CN109072297B - 使用增强的核苷酸特异性三元复合物形成检测的核酸测序方法和系统 - Google Patents

使用增强的核苷酸特异性三元复合物形成检测的核酸测序方法和系统 Download PDF

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Abstract

提供用于检测核苷酸特异性三元复合物的形成的方法和系统，所述核苷酸特异性三元复合物包含DNA聚合酶、核酸和与所述引发的模板核酸的模板化碱基互补的核苷酸。所述方法和系统促进下一正确核苷酸的确定，而无需将所述核苷酸以化学方式掺入所述引物中。这有利地提高信噪比并且增加可在边结合边测序方案中获得的结果的质量，并且使得能够实现延伸的读段长。这些结果甚至可在使用未标记、原生核苷酸的程序中实现。

Description

使用增强的核苷酸特异性三元复合物形成检测的核酸测序方 法和系统
相关申请
本申请要求2016年4月22日提交的美国临时申请号62/326,356的权益。这一在先申请的完整公开内容由此以引用的方式整体并入。
技术领域
本发明一般来说涉及生物技术领域。更具体说来，本发明涉及核酸测序技术。
背景
模板核酸链的精确序列测定在基因组分析、分子诊断学等中有多种重要应用。甚至在已知位置处来自替代物的单核苷酸碱基的鉴别也可用作分析单核苷酸多态性(即，“SNP”)的基础。已知的核酸序列的短区段的检测已经用于从临床或环境来源鉴别细菌、真菌和病毒病原体。在已知的核酸序列中检测遗传或获得性基因变体(例如，改变或突变)也提供重要的信息，例如与对某些药物的改变的易感性有关的信息。最后，基因组规模的测序取决于可组装至一个或多个邻接序列中的数百万个核苷酸的正确鉴别。这些情况中的每一者均显著地取决于在沿着模板核酸链的不同位置处一次一种单个核苷酸的正确鉴别。
人类基因组计划完全地通过使用常规荧光桑格双脱氧核糖核苷酸测序技术来实现。从那时起，后续技术已经简化了用于获得多核苷酸序列信息的程序，所述程序旨在将基因组分析整合至常规临床和工业实验室应用中。
替代核酸测序平台包括通过杂交测序，和边合成边测序。在第一种情况下，可检测标记的DNA链在杂交条件下与固定至固体支撑物上的多达数千种限定的探针序列的阵列接触。在所述程序中形成的短双螺旋可经过检测并且由计算机针对组装至邻接序列中进行分析。边合成边测序程序已经采取了多种形式并且也已经成功。经过标记的核苷酸的添加、检测和后续化学处理的化学过程的自动化和改进已经革新了用于采集原始序列信息的程序。在一些情况下，仅测定核酸序列的相对短区段，但大规模平行处理提供了在基因组规模上推断核酸序列所需的信息。
一般说来，需要在不同测序平台之中具有提高的碱基识别精度的延长测序读段长。本发明解决了这一需要。
简述
一方面，本公开涉及一种确定测试核苷酸是否是下一正确核苷酸的方法，所述下一正确核苷酸包括与引发的模板核酸中的引物紧邻下游的模板链中的下一碱基互补的碱基。所述方法包括以下步骤：(a)使引发的模板核酸与包括DNA聚合酶的第一反应混合物接触；(b)使来自步骤(a)的引发的模板核酸与包括DNA聚合酶和所述测试核苷酸的第二反应混合物接触；(c)分别在步骤(a)和(b)中的每一者期间的一个或多个时刻测量引发的模板核酸与所述第一和第二反应混合物的DNA聚合酶的结合，但所述测试核苷酸并未以化学方式掺入所述引物中；和(d)使用来自步骤(c)的所测量结合结果来确定所述测试核苷酸是否是下一正确核苷酸。根据一个一般优选的实施方案，所述测试核苷酸可为不包括任何所添加的荧光标记的原生核苷酸，并且步骤(c)不包括测量来自构象敏感染料的荧光或吸收信号的差异，所述构象敏感染料由于DNA聚合酶结合至所述测试核苷酸而改变光学特性。根据另一个一般优选的实施方案，所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸。优选地，所述方法进一步包括步骤(e)，即通过形成磷酸二酯键而将所述测试核苷酸以化学方式掺入引发的模板核酸的引物中。更优选地，所述方法进一步涉及重复步骤(a)-(e)。例如，步骤(a)-(e)可重复至少50次。或者，所述方法可进一步包括步骤(f)，即使用第二测试核苷酸替代所述测试核苷酸来重复步骤(a)-(e)，其中所述测试核苷酸和所述第二测试核苷酸彼此不同。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸的其它实施方案中，所述方法进一步包括步骤(e)，即用第三反应混合物替代所述第二反应混合物，所述第三反应混合物包含具有可逆终止子部分的可逆终止子核苷酸和不同于所述第二反应混合物的DNA聚合酶的DNA聚合酶。更优选地，所述方法进一步包括步骤(f)，即通过形成磷酸二酯键将所述可逆终止子核苷酸掺入所述引物中。更优选地，所述方法进一步包括步骤(g)，即从掺入所述引物中的所述可逆终止子核苷酸去除所述可逆终止子部分。更优选地，所述方法进一步涉及重复步骤(a)-(g)至少50次。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸的其它实施方案中，所述引发的模板核酸可固定至固体支撑物，并且步骤(b)可涉及从含有所述第一反应混合物的容器移动所述固体支撑物至含有所述第二反应混合物的不同容器。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸的其它实施方案中，所述引发的模板核酸可固定至固体支撑物，并且步骤(a)和(b)中的每一者均可包括使反应混合物流经所述引发的模板核酸。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸的其它实施方案中，步骤(c)可包括在步骤(a)和(b)中的每一者期间连续地测量所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸的其它实施方案中，步骤(c)可包括测量指示所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合的光学信号，和接着计算所测量的光学信号之间的差异以确定由步骤(b)得到的经测量的结合是否超过由步骤(a)得到的经测量的结合。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸的其它实施方案中，步骤(c)包括测量指示所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合的光学信号，和接着计算所测量的光学信号的比率以确定由步骤(b)得到的经测量的结合是否超过由步骤(a)得到的经测量的结合。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸的其它实施方案中，步骤(c)包括测量指示所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合的光学信号，和接着计算所测量的光学信号的时间依赖性改变速率以确定由步骤(b)得到的经测量的结合是否超过由步骤(a)得到的经测量的结合。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸的其它实施方案中，所述测试核苷酸可为选自由dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP组成的组的原生核苷酸。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸的其它实施方案中，所述测试核苷酸不包含外源荧光标记。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸的其它实施方案中，所述测试核苷酸可为不包含外源标记的未标记测试核苷酸。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸的其它实施方案中，所述测试核苷酸为核苷酸类似物。更优选地，所述核苷酸类似物包含可逆终止子部分。更优选地，所述包含可逆终止子部分的核苷酸类似物进一步包含荧光标记。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸的其它实施方案中，所述引发的模板核酸固定至表面，并且步骤(c)涉及测量折射率的改变以测量所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合。更优选地，步骤(c)涉及通过干涉术或表面等离子体共振传感测量折射率的改变。根据一个不同的一般优选的实施方案，所述第一反应混合物的DNA聚合酶不含所添加的荧光标记。根据一个不同的一般优选的实施方案，所述第一反应混合物的DNA聚合酶不含所添加的荧光标记，所述荧光标记在所述DNA聚合酶结合至核苷酸之后改变特性。在其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸并且其中所述测试核苷酸可为不包含外源标记的未标记测试核苷酸的其它实施方案中，所述第一反应混合物的DNA聚合酶可不含所添加的荧光标记，所述荧光标记在所述DNA聚合酶结合至核苷酸之后改变特性。优选地，所述引发的模板核酸固定至表面，并且步骤(c)包括测量折射率的改变以测量所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合。根据一个不同的一般优选的实施方案，所述第一反应混合物进一步包含浓度低于当所述测试核苷酸为下一正确核苷酸时实现最大三元复合物形成所需的浓度的测试核苷酸，并且所述第二反应混合物包含浓度足以在所述测试核苷酸为下一正确核苷酸时实现最大三元复合物形成的测试核苷酸。根据一个不同的一般优选的实施方案，步骤(d)包括如果由步骤(b)得到的经测量的结合超过由步骤(a)得到的经测量的结合，那么确定所述测试核苷酸是下一正确核苷酸。
另一方面，本公开涉及一种鉴别下一正确核苷酸的方法，所述下一正确核苷酸包含与引发的模板核酸中的引物紧邻下游的模板链中的下一碱基互补的碱基。所述方法包括以下步骤：(a)使引发的模板核酸与包含DNA聚合酶的第一反应混合物接触；(b)使来自步骤(a)的引发的模板核酸与包含DNA聚合酶和第一测试核苷酸的第二反应混合物接触；(c)使来自步骤(b)的引发的模板核酸与包含DNA聚合酶、第一测试核苷酸和第二测试核苷酸的第三反应混合物接触；(d)使来自步骤(c)的引发的模板核酸与包含DNA聚合酶、第一测试核苷酸、第二测试核苷酸和第三测试核苷酸的第四反应混合物接触；(e)使来自步骤(d)的引发的模板核酸与包含DNA聚合酶、第一测试核苷酸、第二测试核苷酸、第三测试核苷酸和第四测试核苷酸的第五反应混合物接触；(f)在步骤(a)-(e)中的每一者期间的一个或多个时刻测量引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合，但所述第一测试核苷酸并未以化学方式掺入所述引物中；和(g)鉴别下一正确核苷酸：(i)如果由步骤(b)得到的经测量的结合超过由步骤(a)得到的经测量的结合，那么是第一测试核苷酸，或(ii)如果由步骤(c)得到的经测量的结合超过由步骤(b)得到的经测量的结合，那么是第二测试核苷酸，或(iii)如果由步骤(d)得到的经测量的结合超过由步骤(c)得到的经测量的结合，那么是第三测试核苷酸，或(iv)如果由步骤(e)得到的经测量的结合超过由步骤(d)得到的经测量的结合，那么是第四测试核苷酸。根据一个一般优选的实施方案，所述方法在步骤(f)之后进一步包括步骤(h)，即通过磷酸二酯键形成将所述下一正确核苷酸以化学方式掺入所述引物中。更优选地，所述测试核苷酸中的每一者彼此不同，并且所述测试核苷酸中的每一者均是选自由dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP组成的组。或者，所述测试核苷酸中的每一者彼此不同，并且每一种测试核苷酸均是选自由dATP、dGTP、dCTP和dTTP组成的组的原生核苷酸。或者，所述测试核苷酸中的每一者彼此不同，并且所述测试核苷酸均不包含外源荧光标记。或者，所述测试核苷酸中的每一者彼此不同，并且其中每一种测试核苷酸均是包含可逆终止子部分的核苷酸类似物。或者，所述掺入引物中的下一正确核苷酸包含可逆终止子部分。优选地，所述掺入引物中的下一正确核苷酸包含可逆终止子部分。根据一个不同的一般优选的实施方案，当所述方法在步骤(f)之后进一步包括步骤(h)，即通过磷酸二酯键形成将所述下一正确核苷酸以化学方式掺入所述引物中时，所述测试核苷酸均不包含可逆终止子部分，并且在步骤(f)与步骤(h)之间存在步骤(i)，即去除结合至引发的模板核酸的任何测试核苷酸，和接着添加至少一种包含可逆终止子部分的核苷酸。根据一个不同的一般优选的实施方案，当所述方法在步骤(f)之后进一步包括步骤(h)，即通过磷酸二酯键形成将所述下一正确核苷酸以化学方式掺入所述引物中时，用于步骤(a)-(e)的聚合酶可不同于用于步骤(h)的聚合酶。
另一方面，本公开涉及一种确定测试核苷酸是否是下一正确核苷酸的方法，所述下一正确核苷酸包含与引发的模板核酸中的引物紧邻下游的模板链中的下一碱基互补的碱基。所述方法包括以下步骤：(a)使引发的模板核酸与包含第一DNA聚合酶的第一反应混合物接触；(b)使来自步骤(a)的引发的模板核酸与包含第二DNA聚合酶和所述测试核苷酸的第二反应混合物接触，其中所述第二DNA聚合酶包含不存在于所述第一DNA聚合酶中的标记；(c)分别在步骤(a)和(b)期间的一个或多个时刻通过检测存在于包含引发的模板核酸的复合物中的标记来测量引发的模板核酸与所述第二DNA聚合酶的结合，但所述测试核苷酸并未以化学方式掺入所述引物中；和(d)使用来自步骤(c)的所测量结合结果来确定所述测试核苷酸是否是下一正确核苷酸。根据一个一般优选的实施方案，所述第一和第二DNA聚合酶的氨基酸序列可相同。根据一个不同的一般优选的实施方案，步骤(a)和(b)中的每一者均在缓冲液条件下发生，所述缓冲液条件使三元复合物的形成稳定化，并且使二元复合物的形成不稳定。优选地，步骤(a)和(b)中的每一者均在高盐缓冲液条件下发生。更优选地，所述第一DNA聚合酶不包含外源可检测标记。根据一个不同的一般优选的实施方案，所述方法进一步包括重复步骤(a)-(c)中的每一者三次，每次使用不同的测试核苷酸。优选地，所述第二DNA聚合酶的标记为荧光标记。更优选地，步骤(c)不包括测量来自构象敏感染料的荧光信号，所述构象敏感染料由于所述第二DNA聚合酶结合至同源核苷酸而改变光学特性。根据一个不同的一般优选的实施方案，所述方法进一步包括去除所述测试核苷酸和结合至引发的模板核酸的任何聚合酶。优选地，存在进一步步骤，即使引发的模板核酸与包含第三DNA聚合酶和可逆终止子核苷酸的第三反应混合物接触，和接着使用所述第三DNA聚合酶将所述可逆终止子核苷酸掺入所述引物中以产生可逆终止的引物。更优选地，所述方法进一步包括使用引发的模板核酸重复步骤(a)-(d)，所述引发的模板核酸包含步骤(a)-(c)中的每一者中的可逆终止的引物。
另一方面，本公开涉及一种在引发的模板核酸分子中在引物紧邻下游的模板链中掺入具有与下一碱基互补的碱基的核苷酸的方法。所述方法包括以下步骤：(a)使引发的模板核酸分子与包含DNA聚合酶的第一反应混合物接触；(b)使来自步骤(a)的引发的模板核酸分子与包含所述DNA聚合酶和第一测试核苷酸的第二反应混合物接触，但所述第一测试核苷酸并未掺入所述引物中；(c)在步骤(a)和(b)中的每一者期间的一个或多个时刻测量引发的模板核酸分子与所述DNA聚合酶的结合，但所述第一测试核苷酸并未以化学方式掺入所述引物中，以确定步骤(b)中是否形成三元复合物；和(d)选择以下两个选项之一：(i)如果在步骤(c)中确定在步骤(b)中并未形成三元复合物，那么使来自步骤(b)的引发的模板核酸分子与包含与第一测试核苷酸和第二测试核苷酸组合的DNA聚合酶的第三反应混合物接触，所述第二测试核苷酸不同于所述第一测试核苷酸；和(ii)如果在步骤(c)中确定在步骤(b)中形成三元复合物，那么使来自步骤(b)的引发的模板核酸分子与第四反应混合物接触并且执行掺入反应以将所述核苷酸掺入所述引物中，而未首先使来自步骤(b)的引发的模板核酸分子与第三反应混合物接触。根据一个一般优选的实施方案，所述引发的模板核酸分子固定至固体支撑物。优选地，所述第四反应混合物包含不同于所述第一和第二反应混合物的聚合酶的聚合酶。或者，所述第四反应混合物包含不同于所述第一和第二反应混合物的聚合酶的聚合酶，并且在步骤(d)(ii)中掺入引物中的核苷酸包含可逆终止子部分。根据一个不同的一般优选的实施方案，所述引发的模板核酸分子固定至固体支撑物，并且接触步骤(a)和(b)各自包括使反应混合物流经固定至固体支撑物的引发的模板核酸分子。根据一个不同的一般优选的实施方案，所述引发的模板核酸分子固定至固体支撑物，并且接触步骤(a)和(b)各自包括从含有所述第一反应混合物的容器移动所述固体支撑物至含有所述第二反应混合物的容器。根据一个不同的一般优选的实施方案，所述第一和第二反应混合物各自包含相同浓度的所述聚合酶。根据一个不同的一般优选的实施方案，所述第四反应混合物包含不同于所述第一和第二反应混合物的聚合酶的聚合酶。根据一个不同的一般优选的实施方案，步骤(c)包括通过干涉术或表面等离子体共振传感中的任一者测量。根据一个不同的一般优选的实施方案，所述第一测试核苷酸为原生核苷酸。根据一个不同的一般优选的实施方案，所述第一测试核苷酸包含可逆终止子部分。根据一个不同的一般优选的实施方案，在步骤(d)(ii)中掺入的核苷酸是原生核苷酸和包含可逆终止子的核苷酸中的任一者。
附图简述
图1提供一系列条线图，所述条线图指示随所询问的dNTP身份(水平轴)而变的所测量的结合信号(垂直轴)。所述图图解说明针对三元复合物形成所测量的信号(即，指示同源核苷酸的存在)的下倾趋势，而针对二元复合物形成所测量的信号(即，指示非同源核苷酸的存在)保持稳定。空心条线指示与正确阳性识别相关的信号，而斑点条线指示与正确阴性识别相关的信号。粗对角线填充物指示假阳性碱基识别(T)，并且细对角线填充物指示假阴性碱基识别(C缺失)。
图2A和2B是图形迹线，其说明随时间(水平轴)而变的结合活性(垂直轴)。图2A中所示的分区指示针对各完整循环的四个部分：结合、掺入、猝灭和再生。图2B示出针对各完整循环的五个部分，其中额外第一(即，初始)部分是归因于双相结合程序，所述程序涉及与聚合酶和第一(低)浓度的核苷酸接触。在循环数2、4、8、10、12、16和20处示出的空心箭头指示正确碱基识别；而在循环6、14和18处示出的实心填充箭头指示不正确碱基识别。在所述图形迹线两者中，“循环数”鉴别了用于使引发的模板核酸与所指示的核苷酸接触的独立步骤。
图3A和3B提供条线图，所述条线图图解说明在边结合边测序程序中随所询问的dNTP身份(水平轴)而变的所测量的结合信号(垂直轴)。图3A示出使用标准边结合边测序程序获得的结果，所述标准边结合边测序程序仅使用单相检查步骤。较高信号指示三元复合物形成，而较低信号与二元复合物形成相关。图3B示出使用用于使引发的模板核酸与聚合酶和核苷酸在两相中结合的双相方案获得的结果。空心条线指示与正确阳性识别相关的信号，而斑点条线指示与正确阴性识别相关的信号。图3A中的箭头指示了一个假阳性识别(粗对角线填充物)和一个假阴性识别(细对角线填充物)。
图4是图形迹线，其说明随进展参数(水平轴)而变的所测量的结合信号(垂直轴)。12个进展时间间隔的持续时间(以秒测量)在所述图上方示出。第一和第二进展时间间隔分别表示引物/模板装载和洗涤步骤。第三进展时间间隔对应于所述双相方案的第一相(即，引发的模板核酸与聚合酶在所添加的核苷酸不存在下相互作用)。时间间隔4-7各自持续20秒，对应于所述双相方案的第二相(即，引发的模板核酸与聚合酶在所添加的核苷酸存在下相互作用)。在进展时间间隔4-7期间存在的核苷酸分别为：dTTP；dTTP和dATP；dTTP、dATP和dCTP；和dTTP、dATP、dCTP和dGTP。欲用于所述组合中的第三核苷酸促进三元复合物形成，并且对应于同源核苷酸(dCTP)。进展时间间隔8是EDTA洗涤步骤。进展时间间隔9-10分别是先于掺入的再生洗涤，和掺入步骤。进展时间间隔11-12是EDTA洗涤和先于后续检查的再生洗涤。
详述
公开一种用于检测三元复合物的技术，所述三元复合物包含引发的模板核酸分子、聚合酶和在引物紧邻下游并且与引发的模板核酸的模板链互补的下一正确核苷酸。已经实现了清楚并且明确的检测，即使在所述聚合酶与引发的模板核酸之间的相互作用促进形成核苷酸独立二元复合物。所述方法是从本文所公开的观察结果得出的，即可制得非特异性二元复合物以便即使在核苷酸不存在下也在引发的模板核酸上饱和。相比之下，核苷酸特异性三元复合物形成展现了剂量依赖性结合并且除了参与二元复合物形成的那些聚合酶分子以外还募集聚合酶分子。虽然不希望受任何特定操作理论束缚，但核苷酸特异性三元复合物和非特异性二元复合物的形成可涉及所述聚合酶与引发的模板核酸分子之间的不同相互作用。在边结合边测序技术中，仅导致三元复合物形成的特异性相互作用可关于下一正确核苷酸提供信息。
用于增强三元复合物形成的检测的技术涉及比较在结合条件下聚合酶与引发的模板核酸的相互作用，所述结合条件的不同之处在于经历测试的候选核苷酸的存在或量。例如，测试核苷酸(例如，原生dATP、dGTP、dCTP或dTTP；或核苷酸类似物)可在两种不同浓度下存在，而聚合酶浓度维持大体上恒定。所述两种测试核苷酸浓度彼此(即，在两种条件下包括的测试核苷酸)相比可相对较低和较高。或者，所述两种不同结合条件可涉及测试核苷酸的存在和不存在(即，零浓度)，而聚合酶浓度在所有情况下维持大体上恒定。
有利的是，所述技术可使用两种类型的核苷酸来实施，包括原生(例如，未标记)核苷酸、具有可检测标记(例如，荧光或其它光学可检测标记)的核苷酸或经过标记或未标记的核苷酸类似物(例如，含有可逆终止子部分的经过修饰的核苷酸)。此外，所述技术提供控制反应条件、明确序列测定、长读段长、低总体试剂成本和低仪器成本。
所公开的技术可应用于通过任何方式和出于任何原因用于测定引发的模板核酸的下一碱基的身份的结合反应。所述技术可用于监测DNA聚合酶和与引发的模板核酸互补的下一正确核苷酸(例如，dNTP)的特异性结合，并且用于区别特异性结合和非特异性结合。所述技术可应用于单一核苷酸测定(例如，SNP测定)，或替代地应用于更广泛核酸测序程序，所述程序使用一次鉴别一种核苷酸的重复循环。例如，本文所提供的方法可连同边结合边测序程序使用，如由编号14/805,381鉴别的共同拥有的美国专利申请(作为美国专利申请公布号US 2017/0022553 A1公布)所述，其公开内容以引用的方式整体并入本文中。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有如本领域技术人员通常所理解的相同意义。为清晰起见，以下特定术语具有规定意义。其它术语在本文中的其它部分中定义。
除非本文另外清楚地指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括多个提及物。如本说明书和权利要求书中所用的近似语言可应用于修饰任何定量表示，所述定量表示可能获准变化，而不导致与其相关的基本功能的改变。相应地，由如“约”等术语修饰的值不欲限于所规定的精确值。除非另外指示，否则用于本说明书和权利要求书中的所有表示成分的量、如分子量等特性、反应条件等等的数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。相应地，除非相反指示，否则陈述于以下说明书和随附权利要求书中的数值参数是近似值，所述近似值可视尝试通过本公开的组合物、装置或方法获得的所需特性而变化。至少，各数值参数应至少根据所报告的有效数的数字并且通过应用普通舍入技术来解释。
如本文所用，“边结合边测序”是指一种测序技术，其中聚合酶和同源核苷酸与引发的模板核酸分子的特异性结合(例如，阻断引发的模板核酸分子)用于鉴别欲掺入引发的模板核酸分子的引物链中的下一正确核苷酸。所述特异性结合相互作用无需导致所述核苷酸以化学方式掺入引物中。在一些实施方案中，所述特异性结合相互作用可先于将所述核苷酸以化学方式掺入引物链中，或可先于将类似、下一正确核苷酸以化学方式掺入引物中。因此，下一正确核苷酸的检测可在未掺入下一正确核苷酸的情况下发生。
