CN107849605B - 核酸测序方法和系统 - Google Patents

Abstract

本公开提供了使用基于聚合酶的核酸结合反应对模板核酸进行测序的组合物、方法以及系统，所述组合物、方法以及系统涉及在一种或多种未标记的核苷酸存在下检查聚合酶与模板核酸之间的相互作用。所述方法部分地依靠在核酸合成期间通过控制测序反应条件来鉴定模板核酸的碱基。模板核酸碱基可以在检查步骤期间被鉴定，随后是任选的掺入步骤。

Description

核酸测序方法和系统

背景

核酸序列信息的确定是生物学研究和医学研究的重要部分。序列信息有助于鉴定基因与疾病和表型的关联性、鉴定潜在的药物靶标、以及了解疾病发展和进展的机制。序列信息是个体化医疗的重要部分，其中它可以用于优化在特定受试者中对疾病的诊断、治疗、或预防。

发明内容

本文提供了用于对模板核酸分子进行测序的方法。所述方法一般包括在掺入未标记的核苷酸之前的检查步骤。更具体地说，所述检查步骤包括提供使用引物引发的模板核酸分子；使所述引发的模板核酸分子与包含聚合酶和至少一种未标记的核苷酸分子的第一反应混合物接触；在所述未标记的核苷酸分子存在下，在所述核苷酸分子没有化学掺入到所述引发的模板核酸中的情况下监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用；以及基于所述在所述未标记的核苷酸分子存在下所监测到的所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用鉴定所述模板核酸中的下一个碱基。

附图简述

图1是示出了使用非标记光学检测方法的实验的结果的图，其中在结合步骤或检查步骤期间镁存在或不存在。

图2是示出了使用Bst酶结合动力学进行测序以使用Bst2.0酶和dNTP确定正确碱基的图。

图3是示出了盐浓度对在

octet仪器(Menlo Park，CA)上使用生物膜干涉测量法得到的匹配碱基和错配碱基辨认作用的影响的图。

图4是示出了在洗涤步骤期间，即在聚合酶解离期间，使用phiX_匹配C和FP2引物以及klenow酶或Bst2.0酶、以及SrCl₂进行的碱基辨认的图。

图5是示出了洗涤对使用不同浓度的SrCl₂(0mM-14mM)使核酸、聚合酶复合物稳定的影响的图。

图6是示出了DNA pol I的3′-5′核酸外切酶活性对测序的影响的图。

图7A和图7B是示出了使用HIV-1逆转录酶、NNRTI化合物7以及所示的dNTP对人ALK看门区域(gatekeeper region)进行测序的图。图7A是示出了连续测序循环的时间过程的图。图7B是示出了在从前一个循环中减去背景之后于单个图中的循环1-12的图。预期的序列读段是CAGCAGGA(SEQ ID NO：1)并且观测到的序列读段是CAGCAGG(SEQ ID NO：2)。

图8是示出了使用HIV-1逆转录酶、NNRTI化合物18以及各种dNTP对人ALK看门区域进行测序的图。

图9是示出了使用SPRi生物传感器对phiX_匹配A模板进行测序的传感图。灰色区域对应于正确碱基识别(base call)。虚线指示用于确定正确Klenow/dNTP组合的结合的强度变化阈值。

图10A、图10B以及图10C是示出了使用来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的Bst DNA聚合酶通过切口平移对dsDNA进行测序的图。在结合缓冲液中在存在或不存在所示的dNTP的情况下用Bst DNA Pol处理具有一个碱基缺口的双链DNA。将生物传感器转移到反应缓冲液中以进行dNTP掺入，继而转移到含有Bst DNA Pol而不含dNTP的反应缓冲液中以对非模板链进行5′-3′核酸外切酶裂解，持续120秒(图10A)或60秒(图10B)。作为对照，使用Bst DNA Pol以通过结合引发的ssDNA模板，进行dNTP掺入，继而进行5′-3′核酸外切酶处理60秒来进行测序(图10C)。

图11A、图11B、以及图11D是示出了使用大肠杆菌DNA聚合酶的克列诺Klenow(3′→5′exo-)片段通过链置换对具有5′-瓣状结构flap的dsDNA进行测序的图表。在不含MgCl2的结合缓冲液中在存在或不存在所示的dNTP的情况下用克列诺Klenow exo-DNA Pol处理DNA模板。将生物传感器转移到含有MgCl2的洗涤缓冲液中以进行催化，继而在不含酶或dNTP的结合缓冲液中重新平衡。对如所示的每一种单独的dNTP重复循环。图11A：单链DNA。图11B：具有单一个碱基缺口的双链DNA。图11C：在单一个碱基对缺口的下游具有5′-寡聚dT瓣状结构flap的双链DNA。

图12A、图12B以及图12C是示出了通过大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow(3′→5′exo-)片段对ssDNA进行的测序是通过盐组分促进的图。结合缓冲液含有200mM的谷氨酸盐(图12A)、100mM的谷氨酸盐(图12B)以及50mM的谷氨酸盐(图12C)。反应缓冲液含有MgCl2而不含谷氨酸盐。对每一个循环的施加的dNTP(“dNTP”)示于图12A、图12B以及图12C中的每一个的顶部文本行(SEQ ID NO：14)中。Klenow(exo-)的结合指示了图12A(SEQ ID NO：15)、图12B(SEQ ID NO：17)以及图12C(SEQ ID NO：19)的第二行中的所观测到的序列(“观测”)。基于模板的“预期”序列示于图12A(SEQ ID NO：16)、图12B(SEQ ID NO：18)、以及图12C(SEQID NO：20)的第三文本行中。

图13A、图13B、以及图13C是通过Klenow exo-DNA聚合酶对ALK野生型的背景下的人ALK C4493A突变体的有义链进行测序的图。图13A是显示在野生型和C4493A突变体的ssDNA混合物中进行测序的传感图。图13B是示出了在ssDNA混合物中在循环4(T)中显示的C4493A突变体的线性定量、以及在循环3(G)中显示的野生型ALK的线性定量的图。图13C是示出了在dsDNA-flap混合物中在循环4(T)中显示的C4493A突变体的线性定量、以及在循环3(G)中显示的野生型ALK的大致线性量的图。

图14A和图14B是在存在或不存在催化性金属(MgCl₂)的情况下Klenow exo-和dCTP与人ALK C4493A突变体的由二价阳离子介导的结合和解离的图。图14A是示出了在非催化性金属存在下与引物/模板的结合和解离的图。图14B是示出了在催化性金属存在下与引物/模板的结合和解离的图。

图15是对人ALK C4493A突变体进行Klenow exo-测序的图，其中结合是由低浓度的CoCl₂介导的，并且掺入是由高浓度的CoCl₂介导的。

图16是对人ALK C4493A突变体进行Klenow exo-测序的图，其中结合是由Ni(II)SO₄介导的，并且掺入是通过MgCl₂实现的。仅在核苷二磷酸激酶和ADP存在下观测到与基线的解离，所述核苷二磷酸激酶和ADP清除游离dNTP，从而防止dNTP重新结合到Klenow exo-和引物/模板的复合物中。

图17A和图17B是示出了在对人ALK C4493A突变体进行Bsu Pol I(大片段)测序期间的均聚物分辨率的图。结合是由Ni(II)SO₄介导的，掺入是由MgCl₂介导的，并且在存在或不存在dNDP的情况下进行解离。图17A是使用Octet QK系统进行测序的传感图。图17B是示出了两个连续G峰的分辨率取决于反应缓冲液中dNDP的浓度的图。

图18A、图18B、图18C、图18D以及图18E是示出了在对人野生型ALK进行Bsu Pol I(大片段)测序期间的均聚物分辨率的图。图18A是聚合酶在模板ALK-G1、ALK-G2以及ALK-G3上的Ni增强结合的传感图。图18B是聚合酶在模板ALK-G4上的Ni增强结合的传感图。图18C是在添加含有Ni和Mg的反应缓冲液之后掺入/解离时间的传感图。图18D是示出了相对于在填充模板的C均聚物所需的引物链中G核苷酸的数目绘制的检查阶段参数的图。对照是单个G掺入(G)，并且“**”指示p＜0.01的统计显著性结果。图18E是示出了针对所示的Bsu聚合酶浓度绘制的掺入/解离阶段期间所观测到的初始速率的图。对照是单个G掺入(G)。

具体实施方式

高通量、具有成本效益的核酸测序具有引领研究和个体化医疗的新时代的潜能。几种商业测序平台是可供使用的，并且尽管它们在整个基因组的规模上进行测序，但是它们对于大众市场遗传分析来说仍是过于昂贵的。通过降低测序成本，将有可能在物种和个体之间详细地分析遗传变异，从而为个体化医疗提供基础以及鉴定基因型与表型之间的联系。除了更少的试剂和劳动力成本之外，测序技术的目标还包括扩大通量和提高准确度。

目前，多种测序技术利用一种被称为边合成边测序(SBS)或边掺入边测序的方法。常见的SBS方法利用诸如聚合酶的酶以通过提供核苷酸或短寡核苷酸合成与待测序的DNA链互补的DNA链，所述核苷酸或短寡核苷酸被鉴定标签修饰，以使得所掺入的核苷酸或寡核苷酸的碱基类型在合成进行时被检测出。检测可以是实时的，其中核苷酸在它们被掺入时被检测出。实时程序因含有高度重复序列的区域和均聚物区域的不准确读段而受到困扰。检测也可以在停止和继续执行步骤的迭代中进行，其中受控的反应条件和/或试剂在合成期间给定的时间可逆地停止和开始反应。

有几种系统和仪器已经被开发或目前正被开发用于进行边合成边测序方法。所述方法使用类似的反应方法，差异包括使用不同的鉴定标签和/或其中检测核苷酸掺入的方式。这些测序系统一般实现约一百个至几百个碱基的相当短的读段长度，但是通过大规模并行化来克服这一限制，其中成千上万个DNA片段在同一基底上同时被测序。

由于许多边合成边测序技术是基于荧光检测，因此需要核苷酸的荧光标记，这连同照射和光学器件一起造成所述系统是复杂的和昂贵的。荧光标记技术可以是劳动力密集型的并且需要技术密集的标记过程。此外，基于荧光的方法的定量准确度可能是欠佳的，这是因为荧光标记易受光漂白的影响以及来自荧光杂质的光谱干扰。此外，一些方法需要使用多个荧光标记(即每一个dATP、dCTP、dGTP、dTTP各一个)，它们各自在不同的波长处被检测，这增加了成本和检测仪器。举例来说，边合成边测序(SBS)方法常常需要荧光标记的dNTP来检测掺入的核苷酸并且因此鉴定模板核酸序列；然而，标记的核苷酸的使用在准确度方面具有限制，这是因为当前使用标记核苷酸的SBS反应在几百个碱基之后变成易错的。当要对整个基因组进行测序时，即使是1％的误差也可能会损害测序结果的意义。当不能检测单个标记导致缺失误差时或当检测到杂散分子导致插入误差时，准确度可能会降低。被漂白的荧光团造成假阴性。此外，标记的dNTP被未标记的dNTP，例如杂质或水解产物污染也可能造成假阴性。此外，来自非特异性结合结构化的表面的标记的dNTP的杂散信号导致插入误差或高信噪比。修饰的核苷酸的使用显著地减慢酶动力学，从而使得测序反应非常缓慢。使用标记的核苷酸的另一个挑战是一旦所述标记被检测到，就需要去除所述标记或使其失活，以使得下一次添加可以在没有背景信号的情况下被观测到。因此，为了获得长的读段长度，在每一次添加之后必须进行几乎100％的化学、酶促或光解步骤以将基底解除阻断或去除染料以用于下一次添加。

本文提供的组合物、系统以及方法克服或减少了与当前的边合成边测序方法相关的一个或多个问题。所提供的方法可以在不存在可检测标记的核苷酸的情况下进行。任选地，所述方法是例如对核苷酸、聚合酶或正被测序的模板在不存在任何可检测的标记的情况下进行的。本文提供的方法使用边结合边测序反应，包括鉴定下一个模板碱基的检查步骤以及向引物的3′末端添加一个或多个互补核苷酸的掺入步骤。所述掺入步骤可以与所述检查步骤同时或分开。所述检查步骤涉及在核苷酸存在下监测聚合酶与待测序的核酸(模板核酸)之间的相互作用。任选地，所述相互作用可以在稳定剂存在下发生，由此在下一个正确的核苷酸存在下，聚合酶-核酸相互作用被稳定剂稳定。所述检查步骤确定模板核酸碱基身份而无需核苷酸掺入和/或标记的核苷酸。可以控制所述检查步骤以减弱或实现核苷酸掺入。如果核苷酸掺入被减弱，那么可以进行单独的掺入步骤。单独的掺入步骤可以被实现而无需进行监测，这是因为碱基已经在检查步骤期间被鉴定。如果在检查期间进行核苷酸掺入，那么后续的核苷酸掺入可以通过稳定剂来减弱，所述稳定剂在掺入之后截留(trap)核酸上的聚合酶。也可以使用可逆终止的核苷酸来防止后续的核苷酸的添加。边结合边测序方法允许受控确定模板核酸碱基而无需标记的核苷酸，这是因为聚合酶与模板核酸之间的相互作用可以在没有核苷酸上的标记的情况下被监测。受控的核苷酸掺入也可以提供关于重复和均聚物区域的准确的序列信息而不需要使用标记的核苷酸。因此，除了提高的准确度之外，本文提供的组合物、系统、以及方法还是有时间和成本效益的，这是因为它们不需要基于荧光的SBS检测所需的标记的核苷酸。如本文进一步提供的那样，模板核酸分子可以在检查条件下被测序，这不需要使用模板核酸或聚合酶与固相载体的连接。本文的组合物、方法以及系统与先前的系统相比提供许多优势，如受控的反应条件、序列的明确确定、长读段长度、低的试剂总成本、以及低的仪器成本。除非另外指明，否则本公开将使用常规的分子生物学和生物传感器技术，这些技术在本领域的技术范围内。除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语所具有的含义与本领域的普通技术人员通常所了解的含义相同。

本文提供了一种用于对模板核酸分子进行测序的方法。所述方法包括：检查步骤，所述检查步骤包括提供用引物引发的模板核酸分子；使所述引发的模板核酸分子与包含聚合酶和至少一种未标记的核苷酸分子的第一反应混合物接触；在所述未标记的核苷酸分子存在下并且在所述核苷酸分子没有化学掺入到所述引发的模板核酸中的情况下监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用；以及基于所述监测的相互作用鉴定所述模板核酸中的下一个碱基。任选地，所述引物是可延伸的引物。任选地，当核苷酸与引发的模板核酸分子的下一个碱基互补时，所述接触在使所述聚合酶、引发的模板核酸分子以及核苷酸之间形成的三元复合物的形成稳定的条件下发生。任选地，当核苷酸与引发的模板核酸分子的下一个碱基不互补时，所述接触在相对于二元复合物的形成有利于三元复合物的形成的条件下发生，所述三元复合物能够在聚合酶、引发的模板核酸以及核苷酸之间形成。任选地，所述鉴定包括鉴定与引发的模板核酸的下一个碱基互补的核苷酸。

提供了用于对模板核酸分子进行测序的方法，所述方法包括检查步骤，所述检查步骤包括提供用引物引发的模板核酸分子；使所述引发的模板核酸分子与包含聚合酶和第一未标记的核苷酸分子的第一反应混合物接触，其中当所述第一未标记的核苷酸分子与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补时，所述引发的模板核酸分子、所述聚合酶以及所述第一未标记的核苷酸分子能够形成三元复合物，其中当第一未标记的核苷酸分子与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基不互补时，所述引发的模板核酸分子和所述聚合酶能够形成二元复合物。所述方法还包括在所述第一未标记的核苷酸分子存在下并且在所述第一未标记的核苷酸分子没有化学掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的情况下监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用；以及通过所述监测的相互作用鉴定与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补的核苷酸。任选地，所述接触在使三元复合物的形成稳定和/或使二元复合物的形成不稳定的条件下发生。这些步骤可以重复一次或多次。举例来说，所述接触步骤和监测步骤可以重复一次或多次。任选地，使用第一反应混合物重复接触步骤和监测步骤。任选地，使用包含聚合酶和第二未标记的核苷酸分子的第二反应混合物重复接触步骤和监测步骤。任选地，使用包含聚合酶和第三未标记的核苷酸分子的第三反应混合物重复接触步骤和监测步骤。任选地，使用包含聚合酶和第四未标记的核苷酸分子的第四反应混合物重复接触步骤和监测步骤。任选地，接触在使二元复合物的形成不稳定的条件下发生。

还提供了一种用于对模板核酸分子进行测序的方法，所述方法包括检查步骤，所述检查步骤包括提供用引物引发的模板核酸分子；使所述引发的模板核酸分子与包含未标记的聚合酶、第一未标记的核苷酸分子以及第二未标记的核苷酸分子的反应混合物接触，所述第一未标记的核苷酸分子和所述第二未标记的核苷酸分子是不同的并且以不同的浓度存在于所述反应混合物中，其中当所述第一未标记的核苷酸分子和/或第二未标记的核苷酸分子与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补时，所述引发的模板核酸分子、所述未标记的聚合酶以及所述第一未标记的核苷酸分子和/或第二未标记的核苷酸分子能够形成三元复合物，其中当所述第一未标记的核苷酸分子和/或第二未标记的核苷酸分子与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基不互补时，所述引发的模板核酸分子和所述未标记的聚合酶能够形成二元复合物。任选地，所述接触在使所述三元复合物的形成稳定的条件下发生。所述方法还包括在所述第一未标记的核苷酸分子和所述第二未标记的核苷酸分子存在下，并且在所述第一未标记的核苷酸分子或所述第二未标记的核苷酸分子没有化学掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的情况下监测所述未标记的聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用；以及通过步骤(c)的监测的相互作用鉴定与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补的核苷酸。任选地，所述反应混合物还包含第三未标记的核苷酸分子，其中所述第三未标记的核苷酸分子不同于所述第一未标记的核苷酸分子和所述第二未标记的核苷酸分子并且以与所述第一未标记的核苷酸分子和所述第二未标记的核苷酸分子不同的浓度存在于所述反应混合物中。任选地，所述反应混合物还包含第四未标记的核苷酸分子，其中所述第四未标记的核苷酸分子不同于所述第一未标记的核苷酸分子、所述第二未标记的核苷酸分子以及所述第三未标记的核苷酸分子并且以与所述第一未标记的核苷酸分子、所述第二未标记的核苷酸分子以及所述第三未标记的核苷酸分子不同的浓度存在于所述反应混合物中。任选地，所述第一反应混合物包含能够掺入到引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第一未标记的核苷酸分子以及不能掺入到引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第一未标记的核苷酸分子。任选地，所述第二反应混合物包含能够掺入到引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第二未标记的核苷酸分子以及不能掺入到引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第二未标记的核苷酸分子。任选地，所述第三反应混合物包含能够掺入到引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第三未标记的核苷酸分子以及不能掺入到引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第三未标记的核苷酸分子。任选地，所述第四反应混合物包含能够掺入到引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第四未标记的核苷酸分子以及不能掺入到引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第四未标记的核苷酸分子。

任选地，所提供的方法还包括洗涤步骤。所述洗涤步骤可以在所述方法中的任何其他步骤之前或之后进行。任选地，所述洗涤步骤在所述监测步骤之前和/或在所述鉴定步骤之前进行。任选地，所述洗涤步骤去除任何二元复合物。任选地，所述洗涤步骤在使所述三元复合物稳定的条件下发生。任选地，所述条件包括稳定剂。任选地，所述稳定剂是非催化性金属离子。任选地，所述非催化性金属离子是锶、锡、或镍。任选地，所述三元复合物具有半衰期并且其中将所述洗涤步骤进行比三元复合物的半衰期短的持续时间，所述三元复合物在未标记的核苷酸分子提供与引发的模板核酸分子的下一个碱基互补的碱基时形成。

任选地，还包括在步骤(d)之后的重新上样步骤，所述重新上样步骤包括在使三元复合物稳定的条件下使所述引发的模板核酸与包含聚合酶和第一未标记的核苷酸分子或任选的第二未标记的核苷酸分子、第三未标记的核苷酸分子以及第四未标记的核苷酸分子的重新上样混合物接触。

任选地，本文提供的方法还包括掺入步骤。举例来说，所述掺入步骤包括使与模板核酸的下一个碱基互补的单个未标记的核苷酸掺入到引发的模板核酸分子的引物中。任选地，所述掺入步骤包括使引发的模板核酸分子、聚合酶以及核苷酸与掺入反应混合物接触。所述掺入反应混合物任选地包含催化性金属离子。所提供的方法还可以包括在掺入步骤之后制备引发的模板核酸分子以用于进行下一个检查步骤。任选地，所述制备包括使引发的模板核酸或核酸/聚合酶复合物经历一个或多个洗涤步骤；温度变化；机械振动；pH值变化；或光刺激。任选地，所述洗涤步骤包括使引发的模板核酸或引发的模板核酸/聚合酶复合物与能够释放聚合酶内的内部交联或聚合酶与核酸之间的交联的一种或多种缓冲剂、洗涤剂、蛋白质变性剂、蛋白酶、氧化剂、还原剂、或其他试剂接触。任选地，所述方法还包括重复所述检查步骤和所述掺入步骤以对模板核酸分子进行测序。可以在进行掺入步骤之前将检查步骤重复一次或多次。任选地，两个连续的检查步骤包括具有不同的未标记的核苷酸分子的反应混合物。任选地，在使单个未标记的核苷酸掺入到引发的模板核酸分子中之前，将第一反应混合物替换为包含聚合酶以及1种、2种、3种、或4种类型的未标记的核苷酸分子的第二反应混合物。任选地，所述核苷酸分子选自dATP、dTTP、dCTP、以及dGTP。

在所提供的测序方法中，所述至少一种未标记的核苷酸包含3′羟基，它可以是例如游离3′羟基。任选地，所述至少一种未标记的核苷酸分子的3′羟基被修饰以包含3′终止子部分。所述3′终止子部分可以是可逆的终止子或可以是不可逆的终止子。任选地，在检查步骤之后置换或去除所述至少一种未标记的核苷酸分子的可逆的终止子。

在本文提供的测序方法中，所述聚合酶在所述至少一种未标记的核苷酸分子存在下与引发的模板核酸分子相互作用以形成封闭的复合物。任选地，所述未标记的核苷酸分子是与模板核酸分子的碱基互补的核苷酸，所述碱基在引发的模板核酸分子中引物的3′末端的下游。任选地，所述未标记的核苷酸分子是下一个正确的核苷酸；其中所述下一个正确的核苷酸是与模板核酸分子的碱基互补的核苷酸，所述碱基在引发的模板核酸分子中引物的3′末端的下游，并且所述封闭的复合物是包含引发的模板核酸分子、聚合酶、以及下一个正确的核苷酸的三元封闭复合物。任选地，三元封闭复合物的形成相对于引发的模板核酸与聚合酶之间的二元复合物的形成是有利的。当第一反应混合物包含高浓度的盐时，三元封闭复合物的形成相对于二元复合物的形成可能是有利的。任选地，所述第一反应混合物包含50mM至1500mM的盐。当第一反应混合物包含具有高pH值的缓冲液时，三元封闭复合物的形成相对于二元复合物的形成可能是有利的。任选地，所述pH值是7.4至9.0。对于从嗜极生物环境提取的某些聚合酶，当第一反应混合物包含具有低pH值的缓冲液时，三元封闭复合物的形成相对于二元复合物的形成可能是有利的。任选地，所述pH值是4.0-7.0。也可以使用反应温度和/或有机添加剂和无机添加剂来调节聚合酶与引发的模板核酸分子之间的亲和力。

在本文提供的测序方法中，第一反应混合物可以包括1种、2种、3种、或4种类型的未标记的核苷酸分子。任选地，所述核苷酸选自dATP、dTTP、dCTP、以及dGTP。任选地，所述反应混合物包含一种或多种三磷酸核苷酸和一种或多种二磷酸核苷酸。任选地，封闭的复合物是在引发的模板核酸、聚合酶、以及四种未标记的核苷酸分子中的任一种之间形成的，因此可以形成四种类型的封闭复合物。包含聚合酶、引发的模板核酸以及核苷酸的封闭复合物在本文可以被称作三元封闭复合物或三元复合物。三元复合物和三元封闭复合物在本文可互换使用。

在未标记的核苷酸分子存在下监测聚合酶与引发的模板核酸分子的相互作用可以包括测量引发的模板核酸、聚合酶、以及四种未标记的核苷酸分子中的任一种之间的相互作用的缔合动力学。在未标记的核苷酸分子存在下监测聚合酶与引发的模板核酸分子的相互作用可以包括测量聚合酶与引发的模板核酸分子之间的平衡结合常数，即在四种未标记的核苷酸中的任一种存在下聚合酶与模板核酸的平衡结合常数。因此，举例来说，所述监测包括在四种未标记的核苷酸中的任一种存在下测量聚合酶与引发的模板核酸的平衡结合常数。在未标记的核苷酸分子存在下监测聚合酶与引发的模板核酸分子的相互作用包括在四种未标记的核苷酸中的任一种存在下测量聚合酶从引发的模板核酸的解离动力学。任选地，在未标记的核苷酸分子存在下监测聚合酶与引发的模板核酸分子的相互作用包括测量封闭复合物的解离的解离动力学，即引发的模板核酸、聚合酶、以及四种未标记的核苷酸分子中的任一种的解离。任选地，所测量的缔合动力学是不同的，这取决于未标记的核苷酸分子的身份。任选地，聚合酶对四种类型的未标记的核苷酸分子中的每一种具有不同的亲和力。任选地，聚合酶对每一种类型的封闭复合物中的四种类型的未标记核苷酸分子中的每一种具有不同的解离常数。缔合动力学、平衡动力学以及解离动力学是已知的并且可以容易地由本领域技术人员来测定。参见例如Markiewicz等人，Nucleic Acids Research 40(16)：7975-84(2012)；Xia等人，J.Am.Chem.Soc.135(1)：193-202(2013)；Brown等人，J.Nucleic Acids，文章ID 871939，11页(2010)；Washington等人，Mol.Cell.Biol.24(2)：936-43(2004)；Walsh和Beuning，J.Nucleic Acids，文章ID 530963，17页(2012)；以及Roettger等人，Biochemistry 47(37)：9718-9727(2008)，这些参考文献以引用的方式整体并入本文。因此，所述监测步骤可以包括在所述第一未标记的核苷酸分子存在下，在所述第一未标记的核苷酸分子没有化学掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的情况下，监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的稳态相互作用。任选地，所述监测包括在所述第一未标记的核苷酸分子存在下，在所述第一未标记的核苷酸分子没有化学掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的情况下，监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的解离。任选地，所述监测包括在所述第一未标记的核苷酸分子存在下，在所述第一未标记的核苷酸分子没有化学掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的情况下，监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的缔合。

在本文提供的测序方法中，在反应混合物中不存在催化性金属离子或在聚合酶的活性位点中不存在催化性金属离子防止了所述核苷酸分子化学掺入到所述引发的模板核酸中。任选地，所述第一反应混合物中催化性金属离子的螯合防止了所述核苷酸分子化学掺入到所述引发的模板核酸中。任选地，所述非催化性金属离子在下一个正确的核苷酸存在下用作三元封闭复合物的稳定剂。任选地，用非催化性金属离子代替第一反应混合物中的催化性金属离子防止了所述核苷酸分子化学掺入到所述引发的模板核酸中。任选地，所述催化性金属离子是镁。聚合酶的金属离子机制假定，可能需要低浓度的金属离子来使聚合酶-核苷酸-DNA结合相互作用稳定。参见例如部分27.2.2，Berg JM，Tymoczko JL，StryerL，Biochemistry第5版，WH Freeman Press，2002。如本文所用，催化性金属离子指的是在核酸(例如引物)的3′OH与进入的核苷酸的磷酸之间的磷酸二酯键形成所需的金属离子。一种或多种金属离子的浓度指的是在核酸(例如引物)的3′OH与进入的核苷酸的磷酸之间的磷酸二酯键形成所需的一种或多种金属离子的量。任选地，第一反应混合物中低浓度的催化性离子防止了所述核苷酸分子化学掺入到所述引发的模板核酸中。任选地，低浓度是约1μM至约100μM。任选地，低浓度是约0.5μM至约5μM。任选地，所述第一反应混合物包含钴并且所述掺入包括与掺入反应混合物接触，所述掺入反应混合物包含与所述第一反应混合物中钴的浓度相比更高浓度的钴。

任选地，包括掺入反应混合物在内的所提供的反应混合物包括至少一种未标记的核苷酸分子，所述至少一种未标记的核苷酸分子是不可掺入的核苷酸或不能掺入到核酸链中的核苷酸。换句话说，所提供的反应混合物可以包括不能掺入到引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种未标记的核苷酸分子。这样的不能掺入的核苷酸包括例如核苷酸二磷酸。举例来说，所述核苷酸可以含有对三磷酸基团的修饰，所述修饰使得所述核苷酸是不可掺入的。不可掺入的核苷酸的实例可以见于美国专利号7,482,120中，该美国专利以引用的方式整体并入本文。任选地，所述引物可以在它的3′末端处不含游离羟基，这不能掺入核苷酸，并且因此使得任何核苷酸是不可掺入的。

在本文提供的测序方法中，如果需要的话，可以利用向第一反应混合物中添加聚合酶抑制剂以在结合下一个正确核苷酸时截留核酸上的聚合酶。任选地，所述聚合酶抑制剂是焦磷酸类似物。任选地，所述聚合酶抑制剂是变构抑制剂。任选地，所述聚合酶抑制剂与催化性离子竞争聚合酶中的结合位点。任选地，所述聚合酶抑制剂是逆转录酶抑制剂。所述聚合酶抑制剂可以是HIV-1逆转录酶抑制剂或HIV-2逆转录酶抑制剂。所述HIV-1逆转录酶抑制剂可以是(4/6-卤素/MeO/EtO取代的苯并[d]噻唑-2-基)噻唑烷-4-酮。

任选地，所述模板核酸被固定到表面上。所述表面可以是平面基底、水凝胶、纳米孔阵列、微粒、或纳米颗粒。任选地，所述第一反应混合物包含多种克隆扩增的模板核酸分子。任选地，所述第一反应混合物包含多种可区分的模板核酸。

如本文所用，核酸是多核苷酸，如DNA、RNA、或其任何组合，其可以在核酸合成期间由聚合酶作用于其上。RNA可以包括编码RNA，例如信使RNA(mRNA)。任选地，所述RNA是非编码RNA。任选地，所述非编码RNA是转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、snoRNA、微RNA、siRNA、snRNA、exRNA、piRNA以及长ncRNA。核酸可以是单链的或双链的。任选地，双链核酸是有利的，这是因为它们使可能妨碍核酸合成的二级结构减到最低限度。双链核酸可以具有单链切口或缺口。测序可以通过使用具有5′-3′核酸外切酶活性(切口平移)或链置换活性的聚合酶从游离的3′-羟基末端开始。任选地，可以使用不同的聚合酶来进行切口平移或链置换和边结合边测序。任选地，所述双链核酸可以具有单链切口或缺口，其中所述切口或缺口的5′末端是单链flap。核酸可以代表单个、多个或克隆扩增的核酸分子群体。

模板核酸是待使用本文所公开的任何测序方法测序的核酸。可以用引物引发模板核酸，其中所述引物是具有5′末端和3′末端并且具有与所述模板核酸的至少一部分互补的序列的寡核苷酸。所述引发的模板核酸包含与模板核酸结合的互补引物。任选地，模板核酸指的是引发的模板核酸，特别是在提到模板核酸、聚合酶以及核苷酸之间的复合物时。紧邻位于与模板核酸结合的引物的3′末端的下游的模板核酸核苷酸被称为下一个模板核苷酸或下一个碱基。与下一个碱基互补的核苷酸被称为下一个正确的核苷酸。与下一个碱基不互补的核苷酸被称为不正确的核苷酸。

任选地，所述模板是双链核酸分子。因此，还提供了一种用于对双链核酸分子进行测序的方法，所述方法包括检查步骤，所述检查步骤包括提供包含第一模板核酸链和包含切口或缺口的第二核酸链的双链核酸分子；使所述双链核酸分子与包含聚合酶和至少一种未标记的核苷酸分子的第一反应混合物在使在所述核苷酸与第一模板核酸链的下一个碱基互补时在聚合酶、双链核酸分子以及核苷酸之间形成的三元复合物的形成稳定的条件下接触；在所述未标记的核苷酸分子存在下，在所述核苷酸分子不掺入到第二链中的情况下监测所述聚合酶与所述第一模板核酸链的相互作用；以及基于所监测的相互作用鉴定模板核酸链中的下一个碱基。任选地，所述聚合酶具有链置换活性。任选地，所述双链核酸分子的第二链包含flap。

