KR20170091158A - 나노튜브를 이용하는 핵산 중합효소 입체구조적 변화의 검출 - Google Patents

나노튜브를 이용하는 핵산 중합효소 입체구조적 변화의 검출 Download PDF

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필립 지 콜린스
그레고리 에이 웨이스
용기 최
티볼리 올센
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)에 비공유 부착된 핵산 중합효소를 제1 뉴클레오타이드 또는 제1 뉴클레오타이드 유사체 및 주형과 접촉시키는 단계 및 핵산 중합효소와 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소 사이의 SWNT의 제1 전기 전도도를 측정함으로써 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소를 검출하는 단계를 수반하는 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 방법은 폴리뉴클레오타이드의 시퀀싱에 유용하다.

Description

나노튜브를 이용하는 핵산 중합효소 입체구조적 변화의 검출{DETECTION OF NUCLEIC ACID POLYMERASE CONFORMATIONAL CHANGES USING A NANOTUBE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 12월 18일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/093,671호의 유익을 주장하며, 이의 내용은 그의 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다.
연방 정부 지원된 연구 및 개발 하에서 이루어진 본 발명에 대한 권리에 대한 언급
본 발명은 미국국립보건원에 의해 부여된 등록 번호 1 RO1 CA133592-01, 및 미국국립과학재단에 의해 부여된 등록 번호 ECCS-1231910 하에서 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
ASCII 파일로서 제출된 "서열목록", 표 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 언급
2015년 12월 13일자로 생성된 파일명 48538-526001WO_ST25.TXT(2,828바이트, 기계 형식 IBM-PC, MS-윈도 작동 시스템)로 기재된 서열목록은 그의 전문이 모든 목적을 위해 본 명세서에 참고로 포함된다.
DNA 시퀀싱 산업 내에서, 합성(비천연) 분자의 사용은 DNA를 구성하는 4가지 뉴클레오타이드 염기(A, C, T 및 G) 사이의 차별화를 위한 1차 전략이다. 이 전략은 본래의 인간 게놈 노력을 위해 사용한 권위있는 생어 시퀀싱(Sanger sequencing) 방법에 대해 성공적으로 적용되었다.
기법은 DNA의 시퀀싱을 위해 존재하지만, 속도를 증가시키고, 오류율을 감소시키며, 복잡성, 비용 및 시약 필요를 감소시킬 수 있는 새로운 기법에 대한 상업적 필요가 있다. 전자 회로를 이용하여 DNA를 시퀀싱할 수 있는 기법에 상당한 관심이 있는데, 고체 전자공학은 속도, 비용 및 복잡성에서 다수의 이점을 제공할 수 있기 때문이다.
최근에, 나노기공(nanopore)을 통해 DNA를 통과시키고 동일한 기공을 통해 이온 전류를 모니터링함으로써 또는 나노기공을 통해 DNA를 통과시키지만 인접한 전기 터널 접합을 이용하여 수송을 도입함으로써 작동하는 전자적 아키텍처(architecture)가 생성되었다. 플랫폼은 둘 다 나노기공을 통한 DNA 통과에 의존하며, 따라서 그들은 나노기공을 이용하는 작업의 특징적 어려움, 예컨대 불안정성, 약함 및 정확한 유체 조절을 공유한다. 더 나아가, 나노기공을 통한 DNA의 통과는 신호 대 노이즈가 제한되지만, 따라서 실행에서, 임의의 시퀀싱 정보가 형광 방법을 이용하여 독립적으로 확인되어야 한다. 추가적으로, 나노기공을 통한 높은 오류율 및 "슬립(slip)"은 인간 동정 용도에 필요한 짧은 종열 반복부의 고도로 반복적인 서열 시퀀싱과 같은 용도를 제한한다.
바이오센서는 형질도입 요소와 직접적인 공간적 접촉에서 생물학적 인식 요소를 혼입하는 분석 소자이다. 해당 집적회로는 생물학적 사건의 검출 가능한 신호로의 빠르고 편리한 전환을 보장한다. 다양한 전기적 바이오센싱 아키텍처 중에서, 전계 효과 트랜지스터(field-effect transistor: FET)에 기반한 소자는 크게 주목되었는데, 그들이 표적 분자(예를 들어, 생물학적 분자)와 트랜지스터 표면 사이의 상호작용을 판독 가능한 전기 신호로 직접 번역할 수 있는 바이오센서의 유형이기 때문이다. 표준 전계 효과 트랜지스터에서, 전류는 2개의 전극(소스(source) 및 드레인(drain))에 연결된 전도 통로(채널)를 따라서 흐른다. 소스와 드레인 사이의 채널 전도도는 얇은 유전체 층을 통해 용량성 결합된 제3(게이트) 전극을 스위치 온(on) 및 오프(off)한다. 전계 효과 트랜지스터는, 예를 들어, 산업 공정 제조, 누수검출, 폐수 모니터링 및 의학적 진단을 포함하는 넓은 범위의 상업적 적용분야에 대해 표적 화학물질을 검출하고 화학물질 농도를 측정한다.
예를 들어, 단일 분자 수준으로 검출하기에 충분히 민감한 전자 소자가 미국 특허 출원 제13/626,760호에 개시되어 있다. 본 발명의 양상은 단일 민감화 분자가 부착된 전기적으로 전도성인 채널을 이용하여 달성된다. 따라서, 그에 개시된 소자는 단일 분자 반응의 역학을 모니터링하며, 중요한 단일 분자 생화학적 분석, 예컨대 단일 분자 시퀀싱 반응의 검출기에서 사용될 수 있다.
따라서, 현재의 기법보다 더 효율적이고 더 유익한 차세대 DNA 시퀀싱 기법에 대한 필요가 있다. 본 명세서에서 당업계의 이들 및 다른 문제에 대한 해결책이 제공된다.
본 명세서에서 특히, DNA 샘플의 유전자 서열을 결정하기 위해 천연 뉴클레오타이드 염기와 비천연 뉴클레오타이드 염기의 혼합물을 이용하는 회로가 제공된다. DNA 가닥의 유전자 암호를 결정하기 위해 회로를 이용하는 실행에 대한 구체적 기법 및 축도가 기재된다.
상기 회로는 DNA의 시퀀싱 및 연장에 의해, RNA 및 탄수화물의 시퀀싱을 가능하게 한다. 본 발명은 더 전통적인 시퀀싱 방법에 의해 성공적으로 완료될 수 있는 저비용, 고속, 고충실도 DNA 시퀀싱 방법을 제공한다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은 효소적 가공 동안 단일 분자의 활성에 따를 수 있다. 합성 기질, 뉴클레오타이드 및 형광단은 DNA 가닥으로부터 독특하고 구별 가능한 신호를 생성하는 데 사용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 화학적으로 변형된 dNTP를 이용하는 KF 활성의 전기적 모니터링을 도시한 도면. 도 1a: 단일 KF 나노회로 및 화학적으로 변형된 dNTP는 KF에 의한 그들의 혼입에 대해 시험하였다. (a) "핑거(finger)" 서브도메인에 도입된 단일 시스테인을 통해 DNA 중합효소 I의 단일 분자에 비공유적으로 생체접합된 단일벽 탄소 나노튜브 전계 효과 트랜지스터(SWCNT-FET)의 개략적 다이어그램. 파이렌-말레이미드 링커(황색)는 π-π 염기쌓임(stacking)을 통해 SWCNT-FET에 접착되고, KF를 고정시키기 위해 단일 시스테인에 공유 부착됨. SWCNT-FET를 SiO2 상에서 증가시키고, 소스 및 드레인 금속 전극에 연결하며, 중합체(PMMA, 적색)에 의해 부동태화하였다. 도 1b: 원자력 현미경은 단일 KF 부착(7㎚, 화살표)에 의한 SWNT FET의 1 내지 2㎚ 직경을 나타낸다. 도 1c: 본 명세서에 개시된 유사체 dNTP의 화학 구조. 천연 dNTP로부터의 화학적 변형을 강조한다.
도 2A 내지 도 2F. 천연 및 유사체 dNTP 혼입 동안 전류의 변화를 도시한 도면. 도 2A: 폴리(dC)42 주형 및 그의 상보성 천연 dGTP의 존재 하에 본 전류 측정에서, 각각의 염기 혼입 동안 ΔI(t) 과도출력이 생긴다. 고전류 및 저전류 상태는 각각 효소 개방 및 폐쇄 입체구조에 대응한다. 도 2B 내지 도 2F: 도 2A에 대응하는 데이터의 시간 배율(시간창 1.5 내지 2.5초)은 dGTP(도 2B), α-티오-dGTP(도 2C), 6-클로로-2APTP(도 2D), 및 2-티오-dCTP(도 2E 내지 도 2F)의 염기 혼입에 대응하는 스위칭 사건의 감소를 도시한다. 각각의 도 2B 내지 도 2F의 오른쪽에, 확대도는 단일 염기 해상도를 강조하는 각각 표시된 염기에 대한 단일 ΔI(t) 과도출력을 도시하며, 막대는 1ms 시간 간격을 나타낸다.
도 3A 내지 도 3B. 50초 초과의 데이터 세트로부터 표시된 dNTP의 혼입 동안의 개방 상태(τopen) 및 폐쇄 상태(τclosed) 지속의 확률 분포의 직접적 비교를 도시한 도면. log 확률 %로서 플롯팅한 Y축. τclosed(도 3A)와 τopen(도 3B) 둘 다에 대해, 동종중합체 폴리(dC)42는 주형을 제공하였다. 도 3A 내지 도 3B에서, 각각의 뉴클레오타이드에 대한 단일-지수 적합성을 실선으로 나타낸다.
도 4A 내지 도 4B는 폴리(dA)42의 가공에서 생성된 전자적 신호를 도시한 도면. 도 4A: 천연 뉴클레오타이드 데옥시티미딘 삼인산염(dTTP)의 존재 하에서 KF가 폴리(dA)42를 가공할 때, 각각의 염기쌍 혼입은 음전류 스파이크 ΔI<0을 생성한다. 도 4B: dTTP가 비천연 뉴클레오타이드 2-티오-2'-데옥시티미딘-5'-삼인산염(2-티오-dTTP)으로 대체될 때, 염기 혼입은 양전류 스파이크 ΔI>0를 생성한다.
도 5A 내지 도 5C는 이종성 기질의 가공에서 생성된 전자적 신호를 도시한 도면. 도 5A: KF가 모두 4가지의 천연 뉴클레오타이드(dNTP)의 존재 하에 균질한 기질을 가공할 때, 각각의 염기쌍 혼입은 음전류 스파이크 ΔI<0을 생성한다. 개개 스파이크는 나타낸 바와 같이 열거하지만, 일반적으로 그들은 염기의 하나의 유형을 서로 구별하지 않는다. 도 5B: 도 5B는 2-티오-dTTP로 대체되는 dTTP와 동일한 데이터 세트의 자극을 보여준디. 티올화된 데옥시티미딘에 의해, 양의 스파이크는 이제 T 뉴클레오타이드가 도입된 위치(#2, 6, 7)를 나타낸다. 도 5C는 KF가 특정 유사체와 혼합된 천연 뉴클레오타이드(dNTP)의 존재 하에 이종성 기질을 가공할 때, 얻어진 패턴이 선택된 염기를 동정하는 데 사용될 수 있는 양전류 및 음전류를 포함한다는 것을 보여준다. 이 예는 G 혼입을 위한 유사체로서 6-Cl-2APTP와 혼합된 3가지 천연 뉴클레오타이드(dATP, dTTP, dCTP)를 이용하여 획득된 데이터를 나타낸다. 이 정보는 올리고뉴클레오타이드의 나노튜브 시퀀싱 방법에서 사용된다.
도 6은 과발현 및 정제 후에 KF의 대표적인 15% SDS-PAGE 겔을 도시한 도면. KF는 95% 초과의 동종성으로 정제되었고, 약 68kDa의 예상 질량에서 이동하였다.
도 7은 정상 상태 조건 하에서 KF(L790C)(검정색 원) 및 야생형 KF(회색 원)를 도시하는 형광 기반 활성 분석을 도시한 도면. 프라이머 연장 반응은 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP의 존재 하에 일어난다. 원 데이터는 dNTP의 부재 시의 활성을 측정한 배경으로부터 차감하였다.
도 8A 내지 도 8B는 본 명세서에 기재한 주형을 이용하는 dNTP 유사체의 혼입을 나타내는 총체 분석을 도시한 도면. dNTP 유사체 및 A/T 혼입 주형(도 8A) 또는 G/C 혼입 주형(도 8B)에 의한 중합 산물을 5% 고해상도 아가로스 겔 상에서 전기 영동하였다. dTTP(1), dATP(2), dCTP(8) 및 dGTP(9)를 생략하고 3가지의 dNTP만을 이용하는 음성 대조군 반응은 dsDNA를 포함하지 않았다. 모두 4가지 dNTP를 이용하는 양성 대조군 반응은 A/T 혼입 주형(3)과 G/C 혼입 주형(10) 둘 다에 의한 dsDNA로의 전환을 나타내었다. dNTP 유사체(4 내지 7 및 11 내지 14)에 의한 반응은 그들의 천연 dNTP 상대가 없었고, 남아있는 3가지 천연 dNTP를 포함하였다. A/T 혼입 주형 반대편으로, α-티오-dTTP(4) 및 2-티오-dTTP(5)는 주형 염기 A를 반대편에 혼입하고, α-티오-dATP(6) 및 6-Cl-2APTP(7)는 주형 염기 T를 반대편에 혼입하였다. G/C 혼입 주형 반대편으로, α-티오-dCTP(11) 및 2-티오-dCTP(12)는 주형 염기 G 반대편으로 혼입하였고, α-티오-dGTP(13) 및 6-Cl-2APTP(14)는 주형 염기 C 반대편으로 혼입하였다. 시각화 후에, 이미지 색은 반전되었고, 이어서, 검정색 및 흰색으로 바뀌었다.
본 명세서에서, 특히, 핵산 중합효소 확인에서 변화의 검출 방법; 핵산 중합효소의 변화가 검출된 핵산 중합효소의 시퀀싱 방법이 제공된다. 실시형태에서, 상기 방법은 핵산 유사체를 이용하여 핵산 중합효소의 입체구조적 변화를 검출하는 것을 포함한다.
정의
다음의 정의는 본 대상을 이해하기 위한 목적을 위해 그리고 첨부된 본 청구범위를 구성하기 위한 목적을 위해 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 약어는 화학적 및 생물학적 분야 내에서 그들의 통상적인 의미를 가진다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, 문헌[Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)] 참조. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 임의의 방법, 소자 및 물질은 본 개시내용의 실행에서 사용될 수 있다. 다음의 정의는 본 명세서에서 빈번하게 사용되는 특정 용어의 이해를 용이하게 하기 위해 제공되며, 본 개시내용의 범주를 제한하는 것을 의미하지 않는다.
용어 "핵산"은 단일-, 이중- 또는 다중 가닥 형태 또는 이들의 상보체 중 하나에서 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이의 중합체를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 선형 서열을 지칭한다. 용어 "뉴클레오타이드"는 전형적으로 폴리뉴클레오타이드의 단일 단위, 즉, 단량체를 지칭한다. 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 이들의 변형된 형태일 수 있다. 본 명세서에 상정된 폴리뉴클레오타이드의 예는 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA(siRNA를 포함), 및 단일 및 이중 가닥 DNA 및 RNA의 혼합물을 갖는 혼성 분자를 포함한다. 핵산은 선형 또는 분지형일 수 있다. 예를 들어, 핵산은 뉴클레오타이드의 선형 사슬일 수 있거나 또는, 예를 들어, 핵산이 뉴클레오타이드의 하나 이상의 아암(arm) 또는 분지를 포함하도록, 핵산은 분지될 수 있다. 선택적으로, 분지된 핵산은 반복적으로 분지되어 덴드리머 등과 같은 더 고차 구조를 형성한다.
포스포티오에이트 골격을 지니는 핵산을 포함하는 핵산은 하나 이상의 반응성 모이어티를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 반응성 모이어티는 공유, 비공유 또는 기타 상호작용을 통해 다른 분자, 예를 들어 핵산 또는 폴리펩타이드와 반응할 수 있는 임의의 기를 포함한다. 예로서, 핵산은 공유, 비공유 또는 기타 상호작용을 통해 단백질 또는 폴리펩타이드 상의 아미노산과 반응하는 아미노산 반응성 모이어티를 포함할 수 있다.
상기 용어는 또한 합성, 천연 유래, 및 비천연 유래이며, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 기준 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 공지된 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 결합을 포함하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는, 제한 없이, 예를 들어, 포스포르아미데이트, 포스포로다이아미데이트, 포스포로티오에이트(또한 포스포티오에이트로서 알려짐), 포스포로다이티오에이트, 포스포노카복실산, 포스포노카복실레이트, 포스포노아세트산, 포스포노폼산, 메틸 포스포네이트, 보론 포스포네이트 또는 O-메틸포스포로아미다이트 결합(문헌[Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press] 참조); 및 펩타이드핵산 골격 및 결합을 포함하는, 포스포다이에스터 유도체를 포함한다. 다른 유사체 핵산은 미국 특허 제5,235,033호 및 제5,034,506호, 및 문헌[Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds]에 기재된 것을 포함하는 양의 골격; 비이온성 골격, 변형당 및 비-리보스 골격(예를 들어, 포스포로다이아미데이트 모폴리노 올리고 또는 잠금 핵산(LNA))을 지니는 것을 포함한다. 하나 이상의 탄소 고리당을 함유하는 핵산이 또한 핵산의 하나의 정의 내에 포함된다. 리보스-인산염 골격의 변형은, 예를 들어, 생리적 환경에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 또는 바이오칩 상의 프로브로서, 다양한 이유로 행해질 수 있다. 천연 유래 핵산과 유사체의 혼합물은; 대안적으로, 상이한 핵산 유사체의 혼합물로 이루어질 수 있고, 천연 유래 핵산과 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다. 실시형태에서, DNA에서 뉴클레오타이드 간 결합은 포스포다이에스터, 포스포다이에스터 유도체, 또는 둘 다의 조합이다.