如本文所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或用于本文中的语法相等物意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。因此，“核酸”为可在核酸合成期间由聚合酶支配的多核苷酸，如DNA、RNA或其任何组合。术语“核酸”包括单链、双链或多链DNA、RNA和其类似物(衍生物)。双链核酸可有利地最小化可阻碍核酸合成的二级结构。双链核酸可具有缺口或单链间隙。
如本文所用，“模板核酸”是欲使用本文所公开的方法或装置检测、测序、评估或以其它方式分析的核酸。
如本文所用，“引发的模板核酸”(或替代地，“引发的模板核酸分子”)是用引物引发(即，杂交)的模板核酸，其中所述引物是寡核苷酸，其3'端具有与所述模板核酸的一部分互补的序列。所述引物可任选地具有游离5'端(例如，所述引物与所述模板非共价地缔合)，或所述引物可与所述模板相连(例如，经由发夹结构)。引发的模板核酸包括互补引物和与其结合的模板核酸。引发的模板核酸分子可在聚合反应中可延伸，或替代地可具有防止延伸的阻断部分。
如本文所用，“核苷酸”是包括含氮碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)和至少一个磷酸酯基的分子。所述术语涵盖核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经过修饰以包含外源标记或可逆终止子的核苷酸和核苷酸类似物。
如本文所用，“原生”核苷酸是指天然存在的核苷酸，其不包含外源标记(例如，荧光染料或其它标记)或化学修饰(如可表征核苷酸类似物)。适用于进行本文所述的边结合边测序程序的原生核苷酸的实例包括：dATP(2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸酯)；dGTP(2'-脱氧鸟苷-5'-三磷酸酯)；dCTP(2'-脱氧胞嘧啶核苷-5'-三磷酸酯)；dTTP(2'-脱氧胸苷-5'-三磷酸酯)；和dUTP(2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸酯)
如本文所用，“核苷酸类似物”具有一种或多种修饰，如化学部分，所述修饰替代、去除和/或修饰原生核苷酸的组分中的任一者(例如，含氮碱基、五碳糖或磷酸酯基)。核苷酸类似物可在核酸聚合反应中通过聚合酶掺入或不可掺入。任选地，核苷酸类似物的3'-OH基团用部分修饰。所述部分可为聚合酶延伸的3'可逆或不可逆终止子。核苷酸的碱基可为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶或其类似物中的任一者。任选地，核苷酸具有肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、硝基吡咯(包括3-硝基吡咯)或硝基吲哚(包括5-硝基吲哚)碱基。核苷酸可包括但不限于ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dUTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP和dGMP。核苷酸也可含有DNA聚合酶的终止抑制剂双脱氧核苷酸或2',3'双脱氧核苷酸，其被缩写为ddNTP(ddGTP、ddATP、ddTTP、ddUTP和ddCTP)。
如本文所用，“下一正确核苷酸”(有时称作“同源”核苷酸)是具有与下一模板核苷酸的碱基互补的碱基的核苷酸。下一正确核苷酸将在引物的3'端杂交以补充下一模板核苷酸。下一正确核苷酸可但无需必定能够掺入引物的3'端。例如，下一正确核苷酸可为将完成掺入反应的三元复合物的成员，或替代地，下一正确核苷酸可为不催化掺入反应的稳定化三元复合物的成员。具有不与下一模板碱基互补的碱基的核苷酸被称作“不正确”(或“非同源”)核苷酸。
如本文所用，“阻断部分”当关于核苷酸类似物使用时是核苷酸的一部分，其抑制或防止所述核苷酸在核苷酸聚合反应的掺入步骤期间与第二核苷酸形成共价连接(例如，经由引物核苷酸的3'-OH)。“可逆终止子”核苷酸的阻断部分可从核苷酸类似物去除以允许核苷酸掺入。所述阻断部分在本文中被称作“可逆终止子部分”。示例性可逆终止子部分陈述于美国专利号7,427,673；7,414,116；和7,057,026和PCT公布WO 91/06678和WO 07/123744中，其中每一者均以引用的方式并入。
如本文所用，“测试核苷酸”是正在被研究参与形成三元复合物的能力的核苷酸，所述三元复合物进一步包括引发的模板核酸(或被阻断的引发的模板核酸)和聚合酶。
如本文所用，“聚合酶”是与同源核苷酸和引发的模板核酸(或被阻断的引发的模板核酸)形成三元复合物的蛋白质或其它分子的通称，包括但不限于DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶、引物酶和转移酶。典型地，所述聚合酶包括可发生核苷酸结合的一个或多个活性位点。任选地，聚合酶包括可发生核苷酸聚合的催化的一个或多个活性位点。任选地，聚合酶缺乏催化核苷酸聚合功能，例如归因于如突变或化学修饰等修饰。或者，所述聚合酶可催化核苷酸聚合至引物的3'端，所述引物结合至其互补核酸链。例如，聚合酶催化下一正确核苷酸经由磷酸二酯键添加至引物的3'-OH基团，由此将所述核苷酸以化学方式掺入所述引物中。任选地，用于所提供的方法中的聚合酶是持续型聚合酶。任选地，用于所提供的方法中的聚合酶是分配型聚合酶。
如本文所用，“双相”是指两阶段过程，其中使引发的模板核酸与聚合酶和测试核苷酸接触。所述过程的第一相涉及使引发的模板核酸与聚合酶在亚饱和水平的核苷酸存在下，或甚至在核苷酸不存在下接触。术语“亚饱和”当关于结合至受体(例如，结合至聚合酶的核苷酸)的配体使用时是指所述配体的浓度低于导致至少90％的所述受体在平衡状态下结合至所述配体所需的浓度。例如，亚饱和量的核苷酸可引起至少90％、95％、99％或更多的聚合酶结合至所述核苷酸。所述过程的第二相涉及使来自第一相的引发的模板核酸与聚合酶在高于第一相中所用的浓度的核苷酸存在下接触，其中所述较高浓度足以在所述反应中的核苷酸为下一正确核苷酸时引起最大三元复合物形成。
如本文所用，“提供”模板、引物或引发的模板核酸是指制备和递送一种或多种核酸聚合物，例如至反应混合物或反应室。
如本文所用，“监测”(或有时“测量”)当关于分子结合事件使用时是指检测两种分子种类之间的可测量相互作用或结合的过程。例如，监测可涉及检测聚合酶与引发的模板核酸(或被阻断的引发的模板核酸)之间的可测量相互作用，典型地在程序中的多个时刻。监测可为间歇的(例如，周期的)或连续的(例如，无中断)，并且可涉及定量结果的采集。监测可通过在结合事件期间的一段时期内检测多个信号或替代地，通过在结合事件期间或之后的单一时间点检测信号来进行。
如本文所用，“接触”是指试剂混合在一起(例如，混合固定的模板核酸与包含聚合酶的缓冲溶液，或聚合酶和测试核苷酸的组合)，使得可发生物理结合反应或化学反应。
如本文所用，“掺入”或“以化学方式掺入”当关于核酸和核苷酸使用时是指通过形成磷酸二酯键使同源核苷酸接合至核酸引物的过程。
如本文所用，“二元复合物”是聚合酶与引发的模板核酸(或被阻断的引发的模板核酸)之间的复合物，其中所述复合物不包含核苷酸分子，如下一正确核苷酸。
如本文所用，“三元复合物”是聚合酶、引发的模板核酸(或被阻断的引发的模板核酸)与直接定位于引物下游并且与所述引发的模板核酸或被阻断的引发的模板核酸的模板链互补的下一正确核苷酸之间的复合物。所述引发的模板核酸可包含例如具有游离3'-OH的引物或被阻断的引物(例如，在3'端核苷酸的碱基或糖部分上具有化学修饰的引物，其中所述修饰排除酶促磷酸二酯键形成)。
如本文所用，“催化金属离子”是指通过聚合酶促进核酸(例如，引物)的3'-OH与引入的核苷酸的磷酸酯基之间的磷酸二酯键形成的金属离子。“二价催化金属阳离子”是具有二价的催化金属离子。催化金属离子可以稳定化聚合酶、核苷酸与引发的模板核酸之间的复合物形成所必需的浓度存在，称作非催化浓度的金属离子。催化浓度的金属离子是指金属离子的量足以使聚合酶催化核酸(例如，引物)的3'-OH基团与引入的核苷酸的磷酸酯基之间的反应。
如本文所用，“非催化金属离子”是指当在聚合酶存在下不促进将核苷酸以化学方式掺入引物中所需的磷酸二酯键形成的金属离子。典型地，非催化金属离子是阳离子。非催化金属离子可抑制通过聚合酶形成磷酸二酯键，并且因此可通过防止核苷酸掺入而稳定化三元复合物。非催化金属离子可与聚合酶相互作用，例如经由与催化金属离子相比竞争性结合。“二价非催化金属离子”是具有二价的非催化金属离子。二价非催化金属离子的实例包括但不限于Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+和Sr2+。三价Eu3+和Tb3+离子是具有三价的非催化金属离子。
如本文所用，“外源标记”是指测序试剂的可检测化学部分，其不存在于所述测序试剂的天然类似物中，如存在于合成核苷酸类似物或合成聚合酶类似物(例如，DNA聚合酶)上的非天然存在的标记。虽然原生dNTP可具有特征性限制荧光概况，但所述原生dNTP不包含任何所添加的比色或荧光部分。相反，经过修饰以包含附接至γ磷酸酯的化学连接体和荧光部分的dATP(2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸酯)分子据说将包含外源标记，因为所附接的化学组分通常并非所述核苷酸的一部分。当然，添加可检测标记至核苷酸碱基中的化学修饰也将被视为外源标记。同样，经过修饰以包含荧光染料(例如，通过附接至作为所述酶的一级序列的一部分的半胱氨酸残基)的DNA聚合酶据说也将包含外源标记，因为所述标记通常并非所述聚合酶的一部分。
如本文所用，“未标记”是指不含所添加的或外源标记或标签的分子种类。当然，未标记的核苷酸将不包含外源荧光标记，或外源拉曼散射标签。原生核苷酸是未标记的分子种类的另一实例。未标记的分子种类可排除本文所陈述或以其它方式在核酸测序或分析生物化学相关领域中已知的标记中的一种或多种。
边结合边测序
本文描述了基于聚合酶的核酸边结合边测序(SBB)反应，其中所述聚合酶在所述反应的个别步骤期间经历开放与闭合构象之间的构象转变。在一个步骤中，所述聚合酶结合至引发的模板核酸以形成二元复合物，所述二元复合物在本文中还称作插入前构象。在一个后续步骤中，引入的核苷酸进行结合并且聚合酶指闭合，从而形成包括聚合酶、引发的模板核酸和核苷酸的化学前构象；其中所述结合的核苷酸尚未掺入。这一步骤在本文中还称作“检查”步骤，可后接化学步骤，其中形成磷酸二酯键并伴随所述核苷酸的焦磷酸盐裂解(即，核苷酸掺入)。所述聚合酶、引发的模板核酸和新近掺入的核苷酸产生化学后、翻译前构象。由于化学前构象和易位前构象两者均包括聚合酶、引发的模板核酸和核苷酸，其中所述聚合酶处于闭合状态，所以任一构象均可在本文中称作闭合复合物或闭合三元复合物。在闭合插入前状态中，如Mg2+等二价催化金属离子介导快速化学反应，所述快速化学反应涉及通过引物的3'羟基对焦磷酸盐(PPi)进行亲核替代。所述聚合酶在PPi释放(易位后步骤)时恢复开放状态，并且易位开始下一轮反应。虽然闭合复合物可在二价催化金属离子(例如，Mg2+)不存在下形成，但所述闭合复合物的聚合酶精于在所述二价金属离子存在下化学添加核苷酸。低或缺乏水平的催化金属离子(如Mg2+)导致闭合复合物中的下一正确核苷酸的非共价(例如，物理)封存。这种闭合复合物可称作稳定化或被俘获的闭合复合物。在上文所述的任何反应步骤中，可在检查步骤期间监测聚合酶构象和/或与核酸的相互作用以鉴别模板核酸序列中的下一正确碱基。在掺入之前或之后，反应条件可改变以使所述聚合酶从所述引发的模板核酸脱离，并且再次改变以从局部环境去除抑制聚合酶结合的任何试剂。
一般来说，SBB程序包括鉴别下一模板碱基的“检查”步骤，和任选地“掺入”步骤，所述步骤添加一种或多种互补核苷酸至所述引发的模板核酸的引物组分的3'端。欲添加的下一正确核苷酸的身份在那一核苷酸并未通过共价键化学连接至引物的3'端的情况下，或在那一核苷酸通过共价键化学连接至引物的3'端之前进行测定。所述检查步骤可涉及提供欲用于所述程序的引发的模板核酸，和使所述引发的模板核酸与聚合酶(例如，DNA聚合酶)和一种或多种正在作为可能的下一正确核苷酸进行研究的测试核苷酸接触。此外，存在如下步骤，其涉及监测或测量在所述测试核苷酸存在下所述聚合酶与所述引发的模板核酸之间的相互作用。任选地，所述相互作用可在稳定剂存在下发生，由此所述聚合酶-核酸相互作用在下一正确核苷酸存在下稳定化。又，所述检查步骤鉴别或测定下一正确核苷酸的身份，而无需掺入那一核苷酸。换句话说，当使用经过标记或未标记的核苷酸进行一个或多个检查循环时，下一正确核苷酸的身份可在未将所述核苷酸以化学方式掺入引物中的情况下加以确定。
虽然可为了方便起见而描述涉及单一模板核酸分子的方法，但这些方法仅仅是示例性的。本文所提供的测序方法容易涵盖多种模板核酸，其中所述多种核酸可为单一核酸的克隆扩增的拷贝，或不同核酸，包括组合，如经过克隆扩增的不同核酸的群体。因此，所述测序方法在本文中充分公开。
检查步骤
根据本文所述的技术的检查方法典型地包括以下子步骤：(1)提供引发的模板核酸(即，与引物杂交的模板核酸分子)；(2)使引发的模板核酸与反应混合物接触，所述反应混合物提供关于聚合酶的两种不同条件(“第一”和“第二”条件)和至少一种测试核苷酸的浓度；(3)监测在所述核苷酸存在下并且任何核苷酸均未以化学方式掺入所述引发的模板核酸中的情况下，所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用；和(4)使用所监测的相互作用鉴别模板核酸中的下一碱基(即，下一正确核苷酸)。所述引发的模板核酸的引物可为可延伸引物。当所述测试核苷酸的碱基与所述引发的模板核酸分子的下一碱基互补时，所述引发的模板核酸、所述聚合酶和所述测试核苷酸能够形成三元复合物。在上文所提及的接触步骤中的第二种条件下，聚合酶和测试核苷酸均存在，其中如果所述测试核苷酸是下一正确核苷酸，那么所述测试核苷酸的浓度足以形成三元复合物。在上文所提及的接触步骤中的第一种条件下，聚合酶典型地以与所述第二种条件大体上相同的浓度存在，但所述测试核苷酸不存在或以比用于所述第二种条件中的浓度低30％、更优选地20％或更优选地10％或更低的浓度存在。当所述测试核苷酸的碱基与所述引发的模板核酸分子的下一碱基不互补时，所述引发的模板核酸和所述聚合酶能够形成二元复合物。任选地，所述接触在相比二元复合物的形成有利于三元复合物的形成的条件下发生。所述鉴别步骤可包括鉴别所述核苷酸中与所述引发的模板核酸的下一碱基互补的碱基。
所有这些步骤均可重复一次或多次以获得广泛序列信息。例如，所述接触和监测步骤可重复一次或多次。任选地，所述接触和监测步骤使用包含所述聚合酶和第一测试核苷酸的反应混合物来重复。任选地，所述接触和监测步骤使用包含所述聚合酶和第二核苷酸的反应混合物来重复。任选地，所述接触和监测步骤使用包含所述聚合酶和第三核苷酸的反应混合物来重复。任选地，所述接触和监测步骤使用包含所述聚合酶和第四核苷酸的反应混合物来重复。应理解，涉及所述聚合酶和测试核苷酸的各接触步骤以涉及所述聚合酶和在较低浓度下(例如，低10倍或更多倍)的相同测试核苷酸或在所述核苷酸不存在下的接触步骤为先导。因此，在前面的接触步骤可涉及在所述测试核苷酸不存在下与所述聚合酶接触。
在本文所提供的测序方法中，包含所述DNA聚合酶和至少一种测试核苷酸的反应混合物可包含1、2、3或4种类型的核苷酸分子(例如，经过标记或未标记的核苷酸)。任选地，所述核苷酸是选自dATP、dTTP、dCTP和dGTP的原生核苷酸。任选地，所述反应混合物包含一种或多种三磷酸酯核苷酸和一种或多种二磷酸酯核苷酸。任选地，在所述引发的模板核酸、所述聚合酶与在所述反应混合物中包含的四种核苷酸分子之一之间形成闭合复合物。
在所提供的方法的一个特定实例中，所述引发的模板核酸最初与包含聚合酶而无添加的测试核苷酸的反应混合物接触。其后，所述引发的模板核酸与包含聚合酶和第一测试核苷酸的反应混合物接触；接着与包含聚合酶和第一测试核苷酸和第二测试核苷酸的组合的反应混合物接触；接着与包含聚合酶和第一测试核苷酸、第二测试核苷酸和第三测试核苷酸的组合的反应混合物接触；并且接着与包含聚合酶和第一测试核苷酸、第二测试核苷酸、第三测试核苷酸和第四测试核苷酸的组合的反应混合物接触。监测可连续地，或在各反应混合物改变之后发生。
所述检查步骤可受控制，使得核苷酸掺入被减弱或得以实现。如果在所述检查步骤期间核苷酸掺入被减弱，那么可在测定下一正确核苷酸的身份之后执行独立掺入步骤。所述独立掺入步骤可无需监测而实现，因为所述碱基已经在所述检查步骤期间被鉴别。如果核苷酸掺入在检查期间继续进行，那么后续核苷酸掺入可通过使用稳定剂而减弱，所述稳定剂在掺入之后在所述核酸上俘获所述聚合酶。可逆终止的核苷酸(即，包含可逆终止子部分的核苷酸)也可用于防止后续核苷酸的添加。所述SBB方法允许模板核酸碱基的控制测定，而无需使用经过标记的核苷酸，因为所述聚合酶与模板核酸之间的相互作用可在所述核苷酸上无标记的情况下进行监测。然而，应清楚当执行目前公开的程序来允许所结合的核苷酸的荧光检测时，经过标记的核苷酸(例如，荧光核苷酸)的使用是任选的。
在本文所提供的测序方法中，所述测试核苷酸(例如，至少一种测试核苷酸)包含3'羟基，其可为例如游离3'羟基。任选地，测试核苷酸分子的3'羟基经过修饰以包含3'阻断部分。所述3'终止子部分可为可逆终止子或可为不可逆终止子。任选地，所述至少一种核苷酸分子的可逆终止子在使用包含所述可逆终止子的测试核苷酸的检查步骤之后的某一时刻被替代或去除。
接触步骤
所公开的方法使用两个步骤使所述引发的模板核酸与DNA聚合酶和一种或多种测试核苷酸接触。第一个步骤(在本文中有时称作“第一相”或“第1相”)涉及使所述引发的模板核酸与所述聚合酶在添加的核苷酸不存在下接触，或与所述聚合酶和一定量或浓度的核苷酸接触，所述量或浓度低于当所述核苷酸是下一正确核苷酸时实现三元闭合复合物的最大形成所需的量或浓度。例如，测试核苷酸可以比用于第二相中的浓度低30％、更优选地20％或更优选地10％或更低的浓度使用。第二个步骤(在本文中有时称作“第二相”或“第2相”)涉及使所述引发的模板核酸与所述聚合酶接触，所述聚合酶与当所述测试核苷酸是下一正确核苷酸时足以产生最大三元闭合复合物形成的量或浓度的核苷酸组合。这一“饱和”水平的核苷酸可容易仅使用合理测试来测定。作为指导，用于第一相中的聚合酶的浓度在第一相中可以是≥400nM，并且在第二相中可以是≤400nM。作为进一步指导，第一相中的dNTP的浓度可以是0-10μM，并且在第二相中可以是20-400μM。虽然所述程序的第一和第二相可使用单一浓度的聚合酶，但当聚合酶浓度不同，使得较高浓度用于第一相中时，也已经实现良好结果。优选地，聚合酶浓度在两个不同接触步骤中大体上相同，使得所述测试核苷酸的浓度孤立作为所述程序中的变量。因此，一般来说，在第二接触步骤期间所述测试核苷酸的浓度将高于可用于初始(即，第一)接触步骤中的测试核苷酸的浓度。任选地，所述测试核苷酸可完全地从用于最初接触引发的模板核酸的溶液中被遗漏。在这种情况下，所述测试核苷酸的第一浓度将为0μM。任选地，初始(即，第一)接触步骤中的测试核苷酸的浓度较低，以致无法通过常规方式检测。
使所述引发的模板核酸分子与包含所述聚合酶和一种或多种测试核苷酸分子的反应混合物接触可在稳定化三元复合物的形成和/或使二元复合网的形成不稳定的条件下发生。任选地，所述反应混合物包含谷氨酸钾。任选地，稳定化三元复合物的形成的条件包括使所述引发的模板核酸与稳定剂接触。任选地，所述反应混合物包含稳定剂。所述稳定剂可为一种或多种非催化金属离子。示例性非催化金属离子包括锶离子、锡离子、镍离子和铕离子。例如，所述检查步骤中包含所述引发的模板核酸、所述聚合酶和所述测试核苷酸的反应混合物也可包含作为稳定剂的0.01mM至30mM氯化锶。
在某些实施方案中，所述引发的模板核酸固定至固体支撑物的表面。所述固定可使用在所述引发的模板核酸的一条或另一条或甚至两条链与所述固体支撑物之间的共价或非共价键。例如，当所述引发的模板核酸的模板和引物链为不同分子时，模板链可例如经由其5'端固定。然而，必需的是，所述引物的3'端可用于与所述聚合酶相互作用。
当所述引发的模板核酸固定至固体支撑物时，存在关于如何执行所述接触步骤的替代方案。例如，所述固体支撑物可在含有不同试剂溶液的不同容器(例如，多孔板的个别孔)之间以物理方式进行转移。这便利地使用自动化或机器人仪器来实现。在另一实例中，所述引发的模板核酸固定至流动池或室内部的固体支撑物。在这种情况下，不同接触步骤可通过不同液体试剂通过所述室或经过固定的引发的模板核酸的控制流动来执行。
监测步骤
监测或测量在核苷酸分子存在下所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用可以多种不同方式实现。例如，监测可包括测量关于所述引发的模板核酸、所述聚合酶与核苷酸之间的相互作用的缔合动力学。监测在核苷酸分子存在下所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用可包括测量所述聚合酶与引发的模板核酸分子之间的平衡结合常数(即，在核苷酸存在下聚合酶与所述模板核酸的平衡结合常数)。因此，例如，所述监测包括测量在核苷酸存在下所述聚合酶与所述引发的模板核酸的平衡结合常数。监测在核苷酸分子存在下所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用包括测量在所述四种核苷酸中的任一者存在下所述聚合酶从所述引发的模板核酸解离的动力学。任选地，监测在核苷酸分子存在下所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用包括测量闭合复合物的解离(即，所述引发的模板核酸、所述聚合酶和所述核苷酸的解离)的动力学。任选地，所测量的缔合动力学视所述核苷酸分子的身份而不同。任选地，所述聚合酶对各类型的所用核苷酸具有不同亲和力。任选地，所述聚合酶对各类型的闭合复合物中的各类型的核苷酸具有不同解离常数。缔合、平衡和解离动力学是已知的并且可容易由本领域技术人员测定。参见例如Markiewicz等人,Nucleic Acids Research 40(16):7975-84(2012)；Xia等人,J.Am.Chem.Soc.135(1):193-202(2013)；Brown等人,J.Nucleic Acids,文章ID871939,11页(2010)；Washington,等人,Mol.Cell.Biol.24(2):936-43(2004)；Walsh和Beuning,J.Nucleic Acids,文章ID 530963,17页(2012)；和Roettger等人,Biochemistry47(37):9718-9727(2008)，其以引用的方式整体掺入本文中。
所述监测步骤可包括监测在第一核苷酸存在下所述聚合酶与所述引发的模板核酸的稳态相互作用，但所述第一核苷酸并未以化学方式掺入所述引发的模板核酸的引物中。任选地，监测包括监测在第一核苷酸存在下所述聚合酶从所述引发的模板核酸的解离，但所述第一核苷酸并未以化学方式掺入所述引发的模板核酸的引物中。任选地，监测包括监测在第一核苷酸存在下所述聚合酶与所述引发的模板核酸的缔合，但所述第一核苷酸并未以化学方式掺入所述引发的模板核酸的引物中。又，这些程序中的测试核苷酸可以是原生核苷酸(即，未标记)、经过标记的核苷酸(例如，荧光标记的核苷酸)或核苷酸类似物(例如，经过修饰以包含可逆或不可逆终止子部分的核苷酸)。