如本文所用，核苷酸指的是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷、修饰的核苷酸、或构成模板核酸或正被合成作为测序过程的一部分的核酸的任何单体组分。核苷酸包含含氮碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)、以及至少一个磷酸基团。任选地，所述磷酸基团被某一部分修饰。所述部分可以包括可检测的标记。任选地，核苷酸的3′OH基团被某一部分修饰。所述部分可以是3′可逆终止子或不可逆终止子。核苷酸可以是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、或尿嘧啶。任选地，核苷酸具有肌苷碱基、黄嘌呤碱基、次黄嘌呤碱基、异胞嘧啶碱基、异鸟嘌呤碱基、硝基吡咯(包括3-硝基吡咯)碱基或硝基吲哚(包括5-硝基吲哚)碱基。核苷酸可以包括但不限于ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP、以及dGMP。核苷酸还可以含有DNA聚合酶的终止抑制剂二脱氧核苷酸或2′，3′-二脱氧核苷酸，它们被缩写成ddNTP(ddGTP、ddATP、ddTTP以及ddCTP)。

如本文所用，聚合酶是核酸合成酶的通用术语，包括但不限于DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、引发酶以及转移酶。通常，所述聚合酶包含可以发生核苷酸结合和/或核苷酸聚合的催化的一个或多个活性位点。所述聚合酶可以催化核苷酸聚合到与核苷酸的互补核酸链结合的引物的3′末端。举例来说，聚合酶催化下一个正确的核苷酸经由磷酸二酯键添加到引物的3′OH基团上，从而使所述核苷酸化学掺入到引物中。任选地，用于所提供的方法中的聚合酶是持续性聚合酶(processive polymerase)。任选地，用于所提供的方法中的聚合酶是分配性聚合酶(distributive polymerase)。

聚合酶可以包括天然存在的聚合酶和其任何修饰的变型，包括但不限于突变体、重组体、融合体、遗传修饰、化学修饰、合成物、以及类似物。天然存在的聚合酶和其修饰变型不限于保留催化聚合反应的能力的聚合酶。任选地，其天然存在的和/或修饰的变型保留催化聚合反应的能力。任选地，天然存在的和/或修饰的变型具有增强它们对DNA进行测序的能力的特殊特性，包括增强的对核酸的结合亲和力、降低的对核酸的结合亲和力、提高的催化速率、降低的催化速率等。突变型聚合酶包括其中一个或多个氨基酸被其他氨基酸(天然存在的或非天然存在的)置换、以及插入或缺失一个或多个氨基酸的聚合酶。修饰的聚合酶包括含有外部标签的聚合酶，所述外部标签可以用于监测所述聚合酶的存在和相互作用。任选地，可以使用来自聚合酶的固有信号来监测它们的存在和相互作用。因此，所提供的方法可以包括经由检测来自聚合酶的固有信号来监测聚合酶、核苷酸以及模板核酸的相互作用。任选地，所述固有信号是光散射信号。举例来说，固有信号包括诸如色氨酸的某些氨基酸的天然荧光，其中来自聚合酶的固有信号的变化可以指示封闭复合物的形成。因此，在所提供的方法中，所述聚合酶是未标记的聚合酶并且在不存在与聚合酶缔合的可检测的标记的情况下进行监测。一些修饰的聚合酶或天然存在的聚合酶在特定的反应条件下可以仅掺入单个核苷酸并且可以在单个核苷酸掺入之后仍与引物-模板结合。任选地，所述聚合酶的拇指状结构域和手指状结构域由于它们在聚合酶的封闭形式中的物理接近而可以形成瞬时或共价交联。所述交联可以例如通过拇指状结构域和手指状结构域上合适的位置处的天然或工程改造的半胱氨酸形成。

如本文所用的术语聚合酶和它的变体还指的是包含例如彼此连接的至少两个部分(portion)的融合蛋白，其中一个部分包含可以催化核苷酸聚合到核酸链中的肽，所述一个部分与另一个部分连接，所述另一个部分包含第二部分(moiety)，如报告酶或持续合成能力修饰结构域(processivity-modifying domain)。举例来说，T7 DNA聚合酶包含核酸聚合结构域和硫氧还蛋白结合结构域，其中硫氧还蛋白结合增强聚合酶的持续合成能力。在不存在硫氧还蛋白结合的情况下，T7 DNA聚合酶是仅具有一个至几个碱基的持续合成能力的分配性聚合酶。尽管DNA聚合酶在细节上是不同的，但是它们具有类似的手状结构的总体形状，所述手状结构具有被称为手指状结构、手掌状结构、以及拇指状结构的特定区域；以及类似的在核酸合成期间的总体结构转变，包括拇指状结构域和/或手指状结构域的移动。

DNA聚合酶包括但不限于细菌DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶、古细菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶以及噬菌体DNA聚合酶。细菌DNA聚合酶包括大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III、IV以及V、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、粪堆梭菌(Clostridium stercorarium，Cst)DNA聚合酶、热纤梭菌(Clostridium thermocellum，Cth)DNA聚合酶以及硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus，Sso)DNA聚合酶。真核生物DNA聚合酶包括DNA聚合酶α、β、γ、δ、

η、ζ、λ、σ、μ、和κ以及Revl聚合酶(末端脱氧胞苷酰转移酶)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。病毒DNA聚合酶包括T4 DNA聚合酶、

DNA聚合酶、GA-l、

样DNA聚合酶、PZADNA聚合酶、

DNA聚合酶、Cp1 DNA聚合酶、Cp7 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、以及T4聚合酶。古细菌DNA聚合酶包括热稳定性和/或嗜热性DNA聚合酶，如从以下各项分离的DNA聚合酶：水生栖热菌(Thermus aquaticus，Tag)DNA聚合酶、丝状栖热菌(Thermus filiformis，Tfi)DNA聚合酶、兹里奇热球菌(Thermococcus zilligi，Tzi)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，Tth)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavusu，Tfl)DNA聚合酶、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei，Pwo)DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus，Pfu)DNA聚合酶和Turbo Pfu DNA聚合酶、海滨热球菌(Thermococcus litoralis，Tli)DNA聚合酶、火球菌属菌种GB-D聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima，Tma)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus，Bst)DNA聚合酶、柯氏火球菌(PyrococcusKodakaraensis，KOD)DNA聚合酶、Pfx DNA聚合酶、热球菌属菌种JDF-3(JDF-3)DNA聚合酶、高氏热球菌(Thermococcus gorgonarius，Tgo)DNA聚合酶、嗜酸热球菌(Thermococcusacidophilium)DNA聚合酶；嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)DNA聚合酶；热球菌属菌种go N-7 DNA聚合酶；隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)DNA聚合酶；沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)DNA聚合酶；嗜热自养甲烷球菌(Methanococcusthermoautotrophicum)DNA聚合酶；詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)DNA聚合酶；除硫球菌属(Desulfurococcus)菌株TOK DNA聚合酶(D.Tok Pol)；深海火球菌(Pyrococcus abyssi)DNA聚合酶；掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)DNA聚合酶；海岛火球菌(Pyrococcus islandicum)DNA聚合酶；福氏热球菌(Thermococcus fumicolans)DNA聚合酶；敏捷气火菌(Aeropyrum pernix)DNA聚合酶；以及异二聚DNA聚合酶DP1/DP2。

RNA聚合酶包括但不限于病毒RNA聚合酶，如T7RNA聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶、以及Kll聚合酶；真核生物RNA聚合酶，如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV、以及RNA聚合酶V；以及古细菌RNA聚合酶。

逆转录酶包括但不限于来自1型人免疫缺陷病毒(PDB 1HMV)的HIV-1逆转录酶、来自2型人免疫缺陷病毒的HIV-2逆转录酶、来自莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒的M-MLV逆转录酶、来自禽成髓细胞瘤病毒的AMV逆转录酶、以及维持真核生物染色体的端粒的端粒酶逆转录酶。

如本文所用，核苷酸类似物可以瞬时结合聚合酶-引发的模板核酸复合物，但是在核酸聚合反应中是不可掺入的(或基本上不可掺入的)。如本文所用，核苷酸类似物可以结合聚合酶-引发的模板核酸复合物，并且在核酸聚合反应中被掺入(或基本上被掺入)。核苷酸类似物可能具有或可能不具有类似于天然核苷酸的结构，所述天然核苷酸包含含氮碱基、五碳糖、以及磷酸基团。修饰的核苷酸可以具有修饰，如部分，所述修饰置换和/或修饰天然核苷酸的组分中的任一种。不可掺入的核苷酸可以是α-磷酸修饰的核苷酸、α-β核苷酸类似物、β-磷酸修饰的核苷酸、β-γ核苷酸类似物、γ-磷酸修饰的核苷酸、笼锁核苷酸(caged nucleotide)、或ddNTP。核苷酸类似物的一些实例描述于美国专利号8,071,755中，该美国专利以引用的方式整体并入本文。

如本文所提到，阻隔部分(blocking moiety)在用于提到核苷酸时是核苷酸的一部分，该部分抑制或防止核苷酸在核酸聚合反应的掺入步骤期间与第二核苷酸(例如引物核苷酸的3′OH)形成共价键。所述阻隔部分可以从核苷酸中去除，从而允许核苷酸掺入。

如本文所用，下一个正确的核苷酸是与引发的模板核酸中引物的3′末端下游的下一个碱基互补的核苷酸。不正确的核苷酸是与模板核酸中引物的3′末端下游的下一个碱基不互补的核苷酸。

如本文所用，二元复合物是聚合酶与核酸之间的复合物。任选地，所述核酸是模板核酸。任选地，所述核酸是引发的模板核酸，其中所述聚合酶结合到引发的模板核酸中引物的3′末端处的聚合位点。复合物也可以在聚合酶与核苷酸之间形成，这在本文被称作“聚合酶-核苷酸复合物”或“聚合酶-核苷酸二元复合物”。如本文所用，三元复合物是聚合酶、核酸、以及核苷酸之间的复合物。任选地，所述核酸是待测序的模板核酸。任选地，三元复合物中的核酸是引发的模板核酸，其中所述聚合酶结合到引发的模板核酸中引物的3′末端处的聚合位点。催化性金属离子指的是聚合酶催化核酸(例如引物)的3′OH基团与进入的核苷酸的磷酸基团之间的反应所需的金属离子。催化性金属离子可以使聚合酶、核苷酸以及核酸之间的复合物的形成稳定所必需的浓度存在，这被称为金属离子的非催化浓度。金属离子的催化浓度指的是聚合酶催化核酸(例如引物)的3′OH基团与进入的核苷酸的磷酸基因之间的反应所需的金属离子的量。

在所提供的方法中，引发的模板核酸分子与包含聚合酶和一种或多种未标记的核苷酸分子的反应混合物的接触可以在使三元复合物的形成稳定的条件下发生。任选地，所述接触在使二元复合物的形成不稳定的条件下发生。任选地，所述条件包括使引发的核酸分子与调节渗透压的缓冲液接触。任选地，所述第一反应混合物包含调节渗透压的缓冲液。任选地，所述缓冲液是高盐缓冲液。任选地，所述缓冲液包含谷氨酸钾。任选地，使三元复合物的形成稳定的条件包括使引发的核酸分子与稳定剂接触。任选地，所述第一反应混合物包含稳定剂。任选地，所述稳定剂是非催化性金属离子。任选地，所述非催化性金属离子是锶、锡或镍。任选地，所述第一反应混合物包含0.01mM至30mM的氯化锶。

本文描述了基于聚合酶的核酸边结合边测序反应，其中所述聚合酶在所述反应的不连续步骤期间在开放式构象与封闭式构象之间经历构象转变。在一个步骤中，聚合酶与引发的模板核酸结合以形成二元复合物，这在本文也被称为插入前构象(pre-insertionconformation)。在随后的步骤中，进入的核苷酸结合并且聚合酶的手指状结构封闭，从而形成包含聚合酶、引发的模板核酸以及核苷酸的化学前构象(pre-chemistryconformation)；其中结合的核苷酸没有被掺入。该步骤在本文也被称为检查步骤，之后可以是化学步骤，其中形成磷酸二酯键，伴随焦磷酸从核苷酸裂解(核苷酸掺入)。聚合酶、引发的模板核酸以及新掺入的核苷酸产生化学后、平移前构象(post-chemistry，pre-translation conformation)。由于化学前构象和易位前构象这两者均包含聚合酶、引发的模板核酸以及核苷酸，其中所述聚合酶处在封闭状态，因此任一种构象在本文均可以被称为封闭复合物或三元封闭复合物。在封闭的插入前状态下，二价催化性金属离子，如Mg²⁺介导快速的化学步骤，该步骤涉及焦磷酸(PPi)被引物末端的3′羟基亲核置换。在释放PPi时聚合酶返回到开放状态，即易位后步骤，并且易位引发下一轮反应。虽然封闭复合物可以在不存在二价催化性金属离子(例如Mg²⁺)的情况下形成，但是在二价金属离子存在下对核苷酸进行化学添加是通晓的。低水平或不足水平的催化性金属离子，如Mg²⁺倾向于引起下一个正确的核苷酸在紧密的封闭复合物中的非共价(物理)隔离。该封闭复合物可以被称为稳定的或截留的封闭复合物。在上文所述的任何反应步骤中，聚合酶的构型和/或与核酸的相互作用可以在检查步骤期间被监测以鉴定核酸序列中的下一个正确的碱基。

如本文所用，核酸测序反应混合物或反应混合物包含通常存在于基于聚合酶的核酸合成反应中的试剂。反应混合物试剂包括但不限于酶(例如聚合酶)、dNTP、模板核酸、引物核酸、盐、缓冲液、小分子、辅因子、金属、以及离子。所述离子可以是催化性离子、二价催化性离子、非催化性离子、非共价金属离子、或其组合。所述反应混合物可以包含盐，如NaCl、KCl、乙酸钾、乙酸铵、谷氨酸钾、NH₄Cl、或(NH₄HSO₄)。所述反应混合物可以包含离子源，如Mg²⁺或Mn²⁺、乙酸镁、Co²⁺、Cd²⁺或Ba²⁺。所述反应混合物可以包含锡、Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Co^{2 +}、Fe(II)SO₄、或Ni²⁺。所述缓冲液可以包括Tris、Tricine、HEPES、MOPS、ACES、MES、基于磷酸盐的缓冲液、以及基于乙酸盐的缓冲液。所述反应混合物可以包含螯合剂，如EDTA、EGTA等。任选地，所述反应混合物包含交联试剂。本文提供了任选地在检查步骤期间使用的第一反应混合物以及在核苷酸掺入期间使用的掺入反应混合物，它们可以包括上述试剂中的一种或多种。在检查期间使用时第一反应混合物在本文可以被称为检查反应混合物。任选地，所述第一反应混合物包含高浓度的盐；高pH；1种、2种、3种、4种、或更多种类型的未标记的核苷酸；谷氨酸钾；螯合剂；聚合酶抑制剂；催化性金属离子；非催化性金属离子；或其任何组合。所述第一反应混合物可以包含10mM至1.6M的谷氨酸钾或10mM至1.6M的任何量。任选地，所述掺入反应混合物包含催化性金属离子；1种、2种、3种、4种、或更多种类型的未标记的核苷酸；氯化钾；非催化性金属离子；或其任何组合。

如本文所用，封闭复合物可以是聚合酶、引发的模板核酸、以及核苷酸之间的三元复合物。封闭复合物可以呈化学前构象，其中核苷酸被隔离，但是没有被掺入。封闭复合物可以呈易位前构象，其中核苷酸通过与引发的模板核酸中引物的3′末端形成磷酸二酯键而被掺入。封闭复合物可以在不存在催化性金属离子的情况下或在不足水平的催化性金属离子下形成，从而将下一个正确的核苷酸物理隔离在聚合酶活性位点内而没有发生化学掺入。任选地，所隔离的核苷酸可以是不可掺入的核苷酸。封闭复合物可以在催化性金属离子存在下形成，其中所述封闭复合物包含被掺入的核苷酸类似物，但是PPi不能释放。在这种情况下，封闭复合物在易位前构象中被稳定。任选地，通过化学交联聚合酶来使易位前构象稳定。任选地，可以通过外部手段来使封闭复合物稳定。在一些情况下，可以通过小分子的变构结合来使封闭复合物稳定。任选地，可以通过焦磷酸类似物来使封闭复合物稳定，所述焦磷酸类似物包括但不限于膦酰基甲酸，它们以高亲和力结合在接近活性位点处，从而防止聚合酶易位。

如本文所用，稳定的封闭复合物或稳定的三元复合物指的是通过包括但不限于以下各项的手段中的一种或组合截留在引发的模板核酸的聚合起始位点(引物的3′末端)处的聚合酶：使拇指状结构域和手指状结构域在封闭式构象中交联；结合防止聚合酶返回到开放式构象的变构抑制剂；结合在易位前步骤中截留聚合酶的焦磷酸类似物；在聚合酶的活性位点中不存在催化性金属离子；以及添加诸如镍、钡、锡以及锶的金属离子作为催化性金属离子的替代物。因而，聚合酶可以被截留在聚合起始位点处，甚至是在核苷酸掺入之后。因此，聚合酶可以在化学前构象、易位前步骤、易位后步骤或其任何中间步骤中被截留。因此，允许对下一个正确的核苷酸或碱基进行充分的检查和鉴定。

如本文所述，基于聚合酶的边结合边测序反应一般包括提供引发的模板核酸；向引发的模板核酸提供聚合酶和一种或多种类型的核苷酸，其中所述核苷酸可能与或可能不与引发的模板核酸的下一个碱基互补；以及在其中核苷酸向引发的模板核酸中的化学掺入在化学前构象中被禁止或严重抑制或者一个或多个互补核苷酸掺入在引物的3′末端处发生的条件下检查聚合酶与引发的模板核酸的相互作用。任选地，其中在核苷酸掺入之前优选地使用稳定剂使化学前构象稳定，可以在检查步骤后进行单独的掺入步骤以使单个核苷酸掺入到引物的3′末端。任选地，在单个核苷酸掺入发生的情况下，可以使易位前构象稳定以有助于检查和/或防止后续的核苷酸掺入。

尽管为了便于说明可以描述单个模板核酸分子，但是本文提供的测序方法容易涵盖多个模板核酸，其中所述多个核酸可以是单个核酸的克隆扩增的拷贝、或不同的核酸，包括组合，如克隆扩增的不同核酸的群体。

所提供的用于对核酸进行测序的方法包括检查步骤。所述检查步骤包括使聚合酶在包含一种或多种核苷酸的反应混合物中结合到引发的模板核酸的聚合起始位点；以及监测相互作用。任选地，在其中通过聚合酶掺入包封的核苷酸被减弱或抑制的条件下，核苷酸被隔离在聚合酶-引发的模板核酸复合物内以形成封闭复合物。任选地，添加稳定剂以在下一个正确的核苷酸存在下使三元复合物稳定。该封闭复合物呈稳定的或聚合酶截留的化学前构象。封闭复合物允许包封的核苷酸掺入，但是不允许后续的核苷酸掺入。该封闭复合物呈稳定的或截留的易位前构象。任选地，通过不限于以下各项的手段中的一种或组合将聚合酶在它的封闭复合物中截留在聚合位点处：使聚合酶结构域交联；使聚合酶与核酸交联；通过小分子进行变构抑制；无竞争性抑制剂；竞争性抑制剂；非竞争性抑制剂；以及变性；其中截留的封闭复合物的形成提供了有关核酸模板上的下一个碱基的身份的信息。

下一个正确碱基或核苷酸的身份可以通过监测三元复合物或封闭复合物的存在、形成、和/或解离来确定。下一个碱基的身份可以在没有使下一个正确的核苷酸化学掺入到引物的3′末端的情况下来确定。任选地，通过在添加的核苷酸存在下监测聚合酶对引发的核酸模板的亲和力来确定下一个碱基的身份。任选地，在下一个正确的核苷酸存在下，聚合酶对引发的模板核酸的亲和力可以用于确定模板核酸上的下一个正确的碱基。任选地，在不正确的核苷酸存在下，聚合酶对引发的核酸模板的亲和力可以用于确定模板核酸上的下一个正确的碱基。

检查步骤可以部分地通过提供反应条件以防止核苷酸的化学掺入，同时允许确定核酸上的下一个碱基的身份来控制。这样的反应条件可以被称为检查反应条件。任选地，在检查条件下形成三元复合物或封闭复合物。任选地，在检查条件下或以化学前构象形成稳定的三元复合物或封闭复合物。任选地，稳定的封闭复合物呈易位前构象，其中包封的核苷酸已经被掺入，但是封闭复合物不允许后续的核苷酸掺入。任选地，所述检查条件突出了在不同的核苷酸存在下聚合酶对引发的模板核酸的亲和力的差异。任选地，所述检查条件引起在不同的核苷酸存在下聚合酶对引发的模板核酸的差别亲和力。举例来说，引起在不同的核苷酸存在下聚合酶对引发的模板核酸的差别亲和力的检查条件包括但不限于高盐和谷氨酸钾。可以用于改变聚合酶对引发的模板核酸的亲和力的谷氨酸钾的浓度包括10mM至1.6M的谷氨酸钾或介于10mM和1.6M之间的任何量。任选地，高盐指的是50mM至1500mM盐的盐浓度。

检查通常包括检测聚合酶与模板核酸的相互作用。检测可以包括光学、电学、热学、声学、化学以及机械手段。任选地，在洗涤步骤之后进行检查，其中所述洗涤步骤从观测区去除任何未结合的试剂，例如未结合的聚合酶和/或核苷酸。任选地，在洗涤步骤期间进行检查，以使得可以使用聚合酶-核酸或聚合酶-核酸-核苷酸复合物的解离动力学来确定下一个碱基的身份。任选地，在添加检查反应混合物或第一反应混合物的过程中进行检查，以使得可以使用聚合酶与核酸的缔合动力学来确定核酸上的下一个碱基的身份。任选地，检查包括将封闭复合物与聚合酶和核酸的二元复合物相区分。任选地，在平衡条件下进行检查，其中所测量的亲和力是平衡亲和力。可以依次进行包括不同的或相似的检查试剂的多个检查步骤以确定下一个模板碱基的身份。在其中多个模板核酸正同时在一个测序反应中被测序的情况下，可以利用多个检查步骤，其中不同的核酸对不同的检查试剂的反应不同。任选地，多个检查步骤可以提高下一个碱基确定的准确度。

本文所述的测序方法任选地包括掺入步骤。所述掺入步骤包括在与模板核酸结合的引物的3′末端处化学掺入一个或多个核苷酸。任选地，在引物的3′末端处掺入单个核苷酸或多个核苷酸。任选地，在引物的3′末端处掺入同一种类的多个核苷酸。任选地，在引物的3′末端处掺入不同种类的多个核苷酸。聚合酶可以在核苷酸掺入之后从聚合起始位点解离或可以在掺入之后保留在聚合起始位点处。因此，举例来说，聚合酶可以在掺入反应之后以易位前状态、易位后状态、其中间状态、或二元复合物状态被截留在引物的3′末端处。可以通过掺入反应混合物来使掺入反应成为可能。任选地，所述掺入反应混合物包含与检查反应不同的核苷酸组成。举例来说，所述检查反应包括一种类型的核苷酸并且所述掺入反应包括另一种类型的核苷酸。作为另一个实例，检查反应包括一种类型的核苷酸并且掺入反应包括四种类型的核苷酸，或反之亦然。任选地，检查反应混合物由掺入反应混合物改变或替代。任选地，掺入反应混合物包含催化性金属离子、氯化钾、或其组合。

存在于反应混合物中，但是没有被隔离在封闭复合物中的核苷酸可能引起多个核苷酸插入。因此，在化学掺入步骤之前可以使用洗涤步骤来确保在掺入步骤期间只有被隔离在截留的封闭复合物内的核苷酸可用于掺入。任选地，可以通过诸如磷酸酶的酶来去除游离核苷酸。截留的聚合酶复合物可以是涉及聚合酶、引发的模板核酸以及下一个正确的核苷酸的封闭复合物、稳定的封闭复合物或三元复合物。

任选地，被包封在检查步骤的封闭复合物内的核苷酸在掺入步骤期间被掺入到模板核酸引物的3′末端中。举例来说，检查步骤的稳定的封闭复合物包含所掺入的下一个正确的核苷酸。任选地，被包封在检查步骤的封闭复合物内的核苷酸在检查步骤期间被掺入，但是封闭复合物不允许后续的核苷酸掺入；在这种情况下，封闭复合物在掺入步骤期间被释放，从而允许后续的核苷酸被掺入。

任选地，所述掺入步骤包括置换来自检查步骤的核苷酸(例如所述核苷酸是不正确的核苷酸)以及将另一个核苷酸掺入到模板核酸引物的3′末端中。所述掺入步骤可以包括从封闭复合物内释放核苷酸(例如所述核苷酸是修饰的核苷酸或核苷酸类似物)以及将不同种类的核苷酸掺入到模板核酸引物的3′末端。任选地，释放的核苷酸被去除并且用包含下一个正确核苷酸的掺入反应混合物置换。

用于掺入的合适的反应条件可以包括用掺入反应混合物代替检查反应混合物。任选地，用掺入反应混合物中的一种或多种核苷酸代替检查反应混合物中存在的核苷酸。任选地，在掺入步骤期间代替在检查步骤期间存在的聚合酶。任选地，在掺入步骤期间修饰在检查步骤期间存在的聚合酶。任选地，在掺入步骤期间修饰在检查步骤期间存在的一种或多种核苷酸。可以在掺入步骤期间通过任何手段改变在检查步骤期间存在的反应混合物和/或反应条件。这些手段包括但不限于去除试剂、螯合试剂、稀释试剂、添加试剂、改变诸如电导率或pH值等反应条件、以及其任何组合。反应混合物中的试剂，包括聚合酶、引发的模板核酸、和核苷酸的任何组合以及每一种，可以在检查步骤和/或掺入步骤期间被修饰。

任选地，掺入步骤包括竞争性抑制剂，其中所述竞争性抑制剂减少多重掺入的发生。在一个实施方案中，所述竞争性抑制剂是不可掺入的核苷酸。在一个实施方案中，所述竞争性抑制剂是氨基糖苷。所述竞争性抑制剂能够代替活性位点中的核苷酸或催化性金属离子，以使得在第一次掺入之后，竞争性抑制剂占据活性位点，从而防止第二次掺入。在一些实施方案中，在掺入步骤中引入可掺入的核苷酸和竞争性抑制剂这两者，以使得可掺入的核苷酸与抑制剂的比率可以被调节以确保单个核苷酸在引物的3′末端处掺入。

在所提供的测序方法中，在掺入步骤之前鉴定下一个碱基，从而允许掺入步骤不需要标记的试剂和/或监测。因此，在所提供的方法中，核苷酸任选地不含连接的可检测的标签或标记。任选地，核苷酸含有可检测的标记，但是所述标记在所述方法中不被检测。任选地，正确的核苷酸不含可检测的标记；然而，不正确的或与下一个碱基非互补的核苷酸含有可检测的标记。

在掺入步骤之前可以将测序反应的检查步骤重复1次、2次、3次、4次或更多次。可以重复检查步骤和掺入步骤直到获得模板核酸的所期望的序列为止。

封闭复合物或稳定的封闭复合物的形成可以用于确保每个测序循环只有一个核苷酸被添加到模板核酸引物中，其中所添加的核苷酸被隔离在封闭复合物内。每个测序循环单个核苷酸的受控掺入提高了包含均聚物重复序列的核酸区域的测序准确度。

任选地，在所提供的方法中，在一个或多个检查步骤和/或掺入步骤之后，添加核苷酸的子组以减少或重置碱基掉队现象(phasing)。因此，所述方法可以包括使正被测序的模板核酸分子与包含核苷酸的子组和酶的组合物接触以使所述核苷酸掺入到与核酸分子的模板链反向的链中的一个或多个步骤。所述接触可以在减少核酸分子中的碱基掉队现象的条件下发生。任选地，接触模板核酸分子的步骤在掺入步骤之后和/或在检查步骤之后发生。任选地，所述接触在1轮、2轮、3轮、4轮、5轮、6轮、7轮、8轮、9轮、10轮、15轮、20轮、25轮、30轮、35轮、40轮、45轮、50轮、60轮、65轮、70轮、75轮、80轮、85轮、90轮、95轮、或100轮或更多轮的测序，即这么多轮的检查和掺入之后发生。任选地，所述接触在30轮至60轮的测序之后发生。任选地，所述接触在每一轮测序之后，即在一个检查步骤和掺入步骤之后发生。任选地，在每一轮测序之后进行多个接触步骤，其中每一个接触步骤可以包括不同的核苷酸子组。任选地，所述方法还包括在接触之后的一个或多个洗涤步骤。任选地，所述子组包含两种或三种核苷酸。任选地，所述子组包含三种核苷酸。任选地，核苷酸的子组选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP或其衍生物中的三种。任选地，这三种核苷酸包括腺苷、胞嘧啶、以及鸟嘌呤。任选地，这三种核苷酸包括腺苷、胞嘧啶、以及胸腺嘧啶。任选地，这三种核苷酸包括胞嘧啶、鸟嘌呤以及胸腺嘧啶。任选地，这三种核苷酸包括腺苷、鸟嘌呤以及胸腺嘧啶。任选地，每一轮接触包括相同的核苷酸子组或不同的核苷酸子组。任选地，监测对核酸模板的测序并且与核苷酸子组的接触在检测到碱基掉队现象时进行。还参见例如美国专利号8,236,532，该美国专利以引用的方式整体并入本文。

任选地，所述测序反应涉及多种模板核酸、聚合酶和/或核苷酸，其中监测多种封闭复合物。可以对克隆扩增的模板核酸共同测序，其中所述克隆被定位在非常接近的位置以允许在测序期间增强的监测。任选地，封闭复合物的形成确保了在多个克隆扩增的模板核酸间碱基延伸的同步性。碱基延伸的同步性允许每个测序循环仅添加一个碱基。

所提供的方法可以在平台上进行，其中核酸聚合反应的任何组分被定位到表面上。任选地，模板核酸连接到平面基底、纳米孔阵列、微粒、或纳米颗粒。任选地，所有反应组分自由地悬浮在反应混合物中。

在调节在检查步骤期间封闭复合物的形成和稳定的反应条件下进行所提供的方法。检查步骤的反应条件有利于封装核苷酸的封闭复合物的形成和/或稳定并且妨碍二元复合物的形成和/或稳定。聚合酶与模板核酸之间的二元相互作用可以通过调节测序反应参数，如离子强度、pH值、温度、或其任何组合、或通过向反应中添加二元复合物去稳定剂来操纵。任选地，利用高盐(例如50mM至1500mM)和/或pH值变化来使二元复合物不稳定。任选地，二元复合物可以在测序反应的检查步骤或掺入步骤期间在聚合酶与模板核酸之间形成，而与核苷酸的存在无关。任选地，所述反应条件有利于三元封闭复合物的稳定和二元复合物的去稳定。举例来说，可以将检查反应混合物的pH值从4.0调节到10.0以有利于三元封闭复合物的稳定和二元复合物的去稳定。任选地，检查反应混合物的pH值是4.0至6.0。任选地，检查反应混合物的pH值是6.0至10.0。

本文所公开的所提供的测序方法以揭示下一个碱基的身份，同时控制核苷酸的化学添加的方式促进聚合酶与核苷酸和模板核酸的相互作用。任选地，所述方法是在不存在可检测标记的核苷酸的情况下或在标记的核苷酸存在下进行的，其中所述标记不被检测。