단어 "상보적" 또는 "상보성"은 제2 폴리뉴클레오타이드에서 다른 핵산과 염기쌍을 형성하는 폴리뉴클레오타이드 내 핵산의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 서열 A-G-T는 서열 T-C-A에 대해 상보적이다. 상보성은 부분적일 수 있는데, 이때 일부의 핵산만이 염기 짝짓기에 따라 매칭되거나, 또는 모든 핵산이 염기쌍에 따라 매칭되는 경우에는 완전하게 매칭된다.
용어 "혼성화" 등은 보통 및 관습적 의미로, 예를 들어, DNA/DNA 혼성체, DNA/RNA 혼성체, 및 RNA/RNA 혼성체를 포함하는 이중 가닥(즉, 듀플렉스) 핵산의 형성을 지칭한다. 듀플렉스 핵산의 형성은 왓슨 크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 통할 수 있다는 것이 이해된다. 어구 "선택적으로(또는 특이적으로) 혼성화하는"은 더 고친화도, 예를 들어, 더 엄격한 조건 하에서, 다른 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 총 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA)보다 더 고친화도로 특정 뉴클레오타이드 서열에 핵산을 결합, 이중가닥 형성 또는 혼성화하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 핵산 중합효소의 입체구조 변화는 단일벽 탄소 나노튜브 전계 효과 트랜지스터(SWCNT-FET)를 이용하여 검출된다. 예를 들어, 클레노브 단편(Klenow Fragment: KF) 나노회로는 "핑거" 서브도메인에 도입된 단일 시스테인을 통해 DNA 중합효소 I(KF)의 단일 분자에 비공유적으로 바이오컨쥬게이션된 SWCNT-FET를 포함한다. 입체구조 변화는 KF 나노회로에 의해 생성된 ΔI(t) 신호에 의해 측정된다. 상기 소자는 음의 ΔI(t) 과도출력의 연속 시퀀스를 생성하며, 각각은 하나의 염기쌍의 형성을 나타내고, 반전된 진폭에 의해 상이한 KF 입체구조를 반영한다(도 2C, 도 2F).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 실시형태에서, 제1 뉴클레오타이드 또는 제1 뉴클레오타이드 유사체는 제2 뉴클레오타이드 또는 제2 뉴클레오타이드 유사체와 각각 동일할 수 있다. 실시형태에서, 제1 뉴클레오타이드 또는 제1 뉴클레오타이드 유사체는 제2 뉴클레오타이드 또는 제2 뉴클레오타이드 유사체와 각각 상이할 수 있다.
어구 "엄격한 혼성화 조건"은 핵산이 그의 표적 서열에, 전형적으로 핵산의 복잡한 혼합물에서(그러나 다른 서열에 대해서는 아님) 혼성화하는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 더 긴 서열은 더 고온에서 특이적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 가이드는 문헌[Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology―Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 발견된다. 일반적으로, 엄격 혼성화 조건은 정해진 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5 내지 10℃ 더 낮게 선택된다. Tm은(정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서) 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 혼성화하는 온도이다(표적 서열이 Tm에서 과량으로 존재하기 때문에, 50%의 프로브가 평형상태에서 점유됨). 엄격한 혼성화 조건은 또한 폼아마이드와 같은 탈안정제의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화에 대해, 양의 신호는 적어도 2회 배경, 바람직하게는 10회 배경 혼성화이다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 다음과 같은 수 있다: 42℃에서 인큐베이션하는 50% 폼아마이드, 5x SSC, 및 65℃에서 인큐베이션하는 1% SDS, 또는 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 0.2x SSC, 및 0.1% SDS 중에서 세척. 예시적인 "중간 정도로 엄격한 혼성화 조건"은 37℃에서 40% 폼아마이드, 1M NaCl, 1% SDS의 완충제 중의 혼성화, 및 45℃에서 1X SSC 중에서 세척을 포함한다. 양성 혼성화는 적어도 2배 배경이다. 당업자는 대안의 혼성화 및 세척 조건이 유사한 엄격성 조건을 제공하는 데 이용될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 혼성화 매개변수를 결정하기 위한 추가적인 가이드라인은 수많은 참고문헌, 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al., John Wiley & Sons]에서 제공된다.
실시형태에서, 단일 분자 센싱 소자(10)는 전기 회로를 "게이팅"하는 작용을 하는 부착된 생체 분자를 이용하여 트랜지스터, 즉, 전계 효과 트랜지스터(FET)의 형태를 취할 수 있다. 본 실시형태에서, 단일 증감(sensitizing) 분자는 소자에 대한 단일 분자 게이트를 제공한다. 트랜지스터 실시형태는 2 또는 3개의 트랜지스터를 포함할 수 있다. 전도 채널은 또한 금속, 금속 산화물, 반도체, 또는 나노미터 규모 도체, 예컨대 나노와이어, 그래핀 또는 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)로부터 형성될 수 있다. 일 실시형태에서, 전도 채널은 단일 SWNT이다.
방법
본 명세서에서 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)에 비공유 부착된 핵산 중합효소를 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체(예를 들어, 제1 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체) 및 주형 핵산 서열(예를 들어, 센스 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)과 접촉시킴으로써, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 및 주형 핵산 서열에 결합된 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소를 형성하는 단계를 포함한다. 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소는 핵산 중합효소와 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소 사이의 SWNT의 전기 전도도 변화를 측정함으로써 검출된다. 용어 "접촉하는" 등은 보통의 그리고 관습적 의미에서, 상호작용(예를 들어, 결합, 화학 반응 등)이 종 사이에 일어날 수 있도록 2 이상의 종이 충분히 가깝게 접촉되는 것을 지칭한다. 용어 "전기 전도도 변화" 등은 보통의 그리고 관습적 의미에서, 당업계에 공지된 그리고 본 명세서에 개시된 방법에 의해 측정될 수 있는 전기 전도도의 변화를 지칭한다. 용어 "입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소" 등은 보통의 그리고 관습적 의미에서 당업계에 공지된 바와 같은 2차, 3차 및/또는 4차 구조 또는 핵산의 변화를 지칭한다.
본 명세서에 개시되는 바와 같은, 전도도의 변화는 핵산 중합효소 및 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소에 대한 핵산 중합효소의 부분을 형성하는 증감 분자(예를 들어, 아미노산)의 일부의 변화 결과일 수 있다. 전류 변동은 스퀘어-에지드(square-edged) 패턴의 단순한 증가 및 감소로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 변동은 삼각형, S자형인 형상을 포함하거나, 또는 임의의 다수의 푸리에(Fourier) 성분을 갖는 임의의 파형요소를 포함할 수 있다. 이들 파형요소의 진폭, 지속기간 및 형상은 모두 표적-특이적 성분의 활성을 암호화하고, 따라서 결합 속도 및 다른 기계적 및 전자적 자유도를 알아내기 위해 컴퓨터를 이용하여 분석될 수 있다. 이 매개변수의 통계학적 분석은 표적 결합 및 비결합 공정의 속도 가변성, 전이 및 중간체 화학물질 상태에 대한 통찰을 제공한다. 전류 신호에서 자유도는 동일한 부위에, 예를 들어 표적 분자와 결합 부위의 저해제 분자 사이에 모두 결합하는 다수의 유사한 표적 분자를 구별한다. 이런 자유도는 또한 실제 결합 전에 일어나는 분자 인식과 같은 상호작용을 구별할 수 있다.
핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법은 핵산(예를 들어 DNA 또는 RNA)을 시퀀싱하는 방법의 부분으로서 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 상기 방법은 제1 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체에 결합된 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소를 검출하는 단계 후에, 상기 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소가 제1 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 방출하여, 핵산 중합효소를 재형성을 허용함으로써 상기 핵산 중합효소의 입체구조의 제2 변화를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 이어서, 상기 방법은 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)에 비공유 부착된 핵산 중합효소를 제2 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체와 접촉시켜, 제2 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드에 결합된 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소를 형성하는 단계를 포함한다. 제2 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체에 결합된 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소는 핵산 중합효소와 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소 사이의 SWNT의 전기 전도도의 변화를 측정함으로써 검출된다.
실시형태에서, 제1 및/또는 제2 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체는 검출되는 독특한 전도도 신호를 생성한다. 독특한 전도도 신호는 상기 제1 및/또는 제2 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 동정함으로써 주형 핵산의 서열을 동정하기 위해 사용된다. 용어 "전도도 신호", "제1 전도도 신호", "독특한 전도도 신호" 등은 보통의 그리고 관습적 의미에서, 본 명세서에 개시된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 측정되는 바와 같은 종의 전도도를 지칭한다.
더 전통적인 시퀀싱 기법보다 더 빠르고, 저비용으로, 그리고 잠재적으로 훨씬 더 낮은 오류율로 작동할 수 있는 탄소 나노튜브가 본 명세서에 제공된 방법에서 유용하다. 본 명세서에 제공된 조성물 및 방법은 나노기공 기반 전자적 아키텍처에 이상으로 상당한 개선을 제공한다. 첫째로, 탄소 나노튜브 회로는 독립적 확인이 필요하지 않은 우수한 노이즈 특징을 지니는 전자 신호를 생성한다. 둘째로, 나노튜브 회로는, 유체 조절 및 전반적 시스템 복잡성에 대한 사양이 나노기공 아키텍처에 비해 상당히 완화될 수 있도록 넓은 범위의 환경 및 개략적인 조절을 용인한다. 셋째로, 나노튜브 회로는 개념적으로 간단하며, 다양한 상이한 방식으로 작동하는 데 용이하게 적합하다. 넷째로, 상기 접근은 염기쌍 차이를 제공하기 위해 고충실도 효소를 사용할 수 있고; 추정 오류율은 효소에 대한 이론적 최대값 18 x 10-6만큼 낮을 수 있다. 이러한 낮은 오류율은 현재 입수 가능한 상업적 기기 이상으로 대략 10,000배 개선을 나타낼 것이다. 따라서, 본 명세서에서 비용, 복잡성, 오류율 및 광범위한 리시퀀싱(resequencing)의 더해진 부담을 상당히 감소시키는 방법 및 조성물이 제공된다. 나노튜브 회로의 일반적 설명은 부록 A 및 미국 특허 출원 제13/626,760호에서 제공된다.
본 발명은 일반적으로 단일 분자 수준에서 검출하기에 충분히 민감한 전자 소자를 제공한다. 본 발명의 양상은 단일 민감화 분자가 부착된 전기적으로 전도성인 채널을 이용하여 달성된다. 따라서, 본 발명의 소자는 단일 분자 반응의 역학을 모니터링하며, 중요한 단일 분자 생화학적 분석, 예컨대 단일 분자 시퀀싱 반응의 검출기에서 사용될 수 있다.
전계 효과 트랜지스터에서 일반적으로 발견되는 임의의 유형의 전도 채널은 본 발명에 의해 사용될 수 있다. 예시적인 전도 채널은 또한 금속, 금속 산화물, 반도체, 또는 나노미터 규모 도체, 예컨대 나노와이어, 그래핀 또는 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)로부터 형성된다. 실시형태에서, 전도 채널은 단일 SWNT이다.
물질의 분류로서, SWNT는 1 전자볼트로부터 효과적으로 0까지 다를 수 있는 전자적 밴드 갭을 지니는 반도체이다. 이 변형은 금속 또는 반금속 및 반도체성의 다른 것으로서 탄소 SWNT의 분류를 야기한다. 연결 전극의 도움으로, 정전식 게이트, 및 기타 제어 회로, 반도성 SWNT는 센서 FET로서, RF 증폭기로서 또는 저온 단일 전자 트랜지스터로서 구성될 수 있다. 상기 소자 및 방법은 이러한 첨가를 불가능하게 하지 않는데, 실시형태에서 상기 소자는 2개 말단, SWNT 도체로만 구성되기 때문이다. SWNT는 게이트 전극에 의해 또는 게이트 전극 없이, 유리, 플라스틱 또는 실리콘 기판 상에서 단일 분자 센싱 소자가 임의의 유형의 SWNT 와이어로부터 제작될 수 있는 전도 채널이다. 본 명세서에 기재된 단일 분자 센싱 소자는 FET 또는 다수의 더 복잡한 전자 또는 광전자적 소자 및 회로 내의 하나의 부품일 수 있다.
본 개시내용의 일 양상은 각각의 소자에서 하나의 활성 증감 분자만의 믿을 수 있는 달성이다. 일반적으로, 증감 분자는 제조에서 사용되는 농도 및 인큐베이션 기간에 의해 결정되는 평균 간격으로 SWNT를 코팅할 것이다. 일단 평균 간격은 특정 조건 세트에 대해 경험적으로 결정하였지만, SWNT 도체는 동일한 길이를 갖는 리소그래피에 의해 정해질 수 있다. 실행에서, 이 길이는 전형적으로, 증감 분자가 SWNT 도체에 직접 부착될 때, 광학 리소그래피를 이용하여 제어하는 것이 어려운 범위인 1 내지 100㎚이다.
실시형태에서, 링커 분자는 증감 분자의 평균 분리 이상으로 제어를 개선시키는 부착 중재자로서 작용한다. 당업계에 공지된 임의의 방법은 도체에 단일 증감 분자를 부착시키기 위해 사용될 수 있다. 실시형태에서, 링커 분자는 단일 증감 분자를 부착하기 위해 사용된다. 실시형태에서, 링커 분자는 적어도 제1 작용기 및 제2 작용기를 포함한다. 일반적으로, 제1 작용기는 전도 채널(예를 들어, 단일벽 탄소나노튜브)과 상호작용하고, 제2 작용기는 증감 분자와 상호작용한다. 예시적인 제1 작용기는 파이렌, 벤젠, 사이클로헥산 및 2,3-다이클로로-5,6-다이사이아노-1,4-벤조퀴논을 포함한다. 예시적인 제2 작용기는 말레이미드이다. 전도 채널이 SWNT인 특정 실시형태에서, 링커 분자는 파이-파이 염기쌓임을 통해 SWNT의 측벽과 상호작용한다.
링커를 이용하여, 증감 분자 사이의 길이는 1 마이크로미터 이상으로 극적으로 증가될 수 있다. 증감 분자가 1마이크로미터 떨어지면, 도체의, 각각 대략 1 마이크로미터 길이로 전체 도체의 웨이퍼를 정하는 표준 리소그래피 마스킹 기법을 사용할 수 있게 된다. 대안적으로, 마스크 설계에 의한 세트로서 목적으로 하는 소자 피치(pitch)가 주어지면, 증감 분자의 농도 및 인큐메이션의 지속기간은 소자 당 한 개의 분자와 동일한 결과를 달성하도록 변할 수 있다. 단일 분자 센싱 소자는 SWNT 도체의 sp2 특징을 파괴하는 일 없이 모두 10회의 제작 시도 중 적어도 8회에서 생산될 수 있다.
당업계에 공지된 임의의 증감 분자는 본 발명의 소자와 함께 사용될 수 있고, 선택된 증감 분자는 검출될 분자 또는 모니터링될 반응에 의존할 것이다. 예시적인 증감 분자는 효소, 단백질, 핵산, 리보자임, 앱타머 및 다당류를 포함한다. 특정 실시형태에서, 효소는 라이소자임, 단백질 키나제 A, 또는 DNA 중합효소 I이다.
다른 양상에서, 하나 초과의 증감 분자는 단일 분자 역학 센싱을 달성하기 위해 각각의 소자에서 필수적일 수 있다. 예를 들어, 목적으로 하는 작동 온도 또는 pH에서, 특정 유형의 증감 분자는 화학적으로 활성이 되는 25% 확률만을 가질 수 있다. 이들 조건 하에서, 활성일 가능성이 있는 소자를 생산하기 위해 각각의 도체에 추가적인 증감 분자(예를 들어, 4개)를 부착하는 것이 적절하다. 이런 더 큰 부착 밀도는 분자 사이의 적절한 다중 평균 분리 거리로 소자 길이를 증가시킴으로써, 또는 그 밖에 부착 조건을 변형하는 것에 의해 동일한 분리를 감소시킴으로써, 상기 기재한 계획을 이용하여 용이하게 달성된다.
실시형태에서, 단일 분자 센싱 소자는 동시에 다중 도체(예를 들어, SWNT 도체)를 포함한다. 단일 활성 증감 분자는 도체 중 하나에 부착되고, 비변형 도체의 병렬이지만 정적 전도도로부터 분리 가능한 동적 전자 신호에 기여한다. 본 실시형태는 도체 합성 또는 배치의 설계에서, 그리고 매우 낮은 부착 확률을 갖는 증감 분자를 이용하는 단일 분자 센싱 소자의 성공적인 제작에서 추가적인 유연성을 제공한다.
실시형태에서, 소자 당 하나의 증감 분자가 부착된 다중 단일 분자 센싱 소자는 동일한 유형의 증감 분자를 이용하여 동시에 제작된다. 다른 실시형태에서, 다수 도체가 제조되며, 이어서, 상이한 표적을 향해 증감화되는 단일 분자 센싱 소자를 달성하기 위해, 상이한 증감 분자에 노출된다. 다른 실시형태에서, 단일 분자 센싱 소자는 다양한 특이성을 지니는 증감 분자를 통해 다수의 표적에 반응한다.
실시형태에서, 단일 분자 센싱 소자는 제1 전극, 및 제2 전극을 포함한다. 단일벽 탄소 나노튜브는 제1 전극 및 제2 전극에 각각 연결된다. 소자는 제1 작용기 및 제2 작용기를 갖는 적어도 하나의 링커 분자를 포함하며, 적어도 하나의 링커 분자는 단일벽 탄소 나노튜브의 측벽에 의해 비공유적으로 기능화된 제1 작용기를 가진다. 단일 증감 분자는 적어도 하나의 작용기를 가지며, 단일 증감 분자 중 상기 적어도 하나의 작용기는 적어도 하나의 링커의 제2 작용기에 의해 기능화된다.