在本文所提供的测序方法中，反应混合物中催化金属离子的不存在或所述聚合酶的活性位点中催化金属离子的不存在防止所述核苷酸以化学方式掺入所述引发的模板核酸的引物中。任选地，所述接触步骤的反应混合物中催化金属离子的螯合作用防止所述核苷酸以化学方式掺入所述引发的模板核酸的引物中。任选地，非催化金属离子在下一正确核苷酸存在下充当用于三元闭合复合物的稳定剂。任选地，用非催化金属离子取代所述接触步骤的反应混合物中的催化金属离子防止所述核苷酸分子以化学方式掺入所述引发的模板核酸中。任选地，所述催化金属离子是镁。聚合酶的金属离子机制要求可需要低浓度的金属离子来稳定化聚合酶-核苷酸-DNA结合相互作用。参见例如部分27.2.2,Berg JM,Tymoczko JL,Stryer L,Biochemistry第5版,WH Freeman Press,2002。
任选地，所述检查步骤的反应混合物中的低浓度的催化离子(即，用于在测试核苷酸存在或不存在下结合聚合酶)防止所述测试核苷酸以化学方式掺入所述引发的模板核酸的引物中。任选地，所述催化离子(例如，镁离子)的低浓度为约1μM至约100μM。任选地，低浓度为约0.5μM至约5μM。任选地，所述检查步骤的反应混合物包含钴，并且所述掺入步骤包括与掺入反应混合物接触，如与所述检查步骤的反应混合物中的钴浓度相比，所述掺入反应混合物含有较高浓度的钴。
所述检查步骤可部分地如下加以控制：提供反应条件来防止核苷酸的以化学方式掺入，同时允许监测所述聚合酶与所述引发的模板核酸之间的相互作用，由此允许确定核酸模板链的下一碱基的身份。所述反应条件可称作“检查反应条件”。任选地，在检查条件下形成三元复合物或闭合复合物。任选地，在检查条件下或以化学前构象形成稳定化三元复合物或闭合复合物。任选地，稳定化闭合复合物是呈易位前构象，其中封入的核苷酸已经掺入，但所述闭合复合物不允许后续核苷酸的掺入。任选地，所述检查条件增强在不同核苷酸存在下聚合酶与引发的模板核酸的亲和力的差异。任选地，所述检查条件引起在不同核苷酸存在下所述聚合酶与所述引发的模板核酸的差异性亲和力。举例说明，引起在不同核苷酸存在下所述聚合酶与所述引发的模板核酸的差异性亲和力的检查条件包括但不限于高盐和包括谷氨酸钾。可用于改变聚合酶对所述引发的模板核酸的亲和力的谷氨酸钾的浓度包括10mM至1.6M谷氨酸钾，或在10mM与1.6M之间的任何量。任选地，高盐是指50mM至1,500mM盐的盐浓度。
检查典型地涉及在所述监测步骤中检测聚合酶与模板核酸的相互作用，或与呈组合形式的模板核酸和核苷酸的相互作用。检测可包括光学、电学、热学、声学、化学和机械方式。任选地，监测是在缓冲液改变或洗涤步骤之后执行的，其中所述洗涤步骤从观察区去除任何未结合的试剂(例如，未结合的聚合酶和/或核苷酸)。任选地，监测是在缓冲液改变或洗涤步骤期间执行的，使得聚合酶-核酸或聚合酶-核酸-核苷酸复合物的解离动力学可用于确定下一碱基的身份。任选地，监测是在添加所述检查反应混合物或第一反应混合物的过程期间执行的，使得所述聚合酶与所述核酸的缔合动力学可用于确定所述核酸上的下一碱基的身份。任选地，监测涉及区别闭合复合物与聚合酶和引发的模板核酸的二元复合物。任选地，监测是在平衡条件下执行的，其中所测量的亲和力是平衡亲和力。包括不同或相似检查试剂的多个检查步骤可依序执行以查明下一模板碱基的身份。多个检查步骤可用于其中多种模板核酸在一个测序反应中同时测序的情形中，其中不同核酸与不同检查试剂不同地反应。任选地，多个检查步骤可提高下一碱基确定的精度。
在一种示例性测序反应中，所述检查步骤包括闭合复合物的形成和/或稳定化，所述闭合复合物包含聚合酶、引发的模板核酸和下一正确核苷酸。监测所述闭合复合物的形成和/或释放的特征以鉴别封入的核苷酸并且因此鉴别模板核酸中的下一碱基。闭合复合物特征可取决于测序反应组分(例如，聚合酶、引物、模板核酸、核苷酸)和/或反应混合物组分和/或条件。任选地，所述闭合复合物是呈化学前构象。任选地，所述闭合复合物是呈易位前构象。任选地，所述闭合复合物是呈易位后构象。
所述检查步骤涉及监测在测试核苷酸存在下聚合酶与引发的模板核酸的相互作用。可监测闭合复合物的形成。任选地，监测闭合复合物的形成的不存在。任选地，监测闭合复合物的解离。任选地，所述掺入步骤涉及监测核苷酸的掺入。任选地，所述掺入步骤涉及监测核苷酸掺入的不存在。
可监测所述检查和/或掺入步骤的任何过程。任选地，聚合酶具有外源标记或“标签”。任选地，所述聚合酶上的可检测标签或标记是可去除的。任选地，所述核苷酸或聚合酶具有可检测标记，然而，所述标记未在测序期间进行检测。任选地，所述测序反应的组分均未用外源标记可检测地标记。
监测在可能或可能不允许核苷酸掺入的条件下在正确和不正确核苷酸存在下聚合酶对模板核酸的亲和力的变化可用于确定所述核酸的序列。在不同核苷酸(包括经过修饰或经过标记的核苷酸)存在下聚合酶对模板核酸的亲和力可作为在所述多种核苷酸存在下聚合酶-核酸相互作用的解离速率来监测。多种标准聚合酶对多种匹配/正确、错误匹配/不正确和经过修饰的核苷酸的亲和力和解离速率是本领域中已知的。Klenow聚合酶的单分子成像揭露了针对模板核酸针对不同核苷酸类型的解离速率是明显地并且可测量地不同的，其中所述核苷酸类型被防止掺入。
任选地，特定类型的核苷酸在引发的模板核酸存在下可用于聚合酶。监测所述反应，其中如果所述核苷酸是下一正确核苷酸，那么所述聚合酶可稳定化以形成闭合复合物。如果所述核苷酸是不正确核苷酸，那么仍可形成闭合复合物；然而，在无稳定剂或反应条件的额外辅助下(例如，催化离子、聚合酶抑制剂、盐的不存在)，所述闭合复合物可解离。解离速率取决于聚合酶、模板核酸和核苷酸的特定组合的亲和力以及反应条件。任选地，所述亲和力作为解离速率加以测量。任选地，所述亲和力在用于所述闭合复合物的不同核苷酸之间是不同的。例如，如果在所述引物的3'端下游的所述模板核酸中的下一碱基是G，那么预期作为解离速率加以测量的聚合酶-核酸亲和力基于是否添加dATP、dCTP、dGTP或dTTP而为不同的。在这种情况下，dCTP将具有最慢解离速率，而其它核苷酸对所述相互作用提供不同解离速率。任选地，所述解离速率可视反应条件，例如稳定剂的存在(例如，镁或抑制化合物的不存在)或反应条件(例如，核苷酸修饰或经过修饰的聚合酶)而不同。一旦下一正确核苷酸的身份被确定，可在特定地靶向闭合复合物的形成的条件下同时将1、2、3、4种或更多种核苷酸类型引入反应混合物中。过量核苷酸可从反应混合物中去除并且可调节反应条件以掺入所述闭合复合物的下一正确核苷酸。这种测序反应确保了每个测序循环仅掺入一种核苷酸。
在核苷酸存在下聚合酶对模板核酸的亲和力可以本领域技术人员已知的多种方法进行测量。任选地，所述亲和力作为解离速率加以测量，其中所述解离速率通过监测当所述反应通过洗涤缓冲液进行洗涤时所述聚合酶从所述模板核酸的释放来测量。任选地，所述亲和力作为解离速率加以测量，其中所述解离速率通过监测在平衡结合条件、尤其其中聚合酶结合速率较低或扩散受限的平衡结合条件下所述聚合酶从所述模板核酸的释放来测量。聚合酶结合速率在聚合酶的充分低浓度下可以是扩散受限的，其中如果所述聚合酶从DNA-聚合酶复合物离开，那么其不会立即装载回来，从而允许足够多的时间来检测所述聚合酶已经从所述复合物释放。关于较高亲和力相互作用，所述聚合酶缓慢地从所述核酸释放，而低亲和力相互作用导致所述聚合酶更快速地释放。在这种情况下，亲和力的范围转变为不同解离速率，其中所述解离速率是在动态洗涤条件下或在平衡状态下测量的。最小解离速率对应于与所添加的核苷酸互补的碱基，而其它解离速率以已知方式视所选择的聚合酶和核苷酸的组合而变化。
任选地，所述解离速率作为将所述聚合酶和核苷酸提供于反应混合物中之后的平衡信号强度加以测量，其中与最低解离速率(最高亲和力)核苷酸的相互作用产生最强信号，而与其它可变解离速率核苷酸的相互作用产生具有可测量地不同强度的信号。作为非限制性实例，优选地在全内反射(TIRF)条件下测量的荧光标记的聚合酶产生不同的所测量荧光强度，所述荧光强度取决于在合适选择的时间窗中结合至表面固定的核酸分子的聚合酶分子的数目。也可使用所述聚合酶的固有荧光，例如色氨酸荧光。高解离速率相互作用产生低测量强度，因为在所选择的时间窗中结合的聚合酶分子的数目极小，其中高解离速率指示大多数聚合酶未与所述核酸结合。可使用任何表面局部测量方案，包括但不限于经过标记或荧光方案。测量平衡条件下的亲和力的合适测量方案包括但不限于结合质量、折射率、表面电荷、介电常数和本领域中已知的其它方案。任选地，缔合速率和解离速率工程改造的组合在所提出的方案中产生较高保真度检测。作为非限制性实例，均一地低缔合速率、碱基依赖性、可变解离速率导致未结合的聚合酶长时期保持未结合，从而允许解离速率和测量强度的变化的增强区分。缔合速率可通过降低所添加的聚合酶、核苷酸或聚合酶和核苷酸两者的浓度来操纵。
任选地，所述聚合酶与所述核酸之间的相互作用经由附接至所述聚合酶的可检测标签来监测。所述标签可通过包括但不限于光学、电学、热学、质量、大小、电荷、振动和压力的检测方法来监测。所述标记可为磁性的、荧光的或带电的。关于外部和内部标记方案，可使用荧光各向异性来测定闭合复合物中聚合酶与核酸的稳定结合。
举例说明，聚合酶用荧光团标记，其中闭合复合物形成作为稳定荧光信号来监测。在不正确核苷酸存在下所述聚合酶与所述模板核酸的不稳定相互作用导致与在下一正确核苷酸存在下形成的闭合复合物相比可测量地较弱信号。然而，在某些优选实施方案中，所述边结合边测序程序不依赖于接合至所述聚合酶的任何外源标记(例如，荧光标记)的检测。例如，所述聚合酶可为原生聚合酶。
鉴别步骤
下一正确碱基或核苷酸的身份可通过监测三元复合物或闭合复合物的存在、形成和/或解离来确定。下一碱基的身份可在未将下一正确核苷酸以化学方式掺入引物的3'端的情况下确定。任选地，下一碱基的身份是通过监测在所添加的核苷酸存在下所述聚合酶对所述引发的模板核酸的亲和力来确定。任选地，在下一正确核苷酸存在下所述聚合酶对所述引发的模板核酸的亲和力可用于确定所述模板核酸上的下一正确碱基。任选地，在不正确核苷酸存在下所述聚合酶对所述引发的模板核酸的亲和力可用于确定所述模板核酸上的下一正确碱基。
掺入步骤
任选地，本文所提供的方法进一步包括掺入步骤。举例说明，所述掺入步骤包括将与所述模板核酸的下一碱基互补的单一核苷酸(例如，未标记的核苷酸、可逆终止子核苷酸或可检测地标记的核苷酸类似物)掺入所述引发的模板核酸分子的引物中。任选地，所述掺入步骤包括使所述引发的模板核酸分子、聚合酶和核苷酸与掺入反应混合物接触。所述掺入反应混合物典型地包括催化金属离子。
所提供的方法可进一步包括在掺入步骤之后制备用于下一检查步骤的引发的模板核酸分子。任选地，所述制备包括使所述引发的模板核酸或所述核酸/聚合酶复合物经受一个或多个洗涤步骤；温度改变；机械振动；pH改变；盐或缓冲液组成改变、光学刺激或其组合。任选地，所述洗涤步骤包括使所述引发的模板核酸或所述引发的模板核酸/聚合酶复合物与一种或多种缓冲液、清洁剂、蛋白质变性剂、蛋白酶、氧化剂、还原剂或能够释放聚合酶内部的内部交联或聚合酶与核酸之间的交联的其它剂。
任选地，所述方法进一步包括重复所述检查步骤和所述掺入步骤以对模板核酸分子测序。所述检查步骤可在执行所述掺入步骤之前重复一次或多次。任选地，两个连续检查步骤包括具有不同核苷酸分子(例如，经过标记或未标记的不同核苷酸)的反应混合物。任选地，在将单一核苷酸掺入所述引发的模板核酸分子中之前，第一反应混合物用包含聚合酶和1、2、3或4种类型的核苷酸分子(例如，不同的未标记的核苷酸)的第二反应混合物替代。任选地，所述核苷酸分子是选自dATP、dTTP、dCTP和dGTP的原生核苷酸。
所述掺入反应可由掺入反应混合物实现。任选地，所述掺入反应混合物包含与所述检查反应不同的核苷酸组成。例如，所述检查反应物包含一种类型的核苷酸并且所述掺入反应物包含另一类型的核苷酸。举另一实例说明，所述检查反应物包含一种类型的核苷酸并且所述掺入反应物包含四种类型的核苷酸，或反之亦然。任选地，所述检查反应混合物由所述掺入反应混合物改变或替代。任选地，所述掺入反应混合物包含催化金属离子、氯化钾或其组合。
存在于反应混合物中但未隔绝于闭合复合物中的核苷酸可引起多种核苷酸插入。因此，洗涤步骤可在以化学方式掺入步骤之前使用以确保仅隔绝于被俘获的闭合复合物内的核苷酸可用于在掺入步骤期间掺入。任选地，游离核苷酸可通过如磷酸酶等酶去除。被俘获的聚合酶复合物可为闭合复合物、稳定化闭合复合物或涉及所述聚合酶、引发的模板核酸和下一正确核苷酸的三元复合物。
任选地，被封入所述检查步骤的闭合复合物内的核苷酸在所述掺入步骤期间掺入所述模板核酸引物的3'端中。任选地，被封入所述检查步骤的闭合复合物内的核苷酸在所述检查步骤期间掺入，但所述闭合复合物不允许后续核苷酸的掺入；在这种情况下，所述闭合复合物在掺入步骤期间被释放，从而允许后续核苷酸被掺入。
任选地，所述掺入步骤包括替代来自所述检查步骤的核苷酸和将另一核苷酸掺入所述模板核酸引物的3'端中。所述掺入步骤可进一步涉及从闭合复合物内释放核苷酸(例如，所述核苷酸是经过修饰的核苷酸或核苷酸类似物)和将不同种类的核苷酸掺入所述模板核酸引物的3'端中。任选地，去除所释放的核苷酸并且用包含下一正确核苷酸的掺入反应混合物替代。
用于掺入的合适反应条件可涉及用掺入反应混合物替代所述检查反应混合物。任选地，存在于所述检查反应混合物中的核苷酸用所述掺入反应混合物中的一种或多种核苷酸替代。任选地，在所述检查步骤期间存在的聚合酶在所述掺入步骤期间被替代。任选地，在所述检查步骤期间存在的聚合酶在所述掺入步骤期间被修饰。任选地，在所述检查步骤期间存在的一种或多种核苷酸在所述掺入步骤期间被修饰。在所述检查步骤期间存在的反应混合物和/或反应条件可在所述掺入步骤期间通过任何方式来改变。这些方式包括但不限于去除试剂、螯合试剂、稀释试剂、添加试剂、改变如传导率或pH等反应条件和其任何组合。包含聚合酶、引发的模板核酸和核苷酸的任何组合的反应混合物中的试剂可在所述检查步骤和/或掺入步骤期间被修饰。
任选地，所述掺入步骤的反应混合物包含竞争性抑制剂，其中所述竞争性抑制剂降低多种掺入的发生。在某些实施方案中，所述竞争性抑制剂是不可掺入的核苷酸。在某些实施方案中，所述竞争性抑制剂是氨基糖苷。所述竞争性抑制剂能够替代活性位点中的核苷酸或催化金属离子，使得在第一次掺入之后，所述竞争性抑制剂占据所述活性位点，从而防止第二次掺入。在一些实施方案中，可掺入的核苷酸和竞争性抑制剂均在所述掺入步骤期间被引入，使得可调节所述可掺入的核苷酸和所述抑制剂的比率以确保单一核苷酸掺入所述引物的3'端。
任选地，包含掺入反应混合物的所提供反应混合物包含至少一种未标记的核苷酸分子，所述核苷酸分子是不可掺入的核苷酸。换句话说，所提供反应混合物可包含一种或多种未标记的核苷酸分子，所述核苷酸分子不能够掺入所述引发的模板核酸分子的引物中。不能够掺入的核苷酸包括例如二磷酸酯核苷酸。例如，所述核苷酸可含有对三磷酸酯基的修饰，所述修饰使得所述核苷酸不可掺入。不可掺入核苷酸的实例可发现于美国专利号7,482,120中，其公开内容以引用的方式整体掺入本文中。任选地，所述引物的3'端可能不含游离羟基，由此使所述引物不能够掺入任何核苷酸，并且因此使任何核苷酸均不可掺入。
聚合酶抑制剂任选地可在所述检查步骤期间包含于含有测试核苷酸的反应混合物中以在结合下一正确核苷酸时在所述核酸上俘获所述聚合酶。任选地，所述聚合酶抑制剂是焦磷酸盐类似物。任选地，所述聚合酶抑制剂是变构抑制剂。任选地，所述聚合酶抑制剂是DNA或RNA适体。任选地，所述聚合酶抑制剂与所述聚合酶中的催化离子结合位点竞争。任选地，所述聚合酶抑制剂是反转录酶抑制剂。所述聚合酶抑制剂可以是HIV-1反转录酶抑制剂或HIV-2反转录酶抑制剂。所述HIV-1反转录酶抑制剂可以是(4/6-卤素/MeO/EtO取代的苯并[d]噻唑-2-基)噻唑烷-4-酮。
在所提供的测序方法中，下一正确核苷酸在所述掺入步骤之前被鉴别，从而使所述掺入步骤不需要经过标记的试剂和/或监测。因此，在所提供的方法中，核苷酸任选地不含附接的可检测标签或标记。任选地，所述核苷酸含有可检测标记，但所述标记未在所述方法中进行检测。任选地，所述正确核苷酸不含可检测标记；然而，下一碱基的不正确或非互补核苷酸含有可检测标记。
所述测序反应的检查步骤可在所述掺入步骤之前重复1、2、3、4次或更多次。所述检查和掺入步骤可重复，直至获得所述模板核酸的所需序列。
闭合复合物或稳定化闭合复合物的形成可用于确保每个测序循环仅一种核苷酸添加至所述模板核酸引物中，其中所添加的核苷酸被隔绝于所述闭合复合物内。每个测序循环中单一核苷酸的控制掺入会增强包括均聚物重复的核酸区的测序精度。
反应混合物
核酸测序反应混合物或简单地“反应混合物”典型地包含通常存在于基于聚合酶的核酸合成反应中的试剂。反应混合物试剂包括但不限于酶(例如，聚合酶)、dNTP、模板核酸、引物核酸、盐、缓冲液、小分子、辅因子、金属和离子。所述离子可以是催化离子、二价催化离子、非催化离子、非共价金属离子或其组合。所述反应混合物可包含盐，如NaCl、KCl、乙酸钾、乙酸铵、谷氨酸钾、NH4Cl或NH4HSO4。所述反应混合物可包含离子来源，如Mg2+或Mn2+Mg-乙酸、Co2+或Ba2+。所述反应混合物可包含锡离子、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe2+、Ni2+或Eu+3。所述缓冲液可包含Tris、Tricine、HEPES、MOPS、ACES、MES、基于磷酸盐的缓冲液和基于乙酸盐的缓冲液。所述反应混合物可包含螯合剂，如EDTA、EGTA等。任选地，所述反应混合物包含交联试剂。本文提供任选地在所述检查步骤期间使用的反应混合物，以及在核苷酸掺入期间使用的掺入反应混合物，所述掺入反应混合物可包含一种或多种上述剂。当在检查期间使用时，反应混合物可在本文中称作检查反应混合物。任选地，所述检查反应混合物包含高浓度的盐；高pH；1、2、3、4种或更多种类型的未标记的核苷酸；谷氨酸钾；螯合剂；聚合酶抑制剂；催化金属离子；非催化金属离子；或其任何组合。所述检查反应混合物可包含10mM至1.6M或在10mM与1.6M之间的任何量的谷氨酸钾。任选地，所述掺入反应混合物包含催化金属离子；1、2、3、4种或更多种类型的核苷酸(例如，未标记的核苷酸)；氯化钾；非催化金属离子；或其任何组合。
任选地，根据所公开的技术的反应混合物在检查步骤期间调节闭合复合物的形成和稳定化。例如，所述检查步骤的反应条件任选地可有利于封装核苷酸的闭合复合物的形成和/或稳定化，并且阻碍二元复合物的形成和/或稳定化。所述聚合酶与模板核酸之间的二元相互作用可通过调节测序反应参数，如离子强度、pH、温度或其任何组合，或通过添加二元复合物去稳定剂至反应中来操纵。任选地，使用高盐(例如，50mM至1,500mM)和/或pH改变来使二元复合物不稳定。任选地，二元复合物可在所述测序反应的检查或掺入步骤期间在聚合酶与模板核酸之间形成，而与核苷酸的存在无关。任选地，所述反应条件有利于闭合三元复合物的稳定化和二元复合物的不稳定化。举例说明，所述检查反应混合物的pH可从pH 4.0调节至pH 10.0以有利于闭合三元复合物的稳定化和二元复合物的不稳定化。任选地，所述检查反应混合物的pH为pH 4.0至pH 6.0。任选地，所述检查反应混合物的pH为pH6.0至pH 10.0。
所提供的反应混合物和本文所公开的测序方法促进聚合酶与所述核苷酸和模板核酸以一定方式相互作用，所述方式揭露了下一碱基的身份，同时控制核苷酸的化学添加。任选地，所述方法在可检测标记的核苷酸不存在下或在经过标记的核苷酸存在下执行，其中标记未进行检测。
本文提供在检查反应混合物条件下促进闭合复合物的形成和/或稳定化的反应混合物和方法，所述闭合复合物包含结合至引发的模板核酸的聚合酶和封入聚合酶-模板核酸复合物内的核苷酸。检查反应条件可抑制或减弱核苷酸掺入。任选地，封入的核苷酸的掺入受到抑制并且所述复合物在化学前构象或三元复合物中稳定化或被俘获。任选地，掺入封入的核苷酸并且后续核苷酸掺入受到抑制。在这种情况下，所述复合物在易位前构象中稳定化或被俘获。关于本文所提供的测序反应，所述闭合复合物在所述检查步骤期间稳定化，从而允许控制核苷酸掺入。任选地，稳定化闭合复合物是如下复合物，其中封入的核苷酸的掺入在检查步骤期间短暂地(例如，以检查所述复合物并且接着掺入核苷酸)或永久地(例如，仅用于检查)减弱。任选地，稳定化闭合复合物允许封入的核苷酸的掺入，但不允许后续核苷酸的掺入。任选地，使所述闭合复合物稳定化以便监测在核苷酸存在下任何的聚合酶与模板核酸相互作用，从而鉴别所述模板核酸中的下一碱基。
任选地，封入的核苷酸已经严重地降低与所述闭合复合物中的模板核酸的结合或无能结合。任选地，封入的核苷酸与所述模板核酸在下一碱基处进行碱基配对。任选地，所述聚合酶、核苷酸、引物、模板核酸或其任何组合的身份会影响所述闭合复合物中封入的核苷酸与所述模板核酸之间的相互作用。
任选地，封入的核苷酸结合至所述闭合复合物的聚合酶。任选地，封入的核苷酸与所述闭合复合物的聚合酶微弱地缔合。任选地，所述聚合酶、核苷酸、引物、模板核酸或其任何组合的身份会影响所述闭合复合物中封入的核苷酸与所述聚合酶之间的相互作用。关于给定的聚合酶，各核苷酸对所述聚合酶具有不同于另一核苷酸的亲和力。任选地，这一亲和力部分地取决于所述模板核酸和/或所述引物。
所述闭合复合物可短暂地形成。任选地，封入的核苷酸是下一正确核苷酸。在一些方法中，下一正确核苷酸的存在部分地有助于闭合复合物的稳定化。任选地，封入的核苷酸并非下一正确核苷酸。
任选地，所述检查反应条件包含多种引发的模板核酸、聚合酶、核苷酸或其任何组合。任选地，所述多种核苷酸包含1、2、3、4种或更多种类型的不同核苷酸，例如dATP、dTTP、dGTP和dCTP。任选地，所述多种模板核酸是模板核酸的克隆群体。
可调节闭合复合物的稳定性的反应条件包括但不限于催化金属离子的可用性、欠佳或抑制金属离子、离子强度、pH、温度、聚合酶抑制剂、交联试剂和其任何组合。可调节闭合复合物的稳定性的反应试剂包括但不限于不可掺入的核苷酸、不正确核苷酸、核苷酸类似物、经过修饰的聚合酶、具有不可延伸的聚合开始位点的模板核酸和其任何组合。
所述检查反应混合物可包含其它分子，包括但不限于酶。任选地，所述检查反应混合物包含一般存在于核酸聚合反应中的任何试剂或生物分子。反应组分可包括但不限于盐、缓冲液、小分子、金属和离子。任选地，所述反应混合物的特性可例如以电学方式、以磁力和/或用振动来操纵。
核苷酸和核苷酸类似物
适用于进行本文所述的边结合边测序程序的核苷酸包括原生核苷酸、经过标记的核苷酸(例如，包含外源荧光染料或未发现于原生核苷酸中的其它标记的核苷酸)和核苷酸类似物(例如，具有可逆终止子部分的核苷酸)。
可与目前所述的技术结合使用的核苷酸的性质具有灵活性。核苷酸可包含以下任一者作为其含氮碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。任选地，核苷酸包含肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、硝基吡咯(包括3-硝基吡咯)或硝基吲哚(包括5-硝基吲哚)碱基。适用的核苷酸包括但不限于ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dUDP、dAMP、dTMP、dCMP、dGMP和dUMP。任选地，磷酸酯基用部分修饰。所述部分可包括可检测标记。任选地，所述核苷酸的3'OH基团用部分修饰。所述部分可为3'可逆或不可逆终止子。核苷酸也可含有DNA聚合酶的终止抑制剂双脱氧核苷酸或2',3'双脱氧核苷酸，其被缩写为ddNTP(ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP和ddUTP)。
任选地，检查步骤的闭合复合物包含核苷酸类似物或经过修饰的核苷酸以促进所述闭合复合物的稳定化。任选地，核苷酸类似物包括含氮碱基、五碳糖和磷酸酯基并且所述核苷酸的任何组分均可经过修饰和/或被替代。核苷酸类似物可为不可掺入的核苷酸。不可掺入的核苷酸可经过修饰以在所述测序方法期间的任何时刻变得可掺入。
核苷酸类似物包括但不限于α-磷酸酯基修饰的核苷酸、α-β核苷酸类似物、β-磷酸酯基修饰的核苷酸、β-γ核苷酸类似物、γ-磷酸酯基修饰的核苷酸、笼状核苷酸或ddNTP。核苷酸类似物的实例描述于美国专利号8,071,755中，其以引用的方式整体掺入本文中。