本文提供了用于在检查反应混合物条件下形成封闭复合物和/或使其稳定的方法，所述封闭复合物包含与引发的模板核酸和核苷酸结合的聚合酶，所述核苷酸被包封在聚合酶-模板核酸复合物内。检查反应条件可以抑制或减弱核苷酸掺入。任选地，包封的核苷酸的掺入被抑制并且所述使复合物以化学前构象或三元复合物稳定或截留。任选地，包封的核苷酸被掺入并且后续的核苷酸掺入被抑制。在这种情况下，使所述复合物以易位前构象稳定或截留。对于本文提供的测序反应，使封闭复合物在检查步骤期间稳定，从而允许受控的核苷酸掺入。任选地，稳定的封闭复合物是如下复合物，其中包封的核苷酸的掺入在检查步骤期间被瞬时减弱(例如以检查复合物，然后掺入所述核苷酸)或永久减弱(例如仅用于检查)。任选地，稳定的封闭复合物允许包封的核苷酸的掺入，但是不允许后续的核苷酸的掺入。任选地，使封闭复合物稳定以在核苷酸存在下监测任何聚合酶与模板核酸的相互作用以鉴定模板核酸中的下一个碱基。

任选地，包封的核苷酸具有严重减少或禁止的与封闭复合物中的模板核酸的结合。任选地，包封的核苷酸与下一个碱基处的模板核酸进行碱基配对。任选地，聚合酶、核苷酸、引物、模板核酸、或其任何组合的身份影响封闭复合物中包封的核苷酸与模板核酸之间的相互作用。

任选地，包封的核苷酸与封闭复合物的聚合酶结合。任选地，包封的核苷酸与封闭复合物的聚合酶微弱缔合。任选地，聚合酶、核苷酸、引物、模板核酸、或其任何组合的身份影响封闭复合物中包封的核苷酸与聚合酶之间的相互作用。对于给定的聚合酶，每一种核苷酸对聚合酶具有与另一种核苷酸不同的亲和力。任选地，该亲和力部分地取决于模板核酸和/或引物。

封闭复合物可以瞬时形成。任选地，包封的核苷酸是下一个正确的核苷酸。在一些方法中，下一个正确的核苷酸的存在部分地有助于封闭复合物的稳定。任选地，包封的核苷酸不是下一个正确的核苷酸。

任选地，所述检查反应条件包括多种引发的模板核酸、聚合酶、核苷酸、或其任何组合。任选地，所述多种核苷酸包括1种、2种、3种、4种、或更多种类型的不同核苷酸，例如dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP。任选地，所述多个模板核酸是模板核酸的克隆群体。

检查反应混合物可以包括其他分子，包括但不限于酶。任选地，所述检查反应混合物包含核酸聚合反应中一般存在的任何试剂或生物分子。反应组分可以包括但不限于盐、缓冲剂、小分子、洗涤剂、拥挤剂(crowding agent)、金属、以及离子。任选地，反应混合物的特性可以例如用电力、用磁力、和/或用振动操纵。

任选地，封闭复合物在本文提供的测序方法的检查步骤期间瞬时形成。任选地，使封闭复合物在检查步骤期间被稳定。稳定的封闭复合物在检查步骤期间可能不允许在聚合反应中掺入核苷酸，这包括掺入包封的核苷酸和/或在包封的核苷酸之后掺入后续的核苷酸。可以调节封闭复合物的稳定性的反应条件包括但不限于催化性金属离子的可用性、次优或抑制性金属离子、离子强度、pH值、温度、聚合酶抑制剂、交联试剂、以及其任何组合。可以调节封闭复合物的稳定性的反应试剂包括但不限于不可掺入的核苷酸、不正确的核苷酸、核苷酸类似物、修饰的聚合酶、具有不可延伸的聚合起始位点的模板核酸、以及其任何组合。

任选地，封闭复合物从它的截留或稳定的构象释放，这可以允许核苷酸掺入到引物-模板核酸双链体中引物的3′末端。可以通过调节反应条件的组成来使封闭复合物不稳定和/或释放。此外，可以通过电学、磁性、和/或机械手段来使封闭复合物不稳定。机械手段包括机械搅拌，例如通过使用超声波搅拌。机械振动使封闭复合物不稳定并且抑制聚合酶与DNA结合。因此，不使用其中用掺入混合物代替检查反应混合物的洗涤步骤，而是可以使用机械搅拌来从模板核酸去除聚合酶，从而使得能够经由连续的掺入步骤进行循环，其中每个步骤添加单个核苷酸。

封闭复合物稳定或封闭复合物释放反应条件和/或方法的任何组合可以组合。举例来说，使封闭复合物稳定的聚合酶抑制剂可以存在于使用催化性离子的检查反应中，所述催化性离子的功能是释放封闭复合物。在上述实例中，使封闭复合物可以稳定或释放，这取决于聚合酶抑制剂的特性和浓度、催化性金属离子的浓度、反应混合物的其他试剂和/或条件、以及其任何组合。

可以使封闭复合物在其中核苷酸与引发的模板核酸中引物的3′末端的共价连接被减弱的反应条件下稳定。任选地，所述封闭复合物呈化学前构象或是三元复合物。任选地，所述封闭复合物呈易位前构象。这种封闭复合物的形成可以通过调节容许封闭复合物释放和/或核苷酸化学掺入到引物中的催化性金属离子在反应混合物中的可用性来被引发和/或使其稳定。示例性金属离子包括但不限于镁、锰、钴以及钡。催化性离子可以是任何制剂，例如盐，如MgCl₂、Mg(C₂H₃O₂)₂、以及MnCl₂。

催化性金属离子的选择和/或浓度可以基于测序反应中的聚合酶和/或核苷酸。举例来说，HIV逆转录酶利用镁进行核苷酸掺入(N Kaushik 1996 Biochemistry 35：11536-11546；以及H P Patel 1995 Biochemistry 34：5351-5363，这些参考文献以引用的方式整体并入本文)。相对于锰，使用镁形成封闭复合物的速率可能是不同的，这取决于聚合酶和核苷酸的身份。因此，封闭复合物的稳定性可以根据催化性金属离子、聚合酶、和/或核苷酸身份而不同。此外，封闭复合物稳定所需的催化性离子的浓度可以根据催化性金属离子、聚合酶、和/或核苷酸身份而变化，并且可以容易地使用本文提供的指导来确定。举例来说，核苷酸掺入可以在一种金属离子的高催化性离子浓度下发生，但是在同一种金属离子的低浓度下不发生，或反之亦然。因此，改变金属离子身份、金属离子浓度、聚合酶身份、和/或核苷酸身份允许受控的检查反应条件。

封闭复合物可以通过在测序反应的检查步骤期间隔离、去除、减少、省去、和/或螯合催化性金属离子以使得封闭复合物释放和/或化学掺入不发生而形成和/或稳定。螯合包括致使催化性金属离子不可用于核苷酸掺入的任何程序，包括使用EDTA和/或EGTA。减少包括稀释反应混合物中催化性金属离子的浓度。可以用包含非催化性离子的溶液稀释或代替反应混合物，这容许封闭复合物形成，但是抑制核苷酸掺入。非催化性离子包括但不限于钙、锶、钪、钛、钒、铬、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、砷、硒、铑、以及锶。任选地，在检查反应中提供Ni²⁺以有助于封闭复合物形成。任选地，在检查反应中提供Sr²⁺以有助于封闭复合物形成。任选地，非催化性金属离子和催化性金属离子这两者均存在于反应混合物中，其中一种离子以比另一种更高的有效浓度存在。在所提供的方法中，非催化性离子，如钴在高浓度下可以变成催化性的，即有助于核苷酸掺入。因此，任选地，使用低浓度的非催化性金属离子来有助于三元复合物形成并且使用更高浓度的非催化性金属离子来有助于掺入。

可以在检查条件下将非催化性离子添加到反应混合物中。所述反应可能已经包括核苷酸。任选地，非催化性离子与一种或多种核苷酸络合并且将络合的核苷酸添加到反应混合物中。可以通过在高温(约80℃)下将核苷酸与非催化性离子混合来将非催化性离子与核苷酸络合。举例来说，可以将铬核苷酸络合物添加到混合物中以有助于封闭复合物形成和稳定。任选地，铬核苷酸络合物是铬单齿络合物、双齿络合物、或三齿络合物。任选地，铬核苷酸络合物是α-单齿核苷酸、或β-γ-双齿核苷酸。

任选地，在包含Sr²⁺的反应条件中，在聚合酶、引发的模板核酸、以及核苷酸之间形成封闭复合物，其中Sr²⁺诱导所述封闭复合物的形成。Sr²⁺的存在可以允许相对于包含不正确的核苷酸的复合物的形成，有利地形成包含下一个正确核苷酸的封闭复合物。Sr²⁺可以约0.01mM至约30mM的浓度存在。任选地，Sr²⁺以10mM SrCl₂存在。在检查条件下监测封闭复合物的形成以鉴定封闭复合物的模板核酸中的下一个碱基。在Sr²⁺存在下聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段Bst)对每一种dNTP(例如dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的亲和力可能是不同的。因此，检查可以涉及测量聚合酶-模板核酸对dNTP的结合亲和力；其中结合亲和力指示模板核酸中的下一个碱基。任选地，结合相互作用可以在使聚合酶与引发的模板核酸之间的二元相互作用不稳定的条件下进行。任选地，结合相互作用可以在使聚合酶、引发的模板核酸、以及下一个正确的核苷酸之间的三元相互作用稳定的条件下进行。在检查之后，洗涤步骤去除未结合的核苷酸，并且将Mg²⁺添加到反应物中以诱导核苷酸掺入和焦磷酸(PPi)释放。任选地，洗涤步骤包含Sr²⁺以维持三元复合物的稳定性，从而防止三元复合物的解离。可以重复所述反应直到获得所期望的序列读段长度为止。

任选地，在包含Ni²⁺的反应条件下，在聚合酶、引发的模板核酸、以及核苷酸之间形成封闭复合物，其中Ni²⁺诱导所述封闭复合物的形成。Ni²⁺的存在可以允许相对于包含不正确的核苷酸的复合物的形成，有利地形成包含下一个正确核苷酸的封闭复合物。Ni²⁺可以约0.01mM至约30mM的浓度存在。任选地，Ni²⁺以10mM NiCl₂存在。在检查条件下监测封闭复合物的形成以鉴定封闭复合物的模板核酸中的下一个碱基。在Sr²⁺存在下聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段Bst)对每一种dNTP(例如dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的亲和力可能是不同的。因此，检查可以涉及测量聚合酶-模板核酸对dNTP的结合亲和力；其中结合亲和力指示模板核酸中的下一个碱基。任选地，结合相互作用可以在使聚合酶与引发的模板核酸之间的二元相互作用不稳定的条件下进行。任选地，结合相互作用可以在使聚合酶、引发的模板核酸、以及下一个正确的核苷酸之间的三元相互作用稳定的条件下进行。在检查之后，洗涤去除未结合的核苷酸和聚合酶，并且将Mg²⁺添加到反应物中以诱导核苷酸掺入和焦磷酸释放。任选地，洗涤缓冲液包含Ni²⁺以维持三元复合物的稳定性，从而防止三元复合物的解离。可以重复所述反应直到获得所期望的序列读段长度为止。

任选地，在包含非催化浓度的Co²⁺的反应条件下，在聚合酶、引发的模板核酸、以及核苷酸之间形成封闭复合物，其中Co²⁺诱导所述封闭复合物的形成。非催化浓度的Co²⁺的存在可以允许相对于包含不正确的核苷酸的复合物的形成，有利地形成包含下一个正确核苷酸的封闭复合物。Co²⁺可以约0.01mM至约0.5mM的浓度存在。任选地，Co²⁺以0.5mM CoCl₂存在。在检查条件下监测封闭复合物的形成以鉴定封闭复合物的模板核酸中的下一个碱基。在Co²⁺存在下聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段Bst)对每一种dNTP(例如dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的亲和力可能是不同的。因此，检查可以涉及测量聚合酶-模板核酸对dNTP的结合亲和力；其中结合亲和力指示模板核酸中的下一个碱基。任选地，结合相互作用可以在使聚合酶与引发的模板核酸之间的二元相互作用不稳定的条件下进行。任选地，结合相互作用可以在使聚合酶、引发的模板核酸、以及下一个正确的核苷酸之间的三元相互作用稳定的条件下进行。在检查之后，洗涤去除未结合的核苷酸和聚合酶，并且将催化浓度的Co²⁺添加到反应物中以诱导核苷酸掺入和焦磷酸释放。任选地，洗涤缓冲液包含非催化量的Co²⁺以维持三元复合物的稳定性，从而防止三元复合物的解离。可以重复所述反应直到获得所期望的序列读段长度为止。

任选地，催化性金属离子可以有助于封闭复合物的形成而不发生后续的核苷酸掺入和封闭复合物释放。任选地，在反应混合物中0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、或10μM浓度的Mg²⁺可以诱导聚合酶的构象变化以形成封闭复合物而不发生后续的核苷酸掺入、PPi和封闭复合物释放。任选地，Mg²⁺的浓度是约0.5μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.5μM至约4μM、约0.5μM至约3μM、约μM至约5μM、约1μM至约4μM、以及约1μM至约3μM。

任选地，测序反应中为允许核苷酸掺入所必需的催化性金属离子的浓度是约.001mM至约10mM、约0.01mM至约5mM、约0.01mM至约3mM、约0.01mM至约2mM、约0.01mM至约1mM、约0.05mM至约10mM、约0.05mM至约5mM、约0.05mM至约3mM、约0.05mM至约2mM、或约0.05mM至约1mM。任选地，催化性金属离子的浓度是5mM至50mM。任选地，催化性金属离子的浓度是5mM至15mM或约10mM。

可以在任何阶段将非催化性离子添加到反应混合物中，所述阶段包括在以下反应步骤中的任一个之前、期间、或之后：提供引发的模板核酸、提供聚合酶、形成二元复合物、提供核苷酸、形成化学前封闭复合物、核苷酸掺入、形成易位前封闭复合物、以及形成易位后构象。可以在洗涤步骤期间将非催化性离子添加到反应混合物中。非催化性离子可以经由反应混合物中的反应而存在。举例来说，将催化性离子以稀释非催化性金属离子的浓度添加到反应混合物中，从而允许核苷酸掺入。

催化性离子和非催化性离子调节核苷酸掺入的能力可以取决于反应混合物中的条件，包括但不限于pH、离子强度、螯合剂、化学交联、修饰的聚合酶、不可掺入的核苷酸、机械能或振动能、以及电场。

任选地，测序反应中为允许封闭复合物形成而不发生核苷酸掺入所必需的非催化性金属离子的浓度是约0.1mM至约50mM、约0.1mM至约40mM、约0.1mM至约30mM、约0.1mM至约20mM、约0.1mM至约10mM、约0.1mM至约5mM、约0.1mM至约1mM、约1mM至约50mM、约1mM至约40mM、约1mM至约30mM、约1mM至约20mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM、约2mM至约30mM、约2mM至约20mM、约2mM至约10mM、或这些范围内的任何浓度。

封闭复合物可以通过将聚合酶抑制剂添加到检查反应混合物中来形成和/或稳定。抑制剂分子膦酰基乙酸(phosphonoacetate)(膦酰基乙酸(phosphonoacetic acid))和膦酰基甲酸(phosphonoformate)(膦酰基甲酸(phosphonoformic acid)，通用名：膦甲酸(Foscarnet))、苏拉明(Suramin)、氨基糖苷、INDOPY-1以及万寿菊菌毒素(Tagetitoxin)是聚合酶活性的无竞争性抑制剂或非竞争性抑制剂的非限制性实例。在酶的活性位点附近抑制剂分子的结合在核苷酸掺入循环的易位前步骤或易位后步骤中截留聚合酶，从而在核苷酸掺入之前或之后使聚合酶在它的封闭复合物构象中稳定，并且迫使聚合酶与模板核酸结合直到通过去除、稀释或螯合使抑制剂分子在反应混合物中不可用为止。

因此，提供了一种用于对模板核酸分子进行测序的方法，所述方法包括检查步骤，所述检查步骤包括提供用引物引发的模板核酸分子；使所述引发的模板核酸分子与包含聚合酶、聚合酶抑制剂以及至少一种未标记的核苷酸分子的第一反应混合物接触；在所述未标记的核苷酸分子存在下，在所述核苷酸没有掺入到引发的模板核酸分子的引物中的情况下监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用；以及通过所监测的相互作用鉴定与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补的核苷酸。聚合酶抑制剂防止所述未标记的核苷酸分子掺入到引物模板核酸的引物中。任选地，所述抑制剂是非竞争性抑制剂、变构抑制剂、或无竞争性变构抑制剂。任选地，所述聚合酶抑制剂与催化性离子竞争聚合酶中的结合位点。

氨基糖苷通过置换Klenow聚合酶中的镁结合位点来非竞争性地抑制聚合酶活性。对于核苷酸结合，相互作用的非竞争性质允许聚合酶与模板核酸和核苷酸相互作用，从而仅影响核苷酸掺入的催化步骤。

一种抑制剂分子是药物依法韦仑(Efavirenz)，它用作HIV-1逆转录酶的非竞争性抑制剂。所述药物对聚合酶的封闭复合物构型具有高亲和力和低解离速率，以使得一旦聚合酶掺入下一个正确的核苷酸，所述药物就与所述聚合酶结合，从而防止聚合酶打开它的手指状结构以允许结合和/或掺入后续的核苷酸。如果反应在相对于二元复合物的形成有利于三元封闭复合物形成的条件下发生，那么非特异性聚合酶-模板核酸相互作用可以被消除，其中聚合酶的结合表示所添加的核苷酸与模板上的下一个碱基互补。如果反应在检查反应条件下发生，那么可以使用聚合酶与含有下一个正确核苷酸的模板核酸的高亲和力结合来区分三元封闭复合物与聚合酶和模板核酸的随机、非特异性相互作用。任选地，高亲和力聚合酶结合指示核苷酸掺入，并且不需要单独的掺入步骤。一旦聚合酶结合并且检测到所述结合，就可以从反应混合物去除或隔离过量的核苷酸和聚合酶。可以在检查反应条件下添加下一个核苷酸并且对于所有的核苷酸类型，或按随机的或预定的顺序循环重复所述过程，直到对所期望的读段长度的测序完成为止。

可以选择任何聚合酶并且可以使用高通量筛选(HTS)方法来揭露合适的非竞争性抑制剂。用于聚合酶抑制剂的HTS方法的许多实例见于文献中，其中特定的筛选标准是用于非竞争性聚合酶抑制剂。作为一般构思，这些抑制剂可以被筛选以具有仅在聚合酶呈它的封闭式构象时暴露的结合位点，并且它们以高亲和力和非常低的解离速率结合，以使得所述抑制剂的结合使呈封闭式构象的聚合酶稳定。这样的抑制剂允许掺入单个碱基，之后所述抑制剂的结合防止聚合酶打开以接受另一个核苷酸。在开始测序反应中的下一步(检查或掺入)之前，可以洗掉整个体系，包括聚合酶。

任选地，使用被发现有效抑制HIV-1逆转录酶聚合酶的聚合酶抑制剂来使封闭复合物稳定。任选地，所述抑制剂是HIV-2逆转录酶的抑制剂。HIV-1逆转录酶抑制剂包括核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)和非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)。NRTi包括但不限于可比韦(COMBIVIR)(拉米夫定(lamivudine)和齐多夫定(zidovudine)；GlaxoSmithKline，Middlesex，UK)、恩曲瓦(EMTRIVA)(恩曲他滨(emtricitabine)；Gilead Sciences，FosterCity，CA)、益平维(EPIVIR)(拉米夫定；GlaxoSmithKline，Middlesex，UK)、依帕徐康(EPZICOM)(硫酸阿巴卡韦(abacavir sulfate)和拉米夫定；GlaxoSmithKline，Middlesex，UK)、海维德(HIVID)(扎西他滨(zalcitabine)；Hoffmann-La Roche，Nutley，N.J.)、立妥威(RETROVIR)(齐多夫定；GlaxoSmithKline，Middlesex，UK)、三协唯(TRIZIVIR)(硫酸阿巴卡韦、齐多夫定、拉米夫定；GlaxoSmithKline，Middlesex，UK)、特鲁瓦达(TRUVADA)(恩曲他滨/反丁烯二酸替诺福韦二吡呋酯(tenofovir disoproxil fumarate)；Gilead Sciences，Foster City，CA)、威泰EC(VIDEX EC)(肠溶包衣去羟肌苷；Bristol Myers-Squibb，NewYork，N.Y.)、威泰(VIDEX)(去羟肌苷；Bristol Myers-Squibb，New York，N.Y.)、惠立妥(VIREAD)(反丁烯二酸替诺福韦二吡呋酯；Gilead Sciences，Foster City，CA)、赛瑞特(ZERIT)(司他夫定(stavudine)；Bristol Myers-Squibb，New York，N.Y.)、以及赛进(ZIAGEN)(硫酸阿巴卡韦；GlaxoSmithKline，Middlesex，UK)。NNRTI的实例包括但不限于维乐命(VIRAMUNE)(奈韦拉平(nevirapine)；Boehringer Ingelheim，Rhein，Germany)、萨提瓦(SUSTIVA)(依法韦仑(efavirenz)，Bristol Myers-Squibb，New York，N.Y.)、地拉韦定(DELAVIRDINE)(瑞斯普特(Rescriptor)；Pfizer，New York，N.Y.)、以及英特莱(INTELENCE)(依曲韦林(etravirine)；Tibotec Therapeutics，Eastgate Village，Ireland)。任选地，NNRTi是结合位于亚基p66上的RNA聚合酶活性位点附近的变构中心的非竞争性聚合酶抑制剂。

任选地，HIV-1逆转录酶聚合酶抑制剂是(4/6-卤素/MeO/EtO取代的苯并[d]噻唑-2-基)噻唑烷-4-酮。表1包括19种(4/6-卤素/MeO/EtO取代的苯并[d]噻唑-2-基)噻唑烷4-酮抑制剂的列表(改编自E.Pitta等人，Synthesis and HIV-1 RT inhibitory action ofhovel(4/6-substituted benzo[d]thiazol-2-yl)thiazolidin-4-ones.Divergence fromthe non-competitive inhibition mechanism，Journal of Enzyme Inhibition andMedicinal Chemistry，2013年2月，第28卷，第1期，第113-122页)。(4/6-卤素/MeO/EtO取代的苯并[d]噻唑-2-基)噻唑烷-4-酮抑制剂具有下式：

表1：(4/6-卤素/MeO/EtO取代的苯并[d]噻唑-2-基)噻唑烷-4-酮抑制剂

可以使用聚合酶抑制剂和聚合酶突变体的任何合适的组合，只要它们截留/稳定封闭复合物并且任选地，防止每个循环多个核苷酸掺入即可。

所提供的反应混合物可以包含100nM至1mM的聚合酶抑制剂或100nM至1mM的任何量的抑制剂。任选地，所提供的反应混合物可以包含1μM至200μM的聚合酶抑制剂或任何量。任选地，所述反应混合物包含30μM至150μM的聚合酶抑制剂。任选地，所述反应混合物包含30μM至70μM的聚合酶抑制剂。任选地，所述反应混合物包含60μM至140μM的聚合酶抑制剂。

任选地，通过使用焦磷酸类似物或其他相关分子来防止封闭复合物的聚合酶打开它的手指状结构域并且易位到下一个模板核酸位置。焦磷酸类似物通过占据靠近聚合酶的活性口袋中的三磷酸结合位点的位点来配置封闭复合物中的聚合酶。焦磷酸(PPi)的释放对于聚合酶呈现开放式构象、易位到下一个模板核酸位置、以及接受下一个核苷酸是关键的。非竞争性抑制剂，如膦甲酸(膦酰基甲酸)、膦酰基乙酸或其他焦磷酸类似物将聚合酶截留在它的手指状结构封闭式构象。任选地，PPi类似物的结合是可逆的，聚合酶活性通过洗掉、稀释、或隔离反应混合物中的抑制剂来完全恢复。广泛而言，在测序反应期间可以使用聚合酶活性的任何非竞争性抑制剂。

任选地，使封闭复合物稳定的聚合酶抑制剂与通常释放封闭复合物的反应条件组合，所述反应条件包括但不限于催化性金属离子，如镁或锰的存在。任选地，使封闭复合物稳定，即使是在催化性金属离子存在下。任选地，封闭复合物被释放，即使是在聚合酶抑制剂存在下。任选地，封闭复合物的稳定部分地取决于稳定试剂的浓度、身份、释放试剂的身份、以及其任何组合。任选地，使用聚合酶抑制剂使封闭复合物稳定与也用以使封闭复合物稳定的另外的反应条件组合，所述反应条件包括但不限于隔离、去除、减少、省去、和/或螯合催化性金属离子；在封闭复合物中存在修饰的聚合酶；在封闭复合物中存在不可掺入的核苷酸；以及其任何组合。

聚合酶可以被修饰以有助于在本文所述的测序方法的检查步骤期间封闭复合物的形成和/或稳定。因此，在所提供的方法中可以使用修饰的聚合酶。聚合酶的修饰可以包括使封闭复合物内的成员与交联剂交联或在聚合酶内形成二硫键以维持封闭复合物。

任选地，半胱氨酸被定位以使得当形成封闭复合物时，半胱氨酸紧密接近以形成至少一个二硫键以将聚合酶截留在封闭式构象中。任选地，聚合酶的手指状结构域和拇指状结构域被工程改造以各自含有一个或多个半胱氨酸，以使得在封闭复合物中，相对的手指状结构上的半胱氨酸相互作用，从而形成二硫键并且将聚合酶截留在它的封闭式构象中。将半胱氨酸引入到聚合酶上的合适的位置以诱导二硫键形成可以使用蛋白质工程改造领域的技术人员已知的方法来实现。可以使用还原剂，如2-巯基乙醇(BME)、半胱氨酸-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、或其任何组合来还原二硫键并且释放聚合酶。任选地，在单独的检查步骤中，连同半胱氨酸修饰的聚合酶一起依次添加核苷酸，一次添加一种，其中对有利于封闭复合物形成和/或稳定的另外的检查反应条件的需要是任选的。任选地，在一个检查步骤中，连同半胱氨酸修饰的聚合酶一起组合添加1种、2种、3种、4种或更多种核苷酸(例如dATP、dTTP、dCTP、以及dGTP)，其中对有利于封闭复合物形成和/或稳定的另外的检查反应条件的需要是任选的。

任选地，半胱氨酸修饰的聚合酶与模板核酸结合而不掺入正确的核苷酸，同时形成封闭复合物。在封闭复合物中时，聚合酶的半胱氨酸在空间上接近到足以形成至少一个二硫键，从而使封闭复合物稳定。在该实例中，聚合酶被截留并且防止核苷酸掺入。

任选地，检查反应混合物中存在的核苷酸是下一个正确的核苷酸，并且半胱氨酸修饰的聚合酶与模板核酸结合并且掺入下一个正确的核苷酸，从而形成封闭复合物；其中在所述封闭复合物中时，聚合酶的半胱氨酸在空间上接近到足以形成至少一个二硫键，从而使所述封闭复合物稳定。在使封闭复合物稳定和监测之后，可以进行掺入步骤，其中还原剂使二硫键断裂，从而从封闭复合物中释放聚合酶。然后可以去除、稀释、或隔离还原剂并且可以进行另一个检查步骤。

任选地，在使封闭复合物稳定之前或期间，二硫键稳定的封闭复合物的核苷酸被掺入。可以通过还原二硫键来进行掺入步骤以允许后续的核苷酸掺入和/或另外的检查步骤。

任选地，在检查步骤期间将一种核苷酸添加到反应混合物中。任选地，在检查步骤期间，将1种、2种、3种、4种或更多种核苷酸添加到反应混合物中。任选地，下一个正确的核苷酸被包封在封闭复合物内。任选地，不正确的核苷酸被包封在封闭复合物内。

任选地，聚合酶可以在形成封闭复合物之后自身形成二硫键。在形成封闭复合物之后，聚合酶可以与引发的模板核酸形成二硫键。封闭复合物可以包括与下一个碱基进行碱基配对和/或被掺入到引发的模板核酸的引物中的下一个正确的核苷酸。任选地，封闭复合物包含不正确的核苷酸，其中与下一个碱基的结合和/或掺入被减弱。

任选地，经由涉及封闭复合物的聚合酶的交联方法使聚合酶稳定。所述交联方法不需要是可逆的，这是因为可以使用其他手段，如酶裂解或化学裂解、变性或其任何组合来使聚合酶从核酸解脱。变性剂包括但不限于酸，如乙酸、或三氯乙酸；溶剂，如乙醇或甲醇；离液剂，如尿素、氯化胍

高氯酸锂；表面活性剂，如十二烷基硫酸钠；或其任何组合。化学裂解包括使用天然的、修饰的、或可商购获得的蛋白酶中的一种或多种。用于释放交联的聚合酶的另外的方法包括但不限于改变pH值、温度、离子强度、或其任何组合。

封闭复合物在反应的检查步骤期间在包封的核苷酸没有掺入的情况下形成。任选地，检查反应混合物在任何时间点包含交联剂，其中所述封闭复合物是交联的。在该实例中，聚合酶被截留并且防止核苷酸掺入。任选地，检查反应混合物中存在的核苷酸是下一个正确的核苷酸，并且聚合酶与模板核酸结合并且掺入下一个正确的核苷酸，从而形成封闭复合物；其中，在所述封闭复合物中时，交联剂可供用于截留所述封闭复合物。在使封闭复合物稳定和监测之后，可以进行掺入步骤，其中封闭复合物从它的封闭式构象释放。任选地，形成封闭复合物并且下一个正确的核苷酸掺入到模板核酸引物中。交联抑制聚合酶易位到下一个碱基位置并且下一个核苷酸不能被添加直到聚合酶不再交联为止。任选地，在使封闭复合物稳定之前或期间，交联稳定的封闭复合物的核苷酸被掺入。可以通过裂解键联和/或使聚合酶变性来进行掺入步骤以允许后续的核苷酸掺入和/或另外的检查步骤。

任选地，聚合酶可以在形成封闭复合物之后自身交联。因此，聚合酶可以在形成封闭复合物之后与引发的模板核酸交联。封闭复合物可以包括与下一个碱基进行碱基配对和/或被掺入到引发的模板核酸的引物中的下一个正确的核苷酸。任选地，封闭复合物包含不正确的核苷酸，所述不正确的核苷酸与下一个碱基的结合和/或掺入被减弱。

任选地，聚合酶被修饰以相对于二元复合物的形成有利于封闭复合物的形成。聚合酶修饰可以被遗传工程改造。聚合酶可以基于它们对模板核酸的选择性结合亲和力来选择。聚合酶可以被选择或修饰以对核苷酸具有高亲和力，其中所述聚合酶在与模板核酸结合之前与核苷酸结合。举例来说，来自非洲猪瘟病毒的DNA聚合酶X具有改变的底物结合顺序，其中所述聚合酶首先与核苷酸结合，然后与模板核酸结合。可以利用首先与核苷酸结合的聚合酶来开发新型测序方案。聚合酶修饰可以被设计成在本文公开的方法中将聚合酶截留在封闭复合物中。聚合酶可以被永久或瞬时截留。

任选地，允许使封闭复合物稳定的修饰的聚合酶与通常释放封闭复合物的反应条件组合，所述反应条件包括但不限于释放试剂(例如催化性金属离子，如镁或锰)的存在。任选地，使封闭复合物稳定，即使是在催化性金属离子存在下。任选地，封闭复合物被释放，即使是在交联剂存在下。任选地，封闭复合物的稳定部分地取决于稳定试剂和/或释放试剂的浓度和/或身份、以及其任何组合。任选地，使用一种或多种修饰的聚合酶使封闭复合物稳定与使封闭复合物稳定的另外的反应条件组合，所述反应条件包括但不限于隔离、去除、减少、省去、和/或螯合催化性金属离子；聚合酶抑制剂、或不可掺入的核苷酸的存在；以及其任何组合。

任选地，检查步骤的封闭复合物包含核苷酸类似物或修饰的核苷酸以有助于封闭复合物的稳定。任选地，核苷酸类似物包含含氮碱基、五碳糖、以及磷酸基团；其中核苷酸的任何组分可以被修饰和/或置换。核苷酸类似物可以是不可掺入的核苷酸。不可掺入的核苷酸可以被修饰以在测序方法期间的任何时刻变成可掺入的。

核苷酸类似物包括但不限于α-磷酸修饰的核苷酸、α-β核苷酸类似物、β-磷酸修饰的核苷酸、β-γ核苷酸类似物、γ-磷酸修饰的核苷酸、笼锁核苷酸、或ddNTP。核苷酸类似物的实例描述于美国专利号8,071,755中，该美国专利以引用的方式整体并入本文。