실시형태에서, 단일 분자 센싱 소자의 제조 방법은 제1 전극 및 제2 전극에 연결된 기판 상에서 적어도 하나의 단일벽 탄소 나노튜브를 형성하는 단계; 복수의 작용기를 함유하는 적어도 하나의 링커 분자의 적어도 하나의 작용기를 이용하여 소자의 단일벽 탄소 나노튜브 측벽을 비공유적으로 기능화하는 단계; 및 단일 증감 분자의 하나 이상의 작용기를 이용하여 적어도 하나의 링커 분자의 작용기 중 적어도 하나를 기능화하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)를 갖는 단일 분자 센싱 소자를 이용하는 방법이 개시된다. SWNT는 기판 상에 배치되며, 제1 전극 및 제2 전극에 연결되고, 센싱 소자는 SWNT에 의해 비공유적으로 기능화된 링커 분자를 이용하여 SWNT에 고정되는 단일 증감 분자를 가진다. 전압은 SWNT를 가로질러 적용된다. 증감 분자는 화학적 환경에 노출된다. SWNT를 통한 전류 흐름의 변동이 모니터링된다.
실시형태에서, 단일 분자 센싱 소자를 이용하여 핵산을 시퀀싱하는 방법이 개시된다. 센싱 소자는 전도성 채널을 포함한다. 전도성 채널은 제1 전극 및 제2 전극에 연결된 기판 상에서 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)를 포함할 수 있다. 센싱 소자는 채널을 이용하여 비공유적으로 기능화된 링커 분자(예를 들어, SWNT)를 이용하여 채널에 고정된 단일 증감 효소를 가진다. 상기 방법은 적어도 하나의 유형의 뉴클레오타이드에 소자를 노출시키는 단계; 채널에 걸쳐 전압 퍼텐셜을 적용하는 단계; SWNT를 통해 전류의 변동을 모니터링하는 단계; 및 전류의 모니터링된 변동에 적어도 부분적으로 기반하여 효소에 의해 핵산 주형에 혼입된 뉴클레오타이드를 동정하는 단계를 포함한다. 효소는 중합효소 또는 역전사효소일 수 있다. 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다. 특정 실시형태에서, 소자는 매번 뉴클레오타이드의 하나 초과의 유형에 노출된다.
센싱 소자는 단백질 또는 효소의 가공 속도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 센싱 소자의 또 다른 용도는 유전자 돌연변이의 효과를 결정하는 것이다. 유전자 돌연변이를 지니는 증감 분자 또는 표적을 이용하는 소자는 돌연변이를 갖지 않는 증감 분자 또는 표적과 유사한 소자로부터 얻은 성능과 비교될 수 있다. 또 다른 용도에서, 센싱 소자는 단백질 상의 약물 또는 다른 소분자가 활성 또는 비활성으로 되기 위한 단백질 상의 약물 또는 다른 소분자의 효과를 측정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 소자를 제작하는 방법은 생화학적 컨쥬게이션 프로토콜 다음에 제어된 린싱을 수반할 수 있다. 이러한 공정은 하나의 증감 분자를 갖고, 간섭 분자의 비특이적 결합이 없는 본 발명의 소자를 야기한다. 특정 실시형태에서, 증감 분자는 비공유 상호작용을 통해 도체에 직접 부착된다. 다른 실시형태에서, 증감 분자는 적어도 2개의 작용기, 즉, 비공유 부착을 위해 설계된 것 및 증감분자에 대한 다용도 바이오컨쥬게이션을 위한 다른 것을 갖는 중간체 링커 분자에 부착된다. 중간체 링커를 이용하는 한 가지 계획은 다양한 부류의 증감 분자로부터 본 발명의 구성 소자에 대해 화학적으로 다용도의 플랫폼을 제공한다.
실시형태에서, 단일 분자 센싱 소자의 제조 방법은 제1 전극 및 제2 전극에 연결된 기판 상에서 적어도 하나의 단일벽 탄소 나노튜브를 형성하는 단계; 복수의 작용기를 함유하는 적어도 하나의 링커 분자의 적어도 하나의 작용기를 이용하여 소자의 단일벽 탄소 나노튜브 측벽을 비공유적으로 기능화하는 단계; 및 단일 증감 분자의 하나 이상의 작용기를 이용하여 적어도 하나의 링커 분자의 작용기 중 적어도 하나를 기능화하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 단일 분자 센싱 소자는 전기 회로를 "게이팅"하는 작용을 하는 부착된 생체 분자를 이용하여 트랜지스터, 즉, 전계 효과 트랜지스터(FET)의 형태를 취할 수 있다. 본 실시형태에서, 단일 증감 분자는 소자에 대한 단일 분자 게이트를 제공한다. 트랜지스터 실시형태는 2 또는 3개의 트랜지스터를 포함할 수 있다. 전도 채널은 또한 금속, 금속 산화물, 반도체, 또는 나노미터 규모 도체, 예컨대 나노와이어, 그래핀 또는 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)로부터 형성될 수 있다. 일 실시형태에서, 전도 채널은 단일 SWNT이다.
일반적으로, SWNT의 길이는 약 0.1 내지 약 10 마이크로미터로 다를 수 있다. SWNT의 특정 길이는, 제조된 통계적으로 대다수의 소자(10)가 SWNT와 회합된 단일 증감 분자만을 갖도록 선택된다. 훨씬 더 바람직하게는, 외부 화학적 환경에 노출된 SWNT의 길이는 제조된 75% 초과의 소자가 SWNT와 회합된 단일 증감 분자만을 포함하도록 선택된다. 일부 예에서, 이 길이는 제1 전극과 제2 전극 사이의 길이이다.
제1 전극 및 제2 전극은 선택적으로 커버로 뒤덮일 수 있다. 커버는 외부 환경으로부터 SWNT까지 접근을 제공하는 창, 오목부, 슬롯 또는 다른 개방 세그먼트를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, SWNT는 화학적 환경에 노출될 수 있다. 예를 들어, 노출된 창은 제조 공정 동안 커버에서 정해질 수 있다. 피복은 제1 전극 및 제2 전극을 포함하는 대다수의 표면이 환경으로부터 보호된다는 것을 보장한다. 게다가, 바람직한 실시형태에서, 창의 길이는 정확한 소자 길이를 달성하기 위해 맞춤된다. 창의 길이는 SWNT에 대해 목적으로 하는 활성 영역을 달성하기 위해 변할 수 있다. 예를 들어, 제1 전극 및 제2 전극은 SWNT에 연결되고, 2㎛ 거리만큼 분리될 수 있다. 그러나, 창은 전극간 거리보다 더 작게 제조될 수 있다. 피복 내에서 노출된 창은 SWNT 및 부착된 증감 분자를 화학적 환경에 노출시킨다. 피복은 하나 이상의 층으로 구성된 임의의 전기적 절연성 필름일 수 있다. 필름 물질은 중합체, 산화알루미늄, 산화하프늄, 이산화규소 또는 질화규소를 포함한다. 창은 리소그래피 기법을 이용하여 피복 내에서 정해진다. 리소그래피 기법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 광학적 노출, 전자빔 방법 및 양성 또는 음성 레지스트의 임의의 허용 가능한 조합을 이용하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 소자 제작은 양성 전자빔 레지스트, 예컨대 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA)의 피복에서 코팅 소자; 전자빔을 이용하는 리소그래피 패턴의 쓰기; 이어서, 길이로 0.5 내지 1.0㎛의 활성 SWNT 채널을 노출시키기 위한 쓰기 면적의 현상(developing)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 소자 제작은 산화알루미늄의 피복에서의 소자 코팅; 추가로 광학적 감광액의 필름에서의 소자 코팅; 목적으로 하는 창의 광에 대한 노출; 산화알루미늄의 좁은 창에 노출시키기 위한 쓰기 영역의 현상; 길이로 0.5 내지 1.0㎛의 기저 SWNT 채널을 추가로 노출시키기 위한 산화알루미늄의 에칭을 포함한다. 피복에서 물질의 2 이상의 층의 조합은 상이한 화학적 특성을 갖는 코팅을 제공한다.
소자는 전자 회로에 결합된다. 전자 회로는 제1 전극과 제2 전극 사이에 전압 바이어스(예를 들어, 50 내지 100mV)를 적용하기 위해 사용되며, 또한 시간의 함수로서 SWNT를 가로지르는 전류 흐름을 측정하도록 구성된다. 전자 회로는 소자를 통한 전압 및 전류의 적용을 제어하기 위해서뿐만 아니라 소자에 의해 생성되는 데이터를 획득, 저장 및 분석하기 위해 사용되는 하나 이상의 처리기를 갖는 컴퓨터(24)에 결합될 수 있다. 소자의 작동 동안, 전압(예를 들어, 일정한 DC 전압 또는 AC 및 DC 전압의 조합)은 제1 전극과 제2 전극 사이에 적용된다. 이어서, SWNT를 통과한 전류는 전자 회로를 이용하여 측정되는데, 이는 하나 이상의 증폭기와 함께 유속계를 포함할 수 있다.
제1 전극, 제2 전극 및 SWNT는 기판 맨 위에 배치될 수 있다. 기판은 다수의 기판 물질, 예컨대 유리, 플라스틱 또는 실리콘을 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 대안적 실시형태는 광학적으로 투명한 기판, 예컨대 유리 또는 석영 상에서의 소자의 제작을 수반한다. 센서 FET 및 센싱과 관련된 대부분의 선행 기술과 달리, 소자는 게이트 전극 또는 전도성 지지 기판이 필요하지 않다. 결과적으로, 소자는 투명한 것을 포함하는 다양한 표면 상에서 제작될 수 있다. 석영은 상기 기재한 CVD 제작에 바람직한데, 이는 고온과 양립 가능하다. SWNT가 합성되고 다른 수단, 예컨대 용액으로부터의 스핀 코팅에 의해 기판 상이 증착된다면, 또는 소자가 웨이퍼 상에서 제작되고, 이어서 지지체에 대한 유리에 전달된다면, 유리 웨이퍼가 또한 사용될 수 있다. 임의의 경우에, 석영, 유리, 사파이어 또는 다른 투명한 기판의 사용은 소자의 광학적 모니터링을 가능하게 한다. 테터링된 분자로부터의 형광 신호를 모니터링하는 것은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 투명한 기판을 통해 가장 잘 달성된다. 석영 기판 상에서 형성된 소자(10)는 본 명세서에 기재된 전기 기법을 이용하여 그리고 단일 분자 형광 및 smFRET를 포함하는 광학적 기법에 의해 분자 역학의 독립적 모니터링을 허용한다.
실시형태에서, 동일한 분자로부터의 전기적 및 광학적 신호는 상이한 시간에 또는 동시에 획득된다. 투명한 기판(예를 들어, 석영) 상에 위치된 단일 분자 센싱 소자는 독립적인 단일 분자 기법을 이용하여 smFRET를 보완하기 위해 선행 기술에서 발견되지 않은 독특한 기회를 제공한다. 본 실시형태에서, SWNT는 발광원(illumination source)을 이용하여 투명 기판을 통해 발광된다. 방출되는 형광은 투명 기판과 접촉하기 위해 오일 또는 물을 이용하는 대물렌즈를 이용하여 수집될 수 있다. 형광은, 예를 들어, 빔 분리기를 이용하여 광자수 측정기로 보내질 수 있다.
이러한 듀얼 모드 모니터링은 하나의 접근에 의해 이루어진 측정, 총체 수준에서 이루어진 형광의 전환 측정에 의한 전자 모니터링을 교정할 수 있다. 두 독립적 수단에 의한 한 개 분자의 동시적 의문은 동일한 분자의 두 상이한 부분을 연구하기 위한 기회, 예를 들어 이동하는 부분, 전하 전달을 받아들이는 부분, 촉매적 부위를 포함하는 부분, 또는 광자를 흡수 또는 방출하는 부분을 비교하기 위한 기회를 제공한다. 두 가지 이러한 부분의 동시 모니터링은 상대적 시간 및 두 사건의 인과관계, 예컨대 조절 부위의 입체구조적 변화와 관련된 활성 부위의 움직임을 결정할 수 있다. 더 나아가, 투명 기판은 촉매적 부위 기능성의 광 유도 활성화 또는 얻어진 입체구조적 변화의 시험을 위한 광 유도 변화-전달을 허용한다. 일 실시형태에서, 유체가 측정을 위해 SWNT를 넘어서 흐를 수 있도록 SWNT는 유세포 등 내에 통합될 수 있다. 대안적으로, 유체는 소자의 상부에 선택적으로 증착될 수 있다.
소자는 SWNT의 외부 측벽에 비공유 부착된 하나 이상의 작용기를 포함하는 하나의 링커 분자를 포함할 수 있다. 작용기는 파이렌, 벤젠, 사이클로헥산, 및 2,3-다이클로로-5,6-다이사이아노-1,4-벤조퀴논을 포함할 수 있다. SWNT의 외부 측벽에 비공유 부착되는 작용기는 당업계에 잘 공지되어 있고, 이 작용기에 대한 특이적 설계는 본 발명에서 사용하기에 적합한 임의의 설계를 포함할 수 있다. 더 나아가, 링커 분자(들)는 증감 분자의 일부 또는 모든 작용기를 유지하기 위한 방법으로 증감 분자에 부착되거나 또는 부착된 다른 작용기에 의해 기능화된 하나 이상의 작용기를 포함한다. 작용기의 쌍은 아자이드 및 알카인, NHS 에스터 및 아민, 티올 및 알카인 및 티올 및 말레이미드를 포함할 수 있다. 다른 작용기에 의해 기능화되는 작용기는 당업계에 잘 공지되어 있고, 이 작용기에 대한 특이적 설계는 본 발명에서 사용하기에 적합한 임의의 설계를 포함할 수 있다.
소자는 증감 분자의 작용기를 유지하기 위한 방법으로 링커 분자 중 하나의 하나 이상의 작용기에 의해 기능화된 하나 이상의 작용기를 포함하는 단일 증감 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 증감 분자는 임의의 분자를 포함한다. 바람직한 증감 분자는 다른 분자와의 상호작용에서 화학적으로 특이적인 분자를 포함한다. 더 바람직하게는, 증감 분자는 중합체, 단백질, DNA, RNA, 라이보자임 및/또는 앱타머, 다당류 또는 다른 생체분자를 포함할 수 있다. 증감 분자(30)는 당업계에 잘 공지되어 있고, 본 발명에서 사용하기에 적합한 임의의 증감 분자를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 링커 분자는 SWNT의 벽에 비공유 접착되는 제1 작용기 및 증감 분자에 부착되도록 설계된 제2 작용기를 포함할 수 있다. 링커 분자의 사용은 증감 분자와 SWNT 사이의 효과적인, 직접적 부착을 설계하는 것의 어려움을 회피한다. 본 실시형태에서, 링커 분자 및 증감 분자는 효과적으로 단일 독립체이다. 실행에서, 목적으로 하는 표면 밀도를 달성 및 제어하는 것은 종종 링커 분자(들) 및 증감 분자가 2개의 별개의 용액으로서 제조되는 것을 필요로 하며, 그들 사이의 최종 결합은 SWNT 상에서 수행된다. 증감 분자는 표적 선택적 작용기를 포함할 수 있는 제1 작용기 및 제2 작용기를 포함할 수 있다. 증감 분자의 제1 작용기는 링커 분자의 제2 작용기에 결합한다. 결합은 당업계에 공지된 임의의 화학적 상호작용, 예를 들어 공유 또는 비공유 결합일 수 있다. 실시형태에서, 결합은 공유 결합을 통한다. 제2 작용기는 임의의 결합 상호작용에 의해 표적 분자 또는 다중 표적 분자에 결합하도록 설계된다. 증감 분자는 또한 SWNT 부착 부위 근처에 이상적으로 위치된 전도성 조절 성분을 포함한다. 전도성-조절 성분은 제2 작용기에 근접할 필요는 없지만, 둘은 기계적, 다른 자리 입체성 또는 전자적 수단을 통해 통신하여야 하고, 따라서 화학적 표적과 증감 분자의 상호작용은 SWNT에서 전자적 변화에 영향을 미치는 동일한 증감 분자의 전도성-조절 성분의 역학적 변화를 유도한다.
실시형태에서, 파이렌 작용기는 파이-파이 염기쌓임을 통해 SWNT 표면에 비공유 부착될 수 있다. 단일 증감 분자는 SWNT와 회합될 수 있다. 완료된 소자의 전형적인 전기적 특징은 반도체 SWNT의 측벽과 직접적 접촉 시 수성 전해질에 의해 측정될 수 있다.
실시형태에서, 모두 3가지 성분이 단일 증감 분자에서 조합된다. 예를 들어, 단백질의 하나의 아미노산은 SWNT에 대한 결합을 위한 효과적인 부위일 수 있고, 다른 아미노산은 SWNT 전도도를 조절할 수 있는 순 표면 전하일 수 있으며, 제3 아미노산은 단백질의 결합 상대인 검출될 표적 분자에 대한 인식 또는 결합 부위로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 공유적 또는 비공유적 복합체는 단일 증감제와 함께 모드 3가지 성분을 가져오도록 설계되고 합성될 수 있다.
실시형태에서, 증감 분자의 상이한 기능성 성분은 2 이상의 분자 중에서 분할되는데, 이들 모두 SWNT 도체 상에 공유적으로 또는 비공유적으로 조립된다. 이 대안의 실시형태에서, 전도성-조절 성분은 링커 분자의 하나의 작용기에 부착되는 분자일 수 있고, 표적-선택적 화학적 성분은 동일한 링커의 상이한 작용기에 부착되는 제2 분자일 수 있다. 대안적으로, 표적-선택적 화학 성분은 전도성-조절 성분을 함유하는 분자에 직접 결합하는 작용기를 가질 수 있다. 이 결합은 다수의 생체분자에 대해 통상적인 공유 결합을 또는 비공유 인식 또는 도킹을 통할 수 있다. 모든 경우에, 기계적, 입체적 또는 전기적 통신의 일부 형태가 성분들 간에 달성될 것이고, 따라서 표적-특이적 성분의 역학은 전체 증감 복합체의 전도도-조절 성분에 대한 변화를 초래한다.