核苷酸类似物可包括终止子，其可逆地防止所述引物的3'端的核苷酸掺入。一种类型的可逆终止子是3'-O阻断的可逆终止子。此处，所述终止子部分连接至核苷酸的5-碳糖的3'-OH端的氧原子。例如，U.S.7,544,794和U.S.8,034,923(这些专利的公开内容以引用的方式掺入)描述了具有由3'-ONH2基团替代的3'-OH基团的可逆终止子dNTP。这种类型的可逆终止子部分可使用含有NaNO2的乙酸盐缓冲溶液便利地去除(例如，在“阻断去除”步骤中)。另一类型的可逆终止子核苷酸是描述于EP 1 974 057中的2'修饰的可逆终止子。另一类型的可逆终止子是3'未阻断的可逆终止子，其中所述终止子部分连接至核苷酸的含氮碱基。例如，U.S.8,808,989(其公开内容以引用的方式并入)公开了可与本文所述的方法结合使用的碱基修饰的可逆终止子核苷酸的特定实例。同样可与本文所述的方法结合使用的其它可逆终止子包括U.S.7,956,171、U.S.8,071,755和U.S.9,399,798(这些美国专利的公开内容以引用的方式并入)中所述的那些。关于具有终止子的核苷酸类似物的回顾，参见例如Mu,R.等人,“The History and Advances of Reversible Terminators Used in NewGenerations of Sequencing Technology,”Genomics,Proteomics&Bioinformatics 11(1):34-40(2013)。任选地，在所述检查步骤期间使用的一种或多种原生核苷酸由在所述掺入步骤期间掺入的第二类型的核苷酸替代。例如，存在于检查步骤期间使用的反应混合物中的核苷酸可由包含可逆终止子部分(例如，定位于所述核苷酸类似物的碱基或糖上)的核苷酸类似物替代。
任选地，用核苷酸取代具有不可逆地防止核苷酸掺入至所述引物的3'端的终止子的经过修饰的核苷酸类似物。不可逆核苷酸类似物包括双脱氧核苷酸、ddNTP(ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP)。双脱氧核苷酸缺乏聚合酶介导的合成所必需的dNTP的3'-OH基团。
任选地，不可掺入的核苷酸包括阻断部分，所述阻断部分在核酸聚合反应的掺入步骤期间抑制或防止所述核苷酸形成与第二核苷酸(引物的3'OH)的共价连接。所述阻断部分可从核苷酸去除，从而允许核苷酸掺入。
任选地，存在于闭合复合物中的核苷酸类似物使所述闭合复合物稳定。任选地，所述核苷酸类似物是不可掺入的。任选地，释放所述核苷酸类似物并且掺入原生核苷酸。任选地，释放所述闭合复合物，修饰所述核苷酸类似物，并且掺入经过修饰的核苷酸类似物。任选地，在修饰所述闭合复合物中的核苷酸类似物和/或使所述核苷酸类似物不稳定的反应条件下释放所述闭合复合物。
任选地，掺入存在于闭合复合物中的核苷酸类似物并且使所述闭合复合物稳定。所述闭合复合物可通过所述核苷酸类似物，或例如通过本文所公开的任何稳定化方法来稳定化。任选地，所述核苷酸类似物不允许后续核苷酸的掺入。所述闭合复合物可例如通过本文所述的任何方法被释放，并且修饰所述核苷酸类似物。经过修饰的核苷酸类似物可允许后续核苷酸掺入至其3'端。
任选地，核苷酸类似物存在于所述检查步骤期间的反应混合物中。例如，1、2、3、4种或更多种核苷酸类似物存在于所述检查步骤期间的反应混合物中。任选地，核苷酸类似物在掺入步骤期间被替代、经过稀释或被隔绝。任选地，核苷酸类似物用原生核苷酸替代。所述原生核苷酸可包括下一正确核苷酸。任选地，核苷酸类似物在掺入步骤期间被修饰。经过修饰的核苷酸类似物可与原生核苷酸相似或相同。
任选地，核苷酸类似物对聚合酶具有不同于原生核苷酸的结合亲和力。任选地，核苷酸类似物具有不同于原生核苷酸的与下一碱基的相互作用。核苷酸类似物和/或不可掺入的核苷酸可与模板核酸的互补碱基进行碱基配对。
任选地，核苷酸类似物是融合至聚合酶的经过修饰的或原生核苷酸。任选地，多种核苷酸类似物包括与多种聚合酶的融合物，其中各核苷酸类似物包括不同聚合酶。
核苷酸可经过修饰以相比二元复合物的形成有利于闭合复合物的形成。核苷酸可经过选择或经过修饰以对聚合酶具有高亲和力，其中所述聚合酶在结合至所述模板核酸之前结合至核苷酸。
在闭合复合物中俘获所述聚合酶的任何核苷酸修饰均可用于本文所公开的方法中。所述核苷酸可永久地或短暂地被俘获。任选地，所述核苷酸类似物并非使闭合复合物稳定化的方式。任何闭合复合物稳定化方法均可组合于使用核苷酸类似物的反应中。
任选地，允许闭合复合物的稳定化的核苷酸类似物是与通常释放所述闭合复合物的反应条件组合。所述条件包括但不限于释放试剂(例如催化金属离子，如镁或锰)的存在。任选地，所述闭合复合物即使在催化金属离子存在下也稳定化。任选地，所述闭合复合物即使在核苷酸类似物存在下也被释放。任选地，所述闭合复合物的稳定化部分地取决于所述稳定化试剂和/或释放试剂的浓度和/或身份，和其任何组合。任选地，使用核苷酸类似物使闭合复合物稳定化是与用于稳定化闭合复合物的额外反应条件组合，所述额外反应条件包括但不限于隔绝、去除、降低、省略和/或螯合催化金属离子；聚合酶抑制剂交联剂的存在；和其任何组合。
任选地，一种或多种核苷酸可用区别和/或可检测标签或标记进行标记；然而，所述标签或标记在检查、碱基的鉴别或碱基的掺入期间未进行检测，并且在本文所公开的测序方法期间未进行检测。所述标签可借助于其荧光、拉曼光谱、电荷、质量、折射率、发光、长度或任何其它可测量特性的差异来区别。所述标签可附接于所述核苷酸上的一个或多个不同位置，只要结合至聚合酶-核酸复合物的保真度经过充分维持以使得能够正确地鉴别所述模板核酸上的互补碱基。任选地，所述标签附接于所述核苷酸的核碱基位置。在合适的反应条件下，经过标记的核苷酸可封入具有所述聚合酶和所述引发的模板核酸的闭合复合物中。或者，标签附接于所述核苷酸的γ磷酸酯基位置。
聚合酶
适用于进行所公开的边结合边测序技术的聚合酶包括天然存在的聚合酶和其经过修饰的变体，包括但不限于突变体、重组体、融合物、基因修饰、化学修饰、合成物和类似物。天然存在的聚合酶和其经过修饰的变体不限于保持催化聚合反应的能力的聚合酶。任选地，所述天然存在的和/或其经过修饰的变化形式保持催化聚合反应的能力。任选地，所述天然存在的和/或经过修饰的变化形式具有增强其对DNA测序的能力的特殊特性，包括增强的与核酸的结合亲和力、降低的与核酸的结合亲和力、增强的催化速率、降低的催化速率等。突变型聚合酶包括如下聚合酶，其中一种或多种氨基酸用其它氨基酸(天然或非天然存在)替代，和一种或多种氨基酸的插入或缺失。经过修饰的聚合酶包括含有外部标签的聚合酶，所述外部标签可用于监测所述聚合酶的存在和相互作用。任选地，来自所述聚合酶的固有信号可用于监测其存在和相互作用。因此，所提供的方法可包括通过检测来自所述聚合酶的固有信号来监测所述聚合酶、核苷酸和模板核酸的相互作用。任选地，所述固有信号是光散射信号。例如，固有信号包括如色氨酸等某些氨基酸的原生荧光，其中来自所述聚合酶的固有信号的改变可指示闭合复合物的形成。因此，在所提供的方法中，所述聚合酶是未标记的聚合酶并且监测是在与所述聚合酶缔合的可检测标记不存在下执行的。一些经过修饰的聚合酶或天然存在的聚合酶可在特定反应条件下仅掺入单一核苷酸并且可在所述单一核苷酸的掺入之后保持结合至引物-模板。任选地，所述聚合酶的拇指和指域可由于其在所述聚合酶的闭合形式中的物理接近而形成短暂或共价交联。所述交联可例如由在所述拇指和指域上的合适位置处的原生或经过工程改造的半胱氨酸形成。
如本文所用，术语聚合酶和其变体还指包括至少两个彼此连接的部分的融合蛋白，例如其中一个部分包括可催化核苷酸聚合至核酸链中的肽，连接至包括第二部分(如报告酶或持续合成性修饰域)的另一部分。例如，T7DNA聚合酶包括核酸聚合域和硫氧还蛋白结合域，其中硫氧还蛋白结合会增强所述聚合酶的持续合成性。在缺乏硫氧还蛋白结合的情况下，T7 DNA聚合酶是分配型聚合酶，具有仅一种至数种碱基的持续合成性。尽管DNA聚合酶在细节上不同，但其具有相似的总体手形状，具有称作指、手掌和拇指的特定区；并且在核酸的合成期间具有相似的总体结构转变，包括拇指和/或指域的移动。
DNA聚合酶包括但不限于细菌DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶、古细菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶和噬菌体DNA聚合酶。细菌DNA聚合酶包括大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III、IV和V、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、耐热梭菌(Cst)DNA聚合酶、热纤梭菌(Cth)DNA聚合酶和硫矿硫化叶菌(Sso)DNA聚合酶。真核生物DNA聚合酶包括DNA聚合酶α、β、γ、δ、€、η、ζ、λ、σ、μ和κ，以及Revl聚合酶(末端脱氧胞啶基转移酶)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。病毒DNA聚合酶包括T4 DNA聚合酶、phi-29 DNA聚合酶、GA-l、phi-29样DNA聚合酶、PZA DNA聚合酶、phi-15 DNA聚合酶、Cpl DNA聚合酶、Cp7 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶和T4聚合酶。其它DNA聚合酶包括热稳定性和/或嗜热性DNA聚合酶，如从水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶、丝状栖热菌(Tfi)DNA聚合酶、速生热球菌(Tzi)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、黄栖热菌(Tfl)DNA聚合酶、乌兹炽热球菌(Pwo)DNA聚合酶、强烈炽热球菌(Pfu)DNA聚合酶和TurboPfu DNA聚合酶、栖热球菌(Tli)DNA聚合酶、炽热球菌属某种GB-D聚合酶、海栖热袍菌(Tma)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bst)DNA聚合酶、超好热始原菌(KOD)DNA聚合酶、Pfx DNA聚合酶、热球菌属某种JDF-3(JDF-3)DNA聚合酶、硫代谢热球菌(Tgo)DNA聚合酶、嗜酸热球菌DNA聚合酶；嗜酸热硫化叶菌DNA聚合酶；热球菌属某种go N-7 DNA聚合酶；隐蔽热网菌DNA聚合酶；沃氏甲烷球菌DNA聚合酶；热自养甲烷球菌DNA聚合酶；詹氏甲烷球菌DNA聚合酶；硫还原球菌菌株TOK DNA聚合酶(D.Tok Pol)；深渊炽热球菌DNA聚合酶；掘越氏炽热球菌DNA聚合酶；岛状炽热球菌DNA聚合酶；栖烟囱热球菌DNA聚合酶；敏捷气热菌DNA聚合酶；和异二聚体DNA聚合酶DP1/DP2分离的DNA聚合酶。经过工程改造和经过修饰的聚合酶与所公开的技术结合也适用。例如，可使用极端嗜热海洋古细菌热球菌属9°N的经过修饰的形式(例如，来自New England BioLabs Inc.；Ipswich,MA的Therminator DNA聚合酶)。
RNA聚合酶包括但不限于病毒RNA聚合酶，如T7 RNA聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶和Kll聚合酶；真核生物RNA聚合酶，如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV和RNA聚合酶V；和古细菌RNA聚合酶。
反转录酶包括但不限于来自人类免疫缺乏病毒1型的HIV-1反转录酶(PDB 1HMV)、来自人类免疫缺乏病毒2型的HIV-2反转录酶、来自莫洛尼氏鼠科动物白血病病毒的M-MLV反转录酶、来自禽成髓细胞瘤病毒的AMV反转录酶和维持真核生物染色体的端粒的端粒酶反转录酶。
任选地，聚合酶用化学发光标签标记，其中闭合复合物形成作为在适当发光触发因素存在下的稳定发光信号来监测。在不正确核苷酸存在下所述聚合酶与所述模板核酸的不稳定相互作用导致与在下一正确核苷酸存在下形成的闭合复合物相比可测量地较弱信号。另外，在触发发光之前的洗涤步骤可能去除未结合至稳定闭合复合物中的所有聚合酶分子。
任选地，聚合酶用光散射标签标记，其中闭合复合物形成作为稳定光散射信号来监测。在不正确核苷酸存在下所述聚合酶与所述核酸的不稳定相互作用导致与在下一正确核苷酸存在下形成的闭合复合物相比可测量地较弱信号。
任选地，所述聚合酶用等离子体纳米粒子标签标记，其中闭合复合物形成作为等离子体共振的转变来监测，所述等离子体共振不同于在所述闭合复合物不存在下或在包括不正确核苷酸的闭合复合物存在下的等离子体共振。等离子体共振的改变可归因于闭合复合物的局部介电环境的改变，或其可归因于所述等离子体纳米粒子在克隆扩增的核酸分子的簇上的同步聚集或在闭合复合物配置中不同地影响等离子体的另一方式。
任选地，聚合酶用拉曼散射标签标记，其中闭合复合物形成作为稳定拉曼散射信号来监测。在不正确核苷酸存在下聚合酶与所述核酸的不稳定相互作用导致与在下一正确核苷酸存在下形成的闭合复合物相比可测量地较弱信号。
任选地，下一正确核苷酸通过经过选择或经过修饰以对核苷酸具有高亲和力的聚合酶上的标签来鉴别，其中所述聚合酶在结合至所述模板核酸之前结合至核苷酸。例如，来自非洲猪瘟病毒的DNA聚合酶X具有改变的底物结合顺序，其中所述聚合酶首先结合至核苷酸，接着结合至所述模板核酸。任选地，聚合酶与独立隔室中的各类型的核苷酸一起孵育，其中各隔室含有不同类型的核苷酸并且其中所述聚合酶用标签不同地标记，视与其一起孵育的核苷酸而定。在这些条件下，未标记的核苷酸结合至不同标记的聚合酶。所述聚合酶可以是结合至各核苷酸类型的同一种类的聚合酶或结合至各核苷酸类型的不同聚合酶。差异性标记的聚合酶-核苷酸复合物可同时添加至所述测序反应的任何步骤中。各聚合酶-核苷酸复合物结合至模板核酸，所述模板核酸的下一碱基与所述聚合酶-核苷酸复合物中的核苷酸互补。下一正确核苷酸通过携带所述核苷酸的聚合酶上的标签来鉴别。通过经过标记的聚合酶-核苷酸复合物来询问下一模板碱基可在非掺入和/或检查条件下执行，其中一旦确定下一模板碱基的身份，使所述复合物不稳定并且去除、隔绝和/或稀释所述复合物并且以确保仅掺入一种核苷酸的方式执行独立掺入步骤。
在聚合酶上引入可检测标签的常用方法任选地涉及化学结合至存在于所述聚合酶的非活性区中的胺或半胱氨酸。所述结合方法是本领域中众所周知的。作为非限制性实例，n-羟基丁二酰亚胺酯(NHS酯)通常用于标记可在酶上发现的胺基团。半胱氨酸容易与硫醇或顺丁烯二酰亚胺基团反应，而羧基可与胺通过用EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐)活化而发生反应。任选地，在其中仅N端胺具反应性的pH范围中(例如，pH 7)使用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)化学，使得每种聚合酶仅添加单一标签。
任选地，附接至所述聚合酶的标签是电荷标签，使得稳定闭合复合物的形成可通过电学方式通过测量在所述模板核酸周围的局部电荷密度的改变来检测。用于检测电荷的方法是本领域中众所周知的，包括如场效应晶体管、介电谱学、阻抗测量和pH测量等方法。场效应晶体管包括但不限于离子敏感性场效应晶体管(ISFET)、电荷调节的场效应晶体管、绝缘闸场效应晶体管、金属氧化物半导体场效应晶体管和使用半导体单壁碳纳米管制造的场效应晶体管。
任选地，电荷标签是具有低于约4或高于约10的等电点的肽标签。任选地，包括肽标签的聚合酶具有低于约5或高于约9的总等电点。电荷标签可以是带正电或带负电的任何部分。所述电荷标签可包括额外部分，包括质量和/或标记，如染料。任选地，所述电荷标签仅在某些反应条件下(如pH的改变)具有正电荷或负电荷。
聚合酶可用荧光团和/或猝灭剂标记。任选地，核酸用荧光团和/或猝灭剂标记。任选地，一种或多种核苷酸用荧光团和/或猝灭剂标记。示例性荧光团包括但不限于荧光纳米晶体；量子点；d-罗丹明受体染料，包括二氯[R110]、二氯[R6G]、二氯[TAMRA]、二氯[ROX]等；荧光素供体染料，包括荧光素、6-FAM等；花青染料，如Cy3B；Alexa染料、SETA染料、Atto染料(如与Cy3B形成FRET对的atto 647N)等。荧光团包括但不限于MDCC(7-二乙基氨基-3-[([(2-顺丁烯二酰亚胺基)乙基]氨基)羰基]香豆素)、TET、HEX、Cy3、TMR、ROX、德克萨斯红、Cy5、LC红705和LC红640。荧光团和其使用方法(包括附接至聚合酶和其它分子)描述于TheMolecular
Figure BDA0001783299040000441
Handbook(Life Technologies；Carlsbad Calif.)和FluorophoresGuide(Promega；Madison,WI)中，其以引用的方式整体并入本文中。示例性猝灭剂包括但不限于ZEN、IBFQ、BHQ-1、BHQ-2、DDQ-I、DDQ-11、Dabcyl、Qxl猝灭剂、Iowa Black RQ和IRDyeQC-1。
任选地，构象敏感染料可紧密附接至所述聚合酶的活性位点而不会影响所述聚合酶的聚合能力或保真度；其中归因于闭合复合物的形成的构象改变或极性环境的改变作为所述染料的荧光或吸光特性的改变来反映。已知常见荧光团(如Cy3和荧光素)对聚合酶结合和闭合复合物形成具有强烈的溶剂变色反应，达到闭合复合物的形成可清楚地与二元聚合酶-核酸复合物区别的程度。任选地，所述闭合复合物可基于来自构象敏感染料的荧光或吸光信号的差异而与二元复合物区别。任选地，溶剂变色染料可用于监测构象转变；其中通过构象改变诱导的局部极性环境的改变可用作报告信号。溶剂变色染料包括但不限于瑞氏染料、IR44、部花青染料(例如，部花青540)、4-[2-N取代-1,4-氢吡啶-4-亚基)亚乙基]环己-2,5-二烯-1-酮、红色吡唑啉酮染料、甲亚胺染料、靛苯胺染料、二氮杂部花青染料、靛类染料(如由靛青示例)和其它染料以及其混合物。将染料或荧光团引入聚合酶的特定位点中的方法是本领域中众所周知的。作为非限制性实例，用染料对T7 DNA聚合酶进行位点特异性标记的程序由Tsai等人提供于“Site-Specific Labeling of T7 DNA Polymerase witha Conformationally Sensitive Fluorophore and Its Use in Detecting Single-Nucleotide Polymorphisms,”Analytical Biochemistry 384:136-144(2009)中，其以引用的方式整体并入本文中。
任选地，聚合酶在可能传感闭合复合物形成而不干涉所述反应的位置处用荧光团标记。所述聚合酶可为原生或经过修饰的聚合酶。经过修饰的聚合酶包括具有一种或多种氨基酸突变、添加和/或缺失的那些。任选地，一个或多个而非所有半胱氨酸氨基酸突变形成另一氨基酸，如丙氨酸。在这种情况下，剩余一个或多个半胱氨酸用于位点特异性结合至荧光团。或者，一个或多个氨基酸突变形成适用于荧光团结合的反应性氨基酸，如半胱氨酸或包括伯胺的氨基酸。
任选地，在正确核苷酸存在下聚合酶与模板核酸之间的结合可诱导荧光的减少，而与不正确核苷酸的结合会引起荧光的增加。在正确核苷酸存在下聚合酶与模板核酸之间的结合可诱导荧光的增加，而与不正确核苷酸的结合会引起荧光的减少。荧光信号可用于监测核苷酸诱导的构象改变的动力学并且鉴别模板核酸序列中的下一碱基。
任选地，聚合酶/核酸相互作用可通过使源于所述聚合物或附接至所述聚合酶的标签(例如，纳米粒子标签)的信号散射来监测。
用于形成和操纵闭合复合物的条件
如本文所用，闭合复合物可为包含聚合酶、引发的模板核酸和核苷酸的三元复合物。所述闭合复合物可呈化学前构象，其中核苷酸被隔绝但未被掺入。所述闭合复合物可替代地呈易位前构象，其中核苷酸通过与所述引发的模板核酸中的引物的3'端形成磷酸二酯键而被掺入。所述闭合复合物可在催化金属离子不存在下或在催化金属离子的缺乏水平下形成，由此以物理方式隔绝聚合酶活性位点内的下一正确核苷酸而无以化学方式掺入。任选地，被隔绝的核苷酸可以是不可掺入的核苷酸。所述闭合复合物可在催化金属离子存在下形成，其中所述闭合复合物包含掺入的核苷酸类似物，但PPi不能释放。在这种情况下，所述闭合复合物在易位前构象中稳定化。任选地，易位前构象通过与所述聚合酶化学交联而稳定化。任选地，所述闭合复合物可通过外部方式稳定化。在一些情况下，所述闭合复合物可通过小分子或如抗体或适体等大分子的变构结合而稳定化。任选地，闭合复合物可通过以高亲和力紧密结合至活性位点，从而防止所述聚合酶易位的焦磷酸盐类似物稳定化。
如本文所用，稳定化闭合复合物或稳定化三元复合物是指聚合酶在所述引发的模板核酸的聚合开始位点(所述引物的3'端)处通过一种方式或方式的组合被俘获，所述方式包括但不限于与闭合构象中的拇指和指域交联、防止所述聚合酶恢复开放构象的变构抑制剂的结合、在易位前步骤中俘获聚合酶的焦磷酸盐类似物的结合、所述聚合酶的活性位点中不存在催化金属离子和添加如镍、锡和Sr2+等金属离子作为催化金属离子的替代物。因而，所述聚合酶即使在核苷酸的掺入之后也可在所述聚合开始位点处被俘获。因此，所述聚合酶可在化学前构象、易位前步骤、易位后步骤或其任何中间步骤中被俘获。因此，允许下一正确核苷酸或碱基的充分检查和鉴别。
如本文所述，基于聚合酶的边结合边测序反应一般涉及提供具有聚合酶和一种或多种类型的核苷酸的引发的模板核酸，其中所述核苷酸可能或可能不与所述引发的模板核酸的下一碱基互补，和检查在如下条件下所述聚合酶与所述引发的模板核酸的相互作用，其中核苷酸以化学方式掺入所述引发的模板核酸中在化学前构象中不能实现或受到严重抑制，或在所述引物的3'端发生一种或多种互补核苷酸掺入。任选地，其中所述化学前构象在核苷酸掺入之前优选地使用稳定剂稳定化，独立掺入步骤可跟随所述检查步骤以将单一核苷酸掺入所述引物的3'端。任选地，在发生单一核苷酸掺入的情况下，所述易位前构象可稳定化以促进检查和/或防止后续核苷酸掺入。
如上文所指示，目前所述的用于对核酸测序的方法包括检查步骤。所述检查步骤涉及使聚合酶结合至包含一种或多种核苷酸的反应混合物中的引发的模板核酸的聚合开始位点，和监测相互作用。任选地，核苷酸被隔绝于聚合酶-引发的模板核酸复合物中以在其中通过所述聚合酶掺入所述封入的核苷酸被减弱或受到抑制的条件下形成闭合复合物。任选地，添加稳定剂以使所述三元复合物在下一正确核苷酸存在下稳定化。这种闭合复合物呈稳定化或聚合酶被俘获的化学前构象。闭合复合物允许封入的核苷酸的掺入，但不允许后续核苷酸的掺入。这种闭合复合物呈稳定化或被俘获的化学前构象。任选地，所述聚合酶通过一种方式或方式的组合被俘获于其闭合复合物中的聚合位点处，所述方式包括但不限于聚合酶域的交联、使所述聚合酶与所述核酸交联、由小分子、非竞争性抑制剂、竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂和变性引起的变构抑制；其中被俘获的闭合复合物的形成提供关于所述核酸模板上的下一碱基的身份的信息。
任选地，闭合复合物从其被俘获或稳定化构象被释放，其可允许核苷酸掺入模板核酸引物的3'端。所述闭合复合物可通过调节反应条件的组成而不稳定和/或被释放。另外，所述闭合复合物可通过电学、磁力和/或机械方式不稳定。机械方式包括机械搅拌，例如通过使用超声波搅拌。机械振动使所述闭合复合物不稳定并且抑制所述聚合酶结合至DNA。因此，与其使用其中所述检查反应混合物用掺入混合物替代的洗涤步骤，可使用机械搅拌从所述模板核酸去除所述聚合酶，使得能够通过连续掺入步骤循环，其中每个步骤进行单一核苷酸添加。
可组合闭合复合物稳定化或闭合复合物释放反应条件和/或方法的任何组合。例如，使闭合复合物稳定化的聚合酶抑制剂可存在于具有催化离子的检查反应中，所述催化离子用于释放所述闭合复合物。在前述实例中，所述闭合复合物可稳定化或被释放，这取决于聚合酶抑制剂特性和浓度、催化金属离子的浓度、反应混合物的其它试剂和/或条件和其任何组合。
所述闭合复合物可在其中核苷酸与所述引发的模板核酸中的引物的3'端的共价附接被减弱的条件下稳定化。任选地，所述闭合复合物是呈化学前构象或三元复合物。任选地，所述闭合复合物是呈易位前构象。这种闭合复合物的形成可通过调节允许闭合复合物释放和/或核苷酸以化学方式掺入反应混合物中的引物中的催化金属离子的可用性来开始和/或稳定化。示例性金属离子包括但不限于镁、锰、钴和钡。催化离子可以是任何制剂，例如盐，如MgCl2、Mg(CH3CO2)2和MnCl2。