核苷酸类似物可以包括可逆地防止核苷酸掺入到引物的3′末端的终止子。一种类型的可逆终止子是3′-O阻隔的可逆终止子。所述终止子与核苷酸的5-碳糖的3′OH末端的氧原子连接。另一种类型的可逆终止子是3′未阻隔的可逆终止子。所述终止子与核苷酸的含氮碱基连接。关于具有终止子的核苷酸类似物的综述，参见例如Mu，R.等人，“The Historyand Advances of Reversible Terminators Used in New Generations of SequencingTechnology，”Genomics，Proteomics & Bioinformatics 11(1)：34-40(2013)。

任选地，将核苷酸取代为具有不可逆地防止核苷酸掺入到引物的3′末端的终止子的修饰的核苷酸类似物。不可逆的核苷酸类似物包括2′，3′-二脱氧核苷酸ddNTP(ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP)。二脱氧核苷酸缺少对于聚合酶介导的合成来说必要的dNTP的3′-OH基团。

任选地，不可掺入的核苷酸包含阻隔部分，所述阻隔部分抑制或防止核苷酸在核酸聚合反应的掺入步骤期间与第二核苷酸(引物的3′OH)形成共价键。所述阻隔部分可以从核苷酸中去除，从而允许核苷酸掺入。

任选地，封闭复合物中存在的核苷酸类似物使得封闭复合物稳定。任选地，所述核苷酸类似物是不可掺入的。任选地，核苷酸类似物被释放并且天然核苷酸被掺入。任选地，封闭复合物被释放，核苷酸类似物被修饰，并且修饰的核苷酸类似物被掺入。任选地，封闭复合物在修饰封闭复合物中的核苷酸类似物和/或使所述核苷酸类似物不稳定的反应条件下被释放。

任选地，封闭复合物中存在的核苷酸类似物被掺入并且使封闭复合物稳定。可以通过核苷酸类似物或例如通过本文公开的任何稳定方法来使封闭复合物稳定。任选地，核苷酸类似物不允许后续核苷酸的掺入。封闭复合物可以例如通过本文所述的任何方法来释放，并且核苷酸类似物被修饰。修饰的核苷酸类似物可以允许核苷酸随后掺入到它的3′末端。

任选地，在检查步骤期间在反应混合物中存在核苷酸类似物。举例来说，在检查步骤期间在反应混合物中存在1种、2种、3种、4种或更多种核苷酸类似物。任选地，在掺入步骤期间，核苷酸类似物被置换、稀释或隔离。任选地，核苷酸类似物被天然核苷酸置换。天然核苷酸可以包括下一个正确的核苷酸。任选地，在掺入步骤期间，核苷酸类似物被修饰。修饰的核苷酸类似物可以与天然核苷酸相似或相同。

任选地，核苷酸类似物对聚合酶具有与天然核苷酸不同的结合亲和力。任选地，核苷酸类似物与下一个碱基具有与天然核苷酸不同的相互作用。核苷酸类似物和/或不可掺入的核苷酸可以与模板核酸的互补碱基进行碱基配对。

任选地，核苷酸类似物是与聚合酶融合的修饰的或天然的核苷酸。任选地，多种核苷酸类似物包括与多种聚合酶的融合体，其中每一种核苷酸类似物包含不同的聚合酶。

核苷酸可以被修饰以相对于二元复合物的形成，有利于封闭复合物的形成。核苷酸修饰可以被遗传工程改造。核苷酸可以被选择或修饰以对聚合酶具有高亲和力，其中所述聚合酶在与模板核酸结合之前与核苷酸结合。

将聚合酶截留在封闭复合物中的任何核苷酸修饰可以用于本文公开的方法中。所述核苷酸可以被永久或瞬时截留。任选地，核苷酸类似物不是使封闭复合物稳定的手段。任何封闭复合物稳定方法可以在利用核苷酸类似物的反应中组合。

任选地，允许使封闭复合物稳定的核苷酸类似物与通常释放封闭复合物的反应条件组合。所述条件包括但不限于释放试剂(例如催化性金属离子，如镁或锰)的存在。任选地，使封闭复合物稳定，即使是在催化性金属离子存在下。任选地，封闭复合物被释放，即使是在核苷酸类似物存在下。任选地，封闭复合物的稳定部分地取决于稳定试剂和/或释放试剂的浓度和/或身份、以及其任何组合。任选地，使用核苷酸类似物使封闭复合物稳定与用以使封闭复合物稳定的另外的反应条件组合，所述反应条件包括但不限于隔离、去除、减少、省去、和/或螯合催化性金属离子；聚合酶抑制剂、交联剂的存在；以及其任何组合。

在示例性测序反应中，检查步骤包括包含聚合酶、引发的模板核酸、以及核苷酸的封闭复合物的形成和/或稳定。监测封闭复合物的形成和/或释放的特征以鉴定包封的核苷酸并且因此鉴定模板核酸中的下一个碱基。封闭复合物的特征可以取决于测序反应组分(例如聚合酶、引物、模板核酸、核苷酸)和/或反应混合物组分和/或条件。任选地，封闭复合物呈化学前构象。任选地，所述封闭复合物呈易位前构象。任选地，所述封闭复合物呈易位后构象。

所述检查步骤涉及在核苷酸存在下监测聚合酶与模板核酸的相互作用。可以监测封闭复合物的形成。任选地，监测封闭复合物的形成的不存在。任选地，监测封闭复合物的解离。任选地，掺入步骤涉及监测核苷酸的掺入。任选地，所述掺入步骤涉及监测核苷酸掺入的不存在。

可以监测检查步骤和/或掺入步骤的任何过程。任选地，聚合酶具有可检测的标签。任选地，测序反应的组分都没有被可检测地标记。任选地，聚合酶上的可检测的标签或标记是可去除的。任选地，核苷酸或聚合酶具有可检测的标记，然而，所述标记在测序期间不被检测。

在正确的核苷酸和不正确的核苷酸存在下，在可能允许或可能不允许核苷酸掺入的条件下，监测聚合酶对模板核酸的亲和力的变化可以用于确定核酸的序列。在包括修饰的或标记的核苷酸在内的不同核苷酸存在下聚合酶对模板核酸的亲和力可以作为在各种核苷酸存在下聚合酶-核酸相互作用的解离速率来监测。许多标准聚合酶对各种匹配/正确、错配/不正确以及修饰的核苷酸的亲和力和解离速率是本领域已知的。Klenow聚合酶的单分子成像揭示了模板核酸对不同的核苷酸类型的解离速率是明显和可测量地不同的，其中所述核苷酸类型被阻止掺入。

任选地，在引发的模板核酸存在下，使特定类型的核苷酸可用于聚合酶。监测所述反应，其中如果所述核苷酸是下一个正确的核苷酸，那么可以使所述聚合酶稳定以形成封闭复合物。如果所述核苷酸是不正确的核苷酸，那么封闭复合物仍可以形成；然而，在没有稳定剂或反应条件(例如不存在催化性离子、聚合酶抑制剂、盐)的额外帮助的情况下，封闭复合物可能解离。解离速率取决于聚合酶、模板核酸、以及核苷酸的特定组合的亲和力以及反应条件。任选地，所述亲和力是以解离速率被测量的。任选地，封闭复合物的不同核苷酸之间亲和力是不同的。举例来说，如果模板核酸中引物的3′末端下游的下一个碱基是G，那么预期测量为解离速率的聚合酶-核酸亲和力基于是否添加dATP、dCTP、dGTP还是dTTP而是不同的。在这种情况下，dCTP将具有最慢的解离速率，其他核苷酸提供相互作用的不同解离速率。任选地，解离速率可以是不同的，这取决于反应条件，例如稳定剂(例如不存在镁或抑制性化合物)或反应条件(例如核苷酸修饰或修饰的聚合酶)的存在。一旦下一个正确核苷酸的身份被确定，就可以在特异性靶向封闭复合物的形成的条件下将1种、2种、3种、4种或更多种核苷酸类型同时引入到反应混合物中。可以从反应混合物中去除过量的核苷酸并且调节反应条件以掺入封闭复合物的下一个正确的核苷酸。该测序反应确保每个测序循环仅掺入一个核苷酸。

任选地，多个模板核酸被拴系到表面上并且使一种(或多种)dNTP依次流入。亲和力谱揭示了下一个正确核苷酸的身份并且因此揭示了模板核酸中的下一个碱基。任选地，测量亲和力而无需去除和更换反应混合物条件，即洗涤步骤。所测量的结合相互作用的强度的自相关例如可以容易地揭示相互作用的动力学，从而揭示亲和力而无需洗涤步骤来测量解离速率。

可以测量聚合酶与核酸之间的动态相互作用的任何技术可以用于测量亲和力并且使得能够进行本文公开的测序反应方法。

任选地，聚合酶对核苷酸的亲和力部分地取决于引发的模板核酸中的下一个碱基的身份和/或所述核苷酸的身份。任选地，可以通过聚合酶、核苷酸、引物、模板核酸、或其任何组合的修饰来改变亲和力。任选地，反应混合物条件和/或另外的组分影响亲和力值。

本文提供了创建核苷酸和下一个碱基的多种可能组合的聚合酶-核酸亲和力的表的方法。由于这些亲和力主要受聚合酶活性位点处的相互作用的影响，其中只有核苷酸和核酸模板上的下一个碱基参与，因此环境特异性效应可以被忽略。环境特异性效应可以包括核酸的二级结构和从模板核酸上的下一个碱基沿序列进一步向下的碱基的影响。所述亲和力表允许确定天然的或修饰的核苷酸，这引起了最广泛的和最容易测量的对不同的模板碱基的亲和力的离散。任选地，所述模板碱基是碱基dATP、dTTP、dCTP、以及dGTP中的1种、2种、3种、或4种。应当了解的是，与核苷酸互补的碱基将存在最强的亲和力。如本文所用，离散特别指的是对其他三种不正确的不互补的碱基的亲和力的变化。任选地，在抑制核苷酸掺入的检查条件下测量每一种亲和力。任选地，聚合酶被修饰或选择以提供广泛的亲和力离散。工程改造的或天然的聚合酶可能具有不利的误差特征或作为测序酶的其他不利的特性，这是不重要的，因为该聚合酶将仅在非掺入条件下使用。聚合酶可以针对它提供对不同模板碱基的容易测量的和不同的亲和力的能力来明确地选择。演变或筛选具有所期望的特性的聚合酶是本领域的标准程序(例如筛选对修饰的核苷酸具有高亲和力的聚合酶)。任选地，将聚合酶用高保真聚合酶代替以进行掺入步骤。任选地，选择聚合酶和核苷酸的组合，该组合提供最方便的对模板碱基的亲和力，从而允许执行测序方法，所述测序方法在所选择的核苷酸存在下测量所选择的聚合酶对模板核酸的亲和力。由所测量的亲和力确定核酸上的下一个碱基，这是因为对模板碱基的亲和力谱提供于所构建的亲和力表中。所述亲和力可以是聚合酶核酸相互作用的缔合速率、解离速率、或缔合速率和解离速率的组合。

在核苷酸存在下聚合酶对模板核酸的亲和力可以本领域技术人员已知的多种方法测量。任选地，亲和力是以解离速率被测量的，其中所述解离速率是通过监测在通过洗涤缓冲液洗涤反应物时聚合酶从模板核酸的释放来测量的。任选地，亲和力是以解离速率被测量的，其中所述解离速率是通过在平衡结合条件，特别是其中聚合酶结合速率低或扩散受限的平衡结合条件下监测聚合酶从模板核酸的释放来测量的。聚合酶结合速率在足够低的聚合酶浓度下可能是扩散受限的，其中如果聚合酶从DNA-聚合酶复合物中脱落，那么它不会立即加载回来，从而允许足够的时间来检测所述聚合酶已经从复合物中释放。对于更高的亲和力相互作用，聚合酶从核酸缓慢地释放，而低亲和力相互作用使得聚合酶更快地被释放。在这种情况下，亲和力谱转换成不同的解离速率，所述解离速率是在动态洗涤条件下或在平衡状态下测量的。最小的解离速率对应于与所添加的核苷酸互补的碱基，而其他解离速率以已知的方式变化，这取决于所选择的聚合酶和核苷酸的组合。

任选地，解离速率是以在反应混合物中提供聚合酶和核苷酸之后的平衡信号强度来测量的，其中与最低解离速率(最高亲和力)核苷酸的相互作用产生最强的信号，而与其他不同解离速率核苷酸的相互作用产生可测量的不同强度的信号。作为非限制性实例，优选地在全内反射(TIRF)条件下测量的荧光标记的聚合酶产生不同的测量荧光强度，这取决于在适当选择的时间窗中与表面固定的核酸分子结合的聚合酶分子的数量。还可以利用聚合酶的固有荧光，例如色氨酸荧光。高解离速率相互作用产生低的测量强度，这是因为在所选择的时间窗中结合的聚合酶分子的数量非常小，其中高解离速率指示大部分的聚合酶从核酸解脱。可以使用任何表面局部测量方案，包括但不限于标记或荧光方案。在平衡条件下测量亲和力的合适的测量方案包括但不限于结合质量、折射率、表面电荷、介电常数、以及本领域已知的方案。任选地，缔合速率和解离速率工程改造的组合在所提出的方案中产生更高保真度检测。作为非限制性实例，均一低的缔合速率、碱基依赖性的不同的解离速率使得解脱的聚合酶在长时间内保持解脱，从而允许对解离速率和测量的强度的变化的辨认增强。缔合速率可以通过降低添加的聚合酶、核苷酸、或聚合酶和核苷酸这两者的浓度来操纵。

任选地，经由与聚合酶连接的可检测的标签来监测聚合酶与核酸之间的相互作用。所述标签可以通过检测方法来监测，所述检测方法包括但限于光学、电学、热学、质量、尺寸、电荷、振动以及压力。所述标记可以是磁性的、荧光的或带电荷。对于外部和内部标记方案，可以使用荧光各向异性来确定封闭复合物中聚合酶与核酸的稳定结合。

举例来说，将聚合酶用荧光团标记，其中封闭复合物形成是以稳定的荧光信号被监测的。与在下一个正确的核苷酸存在下形成的封闭复合物相比，在不正确的核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的不稳定的相互作用产生可测量的更弱的信号。

任选地，将聚合酶用化学发光标签标记，其中在适当的发光触发剂存在下，封闭复合物形成是以稳定的发光信号来监测的。与在下一个正确的核苷酸存在下形成的封闭复合物相比，在不正确的核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的不稳定的相互作用产生可测量的更弱的信号。此外，在触发发光之前洗涤步骤可以去除未结合在稳定的封闭复合物中的所有聚合酶分子。

任选地，将聚合酶用光散射标签标记，其中封闭复合物形成是以稳定的光散射信号被监测的。与在下一个正确的核苷酸存在下形成的封闭复合物相比，在不正确的核苷酸存在下聚合酶与核酸的不稳定的相互作用产生可测量的更弱的信号。

任选地，将聚合酶用等离子体纳米颗粒标签标记，其中封闭复合物形成是以等离子体共振的偏移来监测的，所述等离子体共振不同于在不存在封闭复合物或存在包含不正确的核苷酸的封闭复合物的情况下的等离子体共振。等离子体共振的变化可能是由于封闭复合物的局部介电环境的变化，或它可能是由于等离子体纳米颗粒在一群克隆扩增的核酸分子上的同步聚集或在封闭复合物构型中以不同方式影响等离子体的另外的手段。

任选地，将聚合酶用拉曼散射(Raman scattering)标签标记，其中封闭复合物形成是以稳定的拉曼散射信号被监测的。与在下一个正确的核苷酸存在下形成的封闭复合物相比，在不正确的核苷酸存在下聚合酶与核酸的不稳定的相互作用产生可测量的更弱的信号。

任选地，通过被选择或修饰以对核苷酸具有高亲和力的聚合酶上的标签来鉴定下一个正确的核苷酸，其中所述聚合酶在与模板核酸结合之前与核苷酸结合。举例来说，来自非洲猪瘟病毒的DNA聚合酶X具有改变的底物结合顺序，其中所述聚合酶首先与核苷酸结合，然后与模板核酸结合。任选地，将聚合酶与每一种类型的核苷酸在分开的隔室中孵育，其中每一个隔室含有不同类型的核苷酸并且其中所述聚合酶根据与它一起孵育的核苷酸用标签不同地标记。在这些条件下，未标记的核苷酸与不同标记的聚合酶结合。所述聚合酶可以是与每一种核苷酸类型结合的相同种类的聚合酶或与每一种核苷酸类型结合的不同聚合酶。可以将差异标记的聚合酶-核苷酸复合物同时添加到测序反应的任何步骤中。每一个聚合酶-核苷酸复合物均与模板核酸结合，所述模板核酸的下一个碱基与聚合酶-核苷酸复合物中的核苷酸互补。通过携带所述核苷酸的聚合酶上的标签来鉴定下一个正确的核苷酸。可以在非掺入和/或检查条件下通过标记的聚合酶-核苷酸复合物对下一个模板碱基进行探查，其中一旦下一个模板碱基的身份被确定，就使所述复合物不稳定并且去除、隔离、和/或稀释，并且以确保仅掺入一个核苷酸的方式进行单独的掺入步骤。

在聚合酶上引入可检测的标签的常见的方法涉及与聚合酶的非活性区域中存在的胺或半胱氨酸进行化学缀合。这样的缀合方法是本领域公知的。作为非限制性实例，通常使用n-羟基丁二酰亚胺酯(NHS酯)来对可能存在于酶上的胺基进行标记。半胱氨酸容易与硫醇基团或顺丁烯二酰亚胺基团反应，而羧基可以通过将它们用EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)活化而与胺反应。任选地，在其中只有N-末端胺具有反应性的pH值范围(例如pH 7)使用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)化学方法，以使得每个聚合酶仅添加单个标签。

任选地，与聚合酶连接的标签是电荷标签，以使得稳定的封闭复合物的形成可以通过电学手段，通过测量模板核酸周围的局部电荷密度的变化来检测。用于检测电荷的方法是本领域公知的，包括诸如场效应晶体管、介电谱、阻抗测量、以及pH值测量等方法。场效应晶体管包括但不限于离子敏感性场效应晶体管(ISFET)、电荷调制的场效应晶体管、绝缘栅场效应晶体管、金属氧化物半导体场效应晶体管以及使用半导体单壁碳纳米管制造的场效应晶体管。

任选地，电荷标签是具有低于约4或高于约10的等电点的肽标签。任选地，包含肽标签的聚合酶具有低于约5或高于约9的总等电点。电荷标签可以是带正电荷的或带负电荷的任何部分。电荷标签可以包含另外的部分，所述另外的部分包括质量和/或标记，如染料。任选地，电荷标签只有在某些反应条件，如pH值的变化下才具有正电荷或负电荷。

任选地，场效应晶体管(FET)被配置成用于检测封闭复合物的生物传感器。通过添加模板核酸来对FET的栅极端子进行修改。包含电荷标签的聚合酶的结合引起电化学信号的变化。与在其他不正确的核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的结合相比，具有下一个正确核苷酸的聚合酶与模板核酸的结合提供不同的信号，其中每一种不正确的核苷酸也可能提供不同的信号。任选地，使用FET监测聚合酶与模板核酸的相互作用，而不使用聚合酶、引发的模板核酸、或核苷酸上的标记标签。任选地，使用FET检测由于在掺入反应期间H⁺离子的释放而发生的pH值变化。任选地，聚合酶包含产生由FET检测的连续H⁺离子的标签。任选地，产生连续H⁺离子的标签是ATP合酶。任选地，产生连续H⁺离子的标签是钯、铜或另外的催化剂。任选地，使用FET检测在核苷酸掺入之后PPi的释放。举例来说，每次可以向反应中提供一种类型的核苷酸。一旦下一个正确的核苷酸被添加并且条件允许掺入，PPi就被裂解，释放，并且使用FET检测，从而鉴定下一个正确的核苷酸和下一个碱基。任选地，使模板核酸与纳米管的壁结合。任选地，使聚合酶与纳米管的壁结合。FET由于它的小尺寸和低重量而对于用作测序传感器来说是有利的，这使得它适用作便携式的测序监测部件。分子相互作用的FET检测的细节描述于Dong-Sun Kim等人，“An FET-Type Charge Sensor for HighlySensitive Detection of DNA Sequence，”Biosensors and Bioelectronics，Microsensors and Microsystems 2003，20，第1期(2004年7月30日)：69-74，doi：10.1016/j.bios.2004.01.025；以及Alexander Star等人，“Electronic Detection of SpecificProtein Binding Using Nanotube FET Devices，”Nano Letters 3，第4期(2003年4月1日)：459-63，doi：10.1021/nl0340172中，这些参考文献以引用的方式整体并入本文。

举例来说，聚合酶包含荧光标签。为了以高信噪比监测聚合酶-核酸相互作用，可以使用瞬逝照射或共聚焦成像。定位的模板核酸上封闭复合物的形成可以以例如与背景相比增加的荧光被观测到，而在一些情况下，它也可以以由于猝灭或局部极性环境的变化而降低的荧光被观测到。任选地，在相同的反应混合物中，一部分的聚合酶分子可以用荧光团标记，而另一部分可以用猝灭剂标记；其中，定位的核酸克隆群体上封闭复合物的形成以与背景相比荧光的降低而被揭示。可以使核酸的克隆群体连接到载体表面，如平面基底、微粒或纳米颗粒。任选地，将聚合酶用荧光团、发光团、化学发光团、发色团、或生物发光团标记。

可以将聚合酶用荧光团和/或猝灭剂标记。任选地，将核酸用荧光团和/或猝灭剂标记。任选地，将一种或多种核苷酸用荧光团和/或猝灭剂标记。示例性荧光团包括但不限于荧光纳米晶体；量子点；d-若丹明接受体染料，包括二氯[R110]、二氯[R6G]、二氯[TAMRA]、二氯[ROX]等；荧光素供体染料，包括荧光素、6-FAM等；花青染料，如Cy3B；Alexa染料、SETA染料、Atto染料，如与Cy3B形成FRET对的atto 647N等。荧光团包括但不限于MDCC(7-二乙氨基-3-[([(2-顺丁烯二酰亚胺基)乙基]氨基)羰基]香豆素)、TET、HEX、Cy3、TMR、ROX、得克萨斯红(Texas Red)、Cy5、LC红705以及LC红640。荧光团和它们的使用方法，包括与聚合酶和其他分子的连接，描述于The Molecular

Handbook(LifeTechnologies，Carlsbad Calif.)和Fluorophores Guide(Promega，Madison，WI)中，这些参考文献以引用的方式整体并入本文。示例性猝灭剂包括但不限于ZEN、IBFQ、BHQ-1、BHQ-2、DDQ-I、DDQ-11、Dabcyl、Qxl猝灭剂、Iowa Black RQ、以及IRDye QC-1。

任选地，构象敏感性染料可以连接到聚合酶的活性位点附近而不影响聚合酶的聚合能力或保真度；其中由于封闭复合物的形成所引起的构象变化或极性环境变化被反映为染料的荧光或吸光度特性的变化。已知诸如cy3和荧光素的常见的荧光团对聚合酶结合和封闭复合物形成具有强的溶剂化显色响应(solvatochromatic response)，达到的程度使得封闭复合物的形成可以明显与二元聚合酶-核酸复合物相区分。任选地，可以基于来自构象敏感性染料的荧光或吸光度信号的差异来区分封闭复合物与二元复合物。任选地，可以使用溶剂化显色染料来监测构象转变；其中由构象变化诱导的局部极性环境的变化可以用作报告信号。溶剂化显色染料包括但不限于雷查特氏染料(Reichart′s dye)、IR44、部花青染料(例如部花青540)、4-[2-N-取代的1，4-氢化吡啶-4-亚基)亚乙基]环己-2，5-二烯-1-酮、红色吡唑啉酮染料、偶氮甲碱染料、靛苯胺染料、二氮杂部花青染料、靛青类染料(实例有靛青)等以及其混合物。将染料或荧光团引入到聚合酶的特定位点的方法是本领域公知的。作为非限制性实例，用染料位点特异性标记T7 DNA聚合酶的程序提供于Yu-Chih Tsai，Zhinan Jin以及Kenneth A.Johnson，“Site-Specific Labeling of T7 DNA Polymerasewith a Conformationally Sensitive Fluorophore and Its Use in DetectingSingle-Nucleotide Polymorphisms，”Ahalytical Biochemistry 384，第1期(2009年1月1日)：136-44中，该参考文献以引用的方式整体并入本文。

任选地，将聚合酶在可以感测封闭复合物形成的位置处用荧光团标记而不会干扰反应。所述聚合酶可以是天然的或修饰的聚合酶。修饰的聚合酶包括具有一个或多个氨基酸突变、添加、和/或缺失的聚合酶。任选地，一个或多个，但并非所有的半胱氨酸氨基酸被突变成另一种氨基酸，如丙氨酸。在这种情况下，其余的一个或多个半胱氨酸用于与荧光团进行位点特异性缀合。或者，一个或多个氨基酸被突变成适用于荧光团缀合的反应性氨基酸，如半胱氨酸或包含伯胺的氨基酸。

任选地，在正确的核苷酸存在下聚合酶与模板核酸之间的结合可以诱导荧光降低，而与不正确的核苷酸结合引起荧光增加。在正确的核苷酸存在下聚合酶与模板核酸之间的结合可以诱导荧光增加，而与不正确的核苷酸结合引起荧光降低。可以使用荧光信号来监测核苷酸诱导的构象变化的动力学并且鉴定模板核酸序列中的下一个碱基。

任选地，可以通过源自于聚合酶或与聚合酶连接的标签，例如纳米颗粒标签的散射信号来监测聚合酶/核酸相互作用。

任选地，可以将一种或多种核苷酸用区分和/或可检测的标签或标记来标记，然而，这样的标签或标记在检查、对碱基的鉴定或碱基的掺入期间不被检测，并且这样的标签或标记在本文所公开的测序方法期间不被检测。所述标签可以是可借助于它们在荧光、拉曼光谱、电荷、质量、折射率、发光、长度、或任何其他可测量的特性方面的差异来区分的。所述标签可以连接到核苷酸上的一个或多个不同的位置，只要与聚合酶-核酸复合物的结合的保真度被充分维持以使得能够正确地鉴定模板核酸上的互补碱基即可。任选地，所述标签连接到核苷酸的核苷碱基位置。在合适的反应条件下，标记的核苷酸可以被包封在具有聚合酶和引发的模板核酸的封闭复合物中。或者，标签连接到核苷酸的γ磷酸位置。

任选地，利用来自聚合酶的固有信号来监测在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸之间的相互作用，所述固有信号包括但不限于拉曼信号、色氨酸、2-氨基嘌呤或其他固有荧光。可以利用聚合酶氨基酸的固有荧光来检测在本文所公开的测序方法的一个或多个步骤，例如封闭复合物形成或释放期间发生的聚合酶构象变化。具有固有荧光的氨基酸包括色氨酸、酪氨酸、以及苯丙氨酸。任选地，一个或多个聚合酶氨基酸被突变成包含色氨酸、酪氨酸、或苯丙氨酸残基。聚合酶可以通过包括遗传修饰或化学修饰在内的任何手段来修饰以包含具有固有荧光的另外的氨基酸。任选地，固有荧光受到可能引起荧光猝灭的其他氨基酸，如具有质子化基团的那些氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)的接近的影响。任选地，聚合酶的色氨酸残基在聚合酶被构造成封闭复合物时被埋在疏水核心中，并且在聚合酶被释放或不参与封闭复合物构象时暴露于水性环境。色氨酸的发射光谱是根据环境(亲水或疏水)而不同的，从而允许检测封闭复合物。任选地，使用聚合酶的固有荧光来鉴定在测序反应期间的构象变化。在一个实施例中，使用类似于以下文献中所提到的那些的技术来监测来自聚合酶的色氨酸残基的固有荧光发射：Yu-Chih Tsai，Zhinan Jin以及KennethA.Johnson，“Site-Specific Labeling of T7 DNA Polymerase with aConformationally Sensitive Fluorophore and Its Use in Detecting Single-Nucleotide Polymorphisms，”Analytical Biochemistry 384，第1期(2009年1月1日)：136-44，该参考文献以引用的方式整体并入本文。

可以在不使用所标记的标记的情况下监测在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸之间的相互作用。可以通过检测折射率的变化、电荷检测、拉曼散射检测、椭圆光度法检测、pH值检测、尺寸检测、质量检测、表面等离子体共振、导模共振、纳米孔光学干涉测量法、回音壁模共振、纳米颗粒散射、光子晶体、石英晶体微量天平、生物膜干涉测量法、振动检测、压力检测以及检测由于具有模板核酸的封闭复合物中聚合酶的结合而增加的质量或折射率的其他无标记检测方案来监测测序反应。

任选地，利用聚合酶的拉曼特征(Raman signature)来检测在本文所公开的测序方法的一个或多个步骤，例如封闭复合物形成或释放期间发生的聚合酶构象变化。任选地，在本文所述的核酸测序方法的一个或多个步骤期间，将光以可见、近红外、或近紫外范围引导到测序反应混合物。光与反应中的分子振动或其他激发相互作用，从而使得光的能量被转移。能量转移提供了有关反应的振动模式的信息并且因此提供了有关反应组分(例如聚合酶)的构型的信息。本公开的测序方法可以使用表面增强拉曼光谱法、共振拉曼光谱法、尖端增强拉曼光谱法、偏振拉曼光谱法、刺激拉曼光谱法、透射拉曼光谱法、空间偏移拉曼光谱法、以及超拉曼光谱法来检测。

任选地，检测折射率的变化是以包括但不限于以下各项的手段中的一种或组合来实现的：表面等离子体共振传感、局部等离子体共振传感、等离子体-光子耦合传感、经由亚波长纳米孔的透射传感(增强的光透射)、光子晶体传感、干涉测量法传感、折射传感、导模共振传感、环形谐振器传感、或椭圆光度法传感。任选地，核酸分子可以被定位到表面，其中在各种核苷酸存在下聚合酶与核酸的相互作用可以以局部折射率的变化被测量。

任选地，模板核酸被适当地拴系或定位到表面上或附近，以使得在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的相互作用改变了穿过所述表面透射或从所述表面反射的光。所述表面可以含有纳米结构。任选地，所述表面能够维持等离子体或等离子体共振。任选地，所述表面是光子基底，不限于谐振腔、谐振环或光子晶体板。任选地，所述表面是导模共振传感器。任选地，核酸被适当地拴系到或定位在纳米孔阵列、纳米颗粒或微粒上或附近，以使得在核苷酸存在下聚合酶和模板核酸的相互作用改变了与所述微粒或纳米颗粒相互作用的光的吸光度、散射、反射或共振。

任选地，使用金表面上的纳米孔阵列作为折射率传感器。可以通过标准硫醇化学方法，在PCR反应中用于扩增DNA的引物中的一种上掺入硫醇基来使模板核酸连接到金属表面。当针对入射光适当地调整纳米孔阵列的尺寸时，在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的结合可以以穿过纳米孔透射的光的变化来监测。对于标记方案和无标记方案这两者，简单和直接测量平衡信号强度可以揭示稳定的封闭复合物的形成。

任选地，核酸分子被定位到能够维持表面等离子体的表面，其中由聚合酶与定位的核酸的相互作用所引起的折射率的变化可以经由表面等离子体的特性变化来监测，其中此外，所述表面等离子体的特性可以包括表面等离子体共振。表面等离子体、局部表面等离子体(LSP)、或表面等离子体激元(SPP)源于电磁波与表面电荷的等离子体振荡的耦合。在高电子迁移率表面与电介质之间的界面处，LSP被限制在纳米颗粒表面，而SPP被限制在高电子密度表面。表面等离子体可以沿着界面的方向传播，而它们仅以瞬逝方式穿透到电介质中。当入射电磁辐射的频率与表面电子振荡的自然频率匹配时，建立表面等离子体共振条件。在界面处，例如由于结合或分子拥挤所引起的介电特性的变化影响了表面电子的振荡，从而改变表面等离子体共振波长。能够进行表面等离子体共振的表面以非限制性方式包括纳米颗粒、纳米颗粒簇和聚集体、连续的平面表面、纳米结构化的表面、以及微观结构化的表面。诸如金、银、铝、高导电性金属氧化物(例如氧化铟锡、氧化锌、氧化钨)的材料能够在它们的表面处支持表面等离子体共振。