실시형태에서, 단일 분자 센싱 소자는 하나 이상의 SWNT를 갖는 도체; 2 이상의 작용기를 포함하는 하나 이상의 링커 분자(이 중 하나 이상은 SWNT의 표면에 비공유 결합됨); 및 링커 분자의 적어도 하나의 작용기에 대해 기능화된 적어도 하나의 작용기를 포함하는 단일 증감 분자를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 단일 분자 센싱 소자는 카복실레이트기를 함유하는 링커 분자 및 아민을 포함하는 증감 분자를 포함한다. 링커 분자의 카복실레이트 작용기는 반응성 에스터로서 활성화될 수 있고, 당업계에 잘 공지된 기법을 이용하여 아마이드화될 수 있다. 이어서, 반응성 에스터는 증감 분자의 아민기에 공유 결합되어 당업게에 잘 공지된 방법으로 안정한 아마이드 결합을 형성할 수 있다.
실시형태에서, 단일 분자 센싱 소자는 파이렌 말레이미드인 링커 분자 및 반응성 티올기를 포함하는 증감 분자를 포함한다. 링커 분자의 말레이미드 작용기는 증감 분자의 티올기와 공유 결합되어 당업계에 잘 공지된 방법으로 안정한 티오에스터 결합을 형성한다.
실시형태에서, 비공유적 단일 분자 센싱 소자는 파이렌 말레이미드인 링커 분자를 포함하며, 증감 분자는 단백질이다. 추가적인 실시형태는 단백질이 효소인 것을 포함한다. 실시형태에서, 효소는 DNA 중합효소 또는 역전사효소이다. 각각의 이들 효소를 이용하는 단일 분자 센싱 소자의 유사한 수율은 용액 pH, 침지 지속기간 및 효소의 부착 동안 사용되는 린스 조건을 맞춤으로써 달성되었다.
실시형태에서, 증감 분자는 핵산(예를 들어, DNA, RNA), 라이보자임, 앱타머, 다당류 또는 다른 생체분자이다. 기질 또는 리간드에 대한 결합 또는 작용 시 입체구조적 역학에서 변경을 겪은 임의의 증감 분자는 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 실시형태에서, 링커 분자는 SWNT의 표면에 대해 비공유적으로 기능화하도록 당업계에 공지된 적어도 하나의 작용기 및 다른 작용기와 결합을 형성하는 것으로 당업계에 공지된 작용기인 적어도 하나의 작용기를 포함하는 링커 분자를 포함한다.
실시형태는 DNA, cDNA 또는 RNA 분자의 비광학 시퀀싱을 허용하기 위해 SWNT에 비공유적으로 부착된 단일 증감 분자로서의 DNA 또는 RNA 중합효소 또는 역전사효소의 용도이다. dNTP의 주형-의존적 혼입을 촉매하는 효소는 본 명세서에 기재된 방법 및 소자에서 천연 또는 유사체 dNTP의 뉴클레오타이드 특이적 혼입을 모니터링하기 위해 사용될 수 있고, 따라서 주형 분자의 서열을 제공하는 잘 특성규명된 입체구조적 변화를 겪는 것으로 알려져 있다. 본 발명이 서열 결정의 목적을 위해 일련의 그리고 순환 방식으로 흐르는 개개의 dNTP 또는 유사체 dNTP 또는 NTP의 실행과 양립 가능하지만, 이 무표지 시퀀싱 방법은 4가지 천연 또는 유사체 dNTP 또는 NTP의 균질한 혼합물로부터 뉴클레오타이드 특이적 혼입 사건의 차별을 허용하는 한, 현재 실행되는 비광학적 시퀀싱 바아법 이상으로 이점을 가진다. 비공유적으로 결합된 증감 분자(30)로서 역전사효소의 사용은 중간체 cDNA 전환 단계에 대한 필요 없이 RNA 분자의 직접적 시퀀싱을 가능하게 한다.
정확한 뉴클레오타이드 혼입의 정확성은 DNA, RNA 또는 cDNA 시퀀싱에서 동등한 중요성을 갖기 때문에, 정확한 dNTP 또는 NTP의 특이적 혼입의 검출을 향상시키기 위한 대안의 방법은 정확한 뉴클레오타이드 혼입의 입체구조적 역학을 악화시키고, 따라서 정확한 시퀀싱을 보장하는 유사체 dNTP 또는 NTP를 사용하는 것이다. 정확한 뉴클레오타이드 혼입의 동역학적 또는 역학적 차별을 향상시키기 위해 사용될 수 있는 비표지 유사체 dNTP 또는 NTP는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 추가적인 인산염 변형과 함께 또는 없이, (즉, C-4 및 C-7 위치에서) 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오타이드의 데옥시리보스 또는 리보스 일부, 및 4- 또는 5-인산염의 사용을 포함하는 dNTP 또는 NTP의 알파, 베타 및 감마 인산염의 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
동일한 주형 분자를 다회 판독하는 것을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는 당업자에게 공지된 본 발명과 양립 가능한 서열 정확성 향상의 다른 방법이 사용될 수 있다. 다른 가능성은 동일한 주형 분자를 재차 판독하기 위해 가파이로인산분해(pyrophosphorolysis)가 사용되는 판독 2회 형식의 사용을 수반한다.
실시형태에서, 단일 분자 센싱 소자의 동역학 및 역학을 검출하기 위한 방법이 제공된다. SWNT의 전기 전도도에서 변화를 측정하기 위한 임의의 방법은 단일 분자 센싱 소자를 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 실시형태에서, 100mV의 바이어스 차이가 SWNT에 걸쳐 적용되며, 도체를 통해 흐르는 전류는 전기회로망을 사용하여 시간의 함수로서 측정된다. 증감 분자의 표적 특이적 성분에서 화학적 결합 또는 인식은 증감 분자의 전도성-조절 성분에 대한 변화를 초래하여, 측정된 전류의 증가 및 감소를 야기한다. 평균화 시 표적 특이적 성분의 화학적 역학을 포함하는 다양한 결합 및 비결합 사건은 당업계에 공지된 신호 처리 기법을 이용하여 시간측정, 계수화, 식별, 분석 또는 저장될 수 있는 다양한 전류 변동을 생성한다. 현재의 변동은 스퀘어-에지드(square-edged) 패턴의 단순한 증가 및 감소로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 변동은 삼각형, S자형인 형상을 포함하거나, 또는 임의의 다수의 푸리에(Fourier) 성분을 갖는 임의의 파형요소를 포함할 수 있다. 이들 파형요소의 진폭, 지속기간 및 형상은 모두 표적-특이적 성분의 활성을 암호화하고, 따라서 결합 속도 및 다른 기계적 및 전자적 자유도를 알아내기 위해 컴퓨터(24)를 이용하여 분석될 수 있다. 이 매개변수의 통계학적 분석은 표적 결합 및 비결합 공정의 속도 가변성, 전이 및 중간체 화학물질 상태에 대한 통찰을 제공한다. 현재 신호에서 자유도는 동일한 부위에, 예를 들어 표적 분자와 결합 부위의 저해제 분자 사이에 모두 결합하는 다수의 유사한 표적 분자를 구별한다. 이런 자유도는 또한 실제 결합 전에 일어나는 분자 인식과 같은 상호작용을 구별할 수 있다.
실시형태에서, 저해제 분자의 공유 또는 비공유 결합을 구별하고 모니터링하는 능력이 제공된다. 단백질 기능의 저해제는 항바이러스제, 항암제 및 항박테리아 치료제를 포함하는 약제학적 제제로서 상업적으로 중요하다. 효과적인 저해제의 시험은 시간 소모적이며 비싼 공정이다. 상기 소자는 단일 분자 분해능에 의한 단백질 기능을 직접적으로 모니터링하는 한편, 동시에 다수의 상이한 후보 저해제를 이용하여 단백질을 프로빙하는 것을 제공한다. 당업계에 잘 공지된 자동화된 유체 전달 시스템, 예컨대 유세포를 이용하여, 후보 저해제 용액은 목적으로 하는 동역학 특성을 지니는 저해제를 하나씩 동정하기 위해 소자에 전달될 수 있다. 대안적으로, 후보 저해제는 후보 분자의 전체 배취를 빠르게 분석하기 위해 화학적 구조 또는 기능 또는 임의의 다른 특징에 의해 있는 그대로 합성되거나 또는 목적을 가지고 범주화된 혼합물에 있을 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 방법이 단일 증감 분자의 역학 및 동역학을 검출할 수 있다 것을 알 수 있을 것이다. 증감 분자가 효소일 때, 동역학 및 역학은 효소적 전환 속도 또는 입체구조적 이동 속도를 포함한다. 본 발명의 기술적 이점은 단일 증감 분자의 역학 및 동역학이 검출되어, 다중 증감 분자가 SWNT 상에 존재할 때 생기는 총체 측정의 문제를 극복할 수 있다는 것이다. 더 나아가, 본 개시된 방법은 SWNT 상에서 결점 부위를 생성하고, 이어서, 기능화된 단일 증감 분자인 단일 분자 소자를 제작하는 선행 방법과 관련된 문제를 극복한다.
실시형태는 단일 분자 센싱 소자의 제조 방법을 포함한다. 상기 방법은 제1 전극 및 제2 전극에 각각 연결된 제1 말단 및 제2 말단이 연결된 기판(26) 상에 적어도 하나의 단일벽 탄소 나노튜브를 형성하는 단계를 포함한다. 상기 소자의 단일벽 탄소 나노튜브 측벽은, 이어서, 복수의 작용기를 포함하는 적어도 하나의 링커 분자의 적어도 하나의 작용기에 의해 비공유적으로 기능화된다. 단일 증감 분자는 적어도 하나의 링커 분자의 적어도 하나의 작용기(예를 들어, SWNT에 의해 비공유적으로 기능화되지 않은 작용기)에 의해 기능화된다.
실시형태에서, SWCNT-FET는 엑소뉴클레아제-결여 KF의 단일-시스테인 변이체(D355A/E357A/L790C/C907S)에 의해 제작되고 기능화된다. 95% 초과로의 KF 정제는 그의 동종성에 의해 보장된다(도 6). 형광 기반 분석은 부착 전 벌크 효소의 활성을 확인한다(도 7). SWCNT-FET에 대한 KF의 부착은 N-(1-피렌일)말레이미드 용액(에탄올 중의 1mM, 30분) 중에서 소자를 침지시킨 다음, KF와 함께 인큐베이션(20mM 트리스, 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 100μM TCEP의 표준 KF 활성 완충제에서 300nM KF, pH 8.0)에 의해 달성된다. 데이터 수집 후에 원자력 현미경은 각각의 소자에 대한 단일 KF 분자의 부착을 확인한다(도 1b). 이러한 소자는 단순히 KF 나노회로로서 언급된다.
실시형태에서, 상보적 dNTP 유사체와 혼합된 동종중합체 주형 폴리(dA)42, 폴리(dT)42, 폴리(dG)42 또는 폴리(dC)42는 중합효소, 예를 들어, DNA 중합효소의 입체구조적 변화를 검출하기 위해 사용된다. 실시형태에서, 각각의 주형은 M13 프라이밍 부위에 융합되고, 1:1 화학량론적 비로 M13 정방향 프라이머와 혼합되며; 혼성화를 위해, 혼합물은 95℃로 5 내지 10분 동안 열 순환기에서 가열된 다음, 65℃로 냉각되고, 이어서, 실온에 도달될 때까지 5분마다 5℃의 구배로 추가로 냉각된다. 실시형태에서, KF 나노회로는 100 nM 농도에서 어닐링된 주형-프라이머와 함께 활성 완충제 중에 침지된다. 천연 또는 유사체 dNTP는 과량으로 완충제에 첨가되어, KF 촉매에 대한 V max 조건을 보장한다. dNTP 유사체의 가능하게 감소된 친화도를 보완하기 위해, 실험은 천연 dNTP(예를 들어, 10μM)보다 더 고농도의 유사체(도 1c, 예를 들어, 100μM)를 적용한다.
실시형태에서, 측정은 SWCNT-FET를 통해 소스-드레인 전류, I(t),를 모니터링하는 것으로 이루어지는 한편, 부착된 KF 분자는 그의 주변 환경과 상호작용하였다. 실시형태에서, 드레인 전극은 100mV에서 바이어스되고, 게이트 전극으로서 작용하는 전해질은 0V에서 또는 근처에서 보유된다. 소자의 임의의 주형-프라이머 및 그의 상보적 dNTP와 함께 인큐베이션은 변동, ΔI(t)을 변환시키는 반면, 이들 변동은 비-상보적 dNTP이 없을 수 있고 또는 주형-프라이머 또는 KF 부착이 상실된 대조군 측정일 수 있다. 실시형태에서, I(t) 변동은 증폭되고, 100㎑에서 디지털화되며, 연속된 600s로서 저장된다. 측정 사이에, KF 나노회로는 활성 완충제로 2회 린스될 수 있고, 5분 동안 완충제 중에서 인큐베이션된 다음, 완충제로 2회 린스된 후에 다른 뉴클레오타이드 및 주형-프라이머가 도입될 수 있다. 각각의 KF 분자는 직접 비슷한 데이터 세트를 수집하고, 전형적인 KF 활성을 확인하며 ΔI (t) 과도출력을 생성하기 위해 다수의 유사체, 그들의 대응하는 천연 dNTP, 및 무 뉴클레오타이드 완충제를 이용하여 모니터링될 수 있다.
도 2A 및 2B는 dGTP의 존재 하에 폴리(dC)42 주형을 가공하는 KF 나노회로에 의해 생성된 대표적인 ΔI (t) 신호를 나타낸다. 실시형태에서, 소자는 3가지 상이한 배율로 나타낸 음성 ΔI (t) 과도출력의 연속 시퀀스를 생성한다. 각각의 ΔI (t) 과도출력은 하나의 염기쌍의 형성을 나타내며, ΔI (t) 데이터 세트로부터 유래된 역학 매개변수는 KF 움직임 및 총체 KF 혼입 속도의 알려진 단일-분자 분석과 일치된다. 실시형태에서, G
Figure pct00001
C 또는 C
Figure pct00002
G 염기쌍 형성은 서로 동일할 수 있으며; A
Figure pct00003
T/T
Figure pct00004
A 염기쌍 형성은 또한 서로 비교하여 매우 유사한 중합 동역학, 역학 및 ΔI(t) 값을 제공할 수 있다. 천연 dNTP에 의한 측정은 dNTP 유사체와의 비교를 위해 기준값을 제공할 수 있다.
실시형태에서, 상업적으로 입수 가능한 dNTP 유사체는 총체 분석과 단일 분자 분석 둘 다에서 KF 중합을 통해 DNA 내로 혼입된다(도 8A 내지 도 8B). 실시형태에서, 천연 dNTP와 유사하지만, 상이한 혼입 속도를 지니는 α-티오-dNTP, 또는 dNTPαS, 유사체 생성 ΔI (t) 데이터 세트에 의한 측정이 나타날 수 있다(도 2C). 실시형태에서, KF 나노회로로 측정할 때, 폴리(dC)42와 폴리(dT)42 주형과 반대인 6-클로로-2-아미노퓨린-drTP, 또는 6-Cl-2-APTP의 혼입은 상이한 KF 입체구조를 반영하는 반전된 진폭을 지니는 ΔI (t) 신호를 야기한다(도 2D). 이 유사체는 더 느리게 혼입되며; 예를 들어, 반대의 폴리(dC)42, 6-Cl-2APTP는 dGTP의 80%의 속도에서 ΔI(t) 과도출력을 생성하였다. 2-티오-dNTP 유사체에 의한 ΔI (t) 기록은 1분 동안 KF 활성이 음성 ΔI (t) 과도출력, 다른 1분 동안 양의 ΔI (t) 과도출력, 더 드물게는, 단일 주형 가닥을 따라서 거동 둘 다의 혼합을 생성한 혼합된 거동을 생성하였다(도 2E 내지 도 2F).
천연 dNTP에 대해, 실험 기준 전류에 대한 시간 상수인 τopen는 또한 τhi로서 지칭될 수 있다. 천연 dNTP 혼입 사건을 나타내는 시간 상수는 더 낮은 전류에 의해 생길 수 있고, τ1o으로 지칭된다. 양, 음 또는 양과 음의 ΔI (t) 과도출력 둘 다의 혼합이 본 명세서에 개시되며, 과도출력의 방향에 대한 시간 상수는 τclosed로 칭해진다. τopen 및 τclosed의 분포는 중합 데이터의 각각의 기록으로부터 유도된다.
도 3A 내지 도 3B는 dGTP 기질의 폴리(dC)42 주형으로의 혼입을 위한 예시적 분포를 나타낸다. 천연 및 유사체 dGTP τclosed 사건으로부터의 분포는 본 발명자들이 가장 불량한 통계학을 갖는 꼬리에서의 희귀 사건을 제외하고 거의 구별 가능하지 않았다(도 3A). 천연과 유사체 dNTP 사이의 비교를 도출하기 위해, 본 발명자들은 이들 분포의 1차, 푸아송 성분의 평균 시간 상수 <τ>에 중점을 두었다. <τclosed >에 대한 모든 평균값은 대략 0.3±0.1ms에 가까웠다. 비교에 의해, <τopen>의 분포 및 평균은 분명이 상이하였다. 예를 들어, KF는 α-티오-dGTP를 가공할 때 그의 개방 입체구조에서 63.6±2.8ms를 소모하는데, 이는 천연 dGTP에 대해 관찰된 40.8±0.6ms보다 56% 더 길다(도 3B).
동역학적 매개변수 <τclosed>, <τopen>, 및 평균 혼입 속도 k는 천연 및 유사체 dNTP를 이용하여 4가지 동종중합체 주형에 대해 분석되었다(표 1). 상기 기재한 경우에 의해, 모든 조합은 0.3±0.1ms의 범위에서 <τclosed> 값에 따라 동일한 τclosed 분포를 생성하였다. 4가지 천연 dNTP에 대해 유사한 효과가 이미 관찰되었지만,33 α-포스포다이에스터에서 상이한 핵염기 크기, 전자적 특성, 수소 결합 또는 치환을 갖는 dNTP에 대한 이 결과의 연장은 예상되지 않았다.