催化金属离子的选择和/或浓度可以基于所述测序反应中的聚合酶和/或核苷酸。例如，HIV反转录酶使用镁进行核苷酸掺入(N Kaushik,Biochemistry 35:11536-11546(1996)，和H P Patel,Biochemistry 34:5351-5363(1995)，其以引用的方式整体并入本文中)。相对锰，使用镁形成闭合复合物的速率可以是不同的，视所述聚合酶和所述核苷酸的身份而定。因此，所述闭合复合物的稳定性可以视催化金属离子、聚合酶和/或核苷酸身份而不同。此外，闭合复合物稳定化所必需的催化离子的浓度可视催化金属离子、聚合酶和/或核苷酸身份而变化并且可容易使用本文所提供的指导来测定。例如，核苷酸掺入可在一种金属离子的高催化离子浓度下发生，但不会在同一金属离子的低浓度下发生，或反之亦然。因此，修饰金属离子身份、金属离子浓度、聚合酶身份和/或核苷酸身份会允许控制检查反应条件。
所述闭合复合物可通过在所述测序反应的检查步骤期间隔绝、去除、降低、省略和/或螯合催化金属离子而形成和/或稳定化，使得闭合复合物释放和/或以化学方式掺入不会发生。螯合包括使所述催化金属离子无法用于核苷酸掺入的任何程序，包括使用EDTA和/或EGTA。降低包括稀释反应混合物中的催化金属离子的浓度。所述反应混合物可以用包含非催化离子的溶液稀释或替代，所述非催化离子允许闭合复合物形成，但抑制核苷酸掺入。非催化离子包括但不限于钙、锶、钪、钛、钒、铬、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、砷、硒、铑和锶。任选地，Ni2+提供于检查反应中以促进闭合复合物形成。任选地，Sr2+提供于检查反应中以促进闭合复合物形成。任选地，非催化金属离子和催化金属离子均存在于所述反应混合物中，其中一种离子以高于另一者的有效浓度存在。在所提供的方法中，如钴等非催化离子在高浓度下可变得具催化性(即，促进核苷酸掺入)。因此，任选地，使用低浓度的非催化金属离子来促进三元复合物形成并且使用较高浓度的非催化金属离子来促进掺入。
非催化离子可在检查条件下添加至反应混合物中。所述反应可已经包括核苷酸。任选地，使非催化离子复合至一种或多种核苷酸并且将复合的核苷酸添加至反应混合物中。非催化离子可通过使核苷酸与非催化离子在高温(约80℃)下混合而复合至核苷酸。例如，铬核苷酸复合物可添加至混合物中以促进闭合复合物形成和稳定化。任选地，铬核苷酸复合物是铬单齿、双齿或三齿复合物。任选地，铬核苷酸复合物是α单齿或β-γ-双齿核苷酸。
任选地，闭合复合物在包括Sr2+的反应条件中在聚合酶、引发的模板核酸与核苷酸之间形成，其中Sr2+促进所述闭合复合物的形成。Sr2+的存在可允许相比包含不正确核苷酸的复合物的形成有利于形成包含下一正确核苷酸的闭合复合物。Sr2+离子可以约0.01mM至约30mM的浓度存在。任选地，Sr2+作为10mM SrCl2存在。在检查条件下监测所述闭合复合物的形成以鉴别所述闭合复合物的模板核酸中的下一碱基。在Sr2+存在下所述聚合酶(例如，大肠杆菌DNA聚合酶I、Bst的Klenow片段)对各dNTP(例如，dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的亲和力可以是不同的。因此，检查可涉及测量聚合酶-模板核酸对dNTP的结合亲和力；其中结合亲和力指示模板核酸中的下一碱基。任选地，结合相互作用可在使所述聚合酶与引发的模板核酸之间的二元相互作用不稳定的条件下执行。任选地，结合相互作用可在使所述聚合酶、所述引发的模板核酸与下一正确核苷酸之间的三元相互作用稳定化的条件下执行。在检查之后，洗涤步骤去除了未结合的核苷酸，并且Mg2+添加至反应中以诱导焦磷酸盐(PPi)裂解和核苷酸掺入。任选地，所述洗涤步骤包括Sr2+以维持所述三元复合物的稳定性，从而防止所述三元复合物的解离。所述反应可重复，直至获得所需的序列读段长。
任选地，闭合复合物在包括Ni2+的反应条件中在聚合酶、引发的模板核酸与核苷酸之间形成，其中Ni2+促进所述闭合复合物的形成。Ni2+的存在可允许相比包含不正确核苷酸的复合物的形成有利于形成包含下一正确核苷酸的闭合复合物。Ni2+离子可以约0.01mM至约30mM的浓度存在。任选地，Ni2+作为10mM NiCl2存在。在检查条件下监测所述闭合复合物的形成以鉴别所述闭合复合物的模板核酸中的下一碱基。在Sr2+存在下所述聚合酶(例如，大肠杆菌DNA聚合酶I、Bst的Klenow片段)对各dNTP(例如，dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的亲和力可以是不同的。因此，检查可涉及测量聚合酶-模板核酸对dNTP的结合亲和力；其中结合亲和力指示模板核酸中的下一碱基。任选地，结合相互作用可在使所述聚合酶与引发的模板核酸之间的二元相互作用不稳定的条件下执行。任选地，结合相互作用可在使所述聚合酶、所述引发的模板核酸与下一正确核苷酸之间的三元相互作用稳定化的条件下执行。在检查之后，洗涤去除了未结合的核苷酸和聚合酶，并且Mg2+添加至反应中以诱导焦磷酸盐(PPi)裂解和核苷酸掺入。任选地，洗涤缓冲液包含Ni2+以维持所述三元复合物的稳定性，从而防止所述三元复合物的解离。所述反应可重复，直至获得所需的序列读段长。
任选地，闭合复合物在包括非催化浓度的Co2+的反应条件中在聚合酶、引发的模板核酸与核苷酸之间形成，其中Co2+促进所述闭合复合物的形成。非催化浓度的Co2+的存在可允许相比包含不正确核苷酸的复合物的形成有利于形成包含下一正确核苷酸的闭合复合物。Co2+离子可以约0.01mM至约0.5mM的浓度存在。任选地，Co2+作为0.5mM CoCl2存在。在检查条件下监测所述闭合复合物的形成以鉴别所述闭合复合物的模板核酸中的下一碱基。在Co2+存在下所述聚合酶(例如，大肠杆菌DNA聚合酶I、Bst的Klenow片段)对各dNTP(例如，dATP、dTTP、dCTP、dGTP)的亲和力可以是不同的。因此，检查可涉及测量聚合酶-模板核酸对dNTP的结合亲和力；其中结合亲和力指示模板核酸中的下一碱基。任选地，结合相互作用可在使所述聚合酶与引发的模板核酸之间的二元相互作用不稳定的条件下执行。任选地，结合相互作用可在使所述聚合酶、所述引发的模板核酸与下一正确核苷酸之间的三元相互作用稳定化的条件下执行。在检查之后，洗涤去除了未结合的核苷酸和聚合酶，并且催化浓度的Co2+添加至反应中以诱导焦磷酸盐(PPi)裂解和核苷酸掺入。任选地，洗涤缓冲液包含非催化量的Co2+以维持所述三元复合物的稳定性，从而防止所述三元复合物的解离。所述反应可重复，直至获得所需的序列读段长。
任选地，催化金属离子可促进闭合复合物的形成，而非后续核苷酸掺入和闭合复合物释放。任选地，反应混合物中的0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μM Mg2+浓度可诱导聚合酶的构象改变以形成闭合复合物，而非后续核苷酸掺入、PPi和闭合复合物释放。任选地，Mg2+浓度为约0.5μM至约10μM、约0.5μM至约5μM、约0.5μM至约4μM、约0.5μM至约3μM、约μM至约5μM、约1μM至约4μM和约1μM至约3μM。
任选地，所述测序反应中允许核苷酸掺入所必需的可用催化金属离子的浓度为约0.001mM至约10mM、约0.01mM至约5mM、约0.01mM至约3mM、约0.01mM至约2mM、约0.01mM至约1mM、约0.05mM至约10mM、约0.05mM至约5mM、约0.05mM至约3mM、约0.05至约2mM或约0.05mM至约1mM。任选地，催化金属离子的浓度为5mM至50mM。任选地，催化金属离子的浓度为5mM至15mM或约10mM。
非催化离子可在任何阶段，包括在以下反应步骤中的任一者之前、期间或之后添加至反应混合物中：提供引发的模板核酸、提供聚合酶、形成二元复合物、提供核苷酸、形成化学前闭合复合物、核苷酸掺入、形成易位前闭合复合物和形成易位后构象。非催化离子可在洗涤步骤期间添加至反应混合物中。非催化离子可在整个反应中存在于反应混合物中。例如，催化离子以稀释所述非催化金属离子的浓度添加至反应混合物中，从而允许核苷酸掺入。
催化和非催化离子调节核苷酸掺入的能力可取决于反应混合物中的条件，包括但不限于pH、离子强度、螯合剂、化学交联、经过修饰的聚合酶、不可掺入的核苷酸、机械或振动能和电场。
任选地，所述测序反应中允许闭合复合物形成而不允许核苷酸掺入所必需的非催化金属离子的浓度为约0.1mM至约50mM、约0.1mM至约40mM、约0.1mM至约30mM、约0.1mM至约20mM、约0.1mM至约10mM、约0.1mM至约5mM、约0.1至约1mM、约1mM至约50mM、约1至约40mM、约1mM至约30mM、约1mM至约20mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM、约2mM至约30mM、约2mM至约20mM、约2mM至约10mM，或这些范围内的任何浓度。
闭合复合物可通过添加聚合酶抑制剂至所述检查反应混合物中来形成和/或稳定化。抑制剂分子膦酸乙酸酯(膦酸乙酸)和膦酸甲酸酯(膦酸甲酸，普通名称Foscarnet)、苏拉明、氨基糖苷、INDOPY-1和Tagetitoxin是聚合酶活性的无竞争性或非竞争性抑制剂的非限制性实例。所述抑制剂分子在所述酶的活性位点附近的结合会在核苷酸掺入循环的易位前或易位后步骤中俘获所述聚合酶，从而在核苷酸的掺入之前或之后使所述聚合酶呈其闭合复合物构象稳定化，并且迫使所述聚合酶结合至所述模板核酸，直至所述抑制剂分子通过去除、稀释或螯合无法用于反应混合物中。
因此，提供一种用于对模板核酸分子测序的方法，所述方法包括检查步骤，其包括提供用引物引发的模板核酸分子；使所述引发的模板核酸分子与包含聚合酶、聚合酶抑制剂和至少一种未标记的核苷酸分子的第一反应混合物接触；监测在所述未标记的核苷酸分子存在下所述聚合酶与所述引发的模板核酸分子的相互作用，但未将所述核苷酸掺入所述引发的模板核酸分子的引物中；和通过监测的相互作用鉴别与所述引发的模板核酸分子的下一碱基互补的核苷酸。所述聚合酶抑制剂防止未标记的核苷酸分子掺入引物模板核酸的引物中。任选地，所述抑制剂是非竞争性抑制剂、变构抑制剂或无竞争性变构抑制剂。任选地，所述聚合酶抑制剂与所述聚合酶中的催化离子结合位点竞争。
检测平台：用于检测闭合复合物的仪表
在核苷酸存在下所述聚合酶与所述模板核酸之间的相互作用可不使用外源标记来监测。例如，所述测序反应可通过检测折射率改变、电荷检测、拉曼散射检测、椭圆光度法检测、pH检测、大小检测、质量检测、表面等离子体共振、导引模式共振、纳米孔光学干涉术、回音壁模式共振、纳米粒子散射、光子晶体、石英晶体微天平、生物层干涉术、振动检测、压力检测和检测归因于具有模板核酸的闭合复合物中的聚合酶结合而添加的质量或折射率的其它无标记检测方案来监测。
任选地，检测折射率改变是通过一种方式或方式的组合来实现，所述方式包括但不限于表面等离子体共振传感、局部等离子体共振传感、等离子体-光子耦合传感、通过亚波长纳米孔的传输传感(增强的光传输)、光子晶体传感、干涉术传感、折射传感、导引模式共振传感、环形共振器传感或椭圆光度法传感。任选地，核酸分子可局部化至表面，其中在多种核苷酸存在下聚合酶与核酸的相互作用可作为局部折射率的改变来测量。
任选地，所述模板核酸被系栓至或适当地局部化于表面上或附近，使得在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的相互作用会改变通过所述表面传输或从所述表面反射的光。所述表面可含有纳米结构。任选地，所述表面能够维持等离子体或等离子体共振。任选地，所述表面是光子衬底，不限于共振腔、共振环或光子晶体平板。任选地，所述表面是导引模式共振传感器。任选地，所述核酸被系栓至或适当地局部化于纳米孔阵列、纳米粒子或微粒上或附近，使得在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸的相互作用会改变与所述微粒或纳米粒子相互作用的光的吸光度、散射、反射或共振。
任选地，金表面上的纳米孔阵列用作折射率传感器。所述模板核酸可通过标准硫醇化学附接至金属表面，从而将硫醇基掺入用于PCR反应中的引物之一上以扩增DNA。当所述纳米孔阵列的尺寸针对入射光进行适当调整时，在核苷酸存在下所述聚合酶与所述模板核酸的结合可作为通过所述纳米孔传输的光的改变来监测。关于经过标记和无标记方案两者，平衡信号强度的简单并且直接测量可揭露稳定闭合复合物的形成。
任选地，核酸分子局部化至能够维持表面等离子体的表面，其中由聚合酶与局部化核酸的相互作用引起的折射率改变可通过表面等离子体的特性的改变来监测，其中进一步，表面等离子体的所述特性可包括表面等离子体共振。表面等离子体、局部化表面等离子体(LSP)或表面等离子体极化激元(SPP)由电磁波与表面电荷的等离子体振荡的耦合引起。LSP被限制于纳米粒子表面，而SPP被限制于高电子密度表面，在高电子迁移率表面与电介质之间的界面处。表面等离子体可沿所述界面的方向传播，而其仅以倏逝方式穿透至电介质中。当入射电磁辐射的频率与表面电子的天然振荡频率匹配时，建立表面等离子体共振条件。所述界面处例如归因于结合或分子拥挤的介电特性改变会影响表面电子的振荡，由此改变表面等离子体共振波长。能够表面等离子体共振的表面以非限制性方式包括纳米粒子、纳米粒子的簇和聚集体、连续平坦表面、纳米结构化表面和微米结构化表面。如金、银、铝、高传导率金属氧化物(例如，氧化铟锡、氧化锌、氧化钨)等材料能够在其表面处支持表面等离子体共振。
任选地，单一核酸分子或核酸的多个克隆拷贝附接至纳米粒子，使得聚合酶与所述核酸的结合引起局部化表面等离子体共振(LSPR)的转变。入射至纳米粒子上的光会诱导其中的传导电子以取决于纳米粒子的大小、形状和组成的共振频率共同振荡。所关注的纳米粒子可采用不同形状，包括球形纳米粒子、纳米棒、纳米金字塔、纳米金刚石和纳米盘。由于这些LSPR模式，所述纳米粒子强烈地吸收并且散射光，使得单一纳米粒子容易使用暗视野(光散射)显微法肉眼观察到。例如，单一80-nm银纳米球以3×10-2m2的散射横截面散射445-nm蓝光，比荧光素分子的荧光横截面大一百万倍，并且比用荧光素填充至自猝灭限制的相似大小的纳米球的横截面大一千倍。任选地，所述纳米粒子是等离子体共振粒子，其被配置为超亮、纳米大小的光散射体，具有在可见光谱中无论何处的散射峰值。等离子体共振粒子是有利的，因为其不脱色。任选地，制备等离子体共振粒子，用模板核酸涂布，并且提供于包含聚合酶和一种或多种核苷酸的反应混合物中，其中检测聚合酶-模板核酸-粒子相互作用。上述步骤中的一者或多者可基于或源于由Schultz等人在PNAS 97:996-1001(2000)中公开的一种或多种方法，其以引用的方式整体并入本文中。
在共振波长处的极大消光系数使得贵金属纳米粒子能够用作用于近表面相互作用的极强烈标记。任选地，聚合酶与纳米粒子局部化DNA的相互作用导致共振波长的转变。归因于结合或结合相互作用的共振波长的改变可以多种方式之一测量。任选地，通过波长范围扫描照明以鉴别在成像器件中观察到最大散射时所处的波长。任选地，宽带照明与所述成像器件附近的色散元件结合使用，使得以光谱法鉴别共振峰值。任选地，所述纳米粒子系统可在其共振波长处或其共振波长附近进行照明，并且任何结合相互作用均可作为当新的共振波长远离照明波长移位时散射的光的强度降低来观察。视照明波长的定位而定，相互作用甚至可表现为当共振峰值朝向照明波长移位时散射的纳米粒子的增加。任选地，DNA附接的纳米粒子可局部化至表面，或替代地，所述DNA附接的纳米粒子可悬浮于溶液中。使用纳米粒子进行生物传感的全面回顾由Anker等人描述于Nature Materials 7:442-453(2008)中，其以引用的方式整体并入本文中。
任选地，能够LSPR的纳米特征以光刻法图案化于平坦衬底上。纳米特征的两维图案化在大量不同核酸分子的多重和高通量分析方面具有优势。任选地，金纳米柱是用于聚合酶-模板核酸相互作用的表面等离子体共振成像检测的衬底，其中所述核酸附接至所述纳米柱。纳米结构大小和时期可影响表面等离子体共振信号增强，任选地，当与对照膜相比时提供2、3、4、5、6、7、8倍或更多倍信号扩增。
任选地，表面等离子体共振可在平坦表面中维持。基于Kretschmann配置(例如Biacore,Uppsala,Sweden)和表面等离子体共振成像(例如GWC Technologies；Madison,WI；或Horiba；Kyoto,Japan)的多种商业仪器是可用的，并且具有充分确立的方案用于使DNA作为单一光点和以多重阵列模式附接至其表面。在Kretschmann配置中，金属膜(典型地是金)蒸发至棱镜的侧面上并且入射辐射以一定角度发射以激发表面等离子体。倏逝波穿透所述金属膜，在另一侧面上激发等离子体，其中其可用于监测所述金膜附近的近表面和表面相互作用。在共振角处，从棱镜-金界面反射的光急剧地减弱。假定固定波长照明，结合相互作用可通过监测在接近所述共振角的固定角处反射的光的强度，以及通过监测建立表面等离子体共振条件(最小反射率)所需的入射角的改变来进行检查。当使用如CCD或CMOS相机等2D成像器件来监测反射的光时，整个照明区域可以高分辨率成像。这种方法被称为表面等离子体共振成像(SPRi)。其允许同时对所述表面上的独立区进行高通量分析。也可在固定角配置中使用宽带照明，其中与表面等离子体共振结合的波长以光谱法通过在反射光谱中寻找倾角来鉴别。表面相互作用通过共振波长的转变来监测。
表面等离子体共振是用于监测蛋白质-核酸相互作用的充分确立的方法，并且存在多种用于核酸附接以及用于分析数据两者的标准方案。来自所述文献的说明性参考文献包括Cho等人,“Binding Kinetics of DNA-Protein Interaction Using SurfacePlasmon Resonance,”Protocol Exchange,2013年5月22日；和Brockman等人,“AMultistep Chemical Modification Procedure To Create DNA Arrays on GoldSurfaces for the Study of Protein-DNA Interactions with Surface PlasmonResonance Imaging,”Journal of the American Chemical Society 121:8044-51(1999)，其均以引用的方式整体并入文中。
聚合酶/核酸相互作用可在能够维持局部化表面等离子体的纳米结构化表面上进行监测。任选地，聚合酶/核酸相互作用可在能够维持表面等离子体极化激元的纳米结构化表面上进行监测。
任选地，聚合酶/核酸相互作用可在能够维持局部化表面等离子体的纳米结构化表面上进行监测。任选地，聚合酶/核酸相互作用可在能够维持表面等离子体极化激元的纳米结构化表面上进行监测。
任选地，通过纳米孔的超常光传输(EOT)可用于监测核酸/聚合酶相互作用。通过等离子体金属膜中的亚波长纳米孔传输的光高于从经典电磁理论所预期。这种增强的光传输可通过考虑与入射辐射耦合的等离子体共振来解释，由此在共振波长下，大于预期部分的光通过所述金属纳米孔传输。所述增强的光传输取决于所述纳米孔的尺寸和间距、所述金属的特性以及在具有所述纳米孔的金属膜的任一侧面上的介质的介电特性。在生物传感器的背景中，金属纳米孔阵列的透射率取决于接触所述金属膜的介质的折射率，由此例如，聚合酶与附接至金属表面的核酸的相互作用可作为通过所述纳米孔阵列传输的光的强度的改变来监测。可使用极致密光学装置和成像元件来使用当使用表面等离子体共振的EOT/等离子体纳米孔阵列方法时的仪表和对齐需求。低功率LED照明和CMOS或CCD相机可足以实施稳健EOT等离子体传感器。示例性的基于纳米孔阵列的表面等离子体共振传感器件由Escobedo等人描述于“Integrated Nanohole Array Surface Plasmon ResonanceSensing Device Using a Dual-Wavelength Source,”Journal of Micromechanics andMicroengineering 21:115001(2011)中，其以引用的方式整体并入本文中。
所述等离子体纳米孔阵列可在沉积于玻璃表面上的金的光学不透明层(大于50nm厚度)图案化。任选地，所述等离子体纳米孔阵列可在沉积于玻璃上的铝或银的光学厚膜上图案化。任选地，所述纳米孔阵列在沉积于低折射率塑料上的光学厚金属层上图案化。使等离子体纳米孔阵列在低折射率塑料上图案化通过使所述金属层的两个侧面上的折射率更好匹配来增强所述器件对折射率改变的灵敏性。任选地，所述纳米孔阵列的折射率灵敏性通过增加孔之间的距离而增加。任选地，纳米孔阵列通过复制，例如通过压纹、铸造、压印光刻或模板剥离来制造。任选地，纳米孔阵列通过自我组装使用胶体来制造。任选地，纳米孔阵列通过投影直接图案化，如激光干涉光刻来制造。
纳米桶配置可优于纳米孔配置。在纳米孔配置中，所述纳米特征的底部是玻璃或塑料或其它适当电介质，而在纳米桶配置中，所述纳米特征的底部包含等离子体金属。纳米桶阵列有利地相对容易制造，同时维持对局部折射率的传输灵敏性。
任选地，纳米孔阵列等离子体传感与以廉价方式用于大区域成像的无透镜全息成像组合。任选地，等离子体生物传感平台包括具有纳米孔阵列的等离子体芯片、配置成对所述芯片照明的发光二极管来源和记录纳米孔的衍射图的CMOS成像器芯片，所述CMOS成像器芯片通过表面上的分子结合事件加以调节。所述结合事件可以是在核苷酸存在下聚合酶与模板核酸之间的闭合复合物形成。
使用于表面等离子体共振传感的表面(用于核酸附接)功能化的方法可直接地应用于EOT纳米孔阵列，因为两种传感方案使用相似的需要附接核酸的金属表面。
任选地，与聚合酶/核酸相互作用相关的折射率改变可在不支持等离子体的纳米结构化表面上进行监测。任选地，导引模式共振可用于监测聚合酶/核酸相互作用。导引模式共振或波导模式共振是其中可通过引入相位匹配元件(如衍射光栅或棱镜)来激发并且同时引出光波导的导引模式的现象。所述导引模式还称作“泄漏模式”，因为其不保持导引并且已经在一维和两维光子晶体平板中观察到。导引模式共振可被视为彼此相邻或在彼此的顶部上放置的两个光学结构的衍射模式与波导模式的耦合。例如，关于放置于光波导的顶部上的衍射光栅，所述衍射模式之一可精确地耦合至所述光波导的导引模式，导致那一模式沿所述波导传播。关于非共振条件，光未耦合至所述波导中，因此所述结构看来可完全透明(如果使用介电波导)。在共振下，共振波长强烈地耦合至所述波导中并且可视光栅-波导界面下游的元件而从所述结构中耦合出来。在其中光栅耦合器在所述波导的整个表面上延伸的情况下，光无法被导引，因为其中耦合的任何光均在下一光栅元件处耦合出来。因此，在光栅波导结构中，共振作为强反射峰被观察到，而所述结构对于非共振条件是透明的。所述共振条件取决于入射光的角、光栅特性、极化和波长。关于其中导引模式传播例如归因于光栅耦合至所述波导的整个表面而不存在的情况，鉴于在波导层的横向方向中辐射的强烈光学限制和倏逝传播，共振模式也可称作泄漏模式共振。光栅附近例如归因于生物分子的结合的介电特性改变会影响耦合至所述波导中，由此改变共振条件。任选地，在核酸分子附接至光栅波导结构的表面的情况下，聚合酶/核酸相互作用可作为泄漏模式共振的波长改变来监测。
衍射元件可直接地用于透明衬底上，而无关于波导元件的明确需要。归因于光栅纳米结构附近的相互作用的共振条件改变可作为所反射或所传输的辐射的共振波长转变来监测。
从核酸附接的导引模式共振传感器反射的光可用于监测聚合酶/核酸相互作用。宽带照明来源可用于照明，并且反射的光的光谱检查可能揭露归因于聚合酶结合的局部折射率改变。