任选地，单个核酸分子、或核酸的多个克隆拷贝连接到纳米颗粒，以使得聚合酶与核酸的结合引起局部表面等离子体共振(LSPR)的偏移。入射到纳米颗粒上的光诱导它们中的传导电子以谐振频率共同振荡，所述谐振频率取决于纳米颗粒的尺寸、形状以及组成。所关注的纳米颗粒可以采用不同的形状，包括球形的纳米颗粒、纳米棒、纳米锥体、纳米金刚石、以及纳米圆盘。由于这些LSPR模式，纳米颗粒如此强烈地吸收并且散射光以使得单个纳米颗粒容易使用暗场(光散射)显微镜术由眼睛来观测。举例来说，单个80-nm银纳米球以(3X10^-2)m²的散射截面散射445-nm蓝光，这是荧光素分子的荧光截面的100万倍，并且是填充有荧光素达到自猝灭限度的类似尺寸的纳米球的截面的1000倍。任选地，纳米颗粒是被配置成在可见光谱中的任何位置处具有散射峰的超高亮纳米级光学散射体的等离子体共振颗粒。等离子体共振颗粒是有利的，这是因为它们不会漂白。任选地，制备等离子体共振颗粒，用模板核酸包被，并且提供于包含聚合酶和一种或多种核苷酸的反应混合物中，其中检测聚合酶-模板核酸-颗粒相互作用。上述步骤中的一个或多个可以基于或源自于以下文献中所公开的一种或多种方法：Sheldon Schultz等人，“Single-Target MoleculeDetection with Nonbleaching Multicolor Optical Immunolabels，”Proceedings ofthe National Academy of Sciences 97，第3期(2000年2月1日)：996-1001，该参考文献以引用的方式整体并入本文。

在共振波长处的非常大的消光系数使得贵金属纳米颗粒能够用作用于近表面相互作用的非常强烈的标记。任选地，聚合酶与纳米颗粒定位的DNA的相互作用引起共振波长的偏移。由于结合或结合相互作用所引起的共振波长的变化可以多种方式之一来测量。任选地，通过一定范围的波长扫描照射以鉴定在成像装置处观测到最大散射的波长。任选地，宽带照射结合成像装置附近的色散性元件一起使用，以使得以光谱法鉴定共振峰。任选地，纳米颗粒系统可以在它的共振波长处或它的共振波长附近被照射，并且任何结合相互作用可以以散射光强度的下降来观测，这是因为新的共振波长偏离照射波长。根据照射波长的定位，相互作用甚至可以表现为纳米颗粒散射的增加，这是因为共振峰朝向照射波长偏移。任选地，连接DNA的纳米颗粒可以被定位到表面，或可替代地，连接DNA的纳米颗粒可以悬浮在溶液中。使用纳米颗粒的生物传感的综合评述描述于Jeffrey N.Anker等人，“Biosensing with Plasmonic Nanosensors，”Nature Materials 7，第6期(2008年6月)：442-53中，该参考文献以引用的方式整体并入本文。

任选地，能够进行LSPR的纳米特征在平面基底上被光刻图案化。纳米特征的二维图案化在大量不同的核酸分子的多重化和高通量分析中具有优势。任选地，金纳米柱是用于对聚合酶-模板核酸相互作用进行表面等离子体共振成像检测的基底，其中核酸连接到所述纳米柱。纳米结构尺寸和周期可能影响表面等离子体共振信号增强，任选地，在与对照胶片相比时，提供2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或更高的信号放大。

任选地，表面等离子体共振可以在平面表面中被维持。基于克里施曼配置(Kretschmann configuration)(例如Biacore，Uppsala，Sweden)和表面等离子体共振成像(例如GWC Technologies，Madison，WI或Horiba，Kyoto，Japan)的许多商业仪器在市场上容易获得，并且具有公认的方案来以单点和多重化阵列图案这两者使DNA连接到它们的表面。在克里施曼配置中，金属膜(通常是金)被蒸发到棱镜的侧面上并且以一定角度发射入射辐射以激发表面等离子体。瞬逝波在另一侧穿过激发等离子体的金属膜，其中它可以用于监测金膜附近的近表面和表面相互作用。以此共振角，从棱镜-金界面反射的光严重衰减。假定固定波长照射，可以通过监测接近共振角的固定角度的反射光的强度以及通过监测建立表面等离子体共振条件所需的入射角(最小反射率)的变化来检查结合相互作用。当利用二维成像装置，如CCD或CMOS照相机监测反射光时，整个照射区域可以高分辨率成像。这种方法被称作表面等离子体共振成像(SPRi)。它允许同时对表面上独立的区域进行高通量分析。也可以固定角度配置使用宽带照射，其中通过在反射光谱中寻找下降来用光谱法鉴定与表面等离子体共振相关的波长。经由共振波长的偏移来监测表面相互作用。

表面等离子体共振是监测蛋白质-核酸相互作用的非常成熟的方法，并且存在用于核酸连接以及分析数据的许多标准方案。来自文献的说明性参考包括Bongsup Cho等人，“Binding Kinetics of DNA-Protein Interaction Using Surface PlasmonResonance，”Protocol Exchange，2013年5月22日；以及Jennifer M.Brockman，AnthonyG.Frutos和Robert M.Corn，“A Multistep Chemical Modification Procedure ToCreate DNA Arrays on Gold Surfaces for the Study of Protein-DNA Interactionswith Surface Plasmon Resonance Imaging，”Journal of the American ChemicalSociety 121，第35期(1999年9月1日)：8044-51，这两篇参考文献以引用的方式整体包括在本文中。

聚合酶/核酸相互作用可以在能够维持局部表面等离子体的纳米结构化的表面上被监测。任选地，聚合酶/核酸相互作用可以在能够维持表面等离子体激元的纳米结构化的表面上被监测。

任选地，聚合酶/核酸相互作用可以在能够维持局部表面等离子体的纳米结构化的表面上被监测。任选地，聚合酶/核酸相互作用可以在能够维持表面等离子体激元的纳米结构化的表面上被监测。

任选地，可以使用经由纳米孔阵列的超强光透射(EOT)来监测核酸/聚合酶相互作用。穿过等离子体金属膜中的亚波长纳米孔透射的光高于从经典电磁理论所预期的。该增强的光透射可以通过考虑与入射辐射的等离子体共振耦合来解释，由此在共振波长下，比预期分量大的光穿过金属纳米孔透射。增强的光透射取决于纳米孔的尺寸和间距、金属的特性以及带有纳米孔的金属膜的任一侧上的介质的介电特性。在生物传感器的背景下，金属纳米孔阵列的透射率取决于接触金属膜的介质的折射率，由此，例如，聚合酶与连接到金属表面的核酸的相互作用可以以穿过纳米孔阵列透射的光强度的变化被监测。EOT/等离子体纳米孔阵列方法的优点在于表面等离子体共振的仪器和对准要求可以由非常紧凑的光学器件和成像元件取代。举例来说，仅仅低功率LED照射和便宜的CMOS或CCD照相机就可能足以实现稳健的EOT等离子体传感器。示例性基于纳米孔阵列的表面等离子体共振传感装置描述于C.Escobedo等人，“Integrated Nanohole Array Surface Plasmon ResonanceSensing Device Using a Dual-Wavelength Source，”Journal of Micromechanics andMicroengineering 21，第11期(2011年11月1日)：115001中，该参考文献以引用的方式整体并入本文。

等离子体纳米孔阵列可以在沉积在玻璃表面上的不透光的金层(大于50nm厚度)上被图案化。任选地，等离子体纳米孔阵列可以在沉积在玻璃上的光学厚铝膜或银膜上被图案化。任选地，纳米孔阵列在沉积在低折射率塑料上的光学厚金属层上被图案化。将等离子体纳米孔阵列在低折射率塑料上图案化通过更好地匹配金属层的两侧上的折射率来提高装置对折射率变化的灵敏度。任选地，通过增加孔之间的距离来增加纳米孔阵列的折射率灵敏度。任选地，通过复制，例如通过压印、铸造、压印光刻、或模板剥离来制造纳米孔阵列。任选地，通过使用胶体自组装来制造纳米孔阵列。任选地，通过投影直接图案化，如激光干涉光刻来制造纳米孔阵列。

纳米桶(nano-bucket)配置可能优于纳米孔配置。在纳米孔配置中，纳米特征的底部是玻璃或塑料或其他适当的电介质，而在纳米桶配置中，纳米特征的底部包含等离子体金属。纳米桶阵列配置可能更容易以大规模生产方式制造，同时维持对局部折射率的透射灵敏度。

任选地，纳米孔阵列等离子体传感与无透镜全息成像组合以用于以低成本方式进行大面积成像。任选地，等离子体生物传感平台包括包含纳米孔阵列的等离子体芯片、被配置成照射所述芯片的发光二极管源、以及记录所述纳米孔的衍射图的CMOS成像器芯片，所述衍射图由表面上的分子结合事件调节。所述结合事件可以是在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸之间的封闭复合物的形成。

将表面官能化(用于核酸连接)以用于表面等离子体共振传感的方法可以直接应用于EOT纳米孔阵列，这是因为这两种传感方案均使用需要连接核酸的相似的金属表面。

任选地，与聚合酶/核酸相互作用相关的折射率变化可以在不支持等离子体的纳米结构化的表面上被监测。任选地，可以使用导模共振来监测聚合酶/核酸相互作用。导模共振或波导模共振是其中光波导的导模可以通过引入相位匹配元件，如衍射光栅或棱镜来激发并且同时提取的现象。这样的导模也被称作“漏模(leaky mode)”，这是因为它们不被引导并且已经在一维和二维光子晶体板中被观测到。导模共振可以被认为是彼此相邻放置或彼此叠置的两个光学结构的衍射模与波导模的耦合。举例来说，对于被放置在光波导顶部上的衍射光栅，衍射模之一可以精确地耦合到光波导的导模中，从而引起该模式沿着波导传播。对于非共振条件，没有光被耦合到波导中，因此，结构可能看起来完全透明(如果使用介电波导的话)。在共振下，共振波长被强耦合到波导中，并且可以根据来自光栅-波导界面的下游元件从结构中耦合输出。在其中光栅耦合器在波导的整个表面上延伸的情况下，光不能被引导，这是因为耦合输入的任何光在下一个光栅元件处被耦合输出。因此，在光栅波导结构中，共振以强反射峰被观测到，而结构对于非共振条件是透明的。共振条件取决于入射光的角度、光栅特性、偏振以及波长。对于其中导模传播例如由于光栅与波导的整个表面耦合而不存在的情况，鉴于在波导层的横向方向上辐射的强光学限制和瞬逝传播，共振模也可以被称作漏模共振。例如由于生物分子的结合所引起的在光栅附近介电特性的变化影响了向波导中的耦合，从而改变共振条件。任选地，在核酸分子连接到光栅波导结构的表面的情况下，聚合酶/核酸相互作用可以以漏模共振的波长变化来监测。

可以在透明基底上直接使用衍射元件而对波导元件没有明确的需要。由于光栅纳米结构附近的相互作用所引起的共振条件的变化可以以反射或透射的辐射的共振波长偏移来监测。

可以使用来自连接核酸的导模共振传感器的反射光来监测聚合酶/核酸相互作用。可以使用宽带照射源来照射，并且对反射光的光谱检查可以揭示由于聚合酶结合所引起的局部折射率的变化。

任选地，可以使用宽带照射并且可以检查透射光以鉴定由于聚合酶相互作用所引起的共振偏移。可以使用线性偏振的窄带照射，并且可以经由正交偏振器对透射光进行过滤；其中除了偏振被改变的漏模响应之外，透射光由于正交偏振器而完全衰减。这种实施方式将折射率监测转换成可以在低成本的成像系统上被监测的简单透射测定。公开的材料描述了光学部件的组装。参见Yousef Nazirizadeh等人，“Low-Cost Label-Free BiosensorsUsing Photonic Crystals Embedded between Crossed Polarizers，”Optics Express18，第18期(2010年8月30日)：19120-28，该参考文献以引用的方式整体并入本文。

除了纳米结构化的表面以外，还可以有利地使用平坦的未结构化的表面来监测折射率调节。任选地，可以使用干涉测量法来监测聚合酶与结合到未结构化的光学透明的基底的核酸的相互作用。核酸分子可以连接到载玻片的顶部表面(通过本领域已知的任何手段)，并且从载玻片的底部表面照射系统。在该配置中存在两个反射表面，一个是从载玻片的底部表面反射，并且另一个是从连接有核酸分子的顶部表面反射。这两个反射波可能彼此干涉，从而基于路径长度差而引起相长干涉或相消干涉，从顶部表面反射的波被由于结合的核酸分子所引起的介电常数的变化(并且随后被聚合酶与结合的核酸分子的相互作用)来调节。在来自底部表面的反射保持不变的情况下，与核酸分子的任何结合可以反映在从顶部表面和底部表面反射的光束之间的相位差，这进而影响所观测到的干涉图。任选地，使用生物膜干涉测量法来监测核酸/聚合酶相互作用。可以在商业装置，如由Pall ForteBio公司(Menlo Park，CA)出售的那些上进行生物膜干涉测量法。

任选地，通过使用聚焦光学器件来选择性地选择从顶部表面反射的光。从底部表面反射的光由于它不在焦平面中而被忽略。仅聚焦在连接核酸的顶部表面上，通过聚焦透镜收集的光包括平面波，对应于部分反射的入射辐射；以及散射波，对应于由焦平面中的分子在收集方向上散射的辐射。如果入射辐射是相干的，那么可能使这两个分量干涉。这种基于散射的干涉测量检测是非常灵敏的并且可以用于检测低到单个蛋白质分子。

在检查步骤之后，在下一个碱基的身份已经经由封闭复合物的形成被鉴定的情况下，在适当时可以重置、补给、或改变反应条件，以为任选的掺入步骤或另外的检查步骤作准备。任选地，下一个碱基的身份已经被鉴定而没有化学掺入核苷酸。任选地，在核苷酸化学掺入的情况下鉴定下一个碱基的身份，其中后续的核苷酸掺入已经被抑制。任选地，去除或洗掉不包括正被测序的模板核酸的检查步骤的所有组分，从而使系统返回到检查前条件。任选地，去除检查步骤的部分组分。任选地，将另外的组分添加到检查步骤中。

任选地，在掺入步骤中使用可逆终止子核苷酸来确保每个循环掺入一个核苷酸，并且是仅掺入一个核苷酸。在可逆终止子核苷酸上不需要标记，这是因为碱基身份从检查步骤已知。未荧光标记的可逆终止子容易从商业供应商获得。预期未标记的可逆终止子核苷酸与标记的可逆终止子相比具有快得多的掺入动力学，这是因为它们具有更小的空间占用以及与天然核苷酸相似的尺寸。

本文部分地公开了试剂循环测序方法，其中对于检查和/或掺入的每一个循环，相继地引入测序试剂。任选地，测序反应混合物包含聚合酶、引发的模板核酸、以及至少一种类型的核苷酸。任选地，循环地将核苷酸和/或聚合酶引入到测序反应混合物中。任选地，测序反应混合物包含多种聚合酶、引发的模板核酸、以及核苷酸。任选地，循环地将多种核苷酸和/或多种聚合酶引入到测序反应混合物中。任选地，测序反应的检查步骤与测序反应的掺入步骤具有不同的组成。

如本文所提供，聚合酶指的是单一聚合酶或多种聚合酶。如本文所提供，引发的模板核酸或模板核酸指的是单一引发的模板核酸或单一模板核酸、或多种引发的模板核酸或多种模板核酸。如本文所提供，核苷酸指的是一种核苷酸或多种核苷酸。如本文所提供，单一核苷酸是一种核苷酸。任选地，测序反应核苷酸包括但不限于以下核苷酸中的1种、2种、3种、或4种：dATP、dGTP、dCTP、以及dTTP。任选地，试剂循环涉及将模板核酸固定到平台，洗掉当前的反应混合物，以及向模板核酸添加新的反应混合物。

任选地，将一种或多种核苷酸依次添加到测序反应中并且从测序反应中去除。任选地，将1种、2种、3种、4种或更多种类型的核苷酸添加到反应混合物中并且从反应混合物中去除。举例来说，将一种类型的核苷酸添加到测序反应中，去除，并且用另一种类型的核苷酸代替。任选地，在检查步骤期间存在的核苷酸类型不同于在掺入步骤期间存在的核苷酸类型。任选地，在一个检查步骤期间存在的核苷酸类型不同于在连续检查步骤期间存在的核苷酸类型(即在掺入步骤之前进行连续检查步骤)。任选地，在检查反应混合物中存在1种、2种、3种、4种或更多种类型的核苷酸并且在掺入反应混合物中存在1种、2种、3种、4种、或更多种类型的核苷酸。

任选地，循环地将聚合酶添加到测序反应中并且从测序反应中去除。可以循环地将一种或多种不同类型的聚合酶添加到测序反应中并且从测序反应中去除。任选地，在检查步骤期间存在的聚合酶类型不同于在掺入步骤期间存在的聚合酶类型。在一个检查步骤期间存在的聚合酶类型可能不同于在连续检查步骤期间存在的聚合酶类型(即在掺入步骤之前进行连续检查步骤)。

任选地，试剂条件，如试剂的存在、pH值、温度、以及离子强度在整个测序反应中是变化的。任选地，循环地将金属添加到测序反应中并且从测序反应中去除。举例来说，催化性金属离子可能在检查步骤期间不存在并且在掺入步骤期间存在。或者，聚合酶抑制剂可能在检查步骤期间存在并且在掺入步骤期间不存在。任选地，通过在测序反应期间的任何时刻添加新的组分来补充在测序反应期间消耗的反应组分。

可以连同聚合酶一起向有利于封闭复合物形成的反应条件中每次添加一种类型的核苷酸。如果下一个正确的核苷酸存在，那么聚合酶仅与模板核酸结合。在每一次核苷酸添加之后的洗涤步骤确保未参与封闭复合物的所有过量的聚合酶和核苷酸从反应混合物中去除。如果按照已知的顺序每次添加一种核苷酸，那么在所添加的核苷酸是下一个正确的核苷酸时，通过封闭复合物的形成来确定模板核酸上的下一个碱基。所述封闭复合物可以通过构象变化和聚合酶-模板核酸-核苷酸相互作用的稳定性增加来鉴定。任选地，在下一个正确的核苷酸存在下形成的封闭复合物的稳定性比在不正确的核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的不稳定的相互作用大至少一个数量级。使用洗涤步骤确保不存在未结合的核苷酸和聚合酶并且反应中存在的仅有的核苷酸是被隔离在与聚合酶和模板核酸的封闭复合物中的那些。一旦模板核酸上的下一个碱基被确定，被隔离在封闭复合物中的下一个正确核苷酸就可以通过在有利于封闭复合物的解离或去稳定的反应条件下流动并且使模板核酸引物链延伸一个碱基(掺入)来被掺入。因此，洗涤步骤确保了所掺入的唯一核苷酸是来自封闭复合物的下一个正确的核苷酸。这种试剂循环方法可以重复并且确定核酸序列。这种试剂循环方法可以应用于单个模板核酸分子或克隆群体的集合，如PCR产物或滚环扩增的DNA。如果许多不同的模板例如在固体载体上形成阵列，那么它们可以被并行测序。任选地，所述洗涤步骤使二元复合物的形成不稳定。任选地，将洗涤进行一段持续时间，该持续时间确保二元复合物被去除，从而在反应混合物中留下稳定的封闭复合物。任选地，所述洗涤步骤包括用高离子强度或高pH值溶液洗涤反应物。

任选地，掺入步骤是三阶段过程。在第一阶段中，在有利于封闭复合物形成的反应条件下，将所有四种核苷酸类型与高保真聚合酶一起引入到包含引发的模板核酸的反应中，并且允许下一个正确的核苷酸与模板核酸形成稳定的封闭复合物。在第二阶段中，洗掉过量的核苷酸和未结合的聚合酶。在第三阶段中，改变反应条件以使得封闭复合物不稳定并且封闭复合物内所隔离的核苷酸被掺入到模板核酸引物的3′末端中。可以通过标准技术，如使非特异性DNA结合结构域与聚合酶(例如Phusion聚合酶)融合，以及利用高浓度的核苷酸以确保正确的核苷酸始终存在于封闭复合物中来使得在掺入步骤中能够形成紧密的聚合酶-核酸复合物。

在下一个正确的核苷酸存在下聚合酶分子以手指状结构封闭式构象与引发的核酸分子结合，即使是在不存在聚合酶合成反应通常所需的二价金属离子的情况下。构象变化将与下一个模板碱基互补的核苷酸截留在聚合酶的活性位点内。任选地，可以使用封闭复合物的形成来确定模板核酸上的下一个碱基的身份。任选地，可以在聚合酶存在下，在不存在催化性二价金属离子的情况下，使引发的模板核酸连续地由不同的核苷酸接触；其中封闭复合物的形成指示目前与模板核酸接触的核苷酸是与核酸上的下一个碱基互补的核苷酸。与模板核酸接触(在聚合酶存在下，在不存在催化性金属离子的情况下)的核苷酸的已知顺序确保了以诱导封闭复合物形成的顺序基于特定位置容易地鉴定互补核苷酸。任选地，可以在每一次核苷酸添加之后进行适当的洗涤步骤以确保去除所有过量的酶和核苷酸，从而仅留下与封闭复合物中的核酸结合的聚合酶，其中下一个正确的核苷酸处在活性位点处。所述封闭复合物可以通过以下手段来鉴定：揭示呈封闭式构象的聚合酶的构象变化的手段或通过揭示与二元聚合酶-核酸复合物相比或与聚合酶、引发的模板核酸以及不正确的核苷酸之间的不稳定的相互作用相比聚合酶/核酸/下一个正确核苷酸复合物的稳定性增加的手段。

任选地，鉴定下一个互补核苷酸的过程(检查步骤)包括以下步骤：在抑制核苷酸化学掺入的条件下使固定的引发模板核酸与包含聚合酶和一个种类的核苷酸的检查混合物接触；通过洗涤步骤去除未结合的试剂；检测固定的核酸上聚合酶封闭复合物的存在；以及连续地使用不同种类的核苷酸重复步骤a-c直到检测到封闭复合物的形成为止。可以通过构象变化以及聚合酶/核酸/下一个正确核苷酸复合物的稳定性增加来鉴定封闭复合物。在连续的核苷酸添加之间的洗涤步骤可以通过使用可以高保真度检测封闭复合物的形成的检测机制，例如瞬逝波传感方法或选择性地监测来自封闭复合物的信号的方法来消除。在上述检查步骤之后可以进行掺入步骤，所述掺入步骤包括使封闭复合物与催化性金属离子接触以将被隔离在封闭复合物中的核苷酸共价添加到引物的3′末端。任选地，掺入步骤可以包括在抑制核苷酸化学掺入的条件下使固定的核酸与包含多种类型的核苷酸和聚合酶的组合的预掺入混合物接触；其中所述预掺入混合物可以含有确保非常高效的封闭复合物形成的添加剂和溶液条件(例如低盐条件)。所述方法还可以包括进行洗涤步骤以去除未结合的试剂以及向固定的复合物提供包含催化性金属离子的掺入混合物以化学掺入被隔离在聚合酶的活性位点内的核苷酸。预掺入混合物确保非常高效的封闭复合物形成，而洗涤步骤和掺入混合物确保将单个核苷酸添加到引物的3′末端。任选地，掺入步骤可以在检查一种类型的核苷酸的添加之后直接进行。举例来说，用于测序的重复模式可以包括以下流程模式：(i)dATP+/聚合酶；(ii)洗涤；(iii)Mg；(iv)洗涤；(v)dTTP+/聚合酶；(vi)洗涤；(vii)Mg；(viii)洗涤；(ix)dCTP+/聚合酶；(x)洗涤；(xi)Mg；(xii)洗涤；(xiii)dGTP+/聚合酶；(xiv)洗涤；(xv)Mg；(xvi)洗涤。任选地，用于测序的重复模式可以包括(i)dATP+/聚合酶；(ii)洗涤；(iii)dTTP+/聚合酶；(iv)洗涤；(v)dGTP+/聚合酶；(vi)洗涤；(vii)dCTP+/聚合酶；(viii)洗涤；(ix)预掺入混合物；(x)洗涤；(xi)Mg；(xii)洗涤。洗涤步骤通常含有金属离子螯合剂和其他小分子以防止在检查步骤期间的意外掺入。在掺入步骤之后，引物链通常延伸一个碱基。重复该过程，可以鉴定核酸的连续核碱基，从而有效地确定核酸序列。任选地，在高盐条件下，例如在50mM至1500mM盐的条件下进行检查步骤。

对于测序应用，可以有利的是，使射流器件(fluidics)和试剂交换减到最低限度或消除。去除泵、阀门以及试剂容器可以允许更小的和更低成本的装置。本文部分地公开了“全包式(all-in)”测序方法，其中对于检查和/或掺入的每一个循环，对相继地引入试剂的需要被消除。仅将试剂一次性添加到反应中，并且通过操纵已经包括在测序反应内的试剂来进行边合成边测序。像这样的方案需要区分不同的核苷酸的方法、使核酸的克隆群体中和/或不同的核酸分子间核苷酸的掺入同步化的方法、以及确保每个循环仅添加一个核苷酸的方法。任选地，测序反应混合物包含聚合酶、引发的模板核酸、以及至少一种类型的核苷酸。任选地，测序反应混合物包含多种聚合酶、引发的模板核酸、以及核苷酸。如本文所提供，聚合酶指的是单一聚合酶或多种聚合酶。如本文所提供，引发的模板核酸或模板核酸指的是单一引发的模板核酸或单一模板核酸、或多种引发的模板核酸或多种模板核酸。如本文所提供，核苷酸指的是一种核苷酸或多种核苷酸。如本文所提供，单一核苷酸是一种核苷酸。任选地，测序反应核苷酸包括但不限于以下核苷酸中的1种、2种、3种、或4种：dATP、dGTP、dCTP、以及dTTP。

任选地，检查步骤和掺入步骤在单一测序反应混合物中发生。

任选地，1种、2种、3种、4种或更多种类型的核苷酸(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP)同时共同存在于反应混合物中，其中一种类型的核苷酸是下一个正确的核苷酸。反应混合物还包含至少一种聚合酶和至少一种引发的模板核酸。任选地，模板核酸是模板核酸的克隆群体。任选地，聚合酶、引发的模板核酸、以及核苷酸在检查反应条件下形成封闭复合物。

在所提供的方法中，四种类型的核苷酸可以独特的和不同的浓度存在，其中如果它们是下一个正确的核苷酸，那么对于这四种核苷酸中的每一种，聚合酶对模板核酸的扩散和结合时间是不同的，这是因为四种核苷酸的浓度不同。举例来说，最高浓度的核苷酸将在快速的时间内与它在模板核酸上的互补碱基结合，并且最低浓度的核苷酸将在较慢的时间内与它在模板核酸上的互补碱基结合；其中与模板核酸上的互补碱基结合指的是聚合酶与模板核酸在下一个正确的核苷酸在封闭复合物中的情况下结合。因此通过监测封闭复合物中聚合酶与模板核酸结合的速率或时间来确定下一个正确核苷酸的身份。任选地，这四种类型的核苷酸可以通过它们的浓度来区分，其中所述核苷酸的不同浓度产生聚合酶与核酸结合的可测量地不同的缔合速率。任选地，这四种类型的核苷酸可以通过它们的浓度来区分，其中所述核苷酸的不同浓度产生稳定的封闭复合物的形成的可测量地不同的缔合速率。任选地，聚合酶被标记。在一些情况下，聚合酶没有被标记并且使用本文公开的或本领域已知的任何无标记检测方法。任选地，经由聚合酶的可检测的特征来监测聚合酶与核酸的结合。任选地，经由聚合酶的可检测的特征来监测稳定的封闭复合物的形成。聚合酶的可检测的特征可以包括但不限于光学特征、电学特征、热学特征、比色特征、质量特征、以及其任何组合。

任选地，1种、2种、3种、4种、或更多种核苷酸类型(例如dATP、dTTP、dCTP、dGTP)被拴系到1种、2种、3种、4种、或更多种不同的聚合酶；其中每一种核苷酸类型被拴系到不同的聚合酶并且每一种聚合酶与其他聚合酶具有不同的标签或特征以使得它能够被鉴定。可以将所有拴系的核苷酸类型共同添加到测序反应混合物中，从而形成包含拴系的核苷酸-聚合酶的封闭复合物；监测所述封闭复合物以鉴定聚合酶，从而鉴定与聚合酶拴系的下一个正确的核苷酸。拴系可以在核苷酸的γ磷酸处经由多磷酸基团和接头分子进行。这样的γ-磷酸连接方法在本领域是标准的，其中荧光团与γ磷酸接头连接。标签包括但不限于光学特征、电学特征、热学特征、比色特征、质量特征或任何其他可检测的特征。任选地，通过可区分的标签来鉴定不同的核苷酸类型。任选地，可区分的标签与每一个核苷酸的γ磷酸位置连接。

任选地，测序反应混合物包含催化性金属离子。任选地，催化性金属离子可用于在测序反应中的任何时刻以瞬时方式与聚合酶反应。为了确保稳健的测序，催化性金属离子在短时间内可用，从而允许与模板核酸中的下一个碱基互补的单个核苷酸在掺入步骤期间被掺入到引物的3′末端中。在这种情况下，在没有其他核苷酸的情况下，例如与模板核酸中下一个碱基下游的碱基互补的核苷酸被掺入。任选地，催化性金属离子镁是作为光笼锁络合物(photocaged complex)(例如DM-Nitrophen)存在于测序反应混合物中的，以使得局部UV照射释放镁，从而使得它可用于聚合酶以进行核苷酸掺入。此外，测序反应混合物可以含有EDTA，其中镁在催化核苷酸掺入之后从聚合酶活性位点释放并且由测序反应混合物中的EDTA捕捉，从而使得镁不能催化后续的核苷酸掺入。

因此，在所提供的方法中，催化性金属离子可以螯合或笼锁形式存在于测序反应中，它可以通过触发剂从所述形式中释放。举例来说，催化性金属离子催化封闭复合物的下一个正确的核苷酸掺入，并且在催化性金属离子从活性位点释放时，它被第二螯合剂或笼锁剂隔离，从而使所述金属离子不能催化后续的掺入。通过使用局部解笼锁或解螯合方案，如瞬逝波照射或结构化照射来确保催化性金属离子从它的螯合或笼锁络合物中局部释放。催化性金属离子的受控释放可以例如通过热手段进行。可以通过局限的光场，例如通过瞬逝照射，如波导或全内反射显微镜术在模板核酸附近局部释放催化性金属离子从它们的光笼锁络合物中的受控释放。催化性金属离子的受控释放可以例如通过改变模板核酸附近的溶液的pH值来进行。诸如EDTA和EGTA的螯合剂具有pH值依赖性。在低于5的pH值，二价阳离子Mg²⁺和Mn²⁺不能有效地被EDTA螯合。可控地操纵模板核酸附近的pH值的方法允许催化性金属离子从螯合剂的受控释放。任选地，通过向与核酸连接的表面施加电压来诱导局部pH值变化。pH值方法提供的优势在于当pH值恢复到螯合范围时，该金属回到它的螯合形式。

任选地，催化性金属离子与聚合酶的活性位点强烈结合，这使得有必要在单个核苷酸掺入之后从模板核酸去除聚合酶。聚合酶的去除可以通过使用高度分配性聚合酶来实现，所述高度分配性聚合酶在添加每一个核苷酸之后从正合成的链(引物)的3′末端脱落。可以进一步使未结合的聚合酶经受电场或磁场以将它从核酸分子的附近去除。与聚合酶结合的任何金属离子可以由测序反应混合物中存在的螯合剂隔离或由与金属离子竞争结合聚合酶的活性位点的分子隔离而不干扰封闭复合物的形成。将聚合酶从模板核酸去除掉或移开的力(例如电场、磁场和/或螯合剂)可以被终止，从而允许聚合酶接近模板核酸以进行另一轮测序(即检查和掺入)。在非限制性实例中，下一轮测序包括形成封闭复合物；将未结合的聚合酶从模板核酸和/或封闭复合物附近去除；控制催化性金属离子的释放以掺入封闭复合物内隔离的单个核苷酸；将在单次掺入之后从模板核酸解离的聚合酶从模板核酸附近去除掉；经由使用螯合剂或竞争性结合剂隔离任何游离的催化性金属离子；以及允许聚合酶接近模板核酸以进行下一个测序循环。