반면에, τopen은 dNTP 정체에 더 민감하다. <τopen>의 평균 지속기간은 천연 dCTP에 의한 23ms로부터 α-티오-dATP에 의한 145ms의 범위였다. 4가지 천연 dNTP 중에서, <τopen>은 dGTP 또는 dCTP 혼입에 대해서보다 dTTP 또는 dATP 혼입에 대해 더 길었다. 이 계층제는 모두 4가지의 α-티오-dNTP에 대해 측정한 더 긴 <τopen> 지속기간 내에서 보존되었다. α-티오 치환은 dGTP 및 dCTP의 경우에 50%만큼 <τopen>을 증가시킨 반면, 증가는 dTTP 및 dATP에 대해 100% 더 컸다.
dNTP 혼입을 위한 평균 KF 가공 속도는 k = (<τopen> + <τclosed>)-1. τopen으로서 계산하며, 대체로 k를 결정하였는데, 그것이 30s-1 초과에서 그의 가장 빠른 KF 혼입 2-티오-dCTP에서보다 적어도 60배 더 길기 때문이다. α-티오-dNTP에 대해 상기 기재한 τopen의 증가는 α-티오-dCTP 및 α-티오-dGTP에 대한 15 s- 1 및 α-티오-dATP 및 α-티오-dTTP에 대한 7 s-1로 k를 감소시켰다. 6-Cl-2APTP 혼입을 위한 속도를 가장 바람직하게는 천연 dGTP 혼입을 위해 관찰한 가장 느린 속도와 비교하였다. 대조적으로, 2-티오-dTTP 및 2-티오-dCTP 혼입은 그들의 천연 상대의 혼입보다 약간 더 빠르게 나타났다.
12개의 상이한 KF 분자를 이용하여 유사한 결과를 재현하였다. 각각의 KF를 상이한 SWCNT-FET에 부착하고 나서, 독립적으로 측정하였다. 비교를 위해, dNTP 유사체에 의해 측정한 비-동종중합체 주형은 유사한 동역학을 초래하였다(데이터 미제시). 앞서 언급한 바와 같이, 본 발명자들의 실험은 정상 상태 조건을 보장하기 위해 100μM의 dNTP 유사체를 적용하였고, 비교를 위해, 폴리(dT)42 주형을 지니는 10μM α-티오-dATP는 DNA 중합에 영향을 미치지 않았다. 정적 장애에 기인하여, 일부 KF 분자는 총체 평균보다 더 빠르거나 또는 더 느리게 가공되었지만, 천연 dNTP에 대한 유사체의 상대적 비교에 대해 임의의 상당한 변화는 없었다.
이 연구에서 수행한 단일-분자 실험을 도시하고, DNA 중합효소 유사 KF의 잘-인식된 가소성을 해명하였다. 이런 효소 분류는 심지어 극적으로 변형된 유입 dNTP를 수용할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 특정 변형 dNTP와 맞설 때 충실도를 유지하기 위해 효소에 의해 필요한 입체구조적 움직임을 직접 관찰한다. 이러한 조절에 대한 제한을 반영하여, DNA 중합효소는 dNTP 크기 및 형상의 약간의 변화에 대해 강한 민감성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들의 분석은 수많은 처리 혼입 사건 동안 단일 분자 데이터를 천연 및 유사체 dNTP와 비교하는 것이 유리하다. 이 분석은 τopen 및 τclosed에 의해 포획되는 촉매작용 동안 2가지의 관찰된 효소 입체구조의 동역학에 의해 시작한다.
τopen 동안 생긴 사건은 핵염기와 골격변형 둘 다에 대해 민감한 dNTP 인식의 속도 제한 단계를 포함한다. 적절한 뉴클레오타이드의 성공적인 인식 및 결합은 KF의 활성화 및 폐쇄를 촉발한다. 관련된 T7 DNA 중합효소에 의한 이전의 FRET-기반 실험은 미스매치 인식으로부터 초래된 "완전 개방" 입체구조 상태를 동정하였다. 그러나, L790C 부착 부위를 이용하여, SWCNT-FET는 미스매칭된 dNTP의 존재 하에서 KF 움직임 없음 및 신호 없음을 기록한다. 중간체 상태의 부재 또는 미스매치-관련 움직임은 본 발명자들의 부착 부위가 초기 충실도 검사점에 대해 민감하다는 것을 시사한다. 따라서, ΔI (t) 과도출력은 촉매적으로 얽힌 입체구조로부터 초래되며, 효소 개방 및 폐쇄의 전반적인 움직임을 단순화하도록 제한되지 않는다.
dNTP 유사체는 DNA 중합효소 및 크기, 구조 및 반응성의 변화에 의해 DNA 주형 내로 혼입될 그들의 능력을 위해 선택되었다. 본 발명자들은 α-인산염 또는 핵염기에서 치환을 시험하였다. 제1 유형의 유사체, 예를 들어, α-티오-dNTP는 새로운 입체중심을 도입하기 위해 비-브릿징, α-포스포릴 산소 원자를 황으로 치환하였고, 이 중대한 부위에서 반응성을 변경한다. 핵염기에 대한 제2 범주의 dNTP 유사체, 치환, 예를 들어, 할로겐 또는 황 치환은 염기쌍의 크기 및 전자 구조를 변화시키며; 일부 유사체는 또한 염기짝짓기를 위해 이용 가능한 수소결합을 변경시킨다. 예를 들어, 6-Cl-2-APTP(도 1c)은 2개의 수소 결합 프로파일을 가져서, T 염기와 C 염기 둘 다의 반대편에 그의 혼입을 허용한다. dATP에 비교하여, 6-Cl-2-APTP는 6-아미노기를 염소로 대체하지만, 2-아미노 작용기를 도입하고; 이 입체배치는 궁극적으로 dATP와 동일한 수의 T에 대해 상보성인 왓슨-크릭 수소 결합을 제공한다. dGTP 유사체로서 사용할 때, 6-Cl-2-APTP는 상이한 호변체화를 갖는데, 이는 수소 결합 공여체로부터의 N-l를 수용체(acceptor)로 바꾼다. 이 경우에, 산소의 염소로의 치환은 수소 결합을 극적으로 감소시킨다.41 6-Cl-2APTP와 같이, 황-치환 유사체 2-티오-dTTP 및 2-티오-dCTP는 또한 티오카본일의 증가된 결합 길이에 기인하여 더 큰 염기쌍을 형성한다.
실시형태에서, dNTP 또는 NTP 유사체는 삼인산염 모이어티에서 화학적 변형을 포함한다. 실시형태에서, 삼인산염 모이어티에서 화학적 변형은 α-위치에서 O의 S로의 치환이다. 실시형태에서, 임의의 dNTP 또는 NTP 유사체의 삼인산염 모이어티는 하기 화학식 (I)의 구조를 가진다,
Figure pct00005
(I), 식 중, X1은 S 또는 O이다. 실시형태에서, dNTP 유사체는 α-티오-dATP, α-티오-dGTP, α-티오-dCTP 또는 α-티오-dTTP이다. 실시형태에서, NTP 유사체는 α-티오-ATP, α-티오-GTP, α-티오-CTP 또는 α-티오-TTP이다. 실시형태에서, dNTP 또는 NTP 유사체는 화학식 (I)에서 제시한 바와 같은 삼인산염 모이어티의 α-위치에서의 치환, 및 본 명세서에 개시되고 당업게에 공지된 바와 같은 핵염기에서 하나 이상의 치환을 포함한다.
실시형태에서, dNTP 또는 NTP 유사체는 핵염기에서 치환된다. 실시형태에서, 퓨린은 하기 화학식 (IIa)로 나타내는 바와 같이 치환된다,
Figure pct00006
(IIa), 식 중, X1은 수소, 할로겐 또는 -NH2이고, X2는 수소 또는 -NH2이다. 실시형태에서, X1은 -NH2이고, X2는 수소이며, dATP 또는 ATP를 제공한다. 실시형태에서, X1은 -NH2가 아니고, X2는 -NH2이며, 6-치환된 2-APTP 또는 이의 치환된 유사체를 제공한다. 실시형태에서, 유사체는 6-Cl-2-APTP이며, 또한 6-Cl-dGTP로도 알려져 있다.
실시형태에서, dNTP 또는 NTP 유사체는 8-옥소구아닌, 2,6-다이아미노-4-옥소-5-폼아미도피리미딘, N6-메틸-아데노신, O6-메틸구아노신, N2-메틸-구아노신, 2,6-다이아미노퓨린, 인돌릴, 5-메틸인돌릴, 5-알킬-인돌릴(예를 들어, 5-에틸-인돌릴), 5-에틸렌-인돌릴, 5-나이트로-인돌릴, 4-나이트로-인돌릴, 5-페닐-인돌릴, 5-할로-인돌릴 (예를 들어, 5-F-인돌릴), 5-아미노-인돌릴 또는 6-나이트로-인돌릴인 핵염기를 포함한다.
실시형태에서, dNTP 또는 NTP는 화학식 (IIb)의 구조를 갖는 핵염기를 포함한다,
Figure pct00007
(IIb), 식 중, X3은 O 또는 S이다. 실시형태에서, X3은 O이고, 사이토신 핵염기를 제공한다. 실시형태에서, X3은 S이고, 2-티오 핵염기를 제공한다. 실시형태에서, 핵염기는 2-티오-dCTP 또는 2-티오-CTP이다.
실시형태에서, dNTP 또는 NTP는 화학식 (IIc)의 구조를 갖는 핵염기를 포함한다,
Figure pct00008
(IIc), 식 중, X4는 O 또는 S이다. 실시형태에서, X4는 O이고, 티미딘 핵염기를 제공한다. 실시형태에서, X4는 S이고, 2-티오 핵염기를 제공한다. 실시형태에서, 핵염기는 2-티오-dTTP 또는 2-티오-TTP이다.
실시형태에서, dNTP 또는 NTP는 화학식 (IId)의 구조를 갖는 핵염기를 포함한다,
Figure pct00009
(IId), 식 중, X5는 O 또는 S이다. 실시형태에서, X5는 O이고, 6-아자-티미딘 핵염기를 제공한다. 실시형태에서, X5는 S이고, 6-아자-2-티오 핵염기를 제공한다. 실시형태에서, 핵염기는 6-아자-2-티오-dTTP 또는 6-아자-2-티오-TTP이다.
실시형태에서, 유사체는 알파-티오 dATP, dTTP, dCTP, 및 dGTP, 2-티오 dATP, dTTP, dCTP, 및 dGTP, 2-아미노-6-Cl-퓨린-2'-데옥시리보사이드-삼인산염(6-Cl dGTP 또는 6-Cl-2APTP로 불림), 4-티오 dTTP, 2-아자 dTTP, 5-플루오로 dTTP, 또는 감마-ANS dTTP이다.
실시형태에서, τopen에서 관찰된 차이는 비천연 dNTP를 인식 및 결합하기 위한 메커니즘을 크게 반영한다. 천연 dGTP에 비해 α-티오-dGTP 및 6-Cl-2APTP에 대한 분포에서 긴 꼬리는 <τopen> 증가를 초래할 수 있다(도 3B). 꼬리는 천연 dGTP에 대한 <τopen> 보다 약 5배 더 긴 시간 상수 200ms로 제2 지수에 적합할 수 있다. 유사한 긴 꼬리가 본 명세서에 개시된 모든 dNTP 유사체에 의해 관찰되었는데, 이는 비천연 기질을 혼입할 때 효소에 의해 직면되는 도전을 설명한다. 인식 이외의 단계는 본 명세서에서 보고한 τopen 동안 잠재적으로 일어나며; 공유 결합 형성은 속도 제한으로서 검출 가능한 것으로 α-티오-dNTP의 느린 반응성에 의할 때 조차 너무 빠르게 일어나는 하나의 가능한 예이다. 2-티오 유사체에 의해 관찰되는 더 빠른 혼입 속도는 더 안정한 염기쌍 형성을 초래할 수 있는데, 이는 <τopen> 값을 효과적으로 단축시킨다. 수소 결합에서 2-티오-dCTP 황 원자의 더 큰 크기는 주형과 접하지 않으며, G 염기는 효율적으로 2-티오-dCTP가 염기쌍을 형성하는 능력에 영향을 미치지 않는다. 실시형태에서, 핵산 중합효소 입체구조를 검출하는 방법은 dTTP 혼입에 비해 2-티오-dTTP 및 4-티오-dTTP에 의해 효율적으로 중합의 증가를 검출한다.
dGTP에 비해 훨씬 더 약한 수소 결합 및 그 결과의 불완전한 염기쌍을 지니는 6-Cl-2APTP 유사체는 KF-촉매된 DNA 중합 동안 염기쌍 인식의 도전을 예시한다. 폴리(dC)42 주형 반대편의 6-Cl-2APTP 대 dGTP 혼입에 대한 더 긴 <τopen> 값은 인식을 위해 할당된 시간을 부분적으로 늘림으로써 비천연 dNTP를 수용하는 DNA 중합효소의 자발성을 설명한다. 폴리(dC) 반대편의 6-Cl-2APTP 중합 동안 관찰된 <τopen> 값 및 그에 따른 혼입 속도는 천연 dGTP에 대해 측정된 값과 상보적, 동종중합체 주형 반대편의 dATP 혼입에 대해 측정된 값 사이에서 하락한다. 따라서, 그의 변경된 호변체화 및 그 결과의 dGTP과 비교할 때 적어도 하나의 염기쌍 수소 결합의 상실에도 불구하고, 6-Cl-2APTP는 여전히 천연 dATP보다 더 빠르게 혼입될 수 있다. 실시형태에서, 핵산 중합효소 입체구조를 검출하는 방법은 6-Cl-2APTP가 dGTP 유사체를 고려할 때 소홈(minor groove)에서 염기쌍 수소 결합이 변화되지 않고 남아있다는 것을 검출하며, 폴리(dC) 주형 반대편의 dGTP, dCTP 및 6-Cl-2APTP에 대해 관찰된 상대적으로 더 빠른 속도를 지배할 수 있다.
실시형태에서, 예를 들어, 도 5A를 참조하며, KF가 모두 4가지의 천연 뉴클레오타이드(dNTP)의 존재 하에 균질한 기질을 가공할 때, 각각의 염기쌍 혼입은 음전류 스파이크 ΔI<0을 생성한다. 개개 스파이크는 도 5A에 나타낸 바와 같이 열거하지만, 일반적으로 그들은 염기의 하나의 유형을 서로 구별하지 않는다..
실시형태에서, 예를 들어, 도 5B를 참조하며, 2-티오-dTTP 유사체를 사용한다. 티올화된 데옥시티미딘에 의해, 양의 스파이크는 T 뉴클레오타이드가 도입된 위치(#2, 6, 7)를 나타낸다. 이 관찰은 KF를 RNA 중합효소에 의해 대체함으로써 RNA 시퀀싱으로 연장될 수 있다. 도 5B에 도시한 공정은 특정 DNA 기질에서의 모든 T 뉴클레오타이드 혼입을 동정한다. 상기 공정은 각각 4개의 상이한 티올화된 뉴클레오타이드를 이용하여 기질을 측정함으로써 모두 4개의 염기로 연장될 수 있다.
실시형태에서, 예를 들어, 도 5C를 참조하며, KF가 특정 유사체와 혼합된 천연 뉴클레오타이드(dNTP)의 존재 하에 이종성 기질을 가공할 때, 얻어진 패턴이 선택된 염기를 동정하는 데 사용될 수 있는 양전류 및 음전류를 포함한다는 것을 보여준다. 실시형태에서, G 혼입을 위한 유사체로서 6-Cl-2APTP와 혼합된 3가지 천연 뉴클레오타이드(dATP, dTTP, dCTP)를 사용한다. 본 실시형태에서 전류 스파이크는 15개의 염기 혼입 사건을 열거하도록 넘버링된다. 대부분의 사건(#1, 4, 7, 9, 10, 13, 14, 15)은 천연 뉴클레오타이드의 혼입을 동정하는 단일 음성 전류 스파이크로 이루어질 수 있다. 실시형태에서, 사건 중 다섯(예를 들어, #2, 3, 6, 8, 11; 도 5C에서 화살표로 강조)은 6-Cl-2APTP 뉴클레오타이드 혼입을 동정하는 양의 전류 스파이크이다. 실시형태에서, 6-Cl-2APTP가 천연 dGTP 뉴클레오타이드의 유사체로서 사용될 때, 사건(예를 들어, #2, 3, 6, 8, 11; 도 5C에서 화살표로 강조)은 DNA 서열에서 G 뉴클레오타이드를 동정한다.
실시형태에서, 도 5C에서 나타낸 사건 중 둘(#5, 12)은 가까운 간격의 전류 스파이크 쌍을 포함한다. 이들 쌍은 빠르게 연속으로 하나의 천연 및 하나의 6-Cl-2APTP 뉴클레오타이드의 혼입을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 스파이크의 쌍은 dATP의 위-유사체(pseudo-analog)로서 작용하는 6-Cl-dAPTP로부터 초래된 독특한 신호일 수 있었다.
실시형태에서, 중합효소에서 입체구조 변화를 검출하는 방법은 올리고뉴클레오타이드를 시퀀싱하기 위해 사용된다. 얻어진 정보(예를 들어, 도 5A 내지 도 5C)는 스파이크가, 중합효소가 그의 기질을 따라서 이동함에 따라 뉴클레오타이드 또는 유사체가 혼입된다는 것을 나타내기 때문에 올리고뉴클레오타이드의 서열을 알린다.