任选地，可使用宽带照明并且可检查传输的光以鉴别归因于聚合酶相互作用的共振转变。可使用线性极化的窄带照明，并且传输的光可通过交叉极化器过滤；其中传输的光归因于交叉极化器完全地减弱，除了泄漏模式反应，其极化经过修饰。这一实施方案将折射率监测转化为简单传输分析，所述分析可在廉价成像系统上进行监测。公开材料描述了光学组件的组合件。参见Nazirizadeh等人,“Low-Cost Label-Free Biosensors UsingPhotonic Crystals Embedded between Crossed Polarizers,”Optics Express 18:19120-19128(2010)，其以引用的方式整体并入本文中。
除了纳米结构化表面以外，平坦、未结构化表面也可有利地用于监测折射率调节。任选地，干涉术可用于监测聚合酶与结合至未结构化、光学透明衬底的核酸的相互作用。核酸分子可通过本领域中已知的任何方式附接至载玻片的顶部表面，并且所述系统从所述载玻片的底部表面照明。在这种配置中存在两个反射表面，一个反射来自所述载玻片的底部表面，并且另一反射来自已经附接有核酸分子的顶部表面。所述两个反射的波可基于路径长度差异彼此干涉，引起建设性或破坏性干涉，其中从所述顶部表面反射的波通过归因于所结合的核酸分子的介电常数改变(并且随后通过聚合酶与所结合的核酸分子的相互作用)来调节。在来自所述底部表面的反射未改变的情况下，与核酸分子的任何结合均可以从所述顶部和底部表面反射的波束之间的相差反映，所述相差又会影响所观察到的干涉模式。任选地，使用生物层干涉术来监测核酸/聚合酶相互作用。生物层干涉术可在商业器件上执行，如由Pall Forte Bio corporation(Menlo Park,CA)销售的那些。
任选地，从所述顶部表面反射的光通过使用聚焦光学装置选择性地加以选择。从所述底部表面反射的光被忽视，因为其不在焦平面中。仅聚焦于核酸附接的顶部表面时，通过所述聚焦透镜所收集的光包括平面波，对应于部分反射的入射辐射；和散射波，对应于由所述焦平面中的分子在收集方向中散射的辐射。如果所述入射辐射是连贯的，那么可产生这两种组分来进行干涉。基于干涉术检测的这种散射是极端灵敏的并且可用于检测直至单一蛋白分子。
任选地，场效应晶体管(FET)被配置为用于闭合复合物的检测的生物传感器。所述FET的栅极引出线通过添加模板核酸来修饰。包含带电标签的聚合酶的结合导致电化学信号的改变。具有下一正确核苷酸的聚合酶与所述模板核酸的结合会提供不同于在其它不正确核苷酸存在下与模板核酸结合的聚合酶的信号，其中各不正确核苷酸也可提供不同信号。任选地，聚合酶与模板核酸的相互作用使用FET而不使用所述聚合酶、引发的模板核酸或核苷酸上的外源标记来监测。任选地，使用FET来检测归因于掺入反应期间的H+离子释放的pH改变。任选地，所述聚合酶包含产生连续H+离子的标签，所述连续H+离子通过FET来检测。任选地，所述产生连续H+离子的标签是ATP合酶。任选地，所述连续H+离子产生标签是钯、铜或另一催化剂。任选地，使用FET来检测核苷酸掺入之后的PPi释放。例如，每次可向反应提供一种类型的核苷酸。一旦添加了下一正确核苷酸并且条件允许掺入，使PPi裂解，释放，并且使用FET来检测，因此鉴别下一正确核苷酸和下一碱基。任选地，模板核酸结合至纳米管的壁。任选地，聚合酶结合至纳米管的壁。FET有利地用作测序传感器，这归因于其小型和轻重量，从而使其适合用作便携式测序监测组件。分子相互作用的FET检测的细节由Kim等人描述于“An FET-Type Charge Sensor for Highly Sensitive Detection of DNASequence,”Biosensors and Bioelectronics,Microsensors and Microsystems 20:69-74(2004),doi:10.1016/j.bios.2004.01.025中；并且由Star等人描述于“ElectronicDetection of Specific Protein Binding Using Nanotube FET Devices,”NanoLetters 3:459-63(2003),doi:10.1021/nl0340172中，其以引用的方式整体并入本文中。
举例说明，所述聚合酶包含荧光标签。为了以高信噪比监测聚合酶-核酸相互作用，可使用倏逝照明或共焦成像。局部化模板核酸上的闭合复合物形成可例如作为与本底相比增加的荧光观察到，而在一些情况下，其也可作为归因于局部极性环境中的猝灭或改变而减少的荧光观察到。任选地，一部分聚合酶分子可用荧光团标记，而另一部分可用同一反应混合物中的猝灭剂标记；其中，核酸的局部化、克隆群体上的闭合复合物形成作为与本底相比荧光的减少而揭露。核酸的克隆群体可附接至支撑表面，如平坦衬底、微粒或纳米粒子。任选地，聚合酶用荧光团、发光团、化学发光团、发色团或生物发光团标记。
任选地，多种模板核酸被系栓至表面并且一种(或多种)dNTP依序流动。亲和力的范围揭露了下一正确核苷酸的身份并且因此揭露了模板核酸中的下一碱基。任选地，测量亲和力，而无需去除和替代反应混合物条件(即，洗涤步骤)。所述结合相互作用的测量强度的自相关性例如可能容易地揭露核酸序列的动力学。任选地，检查包括监测在核苷酸存在下所述聚合酶与所述引发的模板核酸的亲和力。任选地，所述聚合酶短暂地与所述核酸结合并且结合动力学和亲和力提供了关于模板核酸上的下一碱基的身份的信息。任选地，形成闭合复合物，其中闭合复合物的形成所牵涉的反应条件提供关于所述核酸上的下一碱基的信息。任选地，所述聚合酶在其相互作用中的聚合位点处被俘获，因此揭露了亲和力，而无需洗涤步骤来测量解离速率。
可测量聚合酶与核酸之间的动态相互作用的任何技术均可用于测量亲和力并且使得能够执行本文所公开的测序反应方法。
用于检测核苷酸特异性三元复合物形成的系统
所提供的方法可使用平台来执行，其中核酸聚合反应的任何组分均局部化至表面。任选地，所述模板核酸附接至平坦衬底、纳米孔阵列、微粒或纳米粒子。任选地，所有反应组分均自由地悬浮于反应混合物中，并且未固定至固体支撑衬底。
任选地，所述模板核酸固定至表面。所述表面可以是平坦衬底、水凝胶、纳米孔阵列、微粒或纳米粒子。任选地，所述反应混合物含有多种克隆扩增的模板核酸分子。任选地，所述反应混合物含有多种可区别的模板核酸。
本文尤其提供用于执行测序反应的系统，其涉及检查在核苷酸存在下聚合酶与引发的模板核酸之间的相互作用以通过一种方式或方式的组合鉴别模板闭合复合物中的下一碱基，所述方式包括但不限于聚合酶域的交联、使所述聚合酶与所述核酸交联、由小分子、非竞争性抑制剂、竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂和变性引起的变构抑制；其中被俘获的聚合酶复合物的形成提供关于所述核酸模板上的下一碱基的身份的信息。
还提供一种用于执行本文所公开的任何测序方法的一个或多个步骤的系统。任选地，所述系统包括在核苷酸存在下执行聚合酶和模板核酸结合分析所必需的组件和试剂，其中所述模板核酸提供于纳米结构上。任选地，所述系统包括使模板DNA分子结合至纳米结构上所必需的一种或多种试剂和说明书。例如，所述系统提供经过配置以与表面等离子体共振一起用于测定结合动力学的纳米结构，如芯片。所述芯片的一个实例是CM5Sensor S芯片(GE Healthcare；Piscatawany,N.J.)。所述系统可提供如表面等离子体共振仪器等仪表。所述系统可提供链霉亲和素和/或生物素。任选地，所述系统提供生物素-DNA、DNA连接酶、缓冲液和/或用于制备生物素化的模板DNA的DNA聚合酶。任选地，所述系统提供用于生物素化的DNA纯化的凝胶或试剂(例如，苯酚:氯仿)。或者，所述系统提供用于生物素化的模板DNA表征(例如，质谱分析或HPLC)的试剂。任选地，所述系统包括链霉亲和素、芯片、试剂、仪表和/或关于使链霉亲和素固定于芯片上的说明书。任选地，芯片提供于已经配置用于模板DNA涂布的系统中，其中所述芯片用能够结合模板核酸或经过修饰的模板核酸(例如，生物素化的模板DNA)的试剂固定。任选地，所述系统提供用于芯片再生的试剂。
还提供一种用于执行本文所公开的任何测序方法的一个或多个步骤的系统。任选地，所述系统包括在核苷酸存在下执行聚合酶和模板核酸结合分析所必需的组件和试剂，其中所述模板核酸提供于纳米粒子上。任选地，所述系统包括使模板DNA分子结合至纳米粒子上所必需的一种或多种试剂和说明书。所述纳米粒子可经过配置用于例如通过使用金纳米粒子对核酸-聚合酶相互作用进行电化学检测。任选地，DNA-纳米粒子结合物在金胶体水溶液与模板DNA分子之间形成，所述模板DNA分子在其末端处包含例如游离硫醇或二硫化物基团。所述结合物可包含相同核酸序列。任选地，所述纳米粒子结合物在高温(例如，高于60℃)和高离子强度(例如，1M Na+)下针对絮凝和沉淀稳定化。任选地，所述系统提供用于制备用于纳米粒子附接的模板DNA分子的试剂，包括用二硫化物或硫醇产生模板DNA分子。含二硫化物的模板核酸可使用例如3'-硫醇修饰剂控制的多孔玻璃(CPG)或通过以通用支撑CPG开始并且添加二硫化物修饰剂亚磷酰胺作为序列中的第一单体来合成。所述系统可提供核酸合成试剂和/或关于获得二硫化物修饰的模板核酸的说明书。含硫醇的模板核酸也可在核酸合成期间用5'-三苯甲基修饰剂亚磷酰胺产生。所述系统可提供关于使用例如电泳或离心进行纳米粒子结合物纯化的试剂和/或说明书。任选地，使用纳米粒子结合物以比色法监测聚合酶-模板核酸相互作用。在这种情况下，纳米粒子结合物的熔化温度在强烈聚合酶结合存在下增加。因此，DNA结合的强度可通过这一融化转变的改变来测定，所述融化转变的改变可通过颜色改变来观察。所述系统任选地提供用于所述融化转变的检测的试剂和设备。
还提供一种用于执行本文所公开的任何测序方法的一个或多个步骤的系统。任选地，所述系统包括在核苷酸存在下使用可检测聚合酶执行聚合酶和模板核酸结合分析所必需的组件和试剂。任选地，所述聚合酶经过可检测标记。任选地，所述聚合酶使用所述聚合酶的固有特性(例如，芳族氨基酸)来检测。任选地，存在于所述系统中的聚合酶和模板核酸经过配置用于溶液，而未结合至支撑物。所述聚合酶上的可检测标记可以是荧光团，其荧光用于监测聚合酶-模板核酸结合事件。任选地，所述可检测聚合酶可以与溶液中的模板核酸，或结合至支撑结构的模板核酸组合使用。任选地，所述聚合酶的一个或多个半胱氨酸残基用Cy3-顺丁烯二酰亚胺标记。任选地，所述系统包含制备荧光标记的聚合酶分子所必需的试剂和/或说明书。所述系统可包含用于荧光标记的聚合酶的纯化的试剂和/或说明书。
所述方法的程序特征
在其中下一碱基的身份已经通过闭合复合物的形成加以鉴别的检查步骤之后，反应条件可以在适当时经过重设、再装填或修饰，准备用于任选的掺入步骤或额外的检查步骤。任选地，下一碱基的身份已经在未以化学方式掺入核苷酸的情况下加以鉴别。任选地，下一碱基的身份在以化学方式掺入核苷酸的情况下加以鉴别，其中后续核苷酸掺入已经受到抑制。任选地，除了正在测序的模板核酸以外，所述检查步骤的所有组分均被去除或洗掉，从而使所述系统恢复检查前条件。任选地，所述检查步骤的部分组分被去除。任选地，额外组分添加至所述检查步骤中。
任选地，可逆终止子核苷酸用于所述掺入步骤中以确保每个循环掺入一种并且仅一种核苷酸。可逆终止子核苷酸上无需标记，因为从所述检查步骤已知碱基身份。未荧光标记的可逆终止子容易从商业供应商获得。预期未标记的可逆终止子核苷酸归因于其较小的空间足迹和与天然核苷酸相似的大小而与经过标记的可逆终止子相比具有快得多的动力学。
本文部分地公开试剂循环测序方法，其中测序试剂一个接一个被引入，用于检查和/或掺入的每个循环。任选地，测序反应混合物包含聚合酶、引发的模板核酸和至少一种类型的核苷酸。任选地，所述核苷酸和/或聚合酶循环地被引入测序反应混合物中。任选地，测序反应混合物包含多种聚合酶、引发的模板核酸和核苷酸。任选地，多种核苷酸和/或多种聚合酶循环地被引入测序反应混合物中。任选地，所述测序反应的检查步骤具有不同于所述测序反应的掺入步骤的组成。
任选地，一种或多种核苷酸依序添加至测序反应中并且从测序反应去除。任选地，1、2、3、4种或更多种类型的核苷酸添加至反应混合物中并且从反应混合物去除。例如，一种类型的核苷酸添加至测序反应中，被去除，并且由另一类型的核苷酸替代。任选地，在所述检查步骤期间存在的核苷酸类型不同于在所述掺入期间存在的核苷酸类型。任选地，在一个检查步骤期间存在的核苷酸类型不同于在相继检查步骤期间(即，所述相继检查步骤在掺入步骤之前执行)存在的核苷酸类型。任选地，1、2、3、4种或更多种类型的核苷酸存在于检查反应混合物中并且1、2、3、4种或更多种类型的核苷酸存在于掺入反应混合物中。
任选地，聚合酶循环地添加至测序反应中并且从测序反应去除。一种或多种不同类型的聚合酶可循环地添加至测序反应中并且从测序反应去除。任选地，在所述检查步骤期间存在的聚合酶类型不同于在所述掺入期间存在的聚合酶类型。在一个检查步骤期间存在的聚合酶类型可不同于在相继检查步骤期间(即，所述相继检查步骤在掺入步骤之前执行)存在的聚合酶类型。
任选地，如试剂的存在、pH、温度和离子强度等条件在所述测序反应过程中变化。任选地，金属循环地添加至测序反应中并且从测序反应去除。例如，催化金属离子可不存在于检查步骤期间并且存在于掺入步骤期间。或者，聚合酶抑制剂可存在于检查步骤期间并且不存在于掺入步骤期间。任选地，在所述测序反应期间消耗的反应组分在所述测序反应期间的任何时刻通过添加新的组分来补充。
核苷酸可每次以一种类型与所述聚合酶一起添加至促进闭合复合物形成的反应条件中。如果存在下一正确核苷酸，那么所述聚合酶仅结合至所述模板核酸。在每一次核苷酸添加之后的洗涤步骤确保了所有未牵涉于闭合复合物中的过量聚合酶和核苷酸均从反应混合物中去除。如果所述核苷酸以已知顺序一次添加一种，那么所述模板核酸上的下一碱基通过当所添加的核苷酸是下一正确核苷酸时形成闭合复合物来确定。所述闭合复合物可通过构象改变和所述聚合酶-模板核酸-核苷酸相互作用的增加的稳定性两者来鉴别。任选地，在下一正确核苷酸存在下形成的闭合复合物的稳定性至少比在不正确核苷酸存在下所述聚合酶与所述模板核酸的不稳定相互作用大一个数量级。洗涤步骤的使用确保了不存在未结合的核苷酸和聚合酶并且存在于反应中的唯一核苷酸是被隔绝于具有聚合酶和模板核酸的闭合复合物中的那些。一旦所述模板核酸上的下一碱基被确定，被隔绝于所述闭合复合物中的下一正确核苷酸可通过在有利于所述闭合复合物的解离或不稳定化的反应条件中流动并且使模板核酸引物链延伸一个碱基(掺入)而得以掺入。因此，所述洗涤步骤确保了所掺入的唯一核苷酸是所述闭合复合物的下一正确核苷酸。这种试剂循环方法可重复并且可测定核酸序列。这种试剂循环方法可应用于单一模板核酸分子，或应用于克隆群体的集合，如PCR产物或滚环扩增的DNA。如果多种不同模板排列于例如固体支撑物上，那么其可平行地测序。任选地，所述洗涤步骤使二元复合物形成不稳定。任选地，执行所述洗涤持续一段持续时间，所述持续时间确保了所述二元复合物被去除，在反应混合物中留下稳定化闭合复合物。任选地，所述洗涤步骤包括用高离子强度或高pH溶液洗涤反应。
任选地，所述掺入步骤是三阶段过程。在第一阶段中，所有四种核苷酸类型均在有利于闭合复合物的形成的反应条件中被引入包含引发的模板核酸和高保真度聚合酶的反应中，并且使下一正确核苷酸与所述模板核酸形成稳定的闭合复合物。在第二阶段中，过量的核苷酸和未结合的聚合酶被洗掉。在第三阶段中，反应条件经过修饰，使得所述闭合复合物不稳定并且被隔绝于所述闭合复合物内的核苷酸掺入所述模板核酸引物的3'端中。在一种替代方法中，所述第二阶段经过修饰以完全地去除任何高保真度聚合酶和可能已经存在于所述闭合复合物中的同源核苷酸，并且去除的组分接着用第二聚合酶和一种或多种核苷酸(例如，可逆终止子核苷酸)替代。在掺入步骤中形成紧密聚合酶-核酸复合物可通过标准技术实现，所述标准技术如使非特异性DNA结合域融合至所述聚合酶(例如Phusion聚合酶，其可获自Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA)，和使用高浓度的核苷酸来确保正确核苷酸始终存在于所述闭合复合物中。
即使在聚合酶合成反应典型地需要的二价金属离子不存在下，聚合酶分子也会在下一正确核苷酸存在下以指闭合构象结合至引发的模板核酸分子。构象改变将与下一模板碱基互补的核苷酸俘获于所述聚合酶的活性位点内。任选地，所述闭合复合物的形成可用于确定所述模板核酸上的下一碱基的身份。任选地，所述引发的模板核酸可在聚合酶存在下，在催化二价金属离子不存在下，依序与不同核苷酸接触；其中闭合复合物的形成指示了目前与所述模板核酸接触的核苷酸是所述核酸上的下一碱基的互补核苷酸。与所述模板核酸接触的核苷酸(在聚合酶存在下和催化金属离子不存在下)的已知顺序确保了基于诱导闭合复合物形成的顺序中的特定位置容易鉴别所述互补核苷酸。任选地，适当洗涤步骤可在每一次核苷酸添加之后执行以确保去除所有过量的酶和核苷酸，仅留下结合至在活性位点处具有下一正确核苷酸的闭合复合物中的核酸的聚合酶。所述闭合复合物可通过揭露闭合构象中所述聚合酶的构象改变的方式或通过揭露与二元聚合酶-核酸复合物相比或与所述聚合酶、引发的模板核酸与不正确核苷酸之间的不稳定相互作用相比聚合酶/核酸/下一正确核苷酸复合物的增加的稳定性的方式来鉴别。
任选地，鉴别下一互补核苷酸的过程(检查步骤)包括如下步骤：使固定的引发的模板核酸与包括聚合酶和一个种类的核苷酸的检查混合物在抑制所述核苷酸的以化学方式掺入的条件下接触，通过洗涤步骤去除未结合的试剂，检测在固定的核酸上聚合酶闭合复合物的存在或不存在，和用不同种类的核苷酸依序重复这些步骤，直至检测到闭合复合物形成。所述闭合复合物可通过构象改变和所述聚合酶/核酸/下一正确核苷酸复合物的增加的稳定性两者来鉴别。在连续核苷酸添加之间的洗涤步骤可通过使用检测机制来消除，所述检测机制可检测具有高保真度的闭合复合物的形成，例如倏逝波传感方法或选择性地监测来自所述闭合复合物的信号的方法。上文所述的检查步骤可后接掺入步骤，所述掺入步骤包括使所述闭合复合物与催化金属离子接触以将隔绝于所述闭合复合物中的核苷酸共价地添加至所述引物的3'端。任选地，所述掺入步骤可包括使固定的核酸与包含多种类型的核苷酸和聚合酶的掺入前混合物在抑制所述核苷酸的以化学方式掺入的条件下接触；其中所述掺入前混合物可含有添加剂和溶液条件以确保高度有效的闭合复合物形成(例如，低盐条件)。所述方法也可包括执行洗涤步骤来去除未结合的试剂，和向固定的复合物提供包含催化金属离子的掺入混合物，以便以化学方式掺入被隔绝于所述聚合酶的活性位点内的核苷酸。所述掺入前混合物确保了高度有效的闭合复合物形成，而所述洗涤步骤和掺入混合物确保了单一核苷酸添加至所述引物的3'端。任选地，所述掺入步骤可直接地在检查一种类型的核苷酸的添加之后发生。例如，用于测序的重复模式可包括以下流动模式(i)dATP+/聚合酶，(ii)洗涤，(iii)Mg+2，(iv)洗涤，(v)dTTP+/聚合酶，(vi)洗涤，(vii)Mg+2，(viii)洗涤，(ix)dCTP+/聚合酶，(x)洗涤(xi)Mg+2，(xii)洗涤，(xiii)dGTP+/聚合酶，(xiv)洗涤，(xv)Mg+2，(xvi)洗涤。任选地，用于测序的重复模式可包括(i)dATP+/聚合酶，(ii)洗涤，(iii)dTTP+/聚合酶，(iv)洗涤，(v)dGTP+/聚合酶，(vi)洗涤，(vii)dCTP+/聚合酶，(viii)洗涤，(ix)掺入前混合物，(x)洗涤，(xi)Mg，(xii)洗涤。所述洗涤步骤典型地含有金属离子螯合剂和其它小分子以防止所述检查步骤期间的意外掺入。在所述掺入步骤之后，引物链典型地延伸一个碱基。重复这一过程，可鉴别核酸的连续核碱基，从而有效地测定核酸序列。任选地，所述检查步骤在高盐条件下，例如在50mM至1,500mM盐的条件下执行。
关于测序应用，最小化或消除流体和试剂交换可以是有利的。去除泵、阀和试剂容器可允许较小器件的简化制造。本文部分地公开“全体(all-in)”测序方法，其中消除了一个接一个引入试剂，用于检查和/或掺入的每个循环的需要。试剂仅向反应中添加一次，并且通过操纵已经封入测序反应内的试剂来执行边合成边测序。诸如此类方案需要区别不同核酸的方法，在核酸的克隆群体中和/或在不同核酸分子中同步掺入核苷酸的方法，和确保每个循环仅添加一种核苷酸的方法。
任选地，测序反应混合物包含聚合酶、引发的模板核酸和至少一种类型的核苷酸。任选地，测序反应混合物包含多种聚合酶、引发的模板核酸和核苷酸。如本文所提供，聚合酶是指单一聚合酶或多种聚合酶。如本文所提供，引发的模板核酸或模板核酸是指单一引发的模板核酸或单一模板核酸，或多种引发的模板核酸或多种模板核酸。如本文所提供，核苷酸是指一种核苷酸或多种核苷酸。如本文所提供，单一核苷酸是一种核苷酸。任选地，所述测序反应核苷酸包括但不限于以下核苷酸中的1者、2者、3者或4者：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。
任选地，所述检查步骤和所述掺入步骤在单一测序反应混合物中发生。
任选地，1、2、3、4种或更多种类型的核苷酸(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP)同时一起存在于反应混合物中，其中一种类型的核苷酸是下一正确核苷酸。所述反应混合物进一步包含至少一种聚合酶和至少一种引发的模板核酸。任选地，所述模板核酸是模板核酸的克隆群体。任选地，所述聚合酶、引发的模板核酸和所述核苷酸在检查反应条件下形成闭合复合物。
在所提供的方法中，四种类型的核苷酸可以独特并且不同的浓度存在，其中所述聚合酶至所述模板核酸的扩散和结合时间关于所述四种核苷酸中的每一者(其应该是下一正确核苷酸)均不同，这归因于所述四种核苷酸的不同浓度。例如，在最高浓度下的核苷酸将以快速时间结合至所述模板核酸上的其互补碱基，并且在最低浓度下的核苷酸将以较慢时间结合至所述模板核酸上的其互补碱基；其中结合至所述模板核酸上的互补碱基是指闭合闭合复合物中所述聚合酶结合至具有下一正确核苷酸的模板核酸。下一正确核苷酸的身份因此通过监测闭合复合物中聚合酶与模板核酸结合的速率或时间来确定。任选地，所述四种类型的核苷酸可以通过其浓度加以区别，其中不同浓度的核苷酸导致可测量地不同的关于所述聚合酶结合至所述核酸的缔合速率。任选地，所述四种类型的核苷酸可以通过其浓度加以区别，其中不同浓度的核苷酸导致可测量地不同的关于稳定化闭合复合物的形成的缔合速率。
任选地，所述聚合酶经过标记。在一些情况下，所述聚合酶未经过标记(即，不具有外源标记，如荧光标记)并且使用本文所公开或本领域中已知的任何无标记检测方法。任选地，所述聚合酶与所述核酸的结合经由所述聚合酶的可检测特征来监测。任选地，稳定化闭合复合物的形成经由所述聚合酶的可检测特征来监测。所述聚合酶的可检测特征可包括但不限于光学、电学、热学、比色、质量和其任何组合。
任选地，1、2、3、4种或更多种核苷酸类型(例如，dATP、dTTP、dCTP、dGTP)被系栓至1、2、3、4种或更多种不同聚合酶；其中各核苷酸类型被系栓至不同聚合酶并且各聚合酶具有不同外源标记或来自其它聚合酶的可检测特征以使得能够进行其鉴别。所有经过系栓的核苷酸类型可一起添加至测序反应混合物中，从而形成包含经过系栓的核苷酸-聚合酶的闭合复合物；监测所述闭合复合物以鉴别所述聚合酶，由此鉴别系栓所述聚合酶的下一正确核苷酸。所述系栓可在所述核苷酸的γ磷酸酯基处通过多磷酸酯基和连接体分子发生。所述γ磷酸酯基连接方法在本领域中是标准的，其中荧光团附接至γ磷酸酯基连接体。任选地，不同核苷酸类型通过可区别的外源标记来鉴别。任选地，所述可区别的外源标记附接于各核苷酸的γ磷酸酯基位置。
任选地，所述测序反应混合物包含催化金属离子。任选地，所述催化金属离子可用于在所述测序反应中的任何时刻以短暂方式与聚合酶反应。为了确保稳健测序，所述催化金属离子可用于一段短暂时期，从而允许与所述模板核酸中的下一碱基互补的单一核苷酸在掺入步骤期间掺入所述引物的3'端中。在这种情况下，不掺入其它核苷酸，例如与所述模板核酸中的下一碱基下游的碱基互补的核苷酸。任选地，催化金属离子镁以光笼状复合物(例如，DM-Nitrophen)形式存在于所述测序反应混合物中，使得局部化UV照明会释放镁，从而使其可用于所述聚合酶以进行核苷酸掺入。此外，所述测序反应混合物可含有EDTA，其中镁在催化核苷酸掺入之后从聚合酶活性位点释放并且由所述测序反应混合物中的EDTA俘获，由此使得镁不能催化后续核苷酸掺入。