本文提供了用于鉴定核酸序列的聚合酶-核酸结合反应。核酸序列鉴定可以包括关于核酸修饰的信息。核酸修饰包括甲基化和羟甲基化。甲基化可以在模板核酸的胞嘧啶碱基上发生。DNA甲基化可以稳定地改变基因表达。DNA甲基化也在各种类型的癌症、动脉粥样硬化、以及衰老的发展中被表现出。DNA甲基化因此可以用作人疾病的表观遗传生物标志物。

任选地，在本文提供的边结合边测序方法期间鉴定模板核酸上的一个或多个胞嘧啶甲基化。可以在测序之前将模板核酸进行克隆扩增，其中扩增子与它们的模板核酸包含相同的甲基化。模板核酸的扩增可以包括使用DNA甲基转移酶来实现扩增子甲基化。向包含聚合酶和一种或多种核苷酸类型的反应混合物提供模板核酸或扩增的模板核酸，其中监测聚合酶与核酸之间的相互作用。任选地，在甲基化的胞嘧啶存在下聚合酶与模板核酸之间的相互作用不同于在未修饰的胞嘧啶存在下的相互作用。因此，基于对聚合酶-核酸相互作用的检查，修饰的核苷酸的身份被确定。

本文特别提供了用于进行测序反应的系统，所述测序反应包括检查在核苷酸存在下聚合酶与引发的模板核酸之间的相互作用以鉴定模板核酸序列中的下一个碱基或鉴定填充在测序期间所遇到的均聚物区域所需的核苷酸数目。任选地，检查包括在核苷酸存在下监测聚合酶对引发的模板核酸的亲和力。任选地，聚合酶与核酸瞬时结合并且结合动力学和亲和力提供有关模板核酸上的下一个碱基的身份的信息。任选地，形成封闭复合物，其中涉及封闭复合物的形成的反应条件提供有关核酸上的下一个碱基的信息。任选地，通过不限于以下各项的手段中的一种或组合将聚合酶截留在它的封闭复合物中的聚合位点处：使聚合酶结构域交联；使聚合酶与核酸交联；通过小分子进行变构抑制；无竞争性抑制剂；竞争性抑制剂；非竞争性抑制剂；以及变性；其中截留的聚合酶复合物的形成提供了有关核酸模板上的下一个碱基的身份的信息。

还提供了一种用于执行本文公开的任何测序方法的一个或多个步骤的系统。任选地，所述系统包括在核苷酸存在下进行聚合酶和模板核酸结合测定所需的组分和试剂，其中模板核酸提供于纳米结构上。任选地，所述系统包括使模板DNA分子结合到纳米结构上所需的一种或多种试剂和说明书。举例来说，所述系统提供纳米结构，如芯片，它被配置用于表面等离子体共振以确定结合动力学。这样的芯片的实例是CM5传感器S芯片(GEHealthcare，Piscatawany，N.J.。所述系统可以提供诸如SPR仪器(例如Biacore)的仪器。所述系统可以提供链霉亲和素和/或生物素。任选地，所述系统提供生物素-DNA、DNA连接酶、缓冲液、和/或DNA聚合酶以用于制备生物素化的模板DNA。任选地，所述系统提供用于生物素化的DNA纯化的凝胶或试剂(例如苯酚∶氯仿)。或者，所述系统提供用于生物素化的模板DNA表征的试剂，例如质谱或HPLC。任选地，所述系统包括链霉亲和素、芯片、试剂、仪器、和/或说明书以用于将链霉亲和素固定在芯片上。任选地，在已经被配置用于模板DNA包被的系统中提供芯片，其中所述芯片用能够结合模板核酸或修饰的模板核酸(例如生物素化的模板DNA)的试剂固定。任选地，所述系统提供用于芯片再生的试剂。

还提供了一种用于执行本文所公开的任何测序方法的一个或多个步骤的系统。任选地，所述系统包括在核苷酸存在下进行聚合酶和模板核酸结合测定所需的组分和试剂，其中模板核酸提供于纳米颗粒上。任选地，所述系统包括使模板DNA分子结合到纳米颗粒上所需的一种或多种试剂和说明书。所述纳米颗粒可以被配置用于例如通过使用金纳米颗粒来电化学检测核酸-聚合酶相互作用。任选地，DNA-纳米颗粒缀合物在金胶体水溶液与模板DNA分子之间形成，所述模板DNA分子在它们的末端处包含游离的硫醇基或二硫基。所述缀合物可以包含DNA分子的克隆扩增的群体，所述DNA分子可能包含或可能不包含相同的核酸序列。任选地，在高温(例如＞60℃)和高离子强度(例如1M Na⁺)下使纳米颗粒缀合物稳定以防止絮凝和沉淀。任选地，所述系统提供用于制备模板DNA分子以用于纳米颗粒连接，包括产生具有二硫化物或硫醇的模板DNA分子的试剂。含有二硫化物的模板核酸可以使用例如3′-硫醇修饰剂可控孔度玻璃(CPG)或通过从通用载体CPG开始并且添加二硫化物修饰剂亚磷酰胺作为序列中的第一个单体来合成。所述系统可以提供用于获得二硫化物修饰的模板核酸的核酸合成试剂和/或说明书。含有硫醇的模板核酸也可以在核酸合成期间使用5′-三苯甲基硫醇修饰剂亚磷酰胺产生。所述系统可以提供用于使用例如电泳或离心进行纳米颗粒缀合物纯化的试剂和/或说明书。任选地，使用纳米颗粒缀合物来用比色法监测聚合酶-模板核酸相互作用。在这种情况下，在强烈的聚合酶结合存在下，纳米颗粒缀合物的解链温度增加。因此，DNA结合的强度可以通过该解链转变的变化来确定，这是可通过颜色变化来观测的。

还提供了一种用于执行本文所公开的任何测序方法的一个或多个步骤的系统。任选地，所述系统包括在核苷酸存在下，使用可检测的聚合酶进行聚合酶和模板核酸结合测定所需的组分和试剂。任选地，聚合酶被可检测地标记。任选地，使用聚合酶的固有特性，例如芳族氨基酸来检测聚合酶。任选地，聚合酶和模板核酸被配置用于溶液中，而不与载体缀合。聚合酶上的可检测的标记可以是荧光团，其中使用荧光来监测聚合酶-模板核酸结合事件。任选地，可检测的聚合酶可以与溶液中的模板核酸、或与载体结构缀合的模板核酸组合使用。任选地，聚合酶的一个或多个半胱氨酸残基用Cy3-顺丁烯二酰亚胺或Cy3-碘乙酰胺标记。任选地，所述系统包括制备荧光标记的聚合酶分子所需的试剂和/或说明书。所述系统可以包括用于纯化荧光标记的聚合酶的试剂和/或说明书。

公开了可以用于所公开的方法和组合物的产物、可以结合所述产物使用、可以用于制备所述产物、或作为所述产物的材料、组合物、以及组分。这些和其他材料公开于本文中，并且应当了解的是，当公开了这些材料的组合、子组、相互作用、组等时，虽然可能没有明确地公开对这些化合物的每一个不同的单独和集体组合和排列的具体提及，但是每一个都在本文中被具体考虑和描述。举例来说，除非特别指出相反的情况，否则如果公开和论述了方法并且论述了可以对包括所述方法在内的许多分子所作出的许多改动，那么所述方法的每一个组合和排列以及可能的改动都被具体考虑。同样，这些的任何子组或组合也被具体考虑和公开。该构思适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以进行的多个另外的步骤，那么应当了解的是，这些另外的步骤中的每一个可以与所公开的方法的任何具体方法步骤或方法步骤的组合一起进行，并且每一个这样的组合或组合的子组被具体考虑并且应当被认为是公开的。

本文引用的出版物以及引用它们的材料在此具体地以引用的方式整体并入本文。本说明书中所提到的所有出版物、专利、以及专利申请均以引用的方式并入本文，其引用的程度就如同每一篇单独的出版物、专利、或专利申请被具体地并且单独地指示为以引用的方式并入本文一般。

已经描述了许多实施方案。然而，应当了解的是，可以作出各种改动。因此，其他实施方案落入权利要求书的范围内。

实施例

实施例1.在结合步骤中存在或不存在镁的情况下确定碱基序列。

方法和材料.聚合酶缓冲液：20mM的Tris(ph 8)、300mM的NaCl、5mM的DTT、100μM的dNTP、150nM的Klenow、0.01％的BSA、0.02％的tween-20、10mM的MgCl2。检查缓冲液：20mM的Tris(ph 8)、300mM的NaCl、5mM的DTT、100μM的dNTP、150nM的Klenow、0.01％的BSA、0.02％的tween-20。掺入缓冲液：20mM的Tris(ph 8)、300mM的NaCl、5mM的DTT、0.01％的BSA、0.02％的tween-20、10mM的MgCl2。洗涤缓冲液：20mM的Tris(ph 8)、300mM的NaCl、5mM的DTT、0.01％的BSA、0.02％的tween-20。

图1示出了使用非标记的光学检测方法的实验的结果，其中在结合步骤或检查步骤期间镁存在或不存在。第一个流程是dCTP(C：T错配)并且第二个流程是dATP(A：T匹配)。图1中的实线示出了使用聚合酶缓冲液的结果。匹配A步骤和错配C步骤的稳态前速率常数分别是0.0106和0.0084。差异太小而无法准确地区分同源碱基。图1中的虚线代表在检查缓冲液中进行的无镁检查步骤，继而是在掺入缓冲液中浸泡。1.1nm的信号阈值可以准确地确定正确的碱基。这些结果显示当在检查期间在缓冲液中包括镁时，传感平台不能捕捉可以区分匹配碱基与错配碱基的瞬时动力学并且将不能进行序列确定(聚合酶缓冲液，实线，图1)。相反，在不存在镁的情况下，结合提供了在正确碱基与不正确碱基之间的非常大的辨认(检查缓冲液，虚线，图1)。正确的碱基序列是通过信号阈值处理，而不是结合速率来确定的。

实施例2.使用Bst酶结合动力学的测序。

可以使用结合动力学来在检查步骤期间，即在聚合酶、DNA模板以及核苷酸之间形成三元复合物期间确定正确的碱基或核苷酸。这示于图2中。Bst酶在正确的碱基存在时显示出双峰式结合曲线并且在不正确的碱基存在时显示出基本指数结合行为(图2)。从而允许在测序期间辨认和检测正确的碱基或核苷酸。

实验条件.

(Menlo Park，CA)Octet仪器(Red384或qk)使用生物膜干涉测量法来在光纤尖端表面处测量结合反应。将尖端用链霉亲和素(SA)官能化以使得能够结合5′生物素标记的DNA模板，所述模板与和所述模板的3′末端附近的序列互补的引物杂交。将PhiX_匹配C和phiX_匹配A上样到单个尖端上。将引物-模板在含有0.01％-0.02％BSA和0.01％-0.02％tween20的1-2×PBS(上样缓冲液)中以100nM至500nM上样到尖端上。FP2引物相对于模板是1.25倍-2倍过量的。通过信号的变化来监测上样并且在30℃通常在5分钟内达到平台。将尖端在上样缓冲液中浸泡1-5分钟以去除未结合的DNA材料。对于碱基识别，通常，将尖端浸泡在含有补充有0.01％-0.02％BSA和0.01％-0.02％tween20(LS缓冲液)、100nM聚合酶、100μM核苷酸、以及50mM至300mM的不同浓度的额外NaCl的1XTaq缓冲液(10mM Tris-HCl、50mM KCl，在25℃下pH 8.3，无镁)的溶液中。在该实验中，对于确定正确的碱基，使用30nM的Bst2.0酶、100μM的dNTP、以及含有150mM NaCl的LS缓冲液。phiX_匹配C双链体将形成三元复合物并且显示出结合信号的增加，这是因为存在正确的下一个核苷酸(同源)。phiX_匹配A不应当是这样，这是因为它是不正确的核苷酸(非同源)。在检查步骤之后，将传感器浸泡在含有5mM Mg的LS缓冲液中，以允许聚合酶掺入核苷酸，继而用含有150mM NaCl的LS缓冲液洗涤。

结果.迭代循环显示这种方法可以用于序列确定。下表显示前3个碱基通过这种检查方法正确地鉴定。第4个碱基通过所述检查方法是无识别并且可能反映了多次添加。这是由后续的碱基被正确鉴定的事实支持的。总之，6个碱基中有5个被正确鉴定。此外，没有观测到不正确的碱基的错误掺入。

表2：碱基鉴定

实施例3：边结合边测序。

在这个实施例中，在检查步骤期间使用高盐进行测序反应，继而进行掺入步骤。

实验条件.所用的结合/检查缓冲液是具有250mM的NaCl、100μM的dGTP、dCTP、dATP或dTTP、1.5mM的Sr、100nM的Klenow exo-聚合酶的LS缓冲液。所使用的掺入缓冲液是具有50mM NaCl、50mM MgCl₂的LS缓冲液，并且所用的洗涤缓冲液是具有250mM NaCl的LS缓冲液。使用

Octet Red384系统(Menlo Park，CA)，使用连接到SA传感器尖端的生物素phiX_匹配C模板和FP2引物序列进行测序循环。测序步骤由以下各项组成：a)使用dATP检查；b)掺入；c)洗涤；d)使用dGTP检查；e)掺入；f)洗涤；g)使用dCTP检查；h)掺入；i)洗涤；j)使用dTTP检查；k)掺入；l)洗涤，继而从a)开始重复这些步骤。对于碱基识别，检查步骤在来自先前洗涤步骤的基线上方和/或相对于对照序列产生可检测的信号。

结果.使用这种方法，12个碱基被正确地鉴定。有2个碱基没有被鉴定，这是因为结合信号过低。该实验正确地鉴定了12/14个碱基，如下表中所示。

表3：序列鉴定

实施例4.在匹配/错配碱基辨认时的盐浓度。

Octet仪器(Red384或qk)(Menlo Park，CA)使用生物膜干涉测量法来在光纤尖端表面处测量结合反应。在该实施例中，将尖端用链霉亲和素(SA)官能化以使得能够结合5′生物素标记的DNA模板，所述模板与和所述模板的3′末端附近的序列互补的引物杂交。

实验条件.将PhiX_匹配C和phiX_匹配A上样到单个尖端上。将引物-模板在含有0.01％-0.02％BSA和0.01％-0.02％tween20的1-2×PBS(上样缓冲液)中以100nM至500nM上样到尖端上。FP2引物相对于模板是1.25倍-2倍过量的。通过信号的变化来监测上样并且在30℃通常在5分钟内达到平台。将尖端在上样缓冲液中浸泡1-5分钟以去除未结合的DNA材料。对于碱基识别，将尖端浸泡在含有补充有0.01％-0.02％BSA和0.01％-0.02％tween20(LS缓冲液)、100nM聚合酶、100μM NTP、以及50mM至300mM的不同浓度的额外NaCl的1XTaq缓冲液(10mM Tris-HCl、50mM KCl，在25C下pH 8.3，无镁)的溶液中。phiX_匹配C双链体将形成三元复合物并且显示出结合信号的增加，这是因为存在正确的下一个核苷酸(同源)。phiX_匹配A不应当是这样，这是因为它是不正确的核苷酸(非同源)。

结果.在标准反应条件下，这两个模板都结合聚合酶。然而，随着盐浓度增加，非同源复合物的结合亲和力降低，而同源复合物的结合亲和力仍然高。因此，碱基辨认的信噪比(SNR)增加以使得下一个正确的碱基可以容易地在该检查步骤期间被鉴定(图3)。在该实施例中使用氯化钠(NaCl)，但是可以使用本领域已知的盐，如KCL、NH₂(SO₄)、谷氨酸钾等。在正确核苷酸与不正确核苷酸之间显示出结合亲和力的差异的聚合酶包括klenow、Bst2.0、Bsu、以及Taq。

实施例5.在解离/洗涤步骤期间的碱基辨认。

在缔合步骤和解离步骤这两者期间的检查可以共同用于提高序列保真度。因此，评价解离动力学以确定它们是否可以用于确定碱基鉴定并且提高序列保真度。

实验条件.在该实验中，将phiX_匹配C和FP2引物上样到SA传感器尖端上，如上文所述。在具有100μM的dGTP、dCTP、dATP或dTTP、以及100nM的klenow酶或Bst2.0酶、以及1mM的SrCl₂的LS缓冲液中形成聚合酶复合物。

结果.在低盐下，聚合酶有效地结合DNA模板引物，无论是否存在同源核苷酸。在洗涤缓冲液(LS缓冲液+50mM或100mM添加的NaCl)中，所有复合物都解离，在额外的NaCl存在时，即使是SrCl₂也不能稳定。然而，当将处于结合缓冲液中50μM的相同dNTP添加到洗涤缓冲液中时，则只有具有不正确的核苷酸的复合物解离并且使正确的三元复合物稳定(图4)。此外，发现dNTP在结合步骤中是不必要的并且可以在洗涤期间被包括。当期间随后引入正确的dNTP时，结合的二元复合物可能仍允许正确的碱基进入并且形成三元复合物。此外，保真度不受不正确的核苷酸的存在的影响。因此，聚合酶的解离速率也可以用于确定dNTP的混合物中正确的碱基，例如以将以不同的速率解离的不同浓度。

实施例6.在洗涤缓冲液中核酸：聚合酶复合物的稳定。

为了使在均聚物区域中多次添加的可能性减到最低限度，可以在掺入之前进行洗涤步骤。诸如钙和锶的金属阳离子可以像镁一样使聚合酶复合物稳定，但是不能支持引起核苷酸的掺入的磷酸二酯键的催化。在该实验中，将不同浓度的SrCl₂(0mM-14mM)添加到洗涤缓冲液(LS缓冲液)中。在洗涤缓冲液中少到3.5mM的Sr(最低浓度)存在下，聚合酶复合物稳定得多。此外，当在结合步骤期间存在正确的或不正确的核苷酸时复合物的稳定性不受显著影响，这表明聚合酶的Sr相关稳定性不限于三元复合物。结果示于图5中。

实施例7.使用没有3′-5′核酸外切酶活性的DNA pol I。

在该实验中，研究DNA Pol I的3′-5′核酸外切酶活性的影响。核酸外切酶活性提高了保真度，这是因为不正确的碱基或flap通过由聚合酶的核酸外切酶活性提供的校对功能去除。然而，这种活性可能潜在地裂解正确的碱基，从而产生不正确的序列读段。使具有3′末端错配的引物与模板杂交，从而产生受损的末端或flap构建体。Klenow exo-聚合酶将不能延伸该末端。然而，DNA pol I大片段具有核酸外切酶活性并且可以去除错配碱基，一旦被去除，引物就可以正常地通过klenow exo-聚合酶或DNA聚合酶延伸。

实验条件.使具有flap结构的两个传感器暴露于DNA聚合酶或klenow exo-以进行测序。然后以正确的顺序使传感器暴露于模板序列。DNA聚合酶传感器能够添加碱基，而klenow片段传感器由于flap结构而不能添加任何碱基。DNA聚合酶的任何3′-5′exo活性将会引起碱基添加与序列不同步。

结果.DNA聚合酶裂解错配碱基允许后续的碱基添加。碱基到4个循环时被纠正。没有核酸外切酶活性，klenow exo(-)不能延伸模板。结果示于图6中。在其中假核酸外切酶活性是有害的情况下，可以通过竞争性、无竞争性或非竞争性化合物或类似物来抑制核酸外切酶。NaF是DNA聚合酶核酸外切酶功能的竞争性抑制剂(Potapova等人，FEBS Letters，277(1-2)：109-111(1990))。

实施例8.使用HIV逆转录酶(RT)和非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)化合物7和18进行测序。

在4％-5％患有非小细胞肺癌的患者中发现EML4-ALK融合体(Soda等人，Nature448：561-6(2007)；Mano，Cancer Sci.99：2349-55(2008)；以及Horn和Pao，J.Clin.Oncol.27：4232-5(2009))。ALK C4493A突变已经在临床肺肿瘤中被鉴定出，它引起ALK蛋白质中的L1196M“看门基因”突变并且赋予对化学治疗药物克唑替尼(crizotinib)的抗性(Choi等人，N.Engl.J.Med.18：1734-9(2010))。4496-4509AS引物使得能够对具有看门基因突变的区域进行测序。模板寡核苷酸序列源自于野生型人ALK基因(核苷酸编号4460-4509)。引物序列与人ALK基因互补(核苷酸编号4496-4509)。

具有3′倒置dT的模板寡核苷酸Btn-4460-4509S的DNA序列：

生物素-5′-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG-3′-(3′-dT-5′)(SEQ ID NO：9)

引物寡核苷酸4496-4509AS的DNA序列：5′-CCCGCCATGAGCTC-3′(SEQ ID NO：10)

试剂制备.模板寡核苷酸Btn-4460-4509S和引物寡核苷酸4496-4509AS是由Integrated DNA Technologies公司(Coralville，IA)合成和分析的(液相色谱-质谱(LC-MS)和电喷雾电离(ESI))。在TE缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA)中制备寡核苷酸以达到100μM。将引物和模板寡核苷酸在容纳退火缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mMEDTA、80mM KCl)的管中组合(每一条链10μM)。将容纳引物-模板溶液的管装载到干热块上(95℃，5分钟)，并且将干热块转移到工作台上以通过逐渐冷却到环境温度来使链退火。无竞争性NNRTI化合物(Pitta等人，J.Enzyme Inhib.Med.Chem.28(10)：113-22(2013)，以引用的方式整体并入本文)来自Epigen Biosciences Inc.(San Diego，CA)。将NNRTI化合物7(3-4-氯-苯并[d]噻唑-2-基)-2-(2-氯-6-氟苯基)噻唑烷-4-酮)和18(3-(6-乙氧基-苯并[d]噻唑-2-基)-2-(2-氯-6-氟苯基)噻唑烷-4-酮)在二甲亚砜(DMSO)中溶解分别达到25.0mM和15.0mM的浓度。重组纯化的HIV逆转录酶(HIV RT)来自Worthington BiochemicalCorp(Lakewood，NJ)。超纯牛血清白蛋白(BSA)来自Ambion公司(Foster City，CA)。所有试剂和溶液均是分子生物学级的。

实验条件.将引物-模板双链体在退火缓冲液中稀释(100μM)。在即将使用之前，将HIV逆转录酶预先稀释到酶稀释剂(50mM Tris(pH 8.0)、8mM MgCl₂)中。结合缓冲液(50mMTris(pH 8.0)、160mM KCl、0.5mM EDTA、11mM MgCl₂、0.3％(v/v)Triton X-100、5.3mM二硫苏糖醇(DTT)、100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、100μM dNTP(dATP、dTTP、dGTP或dCTP)、100nMHIV RT)。在即将掺入结合缓冲液中之前将NNRTI化合物用DMSO预先稀释。反应缓冲液是没有NNRTI、dNTP或HIV RT酶的结合缓冲液。将含有引物-模板(PT)的缓冲液、PT洗涤缓冲液、含有一种dNTP的结合缓冲液、以及反应缓冲液加入(200微升/孔)到Greiner 96孔黑色微孔板(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M9685)中。在使用之前将链霉亲和素(SA)生物传感器(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA；目录号18-5019)在退火缓冲液中重新水合约10分钟。将Octet QK生物传感器系统(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA)设置用于30℃操作并且编程以将生物传感器用引物-模板包被并且用PT洗涤缓冲液洗掉未结合的引物-模板。将生物传感器转移到含有HIV RT+dCTP±NNRTI的结合缓冲液中(缔合阶段)，继而转移到反应缓冲液中(dCTP掺入和解离阶段)。类似地，将生物传感器循环地转移到含有如所示的单独的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP或dTTP)的溶液中。将结合和掺入的循环重复多次。

数据分析.将数据输入到Microsoft Excel和Prism软件(GraphPad Software，SanDiego，CA)中以进行显示。通过在19.4秒窗口内取平均值或通过Prism软件(19.4秒窗口和6阶平滑多项式)来使结合反应和解离反应的进展平滑。

结果.利用据报道具有无竞争性抑制模式的非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)来经由HIV逆转录酶的DNA依赖性DNA聚合酶活性进行DNA测序。在与包被有引物-模板的生物传感器的结合的测定中，HIV逆转录酶、正确的dNTP以及NNRTI化合物7(40μM)的组合在缔合阶段中表现出明显的结合峰，继而在解离阶段期间在洗涤缓冲液中的结合减少(图7A，圆圈)。不同于NNRTI稳定的HIV RT-dNTP混合物，含有HIV RT和正确dNTP的反应物没有产生明显的结合峰(图7A，三角形)，对照也没有产生(在存在或不存在40μM NNRTI化合物7的情况下的HIV RT；图7A，实线和虚线)。结合和解离的时间过程在图7A中显示了前六个循环的测序(核苷酸序列CAGCAG)。分别使用不正确的核苷酸dCTP和dATP的第七个循环和第八个循环没有产生结合峰。第九个循环使用正确的核苷酸dGTP(图7A)。每一个循环的结合(0分钟-5分钟)和解离(5分钟-10分钟)的时间过程示于图7B中。

类似地，使用HIV RT和NNRTI化合物18进行的测序也产生测序结果。在与包被有引物-模板的生物传感器的结合的测定中，HIV逆转录酶、正确的dNTP以及NNRTI化合物18(80μM)的组合在缔合阶段中表现出明显的结合峰，继而在解离阶段期间在洗涤缓冲液中的结合减少(图8，菱形)。不同于NNRTI稳定的HIV RT-dNTP混合物，含有HIV RT和正确dNTP的反应物没有产生明显的结合峰(图8，三角形)，对照也没有产生(HIV RT和80μM的NNRTI化合物18；图8，虚线)。在循环1-3中，结合峰指示HIV RT与正确的核苷酸和化合物18结合以得到序列CAG(图8)。使用HIV RT、不正确的核苷酸dTTP以及化合物18的循环4没有显示出结合峰(图8)。后续的循环没有显示出测序分析的另外的峰。这些结果证实了能够在测序期间使用聚合酶抑制剂。

实施例9.在表面等离子体共振(SPR)成像生物传感器上进行DNA测序。

材料和试剂：SPR传感器芯片：20mm×20mm×1mm高折射率(1.61)载片(NanoSPR，Chicago，IL)。烷烃硫醇PEG6：单硫代烷烃(C11)PEG6-OH(11-巯基十一烷基六乙二醇(目录号：SPT-0011P6)；以及BAT：生物素化的烷烃PEG硫醇(目录号：SPT-0012D)是从Sensopathtechnologies(Bozeman，MT)获得的。基础缓冲液(洗涤)：300mM KCl、20mM Tris HCl(pH8.0)、0.01％Tween-20、1mM SrCl2。检查缓冲液：基础缓冲液加上50nM Klenow片段+100nMdNTP。掺入缓冲液：基础缓冲液加上10mM MgCl2。

在实验之前，将涂有Au的SPR载片用在100％EtOH中稀释到1×10^-4M的最终组合浓度的18％BAT与82％PEG6的混合SAM包被。在室温下将SPR截片在烷烃硫醇溶液中孵育过夜。在孵育之后，将SPR载片在新鲜的100％EtOH中冲洗，继而在去离子水中50％的EtOH中冲洗，并且在去离子水中冲洗。然后将载片在空气中干燥。将载片安装在定制的SPR成像系统上，所述成像系统提供射流控制和图像采集以及数据定量。将在基础缓冲液中含有10μg/ml链霉亲和素的溶液注入到流槽中。通过测量从SPR芯片反射的光的变化，持续约180秒，继而用过量的基础缓冲液洗涤来监测所得的链霉亲和素层的结合。然后将预杂交的引物FP2/PhiX_匹配A模板DNA注入到流槽中并且允许结合到链霉亲和素层，持续约180秒，继而用过量的基础缓冲液洗涤。对于测序，在含有100nM的dATP、dCTP、dTTP或dGTP的基础缓冲液中制备含有50nM Klenow片段的溶液。将dNTP溶液单独地注入到流槽中(按照顺序G、A、A、T、C、G)，并且孵育约180秒以检查SPRi响应。如果不存在/存在低的信号变化，则用过量的基础缓冲液洗涤流槽。如果SPR信号指示碱基匹配，那么用掺入缓冲液(含有10mM Mg2+)将流槽洗涤30秒以掺入正确的dNTP，继而用基础缓冲液洗涤。重复检查步骤、掺入步骤、以及洗涤步骤。

图9示出了对于三个错配碱基和三个正确碱基的鉴定所记录的传感图。在退火的引物序列之后phiX_匹配A模板的前三个正确的共轭碱基是A、T以及G。在传感器上流过的第一溶液含有聚合酶和dGTP，这对应于碱基对错配。所得的传感器迹线显示基线反射率有很小的变化，这表明聚合酶分子没有与引发的模板链结合。在传感器上流过的下一个溶液含有聚合酶和dATP，这对应于正确的共轭碱基。所得的迹线(以灰色方框突出显示)显示反射光的强烈增加，这表明了聚合酶已经与引发的模板链结合，从而改变了SPR的位置。在将聚合酶溶液孵育约180秒(以确保可用结合位点饱和)之后，将含有10mM Mg2+的掺入溶液引入流槽中。Mg2+的引入允许聚合酶将结合的dATP掺入到与模板结合的引物链中。为了确保dATP的成功掺入，使聚合酶-dATP溶液再次在传感器芯片上流过。然而，这一次，反射光的量不像先前那样强烈地增加，这表明聚合酶没有与模板链结合，这是因为正确的同源碱基不再是A。为了检查下一个正确的碱基，使聚合酶和dTTP的溶液在传感器上流过。再一次，反射光强度增加到高于阈值，这表明dATP的掺入是成功的并且下一个正确的碱基是T，如所预期的那样。使掺入缓冲液在传感器芯片上流过以掺入碱基。使用错配(聚合酶-dCTP)，继而使用匹配(聚合酶-dGTP)将过程再重复两次。在这两种情况下，观测到预期的响应，这表明下一个正确的共轭碱基实际上是G。

这些结果证实了能够在SPRi生物传感器上通过Klenow/dNTP结合测定准确地对DNA进行测序。SPRi生物传感器具有足够的灵敏度和耐久性来检测在多轮检查/掺入中进行DNA测序所需的不同的步骤。本文显示的是60bp链内三个碱基对的测序。这种技术可以扩展到任意数目的测序循环。

实施例10.通过切口平移对双链DNA进行测序。

具有3′倒置dT的模板寡核苷酸Btn-4460-4509S的DNA序列：

生物素-5′-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG-3′-(3′-dT-5′)(SEQ ID NO：9)

引物寡核苷酸4496-4509AS的DNA序列：

5′-CCCGCCATGAGCTC-3′(SEQ ID NO：10)

寡核苷酸4460-4494AS的DNA序列：

5′-AGCAGGATGAACCGGG/i5NitInd/CAGGGATTGCAGGCTCAC-3′(SEQ ID NO：11)，其中“/i5NitInd/”是5-硝基吲哚-2′-脱氧核糖残基。5-硝基吲哚意图防止在这种背景下形成鸟嘌呤四联体并且用作通用碱基。

试剂制备.在TE缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA)中制备寡核苷酸以达到100μM。为了制备ssDNA引物/模板，将寡核苷酸Btn-4460-4509S和4496-4509AS在容纳退火缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA、80mM KCl)的管中组合(每一条链10μM)。为了制备具有单碱基对缺口的dsDNA引物/模板，将寡核苷酸Btn-4460-4509S、4496-4509AS以及4460-4494AS在容纳退火缓冲液的管中组合(每一条链10μM)。将容纳寡核苷酸溶液的管装载到干热块上(95℃，5分钟)，并且将干热块转移到工作台上以通过逐渐冷却到环境温度来使链退火。由嗜热脂肪芽孢杆菌编码的全长DNA聚合酶(“Bst DNA聚合酶”，从大肠杆菌中纯化的重组酶)购自New England Biolabs(Ipswich，MA；目录号M0328L)。超纯牛血清白蛋白(BSA)购自Ambion(Foster City，CA)。所有试剂和溶液均是分子生物学级的。