인식 및 결합에 추가로, α-티오-dNTP 혼입에 대해 연장된 <τopen> 값은 새로 합성된 DNA의 감소된 안정성으로부터 초래될 수 있었다. 동종중합체 주형의 KF-촉매된 가공은 왜곡된 dsDNA를 생성할 수 있다. 더 나아가, α-티오-dNTP는 특히 바람직하지 않은 DNA 골격 상호작용에 의해 덜 안정한 2원 복합체를 형성하는 경향이 있는데, 이는 KF의 촉매 속도를 점진적으로 늦춘다. 각각의 천연 dNTP를 이용하는 실험에 비해 이 단계에 대해 더 확연한 효과가 α-티오-dATP/α-티오-dTTP 대 α-티오-dGTP/α-티오-dCTP 혼입 동안 관찰되었다. 실시형태에서, 핵산 중합효소 입체구조를 검출하는 방법은 서열-의존적 DNA 불안정성을 나타내는데, 이는 동종중합체 주형을 사용할 때의 위험부담을 강조한다. 대안적으로, 이 차이는 추가로 <τopen>이 천연 A
Figure pct00010
T/T
Figure pct00011
A 염기쌍에 대해 더 길어지게 하는 메커니즘을 α-티오 치환이 방해한다는 것을 시사한다. α-티오-dNTP 혼입과 관련된 τopen의 일부 변화는 이 유사체의 상업적 합성에서 S p 입체이성질체와 대략 1:1의 비로 존재하는 약하게 저해성인 R p 입체이성질체(K i
Figure pct00012
30μM)로부터 초래될 수 있었다. 이 저해는 천연 dNTP에 대한 K m 보다 거의 10배 더 약하며,10 따라서, 단지 보통으로 <τopen> 값에 영향을 미치는 것으로 예상될 수 있다.
τclosed 동안, KF는 유입 뉴클레오타이드와 초기 dsDNA 사이의 하나의 포스포다이에스터 결합의 형성에 대응하는 별도의 입체구조적 변화를 겪는다. 기질-제한 실험에서, ΔI(t) 과도출력의 수는 돌출 주형 염기의 수와 매칭되고, 따라서 τclosed 동안의 입체구조적 변화는 각각 성공적이고, 전진적인 뉴클레오타이드 혼입이 일어나야 한다. 천연 dNTP에 대한 <τclosed> 더 조기의, 짧고 동일한 지속기간은 τclosed이 공유 결합 형성 단계 그 자체로부터 초래되는 모델을 뒷받침하였다.33 실시형태에서, 핵산 중합효소 입체구조를 검출하는 방법은 dNTP 유사체에 의한 3가지 관찰을 사용한다. 첫째로, ΔI (t) 과도출력의 방향은 일부 dNTP 유사체에 대해 반전된다. 둘째로, 2-티오-dNTP 유사체의 혼입은 양과 음의 ΔI (t) 과도출력 둘 다의 혼합물을 생성한다. 셋째로, 표 1에 나타내는 바와 같이, <τclosed >에서의 불변은 친전자성 α-인산염에서의 치환에도 불구하고 시험한 모든 유사체로 확장되거나 또는 대안의 입체구조가 핵염기에 대한 치환을 수용하는 것이 필요할 가능성이 있다.
본 전자적 기법에서, 근본적인 SWCNT-FET는 부착 부위 1㎚ 내에서 단백질의 하전된 표면 잔기에 의한 정전식 게이팅에 극도로 민감하다. 동일한 효소의 상이한 변이체는 SWCNT-인접 잔기의 하전 및 그들의 움직임 방향에 따라서 양 또는 음의 ΔI(t) 과도출력을 나타낼 수 있다. 실시형태에서, 핵산 중합효소 입체구조를 검출하는 방법 동안, SWCNT-FET를 정전식으로 게이팅하는 KF 및 그의 하전된 잔기는 불변으로 남아있을 수 있다. 가변적 ΔI (t) 과도출력은 KF 부착 부위에 인접한 잔기가 촉매적 적격 주기 동안 특정 dNTP 유사체에 반응하여 상이한 움직임을 채택한다는 것을 나타낼 수 있다. 이러한 움직임은 다른 자리 입체성을 통해 KF 활성 부위로부터 전달될 수 있지만, 그들은 공유 결합 형성의 움직임이 아닐 수 있다. 실시형태에서, 공유 단계는 동일한 메커니즘에 의해 그리고 동일한 <τclosed> 지속기간으로 진행하지 않을 수도 있지만, 2개의 반대 움직임에 의해서는 진행된다. 대신, τclosed를 초래하는 적절한 잔기 움직임은 초기 분자 인식과 KF 촉매의 화학적 단계 둘 다와 독립적일 수 있다.
실시형태에서, 핵산 중합효소 입체구조를 검출하는 방법에서, KF는 τclosed 동안 촉매적으로 사용되는 움직임에 적절한 하전 잔기의 정전식 게이팅 움직임을 연결하는, "핑거" 내 단백질의 L790C 측쇄를 통해 SWCNT-FET에 부착된다. 각각의 τclosed 사건은 활성 부위 O-나선 그 자체 또는 성공적인 뉴클레오타이드 혼입의 관찰 단계 동안 두 가능한 방향으로 비틀어지는 O-나선 잔기로부터 초래될 수 있다. 이런 제안된 비틀림은 공지된 단계의 뉴클레오타이드 혼입 동안 활성 부위 잔기 움직임 및 SWCNT-FET에 대한 하전 잔기의 이론적 근접성에 대한 그들의 효과를 고려함으로써 추론된다. 예를 들어, KF에 의한 smFRET 실험은 개방 상태와 폐쇄 상태 사이의 활성 부위 O-나선의 중간체 입체구조를 나타내며; 잠재적으로 유사한 "약간 열린" 입체구조가 KF 상동체 Bst Pol I의 결정구조에서 관찰된다. KF Y766 동등물의 큰 이동이 KF F762 동등물의 미묘한 회전에 의해 수행되도록 Bst Pol I O-나선의 C-말단은 폐쇄부에 대한 경로 상에 연결된다. KF F762 등가물의 회전은 효소 폐쇄까지 계속된다.
KF 및 Bst Pol I의 결정 구조를 비교함으로써, KF 활성 부위에서 Y766 및 F762에 의한 회전에 반응하여 이동할 수 있는 SWCNT-FET에 인접한 하전된 잔기가 동정된다. 실시형태에서, 핵산 중합효소 입체구조를 검출하는 방법에서, ΔI (t) 과도출력의 소스는 SWCNT-FET 근처에서 하전된 잔기를 계속해서 증식시키는 효소 폐쇄 및 염기 혼입 후 Y766 및/또는 F762의 추가적인 움직임이다. 인접한 염기쌍이 KF 삽입후 부위로 이동할 때 추가적인 KF 입체구조적 변화가 성공적인 뉴클레오타이드 혼입 후 smFRET에 의해 관찰되었으며, 가능하게는 τclosed에 의해 측정된 움직임이고- 방향족 활성 부위 잔기에 의해 부여되는 상당한 상호작용은 새로 형성된 염기쌍에 의한 π-π 염기쌓임을 포함할 수 있었다. 이러한 움직임은 염기쌍의 전자 입체배치를 평가하고, 친수성 상호작용을 필요로 하는 일 없이 결합 형성 단계의 충실도의 정보를 얻는데, 이는 dNTP 유사체의 치환에 의해 변경된다.
개시된 것을 포함하는 DNA 중합효소는 DNA 시퀀싱 적용을 포함하여, 그들의 특성을 맞춤하기 위한 돌연변이 유발을 매우 잘 받아들인다. 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 탄소 나노튜브에 대한 효소의 바이오컨쥬게이션을 위해 DNA 중합효소에 도입된 돌연변이를 수반한다. 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 비천연 염기의 더 효율적인 혼입을 위해 DNA 중합효소의 특성을 변경하고, 효소의 진행도를 변경한다. 실시형태에서, 이러한 돌연변이유발은 전기적 판독 및 효소의 특성을 개선시키는 데 사용된다. 예를 들어, 실시형태에서, 돌연변이는 효소 활성 부위에 대해 이루어진 돌연변이에 상보적인 형상 또는 작용기를 지니는 특정 dNTP 유사체를 수용하기 위해 효소 활성 부위 내로 도입된다. 실시형태에서, DNA 중합효소는 DNA 중합 동안 혼입된 각각의 염기로부터 초래된 전기 반응을 향상시키도록 돌연변이되며; 예를 들어, 탄소 나노튜브에 밀접한 효소의 하전 잔기의 치환은 효소 움직임 동안 합리적인 반응을 제공하였다.
KF 나노회로는 염기쌍의 G
Figure pct00013
C/C
Figure pct00014
G 세트보다 A
Figure pct00015
T/T
Figure pct00016
A 세트에 대해 더 큰 ΔI(t) 과도출력을 나타낸다. 구조적 결과는 A 및 T 주형 염기가 DNA 중합효소 활성 부위에서 가장 깊게 파묻히며, 따라서, O-나선의 회전고리가 최대화될 수 있다는 것을 시사하였다. KF E710 및 Y766 및 기타 상동성 활성 부위 글루탐산염 및 타이로산 잔기는 G
Figure pct00017
C/C
Figure pct00018
G 염기쌍 이상으로 A
Figure pct00019
T/T
Figure pct00020
A 염기쌍의 안정화를 위한 메커니즘에 연루되었다. 실시형태에서, 뉴클레오타이드 혼입 전에 KF E710과 KF Y766 사이의 수소 결합 상호작용은 활성 부위의 크기 및 형상에 영향을 미칠 수 있었고, dNTP 유사체 인식의 τclosed 단계에서 중요한 역할을 할 수 있다.
실시형태에서, 2-티오-dTTP 및 2-티오-dCTP의 혼입 동안 유사한 결과는 염기쌍 전자 구조의 KF의 바람직한 인식이 관찰된다는 것을 설명한다. 황 치환은 2-티오-dCTP 유사체에서 왓슨-크릭 수소 결합 수용체에만 영향을 미치지만, 2-티오-dNTP 유사체는 둘 다 혼입 동안 양 및 음의 ΔI (t) 과도출력의 혼합물을 초래하고, 따라서 둘 다 유사한 KF 움직임을 야기한다. 2-티오-dNTP 유사체의 황 치환은 6-Cl-2APTP 내로 도입된 더 극적인 전자 변이에 약간 비교되지만, 비배타적 방식에도 불구하고 효소는 유사하게 반응한다. 음과 양의 ΔI (t) 과도출력 둘 다의 관찰된 혼합물은 KF가 2-티오-치환된 dNTP의 혼입 동안 각각 천연과 대안의 움직임 둘 다에 접근한다는 것을 시사한다. 분명한 기억 효과는 수십초 동안 하나의 움직임 또는 다른 움직임으로 효소를 잠그는데, 이는 2-티오-dNTP의 특별한 경우에 에너지적으로 쌍안정성인 추가적인 입체구조적 변화를 보여준다.
실시형태에서, 핵산 중합효소 입체구조를 검출하는 방법은 양의 ΔI (t) 과도출력의 가능한 소스로서 비활성 엑소뉴클레아제( exo ) 도메인에 대한 초기 DNA의 왕복을 포함한다. 불완전 염기쌍에 기인하는 불안정 프라이머 말단의 용융 시, DNA는 비활성 exo 도메인까지 그리고 그로부터 왕복하며, KF는 별도의 입체구조적 변화를 겪는다. 그러나, 이러한 전이는 부착 부위로부터 원거리에서 일어나며, 본 명세서에서 관찰된 양의 ΔI (t) 과도출력은 <τclosed>의 지속기간을 변화시키지 않는다. 따라서, exo 도메인에 대한 왕복은 양의 ΔI (t) 과도출력의 관찰과 불일치되는 것으로 보인다. 미스매칭 dNTP 인식 동안 일어나는 것으로 알려진 입체구조적 단계와 유사하게, exo 도메인에 대한 왕복은 τopen 동안 일어나야 한다. 본 개시내용의 ΔI (t) 과도출력은 얽힌 촉매적 주기 동안 일어날 수 있으며, DNA 염기쌍으로부터 새로 형성된 전자적 완전성을 시험하는 회전 O-나선과 일치되는 적응할 수 있는 KF 움직임을 나타낼 수 있다.
실시형태에서, 핵산 중합효소 입체구조, dNTP 유사체를 검출하는 방법은 친전자성 인산염에서의 입체 화학, 유입 염기의 수소 결합 능력 및 및 충실도 확인을 위한 메커니즘을 포함하는 DNA 중합효소에 의한 뉴클레오타이드의 혼입 제한에 도전한다. 대부분의 dNTP 유사체는 평균 <τopen> 및 그의 동역학적 분포의 광범위함이 증가하기 때문에, 속도 결정 dNTP 인식 단계는 기질 구조에서의 약간의 변화에 대해서조차 고도로 민감한 것으로 나타난다. 그러나, 결합 형성의 반응 부위에서의 극적인 치환은 <τclosed>의 지속기간에 영향을 미치지 못한다. 반면에, ΔI (t) 과도출력의 방향은 염기 변형 dNTP 유사체에 의해 양 또는 양과 음의 신호 둘 다의 혼합으로 전환된다. 이들 dNTP 유사체는 천연 기질과 동일한 결합 형성 중심에서 작용기를 갖기 때문에, ΔI (t) 방향의 극적인 변화는 다음 기질을 처리하기 위한 개방 전에 KF에 의한 충실도 확인으로부터 초래될 수 있다. 이러한 사건은 천연 dNTP 혼입 사건과 용이하게 구별될 수 있고, 그의 역학적 오류 확인 방향을 반전시킴으로써 비천연 dNTP를 수용하는 효소의 직접적인 관찰을 제공한다.
실시예
실시예 1. 단일-분자 DNA 중합효소 I(클레노브 단편) 나노회로에 의한 데옥시뉴클레오사이드 삼인산염 유사체의 혼입.
도입 . 모든 알려진 수명 형태의 생존을 보장하기 위해, DNA 중합효소는 유입 데옥시뉴클레오사이드 삼인산염(dNTP) 기질을 정확하게 인식하고, DNA의 새로운 가닥 내로 그들의 혼입을 성공적으로 촉매하여야 한다. 모든 DNA 중합효소의 필요한 충실도는 단일-가닥 DNA 주형에 혼성화하는 유입 dNTP의 왓슨 크릭 염기쌍 상보성에 부분적으로 의존한다.[1,2] 그러나, 천연, 상보적 염기와 수소결합할 수 없는 비천연 dNTP는 또한 DNA 중합효소에 의해 성공적으로 혼입되었다. 이러한 유사체는 정규 A
Figure pct00021
T 및 G
Figure pct00022
C 염기쌍과 유사한 형상으로 안정한 염기쌍을 형성할 수 있다. [3-5] dNTP 유사체에 의한 연구는 뉴클레오타이드 혼입 입체화학, 기하학, 전자 효과 및 소수성 상호작용에 대한 다루어지지 않은 필요를 가진다.[6-9]
dNTP 유사체 혼입 실험으로부터의 결과는 추가적인 사슬 연장 및 효율적인 분석을 위한 필요를 포함하는 DNA 중합효소에 의한 뉴클레오타이드 선택 기준을 분명하게 한다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 유사체에 의한 중합으로부터의 촉매 비율은 dNTP의 친전자성 α-인산염 상에 3'-OH를 프라이밍함으로써 친핵성 공격에 대한 입체화학적 선호도를 결정하였다.[6] 수소결합 위치에서 티오- 및 할로-치환을 포함하는 핵염기의 작은 변형은 변경된 혼입 비율을 초래하며, DNA 중합효소 활성 부위에서 단단한 입체적 적합성에 대한 필요를 입증한다.[8,10] 비천연 염기를 혼입하는 데 필요한 왓슨-크릭 유사 기하학은 중합효소 활성 부위와 나타난 염기쌍 사이의 몇몇 상호작용에 의해 유도된다.[5]
단일 염기쌍 이상의 비천연 dNTP 중합의 상세한 평가는 이 비천연 중합효소 활성에 관한 정확한 동역학적 정보를 제공할 수 있었다. 더 나아가, 염기 인식 동안 관련된 작은 입체구조적 변화의 신뢰 가능한 측정으로의 해석은 DNA 중합에서 입체구조 및 전자 공학에 대한 새로운 양상의 역할을 나타낼 수 있었다. 본 명세서에 보고하는 바와 같이, 이러한 정보는 단일-분자 기법에 의해 설명될 수 있다.
효소의 벌크 또는 총체 집단의 통상적인 연구는 반응 메커니즘에서 중간 단계 및 전이 단계를 관찰할 수 없다. 그러나, 개개 분자에 의한 실험은 총체 집단에서 달리 평균화한 이러한 상태의 관찰을 허용한다.[11-13] 단일-분자 포스터(Forster) 공명 에너지 전달(smFRET)을 사용하는 DNA 중합 실험은 입체구조적 유연성 및 본 명세서에서 이후에 KF로 칭해지는 DNA 중합효소 I 클레노브 단편의 충실도 메커니즘에 대한 통찰을 나타내었다.[14-16] 효소 역학에 관한 새로운 정보를 포획하기 위한 그의 힘에도 불구하고, smFRET는 형광 표지된 단백질 및/또는 기질이 필요하다. 광퇴색 및 형광단 사이의 광자 유입은 smFRET 실험의 지속기간과 시간 분해능을 각각 제한한다.
최근에, 본 발명자들은 단일 분자 효소에 대한 새로운 접근을 기재하였고, 그것을 3가지 효소에 적용하였다. 본 기법에서, 개개 단백질을 단일벽 탄소 나노튜브 전계 효과 트랜지스터에 바이오컨쥬게이팅시킨다(SWCNT-FET; 도 1a). 상기 접근은 단계의 수, 동역학적 매개변수 및 100년에 걸쳐 연구한 효소인 T4 라이소자임의 진행도에 대한 새로운 통찰을 다루지 않았다.[17,18] 폴리뉴클레오타이드 키나제 A(PKA)의 엄청난 역학적 속도는 고도로 조절 가능한 분자 스위치로서 효소의 역할을 다루지 않았다.[19] SWCNT-FET에 컨쥬게이팅된 KF를 시험함에 있어서, A
Figure pct00023
T/T
Figure pct00024
A와 G
Figure pct00025
C/C
Figure pct00026
G 염기쌍 사이의 상당한 차이는 효소의 밀폐된 입체구조가 유입 dNTP의 동일성에 의존한다는 것을 입증하였다.[20] 이 차이에 대한 민감성은 왓슨-크릿 염기쌍이 유사한 크기를 갖기 때문에 놀라우며, 이는 SWCNT-FET 기법이 또한 dNTP 유사체와 관련된 독특한 역학 및 입체구조에 대해 반응성일 수 있다는 것을 나타내었다.