因此，在所提供的方法中，催化金属离子可以螯合或笼状形式存在于测序反应中，其可通过触发因素从所述形式释放。例如，所述催化金属离子催化闭合复合物下一正确核苷酸的掺入，并且当所述催化金属离子从活性位点释放时，其由第二螯合剂或笼化剂隔绝，使得所述金属离子无法催化后续掺入。所述催化金属离子从其螯合或笼化复合物局部释放是通过使用局部化解笼锁或脱除螯合方案，如倏逝波照明或结构化照明来确保。所述催化金属离子的控制释放可例如通过热学方式发生。所述催化金属离子从其光笼化复合物控制释放可通过受限光场，例如通过倏逝照明(如波导)或全内反射显微法在所述模板核酸附近局部地释放。所述催化金属离子的控制释放可例如通过改变在所述模板核酸附近的溶液的pH而发生。如EDTA和EGTA等螯合剂是pH依赖性的。在低于5的pH下，二价阳离子Mg2+和Mn2+未由EDTA有效地螯合。可控制地操纵在所述模板核酸附近的pH的方法允许催化金属离子从螯合剂控制释放。任选地，局部pH改变通过向附接所述核酸的表面施加电压来诱导。所述pH方法提供如下优势，即当pH恢复至螯合范围时，金属回归其螯合形式。
任选地，催化金属离子强烈地结合至所述聚合酶的活性位点，使得有必要在单一核苷酸掺入之后从所述模板核酸去除所述聚合酶。聚合酶的去除可以通过使用高度分配型聚合酶来实现，所述高度分配型聚合酶在每一种核苷酸的添加之后离开正在合成的链(例如，引物)的3'端。未结合的聚合酶可进一步经受电场或磁场以从所述核酸分子的附近去除。结合至所述聚合酶的任何金属离子均可由存在于测序反应混合物中的螯合剂，或由与所述金属离子竞争结合至所述聚合酶的活性位点而不扰乱闭合复合物的形成的分子隔绝。从所述模板核酸去除或移动所述聚合酶的力(例如，电场、磁场和/或螯合剂)可终止，从而允许所述聚合酶接近所述模板核酸以用于另一轮测序(即，检查和掺入)。在一个非限制性实例中，下一轮测序包括形成闭合复合物，从所述模板核酸和/或闭合复合物的附近去除未结合的聚合酶，控制催化金属离子的释放以掺入被隔绝于所述闭合复合物内的单一核苷酸，从所述模板核酸的附近去除在单一掺入之后与所述模板核酸解离的聚合酶，通过使用螯合剂或竞争性结合剂隔绝任何游离的催化金属离子，和使所述聚合酶接近所述模板核酸以执行下一测序循环。
上文描述用于核酸序列的鉴别的聚合酶-核酸结合反应。然而，核酸序列鉴别可包括关于核酸修饰(包括甲基化和羟基甲基化)的信息。甲基化可在模板核酸的胞嘧啶碱基上发生。DNA甲基化可稳定地改变基因的表达。DNA甲基化也在多种类型的癌症、动脉粥样硬化和老化的发展中被指出。DNA甲基化因此可充当人类疾病的表观遗传学生物标记物。
任选地，在本文所提供的边结合边测序方法期间鉴别出模板核酸上的一种或多种胞嘧啶甲基化。所述模板核酸可在测序之前经过克隆扩增，其中扩增子包含相同甲基化作为其模板核酸。所述模板核酸的扩增可包括使用DNA甲基转移酶来实现扩增子甲基化。向包含聚合酶和一种或多种核苷酸类型的反应混合物提供所述模板核酸或扩增的模板核酸，其中监测所述聚合酶与核酸之间的相互作用。任选地，在甲基化胞嘧啶存在下所述聚合酶与模板核酸之间的相互作用不同于在未修饰的胞嘧啶存在下的相互作用。因此，基于对聚合酶-核酸相互作用的检查，确定了经过修饰的核苷酸的身份。
任选地，在一个或多个检查和/或掺入步骤之后，添加核苷酸的子集以降低或重设相位调整。因此，所述方法可包括一个或多个步骤：使正在测序的模板核酸分子与包含核苷酸的子集和用于将所述核苷酸掺入与所述核酸分子的模板链相对的链中的酶的组合物接触。所述接触可在降低核酸分子中的相位调整的条件下发生。任选地，所述接触模板核酸分子的步骤在掺入步骤之后和/或在检查步骤之后发生。任选地，所述接触在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、95或100轮或更多轮测序(即，多轮检查和掺入)之后发生。任选地，所述接触在30至60轮测序之后发生。任选地，所述接触在每一轮测序之后(即，在检查和掺入步骤的一个集合之后)发生。任选地，多个接触步骤在每一轮测序之后发生，其中各接触步骤可不包含核苷酸的不同子集。任选地，所述方法进一步在接触之后包括一个或多个洗涤步骤。任选地，所述子集包含两种或三种核苷酸。任选地，所述子集包含三种核苷酸。任选地，所述核苷酸的子集是选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP或其衍生物中的三者。任选地，所述三种核苷酸包含腺苷、胞嘧啶和鸟嘌呤。任选地，所述三种核苷酸包含腺苷、胞嘧啶和胸腺嘧啶。任选地，所述三种核苷酸包含胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。任选地，所述三种核苷酸包含腺苷、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。任选地，各轮接触包含核苷酸的相同子集或不同子集。任选地，监测核酸模板的测序并且与所述核苷酸的子集的接触在检测相位调整时发生。还参见例如美国专利号8,236,532，其以引用的方式整体掺入本文中。
任选地，所述测序反应涉及多种模板核酸、聚合酶和/或核苷酸，其中监测多种闭合复合物。经过克隆扩增的模板核酸可一起进行测序，其中所述克隆紧密地局部化以允许测序期间增强的监测。任选地，闭合复合物的形成确保了在多种经过克隆扩增的模板核酸中碱基延伸的同步性。碱基延伸的同步性允许每个测序循环仅添加一个碱基。
实施例
初步测试证明了引发的模板核酸、聚合酶和下一正确核苷酸(即，同源核苷酸)的特异性相互作用如何形成指示有用的序列信息的三元复合物。下一正确核苷酸的身份有利地在以化学方式掺入引物延伸产物中之前，并且通过使用原生核苷酸(例如，由dATP、dGTP、dCTP和dTTP组成的未标记的核苷酸)来确定。虽然经过修饰的核苷酸(例如，核苷酸类似物，或掺入荧光或其它标记的核苷酸)可用于所述程序中，但原生核苷酸通过消除在所述测序方案期间去除标记或其它化学部分的需要而促进快速循环。如上文结合用于增强匹配/错误匹配碱基区分的方法所论述，可操纵盐浓度以有利于所述检查步骤期间的三元复合物形成。这增加了由三元复合物形成产生的信噪比，并且提高了正确碱基识别。下文描述用于提高正确碱基识别和延伸读段长的其它方法。
图1提供了使用具有均聚物压缩的标准SBB程序获得的结果，所述标准SBB程序不使用使引发的模板核酸与聚合酶和核苷酸结合的双相方案。使用所有四种dNTP的约28个检查和掺入循环(使用单一碱基询问)来获得刚超过100种核苷酸的序列数据。指示三元复合物形成(与同源核苷酸的鉴别相关)的所测量的信号(垂直轴)在循环数(水平轴)增加时展现下倾趋势。相反地，指示二元复合物(与非同源核苷酸的鉴别相关)的检测的所测量的信号并未同样下降。更特定地，与二元复合物的本底检测相关的信号在所述测序程序的持续时间中保持大体上恒定。结果，针对正确碱基识别的信噪比显示出不利于来自比图中所说明的序列读段长的序列读段的正确碱基识别的趋势。因此，感兴趣的是出于提高可用于SBB程序中的碱基识别的信噪比的目的来研究可能用于降低与二元复合物形成相关的本底信号的方法。
以下实施例说明一种用于比较在两种不同聚合酶结合条件下所监测的相互作用的技术，其中聚合酶浓度保持恒定并且测试核苷酸(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP；核苷酸类似物；或经标记的核苷酸)以两种不同浓度存在。所述两种核苷酸浓度可彼此相比相对较低和较高。例如，所述两种核苷酸浓度可相差10倍或更多倍。实际上，所述两种不同结合条件的差别可在于所述一种或多种测试核苷酸的存在和不存在(即，零浓度)。用于所述两种条件中的第二种的核苷酸浓度将始终较高，使得所述引发的模板核酸首先暴露于所述聚合酶和所述两种核苷酸浓度中的较低浓度。术语“双相”在下文中在提及引发的模板核酸与聚合酶和核苷酸的结合时使用，其中所述核苷酸首先以较低浓度(或甚至零浓度)并且接着以较高浓度存在。来自所述程序的结果意外地指示出DNA聚合酶与所述引发的模板核酸之间的相互作用在所述二元和三元复合物中极其不同。另外，意外地发现所述技术可用于检测正在测序的模板中的均聚物区段。
实施例1说明了当执行边结合边测序程序时根据双相方案使引发的模板核酸与聚合酶接触的优势。与其抑制可能混淆正确碱基识别的二元复合物的形成，所述方法依赖于比较当聚合酶浓度恒定并且核苷酸浓度增加时的结合信号。通过使用所述双相方案急剧地增加了用于碱基识别的信号的质量。更特定地，所述方案基本上建立了非特异性聚合酶结合的基线。
实施例1
DNA聚合酶与引发的模板核酸之间的核苷酸特异性相互作用的本底降低增强的检 测
使用生物层干涉术来测量在光纤尖端的表面处的结合反应的
Figure BDA0001783299040000771
(Menlo Park,CA)Octet仪器以多孔板形式使用以说明本底降低技术。使用在5'端处经过生物素化的模板链，以根据标准程序将所述引发的模板核酸固定至用链霉亲和素(SA)官能化的光纤尖端上。生物素化的ALK100模板DNA的预期序列读段具有SEQ ID NO:1的序列(86个核苷酸的潜在读段长)，并且杂交的DNA引物具有SEQ ID NO:2的序列。尖端在含有200mMKCl、160mM谷氨酸钾和0.01％Tween-20的Tris缓冲溶液中洗涤，接着开始所述循环方案。针对四种测试核苷酸中的每一者的独立结合反应使用检查缓冲液以连续方式进行，所述检查缓冲液含有Tris-HCl(pH 8.0)、160mM KCl、160mM谷氨酸钾、0.01％Tween-20、3％DMSO、300mM甜菜碱、1mMβ-巯基乙醇、100μg/ml BSA、1mM NiSO4、280U/ml Bsu DNA聚合酶大片段和在100μM(dCTP、dATP和dGTP)或400μM(dTTP)浓度下的核苷酸之一。这一程序中的检查缓冲液用DMSO和甜菜碱补充以控制DNA二级结构。在试剂改变之间无需洗涤步骤。当使用单一接触步骤来实现聚合酶和核苷酸与所述引发的模板核酸的结合时，所述结合步骤为200秒长，其中结合相互作用的监测是连续的。这通过使所述引发的模板核酸与包含所述聚合酶和测试核苷酸的单一溶液接触来实现。在所述双相结合方案的一种测试中，所述程序涉及首先使所述引发的模板核酸与包含所述聚合酶和10μM浓度的一种核苷酸的溶液接触持续45秒，并且接着使所述引发的模板核酸与包含所述聚合酶和较高浓度的相同核苷酸(对于dCTP、dATP、dGTP为100μM；并且对于dTTP为400μM)的溶液接触持续30秒。在所述双相结合方案的另一测试中，用于第一接触步骤的溶液包含所述聚合酶，但不包含正在针对可能的结合相互作用进行研究的任何核苷酸；并且用于第二接触步骤的溶液包含所述聚合酶和一种核苷酸(对于dCTP、dATP、dGTP为100μM；并且对于dTTP为400μM)。在所述双相结合方案的这后一测试中，所述第一和第二接触步骤各自进行15秒。在所述双相结合方案的两个测试中，用于所述第一和第二接触步骤的含聚合酶溶液包含恒定浓度(即，280U/ml)的所述聚合酶。接着是掺入步骤，由此使包含于三元复合物中的下一正确核苷酸以化学方式掺入引物链中。此举通过将尖端转移至Tris缓冲溶液中来实现，所述Tris缓冲溶液包含50mM KCl、0.01％Tween-20、3％DMSO、300mM甜菜碱、1mMβ-巯基乙醇、100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)、1U/ml的Bsu DNA聚合酶大片段和最终浓度为2mM的MgCl2以促进所述化学掺入。接着是通过螯合所述二价阳离子来猝灭用于所述掺入反应的步骤。猝灭通过将尖端从掺入缓冲液转移至包含500mM KCl、0.02％Tween-20和2mM EDTA的Tris缓冲的洗涤溶液中来实现。最后，各循环通过将尖端浸泡于包含200mM KCl、160mM谷氨酸钾和0.01％Tween-20的Tris缓冲的再生溶液中来完成。分析来自干涉术监测的结果以鉴别正确和不正确核苷酸。在通过使用所述双相结合程序获得结果的情况下，这涉及比较在涉及聚合酶的第一和第二接触步骤之后测量信号，并且需要在所述第二接触步骤之后测量的信号超出在所述第一接触步骤之后测量的信号以鉴别所述测试核苷酸为下一正确核苷酸。例如，在所述第二接触步骤之后测量的信号必须已经超出在所述第一接触步骤之后测量的信号达最小阈值以作为下一正确核苷酸进行评分。重复各步骤以获得关于所述模板核酸的广泛序列信息。
图2A和2B分别示出使用标准单一结合步骤获得的干涉术迹线，所述标准单一结合步骤涉及使引发的模板核酸与聚合酶和核苷酸同时接触；和使用双相结合步骤获得的干涉术迹线，所述双相结合步骤涉及使引发的模板核酸首先与聚合酶和核苷酸(10μM)接触，并且接着与聚合酶和较高核苷酸浓度的核苷酸接触。图2A中针对循环数3和4的迹线极其相似，即使循环3(使用dTTP进行)应该为阴性结果，而循环4为阳性结果(使用dGTP进行)。这说明在循环3中难以识别，并且可能产生假阳性结果，表面在循环3中监测的位置处存在T。还注意到循环9与其它真阳性识别极其相似，即使循环9实际上表示均聚物三联体(即，GGG)的检测。相比之下，图2B中示出的迹线清楚地区别了阳性识别与阴性识别。在所有情况下，阳性识别均由使用第二(即，较高)浓度的核苷酸时的较高信号指示。相反地，阴性识别不显示在所述第一接触步骤期间测量的最大信号与在使用较高核苷酸浓度的第二接触步骤期间测量的信号之间的实质改变。简单地说，当与在所述第一接触步骤期间监测的最大信号相比，在所述第二接触步骤中监测的信号较高时，指示阳性结果。这也可通过需要在所述第二和第一接触步骤中测量的信号的最小比率来处理。或者，可分析连接特定核苷酸暴露时期的第一和最后时刻的线或向量的斜率以确定是否超出最小值来产生阳性碱基识别。继续进行数据分析，在碱基位置8开始的双联体G(在循环数15-16中检测)在所述第二接触步骤期间产生非常高的信号，由此指示所述双相结合程序可能区别独特、单一碱基与均聚物区段的存在。最后，图2A和2B中的迹线关于掺入步骤(即，关于图2A中的单一碱基的各循环为第二步骤；关于图2B中的单一碱基的各循环为第三步骤)期间观察到的响应在性质上不同。更特定地，所述信号针对图2A中的掺入步骤的持续时间均匀地增加，但在图2B中的掺入步骤期间减少。这种差异指示出通过不同结合步骤方法形成的复合物是不同的。换句话说，所述双相结合方法并非产生相同结果的单一步骤结合方法的变体。反而，不同迹线模式的概况反映了聚合酶与所述引发的模板核酸之间的相互作用的机械差异。
实施例2描述了用于评估在边结合边测序程序中获得的序列信息的质量的技术，所述边结合边测序程序掺入双相聚合酶结合方案。
实施例2
增强的三元复合物形成检测提高了在边结合边测序方案中获得的数据的精度
使引发的模板核酸固定至光纤尖端，并且洗涤所述尖端，准备与基本上如实施例1中所述的
Figure BDA0001783299040000801
(Menlo Park,CA)Octet仪器一起使用。所述程序中使用的检查缓冲液、掺入缓冲液、猝灭缓冲液和再生缓冲液的组成也与实施例1中相同。使用与100μM(dCTP、dATP和dGTP)或400μM(dTTP)浓度的一种测试核苷酸组合的Bsu DNA聚合酶大片段进行对照试验，所述对照试验使用使所述引发的模板核酸与聚合酶接触的单一步骤进行。在这一对照试验中使聚合酶和核苷酸与所述引发的模板核酸接触的步骤继续进行200秒，其中结合相互作用的监测是连续的。所述掺入结合至所述引发的模板核酸的双相聚合酶的试验使用第一接触步骤持续45秒，所述第一接触步骤使用包含所述聚合酶和2μM浓度的一种核苷酸的溶液。这一步骤后接第二接触步骤持续30秒，所述第二接触步骤使用包含所述聚合酶和较高浓度的相同核苷酸(对于dCTP、dATP、dGTP为100μM；并且对于dTTP为400μM)的溶液。用于所述第一和第二接触步骤的溶液包含恒定浓度(即，280U/ml)的所述聚合酶。接着是掺入步骤，由此使包含于三元复合物中的下一正确核苷酸以化学方式掺入引物链中。此举通过将尖端转移至Tris缓冲溶液中来实现，所述Tris缓冲溶液包含50mM KCl、0.01％Tween-20、3％DMSO、甜菜碱、β-巯基乙醇、牛血清白蛋白(BSA)、Bsu DNA聚合酶大片段和最终浓度为2mM的MgCl2以促进所述化学掺入。值得注意的是，用于检查和掺入步骤的缓冲液用DMSO和甜菜碱补充以控制DNA二级结构。接着是螯合所述二价阳离子来猝灭所述掺入反应的步骤。猝灭通过将尖端从掺入缓冲液转移至包含500mM KCl、0.02％Tween-20和2mMEDTA的Tris缓冲的洗涤溶液中来实现。最后，各循环通过将尖端浸泡于包含KCl、谷氨酸钾和Tween-20的Tris缓冲的再生溶液中来完成。基于所监测的干涉术结果来鉴别下一正确核苷酸的程序是如实施例1中所述。重复使所述引发的模板核酸与不同溶液接触的步骤以获得关于所述模板核酸的序列信息。
图3A和3B分别示出在用于相同的引发的模板核酸的约60个核苷酸的长度中的碱基识别结果，所述引发的模板核酸经受具有均聚物压缩的边结合边测序程序，其中聚合酶在单一步骤中，或使用所述双相结合方案。图3A中的图包括在超过50个核苷酸的序列中一种假阴性识别，和一种假阳性识别。正确阴性识别一般地与低于识别阳性结果所需的任意阈值的可检测信号相关。有趣的是，所述趋势指示了关于正确阳性识别，信号幅度随增加的读段长而减少，而与正确阴性识别相关的本底信号保持大体上稳定。因而，信噪比随增加的读段长而减少。如果未通过一些方式降低或控制，那么所述读段长将具有上限。相反，图3B示出了与正确阴性识别相关的可检测信号大体上由所述双相聚合酶结合程序消除。针对正确识别的信噪比在用所述双相结合程序时是显著更有利的。此外，在使用所述双相结合程序获得的结果中未检测到测序误差。
使用与上文刚描述的程序略微不同的双相结合技术，在200个碱基的读段长上实现正确碱基识别结果而无误差。更特定地，引发的模板核酸首先在所述测试核苷酸不存在下与DNA聚合酶接触，并且接着与DNA聚合酶和所述测试核苷酸的组合接触。如上，进行针对结合(即，使用含聚合酶的溶液的第一和第二接触步骤)、掺入(即，添加催化二价阳离子)、猝灭(即，去除二价阳离子和所述聚合酶反应的产物)和缓冲液再生的循环。结果指示在230个核苷酸的读段长内仅观察到两处误差。这种显著提高说明了所述双相结合技术的优势。
实施例3证明了所述双相检查程序在进行掺入反应之前如何用于检查多种测试核苷酸。这种技术有利地降低了与二元复合物的检测相关的本底信号，由此增强包含下一正确核苷酸的三元复合物的特异性检测。此外，通过避免非生产性掺入反应缩短了分析时间。用于所述掺入反应的核苷酸可以是原生核苷酸或未标记的核苷酸类似物。或者，所述掺入反应中的核苷酸可以是经过标记或未标记和/或包含可逆终止子部分的核苷酸类似物。
实施例3
多种测试核苷酸的进行性结合和检查，随后掺入反应
使引发的模板核酸固定至光纤尖端，并且洗涤所述尖端，准备与基本上如实施例1中所述的
Figure BDA0001783299040000821
(Menlo Park,CA)Octet仪器一起使用，其中所述引发的模板核酸的固定化继续进行200秒的过。所述传感器尖端接着在补充有100μg/ml的超纯牛血清白蛋白(BSA)的结合缓冲液中洗涤持续45秒。接着，使所述尖端暴露于检查缓冲液(含有Tris-HCl(pH 8.0)、160mM KCl、160mM谷氨酸钾、0.01％Tween-20、100μg/mL超纯BSA、1mM NiSO4和400nM Bsu聚合酶大片段的溶液)持续30秒以在dNTP不存在下允许二元复合物形成。接着使所述尖端暴露于补充有单一dNTP(100μM dTTP)的检查缓冲液持续20秒；随后20秒暴露于补充有两种dNTP(100μM dTTP和100μM dATP)的检查缓冲液；随后20秒暴露于补充有三种dNTP(100μM dTTP、100μM dATP和100μM dCTP)的检查缓冲液；并且最终随后20秒暴露于补充有所有四种dNTP(针对dTTP、dATP、dCTP和dGTP中的每一者均为100μM)的检查缓冲液。从最终溶液去除所述尖端并且将其直接地投入EDTA洗涤缓冲液(30mM Tris-HCl pH 8.0、500mM KCl、0.02％Tween-20、2mM EDTA)中持续20秒以从已经由所述引发的模板核酸形成的任何复合物剥离聚合酶和核苷酸。在EDTA洗涤期间去除聚合酶、dNTP、Ni2+和谷氨酸钾之后，使所述尖端在不包含聚合酶或核苷酸的酶掺入缓冲液中平衡持续20秒的时期。这一任选的平衡步骤用于从所述尖端去除可能已经从前一步骤携带的任何试剂。接着使所述尖端暴露于掺入缓冲液持续5秒，所述掺入缓冲液补充有聚合酶和一种或多种dNTP(例如，如果已知下一正确核苷酸，那么是单一dNTP，或是所有四种可逆终止子dNTP)和一定量的催化金属离子(如，Mg2+)，所述量足以促进dNTP掺入和响应于模板链的下一正确核苷酸的引物延伸。再次使所述尖端暴露于EDTA洗涤缓冲液持续20秒以去除聚合酶和可逆终止子，并且暴露于检查再生溶液持续20秒，接着以无dNTP检查步骤(即，所述双相聚合酶结合方案的第一相)开始来重复所述循环。所述检查再生溶液是包含200mM KCl、160mM谷氨酸钾和0.01％Tween-20的Tris缓冲溶液。在这一示范中监测是连续的，不过周期性监测也将已经产生良好结果。所有步骤均在30℃下执行，其中在500rpm下振荡。
图4示出干涉术迹线，所述干涉术迹线清楚地确认了所公开的方法增加针对三元复合物检测的信噪比。聚合酶结合的初始相(其中所述引发的模板核酸在所添加的核苷酸不存在下与所述聚合酶接触)导致在30秒处理期间结合信号的实质增加。这指示了所述引发的模板核酸与所述聚合酶之间的二元复合物的形成。当与前一步骤中测量的信号相比时，在聚合酶和dTTP存在下进行的检查大体上保持不变。这指示了仅二元复合物在dTTP存在下形成，并且dTTP并非下一正确核苷酸。当与前一步骤相比时，随后在聚合酶、dTTP和dATP存在下进行的检查给出了相似的结果。这指示了dTTP和dATP均非下一正确核苷酸，因为仅已经形成二元复合物。相反，与前一步骤相比，在聚合酶、dTTP、dATP和dCTP存在下进行的检查步骤指示了结合信号的实质增加，由此指示了包含dCTP的三元复合物的形成。在接触包含dCTP的试剂之后形成所述三元复合物鉴别出dCTP为下一正确碱基。最终，如所预期，与前一步骤相比，在聚合酶、dTTP、dATP、dCTP和dGTP存在下进行的检查步骤并未指示结合信号的任何进一步增加。因此，一旦已经形成所述三元复合物，包含非同源dGTP不会改变结合信号。值得注意的是，用于获得图4中提供的结果的程序不包括通常用于掺入下一正确核苷酸的5秒步骤中的任何核苷酸。因此，在那一步骤期间不存在结合信号的增加。反应间隔提供于图4中以说明包括所述掺入反应的工作流。
接着将使用无标记系统产生的上述发现应用于依赖于外源可检测标记的测序系统。在某些特定情况下，使用一种或多种荧光聚合酶的系统用于鉴别同源核苷酸而无掺入。用于说明性实施例中的聚合酶在所添加的核苷酸存在和不存在下同样发荧光。尽管构象敏感性荧光聚合酶可用于所述程序中，并不需要情况如此。在某些实施方案中，当在同源核苷酸存在或不存在下结合至引发的模板核酸时，所述可检测标记的聚合酶不会产生大体上不同的信号。
优选地，在测试核苷酸(即，同源核苷酸候选物)不存在和存在下接触引发的模板核酸的独立步骤中所用的聚合酶具有同一的氨基酸序列。例如，所述两种聚合酶的不同之处可仅在于在核苷酸存在下使用的聚合酶上的外源可检测标记的存在。更特定地，包括测试核苷酸的第二接触步骤中所用的聚合酶可以是不包括在测试四种不同核苷酸的完整循环期间所测试的任何核苷酸的初始接触步骤中所用的聚合酶的化学修饰形式。
一般说来，在基于聚合酶的测序程序中使用用于聚合酶结合的双相方法是有益的。在结合无标记系统应用的所述双相方法的前述论述集中于在所述第一和第二接触步骤中使用相同聚合酶时本底信号的降低的情况下，使用可检测标记的聚合酶的测序程序优选地使用非同一聚合酶。更特定地，第一反应混合物优选地包含缺乏外源标记的聚合酶，所述外源标记欲用于指示同源核苷酸的存在而无那一核苷酸的掺入。用于第二接触步骤的第二反应混合物包含具有外源标记的聚合酶，所述外源标记将指示同源核苷酸结合，再次无掺入。使用所述双相结合技术时，首先使所述引发的模板核酸与包含聚合酶的第一反应混合物接触，所述聚合酶缺乏存在于所述第二反应混合物中并且在所述第二接触步骤中接触所述引发的模板核酸的聚合酶的荧光标记。