实验条件.将引物-模板双链体在退火缓冲液中稀释(100μM)。结合缓冲液是50mMTris(pH 8.0)、300mM KCl、0.1％(v/v)Triton-X100、100μg/mL牛血清白蛋白。反应缓冲液是含有10mM MgCl₂的结合缓冲液。将含有引物-模板(PT)的缓冲液、含有一种dNTP的结合缓冲液、以及反应缓冲液加入(200微升/孔)到Greiner 96孔黑色微孔板(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M9685)中，并且施加PCR级矿物油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M8662)(75微升/孔)。在使用之前将链霉亲和素(SA)生物传感器(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA；目录号18-5019)在退火缓冲液中重新水合约10分钟。将Octet QK生物传感器系统(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA)设置用于30℃操作并且编程以将生物传感器用引物-模板包被并且用结合缓冲液洗掉未结合的引物-模板。将生物传感器转移到含有136单位/毫升的Bst DNA聚合酶和200μM如所示的dNTP(dATP、dTTP、dGTP或dCTP)的结合缓冲液中(缔合阶段)，继而转移到反应缓冲液中以进行dNTP掺入。将生物传感器转移到含有Bst DNA聚合酶(136单位/毫升)而不含dNTP的反应缓冲液中以促进经由5′-3′核酸外切酶活性的切口平移。将生物传感器转移到不含酶或镁的反应缓冲液中(解离阶段)。类似地，将生物传感器循环地转移到含有如所示的单独的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP或dTTP)的溶液中。将结合和掺入以及5′-3′核酸外切裂解的循环重复多次以评估测序。

数据分析.将数据输入到Microsoft Excel和Prism软件(GraphPad Software，SanDiego，CA)中以进行显示。

结果.在与包被有引物-模板的生物传感器的结合的测定中，Bst DNA聚合酶和正确的2′-脱氧核糖核苷三磷酸(dCTP)的组合在缔合阶段中表现出明显的结合峰(图10A、10B、以及10C，dCTP“C”)。循环1显示了与dsDNA模板中的单碱基对缺口的结合和掺入(图10A和10B)以及对照ssDNA模板中引物下游的正确核苷酸的掺入(图10C)。缺少dNTP的对照显示出最小的结合(图10A、10B、以及10C，循环1-7)。循环2显示了聚合酶与下一个正确的核苷酸dATP组合与dsDNA模板结合(图10A和10B，dATP“A”)，这小于未受阻的ssDNA模板的结合(图10C，dATP“A”)，表明互补链的核酸外切裂解不完全。结合和解离的时间过程显示了dsDNA(图10A和10B)和ssDNA(图10C)的前三个循环的测序(核苷酸序列CAG)。如所预期，使用不正确的核苷酸dTTP的第四个循环没有产生结合峰(图10A、10B、以及10C)。这些结果证实了能够使用DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性通过切口平移对双链DNA进行测序。

实施例11.通过链置换对双链DNA进行测序。

具有3′倒置dT的模板寡核苷酸Btn-4460-4509S的DNA序列：

生物素-5′-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG-3′-(3′-dT-5′)(SEQ ID NO：9)

引物寡核苷酸4496-4509AS的DNA序列：

5′-CCCGCCATGAGCTC-3′(SEQ ID NO：10)

寡核苷酸4460-4494AS的DNA序列：

5′-AGCAGGATGAACCGGG/i5NitInd/CAGGGATTGCAGGCTCAC-3′(SEQ ID NO：11)，其中“/i5NitInd/”是5-硝基吲哚-2′-脱氧核糖残基。5-硝基吲哚意图防止在这种背景下形成鸟嘌呤四联体并且用作通用碱基。

寡核苷酸4460-4494AS-T8的DNA序列：

5′-TTTTTTTTAGCAGGATGAACCGGG/i5NitInd/CAGGGATTGCAGGCTCAC-3′(SEQ ID NO：12)，其中“/i5NitInd/”是5-硝基吲哚-2′-脱氧核糖残基。5-硝基吲哚意图防止在这种背景下形成鸟嘌呤四联体并且用作通用碱基。

试剂制备.寡核苷酸Btn-4460-4509S、4460-4494AS、4496-4509AS以及4460-4494AS-T8是由Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)合成和分析的(液相色谱-质谱(LC-MS)和电喷雾电离(ESI))。在TE缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA)中制备寡核苷酸以达到100μM。为了制备ssDNA引物/模板，将寡核苷酸Btn-4460-4509S和4496-4509AS在容纳退火缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA、80mM KCl)的管中组合(每一条链10μM)。为了制备具有单碱基缺口的dsDNA引物/模板，将寡核苷酸Btn-4460-4509S、4496-4509AS以及4460-4494AS在容纳退火缓冲液的管中组合(每一条链10μM)。为了制备具有5′-寡聚dT flap和单碱基缺口的dsDNA引物/模板，将寡核苷酸Btn-4460-4509S、4496-4509AS以及4460-4494-AS-T8在容纳退火缓冲液的管中组合(每一条链10μM)。将容纳寡核苷酸溶液的管装载到干热块上(95℃，5分钟)，并且将干热块转移到工作台上以通过逐渐冷却到环境温度来使链退火。大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow(3′→5′exo-)片段购自Enzymatics(Beverly，MA；目录号P7010-LC-L)。超纯牛血清白蛋白(BSA)购自Ambion(Foster，City，CA)。所有试剂和溶液均是分子生物学级的。

实验条件.将引物-模板双链体在退火缓冲液中稀释(50nM)。结合缓冲液是20mMTris(pH 8.0)、300mM KCl、0.01％(v/v)Tween-20、100μg/mL牛血清白蛋白、1.0mM二硫苏糖醇。反应缓冲液是含有50mM KCl和10mM MgCl₂的结合缓冲液。将含有引物-模板(PT)的缓冲液、含有一种dNTP的结合缓冲液、以及反应缓冲液加入(200微升/孔)到Greiner 96孔黑色微孔板(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M9685)中，并且施加PCR级矿物油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M8662)(75微升/孔)。在使用之前将链霉亲和素(SA)生物传感器(Pall ForteBio Corp，.Menlo Park，CA；目录号18-5019)在退火缓冲液中重新水合约10分钟。将Octet QK生物传感器系统(Pall ForteBio Corp，.Menlo Park，CA)设置用于30℃操作并且编程以将生物传感器用引物-模板包被并且用结合缓冲液洗掉未结合的引物-模板。将生物传感器转移到含有Klenow exo-(68单位/毫升)和100μM如所示的dNTP(dATP、dTTP、dGTP或dCTP)的结合缓冲液中(缔合阶段)，继而转移到反应缓冲液中以进行dNTP掺入。将生物传感器转移到不含酶或镁的反应缓冲液中(解离阶段)。类似地，将生物传感器循环地转移到含有如所示的单独的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP或dTTP)的溶液中。将结合和掺入的循环重复多次以评估测序。

数据分析.将数据输入到Microsoft Excel和Prism软件(GraphPad Software，SanDiego，CA)中以进行显示。

结果.在与包被有ssDNA引物-模板的生物传感器的结合的测定中，Klenow exo-在正确的单独dNTP存在下产生结合峰，但是在不正确的dTTP核苷酸存在下没有产生(图11A，暗色迹线)。相比之下，阴性对照(在不存在dNTP的情况下的酶)不能结合，如由始终平坦的结合响应所示(图11A，灰色迹线)。因此，Klenow exo-产生序列CAGCAG(C？)A(SEQ ID NO：13)，这与预期序列(CAGCAGGA(SEQ ID NO：1))具有88％同一性。在与包被有在反义引物与下游反义链之间具有单碱基缺口的dsDNA引物-模板的生物传感器的结合的测定中，Klenowexo-仅在第一个正确的单个dCTP核苷酸存在下产生结合峰(图11B，暗色迹线)。阴性对照(在不存在dNTP的情况下的酶)不能结合，如由始终平坦的结合响应所示(图11B，灰色迹线)。因此，Klenow exo-产生序列“C”，其中缺口的第一个碱基被填充以正确的核苷酸。然而，在后续的循环中，进一步结合或聚合到双链DNA区域中被阻断。进一步测序的阻断可能是因为Klenow exo-在本质上缺乏5′-3′核酸外切酶结构域(用于切口平移)或不能破坏DNA的下游双链螺旋(链置换)。因此，引入5′-寡聚dT flap以为Klenow exo-提供更好的底物以进行链置换。将生物传感器用在反义引物与下游反义链之间具有单碱基缺口的带有5′-寡聚dT flap的dsDNA引物-模板包被。Klenow exo-在循环#1的单碱基缺口(C)中产生结合峰，并且对于循环#2、#3以及#5，在dsDNA区域中观测到另外的结合峰，从而提供序列AGC(图11C，暗色迹线)。使用不正确的dNTP的循环#4、#6、#7以及#8没有提供酶与固定的DNA的结合(图11C)。阴性对照(在不存在dNTP的情况下的酶)不能结合，如由平坦的结合响应所示(图11C，灰色迹线)。因此，Klenow exo-产生100％正确的序列“CAGC”，其中缺口的第一个碱基被填充以正确的核苷酸，并且观测到三个另外的碱基进一步结合或聚合到双链DNA区域中。与双链DNA区域相邻的5′-flap使得Klenow exo-能够通过链置换进行测序(图11C)，而缺少5′-flap则阻断向dsDNA区域中的测序(图11B)。这些结果证实了能够使用DNA聚合酶的Klenow exo-片段，通过链置换机制对双链DNA进行测序。

实施例12.阴离子对单链DNA测序的影响。

为了制备ssDNA引物/模板，将寡核苷酸Btn-4460-4509S(SEQ ID NO：9)和4496-4509AS(SEQ ID NO：10)在容纳退火缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA、80mM KCl)的管中组合(每一条链10μM)。将容纳寡核苷酸溶液的管装载到干热块上(95℃，5分钟)，并且将干热块转移到工作台上以通过逐渐冷却到环境温度来使链退火。大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow(3′→5′exo-)片段购自Enzymatics(Beverly，MA；目录号P7010-LC-L)。谷氨酸钾购自(Teknova，Hollister，CA；目录号P2000)。超纯牛血清白蛋白(BSA)购自Ambion(FosterCity，CA)。所有试剂和溶液均是分子生物学级的。

实验条件.结合缓冲液是20mM Tris(pH 8.0)、300mM KCl、0.01％(v/v)Tween-20、100μg/mL牛血清白蛋白、1.0mM二硫苏糖醇。反应缓冲液是含有50mM KCl和10mM MgCl₂的结合缓冲液。对于所测试的每一个水平的谷氨酸钾，制备结合缓冲液以含有0mM、50mM、100mM或200mM的谷氨酸钾。反应缓冲液不含谷氨酸钾。如实施例11中所述来设置Octet QK生物传感器系统。将生物传感器转移到含有Klenow exo-(68单位/毫升)和100μM如所示的dNTP(dATP、dTTP、dGTP或dCTP)的结合缓冲液中(缔合阶段)，继而转移到反应缓冲液中以进行dNTP掺入。将生物传感器转移到含有镁而不含酶的反应缓冲液中(解离阶段)。将生物传感器转移到不含酶或dNTP，但是含有对应浓度的谷氨酸钾的结合缓冲液中以重新平衡。类似地，将生物传感器循环地转移到含有如所示的单独的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP或dTTP)的溶液中。将结合和掺入的循环重复多次以评估测序。

数据分析.将数据输入到Microsoft Excel和Prism软件(GraphPad Software，SanDiego，CA)中以进行显示。

结果.在与包被有ssDNA引物-模板的生物传感器的结合的测定中，对于使用正确的核苷酸进行测序，Klenow exo-(不含谷氨酸盐的KCl)产生结合峰，在含有200mM谷氨酸盐的KCl中酶也是如此(图12A，分别是虚线和实线)。然而，与含有200mM谷氨酸盐的制剂相比，不含谷氨酸盐的缓冲液表现出结合峰的幅度降低以及背景增加(图12A)。在8.25小时的时间过程中，在KCl+200mM谷氨酸盐制剂中，根据含有酶和正确dNTP(而非不正确的dNTP)的混合物的相对峰高观测到正确的序列(图12A)。在这些条件下，均聚物运行似乎以单峰被检测到(图12A、12B、以及12C)。在含有KCl+100mM谷氨酸盐的缓冲液中，在7小时的过程中对于酶+正确dNTP以强峰信号观测到正确的序列，而对照(在不存在dNTP的情况下的酶)没有产生峰并且背景逐渐增加(图12B)。含有KCl+50mM谷氨酸盐的缓冲液在7小时的过程中显示出正确的序列，而在不存在dNTP的情况下对照酶没有产生结合峰并且产生平坦的稳定的背景(图12C)。这些结果证实能够使用DNA聚合酶的Klenow exo-片段在通过谷氨酸钾增强以及通过矿物油覆盖层防止蒸发的情况下对单链DNA进行测序。

实施例13.通过对单链DNA和双链5′-Flap DNA进行测序来检测野生型背景下的点突变。

具有3′倒置dT的模板寡核苷酸Btn-4460-4509S的DNA序列：

生物素-5′-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG-3′-(3′-dT-5′)(SEQ ID NO：9)

具有3′倒置dT的模板寡核苷酸Btn-4460-4509S C4493A的DNA序列：

生物素-5′-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGG-3′-(3′-dT-5′)(SEQ ID NO：21)

引物寡核苷酸4496-4509AS的DNA序列：

5′-CCCGCCATGAGCTC-3′(SEQ ID NO：10)

寡核苷酸4460-4494AS-T8的DNA序列：

5′-TTTTTTTTAGCAGGATGAACCGGG/i5NitInd/CAGGGATTGCAGGCTCAC-3′(SEQ ID NO：12)，其中“/i5NitInd/”是5-硝基吲哚-2′-脱氧核糖残基。5-硝基吲哚意图防止在这种背景下形成鸟嘌呤四联体并且用作通用碱基。

试剂制备.寡核苷酸Btn-4460-4509S、Btn-4460-4509S C4493A、4496-4509AS以及4460-4494AS-T8是由Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)合成和分析的(液相色谱-质谱(LC-MS)和电喷雾电离(ESI))。在TE缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA)中制备寡核苷酸以达到100μM。为了制备ssDNA引物/模板，将寡核苷酸Btn-4460-4509S(或C4493A)和4496-4509AS在容纳退火缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA、80mM KCl)的管中组合(每一条链10μM)。为了制备具有5′-寡聚dT flap和单碱基缺口的dsDNA引物/模板，将寡核苷酸Btn-4460-4509S(或C4493A)、4496-4509AS以及4460-4494-AS-T8在容纳退火缓冲液的管中组合(每一条链10μM)。将容纳寡核苷酸溶液的管装载到干热块上(95℃，5分钟)，并且将干热块转移到工作台上以通过逐渐冷却到环境温度来使链退火。大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow(3′→5′exo-)片段购自Enzymatics(Beverly，MA；目录号P7010-LC-L)。超纯牛血清白蛋白(BSA)和超纯鲑鱼精DNA溶液购自Life Technologies(Foster City，CA)。六水合硫酸镍(II)(目录号467901)、dCDP、dGDP以及dTDP购自Sigma(St.Louis，MO)。所有试剂和溶液均是分子生物学级的。

实验条件.将引物-模板双链体在退火缓冲液中稀释(50nM)。洗涤缓冲液是20mMTris(pH 8.0)、200mM KCl、200mM谷氨酸钾、0.01％(v/v)Tween-20、100μg/mL牛血清白蛋白、1.0mM二硫苏糖醇。结合缓冲液是含有2.0mM Ni(II)SO₄的洗涤缓冲液。反应缓冲液是20mM Tris(pH 8.0)、50mM KCl、MgCl₂(10mM)、0.01％(v/v)Tween-20、100μg/mL牛血清白蛋白、1.0mM二硫苏糖醇。EDTA洗涤缓冲液是含有100μM EDTA的结合缓冲液。将含有引物-模板(PT)的缓冲液、含有一种dNTP的结合缓冲液以及反应缓冲液加入(200微升/孔)到Greiner96孔黑色微孔板(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M9685)中，并且施加PCR级矿物油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M8662)(75微升/孔)。在使用之前将高精度链霉亲和素生物传感器(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA；目录号18-5117)在退火缓冲液中重新水合约10分钟。将Octet QK生物传感器系统(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA)设置用于30℃操作并且编程以将生物传感器用引物-模板包被并且用洗涤缓冲液洗掉未结合的引物-模板。将生物传感器转移到含有Klenow exo-(68单位/毫升)、Ni(II)SO₄(1.5mM)以及100μM如所示的dNTP(dATP、dTTP、dGTP或dCTP)的结合缓冲液中(缔合阶段)，继而在含有MgCl₂(10mM)的反应缓冲液中进行dNTP掺入(解离阶段)。将生物传感器转移到EDTA洗涤缓冲液中，继而在不含酶、核苷酸或二价阳离子的反应缓冲液中重新平衡。类似地，将生物传感器循环地转移到含有如所示的单独的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP或dTTP)的溶液中。对于每一种dNTP重复结合和掺入的循环以评估测序。

数据分析.将数据输入到Microsoft Excel和Prism软件(GraphPad Software，SanDiego，CA)中以进行显示。

结果.在与包被有ssDNA引物-模板的生物传感器的结合的测定中，在循环1-2中在正确的dNTP存在下Klenow exo-酶与生物传感器强烈结合(图13A)。循环3中的“G”峰显示含有递增浓度的ALK野生型模板的混合物中的峰高递增(图13A)。循环4中的“T”峰显示含有递增浓度的ALK C4493A突变的混合物中的峰高递增。在循环4时“T”读数对应于C4493A突变体的反义核苷酸。ALK野生型模板和C4493A模板这两者在循环5和6中均产生“C”和“A”的全高峰。在图13A中峰指示了ALK野生型(CAGCA)和ALK C4493A(CATCA)的正确序列。

在测序期间的峰强度允许对与野生型序列的混合物中的突变等位基因进行定量。循环4峰(T)的强度与ssDNA(图13B)和dsDNA-flap(图13C)的ALK野生型背景下ALK C4493A突变序列的量成比例。类似地，循环3峰(G)随ssDNA模板中的突变体浓度增加而线性降低(图13B)，并且峰3强度随dsDNA-flap模板的突变体浓度而降低(图13C)。在野生型背景下，在ssDNA模板或dsDNA-flap模板中可以检测到少到5％的突变序列。这些结果证实能够在相似DNA序列存在下使用ssDNA模板或dsDNA模板检测少量的突变序列。

实施例14.二价阳离子对使三元复合物稳定以及聚合酶催化的影响。

具有3′倒置dT的模板寡核苷酸Btn-4460-4509S C4493A的DNA序列：

生物素-5′-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGG-3′-(3′-dT-5′)(SEQ ID NO：21)

引物寡核苷酸4496-4509AS的DNA序列：

5′-CCCGCCATGAGCTC-3′(SEQ ID NO：10)

试剂制备.寡核苷酸Btn-4460-4509S C4493A和4496-4509AS是由Integrated DNATechnologies(Coralville，IA)合成和分析的(液相色谱-质谱(LC-MS)和电喷雾电离(ESI))。在TE缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA)中制备寡核苷酸以达到100μM。为了制备ssDNA引物/模板，将寡核苷酸Btn-4460-4509S C4493A和4496-4509AS在容纳退火缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA、80mM KCl)的管中组合(每一条链10μM)。将容纳寡核苷酸溶液的管装载到干热块上(95℃，5分钟)，并且将干热块转移到工作台上以通过逐渐冷却到环境温度来使链退火。大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow(3′→5′exo-)片段购自Enzymatics公司(Beverly，MA；目录号P7010-LC-L)。超纯牛血清白蛋白(BSA)和超纯鲑鱼精DNA溶液购自Life Technologies(Foster City，CA)。氯化锶、氯化钙、氯化锰、氯化钡、氯化钴、氯化锌、氯化铜(II)、硫酸亚铁铵、硫酸铵、六水合硫酸镍(II)、dCDP、dGDP以及dTDP购自Sigma公司(St.Louis，MO)。所有试剂和溶液均是分子生物学级的。

实验条件.将引物-模板双链体在退火缓冲液中稀释(100nM)。洗涤缓冲液是20mMTris(pH 8.0)、50mM KCl、0.01％(v/v)Tween-20、100μg/mL牛血清白蛋白、1.0mM二硫苏糖醇。结合缓冲液是20mM Tris(pH 8.0)、200mM KCl、200mM谷氨酸钾、0.01％(v/v)Tween-20、100μg/mL牛血清白蛋白、1.0mM二硫苏糖醇。反应缓冲液是20mM Tris(pH 8.0)、50mM KCl、0.01％(v/v)Tween-20、100μg/mL牛血清白蛋白、1.0mM二硫苏糖醇以及所示的二价阳离子。EDTA洗涤缓冲液是含有100μM EDTA的结合缓冲液。将含有引物-模板(PT)的缓冲液、含有一种dNTP的结合缓冲液以及反应缓冲液加入(200微升/孔)到Greiner 96孔黑色微孔板(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M9685)中，并且施加PCR级矿物油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M8662)(75微升/孔)。在使用之前将高精度链霉亲和素生物传感器(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA；目录号18-5117)在退火缓冲液中重新水合约10分钟。将Octet QK生物传感器系统(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA)设置用于30℃操作并且编程以将生物传感器用引物-模板包被并且用洗涤缓冲液洗掉未结合的引物-模板。

为了测量未掺入的引物/模板的初始水平，将生物传感器转移到含有Klenow exo-(68单位/毫升)、SrCl₂(2.0mM)以及100μM dCTP的结合缓冲液中(缔合阶段)，继而转移到含有SrCl₂(2.0mM)和鲑鱼精DNA截留剂(trap)(500μg/mL)而不含MgCl₂的洗涤缓冲液中。将传感器转移到含有鲑鱼精DNA截留剂(500μg/mL)而不含MgCl₂的洗涤缓冲液中，继而转移到EDTA洗涤缓冲液中并且在结合缓冲液中重新平衡。

测量与未掺入的引物/模板的结合并且监测三元复合物在无二价阳离子的结合缓冲液中的稳定性。将生物传感器转移到含有Klenow exo-(68单位/毫升)、CoCl₂(1.0mM)或所示的二价阳离子(2.0mM)、以及100μM dCTP的结合缓冲液中(缔合阶段)，继而转移到含有相同浓度的相同二价阳离子和鲑鱼精DNA截留剂(500μg/mL)而不含MgCl₂的洗涤缓冲液中。将传感器转移到含有鲑鱼精DNA截留剂(500μg/mL)而不含MgCl₂的洗涤缓冲液中，继而转移到EDTA洗涤缓冲液中并且在结合缓冲液中重新平衡。

测量在含有各种二价阳离子而不含dNTP的结合缓冲液中三元复合物的稳定。将生物传感器转移到含有Klenow exo-(68单位/毫升)、CoCl₂(1.0mM)或所示的二价阳离子(2.0mM)、以及100μM dCTP的结合缓冲液中(缔合阶段)，继而转移到含有相同的二价阳离子和鲑鱼精DNA截留剂(500μg/mL)而不含MgCl₂的洗涤缓冲液中。将传感器转移到含有鲑鱼精DNA截留剂(500μg/mL)和10mM MgCl₂的洗涤缓冲液中，继而转移到EDTA洗涤缓冲液中并且在结合缓冲液中重新平衡。

最终，通过测量剩余的未掺入的引物/模板来确定核苷酸掺入。将生物传感器转移到含有Klenow exo-(68单位/毫升)、SrCl₂(2.0mM)以及100μM dCTP的结合缓冲液中(缔合阶段)，继而转移到含有SrCl₂(2.0mM)和鲑鱼精DNA截留剂(500μg/mL)而不含MgCl₂的洗涤缓冲液中。将传感器转移到含有鲑鱼精DNA截留剂(500μg/mL)而不含MgCl₂的洗涤缓冲液中，继而转移到EDTA洗涤缓冲液中并且在结合缓冲液中重新平衡。

数据分析.将数据输入到Microsoft Excel和Prism软件(GraphPad Software，SanDiego，CA)中以进行显示。

结果.对聚合酶和dCTP与包被有ssDNA引物-模板的生物传感器的结合进行测定。在第一个非催化循环中，在正确的核苷酸(dCTP)和SrCl₂存在下，Klenow exo-酶与生物传感器强烈结合，继而洗涤，从而回到基线(图14A，峰#1)。在第二个(非催化)循环中，在Ni(II)SO₄、BaCl₂以及SrCl₂存在下传感器由酶和dCTP强烈结合，但是在EDTA存在下不是这样(图BBBB A，峰#2-3)。含有Ni(II)SO₄的洗涤缓冲液在10分钟的过程中使三元复合物稳定(图14A，峰#2-3)。在Mg²⁺存在下信号降低(图14A，峰#3解离)，这对应于掺入，如由低水平的Sr²⁺介导的Klenow exo-和dCTP的结合所证实(图14A，峰#4)。这些结果证实了在缺少dNTP的缓冲液中Ni²⁺使Klenow exo-、dNTP以及ssDNA引物/模板的三元复合物稳定的能力，并且这种稳定与DNA聚合酶对核苷酸的酶促掺入相容。

Klenow exo-在除镁离子以外的替代性二价阳离子存在下表现出聚合酶活性。对聚合酶和dCTP与包被有ssDNA引物-模板的生物传感器的结合进行测定。在第一个非催化循环中，在正确的核苷酸(dCTP)和SrCl₂存在下，Klenow exo-酶与生物传感器强烈结合，继而洗涤，从而回到基线(图14B，峰#1)。在第二个结合循环中，在SrCl₂或硫酸铵存在下传感器由酶和dCTP强烈结合(图14B，峰#2-3)。然而，几种二价阳离子(Cu²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺)在结合缓冲液中对于Klenow exo-和dCTP与固定的引物/模板的结合显示出瞬时峰。(图14B，峰2)。在瞬时峰(Ca²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺)或平峰(Mn²⁺)消失之后，含有相同的二价阳离子和鲑鱼精DNA截留剂或单独的截留剂的洗涤缓冲液在图14A中没有进一步降低结合信号(除了达到基线的Ca²⁺之外)(峰#2)。在循环3中，生物传感器对酶、dCTP以及二价阳离子Ca²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺的第二次暴露没有表现出明显的结合(图14B，峰3)，标准Sr²⁺介导的结合对照也没有表现出明显的结合(图14B，峰4)。在较小程度上，Cu²⁺似乎也增强了Klenow exo-的聚合酶活性，这是因为对Cu²⁺的第二次暴露(图14B，峰3)小于第一次Cu²⁺结合(图14B，峰2)。这种在第一次暴露于酶+dNTP之后二价阳离子(Ca²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺)的结合信号的缺乏以及Sr²⁺介导的对照条件不能支持结合表明了完全的核苷酸掺入是使用某些二价阳离子(Ca²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺)在不存在Mg²⁺的情况下实现的，并且这些瞬时峰可以用于DNA测序。

实施例15.使用CoCl₂介导的结合和催化对单链DNA进行测序的长读段长度。

模板寡核苷酸phiX_100错配的DNA序列：

生物素-5′-GGCAAATCACCAGAAGGCGGTTCCTGAATGAATGGGAAGCCTTCAAGAA-GGTGATAAGCAGGAGAAACATACGAAGCATCATAACGATACCACTGACCC-3′(SEQ ID NO：22)

引物寡核苷酸FP2的DNA序列：

5′-GAGGGTCAGTGGTATCGTTATG-3′(SEQ ID NO：5)

试剂制备.寡核苷酸是由Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)合成和分析的(液相色谱-质谱(LC-MS)和电喷雾电离(ESI))。在TE缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA)中制备寡核苷酸以达到100μM。为了制备ssDNA引物/模板，将寡核苷酸“phiX_100错配”和“FP2”在容纳退火缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA、80mM KCl)的管中组合(每一条链10μM)。将容纳寡核苷酸溶液的管装载到干热块上(95℃，5分钟)，并且将干热块转移到工作台上以通过逐渐冷却到环境温度来使链退火。大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow(3′→5′exo-)片段购自Enzymatics(Beverly，MA；目录号P7010-LC-L)。超纯牛血清白蛋白(BSA)和超纯鲑鱼精DNA溶液购自Life Technologies(Foster City，CA)。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)核苷二磷酸激酶(NDPK)(目录号N0379)、腺苷二磷酸(ADP)以及六水合氯化钴(II)(目录号255599)购自Sigma(St.Louis，MO)。所有试剂和溶液均是分子生物学级的。

实验条件.将引物-模板双链体在退火缓冲液中稀释(100nM)。洗涤缓冲液是20mMTris(pH 8.0)、200mM KCl、200mM谷氨酸钾、0.01％(v/v)Tween-20、100μg/mL牛血清白蛋白、1.0mM二硫苏糖醇。结合缓冲液是含有低CoCl₂(0.050mM)的洗涤缓冲液。反应缓冲液是含有高CoCl₂(15mM)的结合缓冲液。EDTA洗涤缓冲液是含有1.0mM EDTA的结合缓冲液。将含有引物-模板(PT)的缓冲液、含有一种dNTP的结合缓冲液、以及反应缓冲液加入(200微升/孔)到Greiner 96孔黑色微孔板(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M9685)中，并且施加PCR级矿物油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M8662)(75微升/孔)。在使用之前将高精度链霉亲和素生物传感器(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA；目录号18-5117)在退火缓冲液中重新水合约10分钟。将Octet QK生物传感器系统(Pall ForteBio Corp.，MenloPark，CA)设置用于30℃操作并且编程以将生物传感器用引物-模板包被并且用洗涤缓冲液洗掉未结合的引物-模板。将生物传感器转移到含有Klenow exo-(68单位/毫升)、CoCl₂(100μM)以及100μM如所示的dNTP(dATP、dTTP、dGTP或dCTP)的结合缓冲液中(缔合阶段)，继而在含有CoCl₂(15mM)、NDPK、ADP(1mM)以及鲑鱼精DNA(500μg/mL)的反应缓冲液中进行dNTP掺入(解离阶段)。将生物传感器转移到EDTA洗涤缓冲液中，继而在不含酶、核苷酸或二价阳离子的反应缓冲液中重新平衡。类似地，将生物传感器循环地转移到含有如所示的单独的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP或dTTP)的溶液中。对每一种dNTP重复结合和掺入的一式两份循环以评估测序。

数据分析.明显的结合将数据输入到Microsoft Excel和Prism软件(GraphPadSoftware，San Diego，CA)中以进行显示。

结果.在与包被有ssDNA引物-模板的生物传感器的结合的测定中，在不存在dNTP的情况下Klenow(exo-)酶与生物传感器的结合不佳(图15，阴影条柱)。在正确的单独dNTP存在下，对于前40个循环观测到强峰(图15，黑色条柱)，假定每一个均聚物被压缩成单峰，这对应于前30个核苷酸的100％正确的DNA序列。之后，从循环41起观测到小的峰高，这不对应于可辨别的序列。这些结果证实了能够使用DNA聚合酶的Klenow exo-片段，通过在检查阶段中由低Co²⁺浓度介导的酶-dNTP-引物/模板三元复合物的结合，继而在高Co²⁺浓度存在下进行dNTP掺入来对双链DNA进行测序。

实施例16.使用镍增强的结合、镁交换以及在聚合酶截留剂和dNTP清除酶存在下的催化对单链DNA进行测序的长读段长度。具有3′倒置dT的模板寡核苷酸Btn-4460-4509SC4493A的DNA序列：

生物素-5′-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGG-3′-(3′-dT-5′)(SEQ ID NO：21)

引物寡核苷酸4496-4509AS的DNA序列：

5′-CCCGCCATGAGCTC-3′(SEQ ID NO：10)

试剂制备.寡核苷酸是由Integrated DNA Technologies公司(Coralville，IA)合成和分析的(液相色谱-质谱(LC-MS)和电喷雾电离(ESI))。在TE缓冲液(10mM Tris(pH8.0)、0.1mM EDTA)中制备寡核苷酸以达到100μM。为了制备ssDNA引物/模板，将寡核苷酸“Btn-4460-4509S C4493A”和“4496-4509AS”在容纳退火缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA、80mM KCl)的管中组合(每一条链10μM)。将容纳寡核苷酸溶液的管装载到干热块上(95℃，5分钟)，并且将干热块转移到工作台上以通过逐渐冷却到环境温度来使链退火。大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow(3′→5′exo-)片段购自Enzymatics(Beverly，MA；目录号P7010-LC-L)。超纯牛血清白蛋白(BSA)和超纯鲑鱼精DNA溶液购自Life Technologies(Foster City，CA)。酿酒酵母核苷二磷酸激酶(NDPK)(目录号N0379)、腺苷二磷酸(ADP)以及六水合硫酸镍(II)(目录号467901)购自Sigma(St.Louis，MO)。所有试剂和溶液均是分子生物学级的。