본 명세서에서, SWCNT-FET 기법은 KF의 혼입 동안 천연 dNTP와 dNTP 유사체 사이의 차이를 구별하기 위해 사용하였다. 티오- 및 할로-치환된 dNTP 유사체를 이용하여, DNA 중합을 모니터링하였고, 이어서, 모두는 아닌 일부의 dNTP 유사체에 대한 혼입 동역학에서의 차이를 나타내기 위해 통계적으로 분석하였다. 더 나아가, 효소 개방 및 폐쇄 입체구조에서 각각의 유사체가 소모된 시간은 속도 제한 단계에 필요한 시간의 변화를 다루지 않는다. 상기 결과는 촉매작용 동안 분자 인식의 도전에 의한 효소 그래플링(grappling)의 묘사를 제공한다.
실험 . SWCNT FET를 제작하였고[17], 엑소뉴클레아제-결여 KF의 단일 시스테인 변이체에 의해 기능화하였다. KF의 95% 초과로의 정제는 그의 동종성을 보장하였다. 형광 기반 분석은 부착 전에 벌크 효소의 활성을 확인하였다.[20,21] 원자력 현미경은 각각의 소자로부터의 데이터 수집 후에 개개 KF 분자의 부착을 확인하였다(도 1b).
각각의 측정을 위해, dNTP는 동종중합체 주형 폴리(dA)42, 폴리(dT)42, 폴리(dG)42 및 폴리(dC)42를 보완하도록 선택하였다. 각각의 주형을 M13 프라이밍 부위에 융합하고 나서, 혼성화를 위해 1:1 화학량론적 비로 M13 정방향 프라이머와 혼합하고, 혼합물을 95℃로 5 내지 10분 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 100 nM 농도로 주형-프라이머 혼성체를 이용하여 SWCNT FET를 표준 DNA Pol I 활성 완충제(20mM 트리스, 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 100μM TCEP, pH 8.0) 중에서 침지시켰다. 천연 또는 유사체 dNTP는 과량으로 완충제에 첨가되어, KF에 대한 V max 조건을 보장하였다. dNTP 유사체의 더 느린 혼입을 보완하기 위해, 실험은 천연 dNTP(10μM. 피셔(Fisher))보다는 더 고농도의 유사체(도 1c, 100μM. 트릴링크 바이오테크놀로지즈(Trilink Biotechnologies))를 적용하였다.
측정은 SWCNT FET의 소스-드레인 전류 I(f)를 모니터링하는 것으로 이루어지는 한편, 부착된 KF 분자는 그의 주위 환경과 상호작용하였다. FET는 100mV에서 바이어스되고, 게이트 전극으로서 작용하는 전해질을 0V에서 보유한다. 임의의 뉴클레오타이드와 함께 소자를 인큐베이션하고, 전류 전치 증폭기(키슬리(Keithley) 428)를 이용하여 측정한 그의 상보적 주형-프라이머 형질도입 변동ΔI(t)을 100㎑에서 디지털화하고, 이후의 분석을 위해 저장하였다. 측정 사이에, KF 나노회로를 분석 완충제로 2회 린스하고 나서, 완충제 중에서 5분 동안 인큐베이션하고, 이어서, 완충제로 다시 2회 린스한 후에 다른 뉴클레오타이드를 도입하였다. 각각의 KF 분자를 직접적으로 비슷한 데이터 세트를 수집하기 위해 다수의 유사체, 대응하는 천연 dNTP, 및 무 뉴클레오타이드 완충제를 이용하여 모니터링하고, 전형적인 KF 활성을 확인하고 나서, 앞서 보고한 ΔI(t)의 유형을 재현하였다.[20]
결과. 천연 dNTP 및 그의 상보적 주형-프라이머와 함께 나노회로의 인큐베이션은 전류에서 음의 변화, ΔI(t)를 야기하였다(도 2A). 앞서 보고한 바와 같이, 빠른 전류 변동은 KF, dNTP 및 주형-프라이머의 존재 하에서만 일어났다. 각각의 ΔI (t) 과도출력은 KF 효소의 폐쇄와 상관관계가 있다. 따라서, 천연 dNTP에 의한 이러한 전류 과도출력의 측정으로부터 유도된 동역학적 매개변수는 효소 움직임의 이전의 분석과 일치되었다(예를 들어, 도 2A).[20] 이들 측정은 dNTP 유사체와의 비교를 위한 기준값을 제공하였다(표 1).
Figure pct00027
α-인산염에서의 치환 또는 핵염기에 대한 변경으로 dNTP 유사체를 시험하였다. 제1 범주에서, 포스포릴 산소 원자의 황으로의 치환은 dNTP에 새로운 입체중심을 도입하여 dNTPαS로서도 알려진 α-티오-dNTP를 생성한다. 입체 화학에 대한 제어 없이 상업적으로 합성하였고, 이런 α-인에 대한 부분입체이성질체 비는 1:1일 가능성이 있었다. dNTP 유사체의 제2 범주에서, 핵염기에 대한 할로겐 또는 황 치환은 변경된 호변체화 및 결과적으로 상이한 수소 결합을 지니는 더 큰 염기를 도입할 수 있었다. 예를 들어, 유사체 6-클로로-dGTP(또한 6-Cl-2-APTP로서 알려짐)는 수소 결합 공여체로부터 수용체까지 N-1을 변화시키는 dGTP와 상이한 호변체화를 가진다. 또한, 산소의 염화물로의 대체는 수소 결합 강도를 감소시킨다. 변형된 핵염기, 2-티오-dTTP 및 2-티오-dCTP의 일 예는 산소를 황으로 치환하여 이들 염기의 크기를 증가시킨다. 이들 유사체의 혼입으로부터 초래된 변경된 동역학은 별개의 전자 신호를 야기하는 것으로 예상되는데, 유입 dNTP의 효소 인식을 늦출 가능성이 있다.
포스포로티오에이트 유사체(α-티오-dNTP), 6-Cl-dGTP, 2-티오-dTTP 및 2-티오-dCTP를 상보적 주형-프라이머와 함께 인큐베이션시켰다. 천연 dNTP에 의해 관찰한 바와 같이, 음의 전류 변동은 α-티오-dNTP 혼입 동안 생성되었다(도 2B). 반대로, 6-Cl-dGTP 혼입은 양전류 변동을 야기하였다(도 2C). 2-티오 치환을 포함하는 유사체는 음전류와 양전류 변동 둘 다의 혼합물을 야기하였다. α-티오-dGTP와 6-Cl-dGTP 유사체는 둘 다 dGTP보다 덜 빈번하게 2 내지 3회 ΔI(t) 과도출력을 생성하였다.
τopen 및 τclosed에 대한 분포는 dGTP 및 그의 두 유사체에 의한 중합 데이터의 50초과로부터 유도되었다(도 3A 내지 도 3B). 데이터는 단일 <τ> 시간 상수에 의한 단순한 푸아송 분포에 적합하다. 천연 및 유사체 dGTP τclosed 사건에 대한 분포의 적합성은 서로로부터, 특히 꼬리에서 단지 약간 벗어난다. 대부분의 사건은 높은 확률(대략 50%)로 중복되었다. dGTP, α-티오-dGTP 또는 6-Cl-dGTP의 존재 하에 폐쇄된 복합체의 평균 지속시간은 거의 일치되었다(0.2 내지 0.4ms). 천연 dGTP에 대해, 데이터에 대한 단일의 기하급수적 적합성은 90% 초과의 τopen 사건을 포함하였다. 그러나, α-티오-dGTP 또는 6-CldGTP 데이터에 대한 유사한 적합도는 τopen 사건의 대략 75%만을 포함할 수 있었다. KF 개방 입체구조에서, 유사 사건의 20 내지 30%만이 천연 dGTP가 필요한 정확한 시간 상수와 중복된다. dGTP 유사체에 의한 혼입 동역학은 천연으로부터 상당히 벗어나며, 그들의 평균 시간 상수는 용이하게 구별될 수 있었다.
동역학 매개변수 τclosed, τopen, 및 혼입 속도(k)의 이런 분석은 다른 천연 및 유사한 기질로 연장되었다(표 1). α-티오-dGTP 및 6-Cl-dGTP에 대해 기재한 바와 같이, τclosed에 의해 정량화되는 KF 폐쇄 동안의 포스포다이에스터 결합의 형성은 천연 및 유사체를 포함하는 시험한 모든 dNTP에 대해 0.2 내지 0.4ms로 지속된다. 모든 α-티오dNTP에 대해 KF 개방 입체구조의 평균 지속기간, τopen은 그들의 천연 dNTP에 대해서보다 2 내지 3회 더 길었다. 예를 들어, KF는 α-티오-dGTP(63 ± 3ms)를 가공할 때 천연 dGTP(24 ± 1ms)보다 개방 입체구조에서 대략 2.5배 더 길게(τopen) 소모된다. 천연 dNTP에 대해 보고한 바와 같이,[20] α-티오-dCTP 및 α-티오-dGTP는 α-티오-dATP 및 α-티오-dTTP보다 초기 가닥으로 더 빠르게 혼입된다. τopen-우세 A
Figure pct00028
T/T
Figure pct00029
A 염기쌍 형성은 G
Figure pct00030
C/C
Figure pct00031
G 염기쌍에 대해 2 내지 3배 더 길다.
τopen 및 τclosed 값은 dNTP 혼입의 전체 주기 동안 필요한 시간을 나타낸다. 평균 KF 가공 속도를 k = 1/(< τopen> + < τclosed>)로서 계산하였다. 개방 입체구조에서 소모된 훨씬 더 많은 시간(>98%)을 고려하면, τopen의 지속시간은 대체로 효소 촉매작용의 속도를 결정한다. 평균 KF 가공 속도는 α-티오-dNTP 및 6-Cl-dGTP 유사체에 대해 2 내지 3배 감소되었는데, τopen가 2 내지 3배 더 길기 때문이다. 예를 들어, 6-Cl-dGTP(<τopen> = 50 ± 1ms)를 가공할 때 KF 개방 입체구조에서 소모된 시간은 dGTP 가공(<τopen> = 24 ± 1ms)보다 약 2배이며, 41 S-1에 비교하여 각각 20 S-1의 속도를 생성한다. 2-티오-dTTP(<k> = 16s-1) 및 2-티오-dCTP(<k> = 36s-1)에 대한 속도는 그들의 천연 상대와 거의 동일하였다.
논의 . 포스포다이에스터 결합 형성은 변형된 α-인산염에 의할 때 조차 유사한 치환과 무관한 것으로 나타난다. α-티오-dNTP의 황은 중요한 친전자성 작용기에서 비-브릿지 산소 원자를 대체한다. 인산염의 약화된 친전자성 및 그 결과 티오포스포다이에스터 대 포스포다이에스터의 감소된 반응성에도 불구하고, 결합 교환 단계는 여전히 빠르며, 속도 제한되지 않는다.[22,23]
α-티오-dGTP 및 6-Cl-dGTP τopen 사건의 대략 25%는 데이터에 대한 단일 지수 적합화로부터 벗어나는데, 이는 효소가 비천연 dNTP 주위에서 분투함에 따라 생기는 더 큰 이상점 사건과 일치된다. τopen에 대한 더 느린 시간 상수는 변형된 염기에 고유한 dNTP 인식 단계로 들어가는 속도 제한에 필요한 더 긴 시간을 확인하였다. 그러나, 천연과 유사체 dGTP에 대한 분포 사이의 실질적인 중복은 각각의 사건에 대한 KF 입체구조의 즉각적인 배정을 방지한다.
이전의 연구는 DNA Pol I 혼입을 위한 유일한 바람직한 기질로서 α-티오dNTP의 S p 부분입체이성질체를 결정하였다.6 α-티오-dNTP 가공에 대해 관찰된 속도는 R p 부분입체이성질체에 의한 DNA 중합효소의 위-기질 저해로부터 기인할 수 있었다. α-티오-dTTP의 R P 부분입체이성질체는 KF 활성 부위에 약하게 결합하며, K i
Figure pct00032
30μM로 그의 촉매작용을 저해한다. 이 저해 상수는 천연 dNTP에 대해 K m 보다 약 10배 더 약하다.6 비입체화학적으로 제어된 α-티오-치환이 이용 가능한 기질의 절반을 효과적으로 제거하지만, 매우 과량의 α-티오-dGTP는 이러한 효과가 효소의 개방 입체구조에서 소모된 시간의 극적인 연장 원인이 될 가능성이 없다는 것을 보장하였다. 추가로, α-티오-dNTP의 부분입체이성질체 혼합물은 또한 합성 가닥의 DNA 골격의 안정성에 영향을 미칠 수 있었다.[24,25] 그러나, 효소의 폐쇄 입체구조가 τclosed에 의해 정량화되는 동안 생기는 포스포다이에스터 골격의 형성은 변하지 않고 남아있다. 따라서, α-티오-dNTP의 동역학을 늦추는 데 있어서 가장 가능성 있는 요인은 유입 염기 인식 단계 동안 R p 입체이성질체에 의한 저해이다. 따라서, KF는 정확한 입체화학적 입체배치에 의해 dNTP를 발견하여, 효소에 결합하고 저해하기 위해 경쟁하는 부정확한 기질을 거부한다.
이전의 연구는 폴리(dC) 주형에 대한 염기쌍에서 6-Cl-dGTP를 혼입하기 위한 DNA 중합효소에 의한 효율적인 촉매작용을 나타내었다.[26]] 6-Cl-dGTP는 T4 DNA 중합효소에 의해 염기 T 반대편에 혼입될 수 있지만,[27,28] 이 능력은 KF 기능화된 나노회로에서 지금까지 연구된 적이 없다. 본 명세서에 기재한 6-Cl-dGTP를 이용하는 연구는 부정확한 왓슨-크립 염기쌍을 지니는 비천연 dNTP를 수용하는 DNA 중합효소의 자발성을 설명한다. 이들 비천연 염기를 성공적으로 혼입하기 위해, DNA 중합효소는 뉴클레오타이드 선택을 위한 통상적인 수소 결합 인식 기준에 대한 대안을 적용하여야 한다. 동역학적 결과는 dNTP 인식 동안 수소 결합과 관련된 속도 제한 단계의 적용과 일치된다.
더 큰 크기의 염기 6-Cl-dGTP, 2-티오-dTTP 및 2-티오-dCTP의 구별 후 입체구조적 변화는 민감한 SWCNT-FET에 대한 전하 게이팅에서 차이를 유도할 수 있다는 가설을 세웠다. 기쁘게도, KF 나노회로를 6-Cl-dGTP 및 폴리(dC)42와 함께 인큐베이션시켰을 때, 독특한 신호가 관찰되었다. 양의 ΔI (t) 과도출력, 또는 "업스위치"는 상이한 방식의 효소 폐쇄를 나타낼 가능성이 있다(도 2D). 이들 신호는 dGTP 혼입의 결과와 반대이다.20 T4 라이소자임의 전하 돌연변이체에 의한 실험에서 나타낸 바와 같이,29 음으로 하전된 아미노산 작용기는 나노튜브에 더 가깝게 이동하여야 하고, 양으로 하전된 작용기는 6-Cl-dGTP 혼입 동안 훨씬 더 멀리 이동하여야 한다. 2-티오치환된 dNTP에 대해, 업- 및 다운-스위칭 사건의 복잡한 혼합물을 관찰하였다. KF 폐쇄와 관련된 업- 및 다운-스위칭의 무작위 분포는 효율적인 촉매를 유지하기 위해 효소가 하나 이상의 입체구조를 적용한다는 것을 시사한다.
천연 및 유사체 dGTP 혼입을 위한 동역학에서의 큰 중복에도 불구하고, KF는 2-티오 dCTP, 2-티오 dTTP 및 6-Cl-dGTP에 의한 촉매작용 동안 상이한 입체구조에 분명히 접근한다. 엑소뉴클레아제 도메인에 대한 그리고 그로부터의 분할 동안 KF J-나선에 의해 조절되는 입체구조적 변화에 의해 이들 독특한 업-스위칭 신호가 야기될 수 있는데, KF는 완전히 상보적인 염기보다 더 적게 혼입을 인식하기 때문이다.[14,30-32] 그러나, 이러한 왕복은 매우 빠른 속도로 일어날 필요는 없는데, 천연 dNTP에 비교하여 6-Cl-dGTP, 2-티오-dTTP 및 2-티오-dCTP에 대해 효소 폐쇄 시간, τclosed, 사이의 차이가 관찰되지 않기 때문이다. 유입 dNTP 차별을 허용하는 이들 별도의 신호의 퍼텐셜은 DNA 시퀀싱에서 가능한 적용에 대한 추가적인 연구를 받을 만하다.
