖体、单链结合蛋白、拓扑异构酶、解旋酶、核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、锌指核酸酶、RNA指导的DNA核酸内切酶、转录激活子样效应子核酸酶、CRISPR蛋白及其组合。

21.形成用于核酸测序的装置的方法，所述方法包括以下步骤：

提供一种装置，所述装置包括氧化电极、还原电极、位于所述氧化电极和还原电极之间的介电构件，其中介电构件将还原电极与氧化电极分开最多10 nm的第一距离；

通过氧化电极、还原电极或两者产生电场；和

将蛋白附接到所述介电构件的表面，所述蛋白能够易位具有用共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记修饰的核苷酸的多核苷酸链，或者能够接收具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸，使得具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸在易位期间在距所述介电构件的表面最多10 nm处经过。

22.权利要求21的方法，其中所述蛋白是DNA聚合酶、RNA聚合酶、核糖体、单链结合蛋白、拓扑异构酶、解旋酶、核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、锌指核酸酶、RNA指导的DNA核酸内切酶、转录激活子样效应子核酸酶和CRISPR蛋白之一。

23.权利要求21的方法，其中：

所述提供步骤还包括提供具有多个所述装置的阵列；

所述产生步骤还包括通过每个氧化电极、每个还原电极或两者产生电场；和

所述附接步骤还包括附接蛋白，所述蛋白能够易位具有用共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记修饰的核苷酸的多核苷酸链，或者能够接收具有共价键合至修饰核苷酸的核苷碱基的氧化还原标记的修饰核苷酸至每个介电构件的表面，使得所述蛋白在多个所述装置中的介电构件的表面上至少部分对齐。

24.权利要求23的方法，其中多个所述装置中的蛋白选自DNA聚合酶、RNA聚合酶、核糖体、单链结合蛋白、拓扑异构酶、解旋酶、核酸酶、核酸外切酶、核酸内切酶、锌指核酸酶、RNA指导的DNA核酸内切酶、转录激活子样效应子核酸酶、CRISPR蛋白及其组合。