实验条件.将引物-模板双链体在退火缓冲液中稀释(100nM)。洗涤缓冲液是20mMTris(pH 8.0)、200mM KCl、200mM谷氨酸钾、0.01％(v/v)Tween-20、100μg/mL牛血清白蛋白、1.0mM二硫苏糖醇。结合缓冲液是含有2.0mM Ni(IDSO₄的洗涤缓冲液。反应缓冲液是含有MgCl₂(10mM)的结合缓冲液。EDTA洗涤缓冲液是含有1.0mM EDTA的结合缓冲液。将含有引物-模板(PT)的缓冲液、含有一种dNTP的结合缓冲液以及反应缓冲液加入(200微升/孔)到Greiner 96孔黑色微孔板(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M9685)中，并且施加PCR级矿物油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M8662)(75微升/孔)。在使用之前将高精度链霉亲和素生物传感器(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA；目录号18-5117)在退火缓冲液中重新水合约10分钟。将Octet QK生物传感器系统(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA)设置用于30℃操作并且编程以将生物传感器用引物-模板包被并且用洗涤缓冲液洗掉未结合的引物-模板。将生物传感器转移到含有Klenow exo-(68单位/毫升)、Ni(II)SO₄(2.0mM)以及100μM如所示的dNTP(dATP、dTTP、dGTP或dCTP)的结合缓冲液中(缔合阶段)，继而在含有MgCl₂(10mM)、NDPK、ADP(1mM)以及鲑鱼精DNA(500μg/mL)的反应缓冲液中进行dNTP掺入(解离阶段)。将生物传感器转移到EDTA洗涤缓冲液中，继而在不含酶、核苷酸或二价阳离子的反应缓冲液中重新平衡。类似地，将生物传感器循环地转移到含有如所示的单独的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP或dTTP)的溶液中。对每一种dNTP重复结合和掺入的一式两份循环以评估测序。

数据分析.将数据输入到Microsoft Excel和Prism软件(GraphPad Software，SanDiego，CA)中以进行显示。

结果.在与包被有ssDNA引物-模板的生物传感器的结合的测定中，在不存在dNTP的情况下Klenow(exo-)酶与生物传感器的结合不佳(图16，“Klenow”)。在正确的单独dNTP存在下，观测到强峰(图16，“Klenow+dNTP”)，假定每一个均聚物被压缩成单峰，这对应于前32个核苷酸的100％正确的DNA序列(CATCAGGATGAACCGGGGCAGGGATTGCAGGC(SEQ ID NO：23))。在750分钟之后，信号是最小的并且没有产生最后四个核苷酸的可辨别的序列(TCAC)。

均聚物压缩可能由聚合酶在反应缓冲液中掺入多于一个dNTP所引起。使用两种方法以通过意图支持单周转掺入的条件来防止均聚物压缩。第一，为了阻止游离的Klenow与引物/模板重新结合并且掺入第二个dNTP，一些反应缓冲液含有过量的鲑鱼精DNA作为聚合酶截留剂。第二，为了防止反应缓冲液中的游离dNTP重新结合Klenow-引物/模板复合物并且被酶促掺入到新生的链中，含有NDPK和ADP的反应缓冲液意图将游离的dNTP转化成dNDP和ATP以使dNDP不能由聚合酶掺入。在(缔合阶段)中形成三元复合物，之后在反应缓冲液中解离。含有聚合酶截留剂的反应缓冲液显示出在生物传感器尖端上的积聚，如由结合幅度超过解离幅度所证实(图16，“Klenow+dNTP”)。相比之下，含有NDPK和ADP的反应缓冲液在解离之后产生基线分辨率，这表明解离阶段完成(图16，“NDPK+ADP+Klenow+dNTP”)。这些结果表明了dNTP在与聚合酶-引物/模板复合物重新结合中的作用，这可能导致测序的封端、非产出性终止。含有NDPK和ADP的反应缓冲液似乎通过在催化期间消耗游离dNTP的集合来防止这些非产出性封端产物。没有实现单周转掺入，这是因为观测到均聚物压缩，即使是在鲑鱼精DNA、NDPK以及ADP存在下；预期序列(CATCAG₂ ATGA₂C₂G₄ CAG₃ AT₂ GCAG₂ CTCAC(SEQ ID NO：24))被检测为CATCAGATGACGCAGATGCAGC(SEQ ID NO：25)而没有连续的二核苷酸(GG、AA、CC或TT)、三核苷酸(GGG)或四核苷酸(GGGG)，如图16中所示。

综上所述，这些结果证实了能够使用DNA聚合酶的Klenow exo-片段，通过在检查阶段中由Ni²⁺离子介导的酶-dNTP-引物/模板三元复合物的结合，继而经由将二价阳离子交换成MgCl₂进行dNTP掺入，从而使得核苷酸被催化掺入到引物-模板中来对单链DNA进行测序。

实施例17.使用镍(II)增强的结合、镁交换以及在聚合酶截留剂和2′-脱氧核糖核苷二磷酸存在下的催化对单链DNA进行测序的均聚物分辨。

具有3′倒置dT的模板寡核苷酸Btn-4460-4509S C4493A的DNA序列：

生物素-5′-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGG-3′-(3′-dT-5′)(SEQ ID NO：21)

引物寡核苷酸

5′-CCCGCCATGAGCTC-3′(SEQ ID NO：10)4496-4509AS的DNA序列：

试剂制备.寡核苷酸是由Integrated DNA Technologies公司(Coralville，IA)合成和分析的(液相色谱-质谱(LC-MS)和电喷雾电离(ESI))。在TE缓冲液(10mM Tris(pH8.0)、0.1mM EDTA)中制备寡核苷酸以达到100μM。为了制备ssDNA引物/模板，将寡核苷酸“Btn-4460-4509S C4493A”和“4496-4509AS”在容纳退火缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA、80mM KCl)的管中组合(每一条链10μM)。将容纳寡核苷酸溶液的管装载到干热块上(95℃，5分钟)，并且将干热块转移到工作台上以通过逐渐冷却到环境温度来使链退火。来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的缺少核酸外切酶活性的Bsu DNA聚合酶I(大片段)购自New England Biolabs(Ipswich，MA；目录号M0330L)。超纯牛血清白蛋白(BSA)和超纯鲑鱼精DNA溶液购自Life Technologies(Foster City，CA)。六水合硫酸镍(II)(目录号467901)、dCDP、dGDP以及dTDP购自Sigma(St.Louis，MO)。所有试剂和溶液均是分子生物学级的。

实验条件.将引物-模板双链体在退火缓冲液中稀释(100nM)。洗涤缓冲液是20mMTris(pH 8.0)、200mM KCl、200mM谷氨酸钾、0.01％(v/v)Tween-20、100μg/mL牛血清白蛋白、1.0mM二硫苏糖醇。结合缓冲液是含有2.0mM Ni(II)SO₄的洗涤缓冲液。反应缓冲液是20mM Tris(pH 8.0)、50mM KCl、MgCl₂(10mM)、0.01％(v/v)Tween-20、100μg/mL牛血清白蛋白、1.0mM二硫苏糖醇。EDTA洗涤缓冲液是含有1.0mM EDTA的结合缓冲液。将含有引物-模板(PT)的缓冲液、含有一种dNTP的结合缓冲液以及反应缓冲液加入(200微升/孔)到Greiner96孔黑色微孔板(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M9685)中，并且施加PCR级矿物油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M8662)(75微升/孔)。在使用之前将高精度链霉亲和素生物传感器(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA；目录号18-5117)在退火缓冲液中重新水合约10分钟。将Octet QK生物传感器系统(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA)设置用于30℃操作并且编程以将生物传感器用引物-模板包被并且用洗涤缓冲液洗掉未结合的引物-模板。将生物传感器转移到含有Bsu Pol I(68单位/毫升)、Ni(II)SO₄(1.0mM)以及100μM如所示的dNTP(dATP、dTTP、dGTP或dCTP)的结合缓冲液中(缔合阶段)，继而在含有MgCl₂(10mM)、鲑鱼精DNA(500μg/mL)以及相应的dNDP(除了没有使用的dADP之外)的反应缓冲液中进行dNTP掺入(解离阶段)。将生物传感器转移到EDTA洗涤缓冲液中，继而在不含酶、核苷酸或二价阳离子的反应缓冲液中重新平衡。类似地，将生物传感器循环地转移到含有如所示的单独的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP或dTTP)的溶液中。对于每一种dNTP重复结合和掺入的循环以评估测序。

数据分析.将数据输入到Microsoft Excel和Prism软件(GraphPad Software，SanDiego，CA)中以进行显示。

结果.在与包被有ssDNA引物-模板的生物传感器的结合的测定中，在正确的dNTP存在下Bsu Pol I酶与生物传感器强烈结合(图17A)。其中反应缓冲液含有过量的dNDP(3.0mM)的信号峰对应于正确的DNA序列CATCAGG，其中均聚物的两个GG是通过检测到两个不同的峰来分辨的(图17A，箭头)。相反，在反应缓冲液中缺少dNDP的对照的信号峰中观测到不能分辨均聚物，假定GG均聚物被压缩成单个G峰，这对应于正确的DNA序列CATCAGGAT(图17A，“对照”)。通过以下两种手段来验证dNDP对均聚物分辨率的影响：(1.)GG二核苷酸的第二个G峰的高度取决于反应缓冲液中dNDP的浓度(图17A，第二个箭头)；以及(2.)在GG均聚物之后的下一个核苷酸(A和T)与反应缓冲液中的dNDP浓度呈负相关。

均聚物压缩可能由聚合酶在反应缓冲液中掺入多于一个dNTP所引起。使用两种方法以通过意图支持单周转掺入的条件来防止均聚物压缩。第一，为了阻止游离的Bsu Pol I与引物/模板重新结合并且掺入第二个dNTP，反应缓冲液含有过量的鲑鱼精DNA作为聚合酶截留剂。第二，为了防止反应缓冲液中的游离dNTP重新结合Bsu Pol-引物/模板复合物并且被酶促掺入到新生的链中，含有与游离dNTP竞争结合聚合酶的dNDP的反应缓冲液预期结合Bsu Pol-引物/模板复合物并且阻止进一步掺入，从而阻止均聚物压缩。单周转掺入的目标接近实现，这是因为GG均聚物的第二个峰是第一个G峰的大小的60.1％(图17B)，并且通过均聚物压缩，随后两个核苷酸(A和T)的结合分别减少了73.4％和92.0％(图17B)。

这些结果证实了能够使用Bsu Pol I(大片段)，通过在检查阶段中由Ni²⁺离子介导的酶-dNTP-引物/模板三元复合物的结合，继而经由将二价阳离子交换成MgCl₂进行dNTP掺入，从而使得核苷酸被催化掺入到引物-模板中，同时在反应缓冲液中使用竞争性dNDP提高均聚物分辨率来对单链DNA进行测序。

实施例18.使用镍(II)增强的结合、镁交换以及在2′-脱氧核糖核苷二磷酸和竞争性底物存在下的催化对单链DNA进行测序的均聚物分辨的动力学方法。

具有3′倒置dT的野生型ALK模板寡核苷酸Btn-4460-4509S的DNA序列：

生物素-5′-GTGAGCCTGCAATCCCTGCCCCGGTTCATCCTGCTGGAGCTCATGGCGGG-3′-(3′-dT-5′)(SEQ ID NO：7)

ALK-G1引物寡核苷酸4494-4509AS的DNA序列：

5′-CCCGCCATGAGCTCCA-3′(SEQ ID NO：26)

ALK-G2引物寡核苷酸4491-4509AS的DNA序列：

5′-CCCGCCATGAGCTCCAGCA-3′(SEQ ID NO：27)

ALK-G3引物寡核苷酸4476-4509AS的DNA序列：

5′-CCCGCCATGAGCTCCAGCAGGATGAACC/ideoxyI/GGGCA-3′(SEQ ID NO：28)，

其中“/ideoxyI/”是2′-脱氧肌苷残基。

ALK-G4引物寡核苷酸4482-4509AS的DNA序列：

5′-CCCGCCATGAGCTCCAGCAGGATGAACC-3′(SEQ ID NO：29)

试剂制备.寡核苷酸是由Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)合成和分析的(液相色谱-质谱(LC-MS)和电喷雾电离(ESI))。在TE缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、0.1mM EDTA)中制备寡核苷酸以达到100μM。为了制备ssDNA引物/模板，将寡核苷酸“Btn-4460-4509S”和“4494-4509AS”、“4491-4509AS”、“4476-4509AS”、或“4482-4509AS”(分别是ALK-G1双链体、ALK-G2双链体、ALK-G3双链体或ALK-G4双链体)在容纳退火缓冲液(10mMTris(pH 8.0)、0.1mM EDTA、80mM KCl)的管中组合(每一条链10μM)。将容纳寡核苷酸溶液的管装载到干热块上(95℃，5分钟)，并且将干热块转移到工作台上以通过逐渐冷却到环境温度来使链退火。来自枯草芽孢杆菌的缺少核酸外切酶活性的Bsu DNA聚合酶I(大片段)购自New England Biolabs公司(Ipswich，MA；目录号M0330L)。超纯牛血清白蛋白(BSA)和超纯鲑鱼精DNA溶液购自Life Technologies(Foster City，CA)。底物类似物2′-脱氧腺苷-5′-O-(1-硫代三磷酸)(“α-S-dATP”)、2′-脱氧胞苷-5′-O-(1-硫代三磷酸)(“α-S-dCTP”)、2′-脱氧鸟苷-5′-O-(1-硫代三磷酸)(“α-S-dGTP”)以及2′-脱氧胸苷-5′-O-(1-硫代三磷酸)(“α-S-dTTP”)购自TriLink Biotechnologies Inc.(San Diego，CA)。六水合硫酸镍(II)(目录号467901)购自Sigma(St.Louis，MO)。所有试剂和溶液均是分子生物学级的。

实验条件.将引物-模板双链体在退火缓冲液中稀释(100nM)。洗涤缓冲液是30mMTris(pH 8.0)、160mM KCl、160mM谷氨酸钾、0.01％(v/v)Tween-20、100μg/mL牛血清白蛋白、1.0mM二硫苏糖醇。结合缓冲液是含有Bsu Pol I(68单位/毫升)、100μM dGTP+1.0mM Ni(II)SO₄的洗涤缓冲液。反应缓冲液是含有Bsu(1U/mL)、MgCl₂(80μM)、dGTP(28.1μM)、α-S-dGTP(162μM)的洗涤缓冲液。EDTA洗涤缓冲液是不含Ni(II)SO₄，但是含有1.0mM EDTA的洗涤缓冲液。将含有引物-模板(PT)的缓冲液、结合缓冲液以及反应缓冲液加入(200微升/孔)到Greiner 96孔黑色微孔板(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M9685)中，并且施加PCR级矿物油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号M8662)(75微升/孔)。在使用之前将高精度链霉亲和素生物传感器(Pall ForteBio Corp.，Menlo Park，CA；目录号18-5117)在退火缓冲液中重新水合约10分钟。将Octet QK生物传感器系统(Pall ForteBio Corp.，MenloPark，CA)设置用于30℃操作并且编程以将生物传感器用引物-模板包被并且用洗涤缓冲液洗掉未结合的引物-模板。将生物传感器转移到结合缓冲液中(缔合阶段)，继而在反应缓冲液中进行dNTP掺入(解离阶段)。将生物传感器转移到EDTA洗涤缓冲液中，继而在不含酶、核苷酸或MgCl₂的反应缓冲液中重新平衡。

数据分析.将数据输入到Microsoft Excel和Prism软件(GraphPad Software，SanDiego，CA)中以进行显示。使用Prism软件将缔合阶段时间序列拟合成单指数缔合方程。通过InStat统计软件(GraphPad Software，San Diego，CA)，使用杜奈特检验(Dunnetttest)，使用G的单一掺入作为对照条件来分析缔合阶段动力学参数(k_obs和幅度)。使用Prism软件将解离阶段时间序列拟合成双指数解离方程。

结果.在与包被有ssDNA引物-模板的生物传感器的结合的测定中，在正确的dGTP存在下Bsu Pol I酶与包被有引物/模板的生物传感器强烈结合(图18A和18B)。与ALK-G1的结合的信号(图18A)高于与ALK-G2、ALK-G3以及ALK-G4的结合(图18A和18B)。在将包被有三元复合物的生物传感器转移到含有聚合酶、dGTP和α-S-dGTP、Ni²⁺以及Mg²⁺的掺入缓冲液中之后，根据ALK模板观测到不同的解离时间过程(图18C)。针对缔合动力学参数如何受到掺入到引物/模板的均聚物中的核苷酸数目的影响来分析三元复合物的形成的缔合阶段。具有掺入到均聚物中的多个(2个-4个)核苷酸的引物/模板比对照单一掺入具有更低的缔合幅度(图18D)，根据杜奈特检验，这具有统计显著性(p＜0.01)。类似地，具有掺入到均聚物中的多个(2个-4个)核苷酸的引物/模板比对照单一掺入具有更高的表观缔合动力学常数(k_obs)(图18D)，根据杜奈特检验，这具有统计显著性(p＜0.01)。该研究结果表明单一掺入在动力学上可与均聚物模板中的多重掺入相区分。最终，所观测到的解离速率(在转移到反应缓冲液中之后0秒-8秒)按排序ALK-G2＜ALK-G3＜ALK-G4～ALK-G1随掺入的核苷酸数目增加而增加，其中Bsu聚合酶浓度是0.13U/mL-1U/mL(图18E)。

这些结果证实了能够以两步方法定量地检测均聚物模板中的单一掺入和多重掺入。首先，与多重掺入(ALK-G2、ALK-G3、ALK-G4)相比，对于单一掺入(ALK-G1)，三元复合物的缔合动力学参数是不同的。其次，在将包被有三元复合物的生物传感器尖端转移到反应缓冲液中之后，初始解离速率(0秒-8秒)允许定量地辨别均聚物模板中两个、三个或四个核苷酸的掺入(ALK-G2、ALK-G3、ALK-G4)。

Claims (94)

1.一种用于对模板核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：

检查步骤，所述检查步骤包括：

(a)提供用引物引发的模板核酸分子，其中所述引物在3’端包含可逆终止子部分；

(b)使所述引发的模板核酸分子与包含多种聚合酶和第一未标记的核苷酸分子的第一反应混合物接触，

其中当所述第一未标记的核苷酸分子与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补时，所述引发的模板核酸分子、聚合酶以及所述第一未标记的核苷酸分子能够形成三元复合物，并且

其中当所述第一未标记的核苷酸分子与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基不互补时，所述引发的模板核酸分子和所述聚合酶能够形成二元复合物，

(c)在所述第一未标记的核苷酸分子存在下，并且在所述第一未标记的核苷酸分子没有化学掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的情况下，监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用；以及

(d)通过步骤(c)的所述监测的相互作用鉴定与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补的所述核苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括将步骤(b)和(c)重复一次或多次。

3.根据权利要求2所述的方法，其中使用包含所述聚合酶和第二未标记的核苷酸分子的第二反应混合物重复步骤(b)。

4.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括使用包含所述聚合酶和第三未标记的核苷酸分子的第三反应混合物重复步骤(b)。

5.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括使用包含所述聚合酶和第四未标记的核苷酸分子的第四反应混合物重复步骤(b)。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述接触在使所述三元复合物的形成稳定的条件下发生。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述接触在使所述二元复合物的形成不稳定的条件下发生。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述条件包括使所述引发的核酸分子与调节渗透压的缓冲液接触。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一反应混合物包含调节渗透压的所述缓冲液。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述缓冲液是高盐缓冲液。

11.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述缓冲液包含谷氨酸钾。

12.根据权利要求6所述的方法，其中使所述三元复合物的形成稳定的所述条件包括使所述引发的核酸分子与稳定剂接触。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含稳定剂。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述稳定剂是非催化性金属离子。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述非催化性金属离子是锶、锡或镍。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(d)之前的洗涤步骤，其中所述洗涤步骤去除任何二元复合物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述洗涤步骤在使所述三元复合物稳定的条件下进行。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述条件包括稳定剂。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述稳定剂是非催化性金属离子。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述非催化性金属离子是锶、锡或镍。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述三元复合物具有半衰期并且其中将所述洗涤步骤进行的持续时间比所述在未标记的核苷酸分子提供与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补的碱基时形成的三元复合物的半衰期短。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是持续性聚合酶。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是分配性聚合酶。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(d)之后的重新上样步骤，所述重新上样步骤包括使所述引发的模板核酸与包含所述聚合酶和所述第一未标记的核苷酸分子或任选的第二未标记的核苷酸分子、第三未标记的核苷酸分子以及第四未标记的核苷酸分子的重新上样混合物在使所述三元复合物稳定的条件下接触。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(d)之后的掺入步骤，所述掺入步骤包括使与所述引发的核酸分子的下一个碱基互补的所述未标记的核苷酸掺入到所述引物中。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述掺入包括与掺入反应混合物接触，并且其中所述掺入反应混合物包含能够掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种未标记的核苷酸分子以及不能掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种未标记的核苷酸分子。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一反应混合物包含钴并且其中所述掺入包括与掺入反应混合物接触，所述掺入反应混合物包含与所述第一反应混合物中钴的浓度相比更高浓度的钴。

28.根据权利要求25所述的方法，其中在催化性金属离子存在下进行掺入。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中在表面等离子体共振传感器上进行监测步骤(c)。

30.根据权利要求29所述的方法，其中用引物引发的所述模板核酸分子被定位在所述表面等离子体共振传感器上。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中经由检测来自所述聚合酶的固有信号来进行监测步骤(c)。

32.根据权利要求31所述的方法，其中来自所述聚合酶的所述固有信号是光散射信号。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是未标记的聚合酶并且在不存在与所述聚合酶缔合的可检测的标记的情况下进行监测步骤(c)。

34.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中监测步骤(c)包括在所述第一未标记的核苷酸分子存在下，在所述第一未标记的核苷酸分子没有化学掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的情况下监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的稳态相互作用。

35.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中监测步骤(c)包括在所述第一未标记的核苷酸分子存在下，在所述第一未标记的核苷酸分子没有化学掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的情况下监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的解离。

36.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中监测步骤(c)包括在所述第一未标记的核苷酸分子存在下，在所述第一未标记的核苷酸分子没有化学掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的情况下监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的缔合。

37.一种用于对模板核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：

检查步骤，所述检查步骤包括：

(a)提供用引物引发的模板核酸分子，其中所述引物在3’端包含可逆终止子部分；

(b)使所述引发的模板核酸分子与包含未标记的聚合酶、第一未标记的核苷酸分子以及第二未标记的核苷酸分子的反应混合物接触，所述第一未标记的核苷酸分子和所述第二未标记的核苷酸分子是不同的并且以不同的浓度存在于所述反应混合物中，

其中当所述第一未标记的核苷酸分子和/或第二未标记的核苷酸分子与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补时，所述引发的模板核酸分子、所述未标记的聚合酶以及所述第一未标记的核苷酸分子和/或第二未标记的核苷酸分子能够形成三元复合物，并且

其中当所述第一未标记的核苷酸分子和/或第二未标记的核苷酸分子与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基不互补时，所述引发的模板核酸分子和所述未标记的聚合酶能够形成二元复合物；

(c)在所述第一未标记的核苷酸分子和所述第二未标记的核苷酸分子存在下，并且在所述第一未标记的核苷酸分子或所述第二未标记的核苷酸分子没有化学掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的情况下监测所述未标记的聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用；以及

(d)通过步骤(c)的所述监测的相互作用鉴定与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补的所述核苷酸。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述反应混合物还包含第三未标记的核苷酸分子，其中所述第三未标记的核苷酸分子不同于所述第一未标记的核苷酸分子和所述第二未标记的核苷酸分子并且以与所述第一未标记的核苷酸分子和所述第二未标记的核苷酸分子不同的浓度存在于所述反应混合物中。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述反应混合物还包含第四未标记的核苷酸分子，其中所述第四未标记的核苷酸分子不同于所述第一未标记的核苷酸分子、所述第二未标记的核苷酸分子以及所述第三未标记的核苷酸分子并且以与所述第一未标记的核苷酸分子、所述第二未标记的核苷酸分子以及所述第三未标记的核苷酸分子不同的浓度存在于所述反应混合物中。

40.根据权利要求37所述的方法，其中所述反应混合物包含能够掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第一未标记的核苷酸分子以及不能掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第一未标记的核苷酸分子。

41.根据权利要求37所述的方法，其中所述反应混合物包含能够掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第二未标记的核苷酸分子以及不能掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第二未标记的核苷酸分子。

42.根据权利要求38所述的方法，其中所述反应混合物包含能够掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第三未标记的核苷酸分子以及不能掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第三未标记的核苷酸分子。

43.根据权利要求39所述的方法，其中所述反应混合物包含能够掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第四未标记的核苷酸分子以及不能掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种第四未标记的核苷酸分子。

44.根据权利要求37至43中任一项所述的方法，其中所述接触在使所述三元复合物的形成稳定的条件下发生。

45.一种用于对双链核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：

检查步骤，所述检查步骤包括：

a)提供包含第一模板核酸链和包含切口或缺口的第二核酸链的双链核酸分子；

b)使所述双链核酸分子与包含聚合酶和至少一种未标记的核苷酸分子的第一反应混合物在使在所述核苷酸与所述第一模板核酸链的下一个碱基互补时在所述聚合酶、双链核酸分子以及核苷酸之间形成的三元复合物的形成稳定的条件下接触；

c)在所述未标记的核苷酸分子存在下，在所述核苷酸分子没有掺入到所述第二链中的情况下监测所述聚合酶与所述第一模板核酸链的相互作用；以及

d)基于步骤c)的所述监测的相互作用鉴定所述模板核酸链中的下一个碱基。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述聚合酶具有链置换活性。

47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述双链核酸分子的第二链包含flap。

48.一种用于对模板核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：

检查步骤，所述检查步骤包括：

a)提供用引物引发的模板核酸分子，其中所述引物在3’端包含可逆终止子部分；

b)使所述引发的模板核酸分子与包含多种聚合酶和至少一种未标记的核苷酸分子的第一反应混合物接触，

其中当所述第一未标记的核苷酸分子与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补时，所述引发的模板核酸分子、聚合酶以及所述第一未标记的核苷酸分子能够形成三元复合物，并且

其中当所述第一未标记的核苷酸分子与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基不互补时，所述引发的模板核酸分子和所述聚合酶能够形成二元复合物，并且

其中所述三元复合物的形成相对于所述二元复合物的形成是有利的；

c)在所述未标记的核苷酸分子存在下，在所述核苷酸没有掺入到所述引发的模板核酸的引物中的情况下监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用；以及

d)通过步骤c)的所述监测的相互作用鉴定与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补的所述核苷酸。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述方法包括重复步骤b)、步骤c)、以及步骤d)以确定所述核酸分子的序列。

50.根据权利要求48或49所述的方法，其中在不存在可检测标记的核苷酸的情况下进行所述方法。

51.根据权利要求48至50中任一项所述的方法，所述方法还包括掺入步骤，所述掺入步骤包括使与所述引发的模板核酸的下一个碱基互补的所述未标记的核苷酸掺入到所述引物中。

52.根据权利要求51所述的方法，其中在进行所述掺入步骤之前将所述检查步骤重复一次或多次。

53.根据权利要求52所述的方法，其中两个连续的检查步骤包括具有不同的未标记的核苷酸分子的反应混合物。

54.根据权利要求51所述的方法，其中在使所述单个未标记的核苷酸掺入到所述引发的模板核酸分子中之前，用包含聚合酶和1种、2种、3种、或4种类型的未标记的核苷酸分子的掺入反应混合物代替所述第一反应混合物。

55.根据权利要求48至54中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含能够掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种未标记的核苷酸分子和不能掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的一种或多种未标记的核苷酸分子。

56.根据权利要求48至55中任一项所述的方法，其中所述核苷酸包含被修饰以包含3'终止子部分的3'羟基。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述3'终止子部分是可逆的终止子或不可逆的终止子。

58.根据权利要求48至57中任一项所述的方法，其中所述未标记的核苷酸分子是与所述模板核酸分子中所述引物的3'末端下游的碱基互补的核苷酸。

59.根据权利要求48所述的方法，其中所述接触使所述二元复合物的形成不稳定。

60.根据权利要求48至59中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含高浓度的盐。

61.根据权利要求48至60中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含具有4.0至6.0的pH或6.0至10.0的pH的缓冲液。

62.根据权利要求48至61中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含1种、2种、3种或4种类型的未标记的核苷酸分子。

63.根据权利要求48至62中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含谷氨酸钾。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述第一反应混合物包含10mM至1.6M的谷氨酸钾。

65.根据权利要求48至62中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含调节渗透压的缓冲液。

66.根据权利要求48至62中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述引发的模板核酸分子、聚合酶以及未标记的核苷酸分子与调节渗透压的缓冲液接触。

67.根据权利要求65或66所述的方法，其中所述缓冲液包含谷氨酸钾。

68.根据权利要求48至64中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含稳定剂。

69.根据权利要求48至64中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述引发的模板核酸分子、聚合酶以及未标记的核苷酸分子与稳定剂接触。

70.根据权利要求68或69所述的方法，其中所述稳定剂是锶、锡或镍。

71.根据权利要求51所述的方法，其中所述掺入包括与掺入反应混合物接触。

72.根据权利要求71所述的方法，其中所述第一反应混合物包含钴并且其中所述掺入反应混合物包含与所述第一反应混合物中钴的浓度相比更高浓度的钴。

73.根据权利要求48至72中任一项所述的方法，其中所述监测包括在所述未标记的核苷酸存在下监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的稳态相互作用、解离或缔合。

74.根据权利要求48至73中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含非催化性金属离子。

75.根据权利要求74所述的方法，其中所述非催化性金属离子是锶、锡或镍。

76.根据权利要求75所述的方法，其中所述第一反应混合物包含0.01mM至30mM的氯化锶。

77.根据权利要求51所述的方法，其中所述掺入步骤包括使所述引发的模板核酸分子、聚合酶以及核苷酸与包含催化性金属离子的掺入反应混合物接触。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述掺入反应混合物包含0.5mM至50mM的所述催化性金属离子。

79.根据权利要求77或78所述的方法，其中所述催化性金属离子是镁。

80.根据权利要求77至79中任一项所述的方法，其中所述掺入反应混合物包含氯化钾。

81.根据权利要求48至80中任一项所述的方法，其中所述模板核酸被固定到表面。

82.根据权利要求81所述的方法，其中所述表面是纳米孔阵列、平面基底、水凝胶、微粒、或纳米颗粒。

83.一种用于对模板核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：

检查步骤，所述检查步骤包括：

a)提供用引物引发的模板核酸分子，其中所述引物在3’端包含可逆终止子部分；

b)使所述引发的模板核酸分子与包含聚合酶、聚合酶抑制剂以及至少一种未标记的核苷酸分子的第一反应混合物接触；

c)在所述未标记的核苷酸分子存在下，在所述核苷酸没有掺入到所述引发的模板核酸分子的引物中的情况下监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用；以及

d)通过步骤c的所述监测的相互作用鉴定与所述引发的模板核酸分子的下一个碱基互补的所述核苷酸。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述聚合酶抑制剂防止所述未标记的核苷酸分子掺入到所述引发的模板核酸中。

85.根据权利要求83或84所述的方法，其中所述聚合酶抑制剂是焦磷酸类似物。

86.根据权利要求83或84所述的方法，其中所述聚合酶抑制剂是非竞争性抑制剂、变构抑制剂、或无竞争性变构抑制剂。

87.根据权利要求83或84所述的方法，其中所述聚合酶抑制剂与催化性离子竞争所述聚合酶中的结合位点。

88.根据权利要求83或84所述的方法，其中所述聚合酶抑制剂是逆转录酶抑制剂。

89.根据权利要求83或84所述的方法，其中所述聚合酶抑制剂是HIV-1逆转录酶抑制剂。

90.根据权利要求89所述的方法，其中所述HIV-1逆转录酶抑制剂是4/6-卤素/MeO/EtO取代的苯并[d]噻唑-2-基)噻唑烷-4-酮。

91.根据权利要求83至90中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含30μM至150μM的所述聚合酶抑制剂。

92.根据权利要求83至90中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含30μM至70μM的所述聚合酶抑制剂。

93.根据权利要求83至90中任一项所述的方法，其中所述第一反应混合物包含60μM至140μM的所述聚合酶抑制剂。

94.根据权利要求83至93中任一项所述的方法，其中在不存在可检测标记的核苷酸的情况下进行所述方法。

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