在某些优选实施方案中，用于所述第二接触步骤的聚合酶与用于所述第一接触步骤的聚合酶的不同之处在于包含外源化学标记，如外源荧光标记。例如，用于接触所述引发的模板核酸(即，使用不包含同源核苷酸候选物的第一反应混合物)的初始步骤中的聚合酶可以是不含外源荧光部分的聚合酶。因此，接触所述引发的模板核酸的第一聚合酶优选地大体上不会促进荧光信号。由用于所述第二接触步骤中的第二反应混合物提供的聚合酶优选地包含不存在于所述第一反应混合物的聚合酶中的外源荧光标记。应理解，在边结合边测序程序中在无掺入的情况下同源核苷酸的鉴别使可检测信号与三元复合物形成相关。
在依赖于不同核酸的连续添加(即，在已经去除含有早先添加的核苷酸的任何复合物之前使所述引发的模板与第二核苷酸接触)的程序中，后续步骤的聚合酶任选地包含相同标记，或不同标记(例如，相同或不同荧光标记)。重要的是，初始接触步骤(在本文中称作第一接触步骤)的聚合酶缺失欲用于指示同源核苷酸结合的任何一个或多个后续步骤的荧光标记。换句话说，在使用一种或多种经过标记的聚合酶来鉴别同源核苷酸的边结合边测序程序中，所述引发的模板核酸最初应该在用于核苷酸询问的各完整循环的同源核苷酸候选物不存在下接触聚合酶。如果欲研究核苷酸结合的四个步骤，那么在所述检查步骤前面的初始步骤应该涉及在所述四种测试核苷酸中的任一者均不存在的情况下使引发的模板核酸与聚合酶接触。
所述双相方法有利地提高了使用单一经过标记的聚合酶或多种差异性标记的聚合酶的程序中获得的结果。提高的结果源于结合信号的降低，所述降低是归因于在接触任何核苷酸之前聚合酶的存在。
当特定可检测标记一般地用于指示同源核苷酸结合时(即，单一标记用于指示三元复合物形成)，所述特定可检测标记应该不存在于在任何同源核苷酸候选物不存在下接触所述引发的模板核酸的聚合酶中。在这种情况下，相同的可检测标记的聚合酶将存在于各不同核苷酸的添加期间，其中不同核苷酸一次添加一种。应清楚，所述引发的模板核酸最初应该在核苷酸不存在下与聚合酶接触，其中所述聚合酶不包含欲用于指示三元复合物形成的可检测标记。在第一核苷酸结合步骤中，来自初始步骤的引发的模板核酸在来自初始接触步骤的聚合酶(即，“未标记的”聚合酶)不存在下与包含经过标记的聚合酶和第一核苷酸的反应混合物接触。在第二核苷酸结合步骤中，来自前一步骤的引发的模板核酸再次在来自初始接触步骤的聚合酶不存在下与包含经过标记的聚合酶和第二核苷酸的反应混合物接触。任选地，所述第一核苷酸与所述第二核苷酸一起包含于包含经过标记的聚合酶但不包含来自初始接触步骤的聚合酶的反应混合物中。针对第三和第四核苷酸重复所述过程，每次使用进行性地每次更换或添加一种核苷酸的反应混合物，其中包含所述经过标记的聚合酶，但省略来自初始接触步骤的聚合酶。
当使用多种差异性标记的聚合酶来鉴别同源核苷酸而无掺入时，实现平行益处。如上，接触所述引发的模板核酸的初始步骤应该使用包含聚合酶的反应混合物在欲作为潜在同源核苷酸测试的任何所添加的核苷酸不存在下执行。再次如上，初始接触步骤的聚合酶应该不具有与随后用于指示同源核苷酸结合的任何聚合酶相同的可检测标记。接着，通过使来自前一步骤的引发的模板核酸与包含第一经过标记的聚合酶和欲作为同源核苷酸测试的第一核苷酸的反应混合物接触来开始核苷酸询问。接着，来自前一步骤的引发的模板核酸可以与包含第二经过标记的聚合酶和欲作为同源核苷酸测试的第二核苷酸的反应混合物接触。这一反应物仅包含第二经过标记的聚合酶，并且不包含初始接触步骤的聚合酶，或第一经过标记的聚合酶。以这种方式，核苷酸结合可通过与所述聚合酶上的标记缔合而进行编码。接着，来自前一步骤的引发的模板核酸可以与包含第三经过标记的聚合酶和欲作为同源核苷酸测试的第三核苷酸的反应混合物接触。这一反应物仅包含第三经过标记的聚合酶，并且不包含初始接触步骤的聚合酶、第一经过标记的聚合酶或第二经过标记的聚合酶。再次，核苷酸结合可通过与所述聚合酶上的标记缔合而进行编码。最后，来自前一步骤的引发的模板核酸可以与包含第四经过标记的聚合酶和欲作为同源核苷酸测试的第四核苷酸的反应混合物接触。这一反应物仅包含第四经过标记的聚合酶，并且不包含初始接触步骤的聚合酶、第一经过标记的聚合酶、第二经过标记的聚合酶或第三经过标记的聚合酶。再次，核苷酸结合可通过与所述聚合酶上的标记缔合而进行编码。所述第一、第二、第三和第四聚合酶均可具有可区别的标记。通过这种方法，可执行单一扫描作为检查步骤的一部分。例如，可进行单一荧光扫描以检测含有所述差异性标记的聚合酶中的每一者的三元复合物。
上文公开可用于所公开的方法和组合物的产物、可结合所公开的方法和组合物的产物使用、可用于制备所公开的方法和组合物的产物或作为所公开的方法和组合物的产物的材料、组合物和组分。应理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，并且虽然可能未明确地公开这些化合物的每一种不同的个别和集合组合和排列的特定提及，但每一者均特定地涵盖于并且描述于本文中。例如，如果公开并且论述一种方法并且论述了可对包括所述方法的多种分子进行的多种修饰，那么除非特定地相反指示，否则特定地涵盖所述方法的每一种组合和排列和可能的修饰。同样，还特定地涵盖并且公开其任何子集或组合。这一概念适用于本公开的所有方面，包括使用所公开的组合物的方法步骤。因此，如果可执行多个额外步骤，那么应理解这些额外步骤中的每一者均可与所公开的方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合一起执行，并且特定地涵盖各所述组合或组合的子集并且应该将其视为公开的。
本文所引用的公布和所述公布被引用的材料由此特定地以引用的方式整体并入。本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均以引用的方式并入，其并入程度就如同各个别公布、专利或专利申请特定地并且个别地经指示以引用的方式并入一般。
应理解，本文所用的标题是仅出于组织目的并且不打算限制说明书或权利要求书。
已经描述了多个实施方案。然而，应理解可进行多种修改。相应地，其它实施方案在权利要求书的范围内。
Figure IDA0001816841540000011

Claims (63)

1.一种确定测试核苷酸是否是下一正确核苷酸的方法，所述下一正确核苷酸包含与引发的模板核酸中的引物紧邻下游的模板链中的下一碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：
(a)使所述引发的模板核酸与包含DNA聚合酶的第一反应混合物接触，由此形成包含所述引发的模板核酸和所述聚合酶的二元复合物；
(b)使来自步骤(a)的所述二元复合物与包含所述DNA聚合酶和所述测试核苷酸的第二反应混合物接触；
(c)分别在步骤(a)和(b)中的每一者期间的一个或多个时刻测量所述引发的模板核酸与所述第一和第二反应混合物的DNA聚合酶的结合，其包括测量指示所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合的光学信号，和接着计算所测量的光学信号之间的差异以确定由步骤(b)得到的经测量的结合是否超过由步骤(a)得到的经测量的结合，但所述测试核苷酸并未以化学方式掺入所述引物中，
其中所述引发的模板核酸的阻断部分或非催化金属离子防止或抑制所述测试核苷酸掺入所述引物中；和
(d)使用来自步骤(c)的所测量结合结果来确定所述测试核苷酸是否是所述下一正确核苷酸，
其中
(i)所述第一反应混合物不含所述测试核苷酸，或
(ii)所述第一和第二反应混合物各自包含所述测试核苷酸，所述第一反应混合物的测试核苷酸以低于所述第二反应混合物的测试核苷酸的浓度的浓度存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述测试核苷酸是不包含任何所添加的荧光标记的原生核苷酸，并且其中步骤(c)不包括测量来自构象敏感染料的荧光或吸收信号的差异，所述构象敏感染料由于所述DNA聚合酶结合至所述测试核苷酸而改变光学特性。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反应混合物不含核苷酸。
4.如权利要求3所述的方法，其进一步包括步骤(e)，即通过形成磷酸二酯键而将所述测试核苷酸以化学方式掺入所述引发的模板核酸的引物中。
5.如权利要求4所述的方法，其进一步包括重复步骤(a)-(e)。
6.如权利要求5所述的方法，其中步骤(a)-(e)重复至少50次。
7.如权利要求4所述的方法，其进一步包括步骤(f)，即使用第二测试核苷酸替代所述测试核苷酸来重复步骤(a)-(e)，其中所述测试核苷酸和所述第二测试核苷酸彼此不同。
8.如权利要求3所述的方法，其进一步包括步骤(e)，即用第三反应混合物替代所述第二反应混合物，所述第三反应混合物包含含可逆终止子部分的可逆终止子核苷酸和不同于所述第二反应混合物的DNA聚合酶的DNA聚合酶。
9.如权利要求8所述的方法，其进一步包括步骤(f)，即通过形成磷酸二酯键将所述可逆终止子核苷酸掺入所述引物中。
10.如权利要求9所述的方法，其进一步包括步骤(g)，即从掺入所述引物中的所述可逆终止子核苷酸去除所述可逆终止子部分。
11.如权利要求10所述的方法，其进一步包括重复步骤(a)-(g)至少50次。
12.如权利要求3所述的方法，其中所述引发的模板核酸固定至固体支撑物，并且其中步骤(b)包括从含有所述第一反应混合物的容器移动所述固体支撑物至含有所述第二反应混合物的不同容器。
13.如权利要求3所述的方法，其中所述引发的模板核酸固定至固体支撑物，并且其中步骤(a)和(b)中的每一者均包括使反应混合物流经所述引发的模板核酸。
14.如权利要求3所述的方法，其中步骤(c)包括在步骤(a)和(b)中的每一者期间连续地测量所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合。
15.如权利要求3所述的方法，其中步骤(c)包括计算所测量的光学信号的比率以确定由步骤(b)得到的经测量的结合是否超过由步骤(a)得到的经测量的结合。
16.如权利要求3所述的方法，其中步骤(c)包括计算所测量的光学信号的时间依赖性改变速率以确定由步骤(b)得到的经测量的结合是否超过由步骤(a)得到的经测量的结合。
17.如权利要求3所述的方法，其中所述测试核苷酸是选自由dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP组成的组的原生核苷酸。
18.如权利要求3所述的方法，其中所述测试核苷酸不包含外源荧光标记。
19.如权利要求3所述的方法，其中所述测试核苷酸是不包含外源标记的未标记的测试核苷酸。
20.如权利要求3所述的方法，其中所述测试核苷酸是核苷酸类似物。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述核苷酸类似物包含可逆终止子部分。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述包含所述可逆终止子部分的核苷酸类似物进一步包含荧光标记。
23.如权利要求3所述的方法，其中所述引发的模板核酸固定至表面，并且其中步骤(c)包括测量折射率的改变以测量所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合。
24.如权利要求23所述的方法，其中步骤(c)包括通过干涉术或表面等离子体共振传感测量折射率的改变。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反应混合物的DNA聚合酶不含所添加的荧光标记。
26.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反应混合物的DNA聚合酶不含所添加的荧光标记，所述荧光标记在所述DNA聚合酶结合至核苷酸之后改变特性。
27.如权利要求19所述的方法，其中所述第一反应混合物的DNA聚合酶不含所添加的荧光标记，所述荧光标记在所述DNA聚合酶结合至核苷酸之后改变特性。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述引发的模板核酸固定至表面，并且其中步骤(c)包括测量折射率的改变以测量所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合。
29.如权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二反应混合物各自包含所述测试核苷酸，其中所述第一反应混合物包含浓度低于当所述测试核苷酸为所述下一正确核苷酸时实现最大三元复合物形成所需的浓度的所述测试核苷酸，并且其中所述第二反应混合物包含浓度足以在所述测试核苷酸为所述下一正确核苷酸时实现最大三元复合物形成的所述测试核苷酸。
30.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括如果由步骤(b)得到的经测量的结合超过由步骤(a)得到的经测量的结合，那么确定所述测试核苷酸是所述下一正确核苷酸。
31.一种鉴别下一正确核苷酸的方法，所述下一正确核苷酸包含与引发的模板核酸中的引物紧邻下游的模板链中的下一碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：
(a)使所述引发的模板核酸与包含DNA聚合酶的第一反应混合物接触，由此形成包含所述引发的模板核酸和所述DNA聚合酶的第一复合物；
(b)使来自步骤(a)的所述第一复合物与包含所述DNA聚合酶和第一测试核苷酸的第二反应混合物接触，由此形成包含所述引发的模板核酸和所述DNA聚合酶的第二复合物；
(c)使来自步骤(b)的所述第二复合物与包含所述DNA聚合酶、所述第一测试核苷酸和第二测试核苷酸的第三反应混合物接触，由此形成包含所述引发的模板核酸和所述聚合酶的第三复合物；
(d)使来自步骤(c)的所述第三复合物与包含所述DNA聚合酶、所述第一测试核苷酸、所述第二测试核苷酸和第三测试核苷酸的第四反应混合物接触，由此形成包含所述引发的模板核酸和所述DNA聚合酶的第四复合物；
(e)使来自步骤(d)的所述第四复合物与包含所述DNA聚合酶、所述第一测试核苷酸、所述第二测试核苷酸、所述第三测试核苷酸和第四测试核苷酸的第五反应混合物接触，由此形成包含所述引发的模板核酸和所述DNA聚合酶的第五复合物；
(f)在步骤(a)-(e)中的每一者期间的一个或多个时刻测量指示所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合的光学信号，所述第一测试核苷酸并未以化学方式掺入所述引物中，
其中所述引发的模板核酸的阻断部分或非催化金属离子防止或抑制所述测试核苷酸掺入所述引物中；
(g)鉴别所述下一正确核苷酸：
(i)如果由步骤(b)得到的经测量的结合超过由步骤(a)得到的经测量的结合，那么是所述第一测试核苷酸，或
(ii)如果由步骤(c)得到的经测量的结合超过由步骤(b)得到的经测量的结合，那么是所述第二测试核苷酸，或
(iii)如果由步骤(d)得到的经测量的结合超过由步骤(c)得到的经测量的结合，那么是所述第三测试核苷酸，或
(iv)如果由步骤(e)得到的经测量的结合超过由步骤(d)得到的经测量的结合，那么是所述第四测试核苷酸，
其中所述第一反应混合物不含所述第一测试核苷酸、所述第二测试核苷酸、所述第三测试核苷酸和所述第四测试核苷酸。
32.如权利要求31所述的方法，其在步骤(f)之后进一步包括步骤(h)，即通过磷酸二酯键形成将所述下一正确核苷酸以化学方式掺入所述引物中。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述测试核苷酸中的每一者彼此不同，并且其中所述测试核苷酸中的每一者均选自由dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP组成的组。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述测试核苷酸中的每一者彼此不同，并且其中每一种测试核苷酸均是选自由dATP、dGTP、dCTP和dTTP组成的组的原生核苷酸。
35.如权利要求32所述的方法，其中所述测试核苷酸中的每一者彼此不同，并且其中所述测试核苷酸均不包含外源荧光标记。
36.如权利要求32所述的方法，其中所述测试核苷酸中的每一者彼此不同，并且其中每一种测试核苷酸均是包含可逆终止子部分的核苷酸类似物。
37.如权利要求32所述的方法，其中所述掺入所述引物中的下一正确核苷酸包含可逆终止子部分。
38.如权利要求33所述的方法，其中所述掺入所述引物中的下一正确核苷酸包含可逆终止子部分。
39.如权利要求32所述的方法，其中所述测试核苷酸均不包含可逆终止子部分，并且其中在步骤(f)与步骤(h)之间存在步骤(i)，即去除结合至所述引发的模板核酸的任何测试核苷酸，并且接着添加至少一种包含可逆终止子部分的核苷酸。
40.如权利要求32所述的方法，其中用于步骤(a)-(e)中的所述聚合酶不同于用于步骤(h)中的所述聚合酶。
41.一种确定测试核苷酸是否是下一正确核苷酸的方法，所述下一正确核苷酸包含与引发的模板核酸中的引物紧邻下游的模板链中的下一碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：
(a)使所述引发的模板核酸与包含第一DNA聚合酶的第一反应混合物接触，由此形成包含所述引发的模板核酸和所述第一DNA聚合酶的二元复合物；
(b)使来自步骤(a)的所述二元复合物与包含第二DNA聚合酶而非所述第一DNA聚合酶和所述测试核苷酸的第二反应混合物接触，其中所述第二DNA聚合酶包含不存在于所述第一DNA聚合酶中的标记；
(c)通过检测存在于包含所述引发的模板核酸的三元复合物中的所述第二聚合酶的标记来检测所述引发的模板核酸与所述第二DNA聚合酶和所述测试核苷酸的结合，所述测试核苷酸并未以化学方式掺入所述引物中，
其中所述标记是荧光标记，和
其中所述引发的模板核酸的阻断部分或非催化金属离子防止或抑制所述测试核苷酸掺入所述引物中；和
(d)使用来自步骤(c)的所测量结合结果来确定所述测试核苷酸是否是所述下一正确核苷酸，
其中
(i)所述第一反应混合物不含所述测试核苷酸，或
(ii)所述第一和第二反应混合物各自包含所述测试核苷酸，所述第一反应混合物的测试核苷酸以低于所述第二反应混合物的测试核苷酸的浓度的浓度存在。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述第一和第二DNA聚合酶的氨基酸序列是相同的。
43.如权利要求41所述的方法，其中步骤(a)和(b)中的每一者均在缓冲液条件下发生，所述缓冲液条件使三元复合物的形成稳定化并且使二元复合物的形成不稳定。
44.如权利要求43所述的方法，其中步骤(a)和(b)中的每一者均在高盐缓冲液条件下发生。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述第一DNA聚合酶不包含外源可检测标记。
46.如权利要求41所述的方法，其进一步包括重复步骤(a)-(c)中的每一者三次，每次使用不同的测试核苷酸。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述第二DNA聚合酶的标记是荧光标记。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述步骤(c)不包括测量来自构象敏感染料的荧光信号，所述构象敏感染料由于所述第二DNA聚合酶结合至同源核苷酸而改变光学特性。
49.如权利要求41所述的方法，其进一步包括去除所述测试核苷酸和结合至所述引发的模板核酸的任何聚合酶。
50.如权利要求49所述的方法，其进一步包括使所述引发的模板核酸与包含第三DNA聚合酶和可逆终止子核苷酸的第三反应混合物接触，和接着使用所述第三DNA聚合酶将所述可逆终止子核苷酸掺入所述引物中以产生可逆终止的引物。
51.如权利要求50所述的方法，其进一步包括使用所述引发的模板核酸重复步骤(a)-(d)，所述引发的模板核酸包含步骤(a)-(c)中的每一者中的所述可逆终止的引物。
52.一种掺入核苷酸的方法，所述核苷酸具有与引发的模板核酸分子中的引物紧邻下游的模板链中的下一碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：
(a)使所述引发的模板核酸分子与包含DNA聚合酶的第一反应混合物接触，由此形成包含所述引发的模板核酸分子和所述DNA聚合酶的二元复合物；
(b)使来自步骤(a)的所述二元复合物与包含所述DNA聚合酶和第一测试核苷酸的第二反应混合物接触，所述第一测试核苷酸并未掺入所述引物中，由此形成包含所述引发的模板核酸分子和所述DNA聚合酶的第二复合物，
其中所述引发的模板核酸的阻断部分或非催化金属离子防止或抑制所述测试核苷酸掺入所述引物中；
(c)在步骤(a)和(b)中的每一者期间的一个或多个时刻测量所述引发的模板核酸分子与所述DNA聚合酶的结合，其包括测量指示所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合的光学信号，和接着计算所测量的光学信号之间的差异以确定由步骤(b)得到的经测量的结合是否超过由步骤(a)得到的经测量的结合，所述第一测试核苷酸并未以化学方式掺入所述引物中，以确定在步骤(b)中形成的所述第二复合物是否是包含所述第一测试核苷酸的三元复合物；
(d)选择以下两个选项之一，
(i)如果在步骤(c)中确定所述第二复合物并非所述三元复合物，那么使来自步骤(b)的所述第二复合物与包含与所述第一测试核苷酸和第二测试核苷酸组合的所述DNA聚合酶的第三反应混合物接触，所述第二测试核苷酸不同于所述第一测试核苷酸；和
(ii)如果在步骤(c)中确定所述第二复合物是三元复合物，那么执行掺入反应以将所述第一测试核苷酸掺入所述引物中，而未首先使来自步骤(b)的所述引发的模板核酸分子与所述第三反应混合物接触，
其中
所述第一反应混合物不含所述第一测试核苷酸，或
所述第一和第二反应混合物各自包含所述第一测试核苷酸，所述第一反应混合物的第一测试核苷酸以低于所述第二反应混合物的第一测试核苷酸的浓度的浓度存在。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述引发的模板核酸分子固定至固体支撑物。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述第三反应混合物包含不同于所述第一和第二反应混合物的聚合酶的聚合酶。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述第三反应混合物包含不同于所述第一和第二反应混合物的聚合酶的聚合酶，并且其中在步骤(d)(ii)中掺入所述引物中的所述核苷酸包含可逆终止子部分。
56.如权利要求52所述的方法，其中所述引发的模板核酸分子固定至固体支撑物，并且其中接触步骤(a)和(b)各自包括使所述反应混合物流经固定至所述固体支撑物的所述引发的模板核酸分子。
57.如权利要求52所述的方法，其中所述引发的模板核酸分子固定至固体支撑物，并且其中接触步骤(a)和(b)各自包括从含有所述第一反应混合物的容器移动所述固体支撑物至含有所述第二反应混合物的容器。
58.如权利要求52所述的方法，其中所述第一和第二反应混合物各自包含相同浓度的所述聚合酶。
59.如权利要求52所述的方法，其中所述第三反应混合物包含不同于所述第一和第二反应混合物的聚合酶的聚合酶。
60.如权利要求52所述的方法，其中步骤(c)包括通过干涉术或表面等离子体共振传感中的任一者测量。
61.如权利要求52所述的方法，其中所述第一测试核苷酸是原生核苷酸。
62.如权利要求52所述的方法，其中所述第一测试核苷酸包含可逆终止子部分。
63.如权利要求52所述的方法，其中在步骤(d)(ii)中掺入的所述核苷酸选自由原生核苷酸和包含可逆终止子的核苷酸组成的组。
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