결론 . 요약하면, dNTP 유사체는 친전자성 인산염에서의 입체 화학, 유입 염기의 수소 결합 능력 및 효소 폐쇄 정도를 포함하는, DNA 중합효소에 의한 뉴클레오타이드의 혼입 제한에 도전한다. 시험한 대부분의 유사체는 τopen 및 그 결과 효소 속도가 감소가 감소되기 때문에, 속도결정 dNTP 인식 단계는 기질 구조에서의 약간의 변화에 대해 고도로 민감한 것으로 나타난다. 대조적으로, 결합 형성의 반응성 부위에서의 극적인 치환조차 KF 폐쇄 시간에 영향을 미치지 못한다. 본 명세서에 기재한 결과는 KF 나노회로를 이용하는 각각의 단계의 dNTP 유사체 혼입 동안 KF 입체구조 배정을 목표로 하는 두 가능한 전략을 시사한다. 첫째로, 변형은 dNTP 인식 및 활성화 동안 개방 KF의 입체구조를 표적화할 수 있다. 그러나, 지금까지, 6-Cl-dGTP 및 α-티오-dNTP를 포함하는 변형된 dNTP는 단지 효소의 평균 속도를 늦출 수 있다. 추가적인 연구의 가치가 있는 다른 전략은 KF의 폐쇄된 입체구조에 영향을 미친다. 변형된 염기, 예컨대 6-Cl-dGTP, 2-티오dCTP 및 2-티오-dTTP는 혼입 동안 효소의 입체구조를 변경시킬 수 있으며, SWCNT를 통한 전류 통과가 증가함에 따라 관찰되는 전자 신호에 극적으로 영향을 미친다. 이러한 업-스위칭은 천연 dNTP의 혼입과 용이하게 구별될 수 있으며, 비천연 dNTP를 용이하게 수용하는 효소의 직접적 관찰을 제공한다. 결론적으로, 심지어 잘 연구된 효소의 입체구조적으로 민감한 전자 측정은 효소의 움직임 및 역학의 새로운 그리고 예상치 못한 양상을 나타낼 수 있다.
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Figure pct00034
실시예 2. 단일-분자 DNA 중합효소 I(클레노브 단편) 나노회로에 의한 데옥시뉴클레오사이드 삼인산염 유사체의 혼입 -2.
설명 . DNA 중합효소 I의 클레노브 단편(KF)의 클레노브 단편(KF)의 단일 복제물을 단일벽 탄소 나노튜브 소자에 부착하였고, 상이한 화학적 보조인자의 존재 하에 전기적으로 측정하였다. 모든 제작 양상은 문헌[Olsen et. al]에 의해 기재되는 프로토콜에 따랐다.
결과 . 도 4A 내지 도 4B는 천연 뉴클레오타이드 데옥시티미딘 삼인산염(dTTP)의 존재 하에서 KF가 폴리(dA)42를 가공할 때, 각각의 염기쌍 혼입은 음전류 스파이크 ΔI<0을 생성한다는 것을 입증한다. dTTP가 비천연 뉴클레오타이드 2-티오-2'-데옥시티미딘-5'-삼인산염(2-티오-dTTP)으로 대체될 때, 염기 혼입은 양전류 스파이크 ΔI>0를 생성한다.
도 5A는 KF가 모두 4가지의 천연 뉴클레오타이드(dNTP)의 존재 하에 균질한 기질을 가공할 때, 각각의 염기쌍 혼입은 음전류 스파이크 ΔI<O을 생성한다는 것을 입증한다. 개개 스파이크는 나타낸 바와 같이 열거하지만, 일반적으로 그들은 염기의 하나의 유형을 서로 구별하지 않는다.
도 5B에서 입증하는 바와 같이, dTTP와 동일한 데이터 세트의 시뮬레이션을 2-티오-dTTP로 대체하였다. 티올화된 데옥시티미딘에 의해, 양의 스파이크는 이제 T 뉴클레오타이드가 도입된 위치(#2, 6, 7)를 나타낸다. 이 관찰은 KF를 RNA 중합효소에 의해 대체함으로써 RNA 시퀀싱으로 연장될 수 있다. 도 5B에 도시한 공정은 특정 DNA 기질에서의 모든 T 뉴클레오타이드 혼입을 동정한다. 상기 공정은 각각 4개의 상이한 티올화된 뉴클레오타이드를 이용하여 기질을 측정함으로써 모두 4개의 염기로 연장될 수 있다.
도 5C는 KF가 특정 유사체와 혼합된 천연 뉴클레오타이드(dNTP)의 존재 하에 이종성 기질을 가공할 때, 얻어진 패턴이 선택된 염기를 동정하는 데 사용될 수 있는 양전류 및 음전류를 포함한다는 것을 보여준다. 이 예는 G 혼입을 위한 유사체로서 6-Cl-2APTP와 혼합된 3가지 천연 뉴클레오타이드(dATP, dTTP, dCTP)를 이용하여 획득된 데이터를 나타낸다. 본 데이터 세트에서 전류 스파이크는 15개의 염기 혼입 사건을 열거하도록 넘버링된다. 대부분의 사건(#1, 4, 7, 9, 10, 13, 14, 15)은 천연 뉴클레오타이드의 혼입을 동정하는 단일 음성 전류 스파이크로 이루어진다. 사건 중 다섯(#2, 3, 6, 8, 11)은 화살표로 강조하는데, 그들은 6-Cl-2APTP 뉴클레오타이드 혼입을 동정하는 양전류 스파이크이기 때문이다. 6-Cl-2APTP를 본 명세서에서 천연 dGTP 뉴클레오타이드의 유사체로서 사용하기 때문에, 이들 5가지 사건은 DNA 서열에서 G 뉴클레오타이드를 동정한다.
도 5C에서 나타낸 사건 중 둘(#5, 12)은 가까운 간격의 전류 스파이크 쌍을 포함한다. 이들 쌍은 빠르게 연속으로 하나의 천연 및 하나의 6-Cl-2APTP 뉴클레오타이드의 혼입을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 스파이크의 쌍은 dATP의 위-유사체(pseudo-analog)로서 작용하는 6-Cl-dAPTP로부터 초래된 독특한 신호일 수 있었다.
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실시예 3: KF의 발현 및 정제
상업적으로 구입한 시약은 항생제(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)), Ni-IMAC 수지(바이오-래드 래버러토리즈(Bio- Rad Laboratories)), 세포주(스트라타겐(Stratagene)), 데옥시뉴클레오사이드 삼인산염(피셔 사이언티픽), 데옥시뉴클레오사이드 삼인산염 유사체(트라이링크 바이오테크놀로지즈(Trilink Biotechnologies)), 효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 또는 퍼멘타스(Fermentas)), 올리고뉴클레오타이드(피셔), 고해상도 아가로스(더 네스트 그룹(The Nest Group)) 및 96-웰 형광 플레이트(눙크(Nunc))를 포함한다. 모든 다른 화학물질을 아크로스 오가닉스(Acros Organics), EMD, 피셔 사이언티픽 또는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 상업적으로 구입하였다. 모든 시약을 받은 그대로 사용하였다.
본 명세서에서 이후에 KF로 지칭하는 KF를 암호화하는 유전자를 포함하는 pET28c 플라스미드(D355 A/E357A/C907S/L790C)1,2를 열 충격에 의해 CaCl2-적격 BL21(DE3) 이콜라이(E. coli) 세포를 형질전환하기 위해 사용하였다. 밤새 고체 배지 상에서 성장시킨 후에, 단일 콜로니를 사용하여 37℃에서 밤새 액체 배지 중에서 진탕시키면서 성장시키기 위해 40㎍/㎖ 카나마이신으로 보충한 25㎖ LB 배지를 접종하였다. 40㎍/㎖ 카나마이신으로 보충한 LB(1ℓ)를 10㎖로 밤새 접종한 다음, 37℃에서 몇 시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다.. 일단 세포가 대수기에 도달되면(OD600 = 0.9), 1mM IPTG의 첨가에 의해 KF 발현을 유도하였다. 진탕시키면서 37℃에서 단백질 발현 3 내지 4시간 후에, 세포를 원심분리(6000rpm, 20분, 4℃)에 의해 채취하고 나서, 용해 완충제(20mM 트리스, 50mM NaCl, 10mM BME, pH 8.0) 중에서 재현탁시켰다. 세포를 음파처리에 의해 용해시키고, 세포 파편을 원심분리(15,000rpm, 45분, 4℃)에 의해 수집하였다. 0.45㎛ 기공 필터를 통한 여과 후에, 용해물 상청액을 4℃에서 밤새 Ni-IMAC 수지에 결합시켰다. KF를 250mM 이미다졸을 지니는 용해 완충제 중에서 용리시키고 나서, 농축시키고, 이어서, 4℃에서 2일 동안 TEV 프로테아제로 처리하였다. 혼합물을 원심분리시키고, 이어서, 바이오래드 바이오로직 듀오플로우 FPLC(Bio-Rad Biologic DuoFlow FPLC) 상에서 TBS(20mM 트리스, 50mM NaCl, 100μM TCEP, pH 7.9) 중의 크기 배제 크로마토그래피 전에 0.45㎛ 필터를 통해 여과시켰다. KF 순도를 SDS-PAGE에 의해 평가하였다(도 6).
KF 및 dNTP 유사체 혼입의 총체 활성
활성을 시험하기 위해 사용한 올리고뉴클레오타이드
표 2는 KF 활성, dNTP 유사체 혼입, 및 나노회로에 의한 측정에 대해 시험하기 위해 사용한 올리고뉴클레오타이드를 열거한다. 수용 시, HPLC-정제 올리고뉴클레오타이드를 수 중에서 100μM로 용해시켰다. 볼드체 영역은 Ml3 프라이밍 부위를 나타낸다. 이탤릭체 영역은 제한 부위를 나타낸다. [2AmPur]은 2-아미노퓨린을 나타낸다.
Figure pct00037
KF 활성에 대한 총체 분석
변이체 KF(L790C) 대 야생형 KF의 활성을 확인하기 위해, 앞서 기재한 분석을 다음과 같이 적합화하였다.1 ,3 혼합물을 65℃로 가열하고, 실온으로 1시간 동안 서서히 냉각시킴으로써 2-아미노퓨린(표 S1에서 액트어세이 주형)과 M13 프라이밍 부위(밑줄)를 둘 다 포함하는 무작위 DNA 주형을 M13F 프라이머로 어닐링하였다. 프라이머-주형 혼합물(25μM) 및 dNTP(250μM)과 함께 인큐베이션 시 KF(L790C) 및 야생형 KF(둘 다 1μM)에 대해 형광의 비슷한 감소를 관찰하였다. dNTP의 부재 시 측정한 배경의 차감에 의해 원 형광 데이터를 보정하였다. 이 실험에서 사용한 여기 및 방출 파장은 각각 305 및 365㎚였다.
dNTP 유사체 혼입에 대한 총체 분석
dNTP 유사체의 혼입을 확인하기 위해, M13F 프라이머에 대한 혼성화 후 KF에 의해 무작위화된 DNA 주형(표 S1)을 중합하였다. 양성 대조군 반응은 10mM 트리스, 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.9 중의 KF(1μM), dNTP 또는 dNTP 유사체(100μM) 및 A/T 또는 G/C 혼입 주형-프라이머(5μM)를 함유하였다. dNTP 유사체 혼입을 시험하는 반응은 그의 천연 dNTP 대신 100μM 유사체를 함유하고, 음성 대조군 반응은 유사체 또는 그의 천연 dNTP 중 하나가 없었다. 반응을 5% 고분해능 아가로스 겔 상에서 전기영동 전에 열 순환기에서 25℃에서 2시간 동안 유지하였다(도 8B).
본 개시내용의 실시형태:
하기 단계들을 포함하는, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법:
(i) 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)에 비공유로 부착된 핵산 중합효소를 제1 뉴클레오타이드 또는 제1 뉴클레오타이드 유사체 및 주형 핵산 서열과 접촉시킴으로써, 상기 제1 뉴클레오타이드 또는 상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 및 상기 주형 핵산 서열에 결합된 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소를 형성하는 단계;
(ii) 상기 핵산 중합효소와 상기 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소 사이의 SWNT의 제1 전기 전도도 변화를 측정함으로써 상기 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소를 검출하는 단계.
상기 핵산 중합효소는 제1 뉴클레오타이드 유사체와 접촉되는, 방법.
(iii) 상기 제1 전기 전도도 변화에 의해 생성되는 제1 신호에 기반하여 상기 제1 뉴클레오타이드 또는 제1 뉴클레오타이드 유사체를 동정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
(iv) 상기 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소가 상기 제1 뉴클레오타이드 또는 제1 뉴클레오타이드 유사체를 방출하도록 허용함으로써, 상기 핵산 중합효소를 재형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
하기를 더 포함하는 방법
(v) 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)에 비공유로 부착된 핵산 중합효소를 제2 뉴클레오타이드 또는 제2 뉴클레오타이드 유사체 및 상기 주형 핵산 서열과 접촉시킴으로써, 상기 제2 뉴클레오타이드 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체 및 상기 주형 핵산 서열에 결합된 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소를 형성하는 단계;
(vi) 상기 제2 뉴클레오타이드 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체 및 상기 주형 핵산 서열에 결합된 상기 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소와 상기 핵산 중합효소 사이의 SWNT에서 전기 전도도 변화를 측정함으로써 상기 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소를 검출하는 단계.
제5항에 있어서, 상기 핵산 중합효소는 제2 뉴클레오타이드 유사체와 접촉되는, 방법.
(vii) 상기 제2 전기 전도도 변화에 의해 생성되는 제2 신호에 기반하여 상기 제2 뉴클레오타이드 또는 제2 뉴클레오타이드 유사체를 동정하는 단계; 및 상기 주형 핵산 내의 서열을 동정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체는 비-왓슨 크릭 염기 짝짓기에 의해 상기 주형 핵산에 혼성화하는, 방법.
상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체는 2-티오 dCTP, 2-티오 dTTP, 또는 6-Cl-dGTP, 6-아자-dTTP, α-티오-dATP, 또는 α-티오-dTTP인, 방법.
상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체는 삼인산염 모이어티에서 변형된, 방법.
상기 삼인산염 모이어티는 α-티오 치환을 포함하는, 방법.
상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체는 α-티오-dATP, α-티오-dGTP, α-티오-dCTP, 또는 α-티오-dTTP인, 방법.
상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체는 상기 핵염기에서의 치환을 더 포함하는, 방법.
상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체는 α-티오-2-티오-dTTP, α-티오-2-티오-dCTP, α-티오-6-Cl-20APTP, 또는 6-Cl-2APTP인, 방법.
SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California Collins, Philip G. Weiss, Gregory A. Choi, Yongki Olsen, Tivoli <120> DETECTION OF NUCLEIC ACID POLYMERASE CONFORMATIONAL CHANGES USING A NANOTUBE <130> 48538-526001WO <150> US 62/093,671 <151> 2014-12-18 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2-Aminopurine <400> 2 tcgagctatc tctaaagcag ctaactatcg agctatcgcg aaactggccg tcgttttaca 60 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 3 cctaacgcag atagacgttg tttagagccc gggtcggcca tactggccgt cgttttaca 59 <210> 4 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 4 cctaacgcag atagacgttg tttagagatt taaattcggc cactggccgt cgttttaca 59 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 5 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaactggccg tcgttttaca 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 6 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttactggccg tcgttttaca 60 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 7 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg ggactggccg tcgttttaca 60 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 8 cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc ccactggccg tcgttttaca 60 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 9 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tt 42 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 10 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 42 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 11 gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gg 42 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 12 cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cc 42

Claims (14)

  1. 하기 단계들을 포함하는, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법:
    (i) 단일벽 탄소 나노튜브(single walled carbon nanotube: SWNT)에 비공유로 부착된 핵산 중합효소를 제1 뉴클레오타이드 또는 제1 뉴클레오타이드 유사체 및 주형 핵산 서열과 접촉시킴으로써, 상기 제1 뉴클레오타이드 또는 상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 및 상기 주형 핵산 서열에 결합된 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소를 형성하는 단계;
    (ii) 상기 핵산 중합효소와 상기 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소 사이의 상기 SWNT의 제1 전기 전도도 변화를 측정함으로써 상기 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소를 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 중합효소는 제1 뉴클레오타이드 유사체와 접촉되는, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, (iii) 상기 제1 전기 전도도 변화에 의해 생성되는 제1 신호에 기반하여 상기 제1 뉴클레오타이드 또는 제1 뉴클레오타이드 유사체를 동정하는 단계를 더 포함하는, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, (iv) 상기 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소가 상기 제1 뉴클레오타이드 또는 제1 뉴클레오타이드 유사체를 방출하도록 허용함으로써, 상기 핵산 중합효소를 재형성하는 단계를 더 포함하는, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 하기 단계들을 더 포함하는, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법:
    (v) 단일벽 탄소 나노튜브(SWNT)에 비공유로 부착된 핵산 중합효소를 제2 뉴클레오타이드 또는 제2 뉴클레오타이드 유사체 및 상기 주형 핵산 서열과 접촉시킴으로써, 상기 제2 뉴클레오타이드 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체 및 상기 주형 핵산 서열에 결합된 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소를 형성하는 단계; 및
    (vi) 상기 제2 뉴클레오타이드 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체 및 상기 주형 핵산 서열에 결합된 상기 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소와 상기 핵산 중합효소 사이의 상기 SWNT에서 전기 전도도 변화를 측정함으로써 상기 입체구조적으로 변화된 핵산 중합효소를 검출하는 단계.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산 중합효소는 제2 뉴클레오타이드 유사체와 접촉되는, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, (vii) 상기 제2 전기 전도도 변화에 의해 생성되는 제2 신호에 기반하여 상기 제2 뉴클레오타이드 또는 제2 뉴클레오타이드 유사체를 동정하는 단계; 및 상기 주형 핵산 내의 서열을 동정하는 단계를 더 포함하는, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체는 비-왓슨 크릭 염기 짝짓기(non-Watson-Crick base pairing)에 의해 상기 주형 핵산에 혼성화하는, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체는 2-티오 dCTP, 2-티오 dTTP, 또는 6-Cl-dGTP, 6-아자-dTTP, α-티오-dATP, 또는 α-티오-dTTP인, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체는 삼인산염 모이어티에서 변형된, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 삼인산염 모이어티는 α-티오 치환을 포함하는, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체는 α-티오-dATP, α-티오-dGTP, α-티오-dCTP, 또는 α-티오-dTTP인, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체는 상기 핵염기에서의 치환을 더 포함하는, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1 뉴클레오타이드 유사체 또는 상기 제2 뉴클레오타이드 유사체는 α-티오-2-티오-dTTP, α-티오-2-티오-dCTP, α-티오-6-Cl-20APTP 또는 6-Cl-2APTP인, 핵산 중합효소 입체구조의 변화를 검출하는 방법.
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